KR20190141119A - 변형된 대사를 갖는 면역 세포 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체를 과발현시키도록 구성된 변형된 T 세포가 기술된다. 또한, 질환, 특히, 암의 치료에서의 이러한 변형된 T 세포의 용도, SLC1A5를 과발현시키는 변형된 T 세포를 선택하는 방법, 및 이러한 변형된 T 세포를 제공하기 위한 핵산 및 벡터가 기술된다.
Description
본 발명은 저 트립토판 또는 트립토판 고갈된 미세 환경, 특히, 트립토판 이화작용이 일어나는 환경에서 기능하도록 구성된 T 세포에 관한 것으로서, 여기서, T 세포는 이러한 것이 아미노산 수송체, 적합하게는, 글루타민 및/또는 트립토판 수송체, 예를 들어, SLC1A5 및 이의 아이소폼(isoform)을 발현시키도록 변형된, T 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 T 세포를 제공하는 방법 및 이의 용도를 제공한다.
트립토판 분해(tryptophan degradation)는 많은 종양에 의해 사용되는 면역 회피 전략(immune escape strategy)이다.
인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO) 및 트립토판 2,3-다이옥스게나제(TDO)는 키누레닌 경로의 속도 제한 효소로서, 이는 필수 아미노산 트립토판을 키누레닌으로 전환시킨다.
IDO 활성에 의해 야기된, 저 트립토판 조건, 통상적으로, 5μM 미만의 트립토판 조건은 종양 세포의 광범위한 리모델링(remodelling), 아미노산 대사, 유전자 발현, 및 또한 SLC1A5 접합 변형체를 포함하는 SLC7A11, SLC1A4 및 SLC1A5와 같은 아미노산 수송체 암호화 유전자 발현의 상향조절을 유도한다.
SLC1A5는 용질 캐리어 패밀리(solute carrier family)의 나트륨-의존 고-친화력 글루타민 수송체이다. SLC1A5(및 이의 접합 변형체) 발현의 상향조절은 종양 세포 내로의 글루타민의 흡수(uptake)를 개선한다. 글루타민의 흡수를 향상시키는 것 외에, SLC1A5 발현의 상향조절은 또한, 큰 중성 아미노산 수송체(LAT1)의 활성을 향상시킴으로써 트립토판 수송체를 개선시킨다. LAT1은 우선적으로 분지쇄(발린, 류신, 아이소류신) 및 방향족(트립토판, 티로신) 아미노산을 수송하는 헤테로다이머 막 수송 단백질이다. 기능성 LAT1 수송체는 2개의 별개의 유전자에 의해 암호화된 2개의 단백질로 이루어진다:
1. SLC3A2 유전자에 의해 암호화된 4F2hc/CD98 중 소단위 단백질(heavy subunit protein), 및
2. SLC7A5 유전자에 의해 암호화된 CD98 경 소단위 단백질(light subunit protein).
의무적인 아미노산 교환기이기 때문에, LAT1 활성은 분지쇄 및 방향족 아미노산의 흡수를 위한 세포내 글루타민의 교환에 크게 의존한다.
IDO 및 TDO의 구성적 발현(constitutive expression)은 종양 미세환경에서 트립토판 이화작용을 야기시키는 다수의 인간 암에서 보고되었다. 제한된 트립토판 이용률은 T 세포의 증식 및 효과기 기능을 감소시키는 상당한 면역조절 효과를 갖는다. 암 세포는 암 세포에 종양의 다른 세포에 비해 선택적 장점을 제공하는 아미노산 수송체의 상향조절에 의한 이러한 적대적 미세환경에 의해 보호된다.
트립토판 이화작용이 T 세포에 면역억제 효과를 지니고 있다는 것이 규명되었지만, 트립토판 이화작용이 T 세포에 영향을 미치는 메커니즘은 덜 이해되고 있다.
IDO는 최근 몇 년 동안, 부분적으로 트립토판 고갈로부터 및 부분적으로 트립토판 이화 대사산물의 직접 효과로부터 비롯되는, T 림프구에 대한 이의 면역억제 효과로 인해 주목을 받고 있다.
TDO, 즉, 트립토판 분해 효소(tryptophan degrading enzyme)는 면역억제 효과를 제공한다는 것으로 관찰되었다.
TDO 및 IDO 저해제는 종양 면역 거부를 촉진시키고 암 면역치료법의 효율을 개선시키기 위해 제안되었다.
IDO는 사이토솔릭 효소(cytosolic enzyme)이며, 이에 따라, IDO에 의한 트립토판 분해는 세포 내측에서 일어난다. 그러나, 트립토판이 특정 수송체를 통해 원형질막(plasma membrane)을 용이하게 가로지르기 때문에, 세포는 트립토판 싱크(tryptophan sink)로서 작용하여 종양 세포 주변의 미세 환경에서는 트립토판이 적을 수 있다. 인돌라민 2,3-다이옥시게나제(IDO)에 의해 매개된 트립토판 이화작용은 종양 미세환경에서 트립토판 고갈로 인해 종양 면역 회피에 기여하는 말초 면역 내성의 중요한 메커니즘이다. 암 세포를 표적화하는 능력을 갖고 트립토판 이화작용이 일어나는 면역조절 종양 미세 환경을 저항하는 능력을 갖는 T 세포가 제공될 수 있는 것이 유리할 것이다.
본 발명자는 T 세포가 특히, 종양 발현 IDO 또는 TDO 효소(들)에 의해 야기되는 바와 같이, 저 트립토판 조건에 대한 노출 후에 증식 저지(proliferative arrest)에 대한 내성을 제공할 수 있는 방법으로서, SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체를 과발현시키는 T 세포를 제공하는 것을 포함하는 방법을 결정하였다.
T-세포는 이의 T-세포 수용체(T-Cell Receptor: TCR) 성분을 기초로 하여 2개의 그룹으로 나누어진다. TCR 헤테로다이머는 α 및 β 사슬을 포함할 수 있다. α 및 β TCR은 항원 제시 세포 상에 MHC 분자에 의해 제시된 펩타이드를 통해 외래 항원을 인지한다. TCR 헤테로다이머는 대안적으로, γ 및 δ 사슬을 포함할 수 있다. γ 및 δ 사슬을 포함하는 TCR(γδ TCR)은 MHC 독립적이다.
표적 세포의 효과적인 사멸을 야기시키는 T 세포의 완전한 활성화는 생산적 신호 1 및 신호 2 생성을 필요로 한다. TCR/CD3 신호로부터 신호 1을 수신하면, 신호 2는 공동 자극 분자, 예를 들어, CD28에 의해 제공된다.
적합하게는, T 세포는 αβ TCR 또는 γδ TCR을 발현시키는 세포인 것으로 여겨질 수 있다. 적합하게는, T 세포는 V감마(γ)1 내지 9 및 V델타(δ)1 내지 8로부터의 임의의 감마 델타 TCR 쌍의 TCR을 발현시키는 감마 델타(γδ) T 세포일 수 있다. γδ T 세포는 Vγ9Vδ2 서브타입을 가질 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 제1 양상은 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체를 과발현시키는 T 세포를 제공한다. 대안적인 수송체는 고-친화력 글루타메이트 및 중성 아미노산 수송체 패밀리의 다른 구성원(SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7), 헤테로다이머 아미노산 수송체의 중 소단위(SLC3A1, SLC3A2), 나트륨- 및 클로라이드-의존 나트륨:신경전달물질 공수송체 패밀리의 구성원(SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20) 또는 양이온성 아미노산 수송체/당단백질-관련 패밀리의 구성원(SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3, SLC7A4, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A14)을 포함할 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 예를 들어, 문헌[Timosenko et al, "Nutritional Stress induced by tryptophan-degrading enzymes results in ATF4-dependent reprogramming of the amino acid transporter profile in tumor cells", Cancer Res. 2016 76 (21): 6193-6204]에서 논의되는 바와 같이, SLC1A5는 전장 전사체(SLC1A5 긴 (SLC1A5-L))로서 및 SLC1A5 중간 (SLC1A5-M) 및 SLC1A5 짧은 (SLC1A5-S))를 포함하는 절단된 접합 변형체로서 존재하는 것으로 알려져 있다.
적합하게는, T 세포는 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를, T 세포에서 통상적으로 관찰된 발현 수준의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배의 수준으로 발현시킬 수 있으며, 선택적으로, 여기서, 수송체는 고-친화력 글루타메이트 및 중성 아미노산 수송체 패밀리(SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7); 헤테로다이머 아미노산 수송체의 중 소단위(SLC3A1, SLC3A2); 나트륨- 및 클로라이드-의존 나트륨:신경전달물질 공수송체 패밀리의 구성원(SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20) 또는 양이온성 아미노산 수송체/당단백질-관련 패밀리의 구성원(SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3, SLC7A4, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A14)으로부터 선택된다. 변형되지 않은 T 세포에서 내인성 SLC1A5 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체의 발현 수준은 웨스턴 블롯팅 또는 유세포 분석과 같은 기술을 이용하여 결정되고 유전적으로 변형된 T 세포에서의 수준과 비교될 수 있다.
