KR20190084053A - 트립토판 대사 경로 조절인자 관련 면역 치료 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
T 세포 치료와 같은 면역치료, 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여와 관련된 치료 방법이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 세포와 같은 조작된 T 세포, 및 효소의 억제제와 같은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 포함하는 병용 치료를 포함한다. 또한 키누레닌 경로에 관여하는 분자의 발현이 변형된 조작된 세포 제공된다. 또한, 조작된 세포, 세포, 조성물, 대상에 대한 투여 방법, 핵산 및 키트를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 상기 방법 및 세포의 특징들은 입양세포치료를 위해, 세포의 활성, 아웃컴, 기능, 반응, 지속성, 체적증대 및/또는 증식을 증가 또는 개선시킨다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 "트립토판 대사 경로 조절인자 관련 면역 치료 방법 및 조성물"이라는 명칭의 2016년 10월 13일자로 출원된 미국 가출원 제62/407,776호 및 "트립토판 대사 경로 조절인자 관련 면역 치료 방법 및 조성물"이라는 명칭의 2006년 6월 2일자로 출원된 미국 가출원 제 62/514,767 호의 우선권을 주장하며, 그 전문이 참조로서 편입된다.
서열 목록의 참조에 의한 편입
본 출원은 전자 형식으로 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2017년 10월 12일에 작성된 735042007540SeqList.txt라는 파일로 제공되며, 136KB이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 그 전체가 참조로서 편입된다.
분야
본 발명은 일 측면에서 입양세포치료(adoptive cell therapy)와 같은 면역 치료 예를 들어 T 세포 치료, 및 대안적인 트립토판 대사 경로 및/또는 이의 성분 또는 대사 산물과 같이 트립토판의 대사에 관여하는 경로의 조절인자(들)과 관련된 방법, 조성물 및 용도에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, 조절인자는 키누레닌 경로(kynurenine pathway)를 통해 트립토판의 대사를 촉진시키는, 하나 이상의 반응 또는 성분의 조절인자 및/또는 이의 대사 산물을 포함하는, 키누레닌 경로 조절인자를 포함한다. 제공된 방법, 조성물 및 용도는, 면역 치료제 (예를 들어 치료 항체 (예, 다중특이적 (예, T 세포 연관) 항체))와 같은 다른 제제, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)-발현 T-세포와 같은 세포 치료와 함께 하나 이상의 상기 조절인자 (예, 상기 경로에서 효소의 억제제)를 투여하거나 사용하는 것과 관련된 병용 치료을 위한 것들을 포함한다. 또한, 제공된 조성물 및 용도 중에서, 조작된 세포와 같은 하나 이상의 면역 치료제는 하나 이상의 조절인자로 처리, 변경 또는 조작되거나 그러한 조절인자를 포함한다. 조작된 세포들 중에는, 트립토판 이화작용과 같이 트립토판 대사에 반응하여 세포의 면역 억제 활성에 관여하는 단백질과 같은 분자의 발현, 활성 또는 기능이 변형되거나, 변경되거나, 파괴되거나 영향을 받는 세포들이 있다. 또한 조작된 세포, 세포, 조성물, 대상(개체)에 투여하는 방법, 핵산, 상기 방법에 사용되는 제품 및 키트를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 조작된 세포와 같은 면역 치료제와 키누레닌 및/또는 트립토판 조절인자를 포함하는 조합물 및 이들의 투여용 지침이 제공된다. 일부 측면에서, 상기 방법 및 세포의 특징은 입양세포치료, 또는 면역 치료제에 의해 리쿠르트된(recruited) 내인성 면역 세포를 위해 세포의 활성, 기능, 지속성, 체적증가 및/또는 증식을 증가 또는 개선시킨다.
면역 치료, 예를 들어 입양 치료를 위해, 조작된 T 세포의 투여에 대한 다양한 전략이 이용 가능하다. 예를 들어, CAR와 같은 유전적으로 조작된 항원 수용체를 발현시키는 조작된 T 세포 및 그러한 세포를 함유하는 조성물을 대상에게 투여하는 전략이 이용 가능하다. 세포 치료를 위한 개선된 전략이 필요하다. 예를 들어, 일부 상황에서, 투여 후 세포 또는 결과의 하나 이상의 측면에서의 개선, 예를 들어 대상에게 투여시 세포의 지속성, 활성 및/또는 증식을 개선하는 전략이 요구된다. 일부 실시 양태에서, 이러한 필요를 충족시키는 방법, 세포, 조성물, 키트 및 시스템이 제공된다.
개요
T 세포 치료(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료에서 면역 세포 활성의 증진 및/또는 활성을 증강 또는 조절하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 일반적으로 T 세포 치료 (예, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료, 및 트로토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 병용 치료를 투여하는 것과 관련된다.
본 발명은 다음을 포함하는 치료방법을 제공한다: (a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및 (b) 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계. 여기서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시(시작) 전 1일 이전의 시점에서 시작된다.
본원은 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 대상은 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 T 세포 치료의 개시 전 1일 이전의 시점에서 미리 투여받는다.
본원에서 제공된 임의의 방법의 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 전 2 일, 3 일, 6 일, 12 일, 15 일, 30 일, 60 일 또는 90 일 이내에 또는 그 이전의 시점 내에, 또는 약 2 일, 3 일, 6 일, 12 일, 15 일, 30 일, 60 일 또는 90 일 이내에, 또는 그 이전의 시점 내에 시작한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 T 세포 치료의 투여 개시와 함께 또는 투여 개시 후에, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 계속적으로 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 상기 세포 치료를 투여한 후에 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 다음을 포함하는 치료 방법을 제공한다: (a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및 (b) T 세포 치료의 투여 개시 후 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를, 이전에 T 세포 치료를 투여 받은, 암이 있는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 치료방법이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 내 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 내에 투여된다.
일부 실시 양태에서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여를 개시하기 전에, 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 관문 억제제(checkpoint inhibitor)와 함께 조합하여 수행될 수 있다.
본 발명은 다음을 포함하는 치료 방법을 제공한다: (a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및 (b) 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, T 세포를 포함하는 조성물의 투여를 개시하기 전에, 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 관문 억제제(checkpoint inhibitor)와 함께 조합하여 수행될 수 있다.
본 발명은 다음을 포함하는 치료 방법을 제공한다: T 세포 요법을 먼저 투여받은, 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, T 세포를 포함하는 조성물의 투여를 개시하기 전에, 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 관문 억제제(checkpoint inhibitor)와 함께 조합하여 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 질환 또는 증상은 암이다.
일부 실시 양태에서, (b)에서 투여된 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 전에, 동시에 및/또는 투여 후에 투여된다. 일부 실시 양태에서, (b)에서 투여된 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 전 2 일, 3 일, 6 일, 12 일, 15 일, 30 일, 60 일 또는 90 일 내 또는 그 이전 시기(시간) 내, 또는 약 2 일, 3 일, 6 일, 12 일, 15 일, 30 일, 60 일 또는 90 일 내 또는 그 이전 시기(시간) 내에 개시된다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 또한 T 세포 치료의 투여 개시 후 (b)에서 투여된 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 다음과 같은 시기에 투여된다: T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 (T 세포 치료의 투여 개시 후 시점 전)과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플에서 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기; T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 (T 세포 치료의 투여 개시 후 시점 전)의 대상과 비교하여, 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소되기 전에; T 세포가 장시간(prolonged)의 트립토판의 고갈(starvation), 소진(exhaustion)의 징후, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 양상(징후)을 나타내기 전; T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출되기 전; 및/또는 T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 (투여 개시 후 시점 전)과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마((IFNγ)의 수준이 증가되는 시기. 일부 실시 양태에서, 상기 증가 또는 감소는 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 그 이상이다.
일부 실시 양태에서, (b)에서 투여된 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료 개시 이후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일 , 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내 또는 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일 , 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내에 투여된다.
본원에서 제공된 임의의 방법 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 다음과 같은 시기에 투여된다; T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플에서 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있다; T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상과 비교하여, 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소된다; T 세포 치료의 투여 개시 이후에 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수치와 비교하여, 혈액에서 검출가능한 T 세포 치료의 세포 수가 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 50 배 또는 100 배, 또는 약 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 50 배 또는 100 배 또는 그 이상 감소된다; 및/또는 T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상에서 검출될 수 있는 시점 이후에, 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 대상의 혈액 중 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만 또는 0.1 % 미만이다; IFN- 감마 수준이 T 세포 치료의 투여 개시 이전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 증가된다. 일부 실시 양태에서, 증가 또는 감소는 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 그 이상이거나 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 그 이상이다. 일부 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장 또는 종양 샘플이거나 종양이다. 본원에서 제공된 임의의 방법 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 저해하거나 감소시킨다 .일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판의 이화작용을 방지 또는 감소시키거나 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레린 및 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA)으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물(antibody mimetic), 앱타머 또는 핵산 분자이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민- 피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제의 억제제(TDO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 억제제이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민- 피롤 2,3- 디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/ 또는 키누레닌 경로 조절인자는 IDO1의 억제제이고 IDO1의 트립토판 대사 및 또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여 대상으로부터의 생물학적 시료에서 IDO1의 발현 또는 활성이 증가하는 시점에 투여된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판이다.
본원에서 제공된 임의의 방법 중 일부 실시 양태에서, 암은 IDO1에 대해 음성인 종양을 포함하고/하거나 대상이 IDO1 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다; 및/또는 상기 암은 TDO에 대해 음성인 종양을 포함하고/하거나 대상은 TDO 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 암은 IDO1에 대해 음성인 종양을 포함하고/하거나 대상은 IDO1 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다.
본원에서 제공된 임의의 방법 중 일부 실시 양태에서, 상기 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1에 대해 음성인 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다; 및/또는 상기 암은 T 세포 치료의 투여 개시 이전에 TDO에 대해 음성인 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 TDO 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1에 대해 음성인 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 종양의 발현을 위해 대상이 선택되지 않는다.
본 발명은 다음을 포함하는 치료 방법을 제공한다; (a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계, 여기서 상기 암은 T 세포 치료의 투여 개시 이전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1) 또는 트립토판 2,3- 디옥시게나아제 (TDO)에 대한 음성 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 종양 또는 TDO 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다; 및 (b) 대상에게 IDO1의 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 단계.
또한, 본원에서는, T 세포 치료를 먼저 투여받은, 암이 있는 대상에게 IDO1의 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공되며, 여기서 상기 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1) 또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제 (TDO)에 대한 음성 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 종양 또는 TDO 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다.
또한 본원에서는, IDO1의 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 먼저 투여받은, 암이 있는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공되며, 여기서 상기 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1) 또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제 (TDO)에 대한 음성 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 종양 또는 TDO 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 질환 또는 증상은 암이다.
본원에서 제공된 임의의 방법 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 전에, 투여와 동시에 및/ 또는 투여 후에 투여된다.
일부 실시 양태에서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여를 개시하기 전에, 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 관문 억제제(checkpoint inhibitor)와 함께 조합하여 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 또한 T 세포 치료의 투여 개시 후 (b)에서 투여된 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 다음과 같은 시기에 투여된다; T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플에서 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있다; T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상과 비교하여, 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소되기 전에; T 세포가 장시간(prolonged) 트립토판의 결핍(starvation), 고갈(exhaustion), 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 손실의 양상을 나타내기 전에; T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출되기 전에; 및/또는 T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마((IFNγ)의 수준이 증가된다. 일부 실시 양태에서, 상기 증가 또는 감소는 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 이 이상이거나 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 이 이상이다.
일부 실시 양태에서, (b)에서 투여된 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료의 개시 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내에 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내에 투여된다. 일부 실시 양태에서, (b)에서 투여된 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 이내 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 이내에 투여된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전 0 내지 96시간, 0 내지 72 시간, 0 내지 48 시간, 0 내지 24 시간, 0 내지 12 시간 또는 0 내지 6 시간 또는 0 내지 2 시간 또는, 약 0 내지 96시간, 약 0 내지 72 시간, 약 0 내지 48 시간, 약 0 내지 24 시간, 약 0 내지 12 시간 또는 약 0 내지 6 시간 또는 약 0 내지 2 시간에 투여된다; 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전 96 시간, 72 시간, 48 시간, 24 시간, 12 시간, 6 시간, 2 시간 또는 1 시간 이하로 투여된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사 디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트 (epacadostat)), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판이다.
본 발명은 다음을 포함하는 치료 방법을 제공한다: (a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및 (b) 대상에게 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 단계, 여기서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)이거나 이를 포함한다.
또한, 본원에서는 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를, 먼저 T 세포 치료를 투여받은, 암이 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공되며, 여기서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)이거나 이를 포함한다.
또한, 본원에서는 암에 걸린 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 상기 대상은 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 먼저 투여받았던 대상이다. 여기서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)이거나 이를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 질환 또는 증상은 암이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 양태에서, 대상에게 T 세포 치료 투여 시, T 세포 치료의 개시 전에 대상에서의 IFN-감마 수준과 비교하여, 종양의 국소 환경(local environment)에서 또는 대상의 혈청 또는 혈장 시료에서 대상의 IFN-감마 수준의 증가 또는 상승을 일으킨다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 종양 침윤 림프성 (tumor infiltrating lymphocytic, TIL) 치료 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 T 세포 치료이거나 이를 포함한다.
본 명세서의 임의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 유전적으로 조작된 세포는 또한 하나 이상의 활성 또는 아웃컴 또는 효과와 관련된 단백질 또는 다른 인자 또는 분자의 발현, 존재 또는 활성 및/또는 상기 단백질 또는 인자를 코딩하는 핵산에 영향을 주는 변형을 포함한다. 일부 양상에서, 활성, 아웃컴 또는 효과는 트립토판 결핍 또는 트립토판 고갈과 관련되거나 트립토판 결핍 또는 트립토판 고갈에 의해 감지되거나 증진된 것을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 활성, 아웃컴 또는 효과는 세포 또는 환경에서 증가된 양 또는 농도의 키누레닌 또는 하나 이상의 키누레닌 경로 대사 산물 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제 및/또는 감소된 트립토판/키누레닌 비율과 관련되거나 이들에 의해 감지되거나 증진된 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 단백질 또는 인자는, 예를 들어 종양 환경에서 T 세포 기능을 제한할 수 있는 것들과 같이, 트립토판 고갈 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제 효과의 감지에 관여하거나 이와 관련된 단백질이거나 이를 포함한다. 이러한 효과는 T 세포 활성 또는 기능의 저해 또는 감쇠 및/또는 Treg 기능, 수준 또는 활성의 촉진을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 단백질 또는 인자는 세포 및/또는 이웃 세포에서의 IDO 유도 면역 억제 효과에 관여한다.
본원은 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 유전적으로 조작된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 여기서 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) 트립토판 고갈 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제 효과 및/또는 세포에서의 IDO-매개 면역억제 효과와 관련된 단백질의 감지에 관여하거나 관련된 단백질의 발현 변형을 포함한다.
또한, 본원에서는 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 유전적으로 조작된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 여기서 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) 재조합, 조작 및 /또는 이소적으로(ectopically) 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 또한 (b) 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 다음을 포함하는 치료 방법을 제공한다: (a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 유전자 조작된 T 세포를 투여하는 단계, 여기서 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) 트립토판 고갈 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제 효과 및/또는 세포에서의 IDO-매개 면역 억제 효과와 관련된 단백질의 감지에 관여하거나 관련된 단백질의 발현 변형을 포함한다; 및 (b) 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 질환 또는 증상은 암이다.
일부 실시 양태에서, 대상은 L-형 아미노산 전달체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), CD98 중쇄 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) 및/또는 양성자-보조(proton-assisted) 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)의 발현대 대해 양성인 종양을 갖거나 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 대해 양성인 종양 미세 환경에서 세포를 갖기 위해 선택된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판의 이화작용을 차단 또는 감소시키거나 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시 안트라닐산 (3-HAA) 중에서 선택된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제 (TDO)의 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소의 억제제이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중 -작용 (dual-acting) IDO/TDO 억제제이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제이다. 본 발명의 임의의 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누 레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사 디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로 선택된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-(2-[(아미노술포닐)아미노]에틸아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 후에 투여된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 단백질 또는 인자는 mTOR 또는 단백질 키나아제 C 세타 (PKC-Θ)이다.
일부 실시 양태에서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여를 개시하기 전에, 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 관문 억제제(checkpoint inhibitor)와 함께 조합하여 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 전에, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 투여된다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료의 투여 개시 후 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 다음과 같은 시점에 투여된다: T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플에서 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있다; T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상과 비교하여, 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소되기 전에; T 세포가 장기간(prolonged) 트립토판의 고갈(starvation), 소진(exhaustion), 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 손실의 양상(징후)을 나타내기 전; T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출되기 전에; 및/또는 T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마((IFNγ)의 수준이 증가된다. 일부 실시 양태에서, 상기 증가 또는 감소는 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 이 이상이거나, 또는 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 그 이상이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료 개시 이후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일 , 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내에 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일 , 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내에 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료 개시 이후, 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 이내에 투여된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전 0 내지 96 시간, 0 내지 72 시간, 0 내지 48 시간, 0 내지 24 시간, 0 내지 12 시간 또는 0 내지 6 시간 또는 0 시간 내지 2 시간 또는 약 0 내지 96 시간, 0 내지 72 시간, 0 내지 48 시간, 0 내지 24 시간, 0 내지 12 시간 또는 0 내지 6 시간 또는 0 시간 내지 2 시간에 투여된다; 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전 96 시간, 72 시간, 48 시간, 24 시간, 12 시간, 6 시간, 2 시간 또는 1 시간 이하로 투여된다.
일부 실시 양태에서, 변형(modification)은 분자 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 일부 또는 이들의 변이체의 재조합, 조작 및/또는 이소성(ectopi) 발현을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 분자는 mTOR 또는 단백질 키나아제 C 세타 (PKC-Θ)이다.
일부 실시 양태에서, 분자는 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 기능적 및/또는 촉매 활성 부분 또는 이들의 변이체이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 트립토판 수송체이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 rBAT (SLC3A1), CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), Asc 형 아미노산 수송체 1 (Asc-1, SLC7A10), 소듐- 및 클로라이드-의존성 중성 및 염기성 아미노산 수송체 B (0+) (ATB0,+; SLC6A14), 소듐-의존성 중성 아미노산 수송체 B(0)AT1 (B(0)AT1; SLC6A19), 모노카르복실레이트 수송체 10 (TAT1; SLC16A10), 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 그의 일부를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 서열 번호 36 내지 44 중 어느 하나 또는 이의 일부로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 36 내지 44 중 어느 하나 또는 이의 일부로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99% 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 그의 일부 중 하나 이상으로부터 선택한다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 이의 일부를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 서열 번호 37 내지 39 및 44 중 어느 하나 또는 그 일부로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 번호 37 내지 39 및 44 중 어느 하나 또는 그 일부로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포에서 분자의 발현은 조건부 프로모터(conditional promoter) 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 변형(modification)은 단백질 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 이소성(ectopi) 발현을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포에서 단백질의 발현은 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성와인자의 제어 하에 있다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 단백질 또는 인자는 GCN2 키나아제, BLIMP-1, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR) 또는 AHR 핵 수송체 (ARNT)이다. 일부 실시 양태에서, 분자는 GCN2 키나아제, BLIMP-1, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 수송체 (ARNT), 진핵세포 번역 개시 인자 2 α (eIF2α), 활성화 전사 인자 4 (ATF4), 또는 CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질 (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및 IFNγ-R2 중에서 선택된다. 일부 실시 양태에서, 분자는 GCN2 또는 CHOP이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 변형은 분자의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 조작된 세포는 분자의 발현을 감소시키는 억제성 핵산 또는 유전적 파괴를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포에서 분자의 발현은, 제제 또는 유전자 파괴의 부재 하에 세포에서의 발현과 비교하여, 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 % 감소된다.
본원에서 제공된 임의의 방법 중 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 억제성 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 이로써 분자의 발현이 감소된다. 일부 실시 양태에서, 조작된 세포는 억제성 핵산을 포함하고, 억제성 핵산은 RNA 간섭제를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 억제성 핵산은 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA-적응 shRNA(microRNA-adapted shRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 헤어핀 siRNA, 마이크로 RNA (miRNA-전구체) 또는 마이크로 RNA (miRNA)이거나 이를 포함하거나 코딩한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 억제성 핵산을 코딩 또는 생산하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 이로써 분자의 발현이 감소된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 억제성 핵산의 발현은 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 조작된 세포는 유전적 파괴를 포함하고, 여기서: 파괴는 DNA 수준에서 분자를 코딩하는 유전자를 파괴시키는 것과 관련된다. 그리고/또는 파괴는 가역적이지 않다; 그리고/또는 파괴는 일시적이지 않다. 일부 실시 양태에서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하거나 하이브리드화(혼성화)하는 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 세포 내로 도입시키는 것을 수반한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 파괴는 다음을 도입하는 것을 수반한다: (a) DNA-표적화 단백질 및 핵산분해효소를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-유도 핵산분해효소.
일부 실시 양태에서, DNA-표적화 단백질 또는 RNA-유도 핵산분해효소는 징크 핑거 단백질 (ZFP), TAL 단백질 또는 유전자에 특이적인 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid, CRISPR)을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 파괴는, 분자를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 징크 핑거 핵산분해효소 (ZFN), TAL-이펙터 핵산분해효소 (TALEN) 또는 크리스퍼-카스9 조합물을 포함하여, 약물을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 제제는 크리스퍼-카스9 조합물 및 상기 유전자 내의 표적 서열에 상보적이고, 및/또는 혼성화될 수 있는 가이드 서열을 함유하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 크리스퍼-카스9 조합물이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 유전적 피괴는 유도성이다.
일부 실시 양태에서, 크리스퍼-카스9 복합체는 유도성 크리스퍼-카스9 이다. 그리고/또는 카스9은 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 적어도 하나의 엑손의 적어도 일부의 결실을 포함한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 파괴는 유전자 내에 조기 정지 코돈(premature stop codon)의 존재를 야기하는 유전자 내의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함한다; 그리고/또는 상기 파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 제1 또는 제2 엑손 내에 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자는 유도성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자 또는 억제성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자이다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택된다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1 프로모터인 pol III 프로모터; 또는 CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노 바이러스 주요 후기 프로모터인 pol II 프로모터로부터 선택된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 Lac 작동 서열, 테트라사이클린 작동 서열, 갈락토오스 작동 서열 또는 독시사이클린 작동 서열을 포함하거나 이의 유사체이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 프로모터는 억제성 프로모터이다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 Lac 억제자 또는 테트라사이클린 억제자에 의해 결합될 수 있거나, 이의 유사체이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체는 기능성 비(non)-T 세포 수용체이다. 일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor, CAR)이다. 일부 실시 양태에서, CAR는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 영역을 함유한다. 일부 실시 양태에서, 세포내 신호 전달 영역은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 함유한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, CAR는 또한 보조 자극 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호 전달 도메인 또는 ICOS 또는 이의 신호 전달 부분(일부분)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28의 신호 전달 도메인이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 형질 전환 T 세포 수용체 (TCR)이다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 암과 관련된 항원을 인식하거나 표적화한다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 암과 관련된 항원에 결합, 인식 또는 표적화한다.
일부 실시 양태에서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B 형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아성 아세틸콜린 e 수용체 (fetal acethycholine e receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄(kappa light chain), 루이스(Lewis) Y, L1-세포 접착 분자(cell adhesion molecule), MAGE-A1, 메소텔린(mesothelin), MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이항원(prostate specific antigen), PSMA, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), ephrinB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 윌름스 종양 1(Wilms Tumor 1, WT-1), 및 사이클린 A1 (CCNA1)으로부터 선택된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 암은 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)을 포함하고/하거나 대상은 IDO1 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)에 대해 음성인 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 암은 L-형 아미노산 전달체 1 (LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), CD98 중쇄 (4F2hc, CD98hc, SLC3A2) 및/또는 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)의 발현에 대해 양성인 종양을 포함하거나 또는 또는 암은 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 대해 양성인 종양 미세 환경 내의 세포를 포함한다.
본 발명의 임의의 실시 양태에서, 암은 골수종, 림프종, 백혈병이다. 일부 실시 양태에서, 암은 비호즈킨성림프종 (non-Hodgkin lymphoma, NHL), 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia, CLL), 확산성 B-세포 림프종 (diffuse large B-Cell lymphoma, DLBCL) 및 골수종이다. 일부 실시 양태에서, 암은 B 세포 항원을 발현하지 않거나 B 세포 악성 종양이 아니다. 일부 실시 양태에서, 암은 CD19를 발현하지 않는다. 그리고/또는 T 세포 치료는 CD19에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하지 않는다. 그리고/또는 T 세포 치료는 항-CD19 항원-결합 도메인을 포함하지 않는 CAR-T 세포 치료이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 암은 비-혈액 암(non-hematological cancer) 또는 고형 종양이다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에 T 세포 치료의 투여를 포함하는 방법과 비교하여 또는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하지 않는 세포를 투여하는 방법과 비교하여, 종양 또는 대상의 생물학적 샘플, 선택적으로 혈청, 혈장 또는 종양 샘플에서의 트립토판 수준의 증가 및/또는 키누레닌 수준의 증가를 초래한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는, T 세포 치료가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에 대상에게 투여되는 방법과 비교하여, 대상에서의 증가된 또는 장시간의 증식 (체적증가, expansion) 및/또는 지속성을 나타낸다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 경구, 피하 또는 정맥 내 투여된다.일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 경구 투여된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 2.5 mg 내지 약 5000 mg, 2.5 mg 내지 2000 mg, 2.5 mg 내지 1000 mg, 2.5 mg 내지 500 mg, 2.5 mg 내지 200 mg, 2.5 mg 내지 100 mg, 2.5 mg 내지 50 mg, 2.5 mg 내지 25 mg, 2.5 mg 내지 10 mg, 25 mg 내지 5000 mg, 25 mg 내지 2000 mg, 25 mg 내지 1000 mg, 25 mg 내지 500 mg, 25 mg 내지 200 mg, 25 mg 내지 100 mg, 25 mg 내지 50 mg, 50 mg 내지 5000 mg, 50 mg 내지 2000 mg, 50 mg 내지 1000 mg, 50 mg 내지 500 mg, 50 mg 내지 200 mg, 50 mg 내지 100 mg, 100 mg 내지 5000 mg, 100 mg 내지 2000 mg, 100 mg 내지 1000 mg, 100 mg 내지 500 mg, 100 mg 내지 200 mg, 200 mg 내지 5000 mg, 200 mg 내지 2000 mg, 200 mg 내지 1000 mg, 200 mg 내지 500 mg, 500 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 2000 mg, 500 mg 내지 1000 mg 또는 1000 mg 내지 2000 mg 각각을 포함하는 양으로 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1 일 6 회, 1 일 5 회, 1 일 4 회, 1 일 3 회, 1 일 2 회 또는 1 일 1 회 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 적어도 5 mg/일, 10 mg/일, 25 mg/일, 50 mg/일, 100 mg/일, 200 mg/일, 400 mg/일, 500 mg/일, 600 mg/일, 800 mg/일, 1000 mg/일, 1200 mg/일, 1600 mg/일, 2000 mg/일, 5000 mg/일 또는 10000 mg/일 또는 약 2.5 mg 내지 약 5000 mg, 2.5 mg 내지 2000 mg, 2.5 mg 내지 1000 mg, 2.5 mg 내지 500 mg, 2.5 mg 내지 200 mg, 2.5 mg 내지 100 mg, 2.5 mg 내지 50 mg, 2.5 mg 내지 25 mg, 2.5 mg 내지 10 mg, 25 mg 내지 5000 mg, 25 mg 내지 2000 mg, 25 mg 내지 1000 mg, 25 mg 내지 500 mg, 25 mg 내지 200 mg, 25 mg 내지 100 mg, 25 mg 내지 50 mg, 50 mg 내지 5000 mg, 50 mg 내지 2000 mg, 50 mg 내지 1000 mg, 50 mg 내지 500 mg, 50 mg 내지 200 mg, 50 mg 내지 100 mg, 100 mg 내지 5000 mg, 100 mg 내지 2000 mg, 100 mg 내지 1000 mg, 100 mg 내지 500 mg, 100 mg 내지 200 mg, 200 mg 내지 5000 mg, 200 mg 내지 2000 mg, 200 mg 내지 1000 mg, 200 mg 내지 500 mg, 500 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 2000 mg, 500 mg 내지 1000 mg 또는 1000 mg 내지 2000 mg 각각을 포함하는 양으로 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1 일 6 회, 1 일 5 회, 1 일 4 회, 1 일 3 회, 1 일 2 회 또는 1 일 1 회 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 적어도 5 mg/일, 10 mg/일, 25 mg/일, 50 mg/일, 100 mg/일, 200 mg/일, 400 mg/일, 500 mg/일, 600 mg/일, 800 mg/일, 1000 mg/일, 1200 mg/일, 1600 mg/일, 2000 mg/일, 5000 mg/일 또는 10000 mg/일, 또는 적어도 약 5 mg/일, 10 mg/일, 25 mg/일, 50 mg/일, 100 mg/일, 200 mg/일, 400 mg/일, 500 mg/일, 600 mg/일, 800 mg/일, 1000 mg/일, 1200 mg/일, 1600 mg/일, 2000 mg/일, 5000 mg/일 또는 10000 mg/일의 총 일일 투여량으로 투여된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 후 다음의 시기까지 계속된다: 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전과 비교하여 또는 T- 세포 치료의 투여 개시 직전과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 시료에서의 트립토판 수준의 증가, 키누레닌 수준의 감소 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 감소가 있다; 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전의 이전 시점에서의 대상과 비교하여 또는 T-세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 증가한다; T 세포 치료의 투여 개시 후 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수의 2.0 배 이내(크거나 작음)이다; 그리고/또는 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 대상의 혈액에서의 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 또는 60 % 이상이거나, 약 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 또는 60 % 이상이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 다음의 시기까지 투여된다: 대상의 혈액 중의 조작된 세포의 농도 또는 수가 (i) 마이크로리터 당 적어도 약 10 개의 조작된 세포, (ii) 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 총 수의 적어도 20 %, 30 %, 40 % 또는 50 %, (iii) 적어도 또는 적어도 약 1 x 105 개의 조작된 세포이거나; 또는 (iv) 마이크로그램 DNA 당 재조합 수용체를 코딩하는 DNA가 혈액에 적어도 5,000 카피 포함된다; 그리고/또는 (a)에서의 투여 개시 후 90 일째에, CAR-발현 세포가 대상의 혈액 또는 혈청에서 검출 가능하다; 그리고/또는 (a)에서 투여 개시 후 90 일째에, 대상의 혈액이 적어도 20 %의 CAR-발현세포, 마이크로리터 당 적어도 10 개의 CAR-발현 세포 또는 적어도 1 × 104의 CAR-발현 세포를 함유한다.
본원의 실시 양태 중 임의의 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 후 최대 2 일까지, 7 일까지, 14 일까지, 21 일까지, 1 개월까지, 2 개월까지, 3 개월까지, 6 개월까지 또는 1 년까지의 기간 동안 투여된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 CD4+ 또는 CD8+인 T 세포를 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 대상에게 자기조직인(autologous) 세포를 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 대상에게 동종이계인(allogeneic) T 세포를 포함한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 종양 미세 환경에서 IDO1 발현을 상향 조절하는 양으로 투여된다. 일부 실시 양태에서, IDO1 발현은 골수 세포, 간질 세포 또는 종양 세포에부터 상향 조절된다. 일부 실시 양로부터 상향 조절된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 세포 치료는 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 1 x 106 cell/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 1 x 106 cell/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이, 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 또는 , 3.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 또는 약 3.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 (각각 포함)의 세포 수를 함유하는 투여량을 포함한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 투여된 세포의 양은 트립토판 대사 및/또시는 키누레닌 경로 조절인자의 투여없이 세포 치료를 투여하는 방법 또는 세포가 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현을 변형을 포함하지 않는 방법에서의 투여량보다 적다. 일부 실시 양태에서, 투여량은 적어도 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배 또는 10 배 이하이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 세포를 함유하는 단일 약학 조성물로서 투여된다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 분할 투여량인 세포의 양을 포함하며, 여기서 상기 투여량의 세포는 3 일 이하의 기간에 걸쳐 상기 투여량의 세포를 집합적으로 함유하는 복수의 조성물로 투여된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 T 세포 치료의 투여 전에 림프구고갈 화학치료 (lymphodepleting chemotherapy)을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 대상에 플루다라빈을 투여하는 것을 포함하지 않는다. 본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 제공된 방법은 T 세포 치료의 투여 전에 대상에게 림프구고갈 화학요법을 투여하는 것을 포함하지 않는다.
일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열 및 세포에서 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나 또는 그에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 내로 도입시킴으로써 조작된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열(들)은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 및 제 2 핵산(들)은 하나 이상의 벡터(들)에 포함되고, 이는 선택적으로 바이러스 벡터(들)이다.
본원에서는 트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자 투여를 위해 질환 또는 증상을 갖는 대상을 선택하는 방법이 제공되며, 다음을 포함한다: (a) 대상으로부터의 하나 이상의 생물학적 시료에서 트립토판 또는 트립토판 대사 산물의 수준, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준, 또는 인터페론 - 감마 (IFNγ) 수준을 평가하는 단계, 여기서 대상으로부터의 생물학적 시료는 T 세포 치료로 치료할 후보인 대상으로부터 유래된 것이다; 및 (b) (ⅰ) 샘플 중의 트립토판 수준이 역치 수준 이하; (ii) 트립토판 대사 산물의 수준이 역치 수준 이상; (iii) IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 수준 또는 활동 수준이 역치 수준 이상; 또는 (iv) IFNγ의 수준이 역치 수준 이상인 대상을 선택하는 단계.
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 생물학적 샘플은 T 세포 치료의 투여 전에 수득된다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 또한 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 것과 관련된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 또한 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 선택된 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 이전에 또는 T 세포 요법의 투여 개시와 동시에 선택된 대상에게 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 후 투여된다.
본원에서는 트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자 투여를 위해 질환 또는 증상을 갖는 대상을 선택하는 방법이 제공되며, 다음을 포함한다: (a) 대상으로부터의 하나 이상의 생물학적 시료에서 트립토판 또는 트립토판 대사 산물의 수준, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준, 또는 인터페론 - 감마 (IFNγ) 수준을 평가하는 단계, 여기서 생물학적 시료는 T 세포 치료를 투여받은 대상으로부터 수득된 것이다; 및 (b) 다음의 대상을 선택하는 단계: (ⅰ) 시료 중의 트립토판 수준이 역치 수준 미만이거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 또는 T 세포 치료 투여 개시 후 이전 시점에 평가된 수준에 비해 감소된다; (ii) 트립토판 대사 산물의 수준이 역치 수준 초과이거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 또는 T 세포 치료 투여 개시 후 이전 시점에 평가된 수준에 비해 증가된다; (iii) IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준이 역치 수준 이상이거나, T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에 평가된 수준과 비교하여 증가된다; 또는 (ⅳ) IFNγ의 수준이 역치 수준 이상이거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에 평가된 수준과 비교하여 증가된다.
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 생물학적 시료는 T 세포 치료의 투여 후에 수득된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 또한 평가 전에 세포 치료를 대상에게 투여하는 것과 관련된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 키누레인 경로 조절인자를 환자에게 투여하는 것과 또한 관련된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 다음의 시점에 투여된다: T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여 대상으로부터의 생물학적 샘플에서의 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있다; T 세포가 장시간(prolonged) 트립토판의 결핍(starvation), 고갈(exhaustion), 이펙터 기능의 감소, 억제성 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 손실의 양상을 나타내기 전에; T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출되기 전에; 및/또는 T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마((IFNγ)의 수준이 증가된다. 일부 실시 양태에서, 상기 증가 또는 감소는 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 이 이상이거나 또는 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 이 이상이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료 개시 이후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일 , 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일 , 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내에 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료 개시 이후, 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 또는 48 시간 이내, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 또는 48 시간 이내에 투여된다.
일부 실시 양태에서, 질환 또는 증상은 암이다.
일부 실시 양태에서, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준이 T 세포 요법의 투여 개시 이전의 시점에서 평가된 수준에 비해 증가되는 경우, 대상을 선택한다. 일부 실시 양태에서, 시료에서의 트립토판 수준이 역치 수준 미만이거나 T 세포 요법의 투여 시작 이전의 시점에서 평가된 수준에 비해 감소되는 경우 대상을 선택한다.
일부 실시 양태에서, 역치 수준은 복수의 대조군 대상으로부터의 생물학적 시료에서의 평균 수준, 농도 또는 양의 25 % 이내, 20 % 이내, 15 % 이내, 10 % 이내 또는 5 % 이내 및/또는 평균 수준, 농도 또는 양의 표준 편차 이내이다. 일부 실시 양태에서, 대조군 대상은 건강한 또는 정상의 대상으로, 암을 가지지 않는다. 그리고/또는 세포 치료의 투여를 받기 전의 대상이다.
일부 실시 양태에서, 증가 또는 감소는 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 이 이상이거나 또는 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 이상이다.
일부 실시 상태에서, 상기 평가 전에, 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 관문 억제제(checkpoint inhibitor)와 함께 조합하여 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 생물학적 시료는 샘플 혈청, 혈장 또는 종양 샘플로부터 얻어 지거나 얻어진다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA)으로부터 선택된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물, 앱타머 또는 핵산 분자이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제의 억제제(TDO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 억제제이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민- 피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제이다. 본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누 레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사 디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5- 옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택된다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판이다.
일부 실시 양태에서, T 세포는 기능성 비(non)-T 세포 수용체인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체는 기능성 비(non)-T 세포 수용체이다. 일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor, CAR)이다. 일부 실시 양태에서, CAR는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 영역을 함유한다. 일부 실시 양태에서, 세포내 신호 전달 영역은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 함유한다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, CAR는 또한 보조 자극 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호 전달 도메인 또는 ICOS 또는 이의 신호 전달 부분(일부분)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28의 신호 전달 도메인이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 형질 전환 T 세포 수용체 (TCR)이다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 암과 관련된 항원을 인식하거나 표적화한다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 암과 관련된 항원에 결합, 인식 또는 표적화한다. 일부 실시 양태에서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B 형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아성 아세틸콜린 e 수용체 (fetal acethycholine e receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄(kappa light chain), 루이스(Lewis) Y, L1-세포 접착 분자(cell adhesion 몰ecule), MAGE-A1, 메소텔린(mesothelin), MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이항원(prostate specific antigen), PSMA, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), ephrinB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 윌름스 종양 1(Wilms Tumor 1, WT-1), 및 사이클린 A1 (CCNA1)으로부터 선택된다.
본원에서는 (a) 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체; 및 (b) IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하는 조작된 세포가 제공된다.
일부 실시 양태에서, 분자는 mTOR 또는 단백질 키나아제 C 세타 (PKC-Θ)이다.
본원에서는 (a) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) 세포에서 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하는 조작된 세포가 제공된다.
일부 실시 양태에서, 변형(modification)은 분자 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 일부 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 세포에서의 이소성(ectopi) 발현을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 분자는 mTOR 또는 단백질 키나아제 C 세타 (PKC-Θ)이다.
일부 실시 양태에서, 분자는 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체이다.
또한, (a) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및 (b) 재조합, 조작 및/또는 이소적으로(ectopically) 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 이의 변이체를 포함하는 조작된 세포가 제공된다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 트립토판 수송체이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 rBAT (SLC3A1), CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), Asc 형 아미노산 수송체 1 (Asc-1, SLC7A10), 소듐- 및 클로라이드-의존성 중성 및 염기성 아미노산 수송체 B (0+) (ATB0,+; SLC6A14), 소듐-의존성 중성 아미노산 수송체 B(0)AT1 (B(0)AT1; SLC6A19), 모노카르복실레이트 수송체 10 (TAT1; SLC16A10), 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 그의 일부를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 서열 번호 36 내지 115 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 36 내지 115 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99% 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 그의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 이의 일부를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 서열 번호 37 내지 39 및 115 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 번호 37 내지 39 및 115 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 세포에서 분자 또는 아미노산 수송체의 발현은 조건부 프로모터(conditional promoter) 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있다.
일부 실시 양태에서, 분자는 GCN2 키나아제, BLIMP-1, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 수송체 (ARNT), 진핵세포 번역 개시 인자 2 α (eIF2α), 활성화 전사 인자 4 (ATF4), 또는 CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질 (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및 IFNγ-R2 중에서 선택된다. 일부 실시 양태에서, 분자는 GCN2 또는 CHOP이다.
일부 실시 양태에서, 변형(modification)은 단백질 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 세포에서의 이소성(ectopi) 발현을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포에서 분자의 발현은 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있다.
일부 실시 양태에서, 분자는 GCN2 키나아제, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR) 또는 AHR 핵 수송체 (ARNT)이다. 일부 실시 양태에서, 변형은 세포에서 분자의 발현 감소를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 조작된 세포는 분자의 발현을 감소시키는 억제성 핵산 또는 유전 파괴를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포에서의 분자 발현은 억제성 핵산 또는 유전자 파괴의 부재 하에 세포에서의 발현과 비교하여 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 % 감소된다.
일부 실시 양태에서, 세포는 억제성 핵산을 함유하여, 이로써 분자의 발현을 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 억제성 핵산은 RNA 간섭제를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 억제성 핵산은 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA-적응 shRNA(microRNA-adapted shRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 헤어핀 siRNA, 마이크로 RNA (miRNA-전구체) 또는 마이크로 RNA (miRNA)이거나 이를 포함하거나 코딩한다. 일부 실시 양태에서, 억제 핵산의 발현은 조건적 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있다.
일부 실시 양태에서, 조작된 세포는 분자를 코딩하는 파괴된 유전자, 분자를 코딩하는 유전자의 파괴용 제제 및/또는 분자를 코딩하는 유전자의 파괴를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 파괴는 DNA 수준에서 분자를 코딩하는 유전자를 파괴시키는 것을 포함한다 그리고/또는 파괴는 가역적이지 않다; 그리고/또는 파괴는 일시적이지 않다.
일부 실시 양태에서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하거나 또는 하이브리드화하는 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산에 의해 매개된다. 일부 실시 양태에서, 파괴는 (a) DNA-표적화 단백질 및 핵산 분해 효소 또는 (b) RNA-유도 핵산 분해 효소를 포함하는 융합 단백질에 의해 매개된다. 일부 실시 양태에서, 파괴는 유전자 편집 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 또는 크리스퍼(크리스퍼)/Cas9에 의해 매개된다. 일부 실시 양태에서, 파괴는 크리스퍼/Cas9에 의해 매개되고 크리스퍼/Cas9는 유전자 내의 표적 서열에 상보적이고 및/또는 하이브리드화될 수 있는 가이드 서열을 함유하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 유전적 파괴는 조건성 또는 유도성이다. 일부 실시 양태에서, 크리스퍼-카스9 복합체는 유도성 크리스퍼-카스9이고 및/또는 카스9는 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있다.
일부 실시 양태에서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 적어도 하나의 엑손의 적어도 일부의 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 파괴는 유전자 내에 조기 정지 코돈(premature stop codon)의 존재(presence)를 야기하는 유전자 내의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함한다; 그리고/또는 상기 파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 제1 또는 제2 엑손 내에 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 조건적 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터와 같은 유도성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자 또는 억제성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자이다.
일부 실시 양태에서, 프로모터는 다음으로부터 선택된다: U6 또는 H1 프로모터인 pol III 프로모터; 또는 CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (adenovirus major late promoter)인 pol II 프로모터로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 NFκB 또는 NFAT에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 Lac 작동 서열, 테트라사이클린 작동 서열, 갈락토오스 작동 서열 또는 독시사이클린 작동 서열을 포함하거나, 또는 이의 유사체이다.
일부 실시 양태에서, 프로모터는 억제성 프로모터이다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 Lac 억제자 또는 테트라사이클린 억제자에 의해 결합될 수 있거나, 또는 이의 유사체이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 T 세포이다.
일부 실시 양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시 양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 자연 살해 세포 (NK 세포)이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 iPS-유래 세포이다.
일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체는 기능성 비(non)- T 세포 수용체이다. 일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor, CAR)이다.
일부 실시 양태에서, CAR는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 영역을 함유한다.
일부 실시 양태에서, 세포내 신호 전달 영역은 CD3 제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 함유한다.
일부 실시 양태에서, CAR는 또한 보조 자극 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호 전달 도메인 또는 ICOS 또는 이의 신호 전달 부분(일부분)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28의 신호 전달 도메인이다.
일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체는 재조합 수용체이다.
일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합되는 유전적으로 조작된 수용체는 형질전환 T 세포 수용체 (TCR)이다.
일부 실시 양태에서, 세포는 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열 및 세포에서 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나 또는 그에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 내로 도입시킴으로써 조작된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열(들)은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 및 제 2 핵산(들)은 하나 이상의 벡터(들)에 포함되고, 이는 선택적으로 바이러스 벡터(들)이다.
본원에서는, 본원에 기술된 임의의 조작된 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물의 일부 실시 양태에서, 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 세포이다. 일부 실시 양태에서, 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또한, 본원에서는 리간드에 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 세포 및 트립토판 대사 및/또는 키누 레닌 경로 조절인자를 포함하는 조합물이 제공되며, 여기서 재조합 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
또한 본원에 기술된 임의의 조작된 세포 또는 본원에 기술된 임의의 조성물, 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 포함하는 조합물이 제공된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소 시키며/시키거나 키누레닌/트립토판 비율을 감소시킨다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판의 이화작용을 차단 또는 감소시키거나 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3- 하이드록시키누레닌 및 3- 하이드록시안트라닐산 (3-HAA) 중에서 선택된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항체 모방물 (antibody mimetic), 앱타머 또는 핵산 분자이다
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 1 (IDO1), IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3- 디옥시게나아제의 억제제(TDO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 억제제이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제이다.
본원의 임의의 실시 양태 중 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사 디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판이다.
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공되는 조합물은 키트와 같은 제품으로 포장된다. 일부 실시 양태에서, 제품 및/또는 키트는 조작된 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 위해 제공되는 지침 또는 문서를 추가로 포함한다.
또한, 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 세포를 포함하는 세포 집단을 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절제와 접촉시키는 단계; 및 재조합 수용체를 발현하도록 하는 조건 하에서 세포 집단에 재조합 수용체를 코딩하는 핵산을 도입시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 리간드, 선택적으로 항원에 결합한다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 실시 양태에서, 세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포 집단은 T 세포이거나 T 세포를 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ 이다. 일부 실시 양태에서, 세포 집단은 대상, 선택적으로 인간 대상체로부터 분리된다.
일부 실시 양태에서, 접촉은 도입 이전 및/또는 도입 중에 일어난다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판의 이화작용을 차단 또는 감소시키거나 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA) 중에서 선택된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항체 모방물, 앱타머 또는 핵산 분자이다
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3- 디옥시게나아제의 억제제(TDO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 억제제이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사 디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5- 옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판이다.
또한, 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 재조합 수용체를 발현하도록 하는 조건 하에서 세포 집단에 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 도입시키는 단계; 및 제제가 발현되는 조건 하에서, 세포에서의 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나 또는 그에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 내로 도입시키는 단계를 포함한다.
또한 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 재조합 수용체가 발현되는 조건 하에서 세포 집단에 도입하는 단계; 및 재조합, 조작 및/또는 이소적으로(ectopically) 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열 (들)을 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 변형은 분자 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 일부 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 변형은 분자의 감소된 발현을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 분자의 발현을 감소시키는 억제성 핵산 또는 유전적 파괴를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열(들)은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산 및 제 2 핵산(들)은 하나 이상의 벡터(들)에 포함되고, 이는 선택적으로 바이러스 벡터(들)이다.
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공된 조합물은 키트로서 포장된다. 일부 실시 양태에서, 키트는 또한 조작된 세포 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 위한 지침을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 예를 들어 치료적 유효량으로 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 포함하는 것과 같은 제품 및/또는 키트가 제공된다. 일부 측면에서, 제품은 조작된 T 세포 치료와 같은 세포 치료와 같은 치료를 받을 예정이거나 받은 대상에게 조절인자(들)의 투여를 명시하는 설명서 및/또는 문서를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 지침 또는 문서는 질환 또는 증상을 갖는 대상에게의 투여를 추가로 명시하며, 여기서 질환 또는 증상 또는 관련 세포 또는 조직은 IDO -선택적으로 치료의 투여 이후- 및/또는 LAT-1과 같은 하나 이상의 아미노산 전달체를 발현하는 것으로 확인되거나 확인되었다. 일부 실시 양태에서, 지침 또는 문서는 세포 치료의 투여를 위한 전제 조건으로서, IDO의 발현을 지적하지 않고, 및/또는 수송체 또는 다른 마커의 발현을 지적하지 않는다.
도 1A는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 24 시간 또는 48 시간 동안 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극한 후, CD19 (CD19.A549)를 발현하는 A549 선암 세포에서, 및 비자극된 CD19.A549 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 (IDO1)의 발현 수준을 나타낸다.
도 1B는 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극한 후, HCC1806 인간 유방암 세포주; H2286 인간 소형 세포 폐암 세포주; H1975 인간 비소 세포 폐암 세포주; H1299 인간 비소 세포 폐암 림프절 전이 세포주; BT-549 인간 유방암 세포주; 및 CD19 (A549.CD19)를 발현하는 A549 선암 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 1C는 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극 후, Daudi, CD19 (K562.CD19)를 발현하는 K562 세포, CD19 (A549.CD19)를 발현하는 A549 세포, BT-549 인간 유방암 세포주 및 HS-5 인간 골수 간질 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 1d는 실시예 1에 기재된 바와 같이, 단독으로 배양된 CD19.A549 세포와 비교하여, 24 시간 또는 48 시간 동안 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 T 세포 또는 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포와 10㎍/mL 항-IFNγ 항체와 공배양한 후, CD19를 발현하는 A549 선암종 세포 (CD19.A549)에서 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 1E는 단독 배양된 CD19.A549 세포와 비교하여, 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포 또는 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포와 10㎍/mL 항-IFNγ 항체와의 공배양물의, IDO1의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 1F는 항-인터페론-감마 수용체 (IFNγR) 항체의 증가하는 농도 (0.75 부터 2.0 μg/mL까지) 하에서 또는 부재 (처리 없음t, no Tx) 하에서, 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포 또는 항-CD19 CAR T 세포와 함께 공배양한 후에 A549.CD19 표적 세포, 또는 이소타입 대조군에서 유동 세포 계측법에 의해 평가된 IDO1의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
도 1G는 24 시간 동안 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포, 항-ROR1 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포 또는 모의 형질도입 세포 (mock transduced cells)와의 공배양 후, CD19 (A549.CD19) 또는 A549 모세포를 발현하는 A549 선암 세포에서 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 1H는 CD19 (A549.CD19) 또는 A549 모세포를 발현하는 A549 선암 세포와 항-CD19 CAR+ T 세포 또는 모의 형질도입 세포의 공배양 후 배양 상등액에서의 IFNγ 생성을 나타낸다.
도 1I는 2 개의 상이한 프로모터 중 하나의 조절 하에서 내인성 CD19를 발현하는 A549 표적 세포에서의 CD19 발현 수준을 나타낸다.
도 1J는 2 가지 상이한 프로모터 중 하나의 대조군 및 항-CD19 CAR-T 세포 또는 CAR-T 세포가 없는 대조군 중 하나의 제어 하에서, 내인성 CD19를 발현하는 A549 표적 세포의 공배양물로부터 IFNγ 생산량을 나타낸다.
도 1K는 도 IJ에 기술된 공-배양물에서 유동 세포 계측법에 의해 측정된 IDO 발현을 나타낸다.
도 1L은 다양한 농도의 재조합 인간 IFNγ와 함께 배양된 CD19.A549 세포에서의 IDO1 발현을 나타낸다.
도 2A는 실시예 2와 기술된 것과 같이, 0, 0.1, 10 및 1000 nM의 IDO1 억제제 에파카도스타트의 존재 하에, 0.3 : 1, 1 : 1 또는 3 : 1의 이펙터 : 표적 (E : T) 비율에서, CD19.A549 세포와 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공배양물의 배양 상등액에서의, ELISA에 의해 측정된 트립토판 농도 (μM)를 나타낸다. 세포를 배양하고 트립토판 수준을 새로운(fresh) 배양 배지의 트립토판 수준과 비교하였다.
도 2b는 실시예 2와 기술된 것과 같이, 0, 0.1, 10 및 1000 nM 에파카도스타트(epacadostat)의 존재 하에, 3 : 1 E : T에서, CD19.A549 세포와 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공-배양의 배양 상등액에서의, ELISA에 의해 측정된 키누레닌 농도(μM)를 나타낸다. 세포를 배양하고 키누레닌 수준을 새로운 배양 배지의 키누레닌 수준과 비교하였다.
도 2C는 96 시간 동안 다양한 에파카도스타트 농도의 존재 하에서 항-CD19 CAR+ T 세포 및 A549.CD19 IDO+ 표적 세포의 공배양 이후의 트립토판 및 키누레닌 농도 (μM)를 나타낸다.
도 2D는 1 : 1의 이펙터 : 타겟 (E : T) 비율에서, CD19.A549 (IDO1+) 또는 CD19.Daudi 세포 (IDO1-) 및 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공-배양의 배양 상등액에서의, ELISA에 의해 측정된 트립토판 및 키누레닌 농도 (μM)를 나타낸다.
도 2E는 24 시간 동안, 단독으로 배양된(처리되지 않은) 또는 항-CD19 CAR-발현 T 세포 (α-CD19 CAR)와 함께 배양된 A549.CD19 세포 (IDO + 표적 세포)의 배양 상등액에서의 트립토판 및 키누레닌 농도 (μM)를 나타낸다.
도 3은 실시예 3A에 기술된 바와 같이, 0, 0.1, 10 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에서, 0.3 : 1, 1 : 1 또는 3 : 1의 E : T 비율로, CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 공배양한 후의, 항-CD19 CAR-발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 T 세포 증식을 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법에 의한 CellTrace ™ Violet의 희석을 이용하여 측정하였다.
도 4A 및 4B는 실시예 3A에 기술된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, CD19-발현 A549 표적 세포와의 공-배양 후 3 명의 상이한 건강한 공여자로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 CD4+ (도 4A) 또는 CD8+ (도 4B) T 세포의 평균 분열 수를 나타낸다.
도 4C는 250nM 에파카도스타트(epacadostat)의 존재 하에서, 96 시간 동안 CD19.A549 세포와 함께, 1 : 1의 E : T 비율로, 3 명의 상이한 건강한 공여자 중 하나로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공-배양에서의 웰 당 CAR-T 세포의 수를 나타낸다.
