BR112019010839A2 - células imunes com metabolismo modificado e uso das mesmas - Google Patents

Abstract

uma célula t modificada é descrita a qual é adaptada para superexpressar slc1a5, uma isoforma de slc1a5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina. ainda descrito é o uso de tais células t modificadas no tratamento de doenças, em particular câncer, métodos para selecionar células t modificadas que superexpressam slt1a5 e ácidos nucleicos e vetores para prover tais células t modificadas.

Description

CÉLULAS IMUNES COM METABOLISMO MODIFICADO E USO DAS MESMAS [001 ]A presente invenção refere-se a células T adaptadas para funcionar em um microambiente com baixo teor de triptofano ou sem triptofano, em particular, um ambiente no qual o catabolismo de triptofano ocorre, em que as células T foram modificadas de modo que elas expressem transportadores de aminoácidos. adequadamente transportadores de glutamina e/ou triptofano, por exemplo, SLC1A5 e suas isoformas. A presente invenção fornece ainda métodos para prover tais células T e suas utilizações.

Antecedentes da Invenção [002]A degradação do triptofano é uma estratégia de escape imune que é utilizada por muitos tumores.

[003]lndoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) e 2,3-dioxigenase de triptofano (TDO) são enzimas limitadoras de taxa da via de quinurenina, que convertem o aminoácido essencial triptofano em quinurenina.

[004] Baixas condições de triptofano, tipicamente < 5 μΜ, causadas pela atividade IDO induzem a remodelagem extensiva de células tumorais, metabolismo de aminoácidos, expressão gênica e também a regulação positiva da expressão do transportador de aminoácidos que codifica genes tais como SSLC7A11, SLC1A4 e SLC1A5, incluindo variantes de junção SLC1A5.

[005]SLC1A5 é um transportador de glutamina de alta afinidade dependente de sódio da família do veículo solute. A regulação positiva da expressão de SLC1A5 (e suas variantes de junção) melhora a captação de glutamina em células tumorais. Além de aumentar a captação de glutamina, a regulação positiva da expressão de SLC1A5 também melhora o transporte de triptofano pela melhoria da atividade do grande transportador de aminoácidos neutro (LAT1). LAT1 é uma proteína de transporte de membrana heterodimérica que transporta preferivelmente cadeia

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2/31 ramificada de transporte (valina, leucina, isoleucina) e aminoácidos aromáticos (triptofano, tirosina). Um transportador LAT1 funcional é composto de duas proteínas codificadas por dois genes distintos:

1. proteína de subunidade pesada 4F2hc/CD98 codificada pelo gene SLC3A2, e

2. proteína de subunidade leve CD98 codificada pelo gene SLC7A5.

[006]Sendo um permutador de aminoácidos obrigatório, a atividade de LAT1 depende grandemente da troca de glutamina intracelular para a captação de aminoácidos aromáticos de cadeia ramificada e aromáticos.

[007]A expressão constitutiva de IDO e TDO foi relatada em um número de cânceres humanos que levam ao catabolismo de triptofano no microambiente tumoral. A disponibilidade limitada de triptofano tem efeitos imunorreguladores profundos que levam a proliferação e funções efetoras reduzidas de células T. As células cancerosas são protegidas por este microambiente hostil pela regulação positiva de transportadores de aminoácidos que conferem às células cancerígenas uma vantagem seletiva sobre outras células no tumor.

[008]Embora tenha sido estabelecido que o catabolismo de triptofano tem efeitos imunossupressores em células T, o mecanismo pelo qual o catabolismo de triptofano influencia as células T é menos entendido.

[009]IDO tem sido o foco de atenção nos últimos anos por causa de seus efeitos imunossupressores em linfócitos T, resultante parcialmente de depleção de triptofano e parcialmente a partir de efeitos diretos de catabólitos de triptofano.

[010]TDO, a enzima de degradação de triptofano, proporciona efeitos imunossupressores.

[011]Foram sugeridos inibidores de TDO e IDO para promover a rejeição imune tumoral e melhorar a eficiência da imunoterapia do câncer.

Resumo da Invenção

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3/31 [012]ID0 é uma enzima citosólica, portanto, a degradação do triptofano por IDO ocorre dentro da célula. No entanto, à medida que o triptofano atravessa rapidamente a membrana plasmática através de transportadores específicos, as células agem como dissipadores de triptofano causando o microambiente em torno das células tumorais ser baixo em triptofano. Catabolismo de triptofano mediado por uma indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) é um mecanismo importante da tolerância imunológica periférica que contribui para a evasão imunológica tumoral devido ao esgotamento do triptofano no microambiente tumoral. Pode ser benéfico se as células T pudessem ser providas, que tem a capacidade de alvejar células cancerosas e ter a capacidade de resistir ao microambiente de tumor imunorregulador no qual ocorre catabolismo de triptofano.

[013]Os inventores determinaram um método pelo qual células T podem ser providas com resistência à interrupção proliferativa após a exposição a condições baixas de triptofano, em particular, como causado por um tumor que expressa enzima(s) IDO ou TDO, o método compreendendo fornecer uma célula T superexpressando SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina.

[014]Células T são divididas em dois grupos com base em seus componentes do Receptor de Células T (TCR). O heterodímero de TCR pode incluir uma cadeia α e β. Um TCR α e β reconhece antígenos estranhos através de peptídeos apresentados por moléculas MHC em células que apresentam antígenos. O heterodímero TCR pode alternativamente incluir uma cadeia γ e δ. TCRs que incluem cadeias γ e δ, (TCRs γδ) são independentes de MHC.

[015]A ativação completa de uma célula T que resulta na destruição efetiva de uma célula alvo requer o sinal produtivo 1 e a geração do sinal 2. Tendo recebido o sinal 1 do sinal TCR/CD3, o sinal 2 é fornecido por moléculas co-estimuladoras, por exemplo, CD28.

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4/31 [016]Adequadamente, uma célula T pode ser considerada como uma célula que expressa um TCR αβ ou um TGF γδ. Adequadamente, a célula T pode ser uma célula T gama delta (yõ) que expressa um TCR de qualquer pareamento de TCR gama delta de Vgama (y) 1 a 9 e Vdelta (δ) 1 a 8. A célula T yõ pode ser do subtipo Vy9Võ2.

[017]Consequentemente, um primeiro aspecto da presente invenção fornece uma célula T superexpressando SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina. Os transportadores alternativos podem incluir outros membros da família do transportador de glutamate de alta afinidade e do transportador de aminoácidos neutro (SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7), as subunidades pesadas de transportadores de aminoácidos heterodiméricos (SLC3A1, SLC3A2), membros da família de simporter sódio dependente de sódio e cloreto : neurotransmissores (SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20) ou membros da família associada a transportador de aminoácido catiônico / glicoproteína (SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3, SLC7A4, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A14).

[018]Como seria entendido por aqueles versados na técnica, por exemplo, como discutido em Timosenko et al, “Nutritional Stress induced by tryptophandegrading enzymes results in ATF4-dependent reprogramming of the amino acid transporter profile in tumor cells”, Cancer Res. 2016 76 (21): 6193-6204, SLC1A5 é conhecido por existir como um transcrito de comprimento total (SLC1A5 longo (SLC1A5-L)) e como variantes de junção truncados, incluindo SLC1A5 médio (SLC1A5-M) e SLC1A5 curto (SLC1A5-S)).