적합하게는, T 세포는 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 활성화된 T 세포에서 통상적으로 관찰된 발현 수준의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배의 수준으로 발현시킬 수 있으며, 선택적으로, 여기서, 수송체는 고-친화력 글루타메이트 및 중성 아미노산 수송체 패밀리(SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7); 헤테로다이머 아미노산 수송체의 중 소단위(SLC3A1, SLC3A2); 나트륨- 및 클로라이드-의존 나트륨:신경전달물질 공수송체 패밀리의 구성원(SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20) 또는 양이온성 아미노산 수송체/당단백질-관련 패밀리의 구성원(SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3, SLC7A4, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A14)로부터 선택된다.
적합하게는, T 세포는 감마 델타 T 세포일 수 있다. 실시형태에서, 감마 델타 T 세포는 활성화될 수 있다(즉, 이러한 것이 사이토카인을 더욱 빠르게 증식시키고 분비할 때). T 세포는 알파 베타 T 세포일 수 있다. 알파 베타 T 세포는 활성화될 수 있다. T 세포는 종양 항원에 결합할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)와 함께 SLC1A5 수송체 또는 이의 아이소폼 및/또는 글루타민 또는 트립토판 수송체를 포함하는 감마 델타 또는 알파 베타 T 세포일 수 있다. 적합하게는, CAR은 CAR의 세포외 부분이 항원에 결합할 때, 예를 들어, CD3제타 도메인으로부터 단지 신호 1 반응을 제공하거나 예를 들어, CD3제타 도메인 및 공동 자극 도메인으로부터 신호 1 및 신호 2 반응을 제공하는 CAR일 수 있다. 이러한 CAR은 알파 베타 T 세포와 함께 사용하는 데 유용할 수 있다. CAR은 공동 자극 CAR일 수 있고, 단지 WO2016/166544호에 의해 논의된 바와 같이 항원 결합에 대해 신호 2 반응을 제공할 수 있다. 예를 들어, 공동 자극 도메인을 통해 신호 2 반응만을 제공하는 CAR은 감마 델타 T 세포와 함께 사용하기 위해 유리할 수 있으며, 여기서, 신호 1은 TCR에 의해 인지된 항원에 대한 감마 델타 T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)의 결합에 의해 제공될 수 있다.
적합하게는, T 세포는 질환 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)와 함께 SLC1A5 또는 이의 아이소폼 및/또는 글루타민 또는 트립토판 수송체를 과발현시키는 알파 베타 T 세포 또는 감마 델타 T 세포일 수 있다.
적합하게는, T 세포는 V감마(γ)1 내지 9 및 V델타(δ)1 내지 8로부터의 임의의 감마 델타 TCR 쌍의 TCR을 발현시키고 질환 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)와 함께 SLC1A5, 또는 이의 아이소폼 및/또는 글루타민 또는 트립토판 수송체를 발현시키는 감마 델타(γδ) T 세포일 수 있다. γδ T 세포는 Vγ9Vδ2 서브타입일 수 있다.
감마 델타 T 세포는 글루타민 및/또는 트립토판 수송체, 예를 들어, SLC1A5 및 CAR을 포함할 수 있다. 적합하게는, CAR은 전통적인 또는 비-조정 가능 CAR(신호 1 및 신호 2를 제공할 수 있는 CAR)일 수 있다. 전통적인 CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 힌지 영역, 막관통 도메인, 하나 이상의 공동 자극 도메인(신호 2를 제공함) 및 신호 1 제공 활성화 도메인, 예를 들어, CD3 제타로 이루어진다. 실시형태에서, CAR은 (CAR에 결합 시에 단지 공동 자극 신호가 제공되도록(신호 2)(즉, 신호 1이 공동 자극-CAR의 활성화 단독을 통해 제공되지 않음)) 신호 1 제공 활성화 도메인을 포함하지 않고 단지 공동 자극 도메인을 포함하는 공동 자극 CAR일 수 있다. 이러한 실시형태에서, T 세포 상에 존재하는 제2 수용체, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR)는 신호 1 및 신호 2가 T 세포의 활성화를 허용하도록 상승작용하게 하기 위해 신호 1을 제공할 수 있다.
SLC1A5는 LAT1 수송체를 형성하기 위해 단독으로 또는 SLC7A5 및 SLC3A2와 함께 과발현되어, T 세포에 의해 트립토판의 흡수를 추가로 상향 조절할 수 있다.
적합하게는, T 세포는 SLC1A5 및/또는 글루타민 또는 트립토판 수송체를, T 세포에서 통상적으로 관찰된 발현 수준보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배 수준으로 발현할 수 있다.
적합하게는, T 세포는 SLC1A5 및/또는 글루타민 또는 트립토판 수송체를, 활성화된 T 세포에서 통상적으로 관찰되는 발현 수준에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배의 수준으로 발현할 수 있다. 과발현은 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 적합하게는, 과발현은 기능적으로, 변형된 T 세포를, 저 트립토판 미세 환경에서, 예를 들어, 일부 종양 세포에 대해 검출된 바와 같은 저 트립토판 미세 환경에서 유리하게 기능할 수 있게 한다.
트립토판 이화작용이 일어나는 저 트립토판 미세 환경에서 기능하도록 구성된 변형된 γδ T 세포는 키메라 항원 수용체를 포함할 수 있으며, 여기서, 키메라 항원 수용체는 질환 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및
(1) 적어도 하나의 공동 자극 신호전달 영역(신호 1을 제공할 수 없고 신호 2를 제공할 수 있음) 및 신호 1을 제공하지 않는 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3제타('공동 자극' 또는 '조정 가능한' CAR을 제공하기 위함), 또는
(ii) CD3 제타 활성화/신호전달 도메인(신호 1을 제공할 수 있음), 또는
(iii) 적어도 하나의 공동 자극 신호전달 영역 및 CD3 제타(신호 1 및 신호 2를 제공할 수 있는 전통적인 CAR) 활성화/신호전달 도메인을 포함한다.
적합하게는, CAR의 핵산 서열은 CD3 제타 도메인을 포함할 때, CAR은 '전통적인' 또는 '비-조절 가능한' 것으로 여겨진다. CAR이 단지 공동 자극 도메인을 함유하는 실시형태에서, 이는 '공동 자극' 또는 'TCR-조정 가능' CAR인 것으로 여겨질 수 있다.
'전통적인' 또는 '공동 자극'인, CAR을 암호화하는 핵산 서열은 질환-관련 항원 또는 종양 항원을 인지하는 단쇄 가변 단편(scFc) 또는 단백질 또는 탄수화물 또는 지질 또는 소분자를 포함할 수 있다.
CAR의 항원 결합 도메인은 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv), 나노바디, 성장 인자 서열, 가용성 인자를 기초로 한 합성 서열, 수용체 엑토-도메인에 결합하는 인자를 기초로 한 서열, 또는 상술된 바와 같은 막관통 및 공동 자극 도메인에 융합되는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인을 포함하는(그러나, 이로 제한되지 않음) 여러 형태를 가질 수 있다.
적합하게는, 질환 항원은 바이러스 항원일 수 있다.
질환 항원은 종양, 세포 감염증, 박테리아 감염증, 진균 감염증 또는 원생동물 감염증에서 발견된 세포 표면 표적 또는 항원일 수 있거나, 이러한 바이러스로부터의 활성 또는 비활성화된 바이러스 단편, 펩타이드, 단백질, 항원 세그먼트, 등일 수 있다. 세포 표면 표적은 종양-특이적 항원 및/또는 종양 관련 항원을 포함할 수 있다.
적합하게는, 세포외 항원 결합 도메인은 일부 질환화된 세포 및 또한 일부 정상 세포 상에 존재하는 임의의 다른 세포 및/또는 질환-관련 항원 상이 아닌, 종양/질환화된 질환 상에만 존재하는 종양-특이적 또는 질환-관련 항원을 인지하고 여기에 결합할 수 있다. 이러한 질환 관련 항원은 CD19, EGFR, EGFRvRIII, ErbB2, GM3, GD2, GD3, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD70, CD75, CD79b, CD33, CD138, gp100, NY-ESO-1, MICA, MICB, MART1, AFP, ROR1, ROR2, PSMA, PSCA, 돌연변이된 Ras, p53, B-Raf, c-met, VEGF, 탄산 탈수효소 IX, WT1, 암배아 항원, CA-125, MUC-1, MUC-3, 상피 종양 항원 및 MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA12, MAGEC2을 포함하는 MAGE-타입 항원, BAGE, GAGE, XAGE1B, CTAG2, CTAG1, SSX2, 또는 LAGE1 또는 바이러스 항원 또는 이들의 조합 또는 카르바밀화되고 시트루닐화된 단백질을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는 번역후 변형된 단백질을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
세포 표면 항원은 면역 체크포인트 리간드, 예를 들어, PD-L1 또는 PD-L2일 수 있다.