도 5A는 실시예 3A에 기술 된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, 1 : 1의 E : T 비율로, IDO1+ A549 표적 세포 (CD19.A549) 또는 IDO1- Daudi 표적 세포 (CD19.Daudi)와 공배양한 이후의, 항-CD19 CAR-발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 T 세포 증식을 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법에 의한 CellTrace ™ Violet의 희석을 이용하여 측정 하였다.
도 5B 및 5C는 실시예 3A에 기술 된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, IDO1+ A549 표적 세포 또는 IDO1- Daudi 표적 세포와 함께 공배양한 이후의, 항-CD19 CAR-발현 CD4+ (도 5B) 또는 CD8+ (도 5C) T 세포의 평균 분열 수를 나타낸다.
도 6은 실시예 3B에 기술된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, 1 : 1의 E : T로, CD19.A549 세포와 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공배양물의 배양 상등액 중에서, TNFα 분석 키트에 의해 측정된 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) (pg/㎖)의 수준을 나타낸다.
도 7A 및 7B는 실시예 3B에 기술된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에서 IDO1+ A549 표적 세포 또는 IDO1- Daudi 표적 세포와 공배양한 후, 유동 세포 계측법에 의해 검출된, 항-CD19 CAR-발현 CD4+ (도 7A) 또는 CD8+ (도 7B)의 CD25 표면 발현 수준을 나타낸다.
도 8A 및 8B는 실시예 3B에 기술된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, D19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와의 공-배양 후 3 명의 상이한 건강한 공여자로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 CD4+ (도 8A) 또는 CD8+ (도 8B)의, 유동 세포 계측법에 의해 검출된, CD25 표면 발현 수준을 나타낸다.
도 8C는 0.25 : 1의 E : T 비율로, 0, 3.9, 15.6, 62.5, 250 및 1000 nM의 존재 하에서, 항-CD19 CAR-발현 T 세포와 함께 약 340 시간 동안 배양된, NucRed-표지된 CD19.A549 세포의 플롯으로부터의 곡선하면적 (AUC)을 나타낸다.
도 9A는 퓨린 아날로그 플루다라빈의 농도가 증가하는 경우에, 48 시간 동안 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극하거나 자극하지 않고, CD19 (CD19.A549)를 발현하는 A549 선암 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 9B는 퓨린 아날로그 플루다라빈의 농도가 증가하는 경우에, 48 시간 동안 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극하거나 자극하지 않고, CD19 (CD19.A549)를 발현하는 A549 선암 세포의 배양물에서의 생존 가능한 세포의 백분율을 나타낸다.
도 9C는 48 시간에 첨가된 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 200 또는 1000μM의 플루다라빈의 존재 하에, FNγ와 함께 또는 IFNγ없이 배양된 CD19.A549 세포에서의, 96 시간 동안의 생존 세포 및 아넥신 V 염색 결과의 %를 나타낸다.
도 9D는 0, 6.25 또는 12.5 μM의 플루다라빈 존재 하에, IFNγ와 함께 또는 IFNγ없이 배양된 CD19.A549 세포에서, 96 시간 동안의 IDO1 발현의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
도 10A는 공-배양 초기에 첨가된 0, 10, 100 및 1000 nM 에파카도스타트 또는 24 시간 마다 배양물에 첨가된 5 μg/mL 보충(supplemental) 트립토판의 존재 하에, 1:1의 E:T 비율로, CD19.A549와 함께 96 시간 동안 배양한 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공배양물에서의 웰당 CD3+ 세포의 총 수를 나타낸다. 도 10B-10E는 공-배양물로부터의 사이토킨 GM-CSF (도 10B), IFNγ (도 10C), IL-2 (도 10D) 및 TNFα (도 10E)의 양을 나타낸다. 도 10F 및 10G는 공-배양물에서 CD4+ (도 10F) 및 CD8+ (도 10G) T 세포의 CD25 발현의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
도 11A는 20 ng/mL 재조합 인간 IFNγ로 24 시간 동안 자극시킨, HS-5 인간 골수 기질 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 (IDO1)의 발현 수준을 나타낸다. 도 11B는 인터페론-감마 (IFNγ) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 의한 자극시에 수지상 세포 (DC) 및 대식세포 (Mφ)에서의, 유동 세포 계측법에 의해 측정된, IDO1의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
도 12A는 Daudi, K562, HS-5 및 A549 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1, 인간에서 SLC7A5 유전자에 의해 코딩되는)의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
또한, 도 12B는 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극 한 후, HCC1806 인간 유방암 세포주; H2286 인간 소형 세포 폐암 세포주; H1975 인간 비소 세포 폐암 세포주; H1299 인간 비소 세포 폐암 림프절 전이 세포주; BT-549 인간 유방암 세포주; 및 CD19 (A549.CD19)를 발현하는 A549 선암 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 LAT1 발현 수준을 나타낸다.
도 12C는 인터페론-감마 (IFNγ) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 의한 자극시에 수지상 세포 (DC) 및 대식세포 (Mφ)에서의, 유동 세포 계측법에 의해 측정된, LAT1의 MFI를 나타낸다.
도 13은 HS-5 인간 골수 기질 세포 또는 표적 세포와 1 : 1의 E : T 비율로, 또는 HS-5 세포 및 표적 세포와 1 : 1 : 1의 비율로 공배양 후의, CAR-발현 T 세포의 T 세포 증식을 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법(Flow cytometry)에 의한 CellTrace ™ Violet의 희석을 이용하여 측정하였다..
도 14A 및 14B는 96 시간 동안 A549.CD19 세포와 함께, 24 시간마다 트리토판 보충과 함께, 또는 250nM 에파카도스타트의 존재 하에 공-배양 후, 3 개의 상이한 공여자로부터 생성된, 항-CD19 CAR 발현 세포의 T 세포 증식 (도 14A) 및 각 웰에서의 CAR T-세포 수 (도 14B)를 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법에 의한 CellTrace ™ Violet의 희석을 이용하여 측정하였다.
도 15A 및 15B는 다양한 농도의 보충 트립토판이 첨가되거나 첨가되지 않은 트립토판-고갈된 배지에서, CD19 (CD19.K562)로 형질 도입된 K562 인간 골수성 백혈병 표적 세포와 표지된 CD4+ CAR+ T 세포 (도 15A) 또는 CD8+ CAR+ T 세포 (도 15B)의 공배양물에서의 CellTrace ™ 바이올렛 염료의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다. 트립토판 함유 배지를 대조군 (Trp 대조군)으로 사용하였다. 도 15C는 CD19.K562 표적 세포의 수를 나타낸다.
도 15D는 트립토판-결핍된 배지 (tryptophan-depleted media) 단독 또는 다양한 양의 트립토판이 보충된 트립토판-결핍된 배지에서, 플레이트-바운드(plate-bound) 항-이디오타입 항진 항체(anti-idiotypic agonistic antibody)와 함께 배양된 항-CD19 CAR-발현 세포의 배양물로부터의 CAR+ T 세포 수를 나타낸다.
도 15E는 3 개의 다른 공여자로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 T 세포를 이용한 유사한 연구에서의 CAR+ T 세포 수 (y-축)를 나타낸다.
도 16A는 0, 15.6, 62.5, 250 및 1000nM의 에파카도스타트의 존재 하에, 96 시간 동안 배양된 항-19 CAR+ T 세포와 CD19- 발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)의 공배양물의 각 웰에서의 CAR-T 세포 수를 나타낸다. 도 16B는 에파카도스타트 없이 공배양 이후, 24 시간 마다 보충 트립토판 첨가 또는 첨가 없이 96 시간 동안 배양한 배양물의 각 웰에서의 CAR-T 세포 수를 나타낸다.
도 16C 및 16D는 에파카도스타의 부재 (처리 없음 (Tx 없음))하에서 또는 250nM 에파카도스타와 함께, 세포 배지에서 96 시간 동안 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 공배양되고; 이후 보충 트립토판이 있거나 없는 트립토판-결핍된 배지 (96 시간에 처리되지 않은(“no tx”) 배양물로부터의 배지)에서 새로운 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 함께 재-배양된, 2 개의 상이한 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 생성된, CD4+ 또는 CD8+ 항 CD19 CAR-발현 세포 중 IFNγ+ 세포 (도 16C) 및 IL-2+ 세포 (도 16D)의 백분율을 나타낸다.
도 17A는 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 μM L-키누레닌, 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA) 또는 각각 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 μM의 L-키누레닌 및 3- HAA의 존재 하에, 1:1의 이펙터 : 표적 (E : T) 비율로, CD19.Daudi 표적 세포 (IDO1 발현을 유도하지 않는 것으로 관찰된 IDO1- 표적 세포)와의 공배양 후의, 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 T 세포 증식을 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법에 의한 CellTrace ™ 바이올렛의 희석을 이용하여 측정하였다.
도 17B는 6.25 내지 100 μM의 L-키누레닌, 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA) 또는 6.25 내지 100 μM의 L-키누레닌 및 3-HAA 각각의 존재 하에, 96 시간 동안 IDO1-CD19.K562 세포와 공-배양한 후의 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 CAR+ T 세포 수를 나타낸다.
도 18A는 트립토판 고갈 조건 (화학적으로 정의된 트립토판이 없는 배지)에서 24, 48, 72 또는 96 시간 (24, 48, 72 또는 96 시간 Trp starv.) 동안 배양되고; 이후 보충 트립토판이 첨가되고, 24, 48, 72 또는 96 시간에 세포가 수확될 때까지 트립토판 존재 하에서 배양한 항-CD19 CAR+ 세포의 CD3+ 수를 나타낸다. 대조군 세포를 트립토판이 충분한 배지(완전 배지)에서 각각의 시간 동안 배양하였다. 트립토판이 고갈된 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 사이토카인 생산량을 도면에 나타내었다. 도 18B 또는 18C는 각각 IFNγ에 대한 것이고, 18D 또는 18E는 각각 TNFα에 대한 것이다.
도 19A는 유의하게 상향 조절 (오른쪽) 또는 하향 조절 (왼쪽)된 유전자를 포함하는 각 유전자 산물의 발현의 log2 배수-변화 (fold-change)로, 트립토판이 충분한 조건과 트립토판 결핍 조건에서 배양된 CAR+ T 세포들 간에 유전자 산물의 발현(조정된 p 값의 log10) 차이의 통계적 유의성을 도시하는 볼케이노 플롯(volcano plot)을 나타낸다.
도 19B는 트립토판 충분 (Ctrl) 및 트립토판 고갈 (Tryp) 조건에서 배양된 CAR+ T 세포에서의 RNAseq 결과를 나타내며, eIF2α/ ATF4 통합 스트레스 반응 경로, ATF4 및 DDIT3 (또한 CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질(CHOP)로도 알려짐)의 구성원(멤버)을 코딩하는 2 개의 예시적인 유전자에 대해 킬로베이스 밀리언 당 전사체 값 (transcripts per kilobase million (TPM) values)으로 나타내었다.
도 19C는 트립토판 고갈 상태에서 영향을 받는 발현 분석에 기초하여 확인된 세포 신호 전달 경로를 평가하는 유전자 온톨로지 분석 및 발현이 변경된 ATF4 경로에 관련된 유전자를 보여주는 예시적인 도식에 기초한 결과를 나타낸다.
도 20은 항-CD19 CAR-발현 T 세포를 투여 (항-CD19 CAR-T) 또는 투여하지 않은 (나이브) A549.CD19 세포 (IDO+) 종양 이종이식 마우스 모델로부터 분리된 단일 세포 현택액에 대한 유동 세포 계측법 플롯을 나타내며, 이는 살아 있는(live), 비-마우스 세포(non-mouse cell)에 대한 게이팅(gating)을 보여주고 CD3, CD8 및 IDO 발현을 평가한다.
도 21은 항-CD19 CAR을 발현하는 자가 T 세포를 단일 주입하기 전과 후에 DLBCL (Diffuse Large B-Cell Lymphoma)이 있는 인간 대상체(human subjects)로부터의 일련의 종양 생검 섹션에서의, 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색 및 항-CD19 CAR을 코딩하는 mRNA에 특이적인 프로브를 이용한 인 시추(in situ) 하이브리드화 (ISH), IDO1 및 프로그램화된 사멸-리간드 1 (programmed death-ligand 1, PD-L1) 단백질 발현을 평가하기 위한 면역 형광 염색을 나타낸다.
도 1B는 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극한 후, HCC1806 인간 유방암 세포주; H2286 인간 소형 세포 폐암 세포주; H1975 인간 비소 세포 폐암 세포주; H1299 인간 비소 세포 폐암 림프절 전이 세포주; BT-549 인간 유방암 세포주; 및 CD19 (A549.CD19)를 발현하는 A549 선암 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 1C는 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극 후, Daudi, CD19 (K562.CD19)를 발현하는 K562 세포, CD19 (A549.CD19)를 발현하는 A549 세포, BT-549 인간 유방암 세포주 및 HS-5 인간 골수 간질 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 1d는 실시예 1에 기재된 바와 같이, 단독으로 배양된 CD19.A549 세포와 비교하여, 24 시간 또는 48 시간 동안 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 T 세포 또는 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포와 10㎍/mL 항-IFNγ 항체와 공배양한 후, CD19를 발현하는 A549 선암종 세포 (CD19.A549)에서 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 1E는 단독 배양된 CD19.A549 세포와 비교하여, 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포 또는 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포와 10㎍/mL 항-IFNγ 항체와의 공배양물의, IDO1의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 1F는 항-인터페론-감마 수용체 (IFNγR) 항체의 증가하는 농도 (0.75 부터 2.0 μg/mL까지) 하에서 또는 부재 (처리 없음t, no Tx) 하에서, 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포 또는 항-CD19 CAR T 세포와 함께 공배양한 후에 A549.CD19 표적 세포, 또는 이소타입 대조군에서 유동 세포 계측법에 의해 평가된 IDO1의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
도 1G는 24 시간 동안 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포, 항-ROR1 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포 또는 모의 형질도입 세포 (mock transduced cells)와의 공배양 후, CD19 (A549.CD19) 또는 A549 모세포를 발현하는 A549 선암 세포에서 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 1H는 CD19 (A549.CD19) 또는 A549 모세포를 발현하는 A549 선암 세포와 항-CD19 CAR+ T 세포 또는 모의 형질도입 세포의 공배양 후 배양 상등액에서의 IFNγ 생성을 나타낸다.
도 1I는 2 개의 상이한 프로모터 중 하나의 조절 하에서 내인성 CD19를 발현하는 A549 표적 세포에서의 CD19 발현 수준을 나타낸다.
도 1J는 2 가지 상이한 프로모터 중 하나의 대조군 및 항-CD19 CAR-T 세포 또는 CAR-T 세포가 없는 대조군 중 하나의 제어 하에서, 내인성 CD19를 발현하는 A549 표적 세포의 공배양물로부터 IFNγ 생산량을 나타낸다.
도 1K는 도 IJ에 기술된 공-배양물에서 유동 세포 계측법에 의해 측정된 IDO 발현을 나타낸다.
도 1L은 다양한 농도의 재조합 인간 IFNγ와 함께 배양된 CD19.A549 세포에서의 IDO1 발현을 나타낸다.
도 2A는 실시예 2와 기술된 것과 같이, 0, 0.1, 10 및 1000 nM의 IDO1 억제제 에파카도스타트의 존재 하에, 0.3 : 1, 1 : 1 또는 3 : 1의 이펙터 : 표적 (E : T) 비율에서, CD19.A549 세포와 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공배양물의 배양 상등액에서의, ELISA에 의해 측정된 트립토판 농도 (μM)를 나타낸다. 세포를 배양하고 트립토판 수준을 새로운(fresh) 배양 배지의 트립토판 수준과 비교하였다.
도 2b는 실시예 2와 기술된 것과 같이, 0, 0.1, 10 및 1000 nM 에파카도스타트(epacadostat)의 존재 하에, 3 : 1 E : T에서, CD19.A549 세포와 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공-배양의 배양 상등액에서의, ELISA에 의해 측정된 키누레닌 농도(μM)를 나타낸다. 세포를 배양하고 키누레닌 수준을 새로운 배양 배지의 키누레닌 수준과 비교하였다.
도 2C는 96 시간 동안 다양한 에파카도스타트 농도의 존재 하에서 항-CD19 CAR+ T 세포 및 A549.CD19 IDO+ 표적 세포의 공배양 이후의 트립토판 및 키누레닌 농도 (μM)를 나타낸다.
도 2D는 1 : 1의 이펙터 : 타겟 (E : T) 비율에서, CD19.A549 (IDO1+) 또는 CD19.Daudi 세포 (IDO1-) 및 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공-배양의 배양 상등액에서의, ELISA에 의해 측정된 트립토판 및 키누레닌 농도 (μM)를 나타낸다.
도 2E는 24 시간 동안, 단독으로 배양된(처리되지 않은) 또는 항-CD19 CAR-발현 T 세포 (α-CD19 CAR)와 함께 배양된 A549.CD19 세포 (IDO + 표적 세포)의 배양 상등액에서의 트립토판 및 키누레닌 농도 (μM)를 나타낸다.
도 3은 실시예 3A에 기술된 바와 같이, 0, 0.1, 10 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에서, 0.3 : 1, 1 : 1 또는 3 : 1의 E : T 비율로, CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 공배양한 후의, 항-CD19 CAR-발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 T 세포 증식을 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법에 의한 CellTrace ™ Violet의 희석을 이용하여 측정하였다.
도 4A 및 4B는 실시예 3A에 기술된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, CD19-발현 A549 표적 세포와의 공-배양 후 3 명의 상이한 건강한 공여자로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 CD4+ (도 4A) 또는 CD8+ (도 4B) T 세포의 평균 분열 수를 나타낸다.
도 4C는 250nM 에파카도스타트(epacadostat)의 존재 하에서, 96 시간 동안 CD19.A549 세포와 함께, 1 : 1의 E : T 비율로, 3 명의 상이한 건강한 공여자 중 하나로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공-배양에서의 웰 당 CAR-T 세포의 수를 나타낸다.
도 5A는 실시예 3A에 기술 된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, 1 : 1의 E : T 비율로, IDO1+ A549 표적 세포 (CD19.A549) 또는 IDO1- Daudi 표적 세포 (CD19.Daudi)와 공배양한 이후의, 항-CD19 CAR-발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 T 세포 증식을 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법에 의한 CellTrace ™ Violet의 희석을 이용하여 측정 하였다.
도 5B 및 5C는 실시예 3A에 기술 된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, IDO1+ A549 표적 세포 또는 IDO1- Daudi 표적 세포와 함께 공배양한 이후의, 항-CD19 CAR-발현 CD4+ (도 5B) 또는 CD8+ (도 5C) T 세포의 평균 분열 수를 나타낸다.
도 6은 실시예 3B에 기술된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, 1 : 1의 E : T로, CD19.A549 세포와 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공배양물의 배양 상등액 중에서, TNFα 분석 키트에 의해 측정된 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) (pg/㎖)의 수준을 나타낸다.
도 7A 및 7B는 실시예 3B에 기술된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에서 IDO1+ A549 표적 세포 또는 IDO1- Daudi 표적 세포와 공배양한 후, 유동 세포 계측법에 의해 검출된, 항-CD19 CAR-발현 CD4+ (도 7A) 또는 CD8+ (도 7B)의 CD25 표면 발현 수준을 나타낸다.
도 8A 및 8B는 실시예 3B에 기술된 바와 같이, 0, 10, 100, 250, 500 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에, D19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와의 공-배양 후 3 명의 상이한 건강한 공여자로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 CD4+ (도 8A) 또는 CD8+ (도 8B)의, 유동 세포 계측법에 의해 검출된, CD25 표면 발현 수준을 나타낸다.
도 8C는 0.25 : 1의 E : T 비율로, 0, 3.9, 15.6, 62.5, 250 및 1000 nM의 존재 하에서, 항-CD19 CAR-발현 T 세포와 함께 약 340 시간 동안 배양된, NucRed-표지된 CD19.A549 세포의 플롯으로부터의 곡선하면적 (AUC)을 나타낸다.
도 9A는 퓨린 아날로그 플루다라빈의 농도가 증가하는 경우에, 48 시간 동안 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극하거나 자극하지 않고, CD19 (CD19.A549)를 발현하는 A549 선암 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 IDO1 발현 수준을 나타낸다.
도 9B는 퓨린 아날로그 플루다라빈의 농도가 증가하는 경우에, 48 시간 동안 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극하거나 자극하지 않고, CD19 (CD19.A549)를 발현하는 A549 선암 세포의 배양물에서의 생존 가능한 세포의 백분율을 나타낸다.
도 9C는 48 시간에 첨가된 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 200 또는 1000μM의 플루다라빈의 존재 하에, FNγ와 함께 또는 IFNγ없이 배양된 CD19.A549 세포에서의, 96 시간 동안의 생존 세포 및 아넥신 V 염색 결과의 %를 나타낸다.
도 9D는 0, 6.25 또는 12.5 μM의 플루다라빈 존재 하에, IFNγ와 함께 또는 IFNγ없이 배양된 CD19.A549 세포에서, 96 시간 동안의 IDO1 발현의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
도 10A는 공-배양 초기에 첨가된 0, 10, 100 및 1000 nM 에파카도스타트 또는 24 시간 마다 배양물에 첨가된 5 μg/mL 보충(supplemental) 트립토판의 존재 하에, 1:1의 E:T 비율로, CD19.A549와 함께 96 시간 동안 배양한 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 공배양물에서의 웰당 CD3+ 세포의 총 수를 나타낸다. 도 10B-10E는 공-배양물로부터의 사이토킨 GM-CSF (도 10B), IFNγ (도 10C), IL-2 (도 10D) 및 TNFα (도 10E)의 양을 나타낸다. 도 10F 및 10G는 공-배양물에서 CD4+ (도 10F) 및 CD8+ (도 10G) T 세포의 CD25 발현의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
도 11A는 20 ng/mL 재조합 인간 IFNγ로 24 시간 동안 자극시킨, HS-5 인간 골수 기질 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 (IDO1)의 발현 수준을 나타낸다. 도 11B는 인터페론-감마 (IFNγ) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 의한 자극시에 수지상 세포 (DC) 및 대식세포 (Mφ)에서의, 유동 세포 계측법에 의해 측정된, IDO1의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
도 12A는 Daudi, K562, HS-5 및 A549 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1, 인간에서 SLC7A5 유전자에 의해 코딩되는)의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다.
또한, 도 12B는 인터페론 감마 (IFNγ)로 자극 한 후, HCC1806 인간 유방암 세포주; H2286 인간 소형 세포 폐암 세포주; H1975 인간 비소 세포 폐암 세포주; H1299 인간 비소 세포 폐암 림프절 전이 세포주; BT-549 인간 유방암 세포주; 및 CD19 (A549.CD19)를 발현하는 A549 선암 세포에서, 유동 세포 계측법에 의해 검출된 LAT1 발현 수준을 나타낸다.
도 12C는 인터페론-감마 (IFNγ) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 의한 자극시에 수지상 세포 (DC) 및 대식세포 (Mφ)에서의, 유동 세포 계측법에 의해 측정된, LAT1의 MFI를 나타낸다.
도 13은 HS-5 인간 골수 기질 세포 또는 표적 세포와 1 : 1의 E : T 비율로, 또는 HS-5 세포 및 표적 세포와 1 : 1 : 1의 비율로 공배양 후의, CAR-발현 T 세포의 T 세포 증식을 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법(Flow cytometry)에 의한 CellTrace ™ Violet의 희석을 이용하여 측정하였다..
도 14A 및 14B는 96 시간 동안 A549.CD19 세포와 함께, 24 시간마다 트리토판 보충과 함께, 또는 250nM 에파카도스타트의 존재 하에 공-배양 후, 3 개의 상이한 공여자로부터 생성된, 항-CD19 CAR 발현 세포의 T 세포 증식 (도 14A) 및 각 웰에서의 CAR T-세포 수 (도 14B)를 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법에 의한 CellTrace ™ Violet의 희석을 이용하여 측정하였다.
도 15A 및 15B는 다양한 농도의 보충 트립토판이 첨가되거나 첨가되지 않은 트립토판-고갈된 배지에서, CD19 (CD19.K562)로 형질 도입된 K562 인간 골수성 백혈병 표적 세포와 표지된 CD4+ CAR+ T 세포 (도 15A) 또는 CD8+ CAR+ T 세포 (도 15B)의 공배양물에서의 CellTrace ™ 바이올렛 염료의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다. 트립토판 함유 배지를 대조군 (Trp 대조군)으로 사용하였다. 도 15C는 CD19.K562 표적 세포의 수를 나타낸다.
도 15D는 트립토판-결핍된 배지 (tryptophan-depleted media) 단독 또는 다양한 양의 트립토판이 보충된 트립토판-결핍된 배지에서, 플레이트-바운드(plate-bound) 항-이디오타입 항진 항체(anti-idiotypic agonistic antibody)와 함께 배양된 항-CD19 CAR-발현 세포의 배양물로부터의 CAR+ T 세포 수를 나타낸다.
도 15E는 3 개의 다른 공여자로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 T 세포를 이용한 유사한 연구에서의 CAR+ T 세포 수 (y-축)를 나타낸다.
도 16A는 0, 15.6, 62.5, 250 및 1000nM의 에파카도스타트의 존재 하에, 96 시간 동안 배양된 항-19 CAR+ T 세포와 CD19- 발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)의 공배양물의 각 웰에서의 CAR-T 세포 수를 나타낸다. 도 16B는 에파카도스타트 없이 공배양 이후, 24 시간 마다 보충 트립토판 첨가 또는 첨가 없이 96 시간 동안 배양한 배양물의 각 웰에서의 CAR-T 세포 수를 나타낸다.
도 16C 및 16D는 에파카도스타의 부재 (처리 없음 (Tx 없음))하에서 또는 250nM 에파카도스타와 함께, 세포 배지에서 96 시간 동안 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 공배양되고; 이후 보충 트립토판이 있거나 없는 트립토판-결핍된 배지 (96 시간에 처리되지 않은(“no tx”) 배양물로부터의 배지)에서 새로운 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 함께 재-배양된, 2 개의 상이한 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 생성된, CD4+ 또는 CD8+ 항 CD19 CAR-발현 세포 중 IFNγ+ 세포 (도 16C) 및 IL-2+ 세포 (도 16D)의 백분율을 나타낸다.
도 17A는 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 μM L-키누레닌, 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA) 또는 각각 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 μM의 L-키누레닌 및 3- HAA의 존재 하에, 1:1의 이펙터 : 표적 (E : T) 비율로, CD19.Daudi 표적 세포 (IDO1 발현을 유도하지 않는 것으로 관찰된 IDO1- 표적 세포)와의 공배양 후의, 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 T 세포 증식을 나타낸다. T 세포 증식은 유동 세포 계측법에 의한 CellTrace ™ 바이올렛의 희석을 이용하여 측정하였다.
도 17B는 6.25 내지 100 μM의 L-키누레닌, 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA) 또는 6.25 내지 100 μM의 L-키누레닌 및 3-HAA 각각의 존재 하에, 96 시간 동안 IDO1-CD19.K562 세포와 공-배양한 후의 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 CAR+ T 세포 수를 나타낸다.
도 18A는 트립토판 고갈 조건 (화학적으로 정의된 트립토판이 없는 배지)에서 24, 48, 72 또는 96 시간 (24, 48, 72 또는 96 시간 Trp starv.) 동안 배양되고; 이후 보충 트립토판이 첨가되고, 24, 48, 72 또는 96 시간에 세포가 수확될 때까지 트립토판 존재 하에서 배양한 항-CD19 CAR+ 세포의 CD3+ 수를 나타낸다. 대조군 세포를 트립토판이 충분한 배지(완전 배지)에서 각각의 시간 동안 배양하였다. 트립토판이 고갈된 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 사이토카인 생산량을 도면에 나타내었다. 도 18B 또는 18C는 각각 IFNγ에 대한 것이고, 18D 또는 18E는 각각 TNFα에 대한 것이다.
도 19A는 유의하게 상향 조절 (오른쪽) 또는 하향 조절 (왼쪽)된 유전자를 포함하는 각 유전자 산물의 발현의 log2 배수-변화 (fold-change)로, 트립토판이 충분한 조건과 트립토판 결핍 조건에서 배양된 CAR+ T 세포들 간에 유전자 산물의 발현(조정된 p 값의 log10) 차이의 통계적 유의성을 도시하는 볼케이노 플롯(volcano plot)을 나타낸다.
도 19B는 트립토판 충분 (Ctrl) 및 트립토판 고갈 (Tryp) 조건에서 배양된 CAR+ T 세포에서의 RNAseq 결과를 나타내며, eIF2α/ ATF4 통합 스트레스 반응 경로, ATF4 및 DDIT3 (또한 CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질(CHOP)로도 알려짐)의 구성원(멤버)을 코딩하는 2 개의 예시적인 유전자에 대해 킬로베이스 밀리언 당 전사체 값 (transcripts per kilobase million (TPM) values)으로 나타내었다.
도 19C는 트립토판 고갈 상태에서 영향을 받는 발현 분석에 기초하여 확인된 세포 신호 전달 경로를 평가하는 유전자 온톨로지 분석 및 발현이 변경된 ATF4 경로에 관련된 유전자를 보여주는 예시적인 도식에 기초한 결과를 나타낸다.
도 20은 항-CD19 CAR-발현 T 세포를 투여 (항-CD19 CAR-T) 또는 투여하지 않은 (나이브) A549.CD19 세포 (IDO+) 종양 이종이식 마우스 모델로부터 분리된 단일 세포 현택액에 대한 유동 세포 계측법 플롯을 나타내며, 이는 살아 있는(live), 비-마우스 세포(non-mouse cell)에 대한 게이팅(gating)을 보여주고 CD3, CD8 및 IDO 발현을 평가한다.
도 21은 항-CD19 CAR을 발현하는 자가 T 세포를 단일 주입하기 전과 후에 DLBCL (Diffuse Large B-Cell Lymphoma)이 있는 인간 대상체(human subjects)로부터의 일련의 종양 생검 섹션에서의, 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색 및 항-CD19 CAR을 코딩하는 mRNA에 특이적인 프로브를 이용한 인 시추(in situ) 하이브리드화 (ISH), IDO1 및 프로그램화된 사멸-리간드 1 (programmed death-ligand 1, PD-L1) 단백질 발현을 평가하기 위한 면역 형광 염색을 나타낸다.
본 발명은 면역 세포 치료 또는 면역 치료제, 예를 들어 T 세포 치료(예, CAR-발현 T 세포)과 같은 입양 세포 치료용 세포 또는 하나 또는 이상의 T 세포 또는 다른 면역 세포를 리크루팅(모집)할 수 있는 이중 특이적 또는 다중 특이적 제제 또는 항체와 같은 T 세포-관련 치료제를 포함하는 조성물과 관련된, 면역 세포 활성의 증진 및/또는 활성을 강화 또는 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 치료 또는 면역 치료제는 하나 이상의 관문 조절제를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 T 세포 치료(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료, 및 키누레닌 경로 조절인자와 같은 트립토판 대사 경로 조절인자의 병용 요법을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 면역 치료는 T 세포 치료이고 키누레인 경로 조절인자와 같은 트립토판 대사 경로 조절인자와 함께 제공된 병용 요법은 T 세포 치료의 T 세포의 증식 또는 활성을 증진 또는 조절한다. 일부 실시 양태에서, 증식 또는 활성의 증강은, 예를 들어 필수 아미노산 트립토판의 대사 작용, 예를 들어 이화작용으로 인한 면역 억제 효과에 의해 매개되는 효과가 없는 경우에서 관찰되는 수준 또는 활성과 같은 그러한 활성의 기본 (baseline) 상태 또는 정상 상태 수준으로 복원되거나 회복되는 수준이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (indole amine-pyrrole 2,3-dioxygenase 1 (IDO1)) 효소의 억제제이다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료를(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료는 임의로 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 요법, 종양 침윤 림프구(TIL)요법 또는 형질전환 TCR 요법의 선택적인 T 세포 치료를 발현하는 재조합 수용체이다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 키메라 수용체 (CAR)이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자로는 효소 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (indole amine-pyrrole 2,3-dioxygenase 1 (IDO1))의 억제제, IDO2의 억제제 및/또는 트립토판-2,3디옥시게나아제(TDO)의 억제제이다. 일부 실시 양태에서, 조절제는 선택적으로 에파카도스타트인 IDO1의 억제제이다.
본 출원서에 기재된 특허 문서, 과학 기사 및 데이터베이스를 포함한 모든 간행물은 각 개별 간행물이 개별적으로 참조로 포함된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 기재된 정의가 본원에 참고문헌으로 인용된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 공보에 기재된 정의와 상반되거나 그렇지 않아 일치 하지 않으면, 본원에 기재된 정의는 본원에 참고로 인용된 정의보다 우선한다.
제약은 아니지만, 개시의 명료성을 위해, 자세한 설명은 하기의 세부항목으로 구분된다. 본 출원서에서 사용된 세부항목 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며 설명된 주제를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Ι. 면역 치료와 관련된 치료 방법에서 키누레닌 경로의 조절
본 발명은 세포 치료와 같은 면역 치료, 및 키누레닌 경로의 조절인자와 같은 대체 대사 경로와 같은 트립토판 대사 경로의 조절인자를 포함하는 병용 요법을 제공한다.
일 측면에서, 많은 종류의 암의 조양 미세 환경 (TME)에서, 필수 아미노산 트립토판(TRP)의 이화작용과 같은 대사 작용은 면역 억제성 환경유지에 관여한다. 예를 들어, 일 측면에서, 하나 이상의 대안적인 트립토판 대사 작용 경로가 수반된다. TRP 대사에 관여하는 경로 중에는 L-트립토판을 N-포르밀-L-키누레닌으로 전환시킴으로써 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)이 TRP 분해에 관여하고 이어서 일련의 단계를 통해 대사되어 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)를 형성하는 키누레인 경로가 있다. 종양 세포 및 수상돌기 세포(DCs), 대식세포 및 미성숙 단핵구의 특이적인 서브 세트를 포함하는 TMA에서 여러 세포 유형은 인터페론 γ, 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 또는 신호 변환기 및 전사 활성제(STAT3)-활성제 자극제와 같은 염증 신호에 반응하여 IDO1의 증가된 수준을 나타낸다. 일 측면에서, 종양 미세 환경의 “방관자”세포, 예를 들어 골수 간질 세포와 같은 간질 세포는 IFNγ 또는 TNFα와 같은 염증성 신호에 반응하여 증가된 수준의 IDO1을 발현할 수 있다.
일 측면에서, TME의 암 세포 또는 종양 세포는 암세포 또는 종양세포가 세포 독성 또는 전 염증성 면역 반응에 반응하여 그들의 표현형을 변화시켜 항종양 면역 반응을 제한 및 회피하는 적응 면역 저항성을 촉진할 수 있다. 일 측면에서, T 세포 또는 양성 전이된 T 세포와 같은 면역 세포에 의한 암세포의 특이적인 인식은 면역-활성화 사이토카인, 예를 들어 IFN 또는 TNFα의 생산을 유도할 수 있다. 사이토카인의 생성시, 암 또는 종양 세포는 예를 들어 IDO1의 발현, 미세 환경에서의 트립토판의 결핍 또는 암세포에 의한 프로그램된 사멸 리간드(PD-L1)의 발현에 의한 면역 반응을 제한하거나 회피함으로써 반응 한다 (참조, Ribas, A. (2015) Cancer Discov.5 (9) : 915-919 참조). 경우에 따라 적응 면역 저항 반응은 트립토판의 이화 작용을 통해 TME에서 T 세포의 활동을 제한하여 국부적인 아미노산 결핍 및 트립토판 이화 생성물의 축적을 초래할 수 있다.
일 측면에서, 특정 종양 세포 또는 암세포 또는 TME 내의 다른 세포는 트립토판의 결핍 또는 트립토판(또는 다른 아미노산) 고갈 환경에 대한 노출에 대한 반응과 같은, LAT1/CD98hc 또는 LAT2/CD98hc와 같은 트립토판 수송체와 같은 아미노산 수송체의 발현의 높은 수준의 발현 또는 상향 조절을 나타낼 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 상향 조절 및/또는 발현은 환경으로부터 종양세포, 예를 들어 트립토판에 의한 아미노산의 흡수 증가 또는 흡수를 허용한다. 일 측면에서, 조양 세포에 의한 그러한 흡수 또는 증가는 TME에서 트립토판이 고갈된 또는 트립토판이 결핍된 환경 또는 조건을 촉진 또는 향상시킬 수 있다 (참조, Broer 등 (2011) Biochem. J. 436, 193-211, Wang 등 (2015) Am J Cancer Res 5 (4) : 1281-1294, Ribas, A. (2015) Cancer Discov.5 (9) : 915-919). 일 측면에서, 이러한 발현 및 흡수 또는 흡수의 증가는 이미 굶어 죽은 환경의 영향, 예를 들어 T 세포 및/또는 치료의 조작된 T 세포와 같은 다른 면역 세포이 트립토판 및/또는 트립토판 고갈의 경험 효과에 대해 경쟁할 수 없도록, 수송체를 상향 조절 또는 발현시킨 종양 또는 종양 관련 세포는 대부분 또는 모든 이용 가능한 트립토판의 섭취를 악화시킨다.
본 발명에 기재된 바와 같이 일 측면에서, 질병 세포 및/또는 관련된 세포 또는 조직에 의해, 예를 들어 IDO1의 발현 및/또는 활성의 증가 또는 LAT1/CD98hc 또는 LAT2/CD98hc와 같은 트립토판 수송체의 발현의 상향 조절에 의한 트립토판-고갈 또는 트립토판-고갈 상태의 생성 또는 악화는 예를 들어 T 세포와 같은 항-종양 면역 세포의 활성, 증식 및/또는 팽창과 같은 세포 치료 및/또는 면역 세포의 하나 이상의 효과를 억제하거나 저해할 수 있다. 일 측면에서, 키누레닌 경로의 활성 및/또는 종양 미세 환경(TME)에서의 트립토판 대사 작용은 하나 이상의 면역 억제 활성을 초래할 수 있다. 일 측면에서, 종양 미세 환경 (TME)에서의 종양 세포, 골수 세포 및/또는 간질 세포에 의한 IDO1 발현은 TME의 면역 억제 상태에 기여한다. TME에서 높은 수준의 IDO1 발현은 TRP의 감소 또는 결핍 및 키누레닌의 증가 및 항 종양 면역 반응의 억제를 초래할 수 있다. 일 측면에서, TME에서 IDO1의 발현은 예를 들어 T 세포와 같은 면역 세포의 활성, 기능, 증식, 생존 및/또는 지속에 필요한 인자 또는 대사 물질의 고갈을 초래할 수 있다. 일 측면에서, IDO1 발현 세포는 (1) 세포 독성 T 림프구, NK 세포 및 형질 세포의 기능의 실행기 및 증식의 억제를 지시함으로써; (2) 순수한 CD4+ T 세포를 CD4+ CD25+ FOXP3+ Treg로 전환시키고 이들을 활성화시키는 것; 및/또는 (3) 예를 들어 방관자 억제라고 알려진 과정을 수행하는 것과 같이 인접한 IDO1-발현 DC에서 면역 억제 활성을 촉발하여, 예를 들어 TME에서 광범위하고 강력한 면역 억제 효과를 발휘할 수 있다 (Vacchelli et al., (2014) OncoImmunology 3:10, e957994). 일 측면에서, 키누레닌 (KYN) 및 이의 유도체는 아릴 탄화수소 수용체(AHR)에 결합할 수 있다. KYN과 AHR의 결합은 인터루킨-17 (IL-17) 생산 Th (Th17) 세포로의 분화를 억제하면서 Treg 표현형을 선호하는 비 순응 CD4+ T-헬퍼 (Th) 세포의 분화를 재 프로그램한다. AHR의 활성화는 또한 수상 돌기 세포 (DC)에 대한 내인성 표현형을 촉진시킬 수 있으며, CD8+ T 세포 반응, 종양 항원에 대한 면역 내성 및 항원-유도된 세포 사멸 또는 아네르기를 억제 할 수 있다. KYN과 그 유도체의 축적은 또한 CD8+ T 세포, NK 세포 및 NK T 세포에 세포 독성을 나타낼 수 있다.
일부 암 환자에서는 IDO1이 만성적으로 활성화되고 IDO1 발현이 증가하면 일부 암 환자에서 생존율이 감소할 수 있는 독립적인 예후 변수가 될 수 있다. 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML), 소세포 폐, 난소 암, 대장 암, 췌장암 및 자궁 내막 암을 치료하는데 사용될 수 있다 (참고, Moon et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:51, Platten et al., Front Immunol. 2015 Jan 12; 5 : 673; Weinmann , H., ChemMedChem 2016, 11 : 450-466). IDO1의 억제는, 일부 구현 예에서, TRP의 면역 효과 세포를 고갈시키는 것, KYN 및 그의 유도체, 예를 들어 3-하이드록시 키누레닌, 키누레인산 및 3-하이드록시 안트라닐산의 축적을 촉진시키는 것과 같은 TME에서 면역 억제 효과 및/또는 IDO1의 다른 효과를 감소시키거나 반전시킬 수 있고, 중 일부는 CD8+ T 세포, NK 세포 및 NK T 세포에 세포 독성을 나타낼 수 있으며 CD4+ T 세포와 조절 T 세포 (Tregs)의 분화를 촉진할 수 있다.
일 측면에서, T 세포는 키누레닌 경로 및/또는 트립토판 대사 활동의 활성에 민감할 수 있다. 일 측면에서, T 세포는 예를 들어, TME 환경에서 트립토판 결핍에 민감하다. 경우에 따라, T 세포는 세포 주기 정지, 세포 사멸 또는 증식의 결핍으로 야기되는 스트레스 반응 또는 아미노산 결핍 반응의 개시 및 키나아제 일반 제어 비 억제성 2(GCN2)의 활성화로 야기되는 비전하 tRNA를 통해 낮은 트립토판 수준을 감지 할 수 있다. GCN2의 활성화는 또한 조절 T 세포 (Treg)의 분화를 촉진하고 Treg 활성을 증가시켜 추가 면역 억제를 유발한다. 일 경우에, 키누레닌 경로 및/또는 트립토판 대사활동은 소진, T 세포의 실행기의 아네르기 또는 세포 사멸, 항 종약 면역 반응의 억제 또는 종양 하원에 대한 내성, Tregs의 생성 및 활성화, 및 TME의 면역 억제 상태에 기여를 유도할 수 있다 (참조 Moon et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:51, Platten et al., Front Immunol. 2015 Jan 12, 5 : 673, Weinmann, H., ChemMedChem 2016, 11 : 450- 466). 일 측면에서, TME에서 IDO1의 발현은 고갈, 저응답 (아네르기), 증식 결핍, 말단 분화 및/또는 억압 상태로의 분화에 기여하는 인자 또는 대사산물의 생성을 초래할 수 있다. 일 측면에서, TME는 T 세포 기능의 소실 및/또는 세포의 고갈로 이어질 수 있는 T 세포의 고갈을 유도할 수 있다.
일 측면에서, 암 또는 종양 세포는 TME로부터 아미노산의 섭취를 증가시키기 위해 아미노산 수송체의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 몇몇 측면에서 세포 내외로의 아미노산의 흡수 및 교환을 매개할 수 있는 L-형 아미노산 수송체 (LATs)의 성분의 발현은 각종 암세포 (및/또는 아미노산 고갈 상태 또는 다른 TME 조건에 반응하여 종양 및/또는 암세포 또는 종양-관련 세포에 의해 상향 조절 될 수 있음)에서 증가시킴으로써, mTORC1 신호 전달 및 단백질 합성을 조절한다. LAT와 같은 수송체의 증가된 발현은 TME에서 아미노산, 예를 들어 트립토판의 결핍 또는 추가 결핍을 초래 할 수 있으며, 저 아미노산 환경을 형성할 수 있다.
일 측면에서, 면역 치료의 활성, 예를 들어 T 세포 치료는 질환 또는 장애의 국소 미세 환경, 예를 들어 TME에 존재하는 면역 억제 활성 또는 인자에 의해 제한 될 수 있다. 일 측면에서, TME는 T 세포 치료를을 위해 투여된 T 세포의 활성, 기능, 증식, 생존 및/또는 지속을 억제할 수 있는 요인 또는 조건을 포함하거나 생성한다.
일부 실시 양태에서, 제공된 실시 예들은, 적어도 부분적으로, 본 발명에 기재된 관찰에서 CAR T 세포와 같은 T 세포는 트립토판 고갈에 민감하다. 종양 세포를 포함한 TME에서 세포의 IDO1의 상향 조절은 CAR T 세포의 생존 및/또는 활성을 억제되는 트립토판 고갈 환경을 생성 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 고갈의 억제 효과는 IDO1과 같은 필수 아미노산 트립토판(TRP)의 대사 작용, 예를 들어 이화작용, 트립토판의 보충 및/또는 CAR T 세포로 인한 트립토판의 흡수 증대와 관련된 인자의 억제에 의해 감소, 극복 및/또는 역전될 수 있다.
일 측면에서, CAR T 세포에서 장기간 트립토판 고갈은 트립토판이 보충되고 /되거나 트립토판 고갈로 이어지는 상태가 역전되거나 약화되는 조건 하에서 고갈로부터 나중에 회복하는 CAT T 세포의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 일 경우에, 장기간 트립토판 고갈, 예를 들어 TME에서의 장기간 트립토판 고갈은 CAR T 세포 회수의 지연 또는 불능, 예를 들어 성장 및/또는 기능적 활성의 지연 또는 정지를 야기할 수 있다. 일 측면에서, 제공된 실시 예들은 장기간 트립토판 고갈을 예방 또는 감소시키고 및/또는 트립토판 고갈로부터 CAR T 세포의 회수를 촉진 시키는데 사용될 수 있다. 일 측면에서, 제공된 실시 예들은 장기간 트립토판 고갈을 예방 또는 감소시키고 및/또는 트립토판 고갈로부터 CAR T 세포의 회수를 촉진 시키는데 사용될 수 있다. 일 측면에서, 제공된 실시예는 투여된 CAR T 세포가 T 세포의 기능적 활성 및/또는 성장을 기준 또는 정상 상태 수준, 예를 들어 기능적 활성 수준 및/또는 정상 또는 정상 상태에서의 성장 상태 및/또는 트립토판이 고갈되지 않은 상태에서 투여될 수 있다.
일 측면에서, 적응 T 세포 치료법(키메라 항원 수용체(CARs) 및/또는 다른 재조합 항원 수용체와 같은 뿐만 아니라 다른 입양 면역 세포 및 적응 T 세포 치료와 같은 관심 있는 질병 또는 장애에 특이적인 키메라 수용체를 발현하는 세포의 투여를 포함하는 것들을 포함 함)과 같은 T 세포 기반 요법은 암 및 기타 질병 및 장애의 치료에 효과적일 수 있다. 특정 상황에서 세포 치료에 사용할 수 있는 접근법이 항상 완전히 만족스러운 것은 아니다. 일부 상황에서, 최적의 활성 또는 결과는 투여된 세포가 표적 항원과 같은 표적 항원을 인식하고 결합하여 환자의 종양, 종양 및 그 환경 내의 적절한 부위를 수송하고, 국부적으로 성공적으로 진입시키는 능력에 좌우될 수 있다. 일 상황에서는 최적의 활성 또는 결과가 투여된 세포가 활성화되고, 팽창하고, 세포 독성 (cytotoxic) 및 사이토카인 (cytokines)과 같은 다양한 인자의 분비를 비롯하여 다양한 이펙터 (효과기) 기능을 발휘할 수 있는 능력에 의존 할 수 있으며, 특정 표현형 상태(장수명 기억, 덜 분화된 및 작동기 상태)로의 재 프로그램을 차별화, 전환 또는 개입시키고, 질병의 국소 환경에서 면역 억제 상태를 피하거나 줄이며, 효과적이고 견고한 환원 및 표적 리간드 또는 항원에 대한 재 노출 후 반응을 회상하고 피로, 알레르기, 말초 내성, 말단 분화 및/또는 억제 상태로의 분화를 회피 또는 감소시킬 수 있다.
일 측면에서, 제공된 실시예는 CAR T세포가 항원에 의해 자극 될 때 종양 세포와 같은 세포에서 기능성 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (indole amine-pyrrole 2,3-dioxygenase 1 (IDO1))의 발현을 유도할 수 있다는 관찰 및 상기 증가된 기능적 결과(예: 트립토판 대사의 키누레닌 경로 조절을 통한), 효소의 억제제에 의해 조절될 수 있음을 보여 주었다. 종양 세포 외에도, IDO1은 내피 세포, 골수 기질 세포, 섬유 아세포 및 수상 돌기 세포 (DC) 및 대식 세포와 같은 다양한 골수성 기원의 항원 제시 세포로 발현될 수 있으며, 종양 미세 환경에 존재한다. 일 측면에서, 그러한 세포에서 IDO1의 발현 유도는 항원 자극 후 CAR-T 세포에서 또는 세포로부터 인터페론-감마 (IFNγ) 또는 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 생성을 통해 직접적이거나 간접적일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 관찰은 종양 세포 및 TME의 다른 세포가 생체 내에서 CAR T 세포의 투여시 증가된 수준의 IDO1을 발현할 수 있음을 나타낸다. 일 측면에서, 조양 세포 및 다른 세포에 의한 IDO1 발현의 증가는 인터페론 γ(IFNγ)와 같은 염증 신호에 반응한다. 일부 실시 양태에서, CAR-발현 T 세포는 CAR-표적 항원-양성 세포에서 IDO1 발현을 유도 할 수 있고, 상기 유도는 부분적으로 IFNγ에 의해 매개된다.
따라서, 본원에서 제공되는 일부 실시양태는 일부 경우에 재조합 수용체-발현 T 세포 (예를 들어 CAR-T 세포)와 같은 T 세포의 항원 특이적 자극이 종양 또는 종양 미세 환경에서 발견 될 수 있거나 종양 미세 환경과 관련 될 수 있는 하나 이상의 세포에 존재하는 IDO1의 상향 발현된 발현을 초래할 수 있음을 나타내는 본원의 관찰에 기초한다. 특정 상황에서의 이러한 면역 억제 효과는 재조합 수용체-발현 T 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)와 같은 세포 치료의 특정 활성, 지속성, 증식 또는 다른 기능의 특정 특징을 부정적으로 조절할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포 치료법과 조합하여 IDO1 억제제와 같은 트립토판 대사 또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하면 세포 치료제의 세포의 실행기 기능 (예를 들어, 사이토카인 분비), 증식(체적증대) 및/또는 지속성이 향상될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 증식 또는 활성의 증강은 필수아미노산(TRP)의 대사 작용, 예를 들어 이화작용으로 인한 면역 억제 효과에 의해 매개되는 효과 없는 수준 또는 활성과 같은 활성의 기준 또는 정상 상태 수준으로 회복 되거나 복원 되는 수준이다. 일 측면에서, 세포 치료의 세포의 이펙터 기능 (예를 들어, 사이토 카인 분비), 증식(체적증대) 및/또는 지속성의 증진 또는 증가는 CD 25와 같은 T 세포 활성 마커와 같은 세포의 활성에 의해 유도되는 하나 이상의 마커의 증가없이 (및/또는 감소없이) 발생한다. 일부 실시 양태에서, 세포는 실질적인 증식(체적증대) 및/또는 작용기 기능을 나타내지만 덜 분화되거나 덜 활성화된 표면 표현형을 나타낸다.
일부 실시 양태에서, T 세포는 트립토판-고갈 또는 트립토판-결핍 환경, 예를 들어, T 세포 활성, 증식 및/또는 체적증대가 트립토판-고갈, 트립토판-고갈 또는 트립토판-불충분 환경에 민감하다. 종양 세포 또는 암 세포 또는 관련 기질 또는 골수 세포와 같은 관련 세포는 트립토판 수송체, 예를 들어 LAT1/CD98hc 또는 LAT2/CD98hc의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 및/또는, IDO1의 발현 및/또는 활성을 상향 조절함으로써 일부 측면에서 면역 억제 환경 또는 조건을 생성, 결과 또는 악화시킬 수 있다. 일 측면에서, 일부 측면에서, 수송체의 상향 조절은 트립토판 또는 다른 아미노산 결핍 환경에 반응할 수 있다. 일 측면에서, 종양 또는 다른 세포가 TME에서 트립토판 또는 다른 아미노산의 섭취를 증가시킬 수 있는데, 예를 들어, 이미 고갈-상태 환경, 예를 들어, 적용 세포 치료의 세포와 같이 면역 세포에 이용 가능한, 트립토판의 이용 가능한 수준 또는 공급을 고갈시키거나 감소시킬 수 있다. 일 경우에는, 간질 세포와 같은 구경꾼(bystander) 세포와 같은 TME내의 세포도 또한 IDO1의 활성 및/또는 발현을 상향 조절할 수 있다. 일 경우에는, T 세포 활성, 증식 및/또는 체적증대는 LAT1/CD98hc와 같은 트립토판 수송체의 높은 발현을 나타내는 세포의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받을 수 있다.
본 발명에 기술된 결과는 실시예에서 T 세포 치료를 위해 투여된 CAR을 발현하는 T 세포가 낮은 TRP 수준 및/또는 키누레닌 축적에 특히 민감할 수 있고, 키누레닌과 같은 효과 예를 들어 IDO 상향 조절 및/또는 트립토판의 고갈을 유도하는 경로를 촉진하는 능력, 예를 들어 투여 및 활성화에 특히 취약하고/취약하거나한 해석과 일치할 수 있다. 본원에서 관찰되는 바와 같이, CAR T 세포 및/또는 염증 신호의 존재 및/또는 활성에 의해 유도된 것과 같은 TME의 면역 억제 효과는 IDO1의 억제제와 같은 키누레인 경로의 조절인자와 같은 대체 대사 경로와 같은 트립토판의 대사 작용 경로의 조절제를 투여함으로써 극복될 수 있다.
일 측면에서, TME의 면역 억제 효과는 트립토판이 고갈된 환경에서, 예를 들어 트립토판 운반체의 과발현에 의해, 및/또는 트립토판 결핍에 덜 민감하도록, 예를 들어, 트립토판의 부족 또는 키누레닌 또는 다른 트립토판 대사산물의 축적과 같은 IDO-매개 이화작용의 의해 양성적으로 또는 음성적으로 조절하는 분자를 비롯하여, 키누레닌 매개 면역 억제를 감지하거나 이에 반응하는 것과 관련된 분자 및/또는 트립토판 고갈 또는 결핍을 감지하거나 반응하는 것과 관련된 분자와 같은, IDO-매개 또는 IDO-유도된 또는 트립토판 고갈-유도된 면역억제 신호 전달과 관련된 분자의 발현에 감소에 의해, 경쟁하거나 생존하기 위해 CAR T 세포를 조작함으로써 극복 될 수 있다. TME, 예를 들어 트립토판-고갈 또는 트립토판-결핍 면역억제 환경에 좀 더 내성을 갖도록 조작허가나, TRP 결핍 및/또는 KYN 및 그 유도체의 생산을 억제하는, 면역 억제 조건에 기여하는 키누레닌 경로의 일부 억제는 T 세포 치료 (예를 들어, CAR- 발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료의 투여 후 하나 이상의 투여 후 매개 변수 또는 결과를 증가시킬 수 있다.