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5/31 [019]Adequadamente a célula T pode expressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina, opcionalmente em que o transportador é selecionado a partir de uma família do transportador de glutamate de alta afinidade e de aminoácidos neutro (SLC1A1, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7); subunidades pesadas de transportadores de aminoácidos heterodiméricos (SLC3A1, SLC3A2); um membro da família simporter de sódio dependente de sódio e cloreto : neurotransmissores (SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20) ou um membro de uma família associada ao transportador de aminoácido catiônico / glicoproteína (SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3, SLC7A4, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A14) em um nível de pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100 vezes o nível de expressão como tipicamente observado em uma célula T. Níveis de expressão de SLC1A5 ou transportadores de triptofano ou de glutamina alternativos em células T não modificadas podem ser determinados usando-se técnicas tais como western blotting ou citometria de fluxo e em comparação com os níveis em células T geneticamente modificadas.

[020]Adequadamente, a célula T pode expressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina, opcionalmente em que o transportador é selecionado a partir de uma família do transportador de glutamate de alta afinidade e de aminoácidos neutro (SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7); subunidades pesadas de transportadores de aminoácidos heterodiméricos (SLC3A1, SLC3A2); um elemento da família simporter de sódio dependente de sódio e cloro : neutransmissor (SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3,

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SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20) ou um membro de um transportador de aminoácido catiônico/família associada à glicoproteína (SLC7A1, SLC7A2, SLC7A3, SLC7A4, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A14) em um nível de pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100 vezes o nível de expressão como tipicamente observado em uma célula T ativada.

[021]Adequadamente, a célula T pode ser uma célula T gama delta. Em modalidades, as células T gama delta podem ser ativadas (isto é, quando proliferam mais rapidamente e secretam citocinas). A célula T pode ser uma célula T alfa beta. A célula T alfa beta pode ser ativada. A célula T pode ser uma T célula gama delta ou alfa beta compreendendo um transportador SLC1A5 ou uma sua isoforma do mesmo e/ou transportador de glutamina ou triptofano junto com um receptor de antígeno quimérico (CAR) capaz de ligação ao antígeno tumoral. Adequadamente, o CAR pode ser um CAR que fornece uma resposta de sinal 1 apenas, por exemplo, de um domínio CD3zeta, ou um sinal 1 e uma resposta de sinal 2 a partir de, por exemplo, um domínio CD3zeta e um domínio co-estimulador, quando a porção extracelular do CAR se liga a um antígeno. Tais CARs podem ser úteis para utilização com células T alfa beta. O CAR pode ser um CAR co-estimulador e apenas fornecer uma resposta de sinal 2 sobre a ligação de antígeno conforme discutido por WO2016/166544. Um CAR que provê apenas uma resposta de sinal 2 através de, por exemplo, um domínio co-estimulador pode ser vantajoso para uso com células T gama delta em que um sinal 1 pode ser provido pela ligação do receptor de células T (TCR) sobre a célula T gama delta para o antígeno reconhecido pelo TCR.

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7/31 [022]Adequadamente, a célula T pode ser uma célula T alfa beta ou uma célula T gama delta que superexpressa SLC1A5, ou uma isoforma da mesma e/ou um transportador de glutamina ou triptofano junto com um receptor de antígeno quimérico (CAR) que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno de doença.

[023]Adequadamente, a célula T pode ser uma célula T gama delta (yõ) que expressa um TCR de qualquer TCR gama delta de Vgama (y) 1 a 9 e Vdelta (δ) 1 a 8 e que expressa SLC1A5, ou uma isoforma da mesma e/ou um transportador de glutamina ou triptofano junto com um receptor de antígeno quimérico (CAR) que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno de doença. A célula T yõ pode ser do subtipo Vy9Võ2.

[024]As células T gama delta podem compreender um transportador de glutamina e/ou triptofano tal como SLC1A5 e um CAR. Adequadamente, o CAR pode ser um CAR clássico ou não clássico (um CAR que pode fornecer sinal 1 e sinal 2). Um CAR clássica compreendido de um domínio de ligação de antígeno extracelular, uma região de junção, um domínio transmembrana, um ou mais domínios co-estimuladores (provendo o sinal 2) e um sinal 1 que fornece o domínio de ativação, por Exemplo, CD3 zeta. Em modalidades, o CAR pode ser um coestimulador CAR, incluindo apenas domínios co-estimuladores, mas não incluindo um sinal 1 provendo domínio de ativação (tal que quando da ligação à CAR apenas um sinal co-estimulador é fornecido (sinal 2) (isto é, nenhum sinal 1 é fornecido através da ativação do co-estimulador-CAR sozinho)). Em tais modalidades, um segundo receptor presente na célula T, tal como um receptor de células T (TCR), pode fornecer o sinal 1 para permitir que o sinal 1 e o sinal 2 sinergigem para permitir a ativação da célula T.

[025]SLC1A5 pode ser superexpresso sozinho, ou em conjunto com

SLC7A5 e SLC3A2 para formar o transportador LAT1, regulação adicionalmente pela captação de triptofano pela célula T.

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8/31 [026]Adequadamente, a célula T pode expressar SLC1A5 e/ou transportador de glutamina ou triptofano em um nível de pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100 vezes o nível de expressão como tipicamente observado em uma célula T.

[027]Adequadamente, a célula T pode expressar SLC1A5 e/ou transportador de glutamina ou triptofano em um nível de pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100 vezes o nível de expressão como tipicamente observado em uma célula T ativada. A superexpressão pode ser efetuada por quaisquer meios conhecidos na técnica. Adequadamente sobre a expressão funcionalmente permite que uma célula T modificada funcione vantajosamente em um microambiente de baixo teor de triptofano, por exemplo, em um pequeno microambiente de baixo triptofano como detectado em torno de algumas células tumorais.

[028]Uma célula T yõ modificada adaptada para funcionar em um microambiente de baixo triptofano em que o catabolismo de triptofano ocorre pode compreender um receptor de antígeno quimérico em que o receptor de antígeno quimérico compreende um domínio de ligação de antígeno extracelular com especificidade de ligação a um antígeno de doença, um domínio de transmembrana, e (i) pelo menos uma região de sinalização co-estimuladora (capaz de fornecer sinal 2, mas não sinal 1) e nenhum sinal 1 provendo domínio de sinalização, por exemplo, CD3zeta (para fornecer um co-estimulador ou sintonizador CAR), ou (ii) um domínio de ativação/sinalização de CD3 zeta (capaz de fornecer o sinal 1), ou

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9/31 (iii) pelo menos uma região de sinalização co-estimuladora e um domínio de ativação/sinalização CD3 zeta (CAR clássico capaz de fornecer sinal 1 e sinal 2).

[029]Adequadamente, quando a sequência de ácido nucleico do CAR inclui o domínio CD3 zeta, o CAR é considerado clássico ou não sintonizável. Em modalidades nas quais o CAR contém apenas domínios co-estimuladores, pode ser considerado um CAR co-estimulador ou TCR-sintonizável.

[030]Uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR, clássica ou co-estimulatório pode compreender um único fragmento variável de cadeia simples (scFv) reconhecendo um antígeno associado a doença ou antígeno ou proteína ou carboidrato ou lipídeo ou molécula pequena tumoral.

[031 ]O domínio de ligação de antígeno do CAR pode assumir muitas formas, incluindo (mas não limitado a), um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado de um anticorpo, um nanocorpo, uma sequência de fator de crescimento, uma sequência sintética com base em um fator solúvel, uma sequência com base em um fator que se liga a um receptor ecto-domínio, ou o domínio extracelular de um receptor de superfície celular que é então fundido aos domínios transmembrana e co-estimuladores conforme descrito acima.

[032]Adequadamente, o antígeno de doença pode ser um antígeno viral.

[033]O antígeno de doença pode ser um alvo de superfície celular ou um antígeno encontrado em tumor, uma infecção celular, infecção bacteriana, infecção fúngica ou infecção por protozoário ou pode ser um fragmento viral ativo ou inativado, um peptídeo, uma proteína, um segmento antigênico ou similar a partir deste vírus. O alvo de superfície celular pode incluir um antígeno específico tumoral e/ou antígeno associado a tumor.