CAR의 막관통 도메인은 CD3 또는 CD4 또는 CD8 또는 CD28 또는 이의 부분의 막관통 도메인들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
CAR의 공동 자극 신호전달 영역은 예를 들어, CD28, CD137(4-1BB), ICOS, CD27, OX40, LFA1, PD-1, CD150, CD154, CD244, NKG2D, DNAX-활성화 단백질(DAP)-10, DAP-12, LIGHT, Fc 수용체 γ 사슬, IL-2 공통 γ 사슬, IL-12 수용체의 신호 2-제공 세포내 도메인들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 양상에 따르면, 유효량의 본 발명의 제1 양상의 T 세포의 투여를 포함하는, 암, 적합하게는, 포유동물, 바람직하게, 인간에서의 암을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제3 양상에 따르면, 암호화된 트립토판 또는 글루타민 수송체, 예를 들어, SLC1A5를 발현시킬 수 있는 핵산에 의해 T 세포를 변형시키도록 구성된 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다.
SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체의 발현을 위한 핵산 서열은 하기 구성요소를 포함할 수 있다:
T 세포가 CAR을 포함하는 실시형태에서, SLC1A5 서열, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체는 2개의 독립적 mRNA를 형성하기 위해 CAR의 프로모터와 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 적합하게는, 수송체 암호화 핵산 서열에 의해 암호화된 CAR 및 수송체의 발현은 2개의 독립적인 mRNA를 형성하기 위해 공통의 양방향 프로모터로부터의 전사에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, CAR 및 수송체 서열의 발현은 단일 프로모터로부터의 전사에 의해 및 2개의 단백질을 번역할 수 있는 단일 mRNA를 형성하기 위해 2개의 코딩 서열들 사이에 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 도입에 의해 달성될 수 있다. 적합하게는, CAR 및 수송체 서열은 공통 프로모터로부터 유래된, 단일 mRNA를 제공하는 자기-절단 T2A 절단 서열에 의해 분리되어, 2개의 단백질을 생성하기 위해 동시-번역적으로 절단될 단일 폴리펩타이드를 번역할 수 있다.
본 발명의 제4 양상에 따르면, 본 발명의 제3 양상의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체의 핵산 서열의 과발현을 허용할 수 있는 핵산을 도입하기 위한 임의의 적합한 벡터가 사용될 수 있다. 벡터 골격은 복제의 박테리아 기원(bacterial origin), 예를 들어, 예컨대, pBR322, 및 비제한적으로, 박테리아 숙주에서 플라스미드 DNA의 충분한 전파를 허용하기 위해 항생제 암피실린에 대한 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자와 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 선택적으로, 벡터는 박테리어 골격이 없는 미니서클(minicircle)의 생산을 가능하게 하기 위해 I-SceI와 같은 엔도뉴클레아제의 인지 부위와 함께 phiC31와 같은 인테그라아제의 박테리아 및 파지 부착 부위(attB 및 attP)를 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 고려되는 표적 세포, 가장 바람직하게, T 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터 서열에 연결된 SLC1A5, 또는 이의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체의 발현을 위해 암호화하는 서열을 포함할 것이다. 선택적으로, 벡터는 포유류 세포에서 양성 선택을 위한, 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있고, 또한, 비제한적으로, 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 발현의 동정을 위한 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 추가적인 리포터 및/또는 선택 유전자 발현은 개별 프로모터, 양방향 프로모터로부터 유래될 수 있거나, 자기-절단 T2A 서열의 사용에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 제5 양상에 따르면, 본 발명의 제3 양상의 핵산 또는 본 발명의 제4 양상의 벡터로 변형된 숙주 T 세포가 제공된다.
SLC1A5 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체를 암호화하는 핵산을 도입하기 위해 T 세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 당업자에게 공지된 임의의 기술을 포함할 수 있다.
적합한 방법은 바이러스, 예를 들어, 엔티바이러스/레트로바이러스/아데노바이러스로의 바이러스 형질도입, 전기천공에 의한 핵산의 세포 형질감염, 뉴클레오펙션, 지질-기반 형질감염 시약, 나노입자, 칼슘 클로라이드 기반 형질감염 방법 또는 박테리아-유래 트랜스포존, DNA 트랜스포존 또는 레트로트랜스포존, TALENS 또는 CRISPR/Cas9 기술을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
적합하게는, T 세포를 변형시키기 위해 제공된 유전 정보는 DNA(cDNA, 플라스미드, 선형, 에피소말, 미니서클), RNA 또는 시험관내 전사된(IVT) RNA의 형태를 가질 수 있다. 수송체(들) 및/또는 CAR 서열을 암호화하는 유전 정보에 추가하여, 유전 정보는 또한, 숙주 게놈 내에 유전 정보의 통합을 보조하기 위해 요구되는 단백질/효소/서열을 위해 암호화할 수 있다.
렌티바이러스/레트로바이러스/아데노바이러스가 형질도입을 위해 사용될 때, 이러한 과정을 향상시키기 위해 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 화학 시약의 포함이 이용될 수 있다. 이러한 것은 예를 들어, 헥사디메트린 브로마이드(폴리브렌), 피브로넥틴, 재조합 인간 피브로넥틴(예를 들어, RetroNectin-Takara Clontech), DEAE 덱스트란 및 TransPlus Virus Transduction 인헨서(ALSTEM Cell Advancements)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
적합하게는, 수송체 및/또는 CAR을 암호화하는 핵산의 도입은 배양 기간에 걸친 임의의 시점에서 T 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 제대혈 단핵 세포(CBMC) 또는 조직 유래 확장된 T 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 제6 양상에 따르면, 수송체를 발현시킬 수 있는 제3 양상의 핵산 또는 제4 양상의 벡터가 T 세포에 의해 발현되도록 숙주 T 세포를 배양시키는 방법이 제공된다. 선택적으로, 숙주 세포를 배양시키는 방법의 일 실시형태는 세포 배양 배지로부터 T 세포를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼 또는 글루타민 또는 트립토판 수송체를 발현시키는 종양 세포에 본 발명의 T 세포를 전달하는 방법이 제공되며, 여기서, 종양 세포 주변의 미세 환경에는 트립토판이 결여되어 있다. 적합하게는, 실시형태에서, 트립토판 결실은 숙주 동물에서 세포를 둘러싸는 통상적인 세포 미세 환경에서보다 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 적은 트립토판을 야기시킬 수 있다. 트립토판 결실을 평가하기 위하여, 적합한 수송체의 발현은 예를 들어, 유세포 분석, 웨스턴 블롯팅, 면역세포화학, qPCR, 등, 및 이들의 조합을 이용하여 모니터링될 수 있다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 치료제, 적합하게는, 항암제와 함께, 본 발명의 T 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
적합하게는, 치료제는 방사성 뉴클레오타이드, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자, 면역조절제, 면역접합체, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 효능제, 효소, 효소 저해제, 광활성 치료제, 세포독성 약물, 독소, 혈관신생 저해제, 면역-체크포인트 저해제, 치료 항체, 항체-약물 접합체(ADC) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
치료제는 세포독성 약물을 포함하는 면역접합체/ADC를 포함할 수 있다. 적합하게는, 세포독성 약물은 약물, 프로드러그, 효소, 또는 독소일 수 있다.
실시형태에서, 대상체, 적합하게는, 포유동물, 특히, 인간에서 암을 치료하는 방법은 대상체를 치료학적 유효량의 본 발명의 T 세포로 치료하는 것을 포함할 수 있다. 실시형태에서, T 세포는 T 세포의 치료학적으로 효과적인 제형에 체중 1㎏당 1×104개의 세포 내지 용량당 대상체의 체중 1㎏당 5×108개 이상의 세포의 투여량으로 제공될 수 있다.
실시형태에서, 본 방법은 T 세포의 치료학적으로 효과적인 제형을 반복적으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 치료되는 암은 신장, 뇌, 난소, 자궁경부, 폐, 방광, 식도, 대장, 피부, 흑색종, 백혈병, 골수종, 림프종, 뼈, 간세포, 자궁내막, 췌장, 자궁, 두경부, 타액선, 유방, 전립선 또는 결장암으로부터(이들로 제한되지 않음) 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 SLC1A5는 쯔비터이온성 아미노산을 선호하는 중성 아미노산 수송체를 지칭할 수 있다. 적합하게는, 이는 글루타민, 아스파라긴 및 분지쇄 및 방향족 아미노산을 포함하는 기질 중성 아미노산을 수용할 수 있다. 이는 또한, 메틸화된, 음이온성 및/또는 양이온성 아미노산을 포함할 수 있다.
SLC1A5는 또한, ASCT2 또는 ATBO로서 지칭될 수 있고, 나트륨 의존 아미노산 수송체로서 기능할 수 있다.