따라서, T세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역치료, 및 트립토판 대사 작용 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 사용하는 병용 요법은 TME 및 트립토판 결핍 상태의 면역 억제 효과를 감소시키거나 역전시킬 수 있으며, 면역 치료의, 예를 들어 세포 치료, 활성, 결과, 반응 및/또는 지속성을 회복 및/또는 증가시킬 수 있다.
Ⅱ. 병용 요법
1) 대안적인 트립토판 대사 경로의 조절기와 같은 트립토판 또는 트립토판 대사 조절제, 예를 들어, 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1의 억제제 및 2) T 세포 치료 (예: T 세포와 같은 CAR-발현 세포) 또는 T 세포-관여 또는 면역 조절 요법, 예를 들어 다중 특이성 T 세포와 같은 면역 세포 치료 또는 면역 요법 치료제 모집 항체 및/또는 관문 억제제를 개체(대상)에 투여하는 것을 포함하는 병용 요법을 포함하는 방법을 제공할 수 있다. 또한, 세포와 같은 면역 치료제를 포함하는 조성물 및 키누레닌 경로 조절인자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트와 같은 조합 및 제품, 암을 포함하는 질병, 상태 및 장애를 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 조합물의 용도가 제공될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 면역치료는 세포치료, 예를 들어, 면역 세포 치료, 예를 들어 하나이상의 재조합면역 수용체를 포함하는 세포를 수반하는 세포치료, 예를 들어 T 세포 치료(예를 들어 CAR-발현 T 세포의 투여) 일 수 있다. 상기 방법은 T 세포-관련 치료와 같은 다른 요법 또는 T 세포 치료 (예를 들어 CAR-발현 T 세포)와 같은 면역 치료 또는 면역 치료제 투여 (예를 들어, 투여 중에 및/또는 투여 중에) 동안, 투여와 동시에, 투여 도중에, 및/또는 투여 후, 조절제, 예를 들어, 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 포함 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여는 조절제는, 예를 들어 키누레닌 경로 조절인자 및/또는 면역 치료 또는 면역 치료제, 예를 들어, T 세포 치료, 순차적 또는 간헐적 투여를 포함 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 전에, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, T 세포 치료(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T-세포 결합 요법, 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 같은 면역 치료를 개체에게 투여하기 위한 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약학적 조성물은 병용 요법를, 예를 들어 적용 세포 치료를 위한 T 세포 및 IDO1 억제제, 위한 제제 중 하나 또는 둘 모두의 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약제는 별도의 약학적 조성물로 투여하기 위해 제제화 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본원에 제공된 임의의 약학 조성물은 각각의 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제제화될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 면역 치료 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 조작된 세포를 포함하는 T 세포 치료) 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 또는 이의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 병용 요법은 치료될 질환 또는 증상 (예를 들어, 암) 또는 질환 또는 증상 (예를 들어, 암)를 가질 위험이 있는 개체 또는 환자에게 투여할 수 있다. 일 측면에서, 본 방법은 조작된 T 세포에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 줄이는 것과 같은 질병 또는 상태를 치료, 예를 들어 하나의 증상을 완화시키거나, 할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 제공된 방법과 관련하여 사용하기 위한 면역 치료는 재조합 수용체 (예 : CAR-T 세포)로 조작된 세포를 포함하는 조작된 T 세포를 사용하는 T 세포 치료를 포함할 수 있다. 일 경우에, T 세포가 키누레닌 경로 및/또는 트립토판 대사 활동의 활성에 민감 할 수 있다. 일 측면에서, T 세포는 트립토판 고갈 결핍에, 예를 들어 TME, 민감 할 수 있다. 일 경우에, 종양 세포 및/또는 TME의 다른 세포는 트립토판을 대사시키고 및/또는 세포외 트립토판을 종양 세포 및/또는 다른 세포로 운반함으로써 TME에서 CAR T 세포에 이용 가능한 트립토판의 양을 감소시킬 수 있는 트립토판 수송체와 같은 아미노산 수송체 및/또는 IDO1의 발현을 증가 시킬 수 있다. 일 경우에 따라, 트립토판의 결핍 또는 고갈은 소진, 아네르기 또는 T 세포의 이펙터의 세포 죽음, 항 종양 면역 반응 억제, 또는 종양 항원에 대한 내성, Tregs의 생성 및 활성화를 유도할 수 있고, TME의 면역 억제 상태에 기여할 수 있다. (참조, Moon et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:51; Platten et al., Front Immunol. 2015 Jan 12;5:673; Weinmann, H., ChemMedChem 2016, 11:450-466). 일 측면에서, 트립토판 기아 또는 고갈은 CAR T 세포의 기능적 활성 및/또는 생존을 감소시키거나 억제할 수 있다.
일 측면에서, CAR T 세포의 장기간 트립토판 기아 결핍 또는 고갈은 결핍 또는 고갈로부터 회복하고 결핍 또는 고갈의 효과를 역전시키는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 일 경우에는 TME에서 트립토판이 고갈된 조건에 장시간 노출되는 것과 같은 장기간 트립토판 결핍 또는 고갈은 CAR T 세포 회복의, 예를 들어 성장 및/또는 기증적 활성의 지연 또는 정지, 지연 또는 무능력을 초래할 수 있다. 장기 트립토판 결핍 또는 고갈은, 예를 들어 약 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 1 일, 21일, 28일 또는 그 이상 동안 트립토판 기아 결핍 또는 고갈, 기아 또는 고갈의 효과를 회복하거나 역전시키는 T 세포의 능력을 감소시키거나 없앨 수 있다.
일 측면에서, 제공된 실시예는 트립토판의 고갈 또는 고갈을 방지 또는 감소시키고/하거나 트립토판의 결핍 또는 고갈로부터 CAR T 세포의 회수를 촉진 시키는데 사용될 수 있고/있거나 면역 억제 효과 및/또는 TME에서 IDO1 상향 조절의 다른 효과를 예방, 감소 또는 역전시킬 수 있다. 일 측면에서, 제공된 실시예는 트립토판 고갈 또는 소진을 감소 또는 방지하고 및/또는 T 세포의, 예를 들어 조직된 T 세포와 같은, 기능적 활성 및/또는 성장을 기저 또는 정상 상태 수준으로, 예를 들어 기능적 활성 및/또는 정상 상태 또는 정상 상태의 성장, 예를 들어, 트립토판이 충분한 조건, 회복시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 예방 및 회복은 IDO1의 활성을 억제하고, TME에서 트립토판의 고갈을 방지하고, 및/또는 T 세포가 환경으로부터 이용 가능한 트립토판을 섭취하는 능력을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 임의의 것과 같은 병용 요법은 트립토판의 결핍 또는 감소로부터 예방 또는 감소시키거나 트립토판의 결핍 또는 결핍으로부터 CAR-T 세포의 회수를 촉진 시키는데 사용될 수 있다. 일 경우에는, 제공된 실시예는, 예를 들어 트립토판의 고갈 또는 고갈 방지 및/또는 트립토판의 고갈 또는 소진으로부터의 회복 촉진(예를 들어 기준선 또는 정상 상태 T 세포 활성을 회복시키거나 유지하기 위함)은 장기간 트립토판 고갈 또는 결핍이, 예를 들어 T 세포가 고갈 또는 소진으로부터 역전되거나 회복될 수 없게 되기 전에, 확립되기 전에 수행될 수 있다.
일 측면에서, 제공된 실시예는, 예를 들어 CAR-T 및/또는 트립토판 대사 및/또는 실패한 피험자에게 주어질 수 있는 키누레닌 경로 조절인자와 같은 T 세포 치료의 병용 요법, 더 이상 반응하지 않으며, 및/또는 투여 후 다른 치료법으로 재발할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제공된 실시 예는 다른 치료에 실패한 개체, 다른 치료에 내성이 있는 개체 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자로, 예를 들어 IDO1 억제제, 사전 치료하는 것과 같은 다른 치료법을 투여 한 후 재발하는 개체을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 측면에서, CAR-T 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 같은 T 세포 치료의 병용 요법은 실패한 환자, 더 이상 반응하지 않는 환자, 및/또는 에파카도스타트와 같은 IDO 억제제의 투여 후에 재발 할 수 있다.
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 제공된 실시 예는 새로 투여된 세포 치료에 대한 반응을 향상시킬 수 있다. T 세포의(예 : CAR-T 세포, 개체에서 T 세포를 얻음으로써 생성된 재조합 수용체를 발현, 활성화 및/또는 확장하는 기술) 신선한 공급원이 개체으로 도입되기 때문에, IDO1 억제제와 같은 트립토판 대사 활동 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, 예를 들어 에파카도스타트와 같은 IDO1 억제제, 조작되지 않은 개체의 T 세포가 실패했거나 이전의 투여에 대한 치료에 더 이상 반응하지 않더라도 투여된 T 세포에 그 효과를 나타낼 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 새로운 공급원, 예를 들어 조작된 T 세포는 트립토판의 고갈의 개체가 아닐 수 있다. 따라서, 피험자가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자로 이전 치료에 반응하지 않거나 더 이상 반응하지 않는 경우에도, 투여된 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판 고갈 또는 결핍 방지 및/또는 트립토판 고갈 또는 결핍으로부터의 회복 촉진을, 예를 들어 세포의 신선한 공급원의, 예를 들어 조작된 T 세포, 기준선 또는 정상 상태 T 세포 활성을 회복시키거나 유지하기 위해, 촉진할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 병용 요법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 요법과 면역 조절 요법의, 예를 들어 면역 관문 억제제 요법, 병용 요법의 이전 투여와 같이 다른 이전 요법의 투여 후에 실패한 환자, 내성이 있는 환자 및/또는 재발한 환자에게 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이전의 면역 조절 요법은 이전의 T 세포 치료법이 아니다. 일부 실시 양태에서, 개체는 이전의 T 세포 치료를 투여하지 않을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 개체는 CAR-T 세포의 투여에 앞서 트립토판 경로 조절인자와 관문 억제제 또는 다른 면역 치료의 조합을 투여할 수 있다. 일 측면에서, 상기 개체는 면역 요법 또는 관문 억제제 단독 투여에 비해 트립토판 경로 조절인자의 이점을 나타내지 않을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 만약에 실패한 개체, 내성이 있는 개체 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들면 에파카도스타트와 같은 IDO1의 억제제의 사전 투여와 같은 이전 치료 후, 선택적으로 상기 사전 투여는 T 세포 치료이, 예를 들어 면역 관문 억제제 요법, 아닌 면역 조절 요법의 병용으로 선택적으로 수용될 수 있는, 재발 하는 경우 본원에 제공된 실예의 하나의 이상의 투여를 위해 선택되거나 확인 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 병용 요법은 실패한 환자, 내성이 있는 환자 및/또는 트립토판 대산 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 에파카도스타트와 같은 IDO1 억제제, 및 면역 조절제의, 예를 들어 면역 관문 조절제, 병용 요법의 이전 투여와 같은 다른 이전 치료 후에 투여된 후 제발되는 환자에게 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이전의 면역 조절 치료법은 이전의 T 세포 치료법이 아닐 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대상은 이전의 T 세포 치료를 투여하지 않을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 치료되는 질환 또는 증상은 항원의 발현이 질환 상태 또는 장애의 병인과, 예를 들어 지병, 상태 또는 장애와 같은 원인이되거나, 악화시키거나 그렇지 않으면 관여된, 관련되고 및/또는 병인과 관련된 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질병 및 상태는 세포의 악성 또는 형질 전환 (예를 들어, 암),자가 면역 또는 염증성 질환, 또는 전염성 질환과, 예를 들어 박테리아, 바이러스 또는 다른 병원체에 야기되는, 관련된 질환 또는 증상를 포함 할 수 있다. 치료 될 수있는 다양한 질병 및 상태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원은 본원에 기재된 임의의 항원을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 키메라 항원 수용체 또는 트랜스 제닉 TCR을 포함하는 조합 치료의 조작된 세포 상에 발현된 재조합 수용체는 질환 또는 증상와 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 질환 또는 증상은 고형종양, 림프종, 백혈병, 혈액 조양, 전이성 조양 또는 다른 암 또는 종양 유형과 같은 종양일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 질병 또는 상태는 바이러스, 레트로 바이러스, 박테리아 및 원충 감염, 면역 결핍증, 사이토 메갈로 바이러스 (CMV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 및 아데노 바이러스, BK 폴리오 바이러스과, 그러나 이에 한정되지 않음, 같은 전염성 질병 및 상태일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 질병 또는 상태는 관절염, 예컨대 류마티스 관절염 (RA), I형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 염증성 장 질환, 건선, 경피증, 자가 면역 갑상선 질병, 그레이브병, 크론 병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질환 또는 증상과 같은 자가 면역 또는 염증 질환 또는 증상일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 희귀 티로신 키나아제 수용체 (orphan tyrosine kinase receptor) ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린 (mesothelin), CEA, 및 B형 간염 표면 항원(hepatitis B surface antigen), 항-엽산 수용체 (anti-folate receptor), CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아성 아세틸콜린 e 수용체 (fetal acethycholine e receptor) GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alpha, IL-13R-alpha2, kdr, 카파 경쇄 사슬 (kappa light chain), 루이스(Lewis) Y, L1-세포 접착 분자(cell adhesion molecule), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D Ligands, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이항원(prostate specific antigen), PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), ephrinB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 윌름스 종양 1(Wilms Tumor 1, WT-1), 사이클린 A1 (CCNA1)와 같은 사이클린 및/또는 2차 분자 (biotinylated molecules), 및/또는 HIV, HCV, HBV를 발현하는 분자 또는 병원균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 희귀 티로신 키나아제 수용체 (orphan tyrosine kinase receptor) ROR1, B 세포 성숙 항원 (B cell maturation antigen, BCMA), 탄산무수화효소 9 (carbonic anhydrase 9,CAIX), tEGFR, Her2/neu (receptor tyrosine kinase erbB), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesothelin, CEA, 및 B형 간염 표면 항원(hepatitis B surface antigen), 항-엽산 수용체 (anti-folate receptor), CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2 (epithelial glycoprotein 2, EPG-2), 상피 당단백질 40 (epithelial glycoprotein 40, EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 다이머, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질 (folate binding protein, FBP), FCRL5, FCRH5, 태아성 아세틸콜린 수용체 (fetal acethycholine receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄 사슬 (kappa light chain), 루이스(Lewis) Y, L1-세포 접착 분자(L1-cell adhesion molecule, L1-CAM), 흑색종-관련 항원 (Melanoma-associated antigen, MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (Peferentially expressed antigen of melanoma, PRAME), 서바이빈 (survivin), TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 폴레이트 수용체-a (folate receptor-a), CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 듀얼 항원, 암-고환 항원(a cancer-testes antigen), 메소텔린 (mesothelin), 뮤린 (murine) CMV, 뮤신 1 (mucin 1, MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), ROR1, TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), Her2/neu, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), ephrinB2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2 (O-acetylated GD2, OGD2), CE7, 윌름스 종양 1(Wilms Tumor 1, WT-1), 사이클린 (a cyclin), 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원체 특이 항원 (a pathogen-specific antigen) 및 유니버셜 태그 (universal tag)와 관련된 항원, 및/또는 2차 분자 (biotinylated molecules), 및/또는 HIV, HCV, HBV를 발현하는 분자 또는 다른 병원균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 임의의 것과 같은 B 세포 악성 종양과 과련된 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igκ, Igλ, CD79a, CD79b 또는 CD30일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 골수종, 림프종 또는 백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서 상기 방법은 비호지킨림프종 (NHL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 미만성거대B-형림프종 (DLBCL), 급성골수성백혈병 (AML), 또는 골수종, 예를 들어 다발성 골수종 (MM)을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 MM 또는 DBCBL을 치료하는데 사용 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 B 세포 악성 조양이 아닌 및/또는 B 세포 항원을 발현하지 않는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 CD19를 발현하지 않는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제공된 방법은 CD19를 표적화시키지 않거나 또는 특이적으로 결합하는 재조합 수용체-발현 T 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 사용할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 고형 종양과 같은 비-혈액학적 암을 치료하는데 사용 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 방광, 폐, 뇌, 흑색 종 (예 : 소세포 폐, 흑색 종), 유방, 자궁 경부, 난소, 결장 직장, 췌장암, 자궁 내막, 식도, 신장, 간, 전립선, 피부, 갑상선 또는 자궁암의 치료에 사용 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 질병 또는 장애는 면역 억제성 국소 환경과 관련될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 질병의 국소 환경에서의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 활성화와 관련될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 질환 또는 장애의 국소 미세 환경에서, 예를 들어 종양 미세환경 (TME), 감소된 트립토판 수준 및/또는 키누레닌 (KYN) 또는 이의 유도체의 수준 증가와 관련될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 키누레인 경로에 관여하는 효소 또는 인자, 예를 들어 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (indole amine-pyrrole 2,3-dioxygenase 1 (IDO1))의 발현 증가와 관련되거나 TME 내의 세포가 키누레인 경로에 관련된 효소 또는 인자, 예를 들어 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (indole amine-pyrrole 2,3-dioxygenase 1 (IDO1))을 발현하도록 유도될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 키누레닌 경로에 관여하는 효소 또는 인자, 예를 들어 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (indole amine-pyrrole 2,3-dioxygenase 1 (IDO1))의 증가된 발현과 관련이 없을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 질환 또는 장애는, 예를 들어 암, IDO1, IDO2 또는 TDO에 대해 음성 종양을 포함하고/하거나 대상은 IDO1, IDO2 또는 TDO 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않을 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 (예 : IDO1 억제제) 및/또는 T 세포 치료 (예: CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료의 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 유형, 세포 상에 발현된 세포 및/또는 재조합 수용체, 질병의 중증도 및 진행 경로, 투여 경로 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제, 및/또는 면역 치료는, 예를 들어 T 세포 치료, 예방 적 또는 치료 목적, 이전의 치료, 투여 빈도, 환자의 임상 병력 및 세포 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라 질 수 있다. 조성물 및 세포는 일부 실시 양태에서 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여될 수 있다. 제공된 병용 요법에 예시적인 용량 요법 및 스케쥴이 기재되어 있다.
실시양태에서, 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 다른 치료 중재와 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 투여될 수 있는 추가 조합 치료의 일부로서 투여될 수 있다. 일 상황에서, 세포집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 증강시키도록 시간이 충분히 가까운 또 다른 치료법으로 세포를 동시 투여하거나 또는 그 반대일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포는 하나 이상의 추가의 치료 전에 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포는 하나의 추가 치료 후에 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 화학 요법제의 투여와 같은 림프 결핍 치료를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 림프 결핍 치료를 포함하지 않을 수 있다.
면역요법 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료) 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 전, 투여 중에 또는 투여 후에, 일부 실시양태에서 면역 치료의 생물학적 활성은, 예를 들어 조작된 세포 집단의 생물학적 활성, 예를 들어, 다수의 공지된 방법들 중 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가할 매개 변수는하기 섹션 III에서 추가로 기재되는 분석과 같이 당 업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정된, 표적화된 세포가 표적 세포를 파괴시키는 능력을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의, 예를 들어 T 세포에 기초한 요법의 투여를 위한 T 세포, 생물학적 활성은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정될 수 있다. 일 측면에서, 생물학적 활성은 질병 부담 및/또는 종양 부담 또는 부하의 감소와 같은 임상적 결과를 평가함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 수준의 수준 및/또는 변화 또는 변이가 측정될 수 있다. 일부 실시 양태에서 병용 요법 중 하나 또는 둘 모두의 투여 및/또는 요법의 임의의 반복 투여는 병용 요법 중 하나 또는 둘 모두의 요법 전, 도중, 코스 중에 또는 후에 검정의 결과에 기초하여 결정 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 분석의 결과는 병용 요법의, 예를 들어 면역 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료) 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 하나 이상의 단계의 투여 전 및/또는 투여 후, 대상을 확인, 선택, 스크리닝 및/또는 제외하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 특정 대상체는 분석 결과에 기초하여 면역 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료) 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자로 치료를 위해 확인되거나 선택될 수 있다.
A. 면역 치료의 관리 (예를 들어, T 세포 치료 또는 T 세포-관련 치료)
본원에 제공된 방법, 조성물, 조합물, 키트 및 용도의 일 실시예에서, 병용 요법은 개체에게 T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 병용 요법과 같은 면역 치료를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 치료법은 전술한 바와 같이 하나 이상의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예: IDO1 억제제)를 투여하기 전에 투여하고, 이어서 투여할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 면역 치료는 암과 종양과 같은 병변의 표면상에 발현된 분자를 표적으로 하는 면역세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포와 같은 세포의 투여를 포함하는 세포-기반 요법일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 면역 세포는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 다른 항원-결합 수용체를 발현할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 면역 세포는 형질 전환 TCR 또는 키메라 항원 수용체(CAR)과 같은 재조합 수용체를 발현할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포는 환자에게 자가 항원일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포는 환자에게 동종 이식일 수 있다. 제공된 방법 안에서 사용을 위한 세포 치료, 예를 들어 T 세포 치료와과 같은 예시는 하기에 기재되어 있다.
일부 실시 양태에서, 면역 치료는 T 세포상에 발현된 표면 분자에 결합 할 수 있는 결합 분자이거나 또는 이를 포함하는 T 세포 결합 요법일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표면 분자는 수용체 복합체의 성분과 같은 T 세포의 활성화 성분일 수 있다. 일 실시예에서, T표면 분자는 CD3 또는 CD2일 수 있다. 일부 실시 양태에서 T 세포-관련 치료는 항체 또는 항원-결합 단편이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, T 세포-관련 치료는 종양 또는 암세포상의 표면 항원과 같은, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 나열된 항원, 예를 들어 CD19, 표적 세포상의 표면 항원에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인 및 T 세포의 활성화 성분 (예를 들어, T 세포 표면 분자, 예를 들어, CD3 또는 CD2)에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함하는 이중 특이적항체 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 그러한 항체의 이의 표적 둘 모두에 대한 동시 또는 거의 동시적인 결합은 표적 세포와 T 세포 사이에 일시적인 상호 작용이 일어나 T 세포의 활성화, 예를 들어 세포 독성 활성, 및 표적 세포의 계속적인 용해를 초래할 수 있다. 이러한 예시적인 이중 특이적 항체 T 세포-결합자는 유연한 링커에 의해 융합된 직렬 scFv 분자(참조, Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); 다른 것을, 예를 들어 유연한 링터, 통해 융합되고 안정한 결합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어지 FC 도메인을 추가로 포함하는 탠덤 (tandem) scFv 분자 (WO2013026837); 디아바디 및 탠덤 디아 바디를 포함하는 이의 유도체 (Holliger et al, Prot Eng 9, 299-305 (1996); C 말단 이황화물 브릿지를 갖는 디아 바디 (diabody) 포맷을 포함 할 수있는 이중 친 화성 리타 데이션 (DART) 분자; 또는 전체 하이브리드 마우스/ 래트 IgG 분자를 포함하는 삼중체 (Seimetz et al, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)를 포함하는 이중 특이적 T 세포 조작(BiTE) 분자 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, T 세포 참여 요법은 블린사이토 (CD3xCD19 BiTE) 또는 AMG 330일 수 있다. 이러한 T 세포-결합과 같은 어느 것도 제공된 방법에 사용되는 데 사용될 수 있다.
1. T 세포 치료
일 측면에서, T 세포 치료는 종양 침윤 림프성 (TIL) 요법, 형질 전환 TCR 요법 또는 재조합 수용체 발현 세포 치료와 같은 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 T 세포 치료일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 질환 또는 증상와, 예를 들어 암 또는 종양의 세포 상에 발현 또는 연관된, 관련된 리간드와 같은 리간드에 특이적으로있다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 제공된 세포는 리간드-결합 도메인 또는 이의 결합 단편을 포함하는 재조합 수용체와 같은 발현 수용체, 및 T 세포 수용체(TCR) 및 이의 성분, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)과 같은 기능성 비-TRC 항원 수용체에 의해 조작되고/되거나 발현될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인을 포함하는 CAR일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항원과 같은 리간드는 세포 표면에서 발현되는 단백질 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, CAR은 TCR-유사 CAR일 수 있고, 항원은 처리된 펩티드 항원, 예를 들어 TCR과 같이 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면에 인식되는 세포내 단백질의 펩티드 항원 일 수 있다.
재조합 수용체를 포함하는 조작된 세포를 포함하여, 조작된 세포 중에서, 아래의 IV 절에 기술되어 있다. CAR 및 재조합 TCR을 포함하는 예시적인 재조합 수용체뿐만 아니라 수용체를 조작하고 이를 세포내로 도이시키는 방법은 예를 들어 국제 특허 출원 번호 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, US Patent No.6,451,995,7,446,190,8,252,592,8,339,645,8,398,282,7,446,179,6,410,319,7,070,995,7,265,209,7,354,762,7,446,191,8,324,353 및 8,479,118 및, 유럽 특허 출원 제 EP2537416 호 및/또는 Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에 개시되어 있을 수 있다. 일 측면에서, 유전자 공학 항원 수용체는 미국 특허 제 7,446,190호에 기재된 바와 같은 CAR 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014055668 A1에 기재된 것들을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 제공된 방법과 관련하여 사용하기 위한 T 세포 치료는 재조합 수용체 (예 : CAR-T 세포)로 조작된 세포를 포함하는 조작된 T 세포를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 제공된 방법과 관련하여 사용하기 위한 T 세포 치료는 재조합 수용체 (예를 들어, CAR-T 세포)로 조작된 세포를 포함하며, IDO 매개 시그널링의 정상적인 과정 동안 및/또는 트립토판 기아 결핍 또는 불충분함을 감지하거나 이에 관련되어서 및/또는 감지, 키누레닌 매개 면역 억제에 반응하여 또는 연관되어 유도된 그러한 단백질의 발현과 비교하여 IDO 매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 하나 이상의 분자가 트립토판 고갈, 부족 또는 부족에 대한 감지 또는 응답과 관련되거나 키누레닌 매개 면역 억제 (예를 들어, 트립토판 대사 산물의 축적으로 인한 감지 또는 반응과 관련됨)의 발현이 변형된 또는 발현이 증가된다. 이러한 단백질 중에는 트립토판 대사 활동에 반응하여 T 세포에서 변이된 경우, 예를 들면, IDO 활동의 결과로 발생하는 것과 같은 이화작용은 T 세포의 면역 억제에 기여하거나 원인 또는 면역 억제와 관련되어 면역 내성 및 종양이 면역 감시에서 벗어나는 경우가 있을 수 있다. 이러한 단백질은 특정 아미노산의, 예를 들어 트립토판, 감소, 고갈 또는 결핍에 반응하는 아미노산 및/또는 특정 아미노산, 예를 들어 키누레닌, 대사산물의 증가 또는 축적에 반응하는 단백질을 포함 할 수 있다. 이러한 단백질의 예로는 GCN2 키나아제, BLIMP-1/PRDM1, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 이식자 (ARNT), mTOR, 단백질 키나아제 C 세타 (PKC-θ)가 포함 되나, 이에 한정되지는 않는다. GCN2, CHOP, BLIMP-1, AHR 또는 AHR nuclear translocator (ARNT)의 발현 또는 전위된 발현의 상향 조절 및/또는 mTOR 또는 PKC-θ의 발현의 감소 또는 감소는, 어떠한 경우에는, 자가 포식, T 세포 아네르기, T 세포 활성화 감소 및/또는 T 세포 증식 감소와 관련이 있을 수 있다 (참조 Metz et al. (2012) Oncoimmunology, 1:1460-1468; Moon et al. (2015) J Immunother Cancer, 3:51; Platten et al. (2015) Frontiers in Immunology, 5:1).
일부 실시 양태에서, 제공도니 조작된 세포는 IDO 매개 신호전달 및/또는 트립토판 대사산물 (예를 들어 키누레닌)의 부족 또는 축적에 반응하여 T 세포에서 정상적으로 또는 자연적으로 발현이 감소되거나 감소되는 하나 이상의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현에 의해 변형 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 단백질은 mTOR 또는 PKC-θ일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제공된 조작된 세포는 트립토판 기아 또는 트립토판 부족 상태에서, 예를 들어 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및/또는 양성자 -보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)와 같은 아미노산 수송체 또는 아미노산 수송체의 하나 이상의 사슬, 트립토판 또는 다른 아미노산 분자를 발현하는 세포에 의한 흡수를 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 분자의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현에 의해 변형될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 제공된 조작된 세포는 mTOR, PKC- 세타, CD98hc, LAT1, LAT2 또는 PAT4, 또는 그의 기능적 부분 또는 변이체의 재조합, 조작 또는 이소성 발현, 예를 들어 핵산 mTOR, PKC-θ, CD98hc, LAT1, LAT2 또는 PAT4를 암호화 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, mTOR, PKC- 세타, CD98hc, LAT1, LAT2 또는 PAT4의 발현은 이종 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것과 같은 증폭자의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 매개 신호 전달 후 및/또는 단백질의 트립토판 부족 또는 발현에 대한 반응으로, 조작된 세포는 세포 내에서 mTOR, PKC- 세타, CD98hc, LAT1, LAT2 또는 PAT4의 발현보다 높거나 증가할 수 있으나, 유사한 세포에서 단백질은 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현에 의해 변형되지 않을 수 있다. 일 실시에서 상기 단백질의 발현은, 예를 들어 mTOR, PKC-theta, CD98hc, LAT1, LAT2 또는 PAT4, 트립토판 부족 및/또는 트립토판 대사산물의 축적과 관련된 특정 조건 하에서, 재조합, 조작 또는 이소성 발현에 의해 그렇게 변형되지 않은 세포에서 동일한 조건 하에서 단백질의 발현에 과 비교하여 적어도 약 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 5.0 배, 6.0 배, 7.0 배, 8.0 배, 9.0배, 10,0배 또는 그 이상 증가할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 제공된 조작된 세포는 IDO 매개 시그널링시 및/또는 트립토판 대사산물, 예를 들어 키누레닌, 트립토판 부족 또는 축적에 반응하여 T 세포에서 정상적으로 증가 및/또는 전위되는 하나 이상의 단백질의 감소된 발현에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 단백질은 GCN2 키나아제, BLIMP-1/PRDM1, AHR 또는 AHR 핵 이동체 (ARNT)일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 세포는 GCN2, CHOP, BLIMP-1/PRDM1, AHR 또는 ARNT의 발현이 감소시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 감소된 발현은 억제 핵산 분자 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 유전 파괴를 매개할 수 있는 제제와 같은 제제를 통해 수행 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 제제의 발현은 유도성 프로모터와 같은 조건부 프로모터 또는 증폭자의 제어 하에 있으며, 이로써 상기 단백질의 발현 감소를 조건부로 조절 할 수 있다. 감소된 발현 및/또는 유전 파괴를 수행하기 위한 예시적인 시스템 및 제제를 하기에 기술한다. 일 구체예에서, 세포에서 하나이 이성의 단백질 (예 : GCN2, CHOP, BLIMP-1 / PRDM1 및/또는 AHR)의 발현은 비교시 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 % 같은 조건 하에서의 작용제 또는 유전자 파괴의 부재하에 유사한 세포에서의 발현에 적용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 조작된 세포는 mTOR, CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-ㅎ형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및/또는 양성자-보조 ㅇ아암아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 기능적 부분 또는 변이체를 포함하며, GCN2, CHOP, BLIMP-1/PRDM1 또는 AHR의 하나 이상의 감소된 발현을 포함하여, 재조합, 조작 또는 이소성 발현을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 부족 또는 트립토판 대사 산물의 축적에 반응 하여 IDO 매개 시그널링과 관련된 단백질의 발현이 변형된 제공된 인공 조작된 세포는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예 : IDO1 억제제)를 사용하여 조작된 세포가 그렇게 변형되지 않은 방법에 비해 특정 추가 이점을 제공할 수 있다. 일 측면에서, 특정 트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자는 트립토판 대사와 관련된 모든 하류 활성을 표적으로 하지 않을 수 있으며, 제공된 조작된 세포는 키누레닌 경로 및/또는 IDO1의 신호전달 또는 다른 경로 효소의 면역 억제 효과에 대한 조작된 T 세포 치료의 추가 내성을 제공 할 수 있다. 일 경우에, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예 : IDO1 억제제)를 포함하는 병용 요법으로 변형된 조작된 세포를 조합하는 것은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예 : IDO1 억제제)의 투여량 또는 빈도를 감소시킬 수 있다. 일 측면에서, 제공된 조작된 세포에서 단백질의 변형은 조건적, 예를 들어 트립토판 신진 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절기가 이용 가능하지 않거나 활성 인 시간과 같은 시간에 투여될 수는 것과 같은 단백질의 발현 (예를 들어 GCN2, CHOP, BLIMP-1, ARH, ARNT, mTOR, PKC- 세타, CD98hc, LAT1, LAT2 또는 PAT4 중 하나 이상) 조절이 특정 조건하에서 조절될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 변형된 발현 유도 (예: 감소된 발현 또는 증가된 발현)는 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1의 발현 또는 활성의 증가, T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점과 비교하여, 환자의 생물학적 샘플에서 IDO2 또는 TDO를 검출할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 변형된 발현 유도 (예 : 감소된 발현 또는 증가된 발현)는 T 세포 아네르기의 증가 또는 T 세포 치료의 고갈의 증거, T 세포 증식의 감소 및/또는 T 세포 활성화일 수 있다. 이러한 일 양태에서, 이러한 증가 또는 감소는 T 세포 치료의 투여 개시 이전의 수준 또는 활성 또는 T 세포 치료의 개시 후의 이전 시점과 비교하여 약 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배 또는 그 이상일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 변형된 발현 유도 (예를 들어, 감소된 또는 증가된 발현)는 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소되는 경우 (예를 들어, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 이상 감소) T 세포 치료의 개시 후 이전(선행) 시점에서의 T 세포의 수와 비교하여; 검출 가능한 T 세포 치료의 피크 또는 최대 세포 수보다 1.5 배 미만, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 50 배, 100 배 또는 그 이하 T 세포 치료의 개시 후 대상의 혈액; T 세포의 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.2 % 또는 0.1 % 세포 치료는 혈액에서 이러한 세포의 최고 수준의 피크가 검출된 후 한 번에 혈액에서 검출 가능할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 제공되는 방법은 세포 설계에서 이러한 단백질의 발현 (예를 들어 감소 또는 증가된 발현)의 변형을 유도하는 유도성 작용제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 유도제는 알로락토스 또는 IPTG, 테트라 사이클린 또는 테트라 사이클린 유도체 또는 독시 싸이클린 또는 독시 싸이클린 유도체일 수 있다. 유도제의 선택은, 예를 들어 특정 프로모터와 같은 특정 유도 성 시스템, 단백질(예 : 저해 핵산, 핵산 분해 효소 또는 핵산 분해 효소 시스템 또는 복합체)의 발현 조절 또는 단백질의 분열 또는 감소된 발현을 매개하는 제제의 발현 조절에 의존할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 유도제는 활성을 위해 필요한 2개의 서브 유닛의 화학적 유도된 이합체화를, 예를 들어 유도된 split-Cas 9, 촉진시킬 수 있는 라파마이신 또는 다른 유도제일 수 있다 (Zetche et al. (2015) Nat. Biotechnol., 33 : 139-142). 예를 들어, 유도성 시스템과 같은 조건부 조건이 아래에서 설명된다.
양성 세포 치료르 위한 조작된 세포의 투여 방법을 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양T세포치료는 Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공보 제 2003/0170238 호; 로젠버그 (Rosenberg)의 미국 특허 제 4,690,915 호; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85, 참조 문헌 [Themeli et al., (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al., (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al., (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338.에 개시되어 있다.
일부 실시 양태에서, 세포 치료, 예를 들어, 적응 T 세포 치료는 세포가 세포 치료를 받을 대상으로부터 또는 상기 대상으로부터 유래된 샘플로부터 분리 및/또는 다르게 제조되는 방법에 의한 자가 전달에 의해 수행될 수 있다. 따라서 ,일 측면에서, 세포는 치료를 필요로 하는 환자, 예를 들어, 환자로부터 유래되고, 격리 및 처리 후에 세포는 동일한 환자에게 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포 치료, 예를 들어, 양성 T 세포 용법은 여기서 세포는 세포 치료를 수령하거나 또는 궁극적으로 수용하는 대상이 아닌 개체, 예를 들어 제 1 대상으로로부터 분리 및/또는 다르게 준비된 동종 이식 이식에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포는 동일한 종의 상이한 대상 예를 들어 제 2대상에 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제 1 및 제 2 대상는 유전적으로 동일할 수 있다. 일 실시예에서, 제 1 및 제 2대상은 유전적으로 유사할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제 2 대상은 제 1 대상과 동일한 HLA 클래스 또는 수퍼 타입을 나타낼 수 있다.
세포는 적절한 방법으로 투여할 수 있다. 종양 부담의 감소와 같은 효과를 얻기 위해 투여 요법으로 세포를 투여할 수 있다. 투약 및 투여는 부분적으로 T 세포 치료의 투여 개시 이전, 이후 및 또는 동시에 투여될 수 있는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투약 스케쥴에 달려 있을 수 있다. T 세포 치료의 다양한 투약 스케쥴은 다양한 시점, 보강제 투여 및 맥박 주입에 대한 단일 또는 다중 투여를 포함하지만, 이에 한정하지는 않는다.
a. 성분 및 제제
일부 실시 양태에서, 재조합 항원 수용체로 조작된 세포를 포함하는 T 세포 치료, 예를 들어 T 세포 치료의 세포 투여량은 예를 들어 CAR 또는 TCR은 조성물 또는 제제, 예를 들어 약제 조성물 또는 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 질환, 상태 및 장애의 예방 또는 치료와 같은 제공된 방법에 따라 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 조작된 T 세포 (예: CAR T 세포)와 같은 T 세포 치료는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제제화될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 담체의 선택은 특정 세포 또는 약제 및/또는 투여방법에 의해 부분적으로 결정될 수 있다. 따라서 다양하고 적절한 제제가 있을 수 있다. 예를 들어 약제학적 조성물은 방부제를 포함할 수 있다. 적합한 방부제는 예를 들어, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 소듐벤조에이트 및 벤즈 알코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 둘 이상의 방부제의 혼합물이 사용될 수 있다. 보존제 또는 이들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재할 수 있다. 담체는 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 이에 제한되는 것은 아니지만 인산염, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조시놀, 시클로 헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸과 같은 방부제; 저 분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리 펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐 피롤리 돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 자당, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 금속 착물 (예, Zn- 단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이 온성 계면 활성제를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 완충제가 조성물에 포함될 수 있다. 적합한 완충제는 예를 들어, 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용될 수 있다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.001 중량 % 내지 약 4 중량 %의 양으로 존재할 수 있다. 투여 가능한 약제학적 조성물의 제조 방법을 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예를 들어, emington : The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (2005년 5월 1일)에 개시되어 있다.
제형 또는 조성물은 또한 각각의 활성이 서로 역효과를 주지 않는 세포 또는 제제로 예방 또는 치료되는 특정 징후, 질환 또는 증상에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다. 이러한 활성 성분은 적절하게 의도된 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재할 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 약제학적 조성물은 화합 요법제, 예를 들어 아스파라기나아제, 부술판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맵, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등을 추가로 더 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 제제 또는 세포는 염의 형태로, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 염으로 투여될 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 산 부가 염은 염산, 브롬산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산, 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴설폰산, 예를 들어 p-톨루엔 설폰산을 포함할 수 있다.
활성 성분은 마이크로 캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예 : 리포솜, 알부민 마이크로 스피어, 마이크로 에멀젼, 나노 입자 및 나노 캡슐) 또는 마크로 에멀젼에 포획될 수 있다. 일 특정양태에서, 약제학적 조성물은 시클로 덱스트린 내포 복합체와 같은 내포 복합체 또는 리포좀으로서 제형화될 수 있다. 리소좀은 작용제 또는 숙주 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 특정 조직으로 표적화하는 역할을 할 수 있다. 리포솜을 제조하기 위한 많은 방법이 가능하며, 예를 들어 Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), 및 미국 특허4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, and 5,019,369에 개시되어 있다.
약학 조성물은 일 측면에서, 조성물의 전달이 치료될 부위의 민감화를 유발하기에 앞서, 그리고 충분한 시간 동안 유발되도록 시간-방출, 지연 방출 및 서방 형 전달 시스템을 사용할 수 있다. 많은 종류의 방출 전달 시스템이 이미 알려져 있다. 이러한 시스템은 조성물의 반복 투여를 피할 수 있으며, 이에 따라 환자 및 의사에게 편의를 제공할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 약제학적 조성물은 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양, 예를 들어 치료 유효량 또는 예방적 유효량으로 제제 또는 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 치료적 또는 예방적 결과 및/또는 효능은 치료된 대상의 주기적 평가에 의해 모니터링 될 수 있다. 상태에 따라 며칠 또는 몇일에 걸친 반복 투여의 경우, 원하는 억제 또는 개선 또는 지병 또는 상태 표지 또는 증상의 예방이 발생할 때 까지 또는 치료제가 발생하거나 발생할 가능성이 있다고 판단 될 때까지 치료를 반복할 수 있다. 그러나 다른 투여 요법이 유용할 수 있고 결정될 수도 있다. 목적하는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다량 투여, 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
상기 제제 또는 세포는 임의의 적절한 수단, 예를 들어 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥 내 또는 피하 주사, 안내 내 주사, 눈 주위 주사, 망막하 주사, 유리 체내 주사, 중-중성 주사, 경 막내 주사 대구 주입, 결막하 주입, 서브-테넌 (sub-tenon) 주입, 구근 주입, 안구 주위 주입, 또는 후부(후방) 공막옆 (posterior juxtascleral) 전달을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 일부 실시 양태에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비내 투여되고, 국소 치료, 병변 내 관리를 위해 투여될 수 있다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하 투여가 포함될 수 있다.
일 경우에, 세포 치료는 세포를 포함하는 단일 약학 조성물로 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 주어진 용량은 세포 또는 제제의 단일 볼루스 투여에 의해 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이는 세포 또는 제제의 다중 볼루스 투여에 의해, 예를 들어 3일 이하 기간에 걸쳐 투여되거나, 세포 또는 제제의 연속 주입 투여에 의해 투여될 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해 적절한 투여량은 치료할 질병의 유형, 약제의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 종류, 질병의 중증도 및 경과, 약제 또는 세포는 예방 또는 치료 목적, 이전의 치료, 환자의 임상 내력 및 약제 또는 세포에 대한 반응 및 주치의의 재량에 따라 투여될 수 있다. 조성물은 일부 실시 양태에서 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 절적하게 투여될 수 있다.
세포 또는 제제는 표준 투여 기술, 제제 및/또는 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위한 주사기 및 바이알과 같은 제제 및 장치가 제공되 수 있다. 세포와 관련하여, 투여는 자가 또는 이중성일 수 있다. 예를 들어, 면역 반응 세포 또는 전구 세포는 한 대상에서 얻을 수 있으며 동일한 대상 또는 다른 호환 대상에 투여할 수 있다. 말초 혈액 유래 면역 반응 세포 또는 이의 자손(예를 들어, 생체 내, 생체 외 또는 시험 관내 유래)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 내 주사 또는 비경구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여 될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어, 유전자 변형 면역 반응 세포 또는 신경 독성 증상을 치료 또는 완화 시키는 약제를 포함하는 약학 조성물)을 투여하는 경우, 일반적으로 단위 투여형 주사용 형태(용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화될 것이다.
예를 들어, 경구, 정맥 내, 복강 내, 피하, 폐, 경피, 근육 내, 비강 내, 협측, 설하 또는 좌약 투여용 제제를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 작용제 또는 세포 집단은 비경구로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 정맥 내, 근육 내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약제 또는 세포 집단은 정맥내, 복강 내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상에게 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 조성물은 임의의 상태에서 선택된 pH로 완출 될 수 있는 멸균 액체 제제, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 유제, 분산액 또는 점성 조성물로 제공될 수 있다. 액체 제제는 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기 쉬울 수 있다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 편리할 수 있다. 반면 점성 조성물은 적저한 점도 범위내에서 배합되어 특정 조직과의 접촉 시간을 연장시킬 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들어 물, 염분, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적합한 담체, 희석제 또는 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로오스 등과 같은 부형제와 같은 혼합물과 같은 용매에 약제 또는 세포를 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 조성물은 또한 동결 건조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 투여 경로에 따라 습윤제, 분산제 또는 유화제(예:메틸 셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 강화 첨가제, 방부제, 향료제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 표준 원고는 어떤 면에서 적절한 준비를 준비하기 위해 협의될 수 있다.
항균 방부제, 산화 방지제, 킬레이트제 및 완충제를 비롯하여 조성물의 안정성 및 무균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가 할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 파라벤, 클로로 부탄올, 페노, 소르브산 등과 같은 다양한 항균 및 항진균제에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 약제형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아 레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래 될 수 있다.
서방성 제제를 준비할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형된 제품의, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐, 형태이다.
생체 내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 무균일수 있다. 무균은 예를 들어 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성 될 수 있다.
b. 투약 일정 및 관리
일부 실시 양태에서, 세포 투여량은 제공된 방법에 따라 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여량의 크기 또는 시기는 환자의 특정 지환 또는 상태의 함수로서 결정될 수 있다. 제공된 지병에 대한 투여량의 크기 또는 타이밍을 경험적으로 결정하는 것은 숙련된 기술자의 수준 내에 있을 수 있다.
일 특정 양태에서, 세포 또는 세포의 하영의 개별 집단은 예를 들어, 약 5 백만개의 세포, 약 2,500 만 개의 세포, 약 5 억 개의 세포, 약 10 억 개의 세포, 약 50 억 개의 세포, 약 200 억 개의 세포, 약 300 억 개의 세포, 약 400 억 개의 세포, 또는 상기 값 중 임의의 2 개로 정의되는 범위), 1 백만 내지 약 500 억 개의 세포 (예를 들어, 약 5 백만 개의 세포, 약 2,500 만 개의 세포, 약 5 억 개의 세포, 약 10 억 개의 세포, 약 5 개의 세포 10 억 내지 1 천억 개의 세포 (예를 들어, 약 2 천만 개의 세포, 약 10 억 개의 세포, 약 200 억 개의 세포, 약 300 억 개의 세포, 약 400 억 개의 세포 또는 앞의 값 중 임의의 2 개로 정의되는 범위) 약 7,000,000 개의 세포, 약 8,000,000 개의 세포, 약 9,000,000 개의 세포, 약 100 억 개의 세포, 약 250 억 개의 세포, 약 500 억 개의 세포, 약 750 억 개의 세포 900 억 개의 셀, 또는 상기 값 중 임의의 2 개로 정의된 범위), 약 1 억 개에서 500 억 개 정도의 세포 (예 : 약 1 억 2 천만 개의 세포, 약 2 억 5 천만 개의 세포, 약 3 억 5 천만 개의 세포, 약 4 억 5 천만 개의 세포, 약 6 억 5 천만 개의 세포, 약 8 억 개의 세포, 약 9 억 개의 세포, 약 30 억 세포, 약 300 억 세포, 약 450 억 세포) 또는 이들 범위 사이 및/또는 대상의 체중 kg 당 임의의 값과 같이 약 0.1 내지 약 1,000 억 세포의 범위 및/또는 체중 kg 당 세포의 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 투여량은 질병 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 특별한 속성에 따라 다를 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 값은 재조합 수용체-발현 세포의 수를 지칭하며; 다른 실시양태에서, 이들은 T 세포 또는 PBMC 또는 투여된 총 세포수를 지칭할 수 있다.
예를 들어, 대상이 인간인 일부 실시양태에서, 투여량은 총 재조합 수용체 (예를 들어, CAR) 발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 약 1 x 108 미만을, 예를 들어 약 1 x 106 내지 1 x 108 세포 범위, 예를 들어 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 또는 1 x 108 또는 총 그러한 총 세포 또는 상기 값들 중 임의의 2개 사이의 범위 일 수 있는, 포함할 수 있다. 대상이 인간인 일부 실시 양태에서, 투여량은 1 x 106 및 3 x 108 총 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)발현 세포, 예를 들어, 약 1 x 107 내지 2 x 108 그러한 세포, 예를 들어 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 또는 1.5 x 108 t총 그러한 세포, 또는 상기 값들 중 임의의 2개 사이의 범위 일 수 있는, 포함 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 환자는 다중 투여량으로 투여 될 수 있고, 투여량 또는 총 투여량은 각각 상기 값 중 임의의 값 이내 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 약 1 x 105 내지 5 x 108 총 재조합 수용체-발현 t세포 또는 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 108 총 재조합 T 세포 또는 총 T 세포, 약 5 x 105 내지 1 x 107 총 재조합 수용체 발현 T 세포 또는 총 T 세포, 또는 약 1 x 106 내지 1 x 107 to총 재조합 수용체 발현 T 세포 또는 총 T 세포를 각각 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포 치료는 적어도 약 또는 적어도 약 또는 약 0.1 x 106 세포/대상의 체중, 0.2 x 106 세포/kg, 0.3 x 106 세포/kg, 0.4 x 106 세포s/kg, 0.5 x 106 세포/kg, 1 x 106 세포/kg, 2.0 x 106 세포/kg, 3 x 106 세포/kg 또는 5 x 106 세포/kg를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포 치료는 다수의 세포를 포함하는 투여량이 환자의 체중 kg당 약 0.1 x 106 세포/대상의 체중 및 1.0 x 107 세포/kg의 사이, 약 0.5 x 106 cells/kg 및 5 x 106 cells/kg 사이, 약 0.5 x 106 cells/kg 및 3 x 106 cells/kg 사이, 약 0.5 x 106 cells/kg 및 2 x 106 cells/kg 사이, 약 0.5 x 106 cells/kg 및 1 x 106 cell/kg 사이, 약 1.0 x 106 cells/대상의 체중 및 5 x 106 cells/kg 사이, 약 1.0 x 106 cells/kg 및3 x 106 cells/kg 사이, 약 1.0 x 106 cells/kg 및 2 x 106 cells/kg 사이, 약 2.0 x 106 cells/대상의 체중 및 5 x 106 cells/kg 사이, 약 2.0 x 106 cells/kg 및3 x 106 cells/kg사이, 또는 약 3.0 x 106 cells/대상의 체중 및 5 x 106 cells/kg, 각각 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 세포/kg의 약 2 x 105 또는 세포/kg의 약 2 x 106, such as between at 또는 세포/kg의 약 4 x 105 및 또는 약 세포/kg의 1 x 106 of 또는 세포/kg의 약 6 x 105 및 또는 약 세포/kg의 8 x 105 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 피검자의 체중 kg 당 세포의 수 (세포/kg) 당 2 x 105 이하 (예: CAR-발현 세포와 같은 항원-발현), 예를 들어 또는 약 3 x 105 cells/kg 이상, 약 4 x 105 cells/kg 이하, 약 5 x 105 cells/kg 이하, 약6 x 105 cells/kg 이하, 약7 x 105 cells/kg 이상, 약 8 x 105 cells/kg 이하, 약 9 x 105 cells/kg 이하, 약1 x 106 cells/kg 이하, 또는 약 2 x 106 cells/kg 이하일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포 투여량은 개체의 킬로그램 중량당 세포(세포/kg) ekd 적어도 또는 적어도 약 또는 약 2 x 105 (예: CAR- 발현 세포와 같은 항원-발현) 적어도 또는 적어도 약 또는 약 3 x 105 cells/kg, 적어도 또는 적어야 약 또는 약 4 x 105 cells/kg, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 5 x 105 cells/kg, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 6 x 105 cells/kg, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 7 x 105 cells/kg, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 8 x 105 cells/kg, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 9 x 105 cells/kg, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1 x 106 cells/kg, o적어도 또는 적어도 약 또는 약 2 x 106 cells/kg일 수 있다.
적용 세포 치료와 관련하여, 세포의 주어진 "투여량"의 투여는 단일 조성물 및/또는 단일 중단되지 않은 투여로서, 예를 들어 단일 투여 또는 연속 주입, 세포의 주어진 양 또는 수의 투여를 포함하고, 분할된 투여량으로서의 주어진 양 또는 세포 수의 투여를 포함하며, 조성물 또는 주입 물을 3일 이하의 특정 기간에 걸쳐 투여 할 수 있다. 따라서 일부 상황에서, 투여량은 단일 시점에서 주어지거나 개시되는 특정 세포 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나 어떤 경우에는 3일 이상 또는 3일 동안 하루에 1회 또는 2일 동안 또는 하루 동안 여러 번 주입하는 것과 같이 3일 이하의 기간에 걸쳐 여러 번 주사 또는 주입하여 투여 할 수 있다.
따라서, 일 측면에서, 투여량의 세포는 단일 약학 조성물로 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여량의 세포는 투여량의 세포를 집적으로 포함하는 복수의 조성물로 투여될 수 있다.
분할 투여량이란 1일 이상 투여되도록 분할된 투여량을 말한다. 이러한 유형의 투여는 본 방법에 포함되며 단일 투여량으로 간주된다. 일부 실시 양태에서, 분할 투여량의 세포는 3일 이하의 기간에 걸쳐 투여량의 세포를 집합적으로 포함하는 복수의 조성물로 투여될 수 있다.
따라서 세포의 투여량은 분할 투여로 투여 될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 투여량은 2일 이상 또는 3일 이상 동안 환자에게 투여될 수 있다. 분할 투여를 위한 예시적인 방법은 첫 날에 투여량의 25%를 투여하고 두 번째날에 투여량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여량의 33%는 첫날에 투여 될 수 있고, 나머지 67%는 두 번째 날에 투여 될 수 있다. 일 측면에서, 투여량의 10%는 첫 날에 투여될 수 있고, 투여량의 30%가 두 번째 날에 투여될 수 있고, 투여량의 60%가 3일째 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 분할 투여량은 3일 이상에 걸쳐서 퍼지지 않을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 투여량의 세포는 투여량의 일부 세포를 각각 포함하는 제 1 및 제 2 선택적으로 더 많은 것과 같은 복수의 조성물 또는 옹액의 투여에 의해 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 상이한 집단 및/또는 하위 유형을 각각 포함하는 다수의 조성물은 선택적으로 특정 기간 내에 개별적으로 또는 독립적으로 투여될 수 있다. 예를 들어 세포의 개체군 또는 하위 유형은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ 및 CD4+가 강화된 집단을, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 각각 포함하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, 각각 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여량은 CD8+ T 세포의 투여량 또는 CD4+ T 세포의 투여량을 포함하는 제 1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 투여량 중 다른 것을 포함하는 제 2 조성물의 투여를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 조성물 또는 투여량의 투여, 예를 들어, 복수의 세포 조성물의 투여는 세포 조성물의 개별 투여를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 별도의 관리는 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여량은 제 1 조성물 및 제 2 조성물을 포함하고, 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 0 시간 내지 12시간 간격, 0시간 내지 6시간 간격, 또는 0시간 내지 2시간 간격으로 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제 1 조성물의 투여 개시 및 제 2 조성물의 투여 개시는 2 시간이하, 1시간 이하 또는 30분 이하, 15분 이하, 10분 이상 또는 5분을 넘지 않을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제 1 조성물의 투여의 개시 및/또는 완료 및 제 2 조성물의 투여 완료 및/또는 개시는 2 시간 이하, 1시간 이하 또는 30분 이하, 15분 이하, 10분 이상 또는 5분을 넘지 않을 수 있다.