[034]Adequadamente, o domínio de ligação de antígeno extracelular pode reconhecer e se ligar a um antígeno específico de tumor ou antígeno associado a doença que está presente somente em células tumorais / células doentes e não em

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10/31 quaisquer outras células e/ou um antígeno associado com doença que esteja presente em algumas células doentes e também algumas células normais. Tais antígenos associados à doença podem incluir, mas não estão limitados a, CD19, EGFR, EGFRvRIH, ErbB2, GM3, GD2, GD3, CD20, CD22, CD30, CD37, CD38, CD70, CD75, CD79b, CD33, CD138, gp100, NY-ESO-1, MICA, MICB, MARTI, AFP, ROR1, ROR2, PSMA, PSCA, Ras mutada, p53, B-Raf, c-met, VEGF, anidrase carbônica IX, WT1, antígeno carcinoembriônico, CA-125, MUC-1, MUC-3, antígeno de tumor epitelial e um antígeno tipo MAGE incluindo MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA12, MAGEC2, BAGE, GAGE, XAGE1B, CTAG2, CTAG1, SSX2, ou LAGE1 ou antígenos virais ou combinações dos mesmos ou pós-proteínas modificadas translacionalmente que podem incluir, mas não estão limitadas a, proteínas carbamiladas e citroniladas.

[035]O antígeno de superfície celular pode ser um ligante de ponto de controle imune, por exemplo, PD-L1 ou PD-L2.

[036]O domínio transmembrana de um CAR pode compreender um ou mais dos domínios transmembrana de CD3 ou CD4 ou CD8 ou CD28 ou partes dos mesmos.

[037]A região de sinalização co-estimuladora do CAR pode compreender, por exemplo, um ou mais dos domínios intracelulares provedores de sinal 2 de CD28, CD137 (4-1 BB), ICOS, CD27, 0X40, LFA1, PD-1, CD150, CD154, CD244, NKG2D, proteína ativadora DNAX (DAP)-10, DAP-12, LIGHT, cadeia γ do receptor Fc, cadeia γ comum IL-2, receptor IL-12.

[038]De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de câncer, adequadamente um câncer em um mamífero, preferivelmente, um humano, o método compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de uma célula T do primeiro aspecto da invenção.

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11/31 [039]De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina operacionalmente ligado a sequências de controle adaptadas para permitir uma célula T transformada pelo ácido nucleico ser capaz de expressar o transportador de triptofano ou glutamina codificado, por exemplo, SLC1A5.

[040]A sequência de ácido nucleico para a expressão do SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina pode compreender os seguintes elementos;

[041] um promotor, por exemplo, mas não limitado a CMV, EF1a, MSCV, PGK, CAG, IRES ou UBC [042] a sequência de ácido nucleico de SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina, incluindo adequadamente uma sequência de Kozak N-terminal [043] uma sequência de junção/poliadenilação de RNA, por exemplo, mas não limitada a BGH ou SV40.

[044]Em modalidades em que a célula T compreende um CAR, a sequência SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina pode ser operacionalmente ligada a um promotor separado a partir daquele do CAR para produzir dois mRNAs independentes. Adequadamente, a expressão do CAR e do transportador codificado pelo transportador que codifica a sequência de ácido nucleico pode ser obtida pela transcrição de um promotor bidirecional comum para produzir dois mRNAs independentes. Alternativamente, a expressão do CAR e da sequência transportadora pode ser obtida por transcrição a partir de um promotor simples e por incorporação de um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) entre as duas sequências de codificação para produzir um único mRNA capaz de traduzir duas proteínas. Adequadamente, a sequência de CAR e transportadora pode ser

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12/31 separada por uma sequência de divagem de T2A auto-clivante que fornece um único mRNA, acionado a partir de um promotor comum, traduzindo um único polipeptídeo que será co-traducionalmente clivado para gerar duas proteínas.

[045]De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é provido um vetor que compreende um ácido nucleico do terceiro aspecto da invenção.

[046]Qualquer vetor adequado para introduzir ácido nucleico que pode permitir a superexpressão da sequência de ácido nucleico de SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina podem ser usados. A cadeia principal do vetor pode conter uma origem bacteriana de replicação tal como, por exemplo, pBR322 e um marcador selecionável que confere resistência a antibiótico, tal como, mas não limitado ao gene beta-lactamase conferindo resistência ao antibiótico ampicilina para permitir propagação suficiente do DNA plasmídeo em um hospedeiro bacteriano. Opcionalmente, o vetor pode incluir os sítios de ligação bacteriano e de fagos (attB e attP) de uma integrase tal como philC31 em combinação com os sítios de reconhecimento de uma endonuclease tal como l-Scel para permitir a produção de minicírculos desprovidos da cadeia principal bacteriana. O vetor também incluirá uma sequência que codifica a expressão de SLC1A5, ou uma sua isoforma, ou um transportador de triptofano ou glutamina alternativo ligado a uma sequência promotora adequada para expressão na célula alvo de interesse, mais preferivelmente uma célula T. Opcionalmente, o vetor pode incluir um gene de resistência a antibiótico, para seleção positiva em células de mamíferos e também pode incluir um gene repórter para identificação de expressão tal como, mas não limitado a, proteína de fluorescência verde (GFP). A expressão de repórter e/ou gene de seleção pode ser direcionada a partir de promotores individuais, um promotor bidirecional ou obtido pelo uso de uma sequência de IRES ou de auto-clivagem de T2A.

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13/31 [047]De acordo com um quinto aspecto da presente invenção é fornecida uma célula T hospedeira transformada com o ácido nucleico do terceiro aspecto ou vetor do quarto aspecto da presente invenção.

[048]O método de modificação genética de uma célula T para incorporar o ácido nucleico codificando SLC1A5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina pode incluir qualquer técnica conhecida por aqueles versados na técnica.

[049]As metodologias adequadas incluem, mas não estão limitadas a, transdução viral com vírus, por exemplo, lentivírus/retrovírus/adenovírus, transfecção celular de ácidos nucleicos por eletroporação, nucleofecção, reagentes de transfecção baseados em lipídeo, nanoparticulas, métodos de transfecção baseados em cloreto de cálcio ou transposons derivados de bactérias, transposons de DNA ou retrotransposons, tecnologias TALENS ou CRISPR/Cas9.

[050]Adequadamente, a informação genética fornecida para modificar a célula T pode tomar a forma de DNA (cDNA, plasmídio, linear, episômico, minicírculo), RNA ou RNA transcrito in vitro (IVT). Além das informações genéticas que codificam o(s) transportador(s) e/ou as sequências CAR, a informação genética pode também codificar proteínas/enzimas/sequências necessárias para auxiliar a integração da informação genética no genoma hospedeiro.

[051]Quando lentivírus/retrovírus/adenovírus são empregados para transdução, inclusão de reagentes químicos como seria entendido por aqueles versados na técnica para melhorar este processo pode ser usada. Estes incluem, por exemplo, mas não estão limitados a, brometo de hexadimetrina (polibreno), fibronectina, fibronectina humana recombinante (tal como RetroNectin-Takara Clontech), dextran DEAE e Aumentador de Transdução de Vírus de TransPlus (ALSTEM Cell Advancements).

[052]Adequadamente, a incorporação de ácidos nucleicos que codificam um transportador e/ou um CAR pode ser introduzida em células T, células

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14/31 mononucleares de sangue periférico (PBMCs), células mononucleares de sangue umbilical (CBMCs) ou células T expandidas derivadas de tecido em qualquer ponto de tempo durante o período de cultura.