실시형태에서, SLC1A5는 R16, AAAT, NZA1, RDRC, ASCT-T 및 N7BS1일 수 있다. SLC1A5는 또한, 용질 캐리어 패밀리 1 멤버 5, 용질 캐리어 패밀리 1(중성 아미노산 수송체) 멤버 5, 나트륨-의존 중성 아미노산 수송체 타입 2, RD114/시미안 타입 D 레트로바이러스 수용체, 개코원숭이 M7 바이러스 수용체, ATB(0), ASCT2, M7V1, RDRC, 중성 아미노산 수송체 B(0), 중성 아미노산 수송체 B, RD114 바이러스 수용체, M7VS1, AAAT, ATBO, R16 및 RDR로서 지칭될 수 있다.
인간 SLC1A5를 위한 핵산 서열은 NIHNCBI 서열 웹사이트에서 수탁 번호 BC000062로 확인될 수 있다. 실시형태에서, 아미노산 서열은 수탁 번호 AAH00062.1에 의해 제공될 수 있다.
SLC1A5 변이체는 AAH00062.1에 의해 제공된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 인식되는 바와 같이, 이러한 변이체는 특히, 변형된 T 세포 내로의 트립토판 흡수를 향상하기 위해, 수송체로서 기능할 수 있는 단백질을 암호화해야 한다. 명시된 바와 같이, SLC1A5는 절단된 아이소폼으로 존재한다. 이에 따라, 적합하게 수송체로서 기능할 수 있는 단백질을 암호화하는 SLC1A5의 단편인 변이체가 제공된다. SLC1A5의 단편의 이러한 변이체에 의해 암호화된 적합한 N-말단 또는 C-말단 결실 단백질을 결정하기 위해 기능적 활성 스크리닝이 이용될 수 있다.
적합하게는, 인간 SLC1A5 유전자의 변이체는 다른 동물, 예를 들어, 마우스 또는 랫트, 등으로부터의 동족체에 의해 제공될 수 있다. 적합하게는, 이러한 동족체는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성의 서열 상동성을 나타낼 수 있다.
상동성은 필요한 경우에, 최대 퍼센트 상동성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에, 본원에서 논의된 바와 같이, 변이체와 SLC1A5 간에 동일한 아미노산 서열 또는 핵산 서열에서의 잔부의 백분율로서 결정된다.
정렬 및 상동성 및 서열 동일성을 수행하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, SLC1A5 변이체는 SLC1A5의 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있으며, 여기서, 변이체는 SLC1A5 수송체를 암호화하는 핵산 내에 적절한 뉴클레오타이드 변경을 도입함으로써 제공된다. 변형은 결실, 삽입, 치환, 등을 포함할 수 있다. 적합하게는, 아미노산 변경이 이루어질 수 있으며, 여기서, 아미노산 변경은 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하거나, 이는 SLC1A5 수송체의 번역후 변형 과정, 예를 들어, 그 위의 글리코실화 부위의 수 및/또는 위치를 변경시킨다.
적합하게는, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발과 같은 기술은 적합한 아미노산 치환이 이루어질 수 있는지를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 이는 치환, 결실 또는 삽입이 변이체 폴리펩타이드의 적절한 기능적 활성을 위해 제공하는 지를 결정하기 위해 기능적 스크리닝과 함께 사용될 수 있다.
변이체 폴리펩타이드는 또한, 폴리펩타이드의 C- 또는 N-말단에서 변형을 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 적합하게는, 아미노산을 암호화하는 핵산 또는 보존적 치환을 야기시키는 아미노산의 치환이 제공될 수 있으며, 여기서, 공통의 측쇄 성질을 기초로 한 유사한 아미노산, 예를 들어, 소수성, 중성, 친수성, 산성, 염기성, 사슬 배향, 또는 방향족 잔기가 보존적인 것으로 고려된다.
적합하게는, 수송체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 부위 유도 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 등에 의한 제조를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
실시형태에서, "치료학적으로 효과적인(therapeutically effective)"은 포유동물에서의 질환 또는 장애, 특히, 암을 치료하는 데 효과적인 T 세포의 양을 지칭한다. T 세포 및 암과 관련하여 "치료학적 유효" 량은 암 세포의 수를 감소시키고, 예를 들어, 종양 크기를 감소시키고/거나, 그 정도를 억제하거나 늦추고/거나, 말초 장기 내로의 암 세포 침입을 중지시키고/거나, 종양 돌연변이유발을 억제하거나, 늦추거나, 정지시키고/거나, 암의 성장을 억제하거나, 늦추거나, 정지시키고/거나, 암과 관련된 하나 이상의 증상을 억제하거나, 늦추거나, 정지시키는데 요구되는 T 세포의 수일 수 있다.
적합하게는, 치료학적 유효량의 T 세포의 투여는 성장을 예방하고/하거나 존재하는 암세포를 사멸시킬 수 있다. 암 치료법과 관련하여, 치료학적 유효량은 예를 들어, 질환 진행에 대한 시간을 평가하고/하거나 치료 반응 속도를 결정함으로써 측정될 수 있다. 적합하게는, T 세포의 제공 이외에, 추가 항암 치료가 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 조절되지 않은 세포 성장에 의해 특징된, 포유동물, 특히, 인간에서의 생리학적 질환을 지칭한다.
실시형태에서, 이는 양성, 전암성, 악성, 전이성, 비-전이성 세포를 포함할 수 있다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 적합하게는, 암은 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함하는 위암(gastric 또는 stomach cancer), 췌장암, 교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종뿐만 아니라 두경부암을 포함할 수 있다.
적합하게는, 종양 반응은 종양 모폴로지, 예를 들어, 종양 부담(tumor burden), 종양 크기, 등과 관련된 변화를 위해 또는 MRI 스캐닝, x-선 스캐닝, CT 스캐닝, 골 이미징 또는 생검 샘플링을 이용하여 평가될 수 있다.
본원에서, 단리된 핵산 분자는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 동정되고 분리된 핵산 분자일 수 있으며, 이와 함께, 이는 핵산의 천연 공급원과 일반적으로 관련이 있다. 단리된 핵산은 또한, 이러한 것이 자연에서 발견된 것과 상이한 형태 또는 셋팅된 핵산을 포함할 수 있다.
단리된 핵산은 또한, 핵산을 일반적으로 발현시키지만 세포의 상이한 위치, 예를 들어, 상이한 염색체 위치에 제공되는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 제어 서열은 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 위한 DNA 서열을 지칭한다. 적합하게는, 제어 서열은 T 세포에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 허용하기에 적합하다.
본원에서 사용되는 바와 같이 작동 가능하게 연결된 핵산은 다른 핵산 서열과 기능 관계로 놓여 있는 핵산을 기술한다. 예를 들어, 분비 리더 서열을 위한 DNA는 폴리펩타이드의 분리를 허용하는 예비-단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩타이드를 위한 DNA에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터 또는 인헨서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미친 경우에 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 추가 양상은 화학치료제, 세포독성제, 시토카인, 성장 저해제, 항호르몬제, 항혈관신생제 및 조성물의 형성하는 본 발명의 T 세포를 포함할 수 있으며, 이에 따라, 조성물의 성분들은 의도된 목적을 위해 효과적인 양과 함께 동시에, 순차적으로 또는 별도로 제공되게 한다.
실시형태에서, 본 발명의 조성물은 종양 세포가 세포 주변에 트립토판 결핍 미세 환경을 갖는 지의 여부를 결정하기 위해 대상체 또는 대상체로부터 얻어진 종양 세포를 시험한 후에 제공될 수 있다.
이에 따라, 하기 단계를 포함하는 IDO 또는 TDO를 발현시키는 종양을 치료하는 방법이 제공된다:
- 상승된 수준의 IDO 또는 TDO를 발현시키는 종양 세포를 갖는 대상체에게 본 발명의 T 세포 또는 조성물을 제공하는 단계;
- 선택적으로, 본 방법은 종양 세포에서 IDO 또는 TDO의 상승된 발현의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
추가 양상에 따르면, 독립 벡터/작제물 내에 또는 동일한 작제물 내에 함유된 표적 또는 질환 항원 및 글루타민 및/또는 트립토판 수송체에 결합 특이성을 갖는 적합한 CAR을 암호화하는 유전 정보를 도입하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체, 예를 들어, '전통적인' 또는 '공동 자극 CAR' 및 글루타민 및/또는 트립토판 수송체로부터 선택된 키메라 항원 수용체를 동시-발현시키는 방법이 제공된다. SLC1A5 서열, SLC1A5 서열의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체는 2개의 독립적인 mRNA를 형성하기 위해 CAR의 프로모터와 별도의 프로모터로부터 유래될 수 있다. CAR 및 수송체 서열의 발현은 2개의 독립적인 mRNA를 형성하기 위해 공통의 양방향 프로모터로부터의 전사에 의해 달성될 수 있다. CAR 및 수송체 서열의 발현은 2개의 단백질을 번역할 수 있는 단일 mRNA를 형성하기 위해 단일 프로모터로부터의 전사 및 2개의 코딩 서열 사이의 도입에 의해 달성될 수 있다. CAR 및 수송체 서열은 공통 프로모터로부터 유래된, 단일 mRNA를 제공하는 자기-절단 T2A 절단 서열에 의해 분리되어, 2개의 단백질을 생성시키기 위해 공동-번역으로 절단되는 단일 폴리펩타이드를 번역할 수 있다.