일 조성물에서, 제 1 조성물, 예를 들어, 제 1 조성물의 조성물은 CD4+ T 세포를 포함할 수 있다. 일 조성물에서, 제 1 조성물, 예를 들어 제 1 조성물의 조성물은 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제 1 조성물은 제 2 조성물 전에 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포의 투여량 또는 조성은 재조합 수용체를 발현하는 CD8 + 세포 및/또는 CD8+ 세포에 대한 CD4+ 세포에 대한 재조합 수용체를 발현하는 CD4 + 세포의 정의 또는 표적 비를, 상기 비율은 임의로 약 1:1이거나 약 1:3 내지 약3:1, 예를 들어 약 1:1인, 포함할 수 있다. 일 측면에서, 상이한 세포 집단 (예: CD4 +:CD8 + 비율 또는 CAR + CD4 +:CAR + CD8 + 비율, 예: 1:1)의 표적 또는 원하는 비율로 조성물 또는 용량을 투여하는 것은 세포 하나 이상의 개체군을 포함하는 조성물을 투여한 후 다른 개체군을 포함하는 별도의 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 목표 또는 원하는 비율로 또는 그 정도일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 일반적으로 질병 부담을 줄이는데 효과적일 만큼 충분히 클 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포는 원하는 양 또는 세포 유형(들) 및/또는 세포 유형의 원하는 비율을 포함하는 원하는 양으로 투여될 수 있다. 따라서 일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 CD4+ 대 CD8+ 비율과 같은 총 세포 수 (또는 체중 kg 당 수) 및 개별 개체군 또는 아형의 바람직한 비율에 기초할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 개별 집단 또는 개별 세포 유형의 세포의 원하는 총 수(또는 체중 kg당 수)에 기초할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여량은 인구 집단의 원하는 총 세포 수, 원하는 비율 및 원하는 총 세포 수와 같은 그러한 특징의 조합에 기초할 수 있다.
일부 실시 양태에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 개체군 또는 하위 유형은 T 세포의 바람직한 투여량과 같은 총 세포의 바람직한 투여량의 허용 오차 또는 그 범위 내에서 투여될 수 있다. 일 측면에서, 바람직한 투여량은 세포가 투여되는 대상 체의 단위 체중 당 원하는 세포 수 또는 원하는 수, 예를 들어 세포/kg일 수 있다. 일 측면에서, 바람직한 투여량은 체중의 단위당 최소 세포 수 또는 최소 세포 수 이상일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 원하는 투여량으로 투여된 전체 세포 중에서, 개별 개체군 또는 아형 유형은 원하는 출력 비율 (예 : CD4+ 내지 CD8+ 비율), 예를 들어, 이러한 허용비의 일정한 허용 오차 또는 오차 범위 내, 또는 그 근처에 존재할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포는 하나 이상의 개별 집단 또는 예를 들어 원하는 양의 CD4+ 세포 및/또는 소정량의 CD8+ 세포와 같은 세포의 하위 유형의 바람직한 투여량의 허용된 차이 또는 그 범위 내에서 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 바람직한 투여량은 세포가 투여되는 피험자의 체중의 단위 당 소형체 또는 집단의 원하는 수 또는 그러한 세포의 원하는 수 예를 들어, 세포/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 바람직한 투여량은 집단 또는 하위 유형의 최소 세포 수 또는 개체 또는 단위 체중의 단위 또는 하위 유형의 세포의 최소 수 이상일 수 있다.
따라서 일부 실시 양태에서 투여량은 총 세포의 바람직한 고정 투여량 및 바람직한 비율에 기초하고 및/또는 개별 하위 유형의 하나 이상의 바람직한 고정 투여량에, 예를 들어 각각의 개별 하위 유형 또는 하위 집단의 각각, 기초할 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정 또는 최소 투여량 및 CD4+ 내지 CD8+ 세포의 원하는 비율에 기초하고 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정 또는 최소 투여량에 기초할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 아형과 같은 다수 세포 집단 또는 아형의 원하는 출력 비율의 내약된 범위 또는 그 범위 내에서 투여될 수 있다. 일 측면에서, 바람직한 비율은 특정 비율일 수 있거나 또는 비율의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 원하는 비율 (예: CD4+ 대 CD8+ 세포의 비율)은 약 5:1 또는 약 5:또는 약 5:1 이상 (또는 약 1:5 초과 및 약 5:1 미만), 또는 약 1:3 내지 약 3:1 (또는 약 1:3 초과 및 약 3:1 미만) 약 1:5 내지 약 1:5 (또는 약 1:5 초과 및 약 2:1 미만, 예컨대 약 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:약 2.5 %, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5 또는 1:약 10 %, 약 15 %, 약 20 %, 약 25 %, 약 30 %, 약 35 %, 약 40 %, 약 45 %, 약 50 %의 범위일 수 있다.
일 특정 양태에서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체 (예 : CAR) 발현 세포의 수를 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여된 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 수 또는 농도를 지칭한다.
일부 실시 양태에서, 용량의 크기는 이전 치료에 대한 환자의 반응, 예를 들어 화학 요법, 종양 부하, 벌크, 크기 또는 전이 정도, 정도 또는 유형과 같은 환자에서의 질병 부담, 단계, 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성 및/또는 숙주 면역 반응을 나타내는 개체의 가능성 또는 빈도를 포함할 수 있다.
일 경우에는, 제공된 방법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 조절제(IDO 억제제)를 투여하지 않고 세포 치료를 투여하는 방법 또는 트립토판 기아 결핍 또는 불충분에 대한 감지 및/또는 키누레닌-매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호와 관련된 단백질의 발현의 변형을 포함하지 않는 투여량으로서의 투여을 투여하는 방법 또는 IDO 매개 면역 억제 신호전달과 관련된 단백질 발현의 변형을 세포가 포함하지 않는 방법에서의 투여량으로서 투여하는 방법에서 투여량과 동일하거나 더 우수한 효능 또는 다른 결과를 달성하기 위해 그러한 세포의 저용량 투여를 허용한다. 일부 실시 양태에서, 투여된 세포의 투여량은 트립토판 기아 결핍 또는 부전에 대한 감지 또는 반응 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 단백질의 바현의 변형을 포함하지 않는 방법 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 (예: IDO1 억제제)를 투여하지 않고 세포 치료를 투여하는 방법 보다 적어도 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배 또는 10 배 것과 같은 기아 또는 부전의 감지에 반응하여 유도되거나 활성화되거나, 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 같은 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 단백지의 발현의 변형을 포함하지 않는 방법 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예: IDO1 억제제)를 투여하지 않고 세초치료법을 투여하는 방법에서 투여량보다 적을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 예를 들어,
저선량 (lower dose)은 피험자 체중 kg 당 재조합 수용체(예: CAR-)-발현 세포, T 세포 및/또는 PBMCs를 약 5 x 106 세포 미만으로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 피험자 체중 kg 당 약 약 4 x 106, 3 x 106, 2 x 106, 1 x 106, 0.5 x 106 의 세포이거나 이보다 적을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포의 하나 이상의 후속 투여가 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 후속 투여량은 세포의 제 1 투여량 투여 개시 후 약 7일, 14일, 21일, 28일 또는 35일 이상 투여될 수 있다. 세포의 후속 투여량은 제 1 투여량 이상, 거의 같거나 또는 제 1 투여량 보다 적을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 제 1 및/또는 제 2의 투여량의 투여와 같은 T 세포 치료의 투여가 반복될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포 치료제의 투여의 개시, 예를 들어 세포의 투여량 또는 세포의 분할 투여량의 제 1 투여량은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예를 들어 IDO1 억제제)의 투여 전, 이와 동시에 또는 (또는 후속하여) 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포의 투여량 또는 세포의 후속 투여량은 트립토판 대사 활동 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 개시 또는 이후에 0 내지 90일후에 투여될 수 있으며, 예를 들어 0 내지 15 일, 0 내지 6 일, 0 내지 96 시간, 0 일 내지 0 일, 24 시간, 0 내지 12 시간, 0 내지 6 시간 또는 0 내지 2 시간, 2 시간 내지 30 일, 2 시간 내지 15 일, 2 시간 내지 6 일, 2 시간 내지 96 시간, 2 시간 내지 24 시간, 2 6 시간 내지 30 시간, 6 시간 내지 15 시간, 6 시간 내지 6 시간, 6 시간 내지 96 시간, 6 시간 내지 24 시간, 6 시간 내지 12 시간, 2 시간 내지 6 시간, 6 시간 내지 90 일, 12 시간, 90 시간, 12 시간 내지 30 일, 12 시간 내지 15 일, 12 시간 내지 6 일, 12 시간 내지 96 시간, 12 시간 내지 24 시간, 24 시간 내지 90 일, 24 시간 내지 30 일, 24 시간 내지 15 일, 24 시간 내지 6 일, 24 시간 내지 96 시간, 96 시간 내지 90 일, 96 시간 내지 30 일, 96 시간 내지 15 일, 96 시간 내지 6 일, 6 일 내지 90 일, 6 일 내지 30 일, 6 일 내지15 일, 15 일 내지 90 일, 15 일 내지30 일 또는 30 일 내지 90 일 후에 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 투여량 또는 세포의 후속 투여량은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 개시 또는 개시한 후에 투여할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포 투여량은 트립토판 대사 활동 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 개시 또는 이후에 적어도 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 6 일, 12 일, 15 일, 30 일, 60 일 또는 90 일, 또는 적어도 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 6 일, 12 일, 15 일, 30 일, 60 일 또는 90 일 후에 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 하나 이상의 효과가 달성되는 시점에서 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여한 후, 예를 들어 IDO1 억제제를 투여하지만, T 세포 치료를 투여하기 전에, 예를 들어, 적용 T 세포 치료, 키누레닌 경로의 대사물 수준의 변화에 대한 환자의 샘플 평가, 예를 들어, TRP, KYN 또는 KYN 유도체 및/또는 인자 또는 이펙터의 발현 수준, 예를 들어 키누레닌 경로에 관여하는 효소, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 다른 표현형 또는 원하는 결과, 예를 들어 섹션 Ⅲ에 기재된 것과 같은 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전의 수준과 비교하여 TRP 수준의 증가 또는 KYN 또는 KYN 유도체 수준의 감소와 같은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 키누레닌 경로의 대사 산물 수준을 변화 시켰거나 초래할 가능성이 있는 시점에 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 투여량은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전의 수준과 비교하여 TRP 수준의 증가 또는 KYN 또는 KYN 유도체 수준의 (예를 들어, 적어도 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 10 배 또는 이상이거나 또는 적어도 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 10 배 또는 이상의 감소 또는 증가) 감소와 같은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예를 들어 IDO1 억제제)가 키누레닌 경로의 대사 물질 수준을 변경 시켰거나 초래할 가능성이 있는 시점에 투여될 수 있다. 이러한 매개 변수 및 매개 변수와 이를 결정하거나 평가하기 위한 에시는 섹션 Ⅲ에 설명되어 있다.
일부 실시 양태에서, T 세포 치료법의 세포 투여량의 투여, 예를 들어, 적용 T 세포 적용 요법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1억제제의 투여 전에 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포 투여량은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예를 들어: IDO1 억제제)를 투여하기 적어도 약 1 시간 이상, 적어도 2 시간 이상, 적어도 3 시간 이상, 적어도 6 시간 이상, 또는 적어도 또는 적어도 약 12 시간, 적어도 또는 적어도 약 1 일, 적어도 또는 적어도 약 2 일, 적어도 또는 적어도 약 3 일, 적어도 약 4 일, 적어도 또는 적어도 약 5 일, 적어도 약 6 일, 적어도 7 일, 적어도 또는 적어도 약 12 일, 적어도 약 14 일, 적어도 약 15 일, 적어도 적어도 약 21 일, 적어도 또는 적어도 28 일, 적어도 또는 약 30 일, 적어도 또는 적어도 35 일, 적어도 또는 적어도 42 일, 적어도 약 60 일 또는 약 60 일 또는 최소 또는 최소 90 일 전에 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 T 세포 용법의 세포의 투여량을 투여한 후에, 예를 들어 적용 T 세포 치료를 포함하지만, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하기 전에, 예를 들어 IDO1 억제제, 키누레닌 경로에서 대사 물질의 수준의 변화에 대해 환자의 샘플을 평가하는 단계, 예를 들어 TRP, KYN 또는 KYN 유도체 및/또는 인자 또는 이펙터의 발현 수준, 예를 들어, DIO1 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 표현형 또는 원하는 결과, 예를 들어 섹션 Ⅲ에 기재된 것과 같은 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 면역 요법(예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 사전 투여가, 면역 요법 개시 직전 또는 면역 요법 (예를 들어 CAR-T와 같은 T 세포 치료) 개시 직전 시점에서의 수준과 비교하여 TRP 수준의 감소 또는 KYN 또는 KYN 유도체 수준의 증가와 (예를 들어, 적어도 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 10 배 또는 이상이거나, 또는 적어도 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 10 배 또는 이상의 감소 또는 증가) 같은 직접적으로 또는 간접적으로 키누레닌 경로의 대사 산물 수준의 변화를 일으켰거나 유발할 수 있다. 병용 요법의 처방을 결정하거나 평가하기 위한 다양한 변수들이 섹션 Ⅲ에 개시되어 있다.
B. 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여
제공된 방법, 조성물, 조합, 키트 및 용도는 키누레닌 경로의 조절 인자, 예를 들어 효소 인돌아민-피롤2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, 예를 들어 IDO1 억제제, 면역 치료의, 예를 들어 T 세포 치료, 예를 들어 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 T 세포의 투여, 투여와 함께, 연속적으로 및/또는 간헐적으로 동시에 또는 거의 동시에, 순차적으로 및/또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
1. 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로에서 인자 및/또는 효소의 활성을 억제하는 억제제 및/또는 길항제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 대사산물 수준에 영향을 미치며, 예를 들어, 키누레닌 경로의 특정 대상의 산물의 증가 또는 감소를 초래할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, 예를 들어 조절기, 경로에 관하여하는 하나 이상의 인자 또는 이펙터를, 예를 들어 경로에 관여하는 이펙터, 억제 유도 또는 활성화 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥게나아제 1 (IDO1), IDO2, 트립토판 2,3-디옥시게나아제 (TDO), 키누레닌 포르미미다제, 키누레니나아제, 키누레닌-3-하이드록시게나아제, 키누레닌 3-하이드록실라제, 3-하이드록시 안트라닐산 옥시게나아제, 3-하이드록시 안트라닐레이트 3,4-디옥시게나아제, 키누레닌 아미노-트랜스퍼라제 및/또는 퀴놀린산 포스포 리보실 트랜스퍼라제를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로에서 하나 이상의 대사 산물의 수준, 이용 가능성, 농도, 효과, 대사, 합성 및/또는 분해를 조절하거나, 예를 들어 증가 또는 감소, 조절할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 키누레닌 경로의 대사산물은 L-트립토판, n- 포르밀 키누레닌, DL-키누레닌, L-키누레닌, 3-하이드록시-DL-키누레닌, 키닌레닉산, 키랄산, 키누라민, 3-하이드록시-L- 키누레닌, 3-하이드록시-D-키누레닌, 3-하이드록시 안트라닐산, 크산텐산, 피콜리 닉산, 퀴놀린 산 및/또는 신나바리닉 산 (cinnabarinic acid) 뿐만 아니라 모든 실질적으로 동종의 유사체 및 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, 예를 들어 조절하는, 트립토판의 이화 작용 및/또는 N-포르밀-L-키누레닌, 키누레닌 및/또는 이의 유도체의, 예를 들어 TME의 면역 억제 상태에 기여하는 3-하이드록시 키누레닌, 키누렌산 및 3- 하이드록시안트라닐산, 합성을 억제 또는 활성화시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판(TRP) 수준의 증가 및/또는 키누레닌(KYN) 수준의 감소, 매개 또는 결과를 초래 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인도아민-피롤-2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립퇀 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 IDO 2 및/또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제 (TDO)의 억제제일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/ 또는 키누레인 경로 조절인자는 트립토판 이화 작용에서 예를 들어, 효소와 같은 상류 및/또는 하류 인자 또는 작용기의 조절, 예를 들어 억제 또는 활성화하고, 예를 들어 신호 전달, 전사 및/또는 트립토판 및/또는 트립토판 이화 작용 또는 이화 작용 성분(들)의 수송에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 예를 들어, 종합 통제 비억제성 2(GCN2), 인터페론 (IFNγ), 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), 신호 전달자 및 전사 인자 3 (STAT3), 포유 동물 표적 인 라파 마이신 (mTOR), 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 이동체 (ARNT), 다이옥신 (DRE), TRP (트립토판) 수송체와 같은 아미노산의 수송체와 같은 염증 신호, 예를 들어, CD98 및/또는 이와 관련된 사슬, 하나 이상의 CD 98/LAT-1 운반체 복합체, 예를 들어, CD18 중쇄 (4F2hc, SLC3A2) 및/또는 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4), Asc- 2, ATB0, B0AT1, TAT1), PR 도메인 징크 핑거 단백질 1 (PRIM1, BLIMP-1), 진핵 세포 번역 개시 인자 2 α (eIF2α), 전사 인자 4 (ATF4) 활성화, CCAAT/(CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및/ 또는 IFNγ-R2와 같은 트립토판 이화 작용에 관련된 인자 또는 이펙터를 조절할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 보방물, 앱타이머 또는 핵산 분자(예를 들어, siRNA), 지질, 다당류 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 특정 인자 및/또는 효소의 억제제 또는 활성제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 특정 인자 및/또는 효소의 작용제 또는 길항제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 키누레닌 억제제는 키누레닌 경로의 하나이상의 대사 산물의 유사체 또는 유도체일 수 있다. 일부 실시 양태에서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 작은 분자인 억제제일 수 있다. 일부 실시 양태에서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 약제, 예를 들어 대사 경로 조절인자, 예를 들어, 트립토판 경로조 절제, 예를 들어 키누레닌 경로 절제와 같은 대안적인 트립토판 경로조절제는 예를 들어, 경구 투여, 주사, 볼루스 주입, 비경구, 폐내 투여, 비내 투여 및/또는 병용 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약제는 국소적으로 및/또는 전신적으로 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약제는 하나 이상의 다른 치료제 또는 생성물 또는 이들의 전구체를 처리하기 위해 첨가되거나 사용될 수 있다. 일 예에서, CAR과 같은 하나 이상의 조작된 면역 수용체, 예를 들어 CAR-발현 T 세포를 발현하는 세포와 같은, 적용 세포 치료법으로 투여하기 위한 세포를 과정 중에 첨가될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판, 예를 들어 보충 트립토판일 수 있다.
a. IDO1 억제제
일부 실시 양태에서, 병용 요법에서 억제제는 IDO1의 억제제 일 수 있다. IDO1은 IDO1, IDO2 및 TDO를 포함하는 키누레닌 경로에서 L-트립토판의 대사의 첫 번째 제한 속도 단계를 촉매하는데 일반적으로 역할을 하는 세 개의 헴 의존적인 디옥시게나아제 계열에 속할 수 있다. 세 가지 효소는 L-트립토판을 일련의 단계를 통해 대사되어 니코틴 아미드 아데닌 다이 뉴클레오티드 (NAD)를 형성하는 N-포르밀-L-키누레닌으로 전환시킬 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 IDO1 억제제는 International PCT publication Nos. WO 2011/056652; WO 2012/142237; WO 2014/159248; WO 2008/058178; WO 2010/005958; WO 2014/150646; WO 2014/150677; WO 2015/002918; WO 2015/006520; WO 2016/024233, WO 2016/026772; WO 2015/082499; WO 2016/012615; WO 2011/045341; WO 2015/119944; WO 2006/005185; WO 2016/051181; WO 2014/186035; WO 2008/052352; WO 2009/073620; U.S. Patent Pub. No. US 2005/186289; US 2007/0105907; US 2016/0060266; US 2016/0046596; U.S. Patent No. US 7,098,209; Chinese Patent Pub. No. CN 105567690; CN 103070868; CN 102579452; Zadori.et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents (2016), DOI:10.1080/13543776.2016.1189531; Rohrig et al., J. Med. Chem. 2012, 55:5270-5290; Rohrig et al., J. Med. Chem. 2015, 58:9421-9437; Meininger et al., Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteomics 2011, 1814:1947-1954; Tojo et al., ACS Med. Chem. Lett. 2014, 5:1119-1123; Vacchelli et al., (2014) OncoImmunology 3:10, e957994; Moon et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:51; Platten et al., Front Immunol. 2015 Jan 12;5:673; Weinmann, H., ChemMedChem 2016, 11:450-466; Liu et al., Blood. 2010 Apr 29;115(17):3520-30; Ninomiya et al., Blood. 2015 Jun 18;125(25):3905-16; Sheridan, C. Nature Biotechnology 33, 321-322 (2015); Carvalho et al., Org. Biomol. Chem. 2014, 12:2663-2674; Eguchi et al., Arch. Biochem. Biophys. 1984, 232:602-609; Peterson et al., Med. Chem. Res. 1993, 3:473-482; Sono et al., Biochemistry 1989, 28:5392-5399; Opitz et al., PLoS One. 2011; 6(5): e19823; and Saito et al., Biochem. J. 1993, 291:11-14에 기재된 및/또는 요약된 임의의 것이다. 예시적인 IDO1 억제제는 에파카도스타트 (INCB024360), 인독시모드 (1-메틸-D-트립토판), an IDO 펩티드 백신 (peptide vaccine) 및 NLG919을 포함한다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 증가된 독성없이 다양한 화학요법(예: 백금 화합물, 탁산 유도체, 시클로 포스파미드)의 항 종양 활성을 증가시킬 수 있는 것들을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 소분자, 펩티드, 단백질 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물, 앱타머, 또는 핵산 분자(예를 들어, siRNA)일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 작은 분자 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 히드록시 아미딘 유도체, 트립토판 유사체 또는 유도체, 인돌 유도체 또는 유사체, 퀴논 또는 이미노 퀴논 지지체를 갖는 화합물, 페닐 이미다졸 (PIM) 또는 페닐이미다졸 유도체와 같은 이미다졸 유도체, 1,2,3-트리아졸 유도체, 티아 졸로 트리아 졸 골격에 기초한 화합물, 이미다졸 티아졸 유도체, 2,3-디아미노 푸로 [2,3-c] 피리딘 및 2,3-디아미노벤조 [b] 티오펜 유도체, 천연 생성물 억제제 또는 유도체 또는 단일 방향족 고리 화합물 또는 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 히드록시아미딘 유도체일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 화학식 Ⅰ의 화합물일 수 있다:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 상기:
X 는 
R1 는 Cl, Br, CF3, 또는 CN; R2 는 H 또는 F; 및 R3 는 Cl 또는 Br일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 하기 화학식 Ia의 화합물일 수 있다:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시 양태에서, IDO 억제제는 하기 화학식 Ib의 화합물일 수 있다:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 4-(2-[(아미노 술포닐) 아미노] 에틸 아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-히드록시-1,2,5 (에파카도스타트, INCB024360으로도 공지 됨) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 4-(2-[(아미노 설포닐) 아미노] 에틸 아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로 페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사 다이아졸- 3-카복시 이미다졸 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 4-(2-[(아미노 술포닐) 아미노] 에틸 아미노)-N-[4-플루오로-3- (트리 플루오로 메틸)페닐]-N'-히드록시-1,2,5-옥사 다이아졸-3-카복시이미다졸 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 4-(2-[(아미노 술포닐) 아미노] 에틸 아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로 페닐)-N'-히드록시-1,2,5- 옥사 디아졸-5- 3-카복시 이미다졸 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 일부 실시 양태에서, DO1 억제제는 4-(2-[(아미노 술포닐) 아미노] 에틸 아미노)-N- [(4-브로모-2-푸릴) 메틸]-N'-히드록시-1,2,5-옥사 다이아졸-3-카복시 이미 다졸 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 일부 실시 양태에서, DO1 억제제는 4-(2-[(아미노 술포닐) 아미노] 에틸 아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴) 메틸]-N'-히드록시-1,2,5-옥사 다이아졸-3-카복시이미다졸 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 국제 PCT 출원번호 WO2008/058178, WO 2010/005958 또는WO 2015/119944에 개시되어 있는 임의의 억제제 일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 4-(2-[(아미노 술포닐) 아미노] 에틸 아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-히드록시-1,2,5 (에파카도스타트, INCB024360으로도 공지됨) 또는 이의 약학적으로특이적으로 염 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 하기 화합물 일 수 있다:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 트립토판 유사체 또는 유도체, 또는 인돌 유돌 유도체 또는 유사체일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 1- 메틸 트립토판 (1-MT), 예를 들어 1-메틸-D-트립토판 또는 1-메틸-L-트립토판, 2,5-디하이드로-L-페닐알라닌, 또는 메틸티오 히단토인-D, L-트립토판 (MTH-trp 또는 네크로스타틴 1), 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 브라시닌 및 이의 유도체, 예를 들어 S-알릴-브라시닌, S-벤질-브라시닌, 5-브로모-브라시닌, 브라시닌-유도된 디티오 카바메이트, 1-메틸 트립토 항타아자미드 화합물, 트립톨린 유도체 또는 트립타민 유도체, 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 키랄 이성질체 (즉, 1-메틸-D-트립토판 및 1-메틸-L-트립토판)의 혼합물로서 존재하는 IDO1 (및 IDO2)의 경쟁적 저해제인 1-메틸 트립토판 일 수 있다. 일부 실시 양태에서 IDO1 억제제는 1-메틸-D-트립토판 (1-D-MT; 인도록모독 또는 NLG8189로도 공지 됨)일 수 있다. 일부 실시 양태에서 IDO1 억제제는 미국 특허 제 2005/186289 호 및 미국 특허 제 7,098,209 호에 기재된 것 중 어느 것과 같을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 1-메틸-L-트립토판 (1-L-MT)일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 퀴논 또는 이미노 퀴논 스캐폴드를 갖는 화합물 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 카테콜, 히드로퀴논, p-퀴논, L-디히드록시 페닐알라닌, L-에피네프린, 메나디온, 벤조 푸라노 퀴논, β-라파숑 또는 나프토 퀴논계 화합물, 엑시구아민 A, 안뉼린 B, 피라노 나프토 퀴논, 인돌 퀴논, 피라노 나프토 퀴논 벤조 푸란 퀴논, 제스토사프롤 O 유사체, 4-이미노 나프탈렌-1-온 유도체, NSC111041, 마이토마이신 C 또는 이들의 유도체일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 WO 2008/052352; WO 2006/005185; 및 Carvalho 등, Org. Biomol. Chem. 2014, 12 : 2663-2674에 기재된 것 중에 어느 하나 또는 이의 유도체일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 이미다졸 유사체, 예컨대 페닐 이미다졸(PIM) 또는 페닐리이미다졸 유도체일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 국제 PCT 출원 번호 No. WO 2011/056652에 기재된 것과 같은 2-하이드록시 페닐이 미다졸 또는 이의 유도체일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 국제 PCT 출원 번호 WO 2012/142237 및 WO 2014/159248에 기재된 것과 같이 PIM에 기초한 트리시 클릭 화합물일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1억제제는 1-사이클로 헥실-2-(5H- 이미다조 [5,1-a] 이소인돌-5-일) 에탄올 (NLG919; GDC-0919 또는 GTPL9019로도 공지 됨), 이코노졸 또는 이의 유도체일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1억제제는 Rohrig et al., J. Med. Chem. 2012, 55:5270-5290에 기재된 것과 같은, 4-페닐-1,2,3-트리아졸의 유도체와 같은 1,2,3-트리아졸의 유도체 일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 Meininger et al., Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteomics 2011, 1814:1947-1954에 기재된 것과 같은, 티아조로 트리아졸 지지체를 기본으로 하는 화합물일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 N-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-[5-(4-메틸페닐) [1,3] 티아졸로 [2,3-c] [1,2,4] 트리아졸-3-일] 설파닐 아세트 아미드 (AMG-1) 또는 이의 유도체일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 억제제는 Tojo et al., ACS Med. Chem. Lett. 2014, 5:1119-1123에 기재된 것과 같은 이미다조티아졸 유도체 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 억제제는 미코다졸일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 WO 2014/150646, WO 2014/150677, WO 2015/002918 및 WO 2015/006520에 기재된 것과 같은 2-아미노페닐우레아를 기초로한 화합물일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 천연 생성물 억제제 또는 이의 유도체 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 Eguchi et al., Arch. Biochem. Biophys. 1984, 232:602-609; Peterson et al., Med. Chem. Res. 1993, 3:473-482; Sono et al., Biochemistry 1989, 28:5392-5399; 및 Saito et al., Biochem. J. 1993, 291:11-14에 기재된 것과 같은 노르말 항원/베타-카르보린, 벤조모르닐, 할라이드산, 티에라빈, 트립타안트린 또는 갈라닐일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 O- 벤질히드록실아민, 페닐히드라진, 벤질 메르캅탄, S-벤질 이소티오 우레아 유도체, 티오세미카르바지드 유도체, 디티오카르 바메이트 유도체 또는 AC12308 또는 이들의 유도체와 같은 단일 방향족 고리 화합물 또는 그의 유도체 및 WO 2009/073620에 기술된 것 일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 2,3-디아미노-푸로 [2,3-c] 피리딘 및 2,3- 디아미노벤조 [b] 티오펜 유도체, 예컨대 (N3-(3-클로로-4(3-클로로-4-플루오로 페닐) 푸로 [2,3-c] 피리딘-2,3-디아민 또는 N3-(3-클로로-4-플루오로 페닐) 벤조 [b] 티오펜-2,3-디아민 및 WO 2014/186035에 기재된 것들 중에 임의의 어느 것 일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 IDO 1 유전자의 발현을 감소시키거나, 제거하거나, 녹아웃 시키거나, 녹다운 시키거나 또는 파괴시킬 수 있는 제제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 IDO 1 발현을 조절하는 전사인자의 음성 조절제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 Bin 1 또는 KIT 신호의 음성 조절제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 억제제는 내인성 IDO 1 유전자의 발현을 감소키거나 제어할 수 있는 억제 핵산일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 억제 핵산은 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA-적응 shRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 헤어핀 siRNA, 마이크로 RNA 전구체 (pre-miRNA 또는 pri-miRNA) ), 마이크로 RNA (miRNA), 안티센스 RNA 또는 리보 자임, 예를 들어, CN105567690에 기재된 억제 핵산, 또는 그의 변이체, Opitz et al., PLoS One. 2011; 6(5): e19823에 기재된 것들일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 1-메틸-L-트립토판, 1-메틸-L-트립토판, 4-(2-[(아미노술포닐) 아미노] 에틸 아미노)-N-(3-브로모-4-트리플루오로메틸-N'-디 히드록시-D, L-트립토판, 4-페닐이미다졸, NSC401366, NLG919, F001287, PF-06840003, N-β-D-글루코피라노실-L-트립토판, INCB023843, 2-하이드록시페닐이미다졸, 4-페닐-1,2,3-트리아졸, 하이드록시아미딘, 티아졸로트리아졸 골격을 갖는 화합물, 이미다졸 티아졸, 2-아미노페닐우레아 골격을 갖는 화합물, IDO1-표적 백신 및 IDO-1 표적 억제성 핵산 중에서 선택된 것일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 억제제는 MTH-Trp, β-카보린, 나프토퀴논계 화합물, S-알릴-브라시닌, S-벤질-브라시닌, 5-브로모-브라시닌, 페닐이미다졸계 화합물, 엑기 가민 A 또는 NSC401366, 또는 Moon 등, Journal of ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:51에 기술된 것들 중 어느 것일 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 단일 약제 요법 또는 다른 항암제와의, 예를 들어 넵-파클리탁셀, 겜시타빈, 도세탁셀, 이피실리드, PDCD1-표적 모노클로날 항체, 수지상 세포 기반 p53 백신 및 멀티 펩티드 기반 백신, 병용 요법으로 사용할 수 있는 것과 같은 임상 개발 중인 것들을 포함한다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 에파카도스타트 (INCB024360, 개발자 : Incyte), 인독시모드 (1-D-MT, 개발자 : NewLink Genetics), IDO 펩티드 백신 (개발자 : Copenhagen University), F001287, PF-06840003 (개발자 Pfizer / iTeos) 및 NLG919 (개발자 : NewLink Genetics) 중에 선택되는 어는 것일 수 있다. 임상 연구를 위해 개발된 예시적인 IDO 1 억제제, 치료 유형 및 그 적응 증에는 in Moon et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:51. 에 개시된 어느 것을 포함할 수 있다.
b. 기타 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 제 1 속도-제한 단계를 촉매할 수 있는 IDO 2 또는 TDO의 억제제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO1 억제제는 또한 IDO2 및/또는 TDO를 억제할 수 있는 광범위한 억제제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 억제제는 IDO 1, IDO 2 또는 TOD에 특이적일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중 작용 IDO/TDO 억제제일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토한 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 TDO 억제제, 예를 들어 플루오르화 인돌 유도체 680C91 또는 LM10, 및/또는 Dolusic et al., J Med Chem. 2011 Aug 11;54(15):5320-34에 기재된 임의의 것일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 테나토프라졸과 같은 IDO 2의 특이적 억제제 및/또는 Bakmiwewa et al., Bioorg Med Chem Lett. 2012;22(24):7641-7646에 기재된 임의의 어느 것일 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 억제제는 인도시모드(1-D-MT)와 같은 IDO 1 및 IDO 2 모두를 억제할 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1 억제제는 또한 IDO 2 및/또는 TDO를 억제할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 아미노 전이 효소, 키누레닌 3-모노옥시게나아제, 키누레니나아제 및/또는 3-히드록시 안트라닐 레이트 3,4-디옥시게나아제에 의해 촉매된 반응과 같은 키누레닌 경로의 후속 단계를 조절할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 아미노 전이 효소, 키누레닌 3-모노옥시게나아제, 키누레니나아제 및/또는 3-히드록시 안트라닐 레이트 3,4-디옥시게나아제의 억제제일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 EP 2331095; EP 2420494; EP 2736337; EP 2750677; EP 2751086; EP 2833879; US 2012/0046324; US 2012/0329812; US 2013/0029988; US 2013/0331370; US 2014/0329795; US 2014/0329816; US 2015/0057238; US 8,710,237; WO 2008/022286; WO 2010/017132; WO 2010/017179; WO 2011/091153; WO 2013/016488; WO 2013/033068; WO 2013/033085; WO 2013/033085; WO 2013/151707; WO 2015/047978 및 Zadori et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents (2016), DOI:10.1080/13543776.2016.1189531에 기재된 임의의 것들을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 (3-HAA), L-키누레닌, 퀴놀린산 및/또는 신나바린산의 수준, 가용성, 농도, 효과, 활성, 대사, 합성 및/또는 분해를 조절하거나 조절할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 또는 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA)의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레니나아제의 억제제 또는 길항제일 수 있다. 키누레니나아제는 3-히드로시키누레닌의 3-하이드록시 안트라닐산(3-HAA)으로의 전환과 키누레닌의 안트라닐산으로의 전환을 촉매할 수 있다. 키누레니나아제의 억제는 3-HAA의 수준을 감소 시킬수 있다. 예시적인 키누레나아제 억제제는 O-메톡시 벤조일 알라닌 2-아미노-4-[3'-하이드록시 페닐]-4-하이드록시 부탄산 및 US 2015/0175712에 기재된 것들을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소, 예를 들어 키누레닌 경로 또는 이의 유도체 또는 변형된 형태에 관련된 효소일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레니나아제 효소일 수 있고, 키누레닌 효소는 L-키누레닌 및 3-하이드록시-L-키누레닌의 이화 작용을 촉진시킴으로써 키누레닌의 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 미국 특허 제 2015/0064154 호에 기재된 것과 같은 변형된 키누레니나아제 일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 다른 성분 또는 상류 또는 하류 작동기의 다른 구성 요소의 조절제, 예를 들어 트립토판 대사 및/또는 신호 전달에 관여하는 성분, 예를 들어, 종합 통제 비 억제성 2 (GCN2), 인터페론 γ (IFNγ), 신호 전달자 및 전사 인자 3 (STAT3), 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 번역자 (ARNT), 다이옥신 반응 요소 (DRE), TRP (트립토판) 수송체와 같은 아미노산 수송체 (예를 들어, CD98 및/또는 CD98 / LAT-1 수송체 복합체, 예를 들어 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및/또는 L-아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4), Asc-1, Asc-2, ATB0, B0AT1, TAT1), PR 도메인 징크 핑거 단백질 1 (PRIM1, 또한 BLIMP-1로 알려짐), 진핵 세포 번역 개시 인자 2 α (eIF2α), 활성화 전사 인자 4 (ATF4), CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동성 단백질 (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및/또는 IFNγ-R2 (McGaha 등 (2012) Immunol. Rev. 249 (1) : 135-157; Munn et al. (2005) Immunity 22; 633-642; Broer et al. (2011) Biochem. J. 436 : 193-211) 일 수 있다.
2. 조성물 및 제제
본원에서 제공된 방법, 조성물, 조합물, 키트 및 용도의 일부 실시 양태에서, 조합 요법은 하나 이상의 조성물, 예를 들어 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자을 포함하는 약학 조성물로 투여될 수 있다. IDO 1 억제제 및/또는 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 조성물, 예를 들어 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 포함하는 약학적 조성물, 예를 들어 IDO 1 억제제는 희석제, 보조제, 부형제 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1억제제 및/또는 세포에 투여되는 비히클과 같은 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 에는 E. W. Martin의“Pharmaceutical Sciences”에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 치료적 유효량의 틥토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 정제된 형태의 IDO 1 억제제를 적저한 양의 담체와 함께 포함하여 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공할 수 있다. 이러한 약학적 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 원료의 것, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유 및 참깨유를 포함하는 물 및 오일과 같은 무균 액체일 수 있다. 염분 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 커리어, 특히 주사 가능한 용액에 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 임의의 하나 이상의 희석제(들), 보조제(들), 항부형제(들), 결합제(들), 코팅제(들), 충전제(들), 향료(들), 윤활제(들), 활제(들), 방부제(들), 세제(들), 흡수제(들), 유화제(들), 약학부형제(들), pH 완충제(들) 또는 감미료(들) 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약제학적 조성물은 액체, 고체, 겔 형태의 동결건조된 분말 및/이의 조합물 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 담체의 선택은 특정 억제제 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이며, 이에 제한되는 것은 아니지만 인산염, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 페놀, 부틸 또는 벤질알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸과 같은 방부제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리 펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐 피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 자당, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 금속착물 (예, Zn- 단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 안정화제 및/또는 방부제와 같은 비이온성 계면 활성제를 포함 할 수 있다. 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 포함하는 조성물은 또한 동결 건조 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 약제학적 조성물은 근육 내, 정맥 내, 피부 내, 병변 내, 복강 내 주사, 피하, 종양 내, 경막 외, 비강, 경구, 질내, 구강(예: 설하), 경피 투여 또는 임의의 경로로 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 다른 투여 방식도 고려될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여는 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥 내 또는 피하 주사, 안내 주사, 안구 주사, 망막 하 주사, 유리-중격주사, 중-중격 주사, 속보 주사, 맥락 내 주사, 대원 내 주사, 결막하 주사, 결막하 주사, 서브-테논 주사, 구근 주사, 과피 주사, 또는 공막주변 주사일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여는 비경구, 폐내 및 비내 투여이며, 국소 치료를 위해 필요하다면 병내 투여이다. 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하 투여가 포함될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 주어진 용량은 단일 볼루스 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이는 예를 들어 3일 이하의 기간에 걸쳐 또는 연속 주입 투여에 의해 다중 볼루스 투여에 의해 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 투여는 치료 궤적에 따라 국소, 국부 또는 전신 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 치료를 필요로 하는 영역에 대한 국소 투여는 예를 들어, 수술 중 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터, 좌약 또는 임플란트에 의해 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 조성물은 또한 순차적으로, 간헐적으로 또는 동일한 조성물로 다른 생물학적 활성제와 함께 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여는 또한 제어 방출 제제 및 펌프에 의한 것과 같은 장치 제어 방출을 포함하는 제어 방출 시스템을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서 투여는 경구 투여일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 약학적으로 및 치료학적으로 활성인 화합물 및 이의 유도체는 전형적으로 단위 투약 형태 또는 다중 투약 형태로 제제화되고 투여 될 수 있다. 각각의 단위 투여량은 필요한 약제학적 담체, 비히클 또는 희석제와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하기에 충분한 치료적 활성 화합물의 소정량을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 단위 투여 형태는 이에 제한되지 정제, 캡슐제, 환제, 분말, 과립제, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 및 경구용 용액 또는 현탁액, 및 적절양의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 포함하는 오일 워터 에멀젼을 포함할 수 있다. 단위 투양 형태는 앰플 주사기 또는 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함할 수 있다. 단위 투약 형태는 분수 또는 그 배수로 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 다중 투여형은 분리된 단위투여형으로 투여되는 단일 용기에 포장된 다수의 동일한 단위 투여형 일 수 있다. 다주 투여 형태의 예로는 유리병, 정제병 또는 캡슐 병 또는 파인트 또는 갤런 병이 포함될 수 있다.
3. 트립토판 신진 대사 및/또는 키누레닌 경로조절제 투약과 스케쥴
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제, 및 T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역치료를 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 T 세포 치료(예를 들어, CAR 발현 T 세포) 또는 T 세포-결합요법과 같은 면역 치료의 투여 전에, 다음에, 동안에, 동시에, 과정 동안, 동시에, 거의 동시에, 연속해서 및/또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 T 세포 치료의 투여 전에 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1의 억제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포 용법의 투여 후에 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1의 억제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1의 억제제는 T 세포 치료의 개시 후에 추가로 투여되지 않을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여 계획은 T 세포 치료의 개시 전후에 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1의 억제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 투여 계획은 T 세포 치료의 투여와 동시에 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 조절제, 예를 들어 IDO 1의 억제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 다중 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1억제제는 한번 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 IDO 1 억제제는 1일 6회, 1일 5회, 1일 4회, 1일 2회, 1일 2회, 1일 간격으로, 3일 간격으로, 1 주일에 2회, 또는 면역 치료의 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료) 투여 개시 전 또는 개시 후 단 한 번만 투여될 수 있다. 일 측면에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여 빈도는 매주 2 회, 매주 1 회, 14 일마다 1 회, 21 일마다 1 회 또는 매월 1 회일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어, IDO1 억제제는 면역 치료의 (예를 들어, CAR-T 세포 치료) 투여주기 이전, 도중, 과정 도중 및/또는 이후에 규칙적인 간격으로 다중 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 면역 요법 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 투여 전에 규칙적인 간격으로 1 회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제는 면역 치료 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 투여 후에 규칙적인 간격으로 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 량 중 하나 이상은 면역 치료 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 투여량의 투여와 동시에 발생할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1의 억제제의 투여량, 빈도, 지속시간, 및/또는 순서는 스크리닝 단계 및/또는 본원에 기술된 치료 결과의 평가, 예를 들어, 본원 명세서의 섹션 III에 기술된 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 면역 치료(예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 투여 전에 투여될 수 있다. 일 측면에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 시키는 대상의 생물학적 샘플에서 치료하고자 하는 종양의 미세 환경(TME)에서 일어나느 것과 같이 트립토판(TRP) 수준을 증가시키거나 키누레닌 (KYN) 수준을 감소시키기에 충분한 시간이 존재할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 조절제(예를 들어, IDO 1 억제제)가 키누레닌 경로에서 대사 물질의 수준을 변경 시켰거나 초래할 가능성이 있는 시점에 있을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 (예를 들어 IDO 1의 억제제)의 투여는 조절제가 키누레닌 경로의 대사산물 수준의 변화를 가져왔거나 초래할 가능성이 있는 시점, 예를 들어, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전의 수준과 비교하여 TRP의 수준 또는 KYN 또는 KYN 유도체의 수준의 감소를 (예를 들어, 적어도 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 10 배 또는 이상의 증가 또는 감소) 나타낼 수 있다. 키누레닌 경로에서 대사산물 수준의 변화와 관련된 매개 변수를 평가하거나 결정하는 모범적인 방법은 섹션 III에 기재되어 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 예를 들어 면역 치료 (예를 들어. T 세포 치료, 예를 들어 CAR-T 세포 치료)의 개시 전에 약 0 내지 30 일, 0 내지 15 일, 0 내지 6 일, 0 일 0 내지 24 시간, 0 내지 12 시간, 0 내지 6 시간 또는 0 내지 2 시간, 2 시간 내지 30 일, 2 시간 내지 15 일, 2 시간 내지 6 일, 2 시간 내지 96 시간, 2 6 시간 내지 30 시간, 6 시간 내지 15 일, 6 시간 내지 6 일, 6 시간 내지 96 시간, 6 시간 내지 24 시간, 2 시간 내지 12 시간, 2 시간 내지 6 시간, 6 시간 내지 90 일, 24 시간, 6 시간 내지 12 시간, 12 시간 내지 90 일, 12 시간 내지 30 일, 12 시간 내지 15 일, 12 시간 내지 96 시간, 12 시간 내지 96 시간, 12 시간 내지 24 시간, 24 시간 내지 90 일, 24 시간 내지 30 일, 24 시간 내지 15 일, 24 시간 내지 6 일, 24 시간 내지 96 시간, 96 시간 내지 90 일, 96 시간 내지 30 일, 96 시간 내지 15 일, 96 시간 내지 6 일, 6 일 90 일, 6 일 내지 30 일, 6 일 내지 15 일, 15 일 내지 90 일, 15 일 내지 30 일 또는 30 일 내지 90 일과 같이, 약 0 내지 90일에 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 고절제, 예를 들어 억제제는 면역 치료 (예를 들어. T 세포 치료, 예를 들어 CAR-T 세포 치료)의 개시 전에 적어도 약 1 시간 이상, 적어도 약 2 시간 이상, 적어도 약 6 시간 이상 적어도 약 12 시간 이상, 적어도 약 1 일 이상, 약 2 일 이상, 또는 적어도 3 일 이상, 적어도 약 4 일 이상, 적어도 5 일, 적어도 또는 적어도 6 일, 적어도 또는 적어도 7 일, 적어도 또는 적어도 12 일, 적어도 또는 적어도 14 일, 적어도 또는 적어도 15 일, 적어도 약 21 일, 적어도 또는 적어도 약 24 일, 적어도 약 28 일, 적어도 약 30 일, 적어도 약 35 일, 적어도 42 일, 적어도 약 60 일 또는 적어도 약 90 일 전에 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 IDO 1 억제제는 면역 치료 (예를 들어. T 세포 치료, 예를 들어 CAR-T 세포 치료)의 개시 전에 최대 2 일, 최대 3 일, 최대 4 일, 최대 5 일, 최대 6 일, 최대 7 일, 최대 8 일, 최대 12 일, 최대 14 일, 투여 개시 전 최대 15 일, 최대 21 일, 최대 24 일, 최대 28 일, 최대 30 일, 최대 35 일, 최대 42 일, 최대 60 일 또는 최대 90 일 전에 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 면역 치료 (예를 들어. T 세포 치료, 예를 들어 CAR-T 세포 치료)의 개시 전에 1일 이상의 시점에서 시작할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 CAR-T 세포 치료(예를 들어: 투여 개시)와 같은 T 세포 치료의 투여 후에 투여되지만, T 세포 중 일부가 피크 또는 최대 팽창에 도달하는 시간, 트립토판 기아의 연장, 고갈, 알레르기, 세포 사멸, 수축, 항종양 면역 반응 억제 또는 종양 항원에 대한 내성의 억제 및/또는 고갈로부터 회복할 수 없는 상태, 트립토판 고갈 및/또는 소진의 영향을 역전시킬 수 있다. 일 경우에, T 세포가 트립토판 결핍으로 인한 성장 지연 및/또는 기능 정지를 나타내는 시간 전에 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제를 투여할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제는 T 세포 치료의 투여 (예를 들어: 투여 개시) 후에 약 1시간 미만 또는 미만, 약 2시간 미만 또는 미만, 약 6시간 미만 또는 미만, 약 12 시간미만 또는 미만, 약 1일 미만 또는 미만, 약 2일 미만 또는 미만, 약 3일 미만 또는 미만, 약 4일 미만 또는 미만, 약 5 일 미만 또는 미만, 약 6일 미만 또는 미만, 약 7일 미만 또는 미만에 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 이후 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 14일, 21일 이내 또는 약 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 14일, 21일 이내에 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 이후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일 또는 7 일 이내 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일 또는 7 일 이내에 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 이후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일 또는 14 일 이내에 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일 또는 14 일 이내에 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 이후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 내에 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 내에 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, 예를 들어 IDO 1 억제제, T 세포 치료를 투여 받는 환자가 예를 들어 CAR-T 세포 치료 (예를 들어, 투여 개시) T 세포 치료의 투여 전에 수득된 샘플, 상이한 피험자로부터의 기준점 및/또는 샘플과 비교하여, 상기 개체로부터의 종양 샘플에서의 수송체를 의미함, 증가된 IDO1 발현 및/또는 트립토판과 같은 아미노산 수송체의,예를 들어 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4 발현을 나타내는 시간 또는 그 이후에 T 세포 치료의 투여 후에 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 개체로부터의 종양 샘플이 T 세포 투여전에 상이한 피험자로부터의 기준점 및/또는 표본을 포함하는 수득된 샘플과 비교하여 증가된 IDO1 발현 및/또는 트립토판 수송체와 같은 아미노산 수송체, 예를 들어 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4 발현을 나타내는 경우, 개체는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여에 대해 확인되거나 선택될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2의 발현 또는 활성의 증가 또는 TDO를 T 세포 치료의 투여 개시 이전에 비해 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점과 비교하는 단계; 피험자로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 T 세포 치료의 투여 개시 후의 선행 시점의 피험자와 비교하여 감소되기 전에; T 세포가 연장된 트립토판 고갈, 소모, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 손실의 증상을 나타내기 전에; T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 피험자의 혈액에서 검출되기 전에 한 번; 및/또는 인터페론-감마 (IFNγ)의 수준은 T 세포 치료의 투여 개시 이전에 비해, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점과 비교하여, 개체로부터의 생물학적 샘플에서 증가될 수 있다. 일부 구체 예에서, 증가 또는 감소는 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 이상이거나, 또는 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 이상일 수 있다.
면역 치료 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료) 전에 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절이 주어지는 이러한 실시양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제는 면역 치료의 개시까지 및/또는 면역 치료의 개시 이후에 일정한 간격으로 계속될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 면역 치료 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 투여 후에 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제를 투여할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 면역 치료의 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료) 선행 투여가 키누레닌 경로의 대사 물질 수준의 변화를 직접적으로 또는 간접적으로 일으켰거나 유발 하였을 때, 예를 들어 면역 치료 개시 후 선행 지점 또는 면역 치료 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 개시 직전의 수준에 비해 TRP의 수준의 감소 또는 KYN 또는 KYN 유도체의 수준의 증가와 (예를 들어, 적어도 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 10 배 또는 이상이거나 또는 약 1.2 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 10 배 또는 이상의 증가 또는 감소) 같은 것일 것이다. 키누레닌 경로에서 대사산물 수준의 변화와 관련된 매개 변수를 평가하거나 결정하는 모범적인 방법은 섹션 III에 기재되어 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 면역 치료 (예를 들어, T 세포 치료)의 투여 개시 후 약 1시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 96 시간, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일 14 일 15 일 21 일 24 일 28 일 30 일 36 일, 42 일, 60 일, 72 일 또는 90 일 이내에 또는 1시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 96 시간, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일 14 일 15 일 21 일 24 일 28 일 30 일 36 일, 42 일, 60 일, 72 일 또는 90 일 이내에 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제공된 방법은 면역 치료의 투여 개시 후 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 일정한 간격과 같은 연속 투여를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 DI O 억제제는 면역 치료 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 투여 후 최대 또는 최대 약 1일, 최대 또는 최대 약 2일, 최대 또는 최대 약 3일, 최대 또는 최대 약 4일, 최대 또는 최대 약 5일, 최대 또는 최대 약 6 일, 최대 또는 최대 약 7일, 최대 또는 최대 약 12일, 최대 또는 최대 약 14일, 최대 또는 최대 약 21일, 최대 또는 최대 약 24일 또는 최대 또는 최대 약 24일 또는 최대 또는 최대 약 28일, 최대 또는 최대 약 30일, 최대 또는 최대 약 35일, 최대 또는 최대 약 42일, 최대 또는 최대 약 60일 또는 최대 또는 최대 약 60일 또는 최대 또는 최대 약 90일, 최대 또는 최대 약 120일, 최대 또는 최대 약 180일, 최대 또는 최대 약 240일 또는 최대 또는 최대 약 360일 또는 그 이상일 후에 투여 될 수 있다.
일부 실시 양태 중 일부에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어, IDO 1 억제제는 면역 치료 (예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)의 투여 개시 전후에 투여될 수 있다.