[053]De acordo com um sexto aspecto da presente invenção, é provido um método de cultivo de células T hospedeiras, de modo que o ácido nucleico do terceiro aspecto ou do vetor do quarto aspecto capaz de expressar o transportador é expresso pela célula T. Opcionalmente, uma modalidade do método de cultura de uma célula hospedeira compreende ainda a recuperação da célula T do meio de cultura celular.

[054]De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método de distribuição de uma célula T da presente invenção a uma célula tumoral que expressa SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de glutamina ou triptofano em que o microambiente em torno da célula tumoral é esgotada de triptofano. Adequadamente em modalidades, o esgotamento de triptofano pode causar pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco vezes menos triptofano que em um microambiente celular típico que circunda uma célula no animal hospedeiro. Para avaliar a depleção de triptofano, a expressão de um transportador adequado pode ser monitorada utilizando-se, por exemplo, a citometria de fluxo, western blotting, imunocitoquímica, qPCR ou semelhantes e suas combinações.

[055]De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é fornecida uma composição que compreende uma célula T da presente invenção junto com um agente terapêutico, adequadamente um agente anticancerígeno.

[056]Adequadamente, o agente terapêutico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de átomos de radionucleotídeo, boro, gadolínio ou urânio, um imunomodulador, um imunoconjugado, uma citocina, um hormônio, um agonista hormonal, uma enzima, um inibidor de enzima, um agente terapêutico fotoativo, um

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15/31 fármaco citotóxico, uma toxina, um inibidor de angiogênese, inibidor de checkpoint imune, um anticorpo terapêutico, conjugado anticorpo-fármaco (ADC) ou uma combinação dos mesmos.

[057]O agente terapêutico pode compreender um imunoconjugado/ADC compreendendo um fármaco citotóxico. Adequadamente, o fármaco citotóxico pode ser um fármaco, um pró-fármaco, uma enzima ou uma toxina.

[058]Em modalidades, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo, adequadamente um mamífero, particularmente um humano, pode compreender o tratamento do indivíduo com uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma célula T da presente invenção. Em modalidades, a célula T pode ser provida em uma formulação terapeuticamente efetiva de células T em uma dosagem de 1x10⁴ células por kg de peso corporal, a mais de 5x10⁸ células por kg de peso corporal do indivíduo por dose.

[059]Em modalidades, o método pode compreender a administração repetida de uma formulação terapeuticamente efetiva de células T.

[060]Em modalidades, o câncer a ser tratado pode ser selecionado a partir de (mas não limitado a) câncer renal, cérebro, de ovário, cervical, pulmão, bexiga, esofágico, coloretal, pele, melanoma, leucemia, mieloma, linfoma, osso, hepatocelular, endometrial, pancreático, uterine, cabeça e pescoço, glândula salivar, mama, próstata ou de cólon.

[061]Como aqui usado, o termo SLC1A5 pode se referir a um transportador de aminoácidos neutro com uma preferência para aminoácidos zwitteriônicos. Adequadamente, ele pode aceitar um aminoácido neutro de substrato incluindo glutamina, asparagina e aminoácidos aromáticos e de cadeia ramificada. Pode também incluir aminoácidos metilados, aniônicos e/ou catiônicos.

[062]SLC1A5 pode também ser referido como ASCT2 ou ATBO e pode funcionar como um transportador de aminoácido dependente de sódio.

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16/31 [063]Nas modalidades SLC1A5 pode ser R16, AAAT, NZA1, RDRC, ASCT-T e N7BS1.SLC1A5 também podem ser referidos como Família do Veículo Soluto 1 Membro 5, Família do Veículo Soluto 1 (Transportador de aminoácidos Neutro) Membro 5, Transportador de Aminoácidos Neutro Dependente de Sódio do Tipo 2, Receptor de Retrovirus do Tipo D RD114/Símio, Receptor de vírus de M7 Babuíno, ATB(O), ASCT2, M7V1, RDRC, Transportador de Aminoácido Neutro B (0), Transportador de Aminoácido Neutro B, Receptor de Vírus RD114, M7VS1, AAAT, ATBO, R16 e RDR.

[064]Uma sequência de ácido nucleico para o SLC1A5 humana pode ser encontrada em websites de sequências NIHNCBI sob o número de acesso BC000062. Em modalidades, uma sequência de aminoácidos pode ser fornecida pelo número de acesso AAH00062.1.

[065]Uma variante SLC1A5 pode ter pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência para a sequência fornecida pela AAH00062.1. Como será apreciado, tal variante deve codificar uma proteína que pode funcionar como um transportador, em particular para aumentar a captação de triptofano em uma célula T modificada. Como indicado, o SLC1A5 existe em isoformas truncadas. Consequentemente, variantes que são fragmentos de SLC1A5 que podem codificar adequadamente uma proteína que pode funcionar como transportador são fornecidas. A triagem de atividade funcional pode ser utilizada para determinar as proteínas de deleção N-terminais ou C-terminais apropriadas codificadas por tais variantes de fragmentos de SLC1A5.

[066]Adequadamente, uma variante do gene SLC1A5 humano pode ser provida por um homólogo de outro animal, por exemplo, camundongo ou rato ou semelhantes. Adequadamente tais homólogos podem apresentar uma homologia de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos

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95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[067]Homologia é determinada como uma porcentagem de resíduos na sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico que são idênticas entre a variante e SLC1A5 conforme discutido aqui depois de alinhar as sequências e introduzir intervalos, se necessário, para obter a homologia percentual máxima.

[068]Métodos de, e programas de computador para alinhamento e realização de homologia e identidade de sequência são bem conhecidos na técnica.

[069]Como usado aqui, uma variante SLC1A5 pode incluir modificações de sequência de aminoácidos de SLC1A5 em que as variantes são proporcionadas pela introdução de alterações de nucleotídeos apropriadas no ácido nucleico que codifica o transportador SLC1A5. As modificações podem incluir deleções, inserções, substituições ou semelhantes. Adequadamente, mudanças de aminoácidos podem ser feitas em que as alterações de aminoácidos incluem deleção, inserção e/ou substituição ou que alteram os processos de modificação pós-traducionais do transportador de SLC1A5, por exemplo, o número e/ou posição de sítios de glicosilação no mesmo.

[070]Adequadamente, técnicas tais como mutagênese de varredura de alanina podem ser usadas para determinar onde substituições adequadas de aminoácidos podem ser feitas. Isto pode ser usado em combinação com a triagem funcional para determinar onde as substituições, deleções ou inserções proporcionam atividade funcional apropriada dos polipeptídeos variantes.

[071 ]Os polipeptídeos variantes também podem incluir modificações no terminal C ou N do polipeptídeo. Como seria conhecido na técnica, as substituições adequadas de ácidos nucleicos que codificam aminoácidos ou de aminoácidos que resultam em substituições conservativas, em que aminoácidos similares baseados em propriedades de cadeia lateral comuns, por exemplo, hidrofóbicos, neutros,

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18/31 hidrofílicos, os resíduos ácidos, básicos, de orientação de cadeia, ou aromáticos são considerados como sendo conservados, podem ser providos.

[072]Adequadamente, moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequência de aminoácidos de um transportador podem ser preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos podem incluir, mas não estão limitados a, preparação por mutagênese direcionada ao sítio, mutagênese de PCR, mutagênese de cassete ou semelhantes.

[073]Em modalidades terapeuticamente efetiva refere-se a uma quantidade de célula T efetiva para tratar uma doença ou distúrbio em um mamífero, em particular, câncer. Uma quantidade terapeuticamente efetiva em relação a células T e câncer pode ser o número de células T necessárias para reduzir o número de células cancerosas, por exemplo, reduzir o tamanho do tumor, inibir ou retardar a extensão ou parada da infiltração da célula cancerosa em órgãos periféricos, inibição, lenta ou parada de metástase de tumor, inibir, retardar ou parar o crescimento de câncer e/ou inibir, retardar ou parar um ou mais sintomas associados com o câncer.