이에 따라, 키메라 항원 수용체 및 글루타민 및/또는 트립토판 수송체를 발현시키는 T 세포가 제공될 수 있다.
적합하게는, 저 트립토판 및/또는 글루타민 조건에서 증식할 수 있는 T 세포를 선택하는 방법이 제공된다. 선택 방법은 준최적 수준의 L-트립토판, 예를 들어, 5μM 미만의 농도의 L-트립토판을 함유한 세포 배양 성장 배지에서 SLC1A5-과발현(또는 대안적인 과발현 수송체) T 세포를 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 수송체를 발현시키는 세포는 또한, 준최적 수준의 L-글루타민, 예를 들어, 3μM 미만의 농도의 L-글루타민을 함유한, 세포 배양 성장 배지에서의 증식에 의해 농축될 수 있다. 준최적 수준의 L-트립토판 및 L-글루타민 둘 모두를 함유한 세포 배양 성장 배지가 또한, 사용될 수 있다. 대안적으로, 수송체를 발현시키는 세포는 저 트립토판 조건을 모방하기 위해, O-벤질-L-세린과 같은 SLC1A5의 저해제의 존재를 함유하는 세포 배양 성장 배지에서의 증식에 의해 농축될 수 있다. 이러한 성장 조건은 유전적으로 도입된 수송체를 발현시키는 T 세포가 세포 배양 집단 내에서 농축되고 선택되어, 변형되지 않은 T 세포의 증식에 대해 선택할 수 있는 방법을 제공한다.
실시형태에서, 키메라 항원 수용체 및 글루타민 또는 트립토판 수송체를 과발현시키는 T 세포는 저 농도의 트립토판 및/또는 저 글루타민을 함유하거나, SLC1A5의 저해제, 예를 들어, O-벤질-L-세린의 존재를 함유한 배지에서 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다.
실시형태에서, 글루타민 및/또는 트립토판 수송체에 대한 결합 특이성을 갖는 항체는 저 트립토판 및/또는 글루타민 조건에서 증식할 수 있는 T 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 적합하게는, 항체는 항-SLC1A5, 항-SLC7A5, 항-LAT1 또는 항- SLC3A2로부터 선택될 수 있다.
실시형태에서, 대상체에게 치료학적으로 투여된, 변형된 T 세포 상에서 과발현된 수송체에 대해 유도된 항체는 대상체에, 치료에 대한 역반응의 사건에서 투여된 변형된 T 세포를 고갈시키기 위한 안전 메커니즘으로서 별도로 투여될 수 있다. 이러한 항체는 변형된 T 세포를 고갈시키기 위해 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유발시킬 것이다. 이러한 치료 항체는 항-SLC1A5, 항-SLC7A5, 항-LAT1 또는 항-SLC3A2를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
본 텍스트에서 인용된 각 문헌, 참고문헌, 특허 출원 또는 특허는 이의 전문이 본원에 참고로 명백하게 포함되며, 이는 이러한 텍스트의 일부로서 독자에 의해 읽혀지고 고려되어야 함을 의미한다. 텍스트에서 인용된 문헌, 참고문헌, 특허 출원 또는 특허가 이러한 텍스트에서 반복되지 않는다는 것은 단지 간결한 이유 때문이다.
텍스트에 포함된 인용된 자료 또는 정보에 대한 언급은 자료 또는 정보가 공통의 일반적인 지식의 일부이거나, 임의의 국가에서 알려진 것이라는 양해(concession)로서 이해되어서는 안 된다.
본원에서 사용되는 단수 용어는 물품의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(예를 들어, 적어도 하나)를 지칭한다.
"약"은 일반적으로, 측정된 특성 또는 정밀성을 고려하여 측정된 양에 대한 허용 오차를 의미한다.
명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구되지 않는 한, 용어 '포함하다(comprise 또는 include)' 또는 '포함하는('comprises' 또는 'comprising', 'includes' 또는 'including')'과 같은 파생어는 기술된 정수 또는 정수의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 포함하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 각 양상의 바람직한 특징 및 실시형태는 문맥이 달리 요구하지 않는 한 필요한 부분만 약간 수정하여 다른 양상 각각에 대한 것과 같다.
본 발명의 실시형태는 첨부된 도면을 참조로 하여 단지 일례로서 기술될 것이다.
도 1은 본 발명의 제안된 핵산 작제물을 예시한 것이며, 여기서, SLC1A5 유전자는 mRNA 안정성을 위해 EF1알파 프로모터 하에서 BGH 폴리아데닐화 신호로 발현된다. pEF-DEST51 벡터(라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies))는 또한, 박테리아 숙주에서 플라스미드 DNA의 충분한 증식을 허용하기 위해 항생제 암피실린에 대한 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자(AmpR로 주석이 달림) 및 복제의 pUC 기원(pUC origin)을 함유한다.
도 2는 트립토판과 같은 아미노산의 유입을 위해 주로 세포내 글루타민의 유출물에 따르는 SLC7A5/SLC3A2(LAT1) 안티포터 착물(antiporter complex)에 대한 기질을 제공하는 나트륨 의존 방식으로 SLC1A5가 글루타민을 수송하는 변형되지 않은 T 세포, B) SLC1A5 함유 벡터로 T 세포의 형질감염 또는 형질도입에 의해 SLC1A5를 과발현시켜 SLC1A5의 발현을 야기시키고 이에 따라 세포 내에 글루타민의 흡수를 증가시키도록 조작된 변형된 T 세포를 예시한 것이다. 이는 이에 따라 트립토판의 유입/흡수를 증가시키는 SLC7A5/SLC3A2(LAT1) 안티포터에 대한 추가적인 기질(글루타민)을 제공한다.
도 3은 T 세포를 과발현시키는 SLC1A5의 제안된 작용 모드의 예시적인 예를 제공하고, (A) 세포독성 T 세포에서 세포 주기 정지, 감소된 활성화 및 아폽토시스를 야기시키는 저 트립토판 미세환경을 생성시키는 IDO+ 종양 세포를 예시한다. 종양 세포는 SLC1A5의 발현을 상향조절함으로써 저 트립토판 조건을 보상한다. (B) T 세포에 SLC1A5 과발현을 통한 종양 세포와 동일한 메커니즘을 부여함으로써, T 세포는 저 트립토판 종양 미세환경에서 기능할 수 있다.
도 4는 감마 델타 T 세포를 과발현시키는 SLC1A5 및 공동 자극 CAR의 제안된 작용 모드의 예시적인 예를 제공하고, (A) IDO+ 종양 세포가 γδ T 세포를 발현시키는 키메라 항원 수용체에서 세포 주기 정지, 감소된 활성 및 아폽토시스를 야기시키는 저 트립토판 미세환경을 형성시킴을 예시한다. 종양 세포는 보다 많은 트립토판 유입을 허용하는 SLC1A5의 발현을 상향조절함으로써 저-트립토판 조건을 보완한다. (B) 감마 델타 CAR-T 세포에 SLC1A5 과발현을 통해 종양 세포와 동일한 보완 메커니즘을 부여함으로써, 감마 델타 CAR-T 세포는 저 트립토판 종양 미세환경에서 기능할 수 있고, CAR(또는 공동 자극 CAR)을 통해 γδ TCR 및 질환 항원을 통해 포스포항원을 인지함으로써 완전 세포독성 효과기 기능을 발휘하며; CAR/SLC1A5 γδ T 세포는 세포-매개 세포독성으로 기능하고 수행할 수 있다.
도 5는 GMCSF-R 분비 신호 도메인, CD19에 대한 scFv, CD28 힌지, 막관통 및 활성화 도메인 및 CD137(4-1BB) 활성화 도메인을 포함하는 공동 자극 CAR 작제물을 예시한다. 동일한 작제물로부터의 SLC1A5 공동-발현은 SLC1A5 서열 전에 C-말단 T2A 자기-절단 펩타이드 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다.