본원에서 제공된 방법의 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제 및 면역 치료(예를 들어, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료)는 동시에 또는 거의 동시에 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 (예를 들어, IDO 1 억제제)는 하루 2회 투여 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제는 0.02 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.02 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.02 mg/kg 내지 50 mg/kg, 0.02 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.02 mg/kg 내지 1.0 mg/kg, 0.02 mg/kg 내지 0.2mg/kg, 0.2mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.2 mg/kg 내지 50 mg/kg, 0.2 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.2 mg/kg 내지 1.0 mg/kg, 1.0 mg/kg 내지 200 mg/kg, 1.0 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1.0 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1.0 mg/kg 내지 10 mg/kg, 10 mg/kg 내지 200 mg/kg, 10mg/kg 내지 100 mg/kg, 10 mg/kg 내지 50mg/kg, 50 mg/kg 내지 200 mg/kg, 50 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 100 mg/kg 내지 200 mg/kg 와 같이 환자의 체중 kg 당 약 0.02 mg (mg / kg) 내지 약 200 mg / kg 체중으로 독립적으로 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제는 약 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10 mg/kg, 1 1 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg, 100 mg/kg, 또는 250 mg/kg 또는 그 이상일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 투여 되거나, 트립토판 대사 및/또는 키눼닌 경로 조절인자를 각각 약 약 2.5 내지 약 2000mg, 2.5 내지 약 1000mg, 약 2.5 내지 약 500mg, 약 2.5 내지 약 200mg, 약 2.5 내지 약 100mg, 약 2.5mg 내지 약 500mg, 2.5 mg 내지 50 mg, 25 mg 내지 5000 mg, 25 mg 내지 2000 mg, 25 mg 내지 1000 mg, 25 mg 내지 500 mg, 25 mg 내지 200 mg, 25 mg 내지 50 mg, 100 mg, 25 mg 내지 50 mg, 50 mg 내지 5000 mg, 50 mg 내지 2000 mg, 50 mg 내지 1000 mg, 50 mg 내지 500 mg, 50 mg 내지 200 mg, 50 mg 내지 100 mg, 100 mg 내지 5000 mg, 100 mg 내지 2000 mg, 100 mg 내지 1000 mg, 100 mg 내지 500 mg, 100 mg 내지 200 mg, 200 mg 내지 5000 mg, 200 mg 내지 2000 mg, 200 mg 내지 1000 mg, 200 mg 내지 500 mg, 500 500 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 2000 mg, 500 mg 내지 1000 mg 또는 1000 mg 내지 2000 mg, 이의 경계값과 같이 약 2.5 내지 약 5000mg 농도로 독립적으로 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 투여하거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 각각 독립적으로 2.5 mg 내지 2000 mg, 2.5 mg 내지 1000 mg, 2.5 mg 내지 500 mg, 2.5 mg 내지 200 mg, 2.5 mg 내지 100 mg, 2.5 mg 내지 50 mg, 2.5 mg 내지 약 500 mg, 25mg 내지 2000mg, 25mg 내지 1000mg, 25mg 내지 500mg, 25mg 내지 200mg, 25mg 내지 100mg, 25mg 내지 25mg, 25mg 내지 200mg, 50 ㎎ 내지 5000 ㎎, 50 ㎎ 내지 2000 ㎎, 50 ㎎ 내지 1000 ㎎, 50 ㎎ 내지 500 ㎎, 50 ㎎ 내지 200 ㎎, 50 ㎎ 내지 100 ㎎, 100 ㎎ 내지 5000 ㎎, 100 ㎎ 내지 2000 ㎎ , 100 mg 내지 1000 mg, 100 mg 내지 500 mg, 100 mg 내지 200 mg, 200 mg 내지 5000 mg, 200 mg 내지 2000 mg, 200 mg 내지 1000 mg, 200 mg 내지 500 mg, 500 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 2000 mg, 500 mg 내지 1000 mg 또는 1000 mg 내지 2000 mg, 이의 경계 값과 같이 약 2.5 mg 내지 약 5000 mg으로 경구로 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 투여하거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 각각 독립적으로 1일 6회, 1일 5회, 1일 4회, 1일 2회, 1일 1회, 격일로, 3일마다, 주 2회 또는 매주 1회 빈도로 경구로 투여할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제가 투여되거나, 트립토판 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 각 투여가 독립적으로 매일 6회, 1일 5회, 1일 4회, 1일 3회, 1일 2회 또는 1일 1회로 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 매일 또는 적어도 약 5 mg/일, 10 mg/일, 25 mg/일, 50 mg/일, 100 mg/일, 200 mg/일, 400 mg/일, 500 mg/일, 600 mg/일, 800 mg/일, 1000 mg/일, 1200 mg/일, 1600 mg/일, 2000 mg/일, 5000 mg/일 또는 10000 mg/일의 용량으로 투여하거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 각각의 투여를 독립적으로 투여할 수 있다.
일 측면에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 투여하거나 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 각각 독립적으로 적어도 약 0.2 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg 또는 200 mg/kg; 또는 적어도 약 2.5mg, 25mg, 50mg, 100mg, 200mg, 400mg, 500mg, 600mg, 800mg, 1000mg, 1200mg, 1600mg, 2000mg 또는 5000 mg의 투여량으로 투여 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 유도체일 수 있고, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 kg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중 내지 약 1000 mg/kg 체중 또는 이상 및 투여량 사이의 임의의 범위로 투여 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 투여하거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절를 각각의 투여를 정맥내 투여, 예를 들어 정맥 내 주사로 독립적으로 투여할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 단백질 또는 폴리 펩티드 또는 이의 유도체일 수 있고, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 약 1㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중 , 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중 내지 약 1000 mg/kg 체중 또는 이상 및 투여 량 사이의 임의의 범위로 투여 될 수 있다.
C. 림프구고갈 치료 (Lymphodepleting Treatments)
일 측면에서, 제공된 방법은 T 세포 치료 (예 : CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료의 투여 시작 전 또는 투여 개시와 동시와 같이 하나 또는 이상의 림프구 제거 요법을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 림프구제거 요법은 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 플루다라빈은 림프구 제거 요법에서 제외될 수 있다. 일 실실양태에서, 림프구 제거 요법은 투여되지 않을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 면역 결핍 (예를 들어, 림프구 제거) 요법을 갖는 예비 조절 대상은 양자 세포 치료 (ACT)의 효과를 개선시킬 수 있다. 시클로스포린 및 플루다라빈의 조합을 포함한 림프구 제거제를 사용한 사전 조건화는 투여된 세포의 반응 및/또는 지속성을 개선하는 것을 포함하여 세포 치료에서 전이된 종양 침윤 림프구(TIL) 세포의 결과를 개선하는데 효과적일 수 있다 (참고, Dudley et al., Science, 298, 850-54 (2002); Rosenberg et al., Clin Cancer Res, 17(13):4550-4557 (2011). 마찬가지로, CAR+ T 세포의 맥락에서 림프구 제거제, 가장 일반적으로 시클로포스파미드, 플루다라빈, 벤다무스틴, 또는 이들의 조합이 포함되어 있으며, 때로는 저선량 방선 조사가 수반될 있다 (참고, Han et al., Journal of Hematology & Oncology, 6:47 (2013); Kochenderfer et al., Blood, 119: 2709-2720 (2012); Kalos et al., Sci Transl Med, 3(95):95ra73 (2011); Clinical Trial Study Record Nos. NCT02315612; NCT01822652).
이러한 전제 조건은 여러 가지 결과 중 하나 이상의 위험을 줄이려는 목적으로 수행될 수 있다. 이러한 결과는 활동이나 결과 또는 치료 반응을 저해할 수 있다. T 세포, B 세포, NK 세포가 항상성 및 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15; 규제 T 세포, NK 세포 또는 면역계의 다른 세포에 의한 TIL 억제; 종양 미세 환경에서 네거티브 레귤레이터의 여향제와 같은 사이토카인의 활성화을 위해 TILs와 경쟁하는 "사이토 싱크 (cytokine sink)"로 알려진 현상을 포함할 수 있다 (Muranski et al., Nat Clin Pract Oncol. December; 3(12): 668-681 (2006).
일부 실시 양태에서, 제공된 방법은 대상에게 림프구 제거 요법을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 T 세포 기반 치료를 위한 세포 투여량 투여 전에 림프구 제거 요법을 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 림프구 제거 요법은 플루다라빈 및/또는 시클로포스파미드와 같은 화합 요법제를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 림프구 제거 요법은 플루다라빈을 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 림프구 제거 요법은 시클로포스파미드만을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포의 투여 및/또는 림프구 제거 요법은 오래 환자 전달을 통해 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 시클로포스파미드, 플루다라빈, 또는 이들의 조합물과 같은 림프구 제거 또는 화학 요법제와 같은 전처리 제제를 투여량 투여 전에 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 치료 (예를 들어, CAR- 발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료의 첫 번째 또는 후속 투여의 적어도 3, 4, 5, 6, 7일 전과 같이 적어도 2일 전에 환자에게 전처리 제제를 투여 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 개체는 세포 투여량 투여 전에 7일 이하 전 예를 들어 6, 5, 4, 3 또는 2일 이하 전에 전처리제를 투여할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 개체는 환자는 약 20 mg/kg 내지 100 mg/kg 사이, 예를 들어 약 40 mg/kg 내지 80 mg/kg 사이의 용량으로 시클로포스파미드로 전 처리될 수 있다. 일 측면에서, 개체는 약 60 mg/kg 이내 또는 약 이내에 시클로포스파미드로 전 처리될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 시클로포스파미드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 매일 1일 간격으로 또는 3일 마다 제공되는 것과 같은 복수의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 시클로포스파미드는 1일 또는 2일 동안 1일 1회 투여될 수 있다.
플루다라빈을 포함하는 림프구 제거제의 일부 실시 양태에서, 개체는 플루다라빈을 약 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 30 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 26 mg/m2와 같이, 약 1 mg/m2 내지 100 mg/m2 농도로 투여될 수 있다. 어떤 경우에는 개체에게 25 mg/m2의 플루다라빈을 투여할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 플루다라빈은 단일 용량으로 투여 될 수 있거나, 매일, 1일 간격으로 또는 3일 마다 제공되는 것과 같은 복수 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 플루다라빈은 1일 내지 5일 동안, 예를 들어 3일 내지 5일 동안 매일 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 림프구 제거제는 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합물과 같은 약제의 조합물을 포함할 수 있다. 따라서 상기 제제의 조합은 시클로포스파미드를 전술한 바와 같이 임의의 투여량 또는 투여 계획에서, 및 임의의 투여량 또는 투여 계획에서 상기한 바와 같은 투여량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 측면에서, 개체는 세포 투여 전에 60 mg/kg (~2 g/m2)의 시클로포스파미드 및 25 mg/m2 플루다라빈을 3 내지 5회 투여될 수 있다.
일 측면에서, T 세포, 예를 들어 CAR-발현 T 세포를 투여하기 전에, 개체는 트립토판 대사를 받고, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 또는 30 일 전에 세포 및 림프구 제거 시클린파미드의 전처리 화학 요법은 T 세포보다 적어도 2 일 전에 투여될 수 있으며, 일반적으로 세포 투여 7일 전에 투여될 수 있다. 일 경우에는, 예를 들어 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 예를 들어 IDO 1이 투여 한 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 14일, 21일, 28일 또는 30일 후에 시클로포스파미드가 투여될 수 있다. 전처리 치료 후, 개체에게 본원에 기재된 CAR-발현 T 세포의 투여량을 투여할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 예를 들어 림프구 제거 요법을 위한 전처리 제제의 투여는 세포 투여량의 주입 전에 치료 결과를 향상 시킬 수 있다. 예를 들어, 일 측면에서, 전처리는 투여량으로 치료의 효능, 결과 또는 활성을 향상 시키거나, 대상에서 재조합 수용체-발현 세포(예를 들어, CAR-발현 T 세포와 같은 CAR 발현 세포)의 지속성을 증가 시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 전처리 치료는 살아 있고 세포의 투여 후 주어진 시간 기간 후에 최소 잔류 또는 분자적으로 검출 가능한 질환을 나타내지 않는 환자의 퍼세트와 같은 질병 없는 생존을 증가시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 무병 생존 중앙 값까지의 시간이 증가될 수 있다.
세포가 개체(예: 사람)에 투여되면, 일부 측면에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 여러 가지 알려진 방법 또는 본원에 기술된 평가 방법 또는 분석법, 예를 들어 섹션 III 중 임의의 방법으로 측정될 수 있다. 평가할 매개 변수는 조작된 T 세포 또는 다른 면역 세포가 항원, 생체 내, 예를 들어 영상화 또는 생체 외, 예를 들어 ELISA 또는 유동 세포 분석법에서 특이적으로 결합하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 문헌, 예를 들어 Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al., J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)에 기재된 세포 독성 검정과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일 특정양태에서, 세포의 생물학적 활성은 또한 특정 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정될 수 있다. 일 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부하 또는 부하의 감소와 같은 임상적 결과를 평가함으로써 측정될 수 있다. 일 측면에서, 독성 결과, 세포의 지속성 및/또는 증식(체적증대), 및/또는 숙주 면역 반응의 존재 또는 부재가 평가될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포의 투여량을 주입하기 전에 전처리제, 예를 들어 리픔구 제거 요법의 투여는 투여량으로 치료의 효능 결과 또는 활성을 개선시키는 것과 같은 치료 결과를 개선시키는 것과 같은 치료 효과를 개선시키거나 또는 대상에서 재조합 수용체-발현 세포 (예를 들어, CAR-발현 T 세포와 같은 CAR-발현 세포)의 지속성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 림프구 제거 요법은 면역 치료, 예를 들어 T 세포 치료 및/또는 트립토판 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여 전에 제공되지 않을 수 있다.
Ⅲ. 스크리닝, 개체 평가 또는 선택, 치료 결과 평가
본원에서 제공된 방법, 조성물, 조합물, 키트 및 용도의 일부 실시 양태에서, 조합 요법은 조합 요법에 대한 적합성을 결정하기 위한 하나 이상의 스크리닝 및/또는 평가 단계, 조합 요법으로 치료하기 위한 개체를 확인 또는 선택 및/또는 병용 요법 계속 및/또는 치료 결과 및/또는 모니터링 평가 단계 치료 결과를 추가로 더 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계는 본원에 기재된 것과 같은 특정 매개 변수의 평가 또는 평가와 같은 치료 개체를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 치료 결과의 평가를 위한 단계는 치료를 평가 및/또는 모니터링하고/ 하거나 치료의 추가 또는 잔여 단계의 투여 및/또는 반복 치료를 위한 대사을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 치료 결과 평가는 본원에서 제공된 병용 요법의 투여량, 빈도, 기간, 시기 및/또는 순서를 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 제공된 조합 요법은 후술하는 바와 같이 치료 또는 치료와 관련된 임의의 하나 이상의 매개 변수와 관련된 특징과 같은 치료 결과 중 임의의 하나 이상을 초래한다.
일부 실시 양태에서, 조합 요법은 TME의 면역 상태를 극복하고 T 세포 치료(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료의 활성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서 트립토판 (TRP) 결핍 및/또는 키누레인 (KYN) 및 이의 유도체 생산을 억제하는 키누레인 경로의 조절은 T 세포의 증식 및/또는 활성을 증가시켜, 면역 치료의 활성 단독에 비해 면역 치료, 예를 들어 T 세포 용법(CAR을 발현하는 T 세포)의 증가된 활성을 초래한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과 치료의 평가를 사용하여 병용 요법의 활성을 측정 및/또는 모니터링할 수 있다.
일 측면에서, 기술된 바와 같은 특정 매개 변수를 스크리닝하거나 평가하는 것은 특정 치료, 예를 들어, 본원에서 제공된 병용 요법에 대해 적합하고 이에 민감하고 및/또는 이에 반응하는 대상을 확인하거나, 또는 피험자 또는 소집단 또는 다른 피험자 그룹에 대한 유효 투여량을 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 스크리닝 또는 평가는 치료에 반응하는 것으로 예측되는 환자를 선별 또는 동정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계는 본원에서 제공된 병용 요법의 용량, 빈도, 기간, 시기 및/또는 순서를 결정하는데 사용된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 결과의 선별 단계 및/또는 결과의 평가는 제공된 병용 요법, 예를 들어 T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포 결합 요법 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 같은 면역 치료의 하나 이상의 단계의 투여 전, 도중, 진행 중 또는 투여 후에 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 평가는 본원에 제공된 방법 중 임의의 것을 수행하기 전, 도중, 진행 중 또는 수행 후에 수행 후에 행해진다. 일부 실시 양태에서, 평가는 본 명세서에서 제공된 방법을 수행하기 전에 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 평가는 본원에 제공된 방법의 하나 이상의 단계를 수행한 후에 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 평가는 예를 들어 병용 요법을 투여하기에 적합하고 및/또는 감수성이 있는 환자를 스크리닝하고 동정하기 위해, 제공된 병용 요법의 하나 이상의 단계의 투여 전에 투여 전에 수행된다. 일부 실시 양태에서, 평가는 예를 들어, 중간 또는 최종 치료 결과를 평가하기 위해, 예를 들어, 치료활성을 결정하고 및/또는 치료를 계속 또는 반복하지 여부를 결정하고/하거나 병용 요법의 나머지 단계를 투여할지 여부를 결정하기 위해, 제공된 복합 요법의 하나 이상의 단계의 투여 도중, 과정 중에 또는 투여 후에 수행된다.
일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 치료 결과의 평가는 수준 및 변화의 평가, 예를 들어, 인자의 수준의 변경, 예를 들어 키누레인 경로의 인자 및/또는 대사산물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과 치료의 평가는 면역 기능, 예를 들어 세포 기반 치료 및/또는 체내의 내인성 T 세포에 대해 투여된 T 세포의 면역 기능을 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과 치료의 평가는 사이토카인 또는 성장 인자의 수준을 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과 치료의 평가는 지병 부담 및/또는 개선, 예를 들어 종양 부담 및/또는 임상 결과의 평가를 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과 치료의 평가는 본원에 기술된 및/또는 당 업계에 공지된 임의의 평가방법 및/또는 검정을 포함할 수 있으며, 병용 요법의 하나 이상의 단계의 투여 전, 투여 도중, 투여하는 동안 또는 투여 후에 1회 이상 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 특정 매개 변수를 평가하여 병용 요법에 대한 환자를 선택하고, 병용 요법의 순서, 용량 또는 요법을 결정하고, 치료 결과를 결정하고 및/또 병용요법의 활성을 결정하기 위해 평가 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 매개 변수는 예를 들어 키누레닌 경로의 대사물 수준, 예를 들어 TRP, KYN 또는 KYN 유도체의 인자 또는 이펙터의 발현 수준, 예를 들어 키누레닌 경로에 관여하는 효소, 예를 들어 IDO 1, T 세포 증식, T 세포 활성, 세포 표현형 평가, 예를 들어 T 세포 표면 마커 발현 및/또는 치료 활성을 포함한다. 평가는 생체 내, 생체 외 또는 시험 관내에서 이루어질 수 있으며, 특정 매개 변수는 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청 샘플, 혈장 샘플, 종양 생검 또는 생체 내 이미징을 통해 결정될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 뇌척수액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플 또는 이로부터 유도된 가공 샘플을 포함하는 종양 샘플, 예를 들어 조양 생검에서 분리된 세포 및/또는 조직 절편과 같은 체액을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 제공되는 방법의 일부 실시 양태에서 평가될 수 있는 치료결과와 관련된 예시적인 매개 변수 세트는 혈장 키누레닌/트립토판 비율, 말초 혈장 면역 세포 집단 프로파일, 종양 부담 (tumor burden) 및 혈장 종양 마커의 발현 수준 및 면역 조절 및 IDO1+ 발현의 지표를 포함한다.
A. 개체의 선별, 확인 및/또는 선택과 투여량 스케쥴 결정
일부 실시 양태에서, 환자는 병용 요법의 하나 이상의 단계를 투여하기 전에 스크리닝 될 수 있다. 예를 들어, 개체는 질환의 수준, 가용성, 농도, 효과, 활성, 대사, 요소의 합성 및/또는 분해 및/또는 질병의 특성 및/또는 하나 이상의 병용 요법의 투여 후에 또는 투여 전의 질병의 부담 및/또는 하나 이상의 병용 요법의 투여의 적합성, 반응성 및/또는 감수성을 결정하기 위한 치료 전의 반응 및/또는 전처리의 과거력에 대해 스크리닝할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 개체는 키나우레닌 경로의 효소 및/또는 대사제와 같은 인자 또는 이펙터의 수준, 유효성, 농도, 효과, 대사, 합성 및/또는 인자 또는 작동자의 감소, 예를 들어 키누레닌 경로의 대사물의 수준, 예를 들어 인자 또는 작동자의 수준의 발현, TRP, KYN 또는 KYN의 유도체, 예를 들어, 키누레닌 경로에 관여하는 효소, 예를 들어, IDO 1, 및/또는 아미노산 수송체, 예를 들어 개체로부터 생물학적 샘플로부터 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4, 예를 들어, 종약, 혈액 및/또는 샘플에 대해 스크리닝 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 섹션 III. C 에 기술된 바와 같은 본원에 기술된 치료, 스크리닝, 동정 또는 치료 결과와 관련된 매개 변수 중 임의의 항목 치료의 적합성, 반응성 및/또는 감수성을 결정하고/하거나 치료 대상, 예를 드어 본원에서 제공된 실시양태 중 일부, 예를 들어 병용 요법의 하나 이상의 단계로 투여를 선별, 확인 및/또는 선택하기 위한 관련 매개 변수로서 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 복합 요법의 나머지 단계를 받기 위한 대상을 결정하고 동정하기 위해, 복합 요법의 단계 중 하나의 투여 후에 대상을 스크리닝 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료(예를 들어 CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료의 투여 전에 투여되고, 면역 치료를 시행하기 전에 키누레인 경로의 효소 및/또는 대사산물과 같은 인자를 평가해야 한다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 전에 투여되고, 투여된 T 세포의 증식 및/또는 활성 및/또는 키누레닌 경로의 인자, 예를 들어 효소 및/또는 대사 물질의 수준은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 전에 평가된다. 일부 실시 양태에서, 환자는 병용 요법의 투여 전에 종양 또는 종양 미세 환경(TME) 및/또는 질병 부담, 예컨대 종양 부담과 같은 질병의 특정에 대해 스크리닝 될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, T 세포 치료, 예를 들어, CAR T 세포 치료를 받은 개체는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자로 투여하기 위한 대상을 선택 및/또는 동정하기 위해, 종양 샘플에서 증가된 IDO1 발현 및/또는 순환 트립토판 또는 키누레닌 수준과 같은 순환 대사산물 수준을 평가한다. 본원에 기술된 및/또는 당업계에 공지된 임의의 평가 및/또는 검정법 중 임의의 것, 및 조합 요법에 대한 개체를 스크리닝하는 단계로서 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 치료를 위한 지병 또는 증상을 갖는 대상체를 선별하는 방법이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 치료를 위해 개체를 스크리닝 및/또는 확인하기 위해, 매개 변수, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 매개 변수를 평가하는 방법이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 치료는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를, 특히 T 세포 치료와 병용 투여하는 것이다.
일부 실시 양태에서, 스크리닝, 동정 및/또는 선택하는 방법은 분자 및/또는 작용제의 유도 또는 생성을 나타내는 또는 관련되는 수준, 및/또는 인자, 분자 및/또는 작용제의 수준 및/또는 양과 같은, 적응 면역 저항에 관여하는 또는 트립토판 대사/키누레닌의 활성화 경로, IDO1 발현 및/또는 트립토판 결핍과 같은 매개 변수의 평가 방법을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 이러한 평가는 인자, 분자 및/또는 작용제와 같은 매개 변수의 레벨 및/또는 양을 결정하는 것 및/또는 매개 변수의 변화를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 매개 변수의 수준 및/또는 양 및/또는 매개 변수의 수준 및/또는 양의 변화는 개체에서 트립토판 대사/키누레닌 경로, IDO 1 발현 및/또는 트립토판 감소의 활성화와 직접 또는 역으로 상관관계가 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 스크리닝 및/또는 평가의 결과에 기초하여, 치료를 위해 질환 또는 증상를 갖는 개체를 확인 및/또는 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 매개 변수의 수준 및/또는 양 및/또는 매개 변수의 수준 및/또는 양의 변화가, 예를 들어 직접 또는 역으로 상관관계가 있는, 트립토판 대사/키누레닌 경로의 활성화, IDO 1 발현 및/또는 트립토판 고갈을 나타내는 개체를 선별하거나 식별한다. 일부 실시 양태에서, 이러한 개체는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 및/또는 T 세포의 투여를 위해 동정 및/또는 선택된다.
일부 실시 양태에서, 적응 면역 저항, 트립토판 대사/키누레닌 경로의 활성화, IDO 1 발현 및/또는 트립토판 결핍을 나타내는 지표 및/또는 인자, 분자 및/또는 작용제의 수준 및/또는 양과 같은 매개 변수는 트립토판 또는 트립토판 대사산물의 수준, IDO 1, IDO 2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준 또는 인터페론-감마(IFNγ) 수준을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 임계 수준 이상의 수준 또는 매개 변수의 증가와 같은 이전 시점과 비교된 높은 수준의 매개변수는 적응 면역 저항성, 트립토판 대사/키누레닌 경로, IDO 1 발현 및/또는 트립토판 결핍이 표식 되거나 관련이 있다. 일부 실시 양태에서, 평가 결과가 적응 면역 저항성, 트립토판 대사/키누레닌 경로, IDO 1 발현 및/또는 트립토판 결핍과 관련이 있거나 표식이 되는 경우, 개체는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 위해 선택된다.
일부 실시 양태에서, 매개 변수는 생체 내, 생체 외 또는 시험 관내에서 평가 될 수 있으며, 매개 변수는 생물학적 시료, 예를 들어 혈청 샘플, 혈장 샘플, 종양 생검 또는 생체 내 이미지에서 결정될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 뇌 척수액, 활액, 소변, 및 땀, 조직 및 기관 샘플 또는 종양 생검에서 분리된 세포 및/또는 조직 절편 등과 같은 이로부터 유도된 가공 샘플을 포함하는 종양 샘플을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 생물학적 샘플이 T 세포 치료의 투여 전에 수득된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 생물학적 샘플이 T 세포 치료의 투여 후에 수득된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 생물학적 샘플이 T 세포 치료 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 후에 수득된다.
일부 실시 양태에서, 평가는 T 세포 치료의 투여 전에 수행된다. 일부 실시 양태에서, 평가는 T 세포 치료의 투여 후에 수행된다. 일부 실시 양태에서, 평가는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 전에 수행된다. 일부 실시 양태에서, 평가는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 후에 수행된다. 일부 실시 양태에서, 평가는 T 세포 치료 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 후에 수행된다.
일부 실시 양태에서, 매개 변수는 트립토판의 수준이고, 샘플 중의 트립토판 수준은 임계 수준 미만이거나, T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점에서 평가된 수준에 비해 감소된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판의 수준은 적응 면역 저항, 트립토판 대사/키누레닌 경로의 활성화, IDO 1 발현 및/또는 트립토판 고갈에 반비례할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 매개 변수는 IDO 1, IDO 2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준이고, IDO 1, IDO 2 또는 TOD의 발현 또는 활성 수준은 임계 수준 이상이거나 평가된 수준 T 세포 치료의 투여 시작 전의 시점 또는 T 세포의 투여 개시후의 선행 시점에서 투여 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 1, IDO 2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준은 적응 면역 저항성, 트립토판 대사/키누레닌 경로의 활성화, IDO 1 발현 및/또는 트립토판 고갈과 직접 관련될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 매개 변수는 IFNγ의 수준 및 IFNγ 수준이며, T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후의 선행시점에서 평가된 수준과 비교하여 임계 수준 이상이거나 증가 된다. 일부 실시 양태에서, IDO 1, IDO 2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준은 적응 면역 저항성, 트립토판 대사/키누레닌 경로의 활성화, IDO 1 발현 및/또는 트립토판 고갈과 직접 관련될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 샘플에서 트립토판의 수준이 임계 수준 보다 낮거나, T 세포 치료의 투여 개시 전의 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점에서 평가된 수준과 비교하여 감소된 경우; 트립토판 대사 산물의 수준이 임계 수준 높거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 경우; IDO1, IDO2 또는 TDO의 활성 또는 발현 수준이 임계 수준보다 높거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 경우; 또는 IFNγ의 수준이 임계 수준보다 높거나 T 세포 치료의 투여 시작 이전의 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 경우, 개체는 동정되거나 선택된다.
일부 실시 양태에서, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준이 T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 경우 개체는 선택된다. 일부 실시 양태에서, 샘플의 트립토판 수준이 임계 수준보다 낮거나, T 세포 치료의 투여를 개시하기 이전의 시점에서 평가된 수준과 비교하여 감소한 경우, 개체는 선택된다.
일부 실시 양태에서, 임계 수준은 평균 수준, 농도 또는 양의 25 % 이내, 20 % 이내, 15 % 이내, 10 % 이내 또는 5 % 이내이며, 및/또는 복수의 대조 개체 중에 생물학적 샘플의 평균 수준, 농도 또는 양의 표준 편차 이내이다. 일부 실시 양태에서, 대조 개체는 건강한 사람 또는 정상인이고, T 세포 치료의 투여를 받기 전에 암을 가지지 않은 개체 및/또는 개체이다. 일부 실시 양태에서, 증가 또는 감소는 약 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배 또는 이상이다.
일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 투여된 T 세포의 수, 기능, 상태 및/또는 표현형의 평가를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 T 세포 치료의 세포의 초대 또는 최대 수준의 평가가 환자의 혈액에서 검출 가능한 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 연장된 트립토판 고갈, 소진, 알레르기, 세포 사멸, 수축, 종양 항원에 대한 항종양 면역 반응 또는 내성의 억제의 상태를 포함하는 T 세포 기능, 상태 및/또는 표현형의 평가 및/또는 기아로부터 회복하기 위한 능력, 예를 들어, 트립토판 고갈 및/또는 소진의 효과를 역전시킬 수 있다.
일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 종양 내 또는 근방에 존재하는 세포, 예를 들어, CAR T 세포, 종양 세포 및/또는 방관자 세포, 및/또는 종양 내 또는 근방에 존재하는 세포, 예를 들어 CAR T 세포, 종양 세포 및/또는 방관자 세포의 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 IDO 1 발현 및/또는 개체로부터의 샘플, 예를 들어 생검 및/또는 분리된 세포와 같이 개체로부터의 종양 샘플에서 트립토판 수용체, 예를 들어 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4와 같은 아미노산 수용체의 발현 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서 개체의 종양 샘플은 T 세포 치료의 투여 전에, 상이한 개체로부터의 기준점 및/또는 표본으로부터 수득된 샘플과 비교하여 증가된 IDO 1 발현 및/또는 트립토판 수송체, 예를 들어 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4와 같은 아미노산 수송체의 발현이 나타난 경우, 개체는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여를 위해 확인되거나 선택된다.
일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 키누레닌 경로 대사산물, 예를 들어 트립토판 또는 키누레닌 및/또는 이들의 유도체의 수준 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 개체로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장 또는 종양 샘플에서의 키누레닌 경로 대사산물 수준의 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료의 투여 전에 상이한 개체로부터의 기준점 및 또는 표본에서 수득된 샘플과 비교하여 개체로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청 또는 혈장 샘플에서 대사 산물이 변경되거나, 예를 들어 증가 또는 감소되는 경우, 개체는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여를 위해 확인되거나 선택된다.
일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 임의의 선행 요법 및/또는 경과의 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 및/또는 평가는 이전 치료의 반응성 또는 실패, 이전 치료 후의 재발 및/또는 재발에 대한 내성을 평가하는 것을 포함한다. 일 측면에서, 스크리닝 및/또는 평가는 종양 부하, 벌크, 크기, 전이, 단계 및/또는 독성 결과를 나타내는 피험자의 가능성 또는 발병의 유형, 예를 들어 CRS와 같은 환자의 전처치 질병 부담에 대한 피험자의 반응, 마크로파지 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성 및/또는 투여된 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응의 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 이전 치료는 임의의 치료, 예를 들어 화학 요법과 같은 임의의 통상적인 암치료 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이전 치료는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 치료, 예를 들어 IDO 1 억제제 치료 및/또는 면역 검사 치료제와 같은 T 세포 치료가 아닌 면역 조절 치료제의 투여이다. 일부 실시 양태에서, 이전의 치료는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제 및 면역 조절제, 예를 들어 면역 관문 억제제의 병용 요법이다.
일부 실시 양태에서, 개체는 선택적으로 선행 투여가 T 세포 치료, 예를 드어 면역 관문 억제제 요법이 아닌 면역 조절 요법과 병행하여 수행되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제 치료의 선행 투여와 같은 이전의 치료 후에 내성 및/또는 재발하게 되면 본원에 제공된 실시양태의 하나 이상의 단계의 투여를 위해 선택되거나 식별된다. 일부 실시 양태에서, 병용 요법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제 및 면역 조절제, 예를 들어, 면역 관문 억제제의 병용 요법의 다른 이전 치료 후에 실패한 환자, 내성이 있는 환자 및/또는 재발한 개체에게 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이전의 면역 치료 조절 치료법은 이전의 T 세포 치료법이 아니다. 일부 실시 양태에서, 개체는 이전의 T 세포 치료를 투여하지 않았다. 일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 치료 결과 평가는 본원에 제공된 병용 요법의 투여 량, 빈도, 기간, 시기 및/또는 순서를 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 조작된 세포의 투여 개시 또는 조작된 세포의 투여 개시 후 선행되는 시점과 비교하여 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 대상의 혈청 또는 혈장 샘플에서의 IDO 1 발현 또는 활성의 증가; 및/또는 개체로부터의 혈액에서 검출 가능한 조작된 세포의 수는 조작된 세포의 투여 후의 선행 시점에서 개와 비교하여 감소될 때에 재조합 수용체 발현 세포의 투여 개시 후에 개시된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하거나 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점과 비교하여 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 대상의 생물학적 샘플에서 IDO 1, IDO 2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가; 개체로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 T 세포 치료의 투여 개시 후의 선행 시점의 개체와 비교하여 감소; 혈액 내에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 약 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 50 배 또는 100 배 미만이거나 T 세포 치료의 투여 개시후 개체의 혈액에서 검출 가능한 T 세포의 요법의 세포의 최대 또는 최대 수를 1/3이하로 감소; 및/또는 T 세포 치료의 세포의 최대 또는 최대 수준이 환자의 혈액에서 검출 될 수 있는 시점 이후에, 개체로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수는 개체의 혈액에서 총 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 10 %, 5 % 미만, 1 % 미만 또는 0.1 % 미만; IFNγ 또는 TNFα의 수준은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 비해 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점과 비교하여 개체로부터의 생물학적 샘플에서 증가될 때에 투여된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하거나 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점과 비교하여 트립토판 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 개체의 생물학 샘플에서 IDO 1, IDO 2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가; 개체로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 T 세포 치료의 투여 개시 후의 선행 시점의 개체와 비교하여 감소; 혈액 내에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 약 1.5배, 약 2배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 50배 또는 100 배 미만 또는 미만 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 개체의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 최대 또는 최대 수보다 적은 경우; 및/또는 T 세포 치료의 세포의 최대 또는 최대 수준이 개체의 혈액에서 검출 될 수 있는 시점 이후에, 개체로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수는 개체의 혈액 중 총 말라리아 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 10%미만, 5%미만, 1% 미만 또는 0.1% 미만; IFNγ 또는 TNFα의 수준이 T 세포 치료의 투여 개시 전에 비해 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점과 비교하여 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 증가 될 때에 투여된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 세포의 최대 또는 최대 수준이 혈액에서 검출되기 전에 한 번에 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료에서 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점의 피험자와 비교하여 개체로부터 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소하는 것과 같이 세포의 최대 또는 최대 수준으로부터 수축되기 이전의 시간에 투여된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는, T 세포 치료의 투여 시작 전과 비교하거나 T 세포 치료의 투여 개시 후 선행 시점과 비교하여 개체의 생물학적 샘플에서 IDO 1의 발현 또는 활성이 증가 될 때 투여된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제 투여 직전과 비교하거나 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료의 개시 직전과 비교하여 개체의 생물학적 샘플, 선택적으로 혈청 또는 혈장 샘플에서 트립토판 수준의 지속 최대 증가, 키누레닌 수준의 지속적인 초대 감소 또는 IDO 1 발현 또는 활성의 지속적인 최대 감소가 있을 때까지 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료의 투여 개시 후 계속된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로조절제, 예를 들어 IDO 1 억제제는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제 투여 직전과 비교하여 개체로부터의 혈액에서 검출 가능한 조작된 세포의 수가 지속적으로 최대로 증가할 때까지 투여 한다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료의 투여를 개시 한 후 최대 2일, 최대 7일, 최대 14일, 최대 21일, 최대 28일, 최대 35일 또는 최대 42일, 최대 1개월, 최대 2개월, 최대 3개월, 최대 6개월 또는 최대 1년 동안 투여된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 개체의 혈액 내 조작된 세포의 농도 또는 수는 (i) 마이크로 리터 당 적어도 약 10개 조작된 세포, (ii) 적어도 총 수의 20 %, 30 %, 40 % 또는 50 % 말초 혈액 단핵구 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC), (iii) 적어도 1 x 105개 조작된 세포, 또는 (iv) 마이크로 그램 DNA 당 제조합 수용체-코딩 DNA 의 적어도 5,000 카피; 및 또는 (a)에서의 투여 개시 후 90 일째에, CAR- 발현 세포는 환자의 혈액 또는 혈청에서 검출 가능; 및/또는 (a)에서 투여 개시 후 90일째에, 개체의 혈액이 적어도 마이크로리터에 20% CAR-발현 세포들, 적어도 10 CAR-발현 세포들, 또는 적어도 1 x 104 CAR-발현 세포를 포함할 때 까지 투여 된다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 IDO 1에 대해 음성인 종양을 포함하는 및/또는 상기 대상이 IDO 1 양성 종야의 발현을 위해 선택되지 않은 암을 갖는 개체에게 투여되며; 및/또는 상기 방법을 TOD에 대해 음성인 종양을 포함하는 암을 가진 개체에게 투여하고/하거나 개체는 TOD 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 개체(예를 들어, 제공된 치료제가 투여되는)은 트립토판을 섭취하거나 교환할 수 있는 LAT2 (SLC7A8), CD98 중쇄 (4F2hc, CD98hc, SLC3A2) 및/또는 양성자 보조 아미노산 수송체 (예를 들어, L 형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 그 복합체의 하나 이상의 사슬) 4 (PAT4; SLC36A4)와 같은 아미노산 수송체 또는 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 양성이거나 높은 수준으로 발현하는 세포, 예를 들어 종양 미세 환경의 방관 세포를 포함하는 암을 가진 대상을 발현 할 수 있는 양성인 암 또는 종양 관련 조직 또는 세포가 있거나 이에 걸린 것으로 의심되는 개체이다. 일부 실시 양태에서, 제조 물품은 처리전 종양, 종양과 관련된 조직 또는 세포 또는 마커에 대해 개체가 평가되어야 한다고 지시하는 하나 이상의 제제 및, 문헌 및/또는 지시를 포함한다.
평가를 위한 임의의 방법의 일부 실시 양태에서, 대상체의 스크리닝, 동정 및/또는 선별은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 및/또는 T 세포 치료의 투여를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 T 세포 치료를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 선택된 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 평가를 위한 임의의 방법의 일부 실시 양태에서, 개체의 스크리닝, 동정 및/또는 선택은 평가 전에 개체에 세포 치료를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 평가를 위한 임의의 방법의 일부 실시 양태에서, 환자의 스크리닝, 동정 및/또는 선택은 키누레인 경로 조절인자를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 전에 또는 동시에 투여와 함께 선택된 대상에게 투여된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 후에 투여 된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 생물학적 샘플은 T 세포 치료의 투여 후에 수득된다.
B. 치료 결과의 평가 및/또는 치료 결과의 모니터링
본원에서 제공된 방법, 조성물, 조합물, 키트 및 용도의 일부 실시 양태에서, 병용 요법은 치료 결과의 평가 및/또는 치료 결과의 모니터링을 위한 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 치료 결과의 평가 및/또는 치료 결과의 모니터링을 위한 단계는 치료를 감시하고 치료의 활성 또는 효능과 같은 결과를 평가하는 평가 방법 및/또는 검정을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 치료 결과의 평가를 위한 단계를 치룔 평가 및/또는 모니터링하고/하거나 치료의 추가 또는 잔여 단계에 대한 대상을 확인 및/또는 치료를 반복하는 단계를 포함 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 치료 결과의 평가 및/또는 치료 결과의 모니터링을 위한 단계는 본원에서 제공된 병용 요법의 투여량, 빈도, 기간, 시기 및/또는 순서를 결정하는데 사용된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 결과 치료의 평가는 예를 들어, 중간 또는 최종 치료 결과를 평가하기 위해, 예를 들어, 치료 활성을 결정하거나 모니터링하기 위해, 치료를 계속하거나 반복하도록 결정하기 위해, 및/또는 병용 요법의 특정 투여량, 본도, 지속 시간, 시간 및/또는 순서를 결정하기 위해, 제공되는 병용 요법, 예를 들어 T 세포 용법(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 요법 및 트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자의 투여의 하나 이상의 투여 단계의 투여 동안, 과정 중에, 투여 후에 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 결과의 치료 평가는 T 세포 치료(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료의 투여 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여의 모두 후에 사용된다.
일부 실시 양태에서, 치료 결과 평가 및/또는 치료 결과 모니터링에는 본원에 설명된 평가 방법 및/또는 분석, 예를 들어 인자 또는 이펙터의 수준 및/또는 수준의 평가, 예를 들어 효소 및/또는 키누레닌 경로의 대사산물, 면역기능, 예를 들어 세포 기반 요법 및/또는 체내의 내인선 T 세포, 세포 기반 요법, 사이토카인 또는 성장인자, 질병의 부담 및/또는 치료를 위해 투여된 T 세포의 생존 및/또는 기능에 대해 투여도니 T 세포의 면역 기능 개량, 예를 들어, 종양 부담 및/또는 임상결과의 평가를 포함한다. 본원에 기술된 및/또는 당업계에 공지된 평가 방법 및/또는 검정법 중 임의의 것으로, 치료 결과의 평가 및/또는 치료 결과의 모니터링을 위한 단계로 수행 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 평가 방법들 및/또는 분석들 중 임의의 것이 한 번 또는 두 번 이상 수행되거나 반복적으로 수행 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 병용 요법 중 하나 또는 둘 모두의 투여 및/또는 치료의 임의의 반복 투여는 병용 요법 중 하나 또는 둘 모두의 투여 전, 도중 또는 투여 후에 분석 결과에 기초하여 결정 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공되는 방법의 예시적인 치료 결과는 키누레닌 경로 대사산물 수준의 변화, KYN 및 이의 유도체의 생산 감소, 향상된 T 세포 증식, 증가된 T 세포 기능 활성, 면역 세포 표현형 마커 발현의 변화, 질병 부담, 예를 들어 암의 부담 감소로 인한 임상 결과 향상 및/또는 강화된 치료 활성을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 본원에서 제공된 방법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 절제의 부재 하에 투여되는 것을 포함하는 방법에 비해 개체로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청 또는 혈장 샘플에서의 트립토판 수준의 증가 및/또는 키누레닌 수준의 감소를 초래한다.
T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-치료와 같은, 본원에서 제공된 면역 치료의 일부 실시 양태에서, 매개 변수의 평가는 면역 치료가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 부재 하에 대상에게 투여되는 방법과 비교하여 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료에 대한 투여된 T세포의 개체에서의 팽창 및/또는 지속성을 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에 T 세포 치료를 대상에게 투여하는 방법과 비교하여 투여된 T 세포가 개체에서 증가된 또는 연장된 증식(체적증대) 및/또는 지속성을 나타내는 결과를 초래한다.
일 실시양테에서, 상기 방법은 또한 환자에게 세포 치료의 활성에 영향을 미친다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 갖는 방법에서 세포 투여 후 재조합 수용체-발현, 예를 들어 CAR-발현 세포의 개체의 지속성, 증식(체적증대) 및/또는 존재는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 없는 방법을 통해 달성된 것 보다 크다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 재조합 수용체를 발현하는 세포의 투여량이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 부재 하에 개체에게 투여하는 방법과 비교하여 질병 부담, 예를 들어 종양 부담을 줄인다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 재조합 수용체를 발현하는 세포 투여량이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에 개체에게 투여되는 방법과 비교하여 개선된 임상 결과, 예를 들어 객관적인 반응 속도 (ORP), 무진행 생존 (PFS) 및 전체 생존 (OS)를 초래한다.
일부 실시 양태에서, 변경 및/또는 변화, 예를 들어, 상이한 평가 시점, 상이한 조건, 기준 및/또는 상이한 대상에서 동이한 매개 변수의 수준, 값 또는 측정값과 비교할 때 매개 변수의 수준, 값 또는 측정 값에서 증가, 상승, 감소 또는 감소가 결정되거나 평가된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 배 변화(fold change), 예를 들어 특히 매개 변수 예를 들어, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 전 또는 후와 같은 상이한 조건에서 같은 매개 변수를 비교할 때, 샘플 중의 조작된 T 세포의 수의 증가 또는 감소는 결정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 2개 이상의 매개 변수의 수준, 값 또는 측정 값이 결정되고, 상대 수준이 비교된다. 일부 실시 양태에서, 매개 변수의 결정된 수준, 값 또는 측정치는 대조군 시료 또는 미처리 시료로부터의 수준, 값 또는 측정값과 비교된다. 개별 매개 변수의 정량화에서 얻어진 값은, 예를 들어 다중 매개 변수 분석을 사용하여 매개 변수의 수준, 값 또는 측정 값에 대한 산술적 또는 논리적 연산을 형성함으로써 질병 평가의 목적으로 결합 될수 있다. 일부 실시 양태에서, 둘 이상의 특정 매개변수의 비울이 계산될 수 있다.
C. 치료, 스크리닝, 확인 또는 치료 결과와 관련된 매개 변수
1. 트립토판과 키누레닌 대사 물질과 효소 수준
일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과의 치료 및/또는 결과의 평가에 대해 평가할 수 있는 매개를 포함하는 치료 또는 치료 결과와 관련된 매개 변수는 키누레닌 경로 대사 물질, 예를 들어 트립토판 또는 키누레닌의 수준 또는 키누레닌 경로에 관련된 요인 또는 이펙터, 예를 들어 효소, 수용체 또는 신호 분자를 포함한다. 상기 섹션 II.B.1에 논의된 것과 같이, 키누레닌 경로는 트립토판 대사에서 핵심경로이며 많은 단계를 포함하고 여러 가지 대사산물을 포함하며 그 중 일부는 면역 억제성 TME에 기여한다. 일부 실시 양태에서 키누레닌 경로 대사산물 수준의 평가는 병용 치료를 위한 환자를 선택하고, 병용 요법의 순수, 용량 또는 치료를 결정하고, 치료 결과를 결정하고 및/또는 병용 요법의 활성을 결정하기 위해 수행 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 평가된 매개 변수는 수준, 변화, 예를 들어 변경의 수준, 및/또는 키누레닌 경로에서 하나 이상의 효소의 발현 수준이다. 일부 실시 양태에서, 키누레닌 경로의 효소는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1), IDO2, 트립토판 2,3-디옥시게나아제 (TDO), 키누레닌 포르미미다제, 키누레니나아제, L-키누레닌 가수 분해 효소, 키누레닌-3-3-히드록시 안트라닐산 옥시게나아제, 3-히드록시 안트라닐레이트 3,4-디옥시게나아제, 키누레닌 아미노-트랜스퍼라제 및/또는 퀴놀린산 포스포리보실 트랜스퍼라제를 포함한다. 일부 실시 양태에서. 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 효소의 수준은 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현을 검출하기 위한 임의의 통상적인 방법, 예를 들어 핵산 및/또는 단백질을 검출하는 방법, 예를 들어 세포내 효소를 사용하여 결정된다.
일부 실시 양태에서, 평가된 매개변수는 키누레닌 경로 및/또는 트립토판 대사, 신호 및/또는 운반에 관여하는 구성 요소에 관여하는 요소, 예를 들어 작동기의 발현 수준 및/또는 활성화 상태, LAT-1 또는 관련 수송체와 같은 트립토판 수송체 또는 수송체의 복합체를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 평가된 예시적인 매개변수는 발현 수준 또는 활성화 상태, 예를 들어, 트립토판 대사, 수송 및/또는 신호 전달에 관여하는 성분의 인산화 상태 또는 세포 국소화, 예를 들어, 종합 통제 비억제성 2 (GCN2), 인터페론 γ (IFNγ), 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), 신호 변환기 및 전사 인자 3 (STAT3), 포유 동물 표적인 라파 마이신 (mTOR), 아릴 탄화수소 수용체 (AHR) ), AHR 핵 이동체 (ARNT), 다이옥신 반응 요소 (DRE), TRP (트립토판) 수송체 (예를 들어, CD98 및/또는 CD98 / LAT-1 수송체 복합체, 예를 들어 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 중 하나 이상과 같은 결합쇄 및/또는 (LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4, SLC36A4), Asc-1, Asc-2, ATB0, B0AT1, TAT1), PR 도메인 아연 수송체 진핵세포 번역 개시 인자 2 α (eIF2α), 전사 인자 4 (ATF4) 활성화, CCAAT / enhancer binding protein-homologous protein (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및/또는 IFNγ-R2를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 평가된 매개 변수는 키누레닌 경로에서의 하나 이상의 대사 산물의 수준, 유효성, 농도 효과, 활성, 대사 합성 및/또는 분해의 수준 또는 변화, 예를 들어 변경이다. 일부 실시 양태에서, 키누레닌 경로의 대사산물은 L-트립토판, n-포르밀키누레닌, D 및/또는 L-키누레닌, 키누레인산, 퀸데르산, 키누라민, 3-하이드록시-L-키누레닌, 3-하이드록시-D-키누레닌, 크산토마틴 (xanthommatin), 안트라닐산, 크산투렌산 (xanthurenic acid), 피콜린산 (picolinioc acid), 퀴놀린산 및/또는 시나바린산 (cinnabarinic acid)이다.
일부 실시 양태에서, 대사 산물 또는 인자 또는 이펙터, 예를 들어 키누레닌 경로에 관여하는 효소, 수용체 또는 신호분자의 수준, 가용성, 농도, 효과, 활성, 대사 합성 및/또는 분해를 검출 또는 결정하기 위한 방법 또는 분석법은 생물학적 샘플에서 대사산물, 단백질, 핵산 또는 다른 생체 분자의 수준을 검출하기 위한 당 업계에 공지된 임의의 방법을 포함한다. 예를 들어, 검출하는 방법은 면역 조직 화학 법, ELISA, EIA, 면역 형광법, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사 PCR (RT-PCR), 현장 PCR, 정량적 PCR, 유동 세포 계측법, 형광 활성 세포 분류 (FACS) (GC/MS), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피- 이중 질량 분석 (LC-MS/MS), 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화-탠덤 질량 분석 (LC-ESI-MS), 서던 블랏, 노던 블롯, 서던 블롯, 생체 내 이미징, 마이크로어레이, 전사체 시퀀싱, 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 고 처리량 방법을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 대사산물 수준을 결정할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료로부터의 TRP, KYN 및/또는 KYN 유도체의 수준은 바이오센서, 효소 분석법, 바이오칩, 질량 분광계와 같은 분석 장치, NMR-분석기, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 액체 크로마토 그래피-이중 질량 분석 (LC-MS/MS), 액체 크로마토 그래피-전기 분무 이온화-탠덤 질량 분석 (LC-ESI-MS), 형광 검출 및/또는 분광 광도계 방법, Ehrlich 시약 (빙초산 중 2 % p-디메틸 아미노 벤즈알데히드)과 반응 한 후 분광 흡광도를 측정하는 것을 포함하여 분광 광도계 법 및/또는 분광 광도계 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대사 산물은 HPLC를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 트립토판 및 키누레닌 수준은 아미노산 표준 및/또는 아미노산 표준+키누레닌과 비교함으로써 HPLC에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플, 혈장 샘플, 조직 샘플 및/또는 종양 샘플, 예를 들어 종양 생검이다. 일부 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플 또는 이로부터 유도된 처리 샘플을 포함하는 종양 샘플과 같은 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 분리된 세포 및/또는 종양 샘검의 조직 절편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 평가는 생체 내, 생체 외 또는 시험 관내에서 이루어질 수 있으며, 특정 매개 변수는 생물학적 시료 또는 생체 내 이미징을 통해 결정될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포 및 트립토판 수준의 세포에 의한 트립토판 섭취는 트립토판-감지 형광 지시 단백질(FLIP)을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시 양태에서, FLIP는 대장균으로부터 유래된 트립토판 오페론 억제제에 기초한 트립토판 감지 분자를 포함하고, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 형광 단 쌍을 포함한다. FLIP에 대한 트립토판의 결합은 형태 및 FRET 비의 변화를 초래하여 (참조, 예를 들어, Kaper et al. (2007) PLoS Biol 5(10): e257), 세포내 트립토판 수준의 검출을 가능하게 한다.
일 측면에서, 발현 수준을 검출하는 것은 시험 관내 분석을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 시험 관내 검정법은 면역 분석법, 앱 타머-기재 검정법, 조직학 또는 세포학 검정법 또는 mRNA 발현량 검정법이다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 인자, 이펙터, 효소 및/또는 표면 마커 각각 하나 이상에 대한 매개 변수 또는 매개 변수는 효소 연동 면역 측정법 (ELISA), 면역 블로팅 (immunoblotting), 면역 침강법, 방사 면역 측정법 (RIA) 유동 세포 계측법, 표면 플라스몬 공명 (SPR), 화학 발광 분석법, 측방 유동 면역 분석법, 저해 분석법 또는 효능 분석법에 의해 검출된다.
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 인자, 이펙터, 효소 및/또는 표면 마커 중 적어도 하나에 대한 매개 변수는 적어도 하나의 바이오 마커에 특이적으로 결합하는 결합 시약을 사용하여 결정된다. 일 경우에는, 결합 시약은 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 앱 타머 또는 핵산 프로브이다.
일부 실시 양태에서, 효소적 검정은 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청 샘플, 혀장 샘플, 조직 샘플 또는 종양 샘플에서 IDO 1의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. IDO 1에 대한 예시적인 효소 검정에는2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 산화 방지제 분석, 메나디엔 (2-메틸-1,4-나프토퀴논) 산화 환원 분석 또는 헴 기반 산화 환원 분석이 포함된다.
일부 실시 양태에서, 둘 이상의 인자 또는 이펙터, 예를 들어 효소 및/또는 대사 산물의 수준이 결정되고, 상대 수준이 비교된다. 일부 실시 양태에서, 측정된 효소, 인자 및/또는 대사 산물의 수준은 대조군 샘플 또는 비처리 샘플로부터의 수준과 비교된다. 일부 실시 양태에서, 효소, 인자 및/또는 대사 산물의 결정된 수준은 동일한 대상이지만 다른 시점에서의 시료로부터의 수준과 비교된다. 키누레닌 경로의 개별 효소 또는 대사 산물의 정량화에서 얻어진 값은 예를 들어 결정 농도에 대한 산술적 또는 논리적 연산을 형성하거나 다중 매개 변수 분석을 사용하여 질병 평가 목적으로 결합될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 평가된 매개변수는 혈장 키누레닌/트립토판 비율이다.