[074]Adequadamente, a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T pode prevenir o crescimento e/ou matar células cancerosas existentes. Em relação à terapia de câncer, uma quantidade terapeuticamente efetiva pode, por exemplo, ser medida por avaliação do tempo para a progressão da doença e/ou determinação das taxas de resposta do tratamento. Adequadamente, além da provisão de células T, podem ainda ser providos tratamentos anticancerígenos.

[075] O termo câncer, conforme aqui usado, refere-se a uma condição fisiológica em mamíferos, particularmente humanos, caracterizada por crescimento celular não-regulado.

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19/31 [076]Em modalidades, isto pode incluir células benignas, pré-cancerosas, malignas, metastáticas, não metastáticas. Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfóides. Adequadamente, os cânceres podem incluir cânceres de células escamosas, câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estômago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterine, carcinoma salivar, câncer de rim ou renal, câncer da próstata, câncer vulval, câncer da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano bem como câncer de cabeça e pescoço.

[077]Adequadamente, a resposta tumoral pode ser avaliada para mudanças na morfologia do tumor, por exemplo, em relação à carga tumoral, tamanho de tumor e semelhantes ou usando varredura de MRI, varredura de raios-x, varredura CT, formação de imagem óssea ou amostragem de biópsia.

[078]Aqui, uma molécula de ácido nucléico isolada pode ser uma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminada com a qual é comumente associada com a fonte natural do ácido nucléico. Os ácidos nucleicos isolados também podem incluir ácidos nucleicos que estão em uma forma ou ajuste diferente dos quais são encontrados na natureza.

[079]O ácido nucléico isolado também inclui uma molécula de ácido nucléico contida em uma célula que expressa comumente o ácido nucléico, mas que é provido em um local diferente na célula, por exemplo, um local cromossômico diferente. As sequências de controle, conforme aqui usadas, referem-se a

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20/31 sequências de DNA para a expressão de uma sequência de codificação operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro. Adequadamente, as sequências de controle são adequadas para permitir a expressão de uma sequência de codificação operacionalmente ligada em uma célula T.

[080]Ácido nucleico que é operacionalmente ligado conforme aqui usado descreve um ácido nucleico que é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma sequência líder secretória é operacionalmente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que permite a secreção do polipeptídeo. Um promotor ou intensificador é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se ela afeta a transcrição da sequência de codificação.

[081 ]Um aspecto adicional da presente invenção pode compreender um agente quimioterapêutico, um agente citotóxico, uma citocina, um agente inibidor de crescimento, um agente anti-hormonal, agente antiangiogênico e uma célula T da presente invenção, formando uma composição, de modo que os componentes da composição são providos simultaneamente, sequencialmente ou separadamente em combinação com as quantidades efetivas para o propósito pretendido.

[082]Em modalidades, uma composição da presente invenção pode ser provida seguindo-se o teste do paciente ou de uma célula tumoral obtida a partir de um indivíduo para determinar se a célula tumoral tem um microambiente esgotado de triptofano em torno da célula.

[083]Consequentemente, é provido um método para tratar tumores que expressam IDO ou TDO compreendendo as etapas de

- prover uma célula T ou composição da presente invenção a um paciente com uma célula tumoral que expressa um nível elevado de IDO ou TDO,

- opcionalmente, o método pode compreender a etapa de detecção da presença de expressão elevada de IDO ou TDO em uma célula tumoral.

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21/31 [084]De acordo com um aspecto adicional, é provido um método de coexpressar um receptor de antígeno quimérico, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico selecionado de um clássico ou co-estimulador CAR e um transportador de glutamina e/ou triptofano que compreende as etapas de introduzir informação genética que codifica um CAR adequado com especificidade de ligação a um antígeno alvo ou de doença e um transportador de glutamina e/ou triptofano contido dentro de vetores/construções independentes ou dentro da mesma construção. A sequência SLC1A5, uma isoforma da sequência SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina pode ser acionado a partir de um promotor separado a partir daquele do CAR para produzir dois mRNAs independentes. A expressão do CAR e da sequência transportadora pode ser obtida pela transcrição de um comum, promotor bi-direcional para produzir dois mRNAs independentes. A expressão do CAR e da sequência transportadora pode ser obtida pela transcrição de um único promotor e incorporação de um IRES entre as duas sequências codificantes para produzir um único mRNA capaz de traduzir duas proteínas. A sequência CAR e transportadora pode ser separada por uma sequência de divagem T2A auto-clivante fornecendo um único mRNA, acionado a partir de um promotor comum, tradução de um único polipeptídeo que será co-traducionalmente clivado para gerar duas proteínas.

[085]Consequentemente, uma célula T que expressa um receptor de antígeno quimérico e um transportador de glutamina e/ou triptofano pode ser provida.

[086]Adequadamente, é provido um método para selecionar uma célula T que é capaz de proliferar em baixas condições de triptofano e/ou glutamina. O método de seleção pode compreender as etapas de crescimento do SLC1 A5-sobreexpressão (ou transportador de sobre-expressão alternativa) de células T em meio de crescimento de cultura celular que contém níveis sub-ótimos de L-triptofano, por

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22/31 exemplo, concentrações de L-triptofano de menos de 5 μΜ. As células que expressam um transportador adequado podem também ser enriquecidas por propagação em meio de crescimento de cultura celular, que contém níveis subótimos de L-glutamina, por exemplo, concentrações de L-glutamina menores do que 3 μΜ. Meios de crescimento de cultura celular também podem ser usados, o qual contém níveis sub-ótimos de L-triptofano e L-glutamina. Alternativamente, as células que expressam o transportador podem ser enriquecidas por propagação em meio de crescimento de cultura celular que contém a presença de um inibidor de SLC1A5, tal como O-Benzil-L-Serina, para imitar condições baixas de triptofano. Tais condições de crescimento proporcionam um método pelo qual células T que expressam o transportador geneticamente introduzido podem ser enriquecidas e selecionadas para dentro da população de cultura celular, assim, a seleção contra a proliferação de células T não modificadas.

[087]Em modalidades, uma célula T que superexpressa um receptor de antígeno quimérico e um transportador de glutamina ou triptofano pode ser selecionado por cultivo das células em meio contendo baixas concentrações de triptofano e/ou glutamina baixa, ou a presença de um inibidor de SLC1A5, tal como O-Benzil-L-Serina.

[088]Em modalidades, um anticorpo com especificidade de ligação a um transportador de glutamina e/ou triptofano pode ser usado para selecionar células T que são capazes de proliferar em baixas condições de triptofano e/ou glutamina. Adequadamente, um anticorpo pode ser selecionado a partir de anti-SLC1A5, antiSLC7A5, anti-LAT1 ou anti-SLC3A2.

[089]Em modalidades, um anticorpo dirigido contra um transportador superexpresso em uma célula T modificada, que é administrada terapeuticamente a um indivíduo, pode ser administrado separadamente ao paciente como um mecanismo de segurança para esgotar as células T modificadas administradas no

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23/31 evento de uma reação adversa ao tratamento. Tais anticorpos podem instigar a citotoxidade celular dependente de anticorpos (ADCC) para esgotar as células T modificadas. Tais anticorpos terapêuticos podem incluir, mas não estão limitados a, anti-SLC1A5, anti-SLC7A5, anti-LAT1 Ou anti-SLC3A2.