도 6은 Vdelta2 γδ T 세포에서 SLC1A5의 형질도입 효율 및 발현 수준을 예시한 것이다. PBMC는 졸레드론산(zoledronic acid)으로의 자극 후 48시간에, SLC1A5-L(수탁 번호 NP_005619.1) 또는 SLC1A5-S(수탁 번호 NP_001138616.1) 및 GFP 서열을 지닌 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 형질도입된 세포는 추가의 16일 동안 확장되었으며, GFP-양성 세포의 백분율은 유세포 분석에 의해 측정되었다. GFP-양성 세포에 의해 측정된 형질도입 효율(%)은 16.7%(SLC1A5-S) 및 20%(SLC1A5-L)(A)이었다. 세포는 또한 고정화/투과화에 의해 SLC1A5에 대해 세포내에서 염색되었고, 유세포 분석에 의해 분석되었다. γδ T 세포 중 적어도 97%는 형질도입과 무관하게, SLC1A5를 발현시켰다(C). 그러나, SLC1A5의 발현 수준(평균 형광 세기(mean fluorescence intensity: MFI)에 의해 측정한 경우)은 형질도입되지 않은 γδ T 세포에서보다 SLC1A5-L(약 10배) 또는 SLC1A5-S(약 1.5배)로 형질도입된 γδ T 세포에서 더 높았다(B). 이러한 데이터는 SLC1A5-L 또는 SLC1A5-S로 형질도입된 γδ T 세포가 수송체의 더 높은 발현 수준을 가짐을 나타낸다.
도 7은 SLC1A5 저해제 O-벤질-L-세린(BenSer)에 대한 내성, 및 SLC1A5-L 서열을 함유한 렌티바이러스로 형질도입된 Vdelta2 γδ T 세포의 얻어진 양성 선택을 예시한 것이다. PBMC는 졸레드론산으로의 이의 자극 후 48시간에 형질도입되었다. 세포는 최대 21일 동안 BenSer를 갖거나 갖지 않는 ALys 배지에서 확장되었다. 2주 또는 3주의 확장에서의 세포는 선택적 압력 하에서 형질도입된 γδ T 세포의 생존 장점을 결정하기 위해, 생존력(요오드화프로피듐을 사용함) 또는 GFP-양성 γδ T 세포를 측정하는 유세포 분석에 의해 분석되었다. 3주의 확장 후에, BenSer의 존재 하에서, 생존력의 감소는 초기 확장 단계에서 γδ T 세포와 비교하여 형질도입되지 않은 γδ T 세포에서 확인되었다(12일에 80% 초과에서 23일에 60% 미만까지)(A). 그러나, SLC1A5-L 아이소폼으로 형질도입된 γδ T 세포는 생존력의 감소를 나타내지 않아서, BenSer에 대해 내성적이었다(A). 또한, GFP-양성 γδ T 세포의 증가는 비히클 대조군과 비교하여 BenSer의 존재 하에서 2주 또는 3주의 확장 후에 기록되었다(각각 약 17% 및 약 14% 증가(B 및 C)). 이에 따라, 이러한 것은 SLC1A5-L의 과발현이 배양 배지에서 BenSer에 대해 내성적인 γδ T 세포를 제공하는 것을 나타내며, 이는 낮은 수준의 L-트립토판을 모방한 것이다.
도 1은 본 발명의 제안된 핵산 작제물을 예시한 것이며, 여기서, SLC1A5 유전자는 mRNA 안정성을 위해 EF1알파 프로모터 하에서 BGH 폴리아데닐화 신호로 발현된다. pEF-DEST51 벡터(라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies))는 또한, 박테리아 숙주에서 플라스미드 DNA의 충분한 증식을 허용하기 위해 항생제 암피실린에 대한 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자(AmpR로 주석이 달림) 및 복제의 pUC 기원(pUC origin)을 함유한다.
도 2는 트립토판과 같은 아미노산의 유입을 위해 주로 세포내 글루타민의 유출물에 따르는 SLC7A5/SLC3A2(LAT1) 안티포터 착물(antiporter complex)에 대한 기질을 제공하는 나트륨 의존 방식으로 SLC1A5가 글루타민을 수송하는 변형되지 않은 T 세포, B) SLC1A5 함유 벡터로 T 세포의 형질감염 또는 형질도입에 의해 SLC1A5를 과발현시켜 SLC1A5의 발현을 야기시키고 이에 따라 세포 내에 글루타민의 흡수를 증가시키도록 조작된 변형된 T 세포를 예시한 것이다. 이는 이에 따라 트립토판의 유입/흡수를 증가시키는 SLC7A5/SLC3A2(LAT1) 안티포터에 대한 추가적인 기질(글루타민)을 제공한다.
도 3은 T 세포를 과발현시키는 SLC1A5의 제안된 작용 모드의 예시적인 예를 제공하고, (A) 세포독성 T 세포에서 세포 주기 정지, 감소된 활성화 및 아폽토시스를 야기시키는 저 트립토판 미세환경을 생성시키는 IDO+ 종양 세포를 예시한다. 종양 세포는 SLC1A5의 발현을 상향조절함으로써 저 트립토판 조건을 보상한다. (B) T 세포에 SLC1A5 과발현을 통한 종양 세포와 동일한 메커니즘을 부여함으로써, T 세포는 저 트립토판 종양 미세환경에서 기능할 수 있다.
도 4는 감마 델타 T 세포를 과발현시키는 SLC1A5 및 공동 자극 CAR의 제안된 작용 모드의 예시적인 예를 제공하고, (A) IDO+ 종양 세포가 γδ T 세포를 발현시키는 키메라 항원 수용체에서 세포 주기 정지, 감소된 활성 및 아폽토시스를 야기시키는 저 트립토판 미세환경을 형성시킴을 예시한다. 종양 세포는 보다 많은 트립토판 유입을 허용하는 SLC1A5의 발현을 상향조절함으로써 저-트립토판 조건을 보완한다. (B) 감마 델타 CAR-T 세포에 SLC1A5 과발현을 통해 종양 세포와 동일한 보완 메커니즘을 부여함으로써, 감마 델타 CAR-T 세포는 저 트립토판 종양 미세환경에서 기능할 수 있고, CAR(또는 공동 자극 CAR)을 통해 γδ TCR 및 질환 항원을 통해 포스포항원을 인지함으로써 완전 세포독성 효과기 기능을 발휘하며; CAR/SLC1A5 γδ T 세포는 세포-매개 세포독성으로 기능하고 수행할 수 있다.
도 5는 GMCSF-R 분비 신호 도메인, CD19에 대한 scFv, CD28 힌지, 막관통 및 활성화 도메인 및 CD137(4-1BB) 활성화 도메인을 포함하는 공동 자극 CAR 작제물을 예시한다. 동일한 작제물로부터의 SLC1A5 공동-발현은 SLC1A5 서열 전에 C-말단 T2A 자기-절단 펩타이드 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다.
도 6은 Vdelta2 γδ T 세포에서 SLC1A5의 형질도입 효율 및 발현 수준을 예시한 것이다. PBMC는 졸레드론산(zoledronic acid)으로의 자극 후 48시간에, SLC1A5-L(수탁 번호 NP_005619.1) 또는 SLC1A5-S(수탁 번호 NP_001138616.1) 및 GFP 서열을 지닌 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 형질도입된 세포는 추가의 16일 동안 확장되었으며, GFP-양성 세포의 백분율은 유세포 분석에 의해 측정되었다. GFP-양성 세포에 의해 측정된 형질도입 효율(%)은 16.7%(SLC1A5-S) 및 20%(SLC1A5-L)(A)이었다. 세포는 또한 고정화/투과화에 의해 SLC1A5에 대해 세포내에서 염색되었고, 유세포 분석에 의해 분석되었다. γδ T 세포 중 적어도 97%는 형질도입과 무관하게, SLC1A5를 발현시켰다(C). 그러나, SLC1A5의 발현 수준(평균 형광 세기(mean fluorescence intensity: MFI)에 의해 측정한 경우)은 형질도입되지 않은 γδ T 세포에서보다 SLC1A5-L(약 10배) 또는 SLC1A5-S(약 1.5배)로 형질도입된 γδ T 세포에서 더 높았다(B). 이러한 데이터는 SLC1A5-L 또는 SLC1A5-S로 형질도입된 γδ T 세포가 수송체의 더 높은 발현 수준을 가짐을 나타낸다.
도 7은 SLC1A5 저해제 O-벤질-L-세린(BenSer)에 대한 내성, 및 SLC1A5-L 서열을 함유한 렌티바이러스로 형질도입된 Vdelta2 γδ T 세포의 얻어진 양성 선택을 예시한 것이다. PBMC는 졸레드론산으로의 이의 자극 후 48시간에 형질도입되었다. 세포는 최대 21일 동안 BenSer를 갖거나 갖지 않는 ALys 배지에서 확장되었다. 2주 또는 3주의 확장에서의 세포는 선택적 압력 하에서 형질도입된 γδ T 세포의 생존 장점을 결정하기 위해, 생존력(요오드화프로피듐을 사용함) 또는 GFP-양성 γδ T 세포를 측정하는 유세포 분석에 의해 분석되었다. 3주의 확장 후에, BenSer의 존재 하에서, 생존력의 감소는 초기 확장 단계에서 γδ T 세포와 비교하여 형질도입되지 않은 γδ T 세포에서 확인되었다(12일에 80% 초과에서 23일에 60% 미만까지)(A). 그러나, SLC1A5-L 아이소폼으로 형질도입된 γδ T 세포는 생존력의 감소를 나타내지 않아서, BenSer에 대해 내성적이었다(A). 또한, GFP-양성 γδ T 세포의 증가는 비히클 대조군과 비교하여 BenSer의 존재 하에서 2주 또는 3주의 확장 후에 기록되었다(각각 약 17% 및 약 14% 증가(B 및 C)). 이에 따라, 이러한 것은 SLC1A5-L의 과발현이 배양 배지에서 BenSer에 대해 내성적인 γδ T 세포를 제공하는 것을 나타내며, 이는 낮은 수준의 L-트립토판을 모방한 것이다.