일부 실시 양태에서, 평가 매개 변수는 키누레닌 경로 대사 산물, 예를 들어 트립토판 또는 키누레닌의 수준, 또는 키누레닌 경로에 관여하는 인자 또는 이펙터, 예를 들어 효소, 수용체 또는 신호 분자의 상이한 조건에서 및/또는 기준점과 비교하여 평가의 다른 시점에 대한 증가 또는 감소와 같은 변화 및/또는 변경이다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 평가된 매개 변수는 트립토판 수준, 키누레닌 수준 및/또는 IDO 1, IDO 2 및/또는 TDO의 발현 수준의 변화이다. 일부 실시 양태에서, 증가 또는 감소의 배 변화가 결정된다. 일부 실시 양태에서, 키누레닌 경로의 인자 또는 이펙터, 예를 들어 효소 또는 대사 물질의 변화, 예를 들어, 증가 또는 감소는 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배 이상 또는 그 이상이거나, 또는 약 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배 이상 또는 그 이상이다. 일부 실시 양태에서, 기술된 매개 변수, 예를 들어 IDO 1, IDO 2 및/또는 TDO의 발현 수준 또는 트립토판에 관련된 다른 바이오마커는 독성 결과 또는 처리 결과와 관련된 공학 전에, 동안 또는 후에 요법에 사용된 T 세포의 활동, 표현형, 증식 및/또는 기능을 평가 또는 특성화하기 위해, 치료를 위해 환자를 확인하거나 선택하기 위해, 및/또는 투여 또는 다른 치료법을 결정하기 위해 다른 매개 변수 또는 바이오 마커 사이에서 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 평가된 매개 변수는 종양 미세 환경(TME)의 암, 종양 또는 세포에서의 아미노산 수용체, 예를 들어 트립토판 수용체의 발현 및/또는 활성을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 아미노산 수송체 또는 이의 사슬의 발현 및/또는 활성, 예를 들어 L-형 아미노산 수송체 1(LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), CD98 중쇄 (4F2hc, CD98hc, SLC3A2) 및/또는 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)이 평가된다. 일부 실시 양태에서, 개체로부터 수득한 생물학적 샘플 중 종양 세포 또는 암세포는 높은 수준의 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4를 발현 시키거나 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 양성이다. 일부 실시 양태에서, 간질 세포 또는 골수 세포와 같은 종양 미세환경의 다른 세포, 예를 들어 방관자 세포는 또한 높은 수준의 LAT 1, LAT 2, CD98hc 및/또는 PAT2를 발현한다. 일부 실시 양태에서, 골수 간질 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포는 높은 수준의 LAT 1, LAT 2, CD98hc 및/또는 PAT4를 발현할 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 매개 면역 억제 신호 전달에 관여, 트립토판의 고갈 또는 불추분에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 IDO 1 매개 대사, 예를 들어 트립토판의 불충분 또는 키누레인 또는 다른 트립토판 대사ㅊ산물의 축적에 의해 양성적으로 또는 음성적으로 조절되는 분자를 포함하여 키누레닌 매개 면역 억제를 감지하거나 이에 반응하는 것과 관련된 분자(예를 들어, 단백질)의 발현이 변형된 재조합 수용체-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포)와 같이, 본원에 기재된 방법, 세포, 조성물 및/또는 키트로 치료하기 위한 개체는, 그러한 매개 변수에 기초하여 식별되거나 선택될 수 있다. 일부 실시 양태에서, LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 높은 수준을 발현하는 종양 세포 또는 암세포 또는 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 양성인 개체는 트립토판 섭취, 수송 및/또는 대사에 관여하는 분자(예를 들어, 단백질), 예를 들어, LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4를 재조합적으로 발현하도록 변형된 재조합 수용체-발현 세포를 투여할 수 있다.
2. T 세포 노출, 지속성 및 증식
일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과의 치료 및/또는 치료의 결과의 평가에 대해 평가할 수 있는 매개변수를 포함하는 치료 또는 치료결과와 관련된 매개변수는, 예를 들어, T 세포 기반 치료를 위해 투여된 T 세포의 노출, 지속성 및 증식의 평가이거나, 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포의 증가된 노출, 또는 연장된 팽창 및/또는 지속성, 및/또는 세포 표현형 또는 세포의 기능적 활성의 변화, 예를 들어 면역 치료를 위해 투여된 세포, T 세포의 요법은, 본원에서 제공된 방법에서, 시험 관내 또는 생체 외에서 T 세포의 특성을 평가함으로써 측정 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 그러한 분석법은 본원에서 제공된 병용 요법의 하나 이상의 단계를 투여하기 전 또는 후에, 면역 요법에 사용되는 T 세포의 기능을 결정하거나 확인되는데 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 시간이 지남에 따라 이의 확장 및/또는 지속성을 촉진하는 것, 예를 들어 종양 미세 환경 (TME)에서 면역 억제 효과 또는 상태를 극복하는 것과 같이, T 세포에 기초한 치료 위해 투여된 T 세포에 대한 개체의 노출을 촉진 시키도록 설계된다.
일부 실시 양태에서, T 세포 치료는 T 세포 치료가이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 부재 하에 개체에게 투여되는 방법과 비교하여 개체에게 증가된 또는 연장된 증식(체적증대) 및/또는 지속성을 나타낸다.
일부 실시 양태에서, 제공된 방법은 환자의 투여되는 세포에 대한 노출을 증가시키고 (예를 들어, 증가된 세포 수 또는 시간 경과에 따른 지속 시간) 면역 요법, 예를 들어, T 세포 치료의 활성 및 치료 효과를 개선시킨다. 일 측면에서, 상기 방법은 재조합 수용체, 예를 들어, CAR-발현 세포를 발현하는 세포에 대한 보다 큰 노출 및/또는 더 긴 노출이 다른 방법과 비교하여 치료 결과를 개선한다는 점에서 유리하다. 이러한 결과에는 심각한 종양 부담이 있는 환자에게도 환자 생존 및 완화가 포함될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재한의 T 세포 단독 투여와 비교할 때, 세포, 예를 들어 T 세포 치료를 위해 투여 되는 T 세포에 대한 최대, 총 및/또는 지속 시간을 증가 시킬 수 있다. 일 측면에서, 높은 질병 부담( 및 따라서 더 많은 양의 항원)과 관련하여 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 세포의 팽창 및/또는 지속을 방지할 수 있는 면역 억제, 아네르기 및/또는 고갈을 초래하는 것과 같은 맥락에서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에 T 세포 단독 투여와 비교하여 활동을 강화한다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 높은 질졉ㅇ 부담의 맥락에서, 투여된 세포의 고갈을 감소시켜, 더 높은 초기 투여량이 투여되는 것과 같은 다른 방법과 비교하여 임상 활성을 증가시킨다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 전, 투여 중 및/또는 투여 후에, T 세포의 투여 후 개체에서 재조합 수용체(예를 들어, T-세포에 기초한 치료를 위해 투여된 CAR- 발현 세포)를 발현하는 세포의 존재 및/또는 양은 검출된다. 일부 실시 양태에서, 정량적 PCR(qPCR)은 개체의 혈액 또는 혈청 또는 장기 또는 조직 샘플(예를 들어, 질병 부위, 예를 들어, 종양 샘플)에서 재조합 수용체(예를 들어, T-세포에 기초한 치료를 위해 투여된 CAR- 발현 세포)를 발현하는 세포의 양을 평가하는데 사용된다. 일 측면에서, 지속성은 수용체를 코딩하는 DNA 또는 플라스미드의 복제물로서 또는 수용체 발현, 예를 들어 CAR-발현의 수로서, 샘플의, 예를 들어 혈액 또는 혈처의 마이크로 리터당 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs) 또는 백혈구의 총 수, 또는 샘플의 마이크로 리터 당 T 세포수로 정량화된다.
일부 실시 양태에서, 세포는 T 세포, 예를 들어, CAR-발현 T 세포의 투여 후 적어도 4, 14, 15, 27 또는 28일에 개체에서 검출된다. 일 측면에서, 세포는 T세포, 예를 들어 CAR-발현 T 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 후 적어도 또는 2, 4, 또는 6주, 또는 3,6, 또는 12, 18 또는 24, 또는 30 또는 36개월, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상 후에 검출된다.
일부 실시 양태에서, CAR-발현 T 세포 및/또는 트립토판 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 같은 T 세포의 투여에 뒤 따르는 상기 방법에 의한 개체에서의 수용체 발현 세포(예를 들어, CAR-발현 세포)의 지속성은 키누레닌 조절제가 없는 면역 요법, 예를 들어, T 세포의 투여, 예를 들어, CAR-발현 T 세포의 단독 투여와 같은 다른 방법에 의해 달성 될 수 있는 것보다 더 크다.
상기 확장 및/또는 지속성을 나타내는 노출, 예를 들어, 세포의 수, 예를 들어, T 세포 치료의 투여를 위한 T 세포는 개체가 노출된 세포의 최대 수, 검출 가능한 세포 또는 특정 수 또는 백분율 이상의 세포의 지속 기간, 시간 경과에 따른 세포 수에 대한 곡선하 면적 및/또는 이들의 지표 및 이들의 지표로 기재될 수 있다. 이러한 결과는 특정한 샘플에서 핵산 또는 DNA의 총량과 비교하여 재조합 수용체를 코딩하는 핵산의 카피 수를 검출하기위한 qPCR 및/또는 일반적으로 수용체에 특이적인 항체를 사용하여 수용체를 발현하는 세포를 검출하는 유동 세포 계측법과 같은 공지된 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 또한 세포-기반 분석법은 질병 또는 상태의 세포에 대해 반응 할 수 있고/있거나 중화 및/또는 반응을 유도하거나 수용체에 인식되는 항원을 발현할 수 있는 세포와 같은 기능성 세포의 수 또는 백분율을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, T 세포 치료에서 투여되는 T 세포의 존재 및/또는 양의 평가는 종양 부위 또는 그 부근, 예를 들어 종양 미세 환경(TME)의 T 세포의 존재 및/또는 양의 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 평가는 종양, 예를 들어 고형 종양을 침윤하는 T 세포를 투여하는 투여 양 및/또는 존재를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 투여된 T 세포의 존재 및/또는 양은 개체의 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변, 및 땀, 조직 및 체액 또는 그로부터 유래된 가공 샘플을 포함하는 종양 샘플로부터 평가된다. 일부 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 종양 생검으로부터 분리된 세포 및/또는 조직 절편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료에서 투여된 T 세포의 존재 및/또는 양의 평가는 종양 생검에서 분리된 세포 및/또는 조직 절편의 샘플에서 종양에 침투하는 투여된 T 세포의 존재 및 또는 양의 평가를 포함한다.
일 측면에서, 세포에 주제의 증가한 노출은 증가한 확장을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용체 발현 세포, 예를 들면 CAR-발현 세포는 T 세포, 예를 들어, CAR-바현 세포 투여 후 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 투여 후 개체를 확장시킨다. 일 측면에서, 상기 방법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제를 투여하지 않고 T- 세포, 예를 들어, CAR-발현 T 세포의 투여를 포함하는 것과 같은 다른 방법과 비교하여 세포의 더 큰 팽창을 초래한다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 예를 들어 유동 세포 계측법에 의해 측정되는 바와 같이 투여된 세포의 높은 생체 내 증식을 초래한다. 일 측면에서, 세포의 높은 피크 비율이 검출된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 개체 또는 이의 백혈구 분호기, 예를 들어 PBMC 분획 또는 T 세포의 분획의 혈액 또는 질환 부위에서 T 세포, 예를 들어, CAR-발현 T 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 후 적어도 약 10%, 적어도, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%이 재조합 수용체를 발현한다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 최대 농도에서, 혈액 또는 혈청 또는 다른 체액 또는 개체의 기관 또는 조직에서, 적어도 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10,000 또는 15,000 카피 또는 수용체를 코딩하는 핵산 또는 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9 수용체-발현, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 총 단핵구 수, 총 T 세포 수 또는 총 마이크로 리터 수를 초래한다. 일부 실시 양태에서, 수용체를 발현하는 세포는 혈액 내에서 T 세포를 따르는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48 또는 52 주 동안과 같은 수준, 예를 들어 CAR- 발현 T 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하거나, 1, 2, 3, 4, 또는 5 년 이상 투여 및/또는 개체의 혈액에서 총 PBMC의 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 % 이상으로 감지된다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 재조합 수용체을, 예를 들어, CAR, DNA의 마이크로 그램 당, 예를 들어, 개체의 혈청, 혈장, 혈액 또는 조직, 예를 들어 종양 샘플, 코딩하는 핵산의 카피의 2배 이상, 4배 이상, 10배 이상, 또는 20배 이상 증가를 초래한다.
일 측면에서, 수용체를 발현하는 세포는 T 세포, 예를 들어, CAR-발현 T 세포, 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 예를 들어, IDO1 억제제의 투여 후 적어도 약 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 또는 이상의 주 동안, 예를 들어 CAR-발현 T 세포의 투여 후 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 투여 후 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60일 또는 이상에서 qPCR 또는 유동 세포 계측법 기반 검출 방법과 같은 특정한 방법으로 개체의 혈청, 혈장 또는 조직, 예를 들어 종양 샘플에서 검출 가능하다.
일 측면에서, 적어도 약 1 x 102, 적어도 약 1 x 103, 적어도 약 1 x 104, 적어도 약 1 x 105, 또는 적어도 약 1 x 106 또는 적어도 약 5 x 106 또는 적어도 약 1 x 107 또는 적어도 약 5 x 107 또는 적어도 약 1 x 108 재조합 수용체 발현, 예를 들어 CAR-발현 세포, 및/또는 적어도 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500, 또는 1000 재조합-발현 세포 당 마이크로 리터 예를 들어, 적어도 10 마다 마이크로 리터는 혈액, 예를 들어 말초혈액 또는 질환 부위, 예를 들어 종양에서와 같은 개체 또는 체액, 혈장, 혈청 조직 또는 그 구획에서 존재하거나 검출 가능 하다. 일부 실시 양태에서, 그러한 수 또는 농도의 세포는 CAR-발현 T 세포의 투여 후 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 투여 후 개체에서 적어도 약 20일, 적어도 약 40일, 또는 적어도 약 60일, 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월 동안 또는 적어도 2년 또는 3년 검출 가능하다. 그러한 세포 수는 유동 세포 계측법 또는 정략적 PCR에 기초한 방법에 의해 검출되고, 공지된 방법, 예를 들어, 참조 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177), Park et al, Molecular Therapy 15(4):825-833 (2007), Savoldo et al., JCI 121(5):1822-1826 (2011), Davila et al., (2013) PLoS ONE 8(4):e61338, Davila et al., Oncoimmunology 1(9):1577-1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117:72-82, Jensen et al., Biol Blood Marrow Transplant 2010 September; 16(9): 1245-1256, Brentjens et al., Blood 2011 118(18):4817-4828을 사용하여 총 세포 수에 외삽 (extrapolation)될 수 있다.
일 측면에서, 면역 조직 화학법, PCR 및/또는 유동 세포 계측법에 의해 측정된 바와 같은 말초 혈액 또는 골수 또는 다른 구획에서 100개 세포 당 재조합 수용체, 예를 들어 벡터 카피 수를 코딩하는 핵산의 카피 수는 예를 들어 CAR- 발현 T 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 투여 후 적어도 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주 또는 적어도 약 6 주, 또는 적어도 약 2 주, 약 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 11 일 또는 12 개월 또는 적어도 2 또는 3년에 적어도 0.01, 적어도 0.1, 적어도 1, 또는 적어도 10이다. 일부 실시 양태에서, 수용체를 발현하는 벡터의 카피 수, 예를 들어 CAR, 게놈 DNA의 마이크로그램 당은 예를 들어 CAR-발현 T 세포, 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어, IDO1 억제제 투여 후 약 1주, 약 2주, 약 3주 적어도 약 4주 또는 상기 투여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월 또는 적어도 2 또는 3년에 적어도 100, 적어도 1000, 적어도 5000, 또는 적어도 10,000, 또는 적어도 15,000 또는 적어도 20000이다.
일 측면에서, 상기 수용체, 예를 들어 세포에 의해 발현되는 CAR는 예를 들어 T-세포, 예컨대 CAR-발현 T 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 투여를 개시 한 후에 세포의 투여 후에 적어도 약 3 개월, 적어도 약 6 개월, 적어도 약 12 개월, 적어도 약 1 년, 적어도 약 2 년, 적어도 약 3 년, 또는 3 년 이상에서 개체의 혈장, 혈청, 혈액 및/또는 이의 질병 부위, 예를 들어 종양 부위에서, 정량적 PCR (qPCR) 또는 유동 세포 계측법으로 검출 가능하다.
일 측면에서, T 세포, 예를 들어, CAR-발현 T 세포의 투여 후 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제 투여 후에 혈장, 혈청, 조직, 기관 및/또는 질병 부위, 예를 들어 종양 부위에서의 수용체 (예를 들어 CAR-)-발현 세포의 농도에 대한 곡선 하의 면적(AUC)은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제를 투여하지 않고, 대상에게 T-세포, 예를 들어, CAR-발현 T 세포를 투여하는 대체 투여 치료를 통해 달성되는 것보다 크다.
일 측면에서, 상기 방법은 예를 들어 유동 세포 계측법에 의해 측정되는 바와 같이 투여된 세포의 높은 생체 내 증식을 초래한다. 일 측면에서, 세포의 높은 피크 비율이 검출된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 혈장, 혈청, 조직 또는 질병 부위에서 T- 세포, 예를 들어, CAR-발현 T 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어, IDO1 억제제와 같은 피크 또는 최대 수준에서 또는 백혈구 분획, 예를 들어, PBMC 분획 또는 T 세포 분획에서, 세포의 적어도 약 10 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 80 %, 또는 적어도 약 90 %가 재조합 수용체, 예를 들어 CAR를 발현한다.
3. T 세포 기능적 활동
일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과의 치료 및/또는 치료 결과의 평가에 대해 평가할 수 있는 매개 변수를 포함하는 치료 또는 치료 결과와 관련된 매개 변수는, T 세포의 화성, 표현형, 증식 또는 기능 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포의 활성, 표현형, 증식 및/또는 기능, 예를 들어 T 세포 치료를 위해 투여된 T 세포를 평가하기 위한 당 업계의 공지된 임의의 분석법이 사용될 수 있다. 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여 전 및/또는 투여 후에, 일부 실시 양태에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 예를 들어 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정된다. 평가할 매개변수는 조작된 또는 천연의 T 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이적 결합, 예를 들어, 이미징 또는 생체 내, 예를 들어 ELISA 또는 유동 세포 계측법에 의한 생체 내에서의 특이적 결합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어 Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al., J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)에 기재된 세포 독성 검정과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포의 생물학적 활성은 CD107a, IFNγ, IL-2, GM-CSF 및 TNFα와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석하고/하거나 세포 용해 활성을 평가함으로써 측정된다.
일부 실시 양태에서, T 세포, 예를 들어 T 세포 치료를 위해 투여된 T 세포의 활성, 표현형, 증식 및/또는 기능에 대한 분석은 이에 제한되지 않으나 ELISPOT, ELISA, 세포 증식, 세포 독성 림프구 (CTL) 분석, T 세포 에피토프에 결합, 항원 또는 리간드, 또는 세포 내 사이토카인 염색, 증식 분석, 림포카인 분비 측정, 직접 세포 독성 분석 및 한계 희석 분석법을 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포의 증식 반응이 카복시플루오레신 다이아세테이트 석신이미딜 에스터(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE), 셀트레이스 바이올렛 (CellTrace Violetace Violet) 또는 멤브레인 염색PKH26과 같은 염색을 이용하여, 염색 희석 어세이 또는 3H-티미딘, BrdU (5-브로모-2'-데옥시우리딘) 또는 2'-데옥시-5-에틴닐 우리딘 (EdU)을 이의 DNA에 혼입시켜 측정될 수 있다.
일부 실시 양태에서, T 세포 치료, 예를 들어 T 세포 치료를 위해 투여된 T 세포의 활성, 표현형, 증식 및/또는 기능을 평가하는 것은 예를 들어 혈장, 혈청, 혈액 및/또는 조직 샘플, 예를 들어 종양 샘플과 같은 개체의 생물학적 샘플에서 T 세포로부터의 사이토킨 생성 측정 및/또는 사이토킨 생성 측정을 포함한다. 일 경우에, 측정된 사이토카인은 이에 제한되지 않으나 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-감마 (IFNg), 인터루킨-4 (IL-4), TNF-알파 (TNFα), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-10 (IL-10), 인터루킨-12 (IL-12), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), CD107a, 및/또는 TGF-베타 (TGFβ)를 포함한다. 사이토카인을 측정하기 위한 분석은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이에 제한되지 않으나, 관련 사이토카인에 반응하는 세포를 시험 샘플의 존재 하에서 반응성 (예 : 증식)에 대해 시험하는 ELISA, 세포 내 사이토카인 염색, 세포 계측 비드 어레이, RT-PCR, ELISPOT, 유동 세포 계측법 및 생체 검정을 포함한다.
일부 실시 양태에서, T 세포 치료, 예를 들어 T 세포 치료를 위해 투여된 T 세포의 활성, 표현형, 증식 및/또는 기능을 평가하는 단계는 세포 표현형, 예를 들어 특정 세포 표면 마커의 발현을 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료, 예를 들어 T 세포 치료를 위해 투여된 T 세포는 T 세포 활성화 마커 및/또는 T 세포 분화 마커에 대해 평가 된다. 일부 실시 양태에서, 세포 표현형은 투여 전에 평가된다. 일부 실시 양태에서, 세포 표현형은 투여 후에 평가된다. 평가를 위한 T 세포 활성화 마커, T 세포 고갈 마커 및/또는 T 세포 분화 마커는 T 세포의 특정 서브 세트, 예를 들어 CD25, CD38, 인간 백혈구 항원-DR (human leukocyte antigen-DR, HLA-DR), CD69, CD44, CD137, KLRG1, CD62Llow, CCR7low, CD71, CD2, CD54, CD58, CD244, CD160, 프로그램화된 세포 사멸 단백질 (programmed cell death protein 1, PD-1), 림프구 활성화 유전자 3 단백질 (lymphocyte activation gene 3 protein, LAG-3), T-세포 면역글로블린 도메인 및 뮤신 도메인 단백질 3 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain protein 3, TIM-3), 세포독성 T 림프구 항원-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4), 밴드 T 림프구 어테뉴에이터(band T lymphocyte attenuator, BTLA) 및/또는 T-세포 면역글로블린 및 면역수용체 티로신-기반 억제제 모티프 도메인(T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain, TIGIT)와 같은 당 업계에 공지된 임의의 마커를 포함한다 (참조, Liu et al., Cell Death and Disease (2015) 6, e1792). 일부 실시 양태에서, 평가된 세포 표면 마커는 CD 25, PD-1 및/또는 TIM-3이다. 일부 실시 양태에서, 평가된 세포 표면 마커는 CD25이다.
일 측면에서, 발현 수준을 검출하는 것은 시험 관내 분석을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 시험 관내 검정법은 면역 분석법, 앱 타머-기재 검정법, 조직학 또는 세포학 검정법 또는 mRNA 발현량 검정법이다. 일부 실시 양태에서 하나 이상의 인자, 이펙터, 효소 및/또는 표면 마커의 각각 하나 이상에 대한 매개 변수 또는 매개 변수는 효소 연동 면역 측정법 (ELISA), 면역 블로 팅 (immunoblotting), 면역 침강 법, 방사 면역 측정법 (RIA) 유동 세포 계측법, 표면 플라스 몬 공명 (SPR), 화학 발광 분석법, 측방 유동 면역 분석법, 저해 분석법 또는 효능 분석법을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 사이토카인 및/또는 표면 마커의 검출은 적어도 하나의 바이오 마커에 특이적으로 결합하는 결합 시약을 사용하여 결정된다. 일 경우에는, 결합 시약은 항체 또는 이의 항원 결합의 단편, 앱 타머 또는 핵산 프로브이다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 기아에 대한 감지 또는 반응과 관련하여 IDO 매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 단백질의 발현 변형을 포함하도록 조작된 조합 요법 및/또는 세포에서의 조작된 세포의 활성, 표현형, 증식 및/또는 기능 또는 트립토판 부족 또는 키누레닌 또는 다른 트립토판 대사산물의 축적에 반응하여 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제를 감지하거나 반응하는 것과 관련이 있고 및/또는 트립토판 섭취 또는 세포 내로의 수송은 유사한 분석법 예를 들어, 전술한 기능적 분석법 및/또는 시험 관내 분석법을 사용하여 평가할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 조작된 세포의 활성, 표현형, 증식 및/또는 기능은 트립토판 포함 배지에서 보충 트립토판을 첨가하거나 첨가하지 않거나, 또는 트립토판이 없는 배지에서 보충 트립토판을 첨가하거나 첨가하지 않은 후 배양한 후 시험할 수 있다.
일부 실시 양태에서, T 세포의 활성, 표현형 증식 또는 기증 중 하나 이상의 평가는 아미노산 결핍, 예를 들어 트립토판 결핍 또는 트립토판 결핍에 대한 반응의 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포의 활성, 표현형, 증식 또는 기능의 평가는 트립토판 결핍 및/또는 트립토판 가에 대한 반응으로, 소진 평가, 이펙터 T 세포의 아네르기 또는 세포 사멸, 항 종양 면역 반응 억제 또는 종양 학원에 대한 내성, 기능적 활성 및/또는 생존을 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포의 활성, 표현형, 증식 또는 기능의 평가는 고갈로부터 회복하고 고갈의 효과, 예를 들어 성장 및/또는 기능적 활동의 지연 또는 정지를 역전시키는 T 세포의 능력에 영향을 줄 수 있는 트립토판 고갈 상태와 같은 연장된(장시간의) 트립토판 고갈 상태 하에서의 T 세포의 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에서, T 세포의 하나 이상의 활성, 표현형, 증식 또는 기능의 평가는 트립토판 고갈, 예를 들어 연장된(장시간의) 트립토판 고갈로부터의 회복 또는 역전의 평가를 포함한다. 일부 실시 양태에 트립토판 기아로부터의 회복은 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 T 세포 기능 분석에 의해 평가된 바와 같이, 기준 또는 정상 T 세포 활성의 회복을 포함한다.
4. 질병 부담
일부 실시 양태에서, 스크리닝 단계 및/또는 결과의 치료 및/또는 치료 결과의 평가에 대해 평가할 수 있는 매개 변수를 포함하는 치료 또는 치료 결과와 관련된 매개 변수는 종양 또는 질병 부담이 포함된다. T 세포 치료 (예를 들어, CAR- 발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 같은 면역 치료의 투여는 개체의 질병이나 상태의 팽창이나 부담을 줄이거나 막을 수 있다. 예를 들어, 질환 또는 증상이 종양인 경우, 상기 방법 일반적으로 종양 크기, 벌크, 전이, 골수 또는 분자적으로 검출 가능한 암에서의 돌풍의 백분율을 감소시키고 및/또는 예후 또는 생존 또는 종양 부담과 관련된 다른 증상을 개선시킨다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 세포 치료 (예 : CAR- 발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료의 투여 후 부담 및/또는 재발의 감소와 관련하여 시간이 주어진다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 T 세포 치료(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-결합 요업과 같은 면역 치료의 투여 이후에 개체에게 투여되며, 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료의 투여로 대상의 종양 부담이 감소되었을 가능성이 있다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여에 의해 환자의 종양 부담이 감소될 가능성이 있는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 투여 한 후 개체에게 투여한다. 일부 실시 양태에서, T 세포 치료나 T 세포 결합 요법 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 같은 면역 치료의 투여 전에 종양 부담이 모든 대상에서 실제로 감소되지만, 예를 들어 병용 요법으로 치료된 환자의 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 또는 그 이상의 환자는 감소된 종양 부담을 나타내는 것과 같이 그러한 병용 요법으로 치료된 대상의 대다수가 종양 부담을 감소시키는 임상 데이터에 기초하여 치료된 피험자에서 종양 부담이 평균적으로 감소될 필요는 없다.
일부 실시 양태에서, 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료에 의해 질병 부담이 감소되거나 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료에 의해 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제에 의해 감소된 시점에서 개체에게 투여됨으로써, 질병 또는 증상 또는 결과를 추가로 감소 및/또는 제거하거나 또는 확장 또는 진행을 방지하고, 투여된 T 세포의 생존, 증식 및/또는 팽창을 향상 시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 투여에 의해 질병 부담이 감소된 이후 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여에 의해 감소될 가능성이 있는 시점에서, IDO1 억제제, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제, T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료를 개체에게 투여함으로써, 투여된 T 세포의 생존, 증식 및/또는 팽창을 증진시킴으로써 질환 또는 증상 또는 결과를 추가로 감소 및/또는 제거하거나 또는 이의 확대 또는 진행을 방지한다. T 세포 치료(예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 같은 면역 치료의 투여시에 감소된 질병 부담의 상황은, 예를 들어 IDO 1 억제제는 투여된 세포, 예를 들어 CAR-발현 T 세포의 고갈 가능성을 감소시켜 활성을 개선시킨다.
질병 부담은 대상 또는 예를 들어 전이를 나타내는 종양 또는 다른 위치의 장기 또는 조직과 같은 대상의 기관, 조직 또는 체액에서 질병의 세포의 총 수를 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포는 특정 혈액 종양과 관련하여 혈액, 림프 또는 골수에서 검출 및/또는 정량화 될 수 있다. 질병 부담은 일부 실시 양태에서 골수에 존재하는 종양의 지량, 전이의 수 또는 범위 및/또는 돌풍 세포의 백분율을 포함할 수 있다.
질병, 상태 및 질병 중 고형 종양, 혈액학 악성 종양 및 흑색 종을 비롯한 종양 및 국소 종양 및 전이성 종양, 바이러스 또는 다른 병원균, 예를 들어, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV 및 기생충 질환, 및 자가 면역 및 염증 질환에 의한 감염과 같은 감염성 질환이 포함된다. 일부 실시 양태에서, 질환, 장애 또는 상태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물 또는 기타 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시 양태에서, 개체는 골수종, 림프종 또는 백혈병을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 개체는 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 미만성 대형 B-세포 림프종 (DLBCL), 또는 골수종, 예를 들어 다발성 골수종 (MM)을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 개체는 MM 또는 DBCBL를 갖는다. 이러한 질병은 이에 한정되지 않으나 백혈병, 림프종, 예를 들어, 급성 골수성 (또는 골수성) 백혈병 (AML), 급성 만성 골수성 (또는 골수성) 백혈병 (CML), 급성 림프성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 털 세포 백혈병 (HCL), 소규모 백혈병 (HL), 비 호지킨 림프종 (NHL), 역형성대세포 림프종 (ALCL), 여포성 림프종 (follicular lymphoma), 난치성 여포성 림프종 (diffractory follicular lymphoma), 난형성 림프종 (diffuseory follicular lymphoma), 난형성 림프종 대형 B 세포 림프종 (DLBCL) 및 다발성 골수종 (MM)이 포함된다.
일부 실시 양태에서, 개체는 고형 종양을 갖는다.
MM의 경우, 질병 부담의 범위를 평가하는 예시적인 매개 변수는 클론 성 형질 세포의 수 (예를 들어, 골수 생검에서> 10 % 또는 다른 조직으로부터의 생체 검사에서 임의의 양으로; 형질 세포종), 혈청이나 소변 중 단일 클론 단백질 (paraprotein)의 존재, 혈장 세포 질환 (예 : 고칼슘 혈증 (수정된 칼슘> 2.75 mmol / l)과 관련된 말단 기관 손상의 증거; 골수종에 기인한 신부전증; 빈혈 (헤모글로빈 <10 g / dl); 및/또는 골 병변 (용질 병변 또는 골절이 있는 골다공증))과 같은 매개 변수를 포함한다.
DLBCL의 경우, 질병 부담의 범위를 평가하는 예시적인 매개 변수는 세포 형태학 (예를 들어, 중심성 모세포, 면역 모세포 및 미분화 세포), 유전자 발현, miRNA 발현 및 단백질 발현 (예를 들어, BCL2, BCL6, MUM1, LMO2, MYC 및 p21의 발현)와 같은 매개 변수를 포함한다.
백혈병의 경우, 질병 부담의 정도는 혈액 또는 골수의 잔류 백혈병을 평가하여 결정할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 개체는 예를 들어 광학 현미경으로 검출된 바와 같이 골수에 5% 이상의 블라스트 (blasts)가 있으면 형태학적 질환을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 골수에 5% 미만의 블라스트 (blasts)가 존재하는 경우, 환자는 완전 또는 임상적 완화를 나타낸다.
일부 실시 양태에서, 백혈병의 경우, 환자는 완전한 관해를 나타낼 수 있찌만, 형태학적으로 검출할 수 없는(광학 현미경 검사 기술에 의한) 잔류 백혈병 세포가 적은 비율로 존재한다. 피험자가 골수에서 5% 미만의 블라스트 (blasts)를 보이고 분자적으로 검출 가능한 암을 나타내는 경우 피험자는 최소 잔류 병(MRD)을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 분자적으로 검출 가능한 암은 소수의 세포를 민감하게 검출할 수 있는 다양한 분자 기술 중 임의의 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 일 측면에서, 이러한 기술은 독특한 Ig/T-세포 수용체 유전자 재배열 또는 염색체 전위에 의해 생성된 융합된 전사물을 결정할 수 있는 PCR 분석을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 유동 세포 계측법은 백혈병 특이적인 면역 표현형에 기초하여 암세포를 동정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 암의 분자 검출은 100,000개의 정상 세포에서 1개의 백혈병 세포를 검출할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 개체는 100,000 세포 중 1개 이상의 백혈병 세포가 PCR 또는 유세포 분석에 의해 검출되면 분자적으로 검출 가능한 MRD를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 환자의 질병 부담은 분자적으로 검출 불가능 하거나 MRD-이며, 어떤 경우에는 백혈병 세포가 PCR 또는 유동 세포 계측 기술을 사용하여 대상에서 검출될 수 없다.
일부 실시 양태에서, T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 요법 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 방법 및/또는 투여는 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여 직전의 질병 부담과 비교하여 질병 부담을 줄인다. 일부 실시 양태에서, 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료의 투여는 질병 부담, 예를 들어 종양 부담을 줄인다. 일 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/.또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제는 질병 부담의 감소, 예를 들어 추가 감소를 초래한다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절젤, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 질병 부담, 예를 들어 종양 부담을 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료의 투여는 질병 부담의 감소, 예를 들어 추가 감소를 초래한다.
일 측면에서, 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 대사 조절제, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 질병 부담의 증가를 예방할 수 있으며, 이는 질병 부담의 변화가 없는 것으로 입증될 수 있다.
일 측면에서, 질병 또는 상태는 면역 요법, 예를 들어 T 세포의 투여 후에 지속 되고/되거나 면역 요법, T 세포 치료의 투여는 대상에서 질병이나 상태를 근절 시키는데 충분하지 않다.
일 측면에서, 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 면역 요법, 예를 들어 T 세포의 투여 직전 또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1억제제 직전의 질병 부담과 비교할 때 질병 부담을 줄인다. 일 측면에서, 재발의 맥락에서 예를 들면, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여는 면역 요법, 예를 들어 T 세포의 투여 후 질병 부담의 피크 수준과 비교하여 질병 부담을 감소시킨다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 개체가 면역 요법, 예를 들어 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여의 부재 하에 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료를 받는 것과 같은 대체 치료를 사용하는 비교 가능한 방법으로 관찰되는 감소와 비교할 때, 질환 또는 증상의 부담, 예를 들어 종양 세포의 수, 종양의 크기, 환자 생존 기간 또는 무사건 생존 기간을 더 크게 및/또는 더 긴 기간으로 감소시킨다. 일부 실시 양태에서, 질병 부담은 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료를 받지 않는 개체에게 각각의 약제를 단독으로 투여, 예를 들어 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여함으로써 초래 되는 감소; 또는 상기 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료를 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제를 투여 받지 않은 환자에게 투여하여 영향을 줄 수 있는 감소에 비해 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여의 병용 요법에 따라 더 큰 범위 또는 더 긴 기간으로 감소된다.
일부 실시 양태에서, 개체에서 질병 또는 상태의 부담이 검출, 평가 또는 측정된다. 질병 부담은 혈액 또는 혈청과 같은 개체 또는 개체의 기관, 조직 또는 체액에서 질병 또는 지환 관련 세포, 예를 들어 종양 세포의 총 수를 검출함으로ㅆ 일부 측면에서 검출 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 질병 부담, 예를 들어, 종양 부담은 고형 종양의 질량 및/또는 전이의 수 또는 정도를 측정함으로써 평가된다. 일 측면에서, 대상의 생존, 특정 기간 내의 생존율, 생존 범위, 사건이 없거나 증상이 없는 생존 기간 또는 무 재발 생존 기간이 평가된다. 일부 실시 양태에서, 질병 또는 상태의 임의의 증상이 평가된다. 일부 실시 양태에서, 질병 또는 상태 부담의 척도가 특정된다. 일부 실시 양태에서, 결정을 위한 예시적 매개 변수는 질환 또는 증상, 예를 들어 종양의 개선 또는 개선을 나타내는 특정 임상적 결과를 포함한다. 이러한 매개 변수는 완전 반응(CR), 부분 반응(PR) 또는 안전 병변(SD)( 예를 드어, 고체 종양에 대한 반응 평가 기준(RECIST) 지침 참조), 객관적 반응률(ORR), 무 진행 생존(PFS) 및 전체 생존(OS)를 포함하는 질병 통제 기간을 포함한다. 매개 변수에 대한 특정 임계 값을 설정하여 여기에 제공된 병용 치료 방법의 활동을 결정할 수 있다.
일 측면에서, 질병 부담은 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료의 투여 전에, 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료의 투여 후에, 그러나 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여 전에, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여 후에, 그러나 면역 요법, 예를 들어, T 세포 치료의 투여 전에, 및/또는 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 대사 조절제, 예를 들어 IDO 1 억제제의 투여 후에 측정되거나 감지된다. 병용 요법의 하나 이상의 단계의 다중 투여와 관련하여, 일 실시 양태에서 질병 부담은 투여의 임의의 단계, 투여 및/또는 사이클의 투여 전 또는 투여 후에, 또는 임의의 단계, 투여 및/또는 투여 사이클의 투여 사이의 시간에 측정 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 부담은 면역 치료, 예를 들어 T 세포의 투여 후 적어도 약 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 퍼센트 감소된다. 일 측면에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 투여는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 투여 직전과 비교하여, 또는 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료 직전과 전반적으로 비교하여, 종양 부담에서 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 퍼센트와 같이 질병 부담, 예를 들어 종양 부담에서 추가 감소를 초래한다.
일부 실시 양태에서 질병 부담, 종양 크기, 종양 체적, 종양 질량 및/또는 종양 하중 또는 벌크는 면역 치료의 투여 직전, 예를 들어 T 세포 치료 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 대사 조절제, 예를 들어 IDO1 억제제과 비교하여 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % 또는 그 이상 증가되어 면역 치료, 예를 들어 T 세포 치료 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 대사 조절제, 예를 들어 IDO1 억제제 후에 줄어든다.
일부 실시 양태에서, 방법에 의한 질병 부담의 감소는 조합 요법의 투여 후, 예를 들어 개시 후, 형태학적 완전 관해에서의 유도를 포함하며, 예를 들어 1개월, 2개월, 3개월 또는 이상에서 평가된다.
일 측면에서, 예를 들어 다중 파라 메트릭 유동 세포 계측법에 의해 측정된 최소 잔여 질환에 대한 분석은 음성이거나 최소한의 잔류 질환의 수준은 약 0.3 % 미만, 약 0.2 % 미만, 약 0.1 % 미만, 약 0.05 % 미만이다.
일부 실시 양태에서,개체의 사건 없는 생존율 또는 전체 생존율은 다른 방법과 비교하여 방법에 의해 개선된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 병용 요법의 방법을 따르는6 개월에서 상기 방법에 의해 치료된 대상자에 대한 사건없는 생존율 또는 확률은 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과 또는 약 95% 초과이다. 일 측면에서, 전체 생존율은 약 40 % 초과, 약 50 % 초과, 약 60 % 초과, 약 70 % 초과, 약 80 % 초과, 약 90 % 초과, 또는 약 95 % 초과이다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법으로 치료된 대상은 무 사건 생존, 무 재발 생존 또는 6 개월 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 생존을 보인다. 일부 실시 양태에서, 진행 시간은 예를 들어 약 6 개월 또는 약 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 6 년, 7 년, 8 년, 9 년 또는 10 년 이상의 진행 시간 같이 향상된다.
일부 실시 양태에서, 방법에 의한 치료 후, 재발 가능성은 다른 방법과 비교하여 감소된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 병용 요법의 방법을 따르는 6 개월 후의 재발 확률은 약 80 % 미만, 약 70 % 미만, 약 60 % 미만, 약 50 % 미만, 약 40 미만 % 미만, 약 30 % 미만, 약 20 % 미만 또는 약 10 % 미만이다.
일 측면에서, 질병 부담의 감소, 예를 들어 병용 요법의 투여 후에 종양 의 감량(debulking)은 투여 후 독성 또는 독성 결과를 감소시킨다. 종양 부담의 감소에 따른 독성 결과는 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
일 측면에서, 질병 부담의 경감, 예를 들어 본 방법으로 인한 종양의 개체에게 세포, 예를 들어 면역 요법, 예를 들어 T 세포 치료를 위해 투여되는 T 세포의 지속성을 향상시킨다. 예를 들어, 일 측면에서, T 세포 치료 (예를 들어, CAR-발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료 및 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제와 같은 면역 치료의 투여와 같은 병용 요법의 투여는 병용 요법으로 투여되는 세포가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하지 않고 T 세포 치료 (예를 들어, CAR- 발현 T 세포) 또는 T 세포-관련 치료와 같은 면역 치료를 투여하는 것과 같은 다른 치료법으로 치료된 세포보다 오래 지속되도록 질병 부담을 줄인다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO 1 억제제로 투여된 개체에서의 세포 용량의 증가된 또는 연장된 팽 및/또는 지속성은 대상의 종양 과년 결과의 이점과 관련된다. 일부 실시 양태에서, 종양 관련 결과는 종양 부하의 감소 또는 대상에서의 골수의 감소를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 종양 부하는 방법의 투여 후에 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 % 감소된다. 일부 실시 양태에서, 질병 부담, 종양 크기, 종양 체적, 종양 질량 및 종양 하중 또는 벌크가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어 IDO1 억제제의 투여를 포함하지 않는 방법으로 치료된 대상을 비교하여 적어도 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 그 이상으로 세포의 투약 후 감소된다.
Ⅳ. T 세포 치료 및 조작된 세포
일부 실시 양태에서, 제공된 병용 요법에 따라 사용하기 위한 T 세포 용법은 질병 또는 상태와 관련된 분자를 인식 및/또는 특이적으로 결합하도록 설계된 재조합 수용체를 발현하고 이러한 분자에 결합 시 상기 분자에 대한 면역 반응과 같은 반응을 일으키는 조작된 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 수용체는 키메라 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체 (CAR), 및 다른 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR)을 포함하는 다른 트랜스제닉 항원 수용체를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포는 조작된 수용체, 예를 들어 키메라 항우너 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)와 같은 조작된 항원 수용체를 포함하거나 조작하도록 조작된다. 또한 그러한 세포의 개체군, T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포와 같은 특정 유형의 세포가 농축되거나 선택된 것과 같은 그러한 세포를 포함하는 조성물 및/또는 이러한 세포가 농축된 조성물이 제공된다. 조성물 중에는 적용 세포 치료와 같은 투여용 제약 조성물 및 제형이 있다. 또한, 예를 들어, 환자에게 세포 및 조성물을 투여하기 위한 치료 방법이 제공된다.
따라서, 일부 실시 양태에서, 세포는 유전 공학을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고, 이에 의해 그러한 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현한다. 일부 실시 양태에서, 예를 들어 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정될 대, 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 결합시킴으로써 세포를 먼저 자극함으로써 유전자 전달을 수행하고, 이어서 활성화된 세포의 형질 도입 및 배양물의 임상적 적용을 위한 충분한 수의 확장을 포함한다.
설명된 바와 같은 일부 실시 양태에서, 세포는 트립토판 기아 결핍 또는 불충분에 대한 감지 또는 반응과 관련되고 및/또는 트립토판 부족 또는 키누레닌 또는 다른 트립토판 대사산물의 축적에 반응하여, 및/또는 트립토판 섭취 또는 세포 내로의 수송에 관여와 같이 세포에서의 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 단백질의 발현 변형을 포함하도록 추가로 조작된다. 일부 실시 양태에서, 변형은 트립토판 기아 결핍 또는 불충분에 대한 감지 또는 반응과 관련되고 및/또는 mTOR 또는 단백질 키나아제 C 세타 (PKC-Θ) 또는 이의 기능적 또는 촉매 적 활성 부분 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현와 같이 세포에서의 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자 또는 이의 기능적 또는 촉매적 활성 부분 또는 변체의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 변형은 트립토판 섭취 또는 세포로의 수송에 관여하는 분자 또는 그의 기능적 또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 수송체의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 변형은 트립토판 기아 결핍 또는 불충분에 대한 감지 또는 반응 또는 GCN2 키나아제, Blimp-1 (PRDM1), 아릴 탄화수소 수용체 (AHR) 또는 AHR 핵 수송체 (ARNT) 또는 그의 기능적 또는 촉매 적 활성 부분 또는 변이체의 발현 감소와 같은 조작된 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제를 감지하거나 반응하는 것과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 분자 또는 이의 기능적 또는 촉매적으로 활성인 부분 또는 변체의 발현 감소를 포함한다. 일 경우에는, 감소된 발현은 단백질의 유전자 발현 장애로 인한 것이거나 그 결과이다. 일 측면에서, 발현은 변형의 부재 하에 세포에서의 발현과 비교하여 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 % 감소된다.
A. 재조합 수용체
세포는 일반적으로 기능적 비-TCR 항원 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)와 같은 다른 항원-결합 수용체를 포함하는 항원 수용체와 같은 재조합 수용체를 발현한다. 수용체 중에는 다른 키메라 수용체들이다. 일부 실시 양태에서, 다른 키메라 수용체는 U.S. Patent Application Pub. No. US 2017/0051035에 기재된 것과 같은 키메라 자가 항체 수용체(CAAR)를 포함한다.
1. 키메라 항원 수용체 (CARs)
CAR을 포함하는 예시적인 항원 수용체, 및 상기 수용체를 조작하여 세포 내로 도입시키는 방법은 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, U.S. Patent Nos. 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416, 및/또는 Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4): 388-398 (2013); Davila et al., PLoS ONE 8(4): e61338 (2013); Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 24(5): 633-39 (2012); Wu et al., Cancer, 18(2): 160-75 (2012)에 기재된 것들을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항원 수용체는 미국 특허No. 7,446,190 및 국제 트허 출원 공개 번호 No. WO/2014055668 A1.에 기재된 CAR를 포함한다. CAR의 예는 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, U.S. Patent No. 7,446,190, US Patent No. 8,389,282, Kochenderfer et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al., J. Immunother. 35(9): 689-701 (2012); 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 5(177) (2013). 참조, 또한 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, U.S. Patent No. 7,446,190, 및 US Patent No. 8,389,282와 같이 전술한 문헌 중 어는 것에 개시된 CARs를 포함한다. CAR과 같은 키메라 수용체는 항체 분자의 일부, 일반적으로 항체의 가변 중 (VH) 사슬 영역 및/또는 가변 경 사슬 (VL) 사슬 영역, 예를 들어, scFv 항체 단편과 같은 세포외 항원 결합 도메인을 일반적으로 포함한다.
일부 실시 양태에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시 양태에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 실시 양태에서, 항원은 정상 세포 또는 비 표적화된 세포 또는 조직과 비교하여 질환 또는 증상의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현 된다. 일부 실시 양태에서, 항원은 정상 세포 상에 발현되고 및/또는 조작된 세포 상에서 발현된다.
일부 실시 양태에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 희귀 티로신 키나아제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소테린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항 엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2,3 또는 4, FBP, 태아 아세틸린 e 수용체, GD2, GD3, HMW- MAA, IL- MAGE-A1, mesothelin, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성항원, 전립선 특이 항원, PSMA, Her2 / neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, ephrinB2, CD123, c-Met, GD-2 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양1 (WT-1), 사이클린 A1 (CCNA1)과 같은 사이클린 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원균에 의해 발현되는 분자를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CAR은 병원체 특이적 항원에 결합한다. 일부 실시 양태애서, CAR은 바이러스성 항원 (예를 들어, HIV, HCV, HBV 등), 세균성 항원 및/또는 기생 항원에 특이적이다.
일부 실시 양태에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항체 부분은 경첩 영역, 예를 들어 IgG4 경첩 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역과 같은 면역 글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG이다. 일 측면에서, 불변 영역의 부분은 항원 인식 성분, 예를 들어 scFv와 막 횡단 도메인 사이의 스페이서 영역으로 작용한다. 스페이서는 스페이서 부재와 비교하여 항원 결합 후 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이 일 수 있다. 전형적인 경첩 영역과 같은 예시적인 스페이서는 국제 특허 출원 공개 WO2014031687호에 기재된 것을 포함한다. 일 실시예에서, 스페이서는 길이가 약 12 아미노산이거나 12 아미노산 이하이다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229 개의 아미노산, 약 10 내지 200 개의 아미노산, 약 10 내지 175 개의 아미노산, 약 10 내지 150 개의 아미노산, 약 10 내지 125 개의 아미노산, 약 10 내지 100 개의 아미노산, 약 10 내지 75 개의 아미노산, 약 10 내지 50 개의 아미노산, 약 10 내지 40 개의 아미노산, 약 10 내지 30 개의 아미노산, 약 10 내지 20 개의 아미노산 또는 약 10 내지 15 개의 아미노산 및 나열된 범위 중 하나의 끝점 사이의 정수를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산, 약 119 개 이하의 아미노산, 또는 약 229 개 또는 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적인 스페이서는 IgG4 경첩만, CH 2 및 CH 3 도메인에 연결된 IgG4 경첩, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 경첩을 포함한다. 예시적인 스페이서는 이에 한정되는 것은 아니지만, Hudecek 등, Clin. Cancer Res., 19 : 3153 (2013), 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687, 미국 특허 제 8,822,647 호 또는 공개된 출원. US2014 / 0271635에 개시되어 있는 것을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1 같은 인간 IgG이다. 일부 실시 양태에서, 스페이서는 서열 ESKYGPPCPPCP (서열 번호 1에 기재 됨)를 갖고, 서열 번호 2에 기재된 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, 스페이서는 서열 번호 3에 기재된 서열을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 스페이서는 서열번호 4에 기재된 서열을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD이다. 일부 실시 양태에서, 스페이서는 서열 번호 5에 기재된 서열을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 스페이서는 서열번호 1, 3, 4 또는 5 중 임의 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
이 항원 인식 도메인은 일반적으로 CAR의 경우에 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체 및/또는 또 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 통한 활성화를 모방하는 신호 전달 성분과 같은 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분에 결합 할 수 있다. 따라서 일부 실시 양태에서, 항원-결합 성분(예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막 및 신호 전달 도메인에 연결된다. 일부 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 세포외 도메인에 융합된다. 일부 실시 양태에서, 수용체의 도메인 중 하나, 예를 들어 CAR에 자연적으로 결합된 막 횡단 도메인이 사용된다. 일 경우에는, 막 횡단 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 막 전 영역에 이러한 도메인이 결합하는 것을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
상기 막 횡단 도메인은 천연 또는 합성 소스로부터 유도된다. 원천이 자연스러운 경우, 일 측면의 도메인은 암의의 막-결합 또는 막 횡단 단백질로부터 유도된다. 막 횡단 영역은 T 세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16 및 CD16의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래된 것 (즉, 적어도 그것의 막 관통 영역을 포함한다) CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137 또는 CD154를 포함한다. 대안적으로, 일부 실시 양태에서 막 횡단 도메인은 합성이다. 일 측면에서, 합성 막 변이 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막 변이 도메인의 각 말단에서 발견 될 것이다. 일부 실시 양태에서, 결합은 링커, 스페이서 및/또는 막 횡단 도메인(들)에 의한 것이다.
세포 내 신호 전달 영역 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공 자극 수용체와 결합한 수용체를 통한 신호 및/또는 보조 자극 수용체를 통한 신호를 모방하거나 근사하는 영역이 있다. 일부 실시 양태에서, 글리신과 세린을 포함하는 것, 예를 들어 글리신-셀린 이중선과 같은 짧은 올리고-또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어, 2개내지 10개의 아미노산 길이의 링커는 존재하고 세포막내 도메인과 CAR의 세포질 신호 전달 도메인 사이에 연결을 형성한다.
수용체, 예를 들어 CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포내 신호 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용체는 T 세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어, CD3 제타 사슬와 같은 TCR 복합체의 세포 내 성분을 포함한다. 따라서, 일 측면에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 실시 양태에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막 횡단 도메인, CD 3세포 내 신호 전달 도메인 및/또는 다른 CD 막 횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 부분을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체는 CD3- 제타 (CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ 및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.
일부 실시 양태에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 연결시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포 내 신호 도메인은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 작동기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화 시킨다. 예를 들어, 일 상황에서, CAR은 사이토카인 또는 다른 인자의 분비와 같은 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성과 같은 T 세포의 기능을 유도한다. 일부 실시 양태에서, 항원 수용체 성분 또는 보조 자극 분자의 세포 내 신호 전달 도메인의 절단된 부분은 예를 들어 그것이 작동자 기능 신호를 전달하는 경우 완전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 실시 양태에서, T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일 측면에서 천연 수용체가 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하는 그러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동 수용체의 것을 포함한다.
자연적인 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 동시 자극 신호를 필요로 한다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 완전한 활성화를 촉진시키기 위해, 보조 또는 공동-자극 신호를 발생시키는 성분이 또한 CAR에 포함된다. 다른 일부 실시 양태에서, CAR은 보조 자극 신호를 생성하기 위한 구성 요소를 포함하지 않는다. 일 측면에서, 추가 CAR은 동일한 세포에서 발현되며, 이차 또는 공 자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
T 세포 활성화는 몇 가지 측면에서 두 가지 종류의 세포질 신호 전달 서열에 의해 매개되는 것으로 기술되어 있다: TCR (primary cytoplasmic signaling sequences)을 통해 항원 의존적 1차 활성화를 개시하는 것 및 2 차 또는 공동 자극 신호 (2 차 세포질 신호 서열)를 제공하기 위해 항원 비 의존적 방식으로 작용하는 것. 일 측면에서, CAR은 그러한 신호 전달 구성 요소들 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 주요 활성화를 조절하는 주요 세포질 시그널 서열을 포함한다. 자극적인 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 서열은 면역 수용체 티로신계 활성 모티프 또는 ITAM으로 알려진 시그널 모티프를 포함할 수 있다. 1 차 세포질 신호 전달 서열을 포함하는 ITAM의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유도된 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, CAR의 세포질 신호 전달 분자(들)는 세포질 신호 전달 도메인, 이의 부분, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 포한한다.