[090]Cada documento, referência, pedido de patente ou patente citada neste texto é expressamente incorporado aqui em sua totalidade por referência, que significa que ela deve ser lida e considerada pelo leitor como parte deste texto. Tal documento, referência, pedido de patente ou patente citada no texto não é repetida neste texto por motivos de concisão.

[091]Referência a material citado ou informação contida no texto não deve ser entendida como uma concessão de que o material ou informação foi parte do conhecimento geral comum ou foi conhecido em qualquer país.

[092]Conforme usado no presente documento, os artigos um e uma refere-se a um ou mais a mais de um (por exemplo, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo.

[093]Cerca deve-se geralmente significar um grau aceitável de erro para a quantidade medida dada a natureza ou precisão das medições.

[094]Em todo o relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, os termos compreende ou inclui, ou variações tais como compreende ou compreendendo, inclui ou incluindo deve-se entender que implica na inclusão de um número inteiro especificado ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[095]Aspectos e modalidades preferidas de cada aspecto da invenção são como para cada um dos outros aspectos mutatis mutandis, a menos que o contexto exija de outra forma.

[096]As modalidades da presente invenção serão agora descritas a título de exemplo apenas com referência às figuras em anexo nas quais :

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24/31 [097]Figura 1 - ilustra uma construção de ácido nucleico proposta da invenção em que o gene SLC1A5 é expresso sob um promotor EFIalfa com um sinal BGH de poliadenilação para estabilidade do mRNA. O vetor pEF-DEST51 (Life Technologies ) contém também uma origem de replicação de pUC e o gene de betalactamase (anotado AmpR) conferindo resistência à ampicilina antibiótica para permitir propagação suficiente do DNA plasmídeo em um hospedeiro bacteriano.

[098]Figura 2 ilustra A) uma célula T não modificada na qual SLC1A5 transporta glutamina de uma maneira dependente de sódio que provê substrato para complexo antiporter SLC7A5/SLC3A2 (LAT1) que depende grandemente do efluxo da glutamina intracelular para a importação de aminoácidos tal como triptofano. B) uma célula T modificada que é construída para superexpressar SLC1A5 por meio de transfecção ou transdução da célula T com um vetor contendo SLC1A5, causando a expressão de SLC1A5 e assim aumentar a captação de glutamina para o interior da célula. Isto proporciona um substrato adicional (glutamina) para o complexo antiporter de SLC7A5/SLC3A2 (LAT1), aumentando assim a importação/captação de triptofano.

[099]Figura 3 proporciona um exemplo ilustrativo do modo proposto de ação de cCélulas T que superexpressam SLC1A5 e ilustra (A) Células de tumor IDO+ que criam um microambiente de baixo triptofano que causa a interrupção do ciclo celular, a ativação diminuída e a apoptose em células T citotóxicas. As células tumorais compensam as baixas condições de triptofano pela regulação positiva da expressão de SLC1A5. (B) Por equiparação da célula T com o mesmo mecanismo de compensação como a célula tumoral através da superexpressão de SLC1A5, a célula T é capaz de funcionar no microambiente de tumor de baixo teor de triptofano.

[0100]Figura 4 proporciona um exemplo ilustrativo do modo proposto de ação de SLC1A5 e co-estimulador CAR que superexpressa células T gama delta e ilustra (A) células de tumor IDO+ criam um microambiente de baixo teor de triptofano

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25/31 que causa a interrupção do ciclo celular, ativação diminuída e apoptose em receptor de antígeno quimérico que expressa células T yõ. As células tumorais compensam as condições baixas de triptofano pela regulação positiva da expressão de SLC1A5 que permite uma maior importância do triptofano. (B) Ao equiparar a célula gama delta CAR-T com o mesmo mecanismo de compensação como a célula tumoral através da superexpressão de SLC1A5, a célula gama delta CAR-T é capaz de funcionar no microambiente de tumor de baixo teor de triptofano, e elicitar função efetora citotóxica completa pelo reconhecimento de fosfoantígenos através do TCR yõ e do antígeno de doença através da CAR (ou co-estimulador CAR); a célula T CAR/SLC1A5 yõ é capaz de funcionar e realizar a citotoxicidade mediada por células.

[0101 ]Figura 5. Ilustra a construção co-estimuladora CAR que compreende o domínio de sinal de secreção de GMCSF-R, scFv contra CD19, CD28 juncional, domínios transmembrana e ativação e domínio de ativação de CD137 (4-1 BB). A coexpressão SLC1A5 a partir da mesma construção pode ser obtida por um peptídeo de auto-clivagem T2A de C-terminal ou um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) antes da sequência de SLC1A5.

[0102]Figura 6 ilustra a eficiência de transdução e os níveis de expressão de SLC1A5 em células T Vdelta2 yõ. PBMCs foram transduzidas com vetores lentivírus que carregam SLC1A5-L (acesso #NP_005619.1) ou SLC1A5-S (acesso #NP_001138616.1) e sequências de GFP, 48 horas após a sua estimulação com ácido zoledrônico. As células transduzidas foram expandidas por mais 16 dias e a porcentagem de células GFP-positivas foi medida por citometria de fluxo. Eficiência de transdução medida por células GFP-positivas (%) foi 16,7% (SLC1A5-S) e 20% (SLC1A5-L) (A). As células foram também coradas intracelularmente para SLC1A5 por fixação/permeabilização e analisadas por citometria de fluxo. Pelo menos 97% das células T yõ expressaram SLC1A5, independente da transdução (C). Entretanto,

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26/31 os níveis de expressão de SLC1A5 (medidos pela média de intensidade de fluorescência, MFI) foram maiores em células T yõ transduzidas com SLC1A5-L 10 vezes) ) ou SLC1A5-S (~ 1,5 vezes) ) do que em células T γδ não transduzidas (B). Estes dados demonstram que as células T yõ transduzidas com SLC1A5-L ou SLC1A5-S têm níveis de expressão mais altos do transportador.

[0103]Figura 7 ilustra a resistência ao inibidor de SLC1A5 O-Benzil-L-Serina (BenSer) e a seleção positiva resultante de células T Vdelta2 yõ transduzidas com lentivírus contendo a sequência SLC1A5-L. PBMCs foram transduzidas, 48 horas após sua estimulação com ácido zoledrônico. As células foram expandidas em meio ALys com ou sem BenSer por até 21 dias. Células em duas ou três semanas de expansão foram analisadas por citometria de fluxo medindo a viabilidade (usando iodeto de propídio) ou células T yõ positivas de GFP-positivas, para determinar a vantagem de sobrevivência de células T yõ transduzidas sob pressão seletiva. Após três semanas de expansão, na presença de BenSer, uma redução da viabilidade foi encontrada em células T yõ não transduzidas em comparação com as células T yõ em estágios iniciais de expansão (de acima de 80% no dia 12 a abaixo de 60% no dia 23) (A). Entretanto, as células T yõ transduzidas com a isoforma SLC1A5-L não apresentaram redução na viabilidade, tornando-se resistente ao BenSer, (A). Além disso, um aumento nas células T γδ GFP-positivas foi registrada depois de duas ou três semanas de expansão na presença de BenSer, em comparação com o controle veículo (-17% e -14% de aumento, respectivamente, B e C). Portanto, estes demonstram que a superexpressão de SLC1A5-L torna células T γδ resistentes ao BenSer em meio de cultura, que imita baixos níveis de L-triptofano.

Exemplos [0104]A fim de compensar uma falta ou esgotamento de triptofano causado pela expressão de IDO e TDO em que as células tumorais regulam a expressão de transportadores de aminoácidos incluindo SLC1A5 e suas isoformas truncadas que,

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27/31 por sua vez, intensificam a captação de glutamina e triptofano na célula tumoral e causam um microambiente esgotado de triptofano em torno da célula tumoral, a presente invenção proporciona células T que têm a expressão supra-regulada de tais transportadores de aminoácidos incluindo SLC1A5 e suas isoformas truncadas para permitir que as células T proliferem em tais concentrações baixas de triptofano.