실시예
종양 세포가 또한 종양 세포 내에 글루타민 및 트립토판의 흡수를 향상시키고 종양 세포 둘레에 트립토판 고갈된 미세 환경을 야기시키는 SLC1A5 및 이의 절단된 아이소폼을 포함하는 아미노산 수송체의 발현을 조절하는, IDO 및 TDO의 발현에 의해 야기된 트립토판의 부족 또는 고갈을 보상하기 위하여, 본 발명은 이러한 낮은 트립토판 농도에서 T 세포를 증식시키기 위해 SLC1A5 및 이의 절단된 아이소폼을 포함하는 이러한 아미노산 수송체의 발현을 상향조절한 T 세포를 제공한다.
본원에서 논의된 특정 실시형태에서, SLC1A5는 T 세포에 의해 발현되고 T 세포 상에 제공된 키메라 항원 벡터 작제물과 동일한 벡터 상에 동시-발현될 수 있다.
적합하게는, SLC1A5는 프로모터 하에서 발현되거나 공통의 프로모터로부터 유래된, 단일 mRNA를 제공하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 T2A 절단 서열에 의해 키메라 항원 수용체의 발현에 연결되어, 2개의 단백질을 생성시키기 위해 동시-번역적으로 절단되는 단일 폴리펩타이드를 번역할 수 있다(도 5 참조). 본원에서 논의된 바와 같이, SLC1A5 수송체가 제공된 벡터는 게이트웨어 'DEST' 시리즈(라이프 테크놀로지즈사)로부터의 것과 같은 포유류 발현 벡터, 시스 템 바이오사시언시스사(System Biosciences)에 의해 제공된 pCDH 수트(suite)로부터의 것과 같은 렌티바이러스 벡터, 트랜스포존 벡터 또는 미니서클의 생성을 위해 적합한 벡터일 수 있다.
SLC1A5의 공발현은 하기와 같은 수 개의 장점을 제공한다:
1. 키메라 항원 수용체 및 SLC1A5를 발현시키는 형질감염된 T 세포는 저 트립토판 및/또는 글루타민 조건에서 성장 장점을 가지며, 이에 따라, 이러한 조건은 키메라 항원 수용체 및 수송체 둘 모두를 발현시키는 세포를 선택하기 위해 이용될 수 있다.
2. SLC1A5를 단독으로 또는 키메라 항원 수용체와 함께 과발현하는 T 세포는 종양 발현된 IDO 또는 TDO에 의해 야기된 저 트립토판 조건에 대한 노출 후에 증식 정지에 대해 더욱 내성적이다.
3. SLC1A5를 단독으로 또는 키메라 항원 수용체와 함께 과발현하는 T 세포는 SLC1A5 수송체에 대해 특이적인 항체의 사용에 의해 입양 세포 전달 후에 선택적으로 고갈될 수 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 저 트립토판 및/또는 글루타민 조건에서 성장 장점을 갖는 T 세포는 세포 배양 배지에서 저 농도의 글루타민 및/또는 트립토판을 사용하여 형질감염 후에 선택될 수 있다.
대안적으로, 적합한 T 세포는 예를 들어, SLC1A5 등에 결합할 수 있는 항체를 사용하여, 예를 들어, 자기 활성화된 세포 정렬(MACS) 기술, 형광-활성화된 세포 정렬(FACS) 또는 당업자에게 공지된 유사한 기술을 이용하여 긍정적으로 선택될 수 있다.
실시예
1
T 세포의 형질감염
을
허용하는 벡터의 생성
SLC1A5 긴 아이소폼을 암호화한 DNA를 attL1 재조합 부위와 attL2 재조합 부위 사이의 pDONR221 골격에서 GeneArt(라이프 테크놀로지즈사)로부터 획득하였다. 이후에, SLC1A5를 LR Clonase II 리콤비나제 반응(라이프 테크놀로지즈사)을 사용하여 다양한 게이트웨이 호환성 대상 벡터 내에 조합할 수 있다. 이러한 실시예에서, SLC1A5를 EF1알파 프로모터 및 BGH 폴리아데닐화 신호를 함유한 pEF-DEST51 내에 조합하였다(도 1 참조).
실시예
2
T 세포가
감소된
, 예를 들어, 5μM 미만
감소된
트립토판 농도로 인한 T 세포 증식성 정지를 극복하게 하는 수준에서
SLC1A5의
발현을 제공하기 위한 T 세포의 형질감염
T 세포를 뉴클레오펙션(론자사(Lonza)) 또는 Neon 전기천공 시스템(써모피셔사(Thermo Fisher)) 중 어느 하나에 의해 실시예 1에서 기술된 벡터로 전기천공하였다. 24 내지 48시간 동안 완전 배지(예를 들어, IMDM)에서 회수 후에, T 세포를 5μM 미만의 L-트립토판을 함유한 IMDM 배지에서 배양하였다.
실시예
3
렌티바이러스
시스템을 사용하여
SLC1A5
긴
아이소폼
유전자를 제공하는
실시예
실시예 1에서의 SLC1A5 긴 아이소폼 유전자를 pCDH 벡터 골격(시스템 바이오사이언시스사) 내에 클로닝하였다. HEK293T 세포를 pCDH 벡터 및 Purefection 형질감염 시약(시스템 바이오사이언시스사)을 사용하여 바이러스 생산을 위해 필요한 gag, pol, rev 및 env 유전자를 발현시키는 렌티바이러스 패키징 벡터들의 믹스로 동시-형질감염시킴으로써, 렌티바이러스 상청액을 생성하였다. 바이러스 상청액을 형질감염 후 48시간 및 72시간에 수집하고, PEG-it(시스템 바이오사이언시스사)을 이용하여 농축하였다. T 세포를 플레이팅하고, 렌티바이러스의 첨가에 의해 감염시켰다.
SLC1A5 긴 아이소폼(SLC1A5-L) 및 이의 절단된 아이소폼(SLC1A5-S)을 SLC1A5-L 또는 SLC1A5-S 서열 중 어느 하나를 함유하고, 이후에, T2A 및d GFP 서열을 함유한 렌티바이러스 시스템에 의해 γδ T 세포에서 형질도입하였다. 기능적 형질도입 효율은 GFP-양성 γδ T 세포를 기초로 하여, 16.7(SLC1A5-S) 및 20%(SLC1A5-L)이었다(도 6A 참조). 또한, 대부분의 γδ T 세포는, 이러한 것이 형질도입되거나 형질도입되지 않은 지의 여부와는 관계 없이, SLC1A5를 발현시켰다(도 6B 참조). 그러나, SLC1A5의 발현 수준은 형질도입되지 않은 γδ T 세포에서보다 형질도입된 γδ T 세포에서 10배(SLC1A5-L) 또는 1.5배(SLC1A5-S) 더 높았다(도 6C 참조).
실시예
4
트랜스포존
기반 시스템을 이용한
SLC1A5
긴
아이소폼
유전자를 제공한
실시예
실시예 1에서의 SLC1A5 긴 아이소폼 유전자를 PB51x 벡터(시스템 바이오사이언시스사) 내에 클로닝하였다. T 세포를 뉴클레오펙션(론자사) 또는 Neon 전기천공 시스템(써모피셔사) 중 어느 하나에 의해 PB51x 벡터 및 'Super' PiggyBac 트랜스포사제 발현 벡터(System Bioscience)로 동시-형질감염하였다.
실시예
5
선택
마커로서
SLC1A5의
용도 및 선택적 압력 환경을 허용하기 위해 사용될 수 있는 배지의 논의
T 세포를 SLC1A5 발현 작제물(예를 들어, 실시예 1에서)로 형질감염시키거나(실시예 2 및 실시예 4에서와 같이) 형질도입하여(실시예 3에서와 같이) SLC1A5를 과발현시켰다. SLC1A5를 발현시킬 수 있는 벡터로 T 세포의 형질감염/형질도입 이후에, T 세포는 ALyS 또는 IMDM과 같은 완전 배지에서 통상적으로 24 내지 48시간의 회수 기간이 허용되었다. 회수 기간 후에, T 세포를 5μM 미만의 L-트립토판을 함유하거나 4mM 미만의 L-글루타민을 함유한 ALyS 또는 IMDM 배지에서 배양하거나, 조건 성장의 조합을 변형되지 않은 T 세포와 비교하여 모니터링하였다.