일부 실시 양태에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은 공 자극 수용체의 시그널링 도메인 및/또는 막 횡단 부분을 포함한다. 일 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 및 보조 자극 성분을 모두 포함한다.
일부 실시 양태에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 보조 자극 성분은 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 실시 양태에서, CAR은 동일한 세포 상에 발현되는 활성화 또는 자극성 CAR, 보조자극 CAR을 포함 한다(WO2014 / 055668 참조). 일 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극성 또는 활성화성 CAR 및/또는 보조 자극 CAR을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포는 억질병-표적화된 CAR을 통해 전달된 활성화 신호가 저해 CAR의 그의 리간드, 예를 들어 오프-타겟 효과를 줄이기 위해 결합에 의해 감소되거나 저해되는 질환 또는 증상와 관련된 항원 이외의 항원을 인식하는 CAR과 같은 억제성 CARs (iCARs, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215) (2013)을 추가로 더 포함한다.
일부 실시 양태에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3 (예를 들어, CD3-제타) 세포 내 도메인에 연결된 CD28 막 관통 및 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3 제타 세포 내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137 (4-1BB, TNFRSF9) 공-자극 도메인을 포함한다.
일부 실시 양태에서, CAR은 하나 이상의, 예를 들어 2개 이상의 보조 자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 1 차 활성화 도메인을 세포질 부분에 포함한다. 예시적인 CARs은 CD3-제타, CD3-zeta, CD28 및 4-1BB을 포함한다.
일부 실시 양태에서, CAR 또는 다른 항원 수용체는 마커를 추가로 포함하고/하거나 CAR 또는 다른 항원 수용체를 발현하는 세포는 절단된 EGFR (tEGFR)와 같은 세포 표면 수용체의 절단된 형태와 같은 수용체를 발현시키기 위한 세포의 형질 도입 또는 조작을 확인하는데 사용될 수 있는 세포 표면 마커와 같은 대리 마커를 추가로 포함한다. 일 측면에서, 마커, 예를 들어 CD34, NGFR 또는 표피 성장 인자 수용체 (예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부 (예를 들어, 절단된 형태)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 마커를 코딩하는 해산은 절단 가능한 링커 서열, 예를 들어 T2A와 같은 링커 서열을 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어 표지 및 선택적인 링커 서열은 PCT Pub. WO2014031687에 개시된 것일 수 있다. 예를 들어, 마커는 선택적으로 T2A 절단 가능 링커 서열과 같은 링커 서열에 연결된 절단된 EGFR (tEGFR)일 수 있다. 절단된 EGFR (예를 들어, tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩티드는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % %, 99 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다. 예시적인 T2A 링커 서열은 서열번호 6 또는 45에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % %, 99 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시 양태에서, 마커는 T 세포 상에 자연적으로 발견되지 않거나 또는 T 세포의 표면 상에 자연적으로 발견되지 않은 분자, 예를 들어 세포 표면 단백질 또는 이의 일부이다. 일부 실시 양태에서, 분자는 비 자기 분자, 예를 들어 비자성 단백질, 즉 세포가 적용적으로 전이될 숙주의 면역계에 의해 “자체”로 인식되지 않는 비 자체단백이다.
일부 실시 양태에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않으며 및/또는 유전 공학용 마커로서 사용되는, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 것 이외의 효과를 발생시키지 않는다. 다른 실시양태에서, 마커는 수용체 전달 및 리간드와의 만남시 세포의 반응을 강화 및/또는 완충시키기 위한 보조 자극 분자 또는 면역 체크 포인트 분자와 같은 세포와 같이 생체 내에서 마주 치게될 세포에 대한 리간드와 같이 다른 효과를 발휘하는 치료용 분자 또는 분자일 수 있다.
일부 경우에 따라 CAR는 1차, 2차 및/또는 3세대 CAR로 불린다. 일 측면에서 1 세대 CAR은 항원 결합시 단독으로 CD3-쇄 유도 신호를 제공하는 것이다; 일 측면에서, 2세대 CAR은 CD 28또는 CD 137과 같은 보조 자극 수용체로부터의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 것과 같은 신호 및 보조 자극 신호를 제공하는 것이다; 일 측면에서, 제 3세대 CAR은 상이한 보조 자극 수용체의 복수의 보조 자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 실시 양태에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 세포외 부분을 포함한다. 일 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함하고, 세포 내 도메인은 ITAM을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포 내 신호 전달 도메인을 CD3-제타(CD3ζ) 쇄의 제타 쇄의 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 연결하는 막 횡단 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 막 횡단 도메인은 CD 28의 막 횡단 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 동시 자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인 및 막 횡단 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포 외 도메인 및 막 횡단은 본원에 기재된 임의의 것과 같은 스페이서에 연결된다. 일부 실시 양태에서, 수용체는 CD 28 세포 외 부분과 같은 막 횡단 도메인이 유래된 분자의 세포 외 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 키메라 항우너 수용체는 T 세포 동시 자극 분자 또는 기능적 변이체 또는 이의 일부, 예컨대 막 횡단 도메인과 세포 내 신호 전달 도메인 사이에 유래된 세포 내 도메인을 포함한다. 일 측면에서, T 세포 보조 자극 분자는 CD 28 또는 41BB이다.
예를 들어, 일부 실시 양태에서, CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편 CD28 또는 이의 기능적 변이체 또는 부분의 막 횡단 부분이거나 이를 포함하는 막 횡단 도메인 및 신호 전달 부분 또는 기능적 변이체의 신호 전달 부분 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시 양태에서, CAR은 항체, 예를 들어 항체 단편 CD 28 또는 이의 기능적 변이체 또는 부분의 막 횡단 부분이거나 이를 포함하는 막 횡단 도메인 및 4-1BB의 신호 전달 부분을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인 또는 기능적 변이체 또는 그 일부 및 CD3 제타 또는 기능적 변이체의 신호 전달 부분 또는 그의 일부를 포함한다. 일부 이러한 실시 양태에서, 수용체 인간 Ig 분자 같은, Ig 경첩, 예를 들어 IgG4 경첩 같은, 경첩-단지 스페이서와 같은 Ig 분자의 일부를 포함하는 스페이서를 추가로 더 포함한다.
일부 실시 양태에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 막 횡단 도메인은 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 막 횡단 도메인 또는 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD28의 막 횡단 도메인(예 : Accession No. P01747.1) 또는 그의 변이체, 또는 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 이상의 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열; 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체의 막 관통 도메인을 포함하는 부분은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 85 %, 86 %, 87 %, 88 % 90 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 이상의 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열이거나 포함한다.
일부 실시 양태에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 세포내 신호 전달 성분(들)은 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL 내지 GG 치환을 갖는 도메인과 같은 인간 CD28 또는 기능적 변이체 또는 이의 일부의 세포내 보조 자극 시그널링 도메인을 포함한다. 예를 들어, 세포 내 신호 전달 도메인은 서열 번호 10 또는 11에 제시된 아미노산 서열, 또는 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % %, 99 % 또는 그 이상의 서열번호 10 또는 11의 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 12 또는 13에 기재된 아미노산 서열과 같은 4-1BB의 세포 내 보조 자극 신호 전달 도메인 (예 : Accession No. Q07011.1) 또는 이의 기능적 변이체 또는 부분, 또는 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열 번호 12의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 세포내 시그널링 도메인은 미국 특허 제 7,446,190 호 또는 미국 특허 제 8,911,993 호에 개시된 바와 같이 인간 CD3ζ의 이소형 3의 112AA 세포질 도메인 (Accession No. P20963.2) 또는 CD3 제타 신호 전달 도메인과 같은 인간 CD3 제타 자극 시그널링 도메인 또는 기능적 변이체 또는 그의 일부를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 세포내 신호 전달 도메인은 서열 번호 13, 14 또는 15에 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열번호 13, 14 또는 15와 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 스페이서는 IgG4 또는 IgG1의 경첩 (예를 들어, 서열 번호 1에 기재된 경첩 만의 스페이서)와 같은 IgG의 경첩 영역 만을 포함한다. 다른 실시양태에서, 스페이서는 임의로 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 IgG 경첩, 예를 들어 IgG4-유래 경첩이다. 일부 실시 양태에서, 스페이서는 서열 번호 4에 기재된 바와 같이 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 경첩, 예를 들어, IgG4 경첩이다. 일부 실시 양태에서, 스페이서는 서열 번호 3에 기재된 바와 같은, CH3 도메인에만 연결된 Ig 경첩, 예를 들어, IgG4 경첩이다. 일부 실시 양태에서, 스페이서는 글리신-셀린 풍부 서열 또는 공지된 가요성 링커와 같은 다른 가용성 링커이거나 이를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시 양태에서, 상기 CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편과 같은 항체, 면역 글로불린 분자의 일부, 예컨대 경첩 영역 및/또는 중쇄 분자의 하나 이상의 불변 영역, 예를 들어 Ig-항체와 같은 면역 글로불린 분자의 일부를 포함하는 스페이서와 같은 스페이서, 경첩 포함 스페이서, CD28-유래 막 횡단 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 막 횡단 도메인, CD28-유도된 세포 내 신호 도메인 및 CD3 ζ 신호 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, CAR Ig-경첩 포함 스페이서, CD28- 유래 막 횡단 도메인, 4-1BB-유래 세포내 신호 전달 도메인 및 CD3 ζ- 유도 신호 도메인 중 임의의 것과 같은 스페이서, scFv과 같은 항체 또는 단편을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 그러한 CAR 구조물을 코딩하는 핵산 분자는 T2A 리보좀 스킵 요소 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어 CAR을 코딩하는 서열의 하류를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 서열은 서열번호 6 또는 45에 제시된 또는 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % %, 99 % 또는 그 이상의 서열번호 6 또는 45의 서열 상동성을 보이는 아미노산 서열인 T2A리보좀 스킵 요소를 암호화한다. 일부 실시 양태에서, 항원 수용체 (예를 들어, CAR)를 발현하는 T 세포는 그러한 세포를 검출하는 마커로서 사용될 수 있는 비 면역원성 선택 에피토프(예를 들어, 동일한 구조로부터 2 개의 단백질을 발현시키기 위해 T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt를 코딩하는 구조물의 도입에 의해)로서 절단된 EGFR을 발현하도록 생성 될 수 있다 (참조, U.S. Patent No. 8,802,374). 일부 실시 양태에서, 서열은 서열번호 7에 제시된 또는 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열 번호 7의 상동성을 나타내는 아미노산 서열인 tEGFR 서열을 암호화한다.
개체에 투여된 세포에 의해 발현되는 CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 치료되는 질환 또는 증상 또는 세포에서 발현되고, 관련되고/되거나 특이적인 분자를 인식하거나 또는 특이적으로 결합한다. 분자 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하면, 수용체는 일반적으로 ITAM-형질 전환된 신호와 같은 면역 자극 신호를 세포 내로 전달함으로써 질환 또는 증상를 표적으로 하는 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 세포는 질환 또는 증상의 세포 또는 조직에 의해 발현되거나 질병 또는 상태와 관련되는 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
2. TCRs
일부 실시 양태에서, 조작된 세포, 예를 들어 T 세포는 종양, 바이러스 또는자가 면역 단백질의 항원과 같은 표적 폴리펩티드의 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 이의 항원-결합 부분의 발현이 제공된다.
일부 실시 양태에서, "T 세포 수용체"또는 "TCR"은 가변 α 및 β 쇄 (각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지 됨) 또는 가변 γ 및 δ 쇄 (또한 각각 TCRα및 TCRβ 로도 알려짐), 또는 이들의 항원-결합 부분을 포함하며, MHC 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 αβ 형태이다. 일반적으로 αβ와 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 독특한 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 또는 가용성 형태에서 발견할 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견되며, 일반적으로 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 한다.
달리 명시하지 않는 한, 용어 “TCR"은 완전한 TCR 뿐만 아니라 항원-결합 부분 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시 양태에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는 완전한 또는 완전한 길이의 TCR이다. 일부 실시 양태에서, TCR은 전장 TCR 미만이지만 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 것과 같은 MHC 분자에 결합된 특정 펩티드에 결합하는 항원-결합 부분이다. 일 경우에 있어서, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 손상되지 않은 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 포함 할 수 있지만, MHC-펩티드 복합체와 같은 펩티드 에피토프를 전체 TCR이 결합한다. 일 경우에는, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 쇄과 같은 TCR의 가변 도메인을 포함한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩티드, MHC 및/또는 MHC-펩티드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 포함한다.
일부 실시 양태에서, TCR의 가변 도메인은 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 주요 기여자인 초 가변 루프, 또는 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, TCR 또는 이의 조합의 CDR은 주어진 TCR 분자의 항원 결합 부위의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. 일반적으로 TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 프레임 워크 영역 (FR)에 의해 분리되며, 일반적으로 CDR과 비교하여 TCR 분자 사이의 가변성이 덜 나타 난다 (예를 들어, Jores 등, Proc. Nat'l Acad Sci. USA 87 : 9138, 1990; Chothia 등, EMBO J. 7 : 3745, 1988; Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참조). 일부 실시 양태에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주 CDR이거나, 항원 인식 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 처리된 펩티드 부분과의 상호 작용을 위해 주어진 TCR 가변 영역상의 세 CDR 중에서 가장 중요하다. 일 경우에는, 알파 쇄의 CDR1의 특정 항원 펩티드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일 상황에서, β-쇄의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용 할 수 있다. 일 상황에서는, CDR2는 MHC펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 그 인식에 책임이 있는 주 CDR에 가장 강하게 기여하거나 또는 이에 기여한다. 일부 실시 양태에서, β-쇄의 가변 영역은 일반적으로 초 항원 결합 및 항원 인식에 관여하지 않는 추가의 과 가변 영역 (CDR4 또는 HVR4)을 포함할 수 있다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8 : 411-426).
일부 실시 양태에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막 횡단 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 포함할 수 있다 (참조, 예를 들어 Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). 일 측면에서, TCR의 각 쇄는 C-말단에서 하나의 N-말단 면역 글로불린 가변 도메인, 하나의 면역 글로불린 불변 도메인, 막 횡단 영역 및 짭은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 신호 전달을 매개하는 것과 관련된 CD3 복합체의 불변 단백질과 관련된다.
일부 실시 양태에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 예를 들어 주어진 TCR 사슬의 세포외 부분(예를 들어, α 쇄 또는 β 쇄)은 가변 도메인 (예 : Vα 또는 Vβ, Kabat 번호 매김에 기초한 전형적으로 아미노산 1 내지 116, "면역학적 단백질의 서열, “of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) 및 세포에 인접한 불변 도메인(예를 들어, Kabat 번호 매김 또는 β 쇄 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 Kabat에 기초한 쇄의 117 내지 295 위치에 기초한 쇄의 117 내지 259 위치의 α 쇄 불변 도메인 또는 Cα)과 같은 2개의 면역 글로불린 유사 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에는, 2개의 쇄에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인 및 가변 도메인 각각이 CDR을 포함하는 2개의 막-말단 가변 도메인을 포함한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화물 결합을 형성함으로써 TCR의 두 쇄를 연결하는 짧은 연결 서열을 ㅗ포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 α 및 β 쇄 각각에 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있어, TCR은 불변 도메인에서 2 개의 이황화물 결합을 포함한다.
일부 실시 양태에서, TCR 사슬은 막 횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 양전하를 띤다. 어떤 경우에는, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 포함한다. 일 경우에는, 구조는 TCR이 CD3 및 이의 서브 유닛과 같은 다른 분자와 결합하는 것을 허용한다. 예를 들어, 막 횡단 영역을 갖는 불변 도메인을 포함하는 TCR은 세포 막 내의 단백질을 고정시키고, CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브 유닛과 결합할 수 있다. CD3 신호 전달서브 유닛 (예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 쇄)의 세포 내 꼬리는 TCR 복합체의 신호 전달 용량에 관여하는 하나 이상의 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 포함한다.
일부 실시 양태에서, TCR은 2개의 쇄 α 및 β (또는 선택적으로 γ 및 δ)의 이종이 량체 일 수 있거나 단일 사슬 TCR 컨스트럭트일 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 이황화물 결합 또는 이황화물 결합들에 의해 연결된 2개의 분리된 사슬 (α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 포함하는 이종 이량체이다.
일부 실시 양태에서, TCR은 Vα, β 쇄의 서열과 같은 공지된 TCR 서열 (들)로부터 생성될 수 있으며, 실질적으로 전체 길이 코딩 서열이 용이하게 이용 가능하다. 세포 공급원으로부터 V 쇄 서열을 포함하는 전장 TCR 서열을 얻는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 실시 양태에서, TCR을 코딩하는 핵산은 주어진 세포 또는 세포 내에서 또는 이로부터 단리된 TCR- 코딩 핵산의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 또는 공개적으로 이용 가능한 TCR DNA 서열의 합성과 같은 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
일부 실시 양태에서, TCR은 T 세포 (예를 들어, 세포 독성 T 세포), T-세포 하이브리도마 또는 다른 공개적으로 이용 가능한 공급원과 같은 세포로부터와 같은 생물학적 공급원으로부터 얻어진다. 일부 실시 양태에서, T 세포는 생체내 분리세포로부터 수득 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 흉선학적으로 선택된 TCR이다. 일부 실시 양태에서, TCR은 신 에피토프-제한 TCR이다. 일부 실시 양태에서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR 또는 이의 항원-결합 부분은 TCR의 서열 지식으로부터 종합적으로 생성될 수 있다.
일부 실시 양태에서, TCR은 표적 폴리펩티드 항원 또는 이의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝하는 것으로 확인되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 기타 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여 개체로부터 분리된 T 세포로부터의 Vα 및 Vβ 레파토리의 증폭에 의해 생성 될 수 있다. 일 경우에는, T 세포가 종양 침윤 림프구 (TIL)에서 증폭 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 질환이 있는 개체, 즉 병이 있는 TCR 라이브러리의 T 세포 공급원으로부터 증폭 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 퇴화된 프라이머는 인간으로부터 수득된 T 세포와 같은 샘플에서 RT-PCR에 의한 것과 같이 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭 시키는데 사용된다. 일부 실시 양태에서, scTv 라이브러리는 증폭된 생성물이 링커에 의해 분리되도록 복제되거나 조립된 천연 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조립될 수 있다. 대상 및 세포의 출처에 따라 라이브러리는 HLA 대립 형질 특정일 수 있다. 대안적으로, 일부 실시 양태에서, TCR 라이브러리는 모상 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이 유발 또는 다양화에 의해 생성 될 수 있다. 일 측면에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 돌연변이 유발과 같은 직접 진화에 영향을 받는다. 일 측면에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기가 변경된다. 일부 실시 양태에서, 선택된 TCR은 친화성 성숙에 의해 변형 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 펩티드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위해 선별하는 것과 같은 항원 특이적 T 세포를 선택할 수 있다. 일 측면에서, TCR들, 예를 들어 항원 특이적인 T 세포 상에 존재하는 항원은 결합 활성, 예를 들어 항원에 대한 특이적인 친화성 또는 결합력에 의해 선택될 수 있다.
일부 실시 양태에서, TCR 또는 이의 항원-결합 부분은 변형되거나 조작된 것이다. 일부 실시 양태에서, 지시된 진화 방법을 사용하여 특정 MHC-펩티드 복합체에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 것과 같은 변화된 특성을 같는 TCR을 생성시킨다. 일부 실시 양태에서, 직접 진화는 이에 한정되지 않으나 이스트 디스플레이 display (Holler et al., (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al., (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이 (Li et al., (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), 또는 T 세포 디스플레이 (Chervin et al., (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하는 디스플레이 방법에 의해 달성된다. 일부 실시 양태에서, 디스플레이 접근법은 알려진, 부모 또는 기준 TCR을 조작하거나 수정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일 경우에는, 야생형 TCR은 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이된 돌연변이 유발된 TCR을 생성하기위한 주형으로 사용될 수 있으며, 원하는 표적 항원에 대한보다 높은 친 화성과 같은 원하는 변경된 특성을 갖는 돌연변이체가 선택된다.
일부 실시 양태에서, 관심있는 TCR을 생산 또는 생성하는데 사용하기 위한 표적 폴리 펩티드의 펩티드는 공지되어 있거나 통상의 기술자에 의해 용이하게 동정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성시키는데 사용하기에 적합한 펩티드는 관심 대상 표적 폴리 펩티드, 예를 들어 표적 폴리 펩티드에서 HLA-제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 펩티드는 당업자에게 공지된 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 동정된다. 일부 실시 양태에서, MHC 클래스 I 결합 사이트를 예측하기 위해, 그러한 모델은 이에 한정되지 않으나 ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237, 및SYFPEITHI (see Schuler et al., (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, MHC-제한된 에피토프는 모든 백인의 약 39-46 %에서 발현되는 HLA-A0201이며, 따라서 TCR 또는 다른 MHC-펩티드 결합 분자를 제조하는데 사용하기위한 MHC 항원의 적합한 선택을 나타낸다.
컴퓨터 예측 모델을 이용한 HLA-A0201-결합 모티프 및 프로테아좀 및 면역-프로테아좀(immunosporaome)에 대한 절단 부위는 당업자에게 공지되어 있다. MHC 클래스 I 결합 사이트를 예측하기 위해, 그러한 모델은 ProPred1 (Singh 및 Raghava, ProPred : HLA-DR 결합 부위의 예측에 더 자세히 기술되어 있다. BIOINFORMATICS 17 (12) : 1236-1237 2001) 및 SYFPEITHI (참조 huler 외, SYFPEITHI, 검색 및 T 세포 에피토프 예측에 대한 데이터베이스. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409 (1) : 75-93, 2007)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특성이 변경된 재조합적으로 생산된 천연 단백질 또는 이의 돌연변이 형태일 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유류 동물과 같은 다양한 동물 중 하나로부터 유도될 수 있다. TCR은 세포에 결합되거나 가용성 형태일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포 표면상에 발현된 세포-결합 형태이다.
일부 실시 양태에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 실시 양태에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 실시 양태에서, TCR은 이량체 TCR(dt TCR)이다. 일부 실시 양태에서, TCR은 단일 쇄 TCR(SC-TCR)이다. 일부 실시 양태에서, dTCR 또는 scTCR은 WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186에 기재된 바와 같은 구조를 갖는다.
일부 실시 양태에서, TCR은 막 횡단 서열에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시 양태에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 임의의 TCR은 T 세포의 표면상에 활성 TCR을 생성시키는 시그널링 도메인에 연결될 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 세포 표면에서 발현된다.
일부 실시 양태에서, dTCR TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포 외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제 1 폴리펩티드 및 TCR β 쇄 가변 영역 서열에 상응하는 서열은 TCR β 쇄 상수 영역 세포 외 서열에 상응하는 서열을 N 말단에 융합시키고, 상기 제 1 및 제 2 폴리 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 양태에서, 결합은 천연 이량체 αβ TCR에 존재하는 본래 사슬 간 다이 설파이드 결합에 상응할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 사슬 간의 이황화물 결합은 천연 TCR에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 시스테인은 dTCR 폴리펩티드 쌍의 불변 영역 세포외 서열에 혼입될 수 있다. 일 경우에는, 천연 및 비천연 이황화 결합이 바람직할 수 있다. 일부 실시 양태에서, TCR은 멤브레인에 앵커링하기 위해 막 횡단 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, dTCR는 가변 α 도메인, 상수 α 도메인 및 상수 α 도메인의 C-말단에 부착된 제 1 이합체화 모티프를 포함하는 TCR α 사슬 및 가변 β 도메인, 상수 β 도메인 및 상수 β 도메인의 C- 말단에 부착된 제 1 이합체화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 포함하며, 제 1 및 제 2 이합체 화 모티프는 TCR α 사슬과 TCR β 사슬을 함께 연결하는 제 1 이량 체화 모티프의 아미노산과 제 2 이합체화 모티프의 아미노산 사이의 공유 결합을 형성하기 위해 상호 작용하기 쉽다.
일부 실시 양태에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 생성 될 수 있다, 참조 예를 들어 Soo Hoo, W. F. et al., PNAS (USA) 89, 4759 (1992); W
C. and Pl
A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al., PNAS (USA) 90 3830 (1993); 국제 공개 PCT 번호 WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. et al., J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). 일부 실시 양태에서, scTCR은 도입된 비-천연 이황화물 인터체인 (non-native disulfide interchain) 결합을 포함하여 TCR 사슬의 결합을 촉진시킨다 (참조, 예를 들어, 국제 공개 PCT 번호 WO 03/020763). 일부 실시 양태에서, scTCR은 이의 C- 말단에 융합된 이종 류신 지퍼가 사슬 결합을 용이하게 하는 비-이황화물 연결 말단 절단된 TCR이다 (예를 들어, 국제 공개 PCT WO 99/60120 참조). 일부 실시 양태에서, scTCR은 펩티드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유 결합된 TCRα 가변 도메인을 포함한다 (국제 공개 PCT 번호 WO99/18129 참조).
일부 실시 양태에서, scTCR은 TCR α쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 1분절, N에 융합된 TCR β쇄 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 2분절 TCR β쇄 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 말단 및 제 1단편의 C 말단을 제 2단편의 N 말단에 연결시키는 링커 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, scTCR은 α쇄 세포외 불변 도메인 서열의 N말단에 융합된 α쇄 가변 영역 서열로 구성되는 제 1분절과, 서열 β쇄 세포외 상수 및 막 횡단 서열의 N말단 및 선택적으로 제 1단편의 C말단을 제 2단편의 N말단으로 연결시키는 링커 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, scTCR은 β쇄 세포외 불변 도메인 서열의 N말단에 융합된 TCR β쇄 가변 영역 서열로 구성되는 제 1분절과, α 사슬 가변 영역 서열의 N 말단에 융합된 α쇄 가변 영역 서열로 이루어진 제 2분절 서열 α사슬 세포외 상수 및 막 횡단 서열, 및 임의로, 제 1단편의 C말단을 제 2단편의 N말단으로 연결시키는 링커 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 제 1 및 제 2 TCR 분절을 연결시키는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커 서열은 예를 들어 P가 프롤린이고, AA가 아미노산이 글리신 및 세린인 아미노산 서열을 나타내는 화학식 -P-AA-P를 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제 1 및 제 2 세그멘트는 그 가변 영역 서열이 그러한 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일 경우에는, 링커는 첫 번째 분절의 C 말단과 두 번째 분절의 N 말단 사이의 거리를 확장하는데 충분한 길이를 가지지만, 그 반대의 경우도 있지만, scTCR의 타겟 리간드로의 결합을 차단하거나 줄이기에는 너무 길지 않다. 일부 실시 양태에서, 링커는 약 10 내지 45 개의 아미노산, 예를 들어 10 내지 30 개의 아미노산 또는 26 내지 41 개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG) 5-P를 가지며, 여기서는 P는 프롤린이고, G는 글리신이고, S는 세린이다 (서열번호 16). 일부 실시 양태에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS을 가진다 (서열번호 17).
일부 실시 양태에서 scTCR은 α 쇄의 불변 도메인의 면역 글로불린 영역의 잔기를 β 쇄의 불변 도메인의 면역 글로불린 영역의 잔기에 연결시키는 공유 결합 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 천연 TCR에서 사슬 간 (interchain) 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 시스테인은 scTCR 폴리펩티드의 제 1 및 제 2세그멘트의 불변 영역 세포 외 서열에 혼입 될 수 있다. 어떤 경우에는, 천연 및 비천연 이황화 결합이 바람직할 수 있다.
도입된 쇄간 이황화물 결합을 포함하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 실시 양태에서, 천연의 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 천연 쇄간 이황화물 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인은 세린 또는 알라닌과 같은 다른 잔기로 치환한다. 일부 실시 양태에서, 도입된 이황화물 결합은 제 1 및 제 2 단편상의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌여변이시킴으로써 형성될 수 있다. 예시적인 TCR의 비 천연 이황화물 결합은 공개된 국제 PCT 번호 WO2006 / 000830에 기술되어 있다.
일부 실시 양태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 표적 항원에 대한 평형 결합 상수와 약 10-5 내지 10-12M 사이의 친화력 및 모든 개별 값 및 범위를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 표적 항원은 MHC-펩티드 복합체 또는 리간드이다.
일부 실시 양태에서 α 및 β 사슬과 같은 TCR을 코딩하는 핵산 또는 핵산은 PCR, 클로닝 또는 다른 적절한 수단에 의해 증폭되어 적합한 발현 벡터 또는 벡터로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고 임의의 적합한 숙주를 형질 전환 또는 형질 감염시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는, 플라스미드 및 바이러스와 같이, 증식 및 체적증대 또는 발현 또는 이들 모두를 위해 고안된 벡터를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈 (Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 또는 pEX 시리즈 (Clontech, Palo Alto, Calif.) 일 수 있다. 일 경우에는, λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149와 같은 박테리오 파지 벡터도 사용 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 식물 바현 벡터가 사용될 수 있고, pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (Clontech)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo (Clontech)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 레트로 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 사용된다.
일부 실시 양태에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 벡터는 벡터가 DNA 기반인지 또는 RNA 기반인지 여부를 적절하게 고려해하여 벡터가 도입될 숙주의 유형(예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을 포함 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 벡터는 TCR 또는 항원 결합 부분 (또는 다른 MHC-펩티드 결합 분자)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 비 천연 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 비 바이러스 프로모터 또는 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 마우스 줄기 세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터 일 수 있다. 숙련된 숙련자에게 공지된 다른 프로모터 또한 고려된다.
일부 실시 양태에서, TCR을 코딩하는 벡터를 생성하기 위해, 관심있는 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 단리된 총 cDNA로부터 α 및 β 사슬을 PCR 증폭하고 발현 벡터에 클로닝 하였다. 일부 실시 양태에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 실시 양태에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 실시 양태에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로 바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 벡터에 혼입된다.
3. 다중 타겟팅
일부 실시 양태에서, 세포 및 방법은 세포 상에 2개 이상의 유전적으로 조작된 수용체의 발현과 같은 다중 표적화 전략을 포함하며, 각각 상이한 항원의 동일을 인식하고 전형적으로 각각 상이한 세포 내 신호 전달 성분을 포함한다. 그러한 다중 표적화 전략은 예를 들어, PCT Pub. WO 2014055668 A1 (예를 들어, 정상 세포와 같이 표적 상에 개별적으로 존재하지만 치료하고자 하는 질환 또는 증상의 세포에서만 함께 존재하는 두 개의 상이한 항원을 표적으로 하는 활성화 및 보조 자극 CAR의 조합을 기술 함) 및 Fedorov et al., Sci. 번역. 의학, 5 (215) (2013) (활성화 CAR 및 억제 CAR을 나타내는 세포, 예를 들어 활성화 CAR이 정상 또는 비병 출성 세포 모두에서 발현되는 하나의 항원 및 상기 질환 또는 증상의 세포에 결합하는 것) 처리되고, 억제성 CAR은 정상 세포 또는 치료를 원하지 않는 세포에서만 발현되는 다른 항원에 결합한다).
예를 들어, 일부 실시 양태에서, 세포는 일반적으로 제 1 수용체, 예를 들어 제 1 항원에 의해 인식되는 항원에 대한 특이적 결합 시에 세포에 활성화 신호를 유도할 수 있는 제 1 유전적으로 조작된 항원 수용체(예를 들어, CAR 또는 TCR)을 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 세포는 일반적으로 제 2 수용체에 의해 인식되는 제 2 항원에 특이적으로 결합 시 면역 세포에 보조 자극 신호를 유도 할 수 있는 제 2 유전 공학 항원 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR), 예를 들어 키메라 보조 자극 수용체를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 제 1 항원 및 제 2항원은 동일하다. 일부 실시 양태에서, 제 1항원 및 제 2항원은 상이하다.
일부 실시 양태에서, 제 1 및/또는 제 2유전적으로 조작된 항원 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)은 세포에 활성화 신호를 유도 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 성분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 제 1수용체에 의해 유도된 활성화는 신호 전달 또는 ITAM 인산화 및/또는 ITAM 매개 신호 전달 캐스케이드의 개시와 같은 면역 반응의 개시를 초래하는 세포에서의 단백질 발현의 변화, (예 : CD4 또는 CD8 등), NF-κB 및/또는 AP-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 활성화, 및/또는 NF-κB 및/또는 AP-1과 같은 유전자 발현의 유도 사이토카인, 증식 및/또는 생존과 같은 인자를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 제 1 및/또는 제 2 수용체는 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공 자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 제 1 및 제 2 수용체는 상이한 보조 자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 제 1 수용체는 CD28 보조 자극 시그널링 영역을 포함하고, 제 2 수용체는 4-1BB 보조-자극 시그널링 영역을 포함하거나 그 역도 마찬가지이다.
일부 실시 양태에서, 제 1 및/또는 제 2 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인 및 보조 자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 모두 포함한다.
일부 실시 양태에서, 제 1 수용체는TAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하고, 제 2 수용체는 보조 자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 신호와 조합된 공 자극 신호는 증가된 유전자 발현, 사이토카인 및 다른 인자의 분비 및 세포 살상과 같은T 세포 매개된 이펙터와 같은 견고하고 지속적인 면역 반응과 같은 면역 반응을 야기하는 신호이다.
일부 실시 양태에서, 제 1 수용체만의 결합 또는 제 2 수용체의 결합은 강력한 면역 반응을 유도하지 않는다. 일 측면에서, 단지 하나의 수용체가 결찰되다면, 세포는 항원에 대해 내성을 갖거나 비 반응성이고, 또는 억제되고, 및/또는 인자를 증식시키거나 분비하도록 유도되거나 작용기 기능을 수행하지 않는다. 그러나, 일부 이러한 실시양태에서, 제 1 및 제 2 항원을 발현하는 세포의 만남과 같이 다수의 수용체가 결찰되었을 때, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인의 분비, 증식, 지속성에 의해 지시되는 바와 같이, 및/또는 표적 세포의 세포 독성 사멸과 같은 면역 이펙터 기능을 수행하는 것과 같은, 완전한 면역 활성화 또는 자극과 같은 원하는 반응이 달성된다.
일부 실시 양태에서, 2개의 수용체는 세포에 대한 활성화 및 억제 신호를 각각 유도하여 수용체 중 하나에 의한 이의 항원에의 결합이 세포를 활성화시키거나 반응을 유도하지만 제 2 억제 수용체에 의한 결합 이 항원에 대한 신호는 그 반응을 억제하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 예를 들어 활성화 CAR과 억제CAR 또는 iCAR의 조합이다. 이러한 전략은 예를 들어, 활성화 CAR이 질환 또는 증상에서 발현되는 항원에 결합 하나 정상 세포에서도 발현되며, 억제 수용체는 정상 세포에서 발현되는 별도의 항원에 결합하지만 질병이나 증상이 있는 세포가 아니다.
일부 실시 양태에서, 다중 표적화 전략은 특정 질병 또는 증상과 관련된 항원이 비 병사성 세포 (non-diseased cell)에서 발현되고/있거나 일시적(예를 들어, 유전과 관려된 자극시 엔지니어링)으로 또는 영구적으로 조작된 세포 자체에서 발현되는 경우에 사용된다. 이러한 경우, 2 개의 분리된 개별적 항원 수용체의 연결을 요구함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 활성이 개선될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 복수의 항원, 예를 들어, 제 1항원 또는 제 2항원은 암세포에서와 같이 표적화 되는 세포, 조직 또는 질병 또는 증상 상에 발현된다. 일 측면에서, 세포, 조직, 질병 또는 상태는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 실시 양태에서, 복수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 정상 또는 비 병사성 세포 또는 조직 및/또는 조작된 세포 자체와 같은 세포 치료법으로 표적화하는 것이 바람직하지 않은 세포에서 또한 발현된다. 이러한 실시양태에서, 세포의 반응을 달성하기 위해 다중 수용체의 연결을 요구함으로써, 특이성 및/또는 활성이 달성된다.
B. 유전 공학을 위한 세포와 세포의 준비
제공된 방법에 의해 투여되는 수용체를 발현하는 세포 중에는 조작된 세포가 있다. 유전공학은 일반적으로 레트로 바이러스 형질 도입, 형질주입 또는 형질 전환에 의해 재조합 또는 조작된 성분을 코딩하는 핵산을 세포를 포함하는 조성물로 도입하는 것을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 핵산은 이종성이며, 즉 예를 들어, 조작되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 것 같은 다른 생물 또는 세포로부터 얻은 것과 같은 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 통상적으로 존재하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 코딩하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하여 자연계에서 발견되지 않는 핵산과 같이 자연 발생적 핵산은 아니다.
세포는 일반적으로 포유류 세포와 같은 진핵 세포이고, 전형적으로 인간 세포이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되며, 타고난 면역 또는 적응 면역의 세포, 예를 들어 림프구를 비롯한 골수 또는 림프 세포, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 다른 예시적인 세포는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSCs)를 포함하여 다분화능 및 다능성 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함한다. 세포는 전형적으로 대상으로부터 직접 단리된 및/또는 대상으로부터 단리되고 동결된 것과 같은 일차세포이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 T 세포의 하나 이상의 서브 세트 또는 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이들의 모집단과 같은 다른 세포 유형, 예를 들어 기능, 활성화 상태, 성숙도, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토 카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의존적일 수 있다. 치료될 대상과 관련하여, 세포는 동종 및/또는 자가 조직 일 수 있다. 방법 중에는 기성품 방법이 포함된다. 기성 기술과 같은 일 측면에서, 세포는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSCs)와 같은 줄기 세포와 같은 다분화능 및/또는 다능성 세포이다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 피험자로부터 세포를 단리하고, 이들을 제조, 가공, 배양 및/또는 공학하고 동결 보존 전 또는 후에 동일 대상으로 재도입하는 것을 포함한다.
T 세포 및/또 CD4+ 및/또는CD8+ T 세포의 서브 타입 및 서브 집단 중에 줄기 세포 메모리 T (TSCM), 센트럴 메모리 T (TCM), 이펙터 메모리 T (TEM), 또는 말단분화 이펙터 메모리 (terminally differentiated effector memory) T 세포, 종양-침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocytes, TIL), 미성숙 (immature) T 세포, 성숙 (mature) T 세포, 도움 (helper) T 세포, 세포독성 (cytotoxic) T 세포, 점막 관련 불변 T (mucosa-associated invariant T, TMAIT) 세포, 자연적으로 발생하는 및 적응 조절 (adaptive regulatory) T (Treg) 세포, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 폴리큘러 도움 (follicular helper) T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마T 세포와 같은 도움 T 세포와 같은 천연의 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), m메모리 T 세포 및 이의 서브-타입이다.
일부 실시 양태에서, 세포는 천연 킬러 세포(NK cells)이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 단핵 세포 또는 과립구, 예를 들어 골수 세포, 대 식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다.
일부 실시 양태에서, 세포는 유전 공학을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고, 이에 의해 그러한 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현한다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 이종성이며, 즉 예를 들어, 조작되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 세포는 다른 유기체 또는 세포로부터 얻어진 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 통상적으로 존재하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 코딩하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하여 자연계에서 발견 되지 않는 핵산과 같이 자연 발생적 핵산은 아니다.
일부 실시 양태에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조단계를 포함한다. CAR과 같은 형질전화 수용체를 코딩하는 핵산 도입용 세포는 생물학적 샘플, 예를 들어 대상으로부터 수득되거나 이로부터 유도된 샘플과 같은 샘플로부터 분리 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포가 단리된 대상은 질환 또는 증상를 가지거나 세포 치료가 필요하거나 세포 치료가 투여될 대상이다. 일부 실시 양태에서 환자는 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 적용 세포 치료와 같은 특정 치료적 중재가 필요한 인간이다.
따라서, 일 실시예에서 세포는 일차 세포, 예컨대 일차 인간 세포이다. 샘프에는 분리, 원심 분리, 유전공학 (예를 들어, 바이러스 벡터를 이용한 형질 도입), 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 처리 단계에서 생성도니 샘플뿐만 아니라 조직에서 추출한 조직, 유체 및 기타 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 소스 또는 처리된 샘플에서 직접 얻은 샘플 일 수 있다. 생물학적 시료로는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플(이로부터 추출한 가고 샘플 포함)과 같은 체액이 있으나 이에 국한되지 않는다.
일 측면에서, 세포가 유래되거나 분리되는 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이고, 또는 성분채집술 또는 백혈구 추출물에서 유래된 것이다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 다른 기관에서 유래된 세포, 및/또는 이로부터 유래된 세를 포함한다. 샘플은 세포 치료와 관련하여, 예를 들어, 적용 세포 치료, 자가 및 동종 원천으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 세포는 세포주, 예를 들어 T 세포주에서 유래한다. 일부 실시 양태에서 세포는 이종의 소스, 예를 들어 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 실시 양태에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성에 기초한 세포 분리 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 세포를 세척, 원심 분리 및/또는 하나 이상의 시약의 존재 하에, 예를 들어 원하지 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 풍부하게하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 시키거나 제거하기 위해 배양한다. 일 실시예에서, 세포는 밀도, 부착 성질, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 분리된다.
일 예를 들어, 환자의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 제거에 의해 얻어진다. 샘플에는 T 세포, 단핵 세포, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 일부 림프구가 포함되어 있으며 일부 측면에는 적혈구 및 혈소판 이외의 세포가 포함되어 있다.
일부 실시 양태에서, 환자로부터 수집된 혈액 세포를 세척하여 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 위치시킨다. 일부 실시 양태에서, 세포는 인산 환충 식염수 (PBS)로 세척한다. 일부 실시 양태에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수 또는 모든 2가 양이온이 부족하다. 일 측면에서 세척 단계는 반자동 “플로우 스루(flow-through)" 원심 분리기 (예를 들어, the Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 제조사의 지침에 따라 수행한다. 일 측면에서, 세척 단계는 제조사의 지시에 따라 접선 유동 여관 (TFF)에 의해 수행된다. 일부 실시 양태에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca++/Mg++ 없 PBS에 재현탁된다. 일 구체양태에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁한다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 적혈구를 용해시켜 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통해 원심 분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리방법을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 단리 방법은 표면 마커, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 분리는 친화도 또는 면역 친화성-기재분리이다. 예를 들어, 일 측면에서 단리는 세포의 예를 들어, 그러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의해, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하며, 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합한 세포를 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다.
이러한 분리 단계는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 보유되는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 보유된 양성 선택 및/또는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일 예에서, 두 분획은 추후 사용을 위해 보유된다. 일 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어, 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발견된 마커에 기초하여 분리가 가장 잘 수행된다.
분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100 % 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 또는 풍부화는 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 말하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 없게 할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선별, 제거 또는 고갈은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 의미하지만 그러한 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.
일 예에서, 한 번의 단계로부터 양 또는 음으로 선택된 분획이 후속적인 양성 또는 음성의 선택과 같은 다른 분리 단계를 거치는 다중 단계의 분리 단계가 수행된다. 일 예에서, 단일 분리 단계는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 항온 처리함으로써, 복수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있으며, 각각은 음성 선택을 목표로 하는 마커에 특이적이다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 배양함으로써 동시에 양성으로 선택 될 수 있다.
예를 들어 일 측면에서, 양성이거나 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 높은 수준을 발현하는 세포와 같은 T 세포의 계군 (subpopulation)은 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 분리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 접한된 자기 비드 (e.g., DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T 세포 확장기)를 사용하여 적극적으로 선택될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 단리는 음성 선택에 의한 양성 선별 또는 특정 세포군의 고갈에 의해 특정 세포 집단에 대한 농충에 의해 수행된다. 일부 실시 양태에서, 양성 또는 음성 선별는 양성 또는 음성으로 선택된 세포 상에 상대적으로 높은 수준 (마커하이(hight))으로 발현되거나 발현되는 하나 이상의 표면 마커 (마커+)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션시킴으로써 달성된다.
일부 실시 양태에서, T 세포는 B 세포, 단구 또는 CD14와 같은 다른 백혈구와 같은 비 T 세포에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선별 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성T 세포를 분리하는데 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 모집단은 하나 이상의 순진, 기억 및/또는 작동자 T 세포 하위 집단에서 상대적으로 높은 정도로 발현되거나 표현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 실시 양태에서,CD8+ 세포는 각각의 부분 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선별에 의해, 순화, 중앙 기억, 작동체 기억 및/또는 중추 성 기억 줄기 세포를 추가로 풍부하게 하거나 고갈시킨다. 일부 실시 양태에서, 중앙 메모리T (TCM) 세포에 대한 농축은 팽창 및/또는 생체 내 투여를 개선하기위한 것과 같은 하나 이상의 투여 후 매개 변수 또는 결과를 증가시키기 위해 수행되며, 일부 측면에서는 특히 이러한 하위 집단에서 강건하다. 참조 Terakura et al., Blood.1:72-82 (2012); Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012). 일부 실시 양태에서, TCM-풍부CD8+ T 세포 및CD4+ T 세포를 결합 시키는 것은 하나 이상의 투여 후 매개 변수 또는 결과를 추가로 강화시킨다.
일부 실시 양태에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브 세트에 모두 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하는 것과 같은, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 풍부하게거 하거나 고갈시킬 수 있다.
일부 실시 양태에서, 중추 신경계 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127의 양성 또는 고표면 발현에 기초하여; 일 측면에서 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 실시 양태에서 TCM 세포에 대한 풍부한 CD8+ 집답의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선별을 실시한 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행한다. 일 측면에서 이러한 선택은 동시에 수행되고 다른 측면에서는 어느 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 실시 양태에서, CD8 + 세포 집단 또는 부분 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 하위 집단을 생성 시키는데 사용되어 CD4- 기반 분리의 양성 및 음성 분획 선택적으로 하나 이상의 추가의 양성 또는 음성 선별 단계에 후속하여, 방법의 후속 단계에서 보유되고 사용된다.
특정 예에서, PBMCs 또는 다른 백혈구 샘플의 시료는 CD4+ 세포의 선택에 종속되며, 여기서 양성 및 양성 분획 모두가 유지된다. 이어서, 음성 분획을 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초한 음성 선별 및 양성 및 음성 선별이 어느 순서로 수행되는지에 대한 CD62L 또는 CCR7와 같은 중앙 메모리 T 세포의 표지 특징에 기초한 양성 선별을 실시한다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 가진 세포 집단을 확인함으로써 순진하고 중앙 기억 및 효과 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 얻을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 천연의 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 실시 양태에서, 중앙 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 실시 양태에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO- 이다.
일 예에서, 음성 선택에 의한 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리를 허용하기 위해 자기 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 세포 및 세포 집단은 면역 자기(또는 친화력 자기) 분리 기술을 사용하여 분리 또는 단리 된다(reviewed in Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒHumana Press Inc., Totowa, NJ).
일 측면에서, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 상자성 비드 (예를 들어, Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같은 자기적으로 반응하는 입자 또는 미세 입자와 같은 작고 자화 가능한 또는 자기적으로 반응하는 물질로 배양된다. 자기 반응 물질, 예를 들어, 입자는 세포, 세포 또는 분리하고자하는 세포 집단 상에 존재하는 분자, 예를 들어, 표면 마커에, 예를 들어, 음성 또는 양성으로 선발하는 것이 바람직하다는 것을 의미, 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합 파트너에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 실시 양태에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재에 결합된 자기 반응 물질을 포함한다. 자기 분리 법에 많이 사용되는 자기 반응 재료가 있다. 적합한 자기 입자는 Molday, 미국 특허 번호 4,452,773, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 개시되어 있으며, 이는본원에 참고로 인용된다. Owen U.S. 미국 특허 번호 4,795,698, 및 Liberti et al., 미국 특허 번호 5,200,084에 기재된 것과 같은 콜로이드 상 입자는 다른 예이다.
일반적으로 배양은 샘플 내의 세포에 존재하는 경우, 자성 입자 또는 비드에 결합된 항체 또는 결합 파트너 또는이 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 이차 항체 또는 다른 시약과 같은 분자가 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에서 수행된다.
일 측면에서, 샘플은 자기장에 놓이며, 자기적으로 반응하는 또는 자화 가능한 입자가 부착된 세포는 자석에 끌려가서 비 표지된 세포로부터 분리될 것이다. 긍정적인 선택의 경우, 자석에 끌리는 세포는 유지된다; 음성 선택의 경우 끌리지 않는 세포(레이블이 없는 세포)은 유지된다. 일부 실시 양태에서, 양성 및 음성 선별의 조합은 양성 및 음성 분획이 보유되고 추가 처리되거나 추가 분리 단계에 종속되는 동일한 선별 단계에서 수행된다.
일부 실시 양태에서, 자기적 응답 입자는 1 차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘에 코팅된다. 일부 실시 양태에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 일부 실시 양태에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포-유형 특이적인 2차 항체 또는 다른 결합 파트너 (예를 들어, 스트렙타빈)-코팅 자성 입자가 첨가된다. 일부 실시 양태에서, 스트렙타비딘-코팅 자성 입자는 바이오티닐화된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 실시 양태에서, 자기적으로 반응하는 입자는 후속 배양, 배양 및/또는 조작되는 세포에 부착된 채로 남게된다; 일부 실시 양태에서 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 실시 양태에서, 자화 가능 또는 자기적으로 반응하는 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어, 경쟁하는 비 표지된 항쳉 및 자화 가능한 입자 똔느 절단 가능한 리어에 접합된 항체를 포함된다. 일부 실시 양태에서, 자화 가능한 입자는 생분해성이다.
일부 실시 양태에서, 친화도-기재 선택은 자기-활성화 세포 분류 (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. 자기화성화 세포 분류 (MACS) 시스템은 자화된 입자가 부착되 세포를 고 순도로 선택할 수 있다. 일부 실시 양태에서, MACS는 비 표적종 및 표적종을 외부 자기장의 적용 후에 순차적으로 용출시키는 모드로 작동한다. 즉 자화된 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 화학종이 용리되는 동안 제 위치에 유지된다. 이어서, 이 첫 번째 용출 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되어 용출되는 것을 방지 한 종을 용리 및 회수 할 수 있는 방법으로 자유롭게 한다. 일부 실시 양태에서, 비 표적 세포는 표적화 되고 세포의 이종 집단으로부터 고갈된다.
일부 실시 양태에서, 추출 또는 분리는 세포 준비, 분리, 처리, 항온 배양, 배양 및/또는 방법의 제형 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 장치 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일 측면에서, 시스템은 폐쇄, 무균 환경, 예를 들어, 에러, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 이들 단계 각각을 수행하는데 사용된다. 일 예에서, 시스템은 PCT 출원 번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380 A1에 기재된 것과 같은 시스템이다.
일 실시예에서, 시스템 또는 장치는 자동화된 또는 프로그래밍 가능한 방식으로, 하나 이상의, 예를 들어 모든 분리, 처리, 엔지니어링 및 제형 단계를 수행한다. 일 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 프로세싱, 격리, 엔지니어링 및 제형 단계의 결과를 프로그램, 제어, 평가 및/또는 조정할 수 있게 하는 시스템 및/또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일 측면에서, 분리 및/또는 다른 단계는 ClinMACS 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여, 예를 들어 밀폐된 및 멸균 시스템에서 임상 규모의 세포의 자동화된 분리를 위해 수행된다. 구성 요소에는 통합 마이크로 컴퓨터, 자기 분리 장치, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브가 포함될 수 있다. 일 측면의 통합 컴퓨터는 계측기의 모든 구성 요소를 제어하고 표준화된 순서로 반복적인 절차를 수행하도록 시스템에서 지시한다. 일 측면에서 자기 분리 유닛은 이동 가능한 영구 자석 및 선택 컬럼용 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 배관 세트 전체의 유속을 제어하며 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름과 세포의 지속적인 정지를 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일 측면에서 멸균 비 발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자성 입자를 사용한다. 일부 실시 양태에서, 자성 입자로 세포를 표지한 후, 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서 세포 준비 백을 튜빙 세트에 연결하고, 버퍼 세트 및 세포 수집백을 연결한다. 튜빙 세트는 프리-컬럼과 분리 컬럼을 포함하여 미리 조립된 무균 튜빙으로 구성되어 있으며 일회용으로만 사용된다. 분리 프로그램을 시작하면 시스템이 자동을 세포 샘플을 분리 컬럼에 적용한다. 표지된 세포는 컬럼 내에 보유되는 반면, 표지되지 않는 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 지답은 표지되지 않고 칼럼에 보유되지 않?다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 컬럼에 보유된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 후 컬럼으로부터 용리되어 세포 수집 백 내에 수집된다.
특정 실시양태에서, 분리 및/또는 다른 단계는CliniMACS Prodigy 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 원심 분리에 의한 세포의 자동화된 세척 및 분별을 가능하게 하는 세포 처리 단일체를 갖추고 있다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템에는 소스 세포 생성물의 거시적층을 식벼하여 최적의 세포 분획 종말점을 결정하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트 웨어가 포함될 수 있다. 예를 들어 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 세포 분화 및 팽창, 항원 로딩 및 장기 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 수행하는 일체형 세포 배양 챔버를 포함 할 수 있다. 입력 포트는 멸균 제거 및 매체의 보충을 허용할 수 있으며, 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터할 수 있다. 예를 들어, 참조 Klebanoff et al., J Immunother. 35(9): 651-660 (2012), Terakura et al., Blood.1:72-82 (2012), 및 Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012).
일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 세포 집단은 유동 세포 계측법을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되며, 여기서 다수의 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포는 유체 스트림으로 운반된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 세포 집단은 예비 스케일 (FACS)-분류를 통해 수집 및 농축 (또는 고갈)된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 조합된 마이크로 전자 기계 시스템 (MEMS) 칩의 사용에 의해 수집 및 농축 (또는 고갈)된다. (예를 들어, 참조 WO 2010/033140, Cho et al., Lab Chip 10, 1567-1573 (2010); 및 Godin et al., J Biophoton. 1(5):355-376 (2008). 두 경우 모두 세포를 여러 마커로 분류하여 잘 정의된 T 세포 하위 세트를 고 순도로 분리 할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 카로 표지되어 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지된 항체와의 결합에 기초 할 수 있다. 일 예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적ㅇ니 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 형광-활성 세포 분류 (FACS)을 포함하는 분취용 (FACS) 및/또는 미세 전자 기계 시스템 (MEMS) 칩, 예를 들어 유동 세포 계측 탐지 시스템과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 방법은 동시에 여러 마커를 기반으로 긍정적이고 부정적인 선택을 허용한다.
일부 실시 양태에서, 제조 방법은 단리, 항온 처리 및/또는 조작 전 또는 후에 세포를 동결, 예를 들어 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 동결 및 후속 행동 단계는 과립구 및 어는 정도는 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 실시 양태에서, 세포는 예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에 냉동 용액에 현탁된다. 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터가 사용될 수 있다. 일예로 20 % DMSO 및 8 % 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO와 HSA의 최종 농도가 각각 10 %와 4%가 되도록 배지로 1 : 1로 희석한다. 이어서, 세포를 일반적으로 분당 1°의 속도로 -80 ℃로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장한다.