[0105]Em uma modalidade particular discutida aqui, o SLC1A5 pode ser coexpresso no mesmo vetor como uma construção de vetor de antígeno quimérico que é expresso por e provido em uma célula T.

[0106]Adequadamente, o SLC1A5 pode ser expresso sob um promotor ou ligado a expressão de um receptor de antígeno quimérico por um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) ou uma sequência de divagem de T2A que fornece um único mRNA, acionado a partir de um promotor comum, tradução de um único polipeptídeo que será co-traducionalmente clivado para gerar duas proteínas (ver Figura 5). Como discutido aqui, um vetor no qual o transportador SLC1A5 é provido pode ser um vetor de expressão de mamífero tal como a partir da série Gateway DEST, um vetor lentivírus tal como do conjunto de pCDH fornecido por sistema System Biosciences, um vetor de transposon ou um vetor adequado para a geração de minicírculos.

[0107]A co-expressão de SLC1A5 proporciona diversas vantagens em que:

1. Células T transfectadas que expressam um receptor de antígeno quimérico e SLC1A5 têm uma vantagem de crescimento em baixas condições de triptofano e/ou glutamina e, assim, estas condições podem ser usadas para selecionar células que expressam tanto o receptor de antígeno quimérico quanto o transportador.

2. Células T supra-expressando SLC1A5 isoladamente ou em conjunto com um receptor de antígeno quimérico são mais resistentes à interrupção proliferativa

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28/31 após a exposição a baixas condições de triptofano causadas por IDO ou TDO expressos por tumor.

3. Células T que expressam SLC1A5 sozinhas ou em conjunto com um receptor de antígeno quimérico podem ser seletivamente esvaziadas após a transferência de células adotivas pelo uso de um anticorpo específico para o transportador SLC1A5.

[0108] Como discutido aqui, células T que têm uma vantagem de crescimento em baixas condições de triptofano e/ou glutamina podem ser selecionadas após a transfecção utilizando baixas condições de glutamina e/ou triptofano no meio de cultura celular.

[0109]Alternativamente, células T adequadas podem ser selecionadas positivamente utilizando, por exemplo, anticorpos capazes de ligar-se a SLC1A5 ou semelhantes. Por exemplo, a utilização de tecnologias de separação de células ativada por magnetismo (MACS), seleção de células ativada por fluorescência (FACS) ou técnicas semelhantes conhecidas por aqueles versados na técnica.

Exemplo 1

Geração de um vetor para permitir a transfecção de uma célula T [0110]O DNA que codifica a isoforma SLC1A5 longa foi obtido de GeneArt (Life Technologies) na cadeia principal de pDONR221 entre sítios de recombinação attL1 e attL2. O SLC1A5 pode então ser recombinado em uma variedade de vetores de destino compatíveis Gateway usando a reação de recombinase LR Clonase II (Life Technologies). Neste exemplo, o SLC1A5 foi recombinado em pEF-DEST51 contendo um promotor EFIalfa e um sinal de poliadenilação BGH (ver Figura 1).

Exemplo 2 [0111]Transfecção de uma célula T para fornecer a expressão de SLC1A5 em um nível que permite a célula T supere a interrupção proliferativa da célula T

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29/31 devido às concentrações de triptofano diminuídas, por exemplo, diminuída abaixo de 5 μΜ.

[0112]Células T são eletroporadas com o vetor descrito no exemplo 1 por Nucleofecção (Lonza) ou sistema de eletroporação de Neon (Thermo Fisher). Após a recuperação em meio completo (tal como IMDM) por 24 a 48 horas, células T são cultivadas em meios IMDM contendo menos do que 5 μΜ de L-triptofano.

Exemplo 3

Exemplo de fornecimento do gene de isoforma longa SLC1A5 utilizando um sistema lentivírus.

[0113]O gene de isoforma longa SLC1A5 no Exemplo 1 foi clonado no na estrutura principal do vetor pCDH (Systems Bioscience). Os sobrenadantes lentivírus foram gerados pela co-transfecção de células HEK293T com o vetor pCDH e uma mistura de vetores de empacotamento lentivírus que expressam os genes gag, pol, rev e env, necessários para a produção viral utilizando Reagente de Transfecção de Purefection (System Bioscience). Os sobrenadantes virais foram coletados em 48 e 72 horas após a transfecção e concentrados utilizando-se PEG-it (Sistema Bioscience). Células T foram plaqueadas e infectadas por adição do lentivírus.

[0114]A isoforma longa SLC1A5 (SLC1A5-L) e sua isoforma truncada (SLC1A5-S) foram transduzidas em células T yõ por um sistema lentivírus que contém sequências SLC1A5-L ou SLC1A5-S, seguido por sequências T2A e GFP. A eficiência da transdução funcional foi 16,7 (SLC1A5-S) e 20% (SLC1A5-L), com base nas células T yõ GFP-positivas (ver Figura 6A). Além disso, a grande maioria das células T yõ expressa SLC1A5, se elas foram transduzidas ou não (ver Figura 6B). No entanto, os níveis de expressão de SLC1A5 foram de 10 vezes (SLC1A5- L) ou 1,5-vezes mais alta (SLC1A5-S) em células T yõ transduzidas do que em células T yõ não transduzidas (ver Figura 6C).

Exemplo 4

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30/31 [0115]Exemplo de fornecimento de urn gene de isoforma longa SLC1A5 utilizando um sistema baseado em transposon.

[0116]O gene de isoforma longa SLC1A5 no Exemplo 1 foi clonado no vetor PB51x (System Bioscience). Células T foram co-transfectadas com o vetor PB51x e o vetor de expressão de transposase Super PiggyBac (System Bioscience) por Nucleofection (Lonza) ou sistema de eletroporação Neon (Thermo Fisher).

Exemplo 5 [0117]Utilização de SLC1A5 como um marcador de seleção e discussão de meios que poderíam ser usados para permitir um ambiente de pressão seletiva.

[0118]As células T são transfectadas (como nos Exemplos 2 e 4) ou transduzidas (como no Exemplo 3) com uma construção de expressão SLC1A5 (tal como no Exemplo 1), permitindo a superexpressão de SLC1A5. Seguindo transfecção/transdução das células T com um vetor capaz de expressar SLC1A5, as células T são deixadas por um período de recuperação de 24 a 48 horas em meios completos, tais como ALys ou IMDM. Após o período de recuperação, as células T são cultivadas em meios ALyS ou IMDM contendo menos do que 5 μΜ de Ltriptofano ou contendo menos do que 4 mM de L-glutamina ou uma combinação de condições de crescimento é monitorada em comparação com células T não modificadas.

[0119]Como a concentração real de L-triptofano em sistemas de cultura celular não foi controlada com o tempo, isto pode causar impactar sobre a resposta de células T gama delta. Portanto, o inibidor de SLC1A5 O-Benzil-L-Serina (BenSer) foi adicionado no meio de cultura, para gerar um ambiente de pressão seletiva controlado, que mimetiza a baixa condição de L-triptofano. PBMCs transduzidas com vetores lentivírus que carregam SLC1A5-S ou SLC1A5-S (48 horas após estimulação com ácido zoledrônico ) foram cultivados em meio de ALys com ou sem BenSer. Durante a segunda e terceira semanas de expansão, células T yõ foram

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31/31 analisadas por citometria de fluxo para medir a viabilidade celular e células GFPpositivas, para determinar a vantagem de sobrevivência de células T yõ transduzidas sob pressão seletiva. Após três semanas de expansão, a presença de BenSer reduziu a viabilidade de células T yõ não transduzidas, comparado com estágios iniciais de expansão (Figura 7A). Entretanto, as células T yõ transduzidas com a isoforma SLC1A5-L não apresentaram redução na viabilidade, e, portanto, se tornarão resistente ao BenSer, (Figura 7A). Além disso, a porcentagem de células T yõ GFP-positivas aumentou após duas e três semanas de expansão em presença de BenSer comparado ao veículo controle (aproximadamente 17% e 14% de aumento, respectivamente, Figura 7B-C). Portanto, a superexpressão da isoforma SLC1A5-L torna as células T gama delta resistentes ao BenSer em meio de cultura, que mimetiza baixos níveis de L-triptofano.