세포 배양물 시스템에서 L-트립토판의 실제 농도가 시간에 따라 조절되지 않기 때문에, 이는 감마 델타 T 세포의 반응에 영향을 미칠 수 있다. 이에 따라, SLC1A5 O-벤질-L-세린(BenSer)의 저해제를 배양 배지 내에 첨가하여, 제어된 선택적 압력 환경을 발생시켰으며, 이는 저 L-트립토판 조건을 모방한 것이다. SLC1A5-S 또는 SLC1A5-S를 지닌 렌티바이러스 백터로 형질도입된 PBMC(졸레드론산으로 자극 후 48시간)를 BenSer를 갖거나 갖지 않는 ALys 배지에서 배양하였다. 확장 2주 또는 3주 동안에, γδ T 세포를 유세포 분석에 의해 분석하여 세포 생존력을 측정하고, GFP-양성 세포를 분석하여 선택적 압력 하에서 형질도입된 γδ T 세포의 생존 이점을 결정하였다. 확장 3주 후에, BenSer의 존재는 초기 확장 단계와 비교하여 형질도입되지 않은 γδ T 세포의 생존력을 감소시켰다(도 7A). 그러나, SLC1A5-L 아이소폼으로 형질도입된 γδ T 세포는 생존력의 감소를 나타내지 않았고, 이에 따라, BenSer에 대해 내성적이 되었다(도 7A). 또한, GFP-양성 γδ T 세포의 백분율은 비히클 대조군과 비교하여 BenSer의 존재 하에서 확장의 2주 및 3주 후에 증가하였다(각각, 대략 17% 및 14% 증가, 도 7B 및 도 7C). 이에 따라, SLC1A5-L 아이소폼의 과발현은 배양 배지에서 BenSer에 대해 내성적인 감마 델타 T 세포를 제공하며, 이는 낮은 수준의 L-트립토판을 모방한 것이다.
본 발명이 특정 실시예를 참조하여 특별히 도시되고 기술되었지만, 형태 및 세부사항의 다양한 변화가 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
Claims (26)
- SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼(isoform) 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 과발현시키도록 구성된 변형된 T 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 T 세포가 변형되지 않은 T 세포에서 관찰된 발현 수준의 적어도 2배 수준으로 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 발현시키도록 구성된, 변형된 T 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 T 세포는 변형되지 않은 활성화된 T 세포에서 관찰된 발현 수준의 적어도 2배 수준으로 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 발현시키도록 구성된, 변형된 T 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는,
(i) 감마 델타 T 세포 수용체,
(ii) 알파 베타 T 세포 수용체,
(iii) T 세포 수용체 및 적어도 하나의 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)
중 적어도 하나를 발현시키는, 변형된 T 세포. - 제4항에 있어서, 상기 T 세포는 감마 델타 T 세포 수용체 및 공동 자극 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키되, 상기 공동 자극 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 세포내 신호전달 도메인은 세포외 항원 결합 도메인에 대한 항원의 결합 후에 상기 T 세포에 공동 자극 신호(단지 신호 2)를 제공하는, 변형된 T 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 T 세포는 T 세포 수용체 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키되, 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 세포내 신호전달 도메인은 상기 항원 결합 도메인에 대한 항원의 결합 후에 상기 T 세포에 단지 신호 1 반응을 제공하는, 변형된 T 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 T 세포는 T 세포 수용체 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키되, 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 세포내 신호전달 도메인은 상기 항원 결합 도메인에 대한 항원의 결합 후에 상기 T 세포에 신호 1 반응 및 신호 2 반응(공동 자극 도메인으로부터)을 제공하는, 변형된 T 세포.
- 제5항에 있어서, 상기 T 세포는 감마 델타 T 세포 수용체 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키되, 사용 시에, 신호 1은 상기 TCR에 의해 인지된 세포 결합 표적에 대한 상기 감마 델타 T 세포 상의 상기 TCR의 제1 결합 이벤트(binding event)에 의해 제공되고, 신호 2는 상기 공동 자극 CAR의 상기 항원 결합 도메인에 대한 항원의 제2 결합 이벤트에 의해 제공되며, 제1 결합 이벤트 및 제2 결합 이벤트 둘 모두로부터의 신호 1 및 신호 2는, 조합하여, 각각 상기 T 세포를 활성화시키는, 변형된 T 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 감마 델타 T 세포 수용체를 발현시키되, 상기 감마 델타(γδ) T 세포는 Vγ9Vδ2 서브타입인, 변형된 T 세포.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, SLC1A5가 LAT1 수송체를 형성하기 위해 SLC7A5 및 SLC3A2와 함께 과발현되는, 변형된 T 세포.
- 암의 치료 방법으로서,
암의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변형된 T 세포의 투여를 포함하는, 암의 치료 방법. - 의약품에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변형된 T 세포.
- 암 또는 바이러스의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변형된 T 세포.
- 암호화된 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 발현시키기 위해 핵산에 의해 T 세포를 변형시키도록 구성된 제어 서열(control sequence)에 작동 가능하게 연결된 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 암호화하는 단리된 핵산으로서, 선택적으로, 상기 트립토판 또는 글루타민 수송체는 고-친화력 글루타메이트 및 중성 아미노산 수송체 패밀리(SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7); 헤테로다이머 아미노산 수송체의 중 소단위(heavy subunit)(SLC3A1, SLC3A2); 나트륨- 및 클로라이드-의존 나트륨:신경전달물질 공수송체 패밀리의 구성원(SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20) 또는 양이온성 아미노산 수송체/당단백질-관련 패밀리의 구성원(SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3, SLC7A4, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A14)으로부터 선택되는, 단리된 핵산.
- 제14항의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제14항의 핵산 또는 제15항의 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 숙주 T 세포.
- 제14항의 핵산 또는 제15항의 벡터에 의해 암호화된 수송체를 발현시키기 위해 T 세포를 배양하는 방법으로서, 제14항에 따른 핵산 또는 제15항에 따른 벡터를 T 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, T 세포를 배양하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 T 세포가 치료될 질환을 갖는 대상체로부터 단리된 T 세포인, T 세포를 배양하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 T 세포 및 치료제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 변형된 T 세포의 용도.
- 제20항에 있어서, 상기 질환은 암인, 약제의 제조에서의 변형된 T 세포의 용도.
- 대상체에게 변형된 T 세포를 제공하는 방법으로서,
a) 대상체로부터 단리된 T 세포 함유 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 T 세포 함유 샘플 중의 T 세포에 제14항의 핵산 또는 제15항의 벡터를 형질도입시키거나 형질감염시키는 단계; 및
c) 상기 대상체에게 단계 b)로부터의 상기 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 변형된 T 세포를 제공하는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른, SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 과발현시키도록 구성된 변형된 T 세포를 선택하는 방법으로서,
a) 5μM 미만의 농도의 L-트립토판 및 3μM 미만의 농도의 L-글루타민 중 적어도 하나를 갖는 배지에서 또는 SLC1A5의 저해제의 존재 하에서, SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체를 과발현시키도록 구성된 변형된 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 배양하는 단계로서, 선택적으로, 상기 저해제는 O-벤질-L-세린인, T 세포의 집단을 배양하는 단계; 및
b) 단계 a)에 따라 배양될 때 증식되는 변형된 T 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포를 선택하는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른, SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체를 과발현시키도록 구성된 변형된 T 세포를 선택하는 방법으로서,
a) SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체 중 적어도 하나를 발현시키는 T 세포에, SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체 중 적어도 하나에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 구성원을 제공하는 단계;
b) 선택적으로, 단계 a)에서의 상기 T 세포에 대한 상기 결합 구성원의 결합을 검출하는 단계; 및
c) 상기 결합 구성원이 결합된 상기 T 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포를 선택하는 방법. - SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체를 과발현시키도록 구성된 변형된 T 세포를 단리시키는 방법으로서,
a) T 세포를 포함하는 배양물에 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 대안적인 트립토판 또는 글루타민 수송체에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 구성원을 제공하는 단계; 및
b) 상기 결합 구성원이 결합되어 상기 배양물을 형성하는 T 세포를 단리시키는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포를 단리시키는 방법. - 제11항에 있어서, 상기 방법은 제1 시점에서 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변형된 T 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 방법은, 상기 대상체에게, 후속의 제2 시점에서 상기 대상체에 존재하는 상기 변형된 T 세포에 선택적으로 결합하고 상기 변형된 T 세포를 감소시키기 위해 상기 변형된 T 세포에 결합할 수 있는 SLC1A5, SLC1A5의 아이소폼, 또는 트립토판 또는 글루타민 수송체에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 구성원을 투여하는 단계를 더 포함하는, 암의 치료 방법.
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