[0120]Embora a invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência a exemplos particulares, será entendido por aqueles versados na técnica que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas na mesma sem se afastar do escopo da presente invenção.

Claims (26)

1. Célula T modificada CARACTERIZADA pelo fato de ser adaptada para superexpressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina.

2. Célula T modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T é adaptada para expressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina em um nível pelo menos duas vezes maior que o nível de expressão observado em uma célula T não modificada.

3. Célula T modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T é adaptada para expressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina em um nível pelo menos duas vezes maior que o nível de expressão observado em uma célula T ativada não modificada.

4. Célula T modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T expressa pelo menos um de (i) um receptor de célula T gama delta, (ii) um receptor de célula T alfa beta, (iii) um receptor de célula T e pelo menos um receptor de antígeno quimérico (CAR).

5. Célula T modificada, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T expressa um receptor de célula T gama delta e um receptor de antígeno quimérico co-estimulador (CAR) em que o CAR coestimulatório compreende um domínio de ligação de antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular em que o domínio de sinalização intracelular provê um sinal co-estimulatório (sinal 2 somente) para a

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2/6 célula T seguindo ligação de antígeno ao domínio de ligação de antígeno extracelular.

6. Célula T modificada, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T expressa um receptor de células T e um receptor de antígeno quimérico (CAR) em que o CAR compreende, um domínio de ligação de antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular em que o domínio de sinalização intracelular provê uma resposta de sinal 1 somente à célula T seguindo ligação de antígeno ao domínio de ligação de antígeno.

7. Célula T modificada, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T expressa um receptor de células T e um receptor de antígeno quimérico (CAR) em que o CAR compreende um domínio de ligação de antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular em que o domínio de sinalização intracelular provê uma resposta de sinal 1 e uma resposta de sinal 2 (de um domínio co-estimulatório) para a célula T seguindo ligação de antígeno ao domínio de ligação de antígeno.

8. Célula T modificada, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T expressa um receptor de célula T gama delta e um receptor de antígeno quimérico (CAR) em que, em uso, o sinal 1 é provido por um primeiro evento de ligação do TCR na célula T gama delta para o alvo de ligação celular reconhecido pelo TCR e sinal 2 é provido por um segundo evento de ligação de antígeno ao domínio de ligação de antígeno do CAR co-estimulatório e em combinação de sinal 1 e sinal 2 tanto dos primeiro e segundo eventos de ligação respectivamente para ativar a célula T.

9. Célula T modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula T expressa um receptor de células T gama delta em que a célula T gama delta (yõ) é do subtipo Vy9Võ2.

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10. Célula T modificada, de acordo com qualquer reivindicação precedente, CARACTERIZADA pelo fato de que SLC1A5 é superexpressa em conjunto com SLC7A5 E SLC3A2 para formar um transportador LAT1.

11. Método de tratamento de um câncer, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração de uma quantidade efetiva de uma célula T modificada conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 a um paciente em necessidade do mesmo.

12. Célula T modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de ser para uso em medicina.

13. Célula T modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de ser para uso no tratamento de câncer ou um vírus.

14. Ácido nucleico isolado codificando SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina operacionalmente ligado a sequências controle adaptados para permitir uma célula T transformada pelo ácido nucleico expressar o SLC1A5 codificado, uma isoforma de SLC1A5, ou transportador de triptofano ou glutamina, opcionalmente CARACTERIZADO pelo fato de que o transportador de triptofano ou glutamina é selecionado a partir de uma família de transportador de glutamate de alta afinidade e de aminoácidos neutros (SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5, SLC1A6, SLC1A7); subunidades pesadas de transportadores de aminoácidos heterodiméricos (SLC3A1, SLC3A2 ); um membro da família simporter de sódio dependente de sódio e cloro : neurotransmissor (SLC6A1, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC6A5, SLC6A6, SLC6A7, SLC6A8, SLC6A9, SLC6A10, SLC6A11, SLC6A12, SLC6A13, SLC6A14, SLC6A15, SLC6A16, SLC6A17, SLC6A18, SLC6A19, SLC6A20) ou um membro de um transportador de aminoácido catiônico/família associada à glicoproteína

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15. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de compreender um ácido nucleico conforme descrito na reivindicação 14.

16. Célula T hospedeira CARACTERIZADA pelo fato de ser transfectada ou transduzida com o ácido nucleico conforme descrito na reivindicação 14 ou vetor conforme descrito na reivindicação 15.

17. Método de cultura de uma célula T para expressar o transportador codificado pelo ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 14 ou o vetor de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende a etapa de introduzir um ácido nucleico conforme descrito na reivindicação 14 ou um vetor conforme descrito na reivindicação 15 em uma célula T.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula T é uma célula T isolada a partir de um indivíduo com uma doença a ser tratada.

19. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma célula T conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e um agente terapêutico.

20. Uso de uma célula T modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de doenças.

21. Uso de uma célula T modificada na fabricação de um medicamento, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença é câncer.

22. Método para prover uma célula T modificada a um paciente CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas

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a. prover uma amostra contendo células T que tenha sido isolada de um paciente

b. transdução ou transfecção de uma célula T da amostra contendo células T com ácido nucleico conforme descrito na reivindicação 14 ou um vetor conforme descrito na reivindicação 15, e

c. administração das células a partir de (b) ao paciente.

23. Método de seleção de uma célula T modificada adaptada para superexpressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende as etapas:

a. cultivo de uma população de células T compreendendo células T modificadas adaptadas para superexpressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina em um meio com pelo menos um de L-triptofano em uma concentração inferior a 5 μΜ e L-glutamina em uma concentração inferior a 3 μΜ, ou na presença de um inibidor de SLC1A5, opcionalmente em que o referido inibidor é O-Benzil-L-Serina;

b. seleção daquelas células T modificadas que proliferam quando cultivadas de acordo com a etapa a.

24. Método de seleção de uma célula T modificada adaptada para superexpressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende

a. prover um membro de ligação com especificidade de ligação a pelo menos um de SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina, a uma célula T que expressa pelo menos um de SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina,

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b. opcionalmente, detecção da ligação do elemento de ligação à célula T na etapa a, e

c. seleção da célula T à qual o elemento de ligação é ligado.

25. Método de isolamento de uma célula T modificada adaptada para superexpressar SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas :

a. prover um membro de ligação com especificidade de ligação a SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador alternativo de triptofano ou glutamina a uma cultura que compreende células T,

b. isolamento de uma célula T à qual o membro de ligação é uma forma ligada à cultura.

26. Método de tratamento de um câncer, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar a um primeiro ponto de tempo uma quantidade efetiva de uma célula T modificada conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 a um paciente em necessidade do mesmo, em que o método ainda compreende uma etapa de administrar ao paciente em um segundo ponto de tempo posterior um membro de ligação com especificidade de ligação a SLC1A5, uma isoforma de SLC1A5 ou um transportador de triptofano ou glutamina capaz de se ligar à célula T modificada para ligar seletivamente e reduzir as células T modificadas presentes no paciente.