일부 실시 양태에서, 세포는 유전 공학 전에 또는 유전 공학과 관련하여 배양 및/또는 배양된다. 배양 단계는 배양(culture), 배양(cultivation), 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함 할 수 있다. 배양 및/또는 조작은 배양 용기 또는 세포 배양을 위한 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 백 또는 기타 용기와 같은 배양 용기에서 수행 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 배양된다. 그러한 조건은 집단 내에서 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전 공학을 위해 세포를 준비하는 것을 포함한다.
조건은 하나 이상의 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체, 및 세포를 활성화 시키도록 고안된 임의의 다른 제제를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 자극 조건 또는 작용제는 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 영역을 활성화 시킬 수 있는 하나 이상의 약제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 일 측면에서, 상기 약제는 T 세포에서 TCR/CD 3세포 내 신호 전달 계통을 작동시키거나 개시시킨다. 이러한 제제는 TCR, 예를 들어 항-CD3에 특이적인 것과 같은 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 자극 조건은 하나 이상의 약제, 예를 들어 보조 자극 수용체를 자극 할 수 있는 리간드, 예를 들어 항-CD28을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 이러한 제제 및/또는 리간드는 비드 및/또는 하나 이상의 사이토카인과 같은 고체 지지체에 결합 될 수 있다. 선택적으로 상기 확장 방법은 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양 배지에 (예를 들어, 적어도 약 0.5 ng/ml 농도로) 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 자극제는 IL-2 및/또는IL-15, 예를 들어, 적어도 약 10 유닛/mL의 IL-2 농도를 포함한다.
일 측면에서, 배양 기술은 미국 특허번호 6,040,1 77 to Riddell et al., Klebanoff et al., J Immunother. 35(9): 651-660 (2012), Terakura et al., Blood.1:72-82 (2012), 및/또는Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012)에 기재된 기술에 따라 수행된다.
일부 실시 양태에서 상기 T 세포는비분 할 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 같은 배양 개시 조성물 피더 세포에 첨가함으로써 확대 된다 (예를 들어, 결과적인 세포 집단이 신장 될 초기 집단에서 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 이상의 PBMC 공급 세포를 포함하도록); 세포의 배양 (예를 들어, T 세포의 수를 확장시키기에 충분한 시간 동안). 일 측면에서, 비 분할 피더 세포는 감마-조사 PBMC 피더세포를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위의 감마선으로 조사된다. 일 측면에서, 피더 세포는 T 세포 집단을 첨가하기 전에 배양 배지에 첨가된다.
일 측면에서, 자극 조건은 간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃, 일반적으로 약 30℃ 및 일반적으로 약 37℃를 포함한다. 선택적으로, 배양은 피더 세포로서 비 분할 EBV-형질 전환 림프구 세포 (LCL)를 첨가하는 것을 추가로 포함 할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rad의 범위의 감마선으로 조사 될 수 있다. 일 측면에서의 LCL 피더 세포는 초기 T 림프구에 대한 LCL 피더 세포의 비율이 적어도 약 10 : 1과 같은 임의의 적합한 양으로 제공된다.
일부 실시 양태에서, 항원-특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은 항원 특이적 T 세포는 항원으로 순수 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극함으로써 수득된다. 예를 들어, 항원 특이적인 T 세포주 또는 클론은 감염된 피험자로부터 T 세포를 분리하고 시험 관내에서 동일한 항원으로 세포를 자극함으로써 사이토 메갈로 바이러스 항원에 생성될 수 있다.
C. 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자의 변형된 발현
일 측면에서, 트립토판 기아 결핍 또는 기능 부전에 대한 감지 또는 반응과 관련된 및/또는 IDO 매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자 (예를 들어, 단백질)의 발현이 변형된 재조합 수용체 발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포) IDO 매개 대사에 의해 양성 또는 음성으로 조절되는 분자, 예를 들어 트립토판 부족 또는 키누레닌 축적 또는 다른 트리토판 대사물를 포함하여 키누레닌 매개 면역 억제를 감지하거나 반응하는 유전자 조작된 세포가 제공된다. 일 측면에서, 변형은 트립토판 섭취, 수송 및/또는 대사에 관여하는 분자(예를 들어, 단백질)의 발현을 수반한다.
일부 실시 양태에서, 분자는 감소된 발현 또는 활성은 세포의 면역 억제 활성을 유도하거나, 관련되거나, 또는 면역 억제 활성을 촉진시키는 IDO 매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 불충분 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 반응하여 감소 또는 저해되는 분자와 같은 IDO 매개 이화 작용에 의해 음성적으로 조절되는 분자이다. 그러한 단백질의 예로는 IDO 매개 대사 (metz et al. (2012) Oncoimmunology, 1 : 1460-1468 참조)에 반응하여 저해되는 단백질 인 mTOR 및 PKC 세타가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 예로는 환경으로부터 아미노산 영양소의 섭취에 관여하는 L-형 아미노산 수송체 (LATs)와 같은 아미노산 수송체 (Wang 등 (2015) Am J Cancer Res 5 (4) : 1281-1294)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 제공되는 유전자 조작된 세포는 IDO 매개된 대사 작용에 의해 음성적으로 조절되는 단백질의 재조합, 조작 또는 이소성 발현에 의해, 예를 들어 단백질을 코딩, 예를 들어 mTOR 또는 PKC-θ 인코딩하는 외인성 핵산을 세포 내로 도입함으로써 변형된다. 일부 실시 양태에서, 제공된 유전자 조작된 세포는 아미노산 수송체, 예를 들어 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-타입 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및/또는 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4).와 같은 낮은 수준의 아미노산을 포함 할 수 있는 미세 환경으로부터 트립토판과 같은 아미노산의 섭취를 증가시킬 수 있는 분자의 재조합, 조작 또는 이소성 발현에 의해 변형 된다.
일부 실시 양태에서, 상기 분자는 세포에서의 발현, 활성 또는 수송이 IDO 매개 면역 억제 신호, 트립토판 기아 결핍 또는 불충분 및/또는 세포의 면역 억제 활성을 유도하거나, 세포 내 면역 반응을 일으키거나 또는 면역 억제 활성을 촉진하는 발현, 활성 또는 수송을 증가시키거나 촉진시키는 키누레닌 매개 면역 억제에 반응하여 증가되거나 촉진되는 분자와 같은 IDO 매개 면역 억제 신호, 트립토판 기아 결핍 또는 불충분에 의해 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 반응하여 양으로 조절되는 분자이다. 이러한 단백질의 예로는 이에 제한되지 않으나 GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2를 포함한다. 예를 들어 GCN2은 IDO 매개 트립토판 분해시 활성화되는 스트레스 키나아제 경로에 관여한다 (Sucher et al. (2010) Int. J. Tryptophan Res., 3:113-120). 일부 실시 양태에서, 제공된 유전자 조작된 세포는 GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2를 코딩하는 유전자의 감소된 또는 파괴돈 발현에 의해 변형된 것과 같은 이러한 단백질을 코딩하는 유전자의 감소된 또는 파괴돈 발현에 의해 변형된다.
일 측면에서, 종양 세포 또는 암세포는 LAT1/CD98hc 또는 LAT2/CD98hc와 같은 트립토판 수송체와 같은 아미노산 수송체의 발현을 높게 발현하거나 상향 조절하여 아미노산, 예를 들어 트립토판의 환경에서의 섭취를 증가시킬 수 있고, 트립토판-결핍 상태를 생성하여 항-종양 면역 반응을 회피하기위한 메커니즘으로서 면역 세포, 예를 들어, T 세포의 증식을 방해할 수 있다 (참조, 예를 들어Broer et al. (2011) Biochem. J. 436, 193-211; Wang et al. (2015) Am J Cancer Res 5(4):1281-1294; Ribas, A. (2015) Cancer Discov. 5(9): 915-919). 일부 실시 양태에서, 세포 치료를 위해 투여된 세포, 예를 들어, 적용 세포 치료는은 트립토판 기아 결핍 또는 부전에 대한 감지 또는 반응 및/또는 예를 들어 GCN2, CCAAT /인핸서 결합 단백질-상동성 단백질 (CHOP), Blimp-1, AHR 또는 ARNT의 키누레닌-매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO-매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 분자의 발현을 감소 및 아미노산 수송체 (들)의 재조합 발현 또는 과발현과 같은 환경에서 생존, 경쟁 또는 증식을 위해 설계 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 증가된 수준의 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4를 갖는 종양 또는 암을 갖는 대상체는 본원에 기재된 방법, 세포, 조성물 및/또는 키트 중 임의의 것의 치료를 위해 동정되거나 선택될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응 및/또는 IDO 매개 대사에 의해 양성 또는 음성적으로 조절되는 분자, 예를 들어 트립토판의 불충분 또는 키누레인 또는 다른 트립토판 대사물의 축적를 포함하는 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 분자(예를 들어, 단백질)의 변형은 분자의 이소성 또는 재조합 발현을 위한 핵산, 또는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 코딩하는 핵산과 함께 분자를 코딩하는 유전자를 억제, 발현을 감소시키거나 또는 조작 할 수 있는 핵산을 조작 대상 세포로 도입함으로써 수행 된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 및 분자 또는 그의 일부를 코딩하는 제 2 핵산, 또는 분자의 발현을 변형시킬 수 있는 제제 (예를 들어, 분자의 발현을 감소시킬 수 있거나 분자를 코딩하는 유전자를 파괴 할 수 있는 제제)가 세포 내로 도입된다.
일부 실시 양태에서, 재조합 수용체를 코딩하는 핵산 및 분자 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산 또는 분자의 발현을 변형시킬 수 있는 제제는 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 폴리 뉴클레오타이드 및/또는 벡터, 어떤 조합 또는 배열에 포함 될 수 있다. 벡터는 바이러스 벡터 및 발현 벡터를 포함하여 본원에 기재된 임의의 벡터일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 제 1 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 구조체는 재조합 수용체를 코딩하는 핵산을 함유하고 제 2 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 구조물은 재조합 수용체를 코딩하는 핵산 및 분자 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산 또는 분자의 발현을 변형시킬 수 있는 제제를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 분자의 발현을 변형시킬 수 있는 분자 또는 하나 이상의 성분은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서 코딩될 수 있다. 재조합 수용체를 코딩하는 핵산 및 분자 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산 또는 분자의 발현을 변형시킬 수 있는 제제는 하나의 폴리뉴클레오티드에서 각각 발현을 위한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 하나의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 각각의 폴리뉴클레오티드는 멀티 시스트론성일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 각각은 표면 마커, 예를 들어 절단된 EGFR (tEGFR) 또는 Thy1.1과 같은 하나 이상의 마커를 또한 코딩 할 수 있다. 2개의 이상의 폴리뉴클레오티드가 도입되는 일부 실시 양태에서, 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 표면 마커를 코딩할 수 있다.
또한, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 구조물, 예를 들어 상기 기재된 것을 포함하는 조성물이 제공된다. 폴리뉴클레오티드, 벡터, 구조물 또는 조성물은 IDO 매개 대사 이상에 의해 양성 또는 음성저으로 조절되는 분자, 예를 들어, 트립토판의 결핍 또는 키누레닌 또는 다른 트립토판 대사 산물의 축적, 및/또는 그러한 분자의 발현을 변형시킬 수 있는 제제를 포함하여 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 임의의 재조합 수용체, 분자를 발현하기 위해 T 세포와 같은 세포를 조작하는데 사용될 수 있다.
1. 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현
일부 실시 양태에서, 유전적으로 조작된 세포를 제조하는 방법은 예를 들어 mTOR 또는 PKC-θ, 또는 L- 형 아미노산 수송체 (LAT)와 같은 아미노산 수송체의 IDO 매개 면역 억제 신호에 의해 음성으로 조절되는 분자, 트립토판 기아 결핍 또는 불충분 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제와 같은 트립토판 기아 결핍 또는 부전에 대한 감지 또는 반응 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 분자, 예를 들어 단백질을 재조합적으로 또는 외래적으로 세포 내에서 발현시키는 것을 포함한다. 핵산 분자, 예를 들어 핵산 분자. 아미노산 수송체 (예를 들어, CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (L-type Amino Acid Transporter 1))의 하나 이상의 사슬을 코딩하는 벡터, IDO 매개 대사 (예 : mTOR 또는 PKC-세타) (LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및/또는 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4))가 세포에 도입되며, 상기 도입은 CAR과 같은 형질 전환 수용체를 코딩하는 핵산의 도입과 동시에 또는 순차적으로 발생할 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO 매개 면역 억제 신호 전달, IDO 매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질, 예컨대 트립토판 기아 결핍 또는 불충분에 대한 감지 또는 반응 및/또는 키누레닌 매개에 의한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 불충분 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 의해 부정적으로 조절되는 것과 같은 면역 억제는 mTOR 또는 기능적 단편 또는 기능적 변이체 또는 기능적 단편 또는 기능적 변이체 또는 촉매 활성인 부분 및/또는 IDO 매개 면역 억제 신호, 트립토판 기아 결핍 또는 불충분 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 의해 발현 또는 활성이 음으로 조절 (예를 들어, 감소)되는 부분을 포함한다. mTOR의 이소성 발현을 코딩하는 플라스미드 또는 벡터는 공지되어 있고 표준 재조합 DNA 기술 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 구입될 수 있다 (참조, 예를 들어 Zhao et al. (2016) Nature Communications, 7:11309; Dressen et al. (2010) Biotechnolgoy and Bioengineering, 108:853-866). 일부 실시 양태에서, mTOR은 서열 번호 20번에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열 번호 20번의 서열 동일성을 나타내는 아미노산을 포함하거나, 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 실시 양태에서, mTOR는 서열 번호 21에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열 번호 21 번, 서열 상동성을 나타내는 뉴클레오티드를 코딩하거나, 이의 기능적 단백질 변이체 또는 단편을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, mTOR은 인간 단백질이다.
일부 실시 양태에서, IDO 매개 면역 억제 신호에 관여하는 트립토판 고갈 또는 불충분에 대한 감지 또는 반응 및/또는 IDO 매개 면역 억제에 의해 부정적으로 조절되는 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질 신호 전달, 트립토판 기아 결핍 또는 불충분 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제는 기능적 단편 또는 기능적 변이체 또는 촉매 활성 인 부분 및/또는 표정 또는 활성이 IDO-1에 의해 부정적으로 조절 (예를 들어, 감소)되는 PKC-세타 또는 기능적 단편 또는 기능적 변이체 또는 그 일부이거나, 트립토판 고갈 또는 불충분 및/또는 키누레닌-매개 면역 억제를 포함한다. PKC- 세타의 이소성 발현을 코딩하는 플라스미드 또는 벡터는 공지되어 있고 표준 재조합 DNA 기술 방법에 의해 제조되거나 상업적으로 구입될 수 있다 (참조, 예를 들어 Belguise et al. (2012) Oncogene, 31:4889-4897; Wing-yiu et al. (2010) J Biol. Chem., 285:23889-98). 일 측면에서, PKC-세타는 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 이상의 서열번호 22의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나, 이의 기능적 단편이다. 일부 실시 양태에서, PKC-세타는 서열번호 23에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클로레오티드 서열, 또는 이의 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 이상의 서열번호 23의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 코딩하거나, 이의 기능적 단백질, 변이체 또는 단편을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, PKC-세타는 인간 단백질이다.
일부 실시 양태에서, IDO 매개 면역 억제 신호 전달, IDO 매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질, 예컨대 트립토판 기아 결핍 또는 불충분에 대한 감지 또는 반응 및/또는 키누레닌 매개에 의한 감지 또는 반응과 관련된 IDO 매개 면역 억제 신호에 의해 부정적으로 조절되는 면역 억제, 트립토판 기아 결핍 또는 불충분 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제는 아미노산 수송체, 예를 들어 트립토판 수송체이거나 또는 이를 포함한다. TME에서, 암 또는 종양 세포 또는 "방관자 (bystander)"세포에 의한 IDO1 및/또는 아미노산 전달체의 상향 조절은 아미노산 결핍 상태, 예를 들어 트립토판 고갈 상태를 초래할 수 있다. 따라서, 조작된 T 세포와 같은 면역 세포의 증식 및/또는 기능은 미세 환경에서 충분한 트립토판의 부족으로 인해 억제될 수 있다. 면역 세포에서 재조합 또는 이형으로 발현하는 분자, 예를 들어, 아미노산 전달체는 면역 세포가 트립토판 기아 또는 부적응에 반응하도록, 예를 들어 IDO1의 활성 및/또는 종양 또는 암세포 및/또는 구경꾼 세포에 의한 아미노산 전달체의 상향 조절에 의해 생성된 아미노산 결핍 환경에서 트립토판 또는 다른 아미노산의보다 효율적인 흡수에 의해 조절되도록 허용할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 조작된 세포는 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 전달체 1 (LAT1; SLC7A5), L-아미노산 전달체 1 (LAT1), LAT2 (SLC7A8) 및/또는 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4).로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 수송체 또는 하나 이상의 아미노산 수송체를 재조합 또는 이형으로 발현하도록 조작된다.
일부 실시 양태에서, 트립토판 기아 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관려된 분자, 예를 들어 단백질은 아미노산 수송체이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 SLC(용질 캐리어) 패밀리 수송체이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 트립토판 수송체이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 아르기닌 수송체이다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 이종 아미노산 수송체(HAT)이다. HATs는 1:1 화학량 론을 가진 아미노산 역수송체(교환기)이다. 일부 실시 양태에서, HAT는 보존된 이황화물 브릿지에 의해 연결된 중쇄 (SLC3 패밀리) 및 경쇄 (SLC7 패밀리)로 구성된다. 일반적으로 중쇄는 홀로 운반자의 멤브레인으로의 수송(trafficking)에 필수적이며 경쇄는 수송체 기능을 촉매한다. 전형적으로 인간은 2 개의 중쇄 : rBAT (SLC3A1이라 불리는 넓은 특이성 중성 또는 양이온 성 아미노산 수송과 관련된, 서열 번호 36에 기재되어있는 예시적인 서열) 및 4F2hc (4F2 세포 표면 항원 중쇄; CD98 중쇄 또는 SLC3A2, 서열 번호 37에 제시된 예시적인 서열)을 인간 SLC3 패밀리에 포함한다. 중쇄 (SLC3) 구성원은 단일 막 횡단 도메인 세그먼트, 세포 내 N-터미널 및 큰 세포 밖의 C 말단을 갖는 II 형 막 N-당 단백질이다. 전형적으로 인간에서 6 개의 SLC7 구성원 (LAT1 (SLC7A5), 서열 번호 38에 기재되어 있는 예시 서열), LAT2 (SLC7A8, 서열 번호 39에 기재되어 있는 예시 서열), y+LAT1 (SLC7A7), y+Asc-1 (SLC7A10, 서열 번호 40에 기재되어 있는 예시 서열) 및 xCT (SLC7A11))는 4F2hc와 헤테로 이합체화된다. 경쇄 (SLC7) 멤버는 12-막 횡단 도메인 토폴로지를 가지며 박테리아 아미노산 전달체와 상동성을 갖는다 (참조, 예를 들어, Broer et al. (2011) Biochem J. 436, 193-211; Wang et al. 2015) Am J Cancer Res 5 (4) : 1281-1294). 또한 참조 Lin et al., Neoplasia. 2004 Jan; 6(1): 74-84; Barollo et al., PLoS One. 2016; 11(5): e0156044.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 L-형 아이노산 수송체 (LAT) 이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 4F2hc (CD98hc)/LAT1 헤테로 다이머 또는 L- 형 수송 시스템 (큰 중성 아미노산, 예를 들어, 류신을 수송한다)을 형성하는 4F2hc (CD98hc)/LAT2 헤테로 다이머를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 4F2hc (CD98hc)/Asc-1 헤테로 다이머 또는 ASC 수송체 (알라닌, 세린 및 시스테인에 대한 선호성을 갖는 수송체)를 형성할 수 있는 Asc-2를 포함하는 헤테로 다이머를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 SLC6 계열 수송체이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 SLC6A14 (ATB0, +; 서열 번호 41에 제시된 예시적인 서열), 중성 및 양이온 성 아미노산 (시스템 B0, +)에 대한 운반체, 또는 SLC6A19 (B0AT1, 넓은 뉴트럴 (0) 아미노산 수송체 1, 서열 번호 42에 기재된 예시 서열) 이고, 이것은 1 개의 Na +로 동시에 수송되는 16 개의 모든 중성 아미노산을 수송한다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 TAT1 (모노 카르복실레이트 수송체 10 또는 SLC16A10으로도 알려짐: 서열 번호 43에 기재된 예시적인 서열)과 같은 아미노산 수송 체는 T-타입 수송체 (방향성 아미노산에 대한 수송체)이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 SLC36 패밀리 수송체이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 프로톤에 대한 평형 수송체 및 양성자 수송에 커플링되지 않은 트립토판을 포함하는 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4로도 알려짐; 서열 번호 44에 기재되어있는 예시적인 서열)이다.
일부 실시 양태에서, 분자, 예를 들어 IDO 매개 면역 억제 신호, 트립토판 기아 결핍 또는 불충분 및/또는 키누레닌 매개 면역 억제에 의해 부정적으로 조절되는 것과 같은 IDO 매개 면역 억제 신호 전달, IDO 매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응 및/또는 키누 레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 단백질은 아미노산 수송체, 예를 들어 서열 번호 36 내지 44에 기재된 아미노산 서열 또는 기능적 변이체 또는 이의 일부를 포함하는 아미노산 수송체, 예를 들어 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열번호 36 내지 44의 서열과 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 서열번호 36 내지 44에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 변이체 또는 그 일부를, 예를 들어 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열번호 36 내지 44의 서열 동일성을 나타내거나, 그 기능적 단백질, 변이체 또는 단편을 코딩하는 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 인간 단백질 또는 이의 변이체이다.
일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 서열번호 36 또는 37에 개시된 아민노산 서열, 또는 기능적 변이체, 또는 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 또는 그 이상의 서열번호 36 또는 37의 서열 상동을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 헤테로다이머이고, 서열번호 38 내지 40에 개시된 아미노산 서열 중 임의의 하나, 또는 기능적 변이체, 또는 5 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 또는 그 이상의 서열번호 38 내지 40의 서열 상동을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (예를 들어, LAT1, LAT2 또는 Asc-1)이다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체(들)은 서열번호 36 또는 37에 개시된 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부, 예를 들어 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열번호 36 또는 37의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄(예를 들어, 4F2hc), 및 서열번호 38 내지 40에 개시된 아미노산 서열, 도는 기능적 변이체 또는 이의 일부, 예를 들어 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열번호 38 내지 40의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 경쇄 (예를 들어, LAT1, LAT2 또는 Asc-1)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체는 인간 단백질 도는 이의 변이체이다.
일부 실시 양태에서, 리간드, 예를 들어 재조합체, 키메라 수용체 및 IDO-매개 면역 억제 신호에 의해 음으로 조절되는 분자, 트립토판 고갈 또는 불충분과 같은 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체를 코딩하는 핵산 및/또는 키누레닌-매개 면역 억제, 예를 들어 mTOR 또는 PKC-세타 또는 이의 기능적 부분은 발현을 위해 세포 내로 도입된다. 일부 실시 양태에서, 제 1 핵산은 리간드에 특이적으로 결합하는 유전자 공학 수용체를 암호화하고, 제 2 핵산은 IDO 매개 면역 억제 시그널링, 트립토판 기아 결핍 또는 불충분 및/또는 kTure 또는 PKC-세타 또는 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 전달체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및/또는 아미노산 수송체 또는 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 수송체(들) 또는 하나 이상의 아미노산 수송체의 사슬와 같은 키누레닌 매개 면역 억제에 의해 음성으로 조절되는 분자를 암호화한다. 일부 실시 양태에서, 첫 번째, 두 번째 핵산
일부 실시 양태에서, 트립토판 고갈 또는 결핍에 대한 감지 또는 반응과 관련된 및/또는 이와 관련된 재조합, 예를 들어, 키메라, 수용체 및 분자와 같은 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체를 코딩하는 핵산, 예를 들어 아미노산 예를 들어, SLC (용질 캐리어) 패밀리 수송체 또는 이의 기능적 부분과 같은 하나 이상의 아미노산 수송체의 사슬과 같은 수송체는 발현을 위해 세포 내로 도입된다. 일부 실시 양태에서, 아미노산 수송체의 하나 이상의 사슬 또는 성분 및 유전자 조작된 수용체의 하나 이상의 성분을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 세포내로 도입된다. 예를 드어, 일부 실시 양태에서, 제 1핵산은 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체 및 CD98hc 및/또는 LAT1 또는 LAT2의 하나 이상의 사슬과 같은 아미노산 운반체의 하나 이상의 사슬을 코딩하는 제 2 핵산을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, L-형 아미노산 수송체의 하나 이상의 사슬은 예를 들어 아미노산 수송체의 하나 이상의 사슬을 코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 아미노산 수송체를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 핵산은 바이시스트로닉(bicistronic)과 같은 멀티 시스트론 (multistronic)이거나 그렇지 않으면 동일한 프로모터로부터의 둘 이상의 것과 같은 다수의 분리된 펩티드 쇄의 동시 발현을 허용한다. 일 실시예에서의 전사(transcript)는 두 개의 최종 생산물과 같이 하나이상의 최종 생산물을 코드할 수 있는 가능성이 있다. 일부 실시 양태에서, 핵산 중 적어도 하는 유전자 조작된 수용체 및 대사 경로에 관여하는 분자가 동일한 프로모터의 제어하에 발현되도록 암호화된 분자를 분리하는 내부 리보솜 결합 부위(IRES)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, “내부 리보솜 진입 부위 (IRES)"는 단백질 합성의 일부로서 메신저 RNA(mRNA) 서열의 중간에서 번역을 허용하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
일부 실시 양태에서, 핵산은 하나 이상의 리보좀 스킵 서열, 예컨대 피코르 나 바이러스 2A 리보솜 스킵 펩티드를 포함하여 2 개 이상의 펩티드 쇄 또는 다른 산물이 동일한 프로모터와 작동 가능한 연결로 발현 될 수 있지만 별도의 사슬로서 생성 될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 단일 프로모터는 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)에서 자체 절단 펩티드(예를 들어, 2A 서열) 또는 프로테아제 인식 부위 (예를 들어, 퓨린(furin)을 시퀀스 인코딩으로부터 분리된 서열2 개 또는 3 개의 유전자를 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다 (예를 들어, 대사 경로를 조절하고 재조합 수용체를 코딩하는 것과 관련된 분자를 코딩함). 단일 ORF는 하나의 폴리 펩티드를 암호화하는데, 이는 (2A의 경우) 또는 번역 후에, 개별 단백질로 가공된다. 일 경우에 있어서, T2A와 같은 펩티드는 2A 요소의 C 말단에서 펩티드 결합의 스킵 (리보좀 건너 뛰기) 합성을 일으켜 2A 서열의 말단과 다음 펩티드 사이의 분리를 유도할 수 있다 (참조, 예를 들어, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). 많은 2A 원소가 당업계에 공지되어 있다. 방법 및 핵산에서 사용될 수 있는 2A 서열의 예는 제한 없이, 구제역 바이러스 (F2A, 예를 들어, 서열 번호 : 49)로부터의 2A 서열, 말 비염 A 바이러스 (E2A, 예를 들어, 서열 번호 48), 대장균 바이러스 (T2A, 예를 들어, 서열 번호 6 또는 45), 및 미국 특허 공개 제 20070116690 호에 기술된 바와 같은 돼지 테스코 바이러스-1 (P2A, 예를 들어, 서열 번호 46 또는 47)에 개시된 바와 같다.
일부 실시 양태에서, 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체를 코딩하는 핵산 또는 mTOR 또는 PKC-세타와 같은 IDO-매개 이화 작용에 의해 음으로 조절되는 분자, 또는 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5)의 하나 이상의 아미노산 수송체(들) 또는 하나 이상의 아미노산 수송체(들) ), LAT2 (SLC7A8) 및/또는 양성자 보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)와 같은 틥토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련 분자는 동일한 또는 상이한 핵산 분자(들) 및/또는 벡터에서 발현된다. 일부 실시 양태에서, 핵산 분자는 제 1 핵산이 리간드에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 수용체를 코딩 할 수 있고, 아미노산 수송 체의 하나 이상의 사슬, 예컨대 CD98hc 및/또는 LAT1 또는 LAT2의 하나 이상의 사슬을 코딩하는 제 2 핵산을 포함 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제 1, 제 2 및/또는 제 3 핵산은 둘 이상의 개별적인 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터에 포함될 수 있다. 벡터는 바이러스 벡터 및 발현 벡터를 포함하여 본원에 기재된 임의의 벡터일 수 있다.
2. 유전자 발현의 억제, 감소 또는 파괴
일부 실시 양태에서, 유전적으로 조작된 세포를 제조하는 방법은 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현을 감소시키거나 감소시킬 수 있는 제제, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절되는 단백질과 같은, 예를 들어, GCN2, CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질(CHOP), Blimp-1, AHR, ARNT, 진핵세포 번역 개시 인자 2 α (eIF2α), 활성 전사 인자 4 (ATF4), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2를 세포 내로 도입시키는 것을 포함하며, 도입은 CAR와 같은 형질 전환 수용체를 코딩하는 핵산의 도입과 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 일부 양태에서, 제제(약제)를 포함하거나, 제제 내에 포함되거나, 또는 제제를 코딩하는 핵산 분자가 세포 내로 도입된다. 또한, 유전자 조작된 (재조합) 세포 표면 수용체를 포함하고, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된, 예를 들어 GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2와 같은, 단백질의 발현을 감소시키거나 단백질을 암호화하는 유전자에서 파괴되는 세포가 제공된다. 일부 실시 양태에서, 세포는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질의 발현을 감소시키거나 억제하는 억제성 핵산 분자와 같은 제제를 포함한다 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2). 일부 실시 양태에서, 발현, 활성 및/또는 기능은 세포에서 하나 이상의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 억제를 수행함으로써 감소된다.
일부 실시 양태에서, 유전자 억제는 녹아웃 (knock-out), 삽입, 과오(missense) 또는 이대립인자성(biallelic) 격자이동(frameshift) 돌연변이와 같은 격자이동(frameshift) 돌연변이, 유전자 전부 또는 일부(예, 하나 이상의 엑손 또는 이의 일부)의 결실 또는 녹-인(knock-in))와 같이 유전자에서 파괴를 일으킴으로써 수행된다. 일부 실시 양태에서 이러한 파괴는 DNA-결합 표적 뉴클레아제 및 징크 핑커 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)와 같은 유전자 편집 뉴클레아제를 포함하는 서열-특이적 또는 표적 뉴클라아제 및 유전자의 서열 또는 그의 일부를 표적으로 하도록 특별히 고안된 크리스퍼-관련 뉴클레아제 (Cas)를 포함하는 제제에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 서열 특이적 또는 표적 뉴클레아제는 억제성 핵산 분자에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, 이러한 뉴클레아제는 가이드 RNA (gRNA)와 같은 DNA- 결합 핵산 분자에 의해 유도되거나 표적화될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 유전자 억제는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질의 발현을 감소시키는 것에 의해 수행된다 (예, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2). 실시 양태에서, 그러한 유전자 억제는 RNA 간섭 (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 (shRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 안티센스 RNA 및/또는 리보자임과 같은 억제 성 핵산 분자를 사용하여 달성되며, 이는 유전자의 발현의 선택적 서프레스 또는 리프레스(suppress or repress)에 사용될 수있다.
siRNA 기술은 유전자로부터 전사되는 mRNA의 뉴클레오티드 서열과 상동인 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 이중 가닥 RNA 분자를 이용하는 RNAi에 기초한 것을 포함한다. siRNA는 일반적으로 유전자로부터 전사되는 mRNA의 한 영역과 상동/상보적이거나 또는 상이한 영역에 대해 상동/상보적인 복수의 RNA 분자를 포함하는 siRNA일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 유전자 억제는 가이드 RNA (gRNA)와 같은 DNA- 결합 핵산 분자, 및 효소 적으로 비활성인 Cas9 (eiCas9) 단백질 또는 eiCas9를 포함하는 융합 단백질과 같은 RNA 유도 뉴클레아제의 변이체를 사용하여 달성된다. 일부 실시 양태에서, 유전자 억제는 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 ZFP를 함유하는 융합 단백질과 같은 DNA-결합 표적 단백질에 의해 달성된다.
a. 단백질 발현의 감소
일부 실시 양태에서, 제공된 방법 및 세포는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질(예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, 진핵생물의 번역 개시 인자 2 α (eIF2α), 활성화 전사 인자 4 (ATF4), CCAAT/인핸서 결한 단백질-상동 단백질 (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκFK506-BP8, IFNγ)의 발현의 감소 또는 억제와 같은, 세포에서의 녹다운(knockdown)을 초래한다. 일부 실시 양태에서, 녹다운은 조건부(conditiona)와 같이 일시적일 수있다. 일부 실시 양태에서, 녹다운은 일시적이지 않거나 영구적이다.
일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질(예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, 진핵생물의 번역 개시 인자 2 α (eIF2α), 활성화 전사 인자 4 (ATF4), CCAAT/인핸서 결한 단백질-상동 단백질 (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκFK506-BP8, IFNγ)의 발현의 노킹 다운(knocking down), 감소 또는 억제는 RNA 간섭 (RNAi)에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시 양태에서, RNAi는 그들의 표적 핵산 서열에 대해 서열-특이적 상동성을 갖는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자에 의해 매개 될 수 있다 (Caplen , NJ, 등 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 : 9742- 9747 (2001)). 초파리 무세포 용해물 (Drosophila cell-free lysates)의 생화학적 연구는, 일부 실시 양태에서, RNA 의존성 유전자 사일런싱의 매개체가 21-25 뉴클레오티드 "작은 간섭"RNA 이중 가닥 (siRNA)임을 나타낸다. 상기 siRNA는 다이서(Dicer)로 알려진 RNase 효소에 의한 dsRNA의 가공으로부터 유도될 수 있다 (Bernstein, E. 등 , Nature 409 : 363-366 (2001)). siRNA 이중 가닥 산물(duplex products)은 RISC (RNA Induced Silencing Complex)라 불리는 다중-단백질 siRNA 복합체로 리크루트(모집)될 수 있다. 일부 실시 양태에서, RISC는 표적 핵산 (적합하게는 mRNA)으로 인도될 수 있으며, 여기서 siRNA 이중 가닥은 서열-특이적 방식으로 상호 작용하여 촉매 방식으로 절단을 매개한다 (Bernstein, E. 등 , Nature 409 : 363-366 (2001); Boutla , A., 등 , Curr . Biol. 11 : 1776-1780 (2001)). 작은 간섭 RNA는 당업계에 공지되어 있고 당업자에게 친숙한 절차에 따라 합성되고 사용될 수 있다. 작은 간섭 RNA는 약 0 내지 약 50 뉴클레오티드 (nt)를 포함한다. 비제한적인 실시 양태의 예에서, siRNA는 약 5 내지 약 40 nt, 약 5 내지 약 30 nt, 약 10 내지 약 30 nt, 약 15 내지 약 25 nt의 또는 약 20 내지 25의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, RNA 간섭제는, RNAi 메커니즘 또는 그러한 구조를 형성하기 위해 서로 하이브리화는 적어도 부분적으로 상보적인 부분을 포함하는 RNAi 메커니즘 또는 RNA 가닥을 통해 유전자 발현의 억제를 매개하기 위한 당업계에 공지된 분자의 특징적인 구조를 갖는, 적어도 부분적으로 이중-가닥 RNA이다. RNA가 서로 혼성화하는 상보적 영역을 포함할 때, RNA는 자기-혼성화(self-hybridize)라고 할 것이다. 일부 실시 양태에서, RNA 간섭제와 같은 억제성 핵산은 표적 유전자에 실질적으로 상보적인 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, RNA 간섭제는 선택적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형을 포함한다. 당업자는 RNAi 제제가 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드 또는 백본 등을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시 양태에서, RNA 간섭제는 전사 후에 변형될 수있다. 일부 실시 양태에서, RNA 간섭제는, 약 15-29 뉴클레오티드 길이 사이의 이중 부위를 포함하는 구조를 형성하도록 혼성화 또는 자기-혼성화하고, 선택적으로 이중 가닥 내에 불일치된(mismatched) 또는 쌍을 이루지 않는(unpaired) 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는, 하나 이상의 가닥을 포함한다. 일부 실시 양태에서, RNA 간섭제는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRN), 및 shRNA 를 생성하기 위해 세포 내에서 가공될 수 있는 기타 RNA 종 (자연 발생 miRNA 전구체 또는 miRNA-유사 RNA의 설계된 전구체와 동일한 RNA 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다)을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 용어 "짧은 간섭 RNA"(siRNA)는 약 15-29 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 부분을 포함하고, 한쪽 또는 양쪽 가닥에 선택적으로 단일-가닥 오버행(overhang)(예, 1-6 뉴클레오티드의 길이)을 포함하는 핵산을 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 이중 가닥 부분은 17-21 뉴클레오티드의 길이 (예를 들어, 19 뉴클레오티드의 길이)일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 오버행은 각 가닥의 3 '말단에 존재하고, 2 뉴클레오티드 길이일 수 있으며, DNA 또는 뉴클레오티드 유사체로 구성될 수있다. siRNA와 함께 혼성화하는 두 개의 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있고, 또는 대안적으로 짧은 헤어핀 RNA와 같은 자기-혼성화 부분을 포함하는 단일 RNA 가닥으로부터 생성될 수 있다. 당업자는 하나 이상의 불일치된(mismatched) 또는 쌍을 이루지 않는(unpaired) 뉴클레오티드가 2 개의 siRNA 가닥에 의해 형성된 이중 가닥에 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시 양태에서, 단일 가닥의 siRNA ("안티센스" 또는 "가이드" 가닥)은 표적 핵산, 예컨대, mRNA의 전사체와 혼성화하는 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 안티센스 가닥은 약 15-29 뉴클레오티드, 때로는 17-21 뉴클레오티드, 예를 들어 19 뉴클레오티드에 걸쳐 표적과 완벽하게 상보적이고, 이는 siRNA가 이러한 길이에 걸쳐 단일 불일치 (single mismatch) 없이 표적 전사물에 혼성화하는 것을 의미한다. 당업자는 하나 이상의 불일치된(mismatched) 또는 쌍을 이루지 않는(unpaired) 뉴클레오티드가 siRNA 가닥과 표적 전사체 사이에 형성된 이중 가닥에 존재할 수 있음을 인식할 것이다.
일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질(예. GGCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 발현은 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질(예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 핵산을 표적으로 하는 작은-헤어핀 RNA (shRNAs)를 사용하여 감소되거나 억제된다. 일부 실시 양태에서, 짧은(short) 헤어핀 RNA (shRNA)는 RNAi를 매개할 만큼 충분히 긴 (전형적으로 15-29 뉴클레오티드의 길이) 이중가닥 구조를 형성하도록 혼성화되거나 혼성화될 수 있는 적어도 2 개의 상보적 부분 및 이중 가닥(duplex)을 형성하는 두 개의 서열의 말단을 연결하는 루프를 형성하는 길이가 약 1 내지 10 뉴클레오티드인 적어도 하나의 단일 가닥 부분을 포함하는 핵산 분자이다. 일부 실시 양태에서, 구조물은 오버행을 추가로 포함할 수 있다. 주어진 표적 유전자의 녹다운 (knockdown)에 적합한 shRNA 서열은 당업계에 잘 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일부 실시 양태에서, shRNA의 자기-상보적 부분의 혼성화에 의해 형성된 이중 가닥은 siRNA의 것과 유사한 특성을 가질 수 있으며, 후술하는 바와 같이, 보존된 세포 RNAi 기계에 의해 shRNA가 siRNA로 가공될 수 있다. 따라서 shRNA는 siRNA의 전구체가 될 수 있으며 표적 전사체의 발현을 유사하게 억제할 수 있다. 일부 실시 양태에서, shRNA는 표적 핵산, 예컨대 mRNA 전사체와 혼성화하는 부분을 포함하고, 약 15-29 뉴클레오티드, 때로는 17-21 뉴클레오티드, 예를 들어 19 뉴클레오티드에 걸쳐 표적과 완벽하게 상보적일 수 있다. 그러나, 당업자는 하나 이상의 불일치된 또는 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드가 shRNA 가닥과 표적 전사체 사이에 형성된 이중 가닥에 존재할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시 양태에서, shRNA는 구조 A-B-C 또는 C-B-A의 뉴클레오티드 (예 : DNA) 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 카세트는 적어도 2 개의 DNA 단편 A 및 C 또는 C 및 A를 포함하고, 상기 적어도 2 개 이상의 단편 각각은 상기에서 정의된 바와 같은 별도의 프로모터(예를 들어, 유도성 U6, H1 등을 포함하는 PolIII 프로모터)의 제어 하에 있다. 상기 세그먼트에서: A는 15 내지 35 bp 또는 19 내지 29 bp DNA 서열일 수 있으며,이는 녹다운될 유전자 (예: GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)에 대해 적어도 90 % 또는 100 % 상보적이다; B는 발현된 RNA 헤어핀 분자의 루프를 형성하는 5 내지 9 bp를 갖는 스페이서 DNA 서열일 수 있고, C는 서열 A에 적어도 85 % 상보적인 15 내지 35 또는 19 내지 29 bp DNA 서열일 수 있다.
일부 실시 양태에서, RNA 간섭제는 (1) RNAi 제제가, 길이 약 15-29 뉴클레오티드의 영역, 예를 들어 길이가 약 15, 약 17, 약 18 또는 약 19 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 전사체와 적어도 약 80 %, 약 85 %, 약 90 %, 약 91 %, 약 92 %, 약 93 %, 약 94 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 % 또는 약 100 % 상보적인 부분, 예를 들어 가닥(strand)을 포함하는 경우; 및/또는 (2) 포유류 세포의 세포질 또는 핵 내에 전형적으로 존재하는 조건 (온도 제외) 하에서, RNAi 제제의 한 가닥의 15 뉴클레오티드 및 전사체의 15 뉴클레오티드 부분의 신장 (stretch)에 의해 형성된 이중 가닥의 Tm은, RNA 간섭제의 동일한 15 뉴클레오티드 및 그의 정확한 보체 (exact complement)에 의해 형성되는 이중 가닥의 Tm 보다, 단지 약 15 ℃ 낮거나 약 10 ℃ 낮은 경우; 및/또는 (3) 전사체의 안정성이 RNA 간섭제의 존재 하에서, 그것의 부재와 비교하여 감소되는 경우, 전사체 및 전사체를 코딩하는 유전자에 "표적화"되는 것으로 간주한다. 일부 실시 양태에서, 전사체를 표적으로하는 RNA 간섭제는 또한 전사체를 코딩하고 합성을 지시하는 유전자를 표적으로하는 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표적 영역은 RNA 간섭제의 안티센스 가닥과 혼성 화하는 표적 전사체의 영역일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표적 전사체는 RNA 간섭에 의한 억제를 위한 표적인 임의의 RNA일 수 있다.
일부 실시 양태에서, siRNA는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 발현을 선택적으로 억제한다. 또한, siRNA의 모든 뉴클레오티드 서열은 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 mRNA의 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있고, 또는 이의 일부가 상기 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기의 siRNA는 리보뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 그 일부는 리보뉴클레오티드 이외의 뉴클레오타이드, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 유도체, 리보뉴클레오티드 유도체 등을 포함할 수 있다. siRNA는 공지의 화학 합성법에 의해 합성될 수 있으나, 그 방법은 특별히 제한되지는 않는다. 일부 실시 양태에서, 이는 적합한 주형 핵산을 사용하여 효소적으로(예를 들어, RNA 폴리머라제를 사용하여) 제조될 수 있다. 일부 실시 양태에서, siRNA는 분자 내에 이중 가닥을 형성할 수 있는 단일 가닥 RNA, 및 줄기(stem)로서 siRNA 부분 및 루프 (shRNA)로서 임의의 서열을 갖는 줄기-루프(stem-loop) 구조(짧은 헤어핀 구조 : sh 구조)의 단일 가닥 RNA의 형태일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 1 내지 30 뉴클레오티드, 1 내지 25 뉴클레오티드 또는 5 내지 22 뉴클레오티드의 서열이 임의 서열로 사용될 수 있다.
siRNA의 서열은 발현을 억제하고자하는 유전자 서열에 기초하여 적절히 설계될 수 있다. 많은 siRNA 디자인 알고리즘이 보고되었으며 (예를 들어, WO 2004/0455543 및 WO 2004/048566 참조), 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어가 또한 사용될 수 있다. 또한 발현을 억제하고자 하는 유전자 서열의 정보로부터 siRNA를 고안하여, siRNA를 합성 및 제공하는 기업이 많이 있다. 따라서, 당업자는 발현을 억제하고자 하는 유전자 서열에 기초한 siRNA를 용이하게 얻을 수 있다.
일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 발현을 선택적으로 억제하는 임의의 siRNA가 생산될 수 있고 또한 상업적으로 수득할 수 있다. GCN2를 표적화하기 위한 전형적(exemplary) siRNA는 Barnes et al. (2009) J. Biol. Chem., 183 : 5768-5777; Malmberg and Adams (2008) J. Biol. Chem., 283: 19229-19234에 기술된 것들 또는 상업적으로 이용가능한, 예를 들어 Dharmacon (Lafayette, CO; 카탈로그 번호 D-044353-02)로부터 입수할 수 있는 것들을 포함한다. BLIMP-1을 표적으로 하는 전형적 siRNA는 Yu et al. (2012) PLoS One, e33287; Yan et al. (2007) PNAS, 104 : 1841-1846)에 기술된 것들 또는 상업적으로 이용가능한, 예를 들어 Santa Cruz Biotechnology (CA; 예 : 카탈로그 번호 sc-37714)로부터 입수할 수 있는 것들을 포함한다. CCAAT/인핸서-결합 단백질-상동 단백질 (CHOP)을 표적화하기 위한 전형적 siRNA는 Kim et al. (2012) Horm Metab Res 45 (1):9-14, Ryder et al., Biochem Biophys Res Commun. (2013) 430(4): 1283-1288에 기술된 것들 또는 상업적으로 이용가능한, 예를 들어 ThermoFisher Scientific (예 : 카탈로그 번호 AM16708)로부터 입수할 수 있는 것들을 포함한다. AHR 또는 ARNT를 표적화하기 위한 전형적 siRNA는 Adelrahim et al. (2003) Mol. Pharmacol., 63 : 1373-81; Overvik et al.(2014) 세포 커뮤니케이션과 신호 전달 (Cell Communication and Signaling), 12:48; Ishida et al. (2010) Carcinogenesis, 31 : 287-295)에 기재되어 있는 것들 또는 상업적으로 이용가능한, 예를 들어 Applied Biological Materials (Richmond, BC, Canada; Catalog. No. iV000726)로부터 입수할 수 있는 것들을 포함한다. ATF4를 표적화하기 위한 전형적 siRNA는 Armstrong et al., (2010) J. Biol. Chem. 285:6091:6100에 기재되어 있는 것들 또는 상업적으로 이용가능한, 예를 들어 ThermoFisher Scientific (예 : 카탈로그 번호 AM16708)로부터 입수할 수 있는 것들을 포함한다. eIF2α를 표적화하기 위한 전형적 siRNA는 Fan et al. (2016) Scientific Reports 6 : 21145, Wang et al. (2015) PLoS ONE 10 (6) : e0130806에 기재되어 있는 것들 또는 상업적으로 이용가능한, 예를 들어 Santa Cruz Biotechnology (예 : 카탈로그 번호 sc-35272)로부터 입수할 수 있는 것들을 포함한다.
일부 실시 양태에서, shRNA 및 siRNA 단편은 정지 및/또는 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 안티센스 뉴클레오티드는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 발현을 억제시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 안티센스 뉴클레오티드는, 예를 들어 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 mRNA 분자의 번역을 직접 간섭(방해)함으로써, RNA 분해 효소 H에 의한 mRNA의 분해에 의해, mRNA의 5 '캡핑을 간섭(방해)함으로써, 5'캡을 마스킹함으로써, 번역 인자와 mRNA의 결합을 방지함으로써, 또는 mRNA의 폴리아데닐화를 억제함으로써, 단백질의 발현을 억제시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 단백질의 발현 억제는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 RNA와 안티센스 뉴클레오티드 사이의 혼성화에 의해 발생할 수 있다. 일부 실시 양태에서, mRNA 상의 특정 표적화 부위는 mRNA의 안정성을 감소 시키거나 또는 mRNA를 분해시키기 위해 안티센스 뉴클레오티드의 표적으로 선택된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 표적 부위가 동정될 때, 표적 부위와 충분히 상보적인(즉, 생리학적 조건 하에서 충분히 또는 충분히 특이적으로 혼성화되는) 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드가 디자인될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 안티센스 뉴클레오티드는 예를 들어 8 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 80 뉴클레오티드 또는 14 내지 35 뉴클레오티드의 사슬 길이를 가질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 세포 내로의 도입 또는 전달 방법은 유전적으로 조작 된 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 상기에서 기술된 방법과 동일하거나 유사할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포 내(예, T 세포)에서, shRNA 또는 siRNA와 같은 억제성 핵산의 발현은 임의의 통상적인 발현 시스템, 예를 들어, 렌티 바이러스 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시 양태에서, RNA는 바이러스 벡터의 성분일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 바이러스 벡터는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 발현을 억제하거나, shRNA 또는 그러한 능력을 갖는 억제성 핵산을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 바이러스 벡터는 렌티 바이러스 벡터이다. 일부 실시 양태에서, 렌티 바이러스 벡터는 통합 렌티 바이러스 벡터이다.
일부 실시 양태에서, 적합한 프로모터(suitable promoters)는, 예를 들면, (인간 및 쥐) U6 프로모터, (인간 및 쥐) H1 프로모터, 및 (인간 및 쥐) 7SK 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는 RNA 폴리머라제 (pol) III 프로모터를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 또한 혼성 프로모터가 예를 들어 별개의 RNA 폴리머라제 (pol) III 프로모터로부터 유래된 요소를 함유하도록 제조될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 둘 이상의 자연 발생 프로모터 서열로부터 유래된 서열 요소를 함유하는 변형된 프로모터는 당업자에 의해 결합되어 원하는 일련의 조건 하에 또는 특정 상황 하에서 전사를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 및 쥐(murine) U6 RNA 폴리머라제 (pol) III 및 H1 RNA pol III 프로모터는 잘 특성화 되어 있다. 당업자는 하나 이상의 유전자의 발현 조절을 최적화하기 위해 원하는 어플리케이션 및 세포 유형에 가장 효과적인 프로모터를 선택 및/또는 변형할 수 있을 것이다. 일부 실시 양태에서, 프로모터 서열은 예를 들어 포유류 세포와 같은 진핵 세포에서 작용하는 한, 자연에서 발생하지 않는 서열일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 전형적 전달 비히클은 나노 입자, 예를 들어 리포좀 또는 다른 적합한 서브-마이크론 크기의 전달 시스템이다. 일부 실시 양태에서, 세포 내로 핵산을 도입하기 위해 지질 제제의 사용이 고려된다. 지질 입자는 양이온 성 지질, 비-양이온성 지질 및 선택적으로 입자의 응집을 방지하는 복합 지질 (conjugated lipid)로부터 형성될 수 있는 핵산-지질 입자일 수 있다. 핵산은 입자의 지질 부분에 캡슐화되어 효소 분해로부터 보호될 수 있다. 안정한 핵산 - 지질 입자는 지질 (예, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 임의로는 입자의 응집을 방지하는 복합 지질)로부터 제조된 입자일 수 있으며, 핵산은 지질 내에 완전히 캡슐화된다.
일부 실시 양태에서, 지질 입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm 약 70nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm , 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm 또는 150nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 지질 입자는 실질적으로 무독성이다. 일부 실시 양태에서, 핵산은, 본 발명의 지질 입자 내에 존재할 때, 뉴클레아제로 분해되는 수용액에서 저항성(내성)을 가질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 지질 입자는 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 양자 모두를 갖는 핵산을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 지질 입자 내에 완전히 캡슐화되어 핵산-지질 입자를 형성한다.
일부 실시 양태에서, 복합 지질은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질 복합, 예를 들어 다이알킬옥시프로필에 결합된 PEG (예 : PEG-DAA 복합), 다이아실글리세롤에 결합된 PEG (예 : PEG-DAG 복합), 콜레스테롤에 결합된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG, 및 세라마이드에 결합된 PEG, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린 (POZ) - 지질 복합 (예 : POZ-DAA 복합); 폴리아미드 올리고머 (예, ATTA-지질 복합) 및 이들의 혼합물을 비롯한 지질 입자의 응집을 억제한다. 일부 실시 양태에서, PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합될 있거나 링커 부분을 통하여 지질에 결합될 수 있다. 지질에 PEG 또는 POZ가 결합하기에 적합한 임의의 링커 부분은 예를 들어, 비-에스테르 함유 링커 부분 및 에스테르-함유 링커 부부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비-에스테르 함유 링커 부분, 예컨대 아미드 또는 카바메이트가 사용된다.
일부 양태에서, 양친매성 지질은 소수성 상 (hydrophobic phase)으로 향하는 소수성 부분 및 수성 상 (aqueous phase)으로 향하는 친수성 부분을 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 친수성 특성은 탄수화물, 포스페이트, 카르복실릭, 술파토 (sulfato), 아미노, 술프하이드릴 (sulfhydryl), 니트로, 하이드록실 (hydroxyl), 및 기타 유사한 기 (group)와 같은 극성 또는 하전된 기 (charged groups)의 존재로부터 유래한다. 일부 실시 양태에서, 소수성은 비극성 기(apolar group)를 포함시킴으로써 부여될 수 있으며, 상기 비극성 기는 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로사이클릭 기에 의해 치환된 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 양친매성 화합물의 예는 인지질, 아미노지질 및 스핑고지질을 포함하나 이에 한정되지 않는다 .
인지질의 대표적인 예로는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜린, 포스파티딜이노시톨, 포스폰산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 다이올에오일포스포파티딜콜린 (dioleoylphosphatidylcholine), 다이스테아오일포스포파티딜콜린 (distearoylphosphatidylcholine) 및 다이리놀레오일포스포파티딜콜린 (dilinoleoylphosphatidylcholine)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 스핑 고지질 (sphingolipid), 글리코스핑고지질 (glycosphingolipid) 계열, 다이아실글리세롤 (diacylglycerols) 및 3- 아실옥시산과 같이 인이 결핍된 다른 화합물도 양친매성 지질로 지정된 그룹 내에 포함된다. 또한, 상기 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤을 비롯한 다른 지질과 혼합될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 중성 지질은 선택된 pH에서 비하전성 또는 중성 쌍성 이온성 (zwitterionic) 형태로 존재한다. 일부 실시 양태에서, 생리적 pH에서, 상기 지질은, 예를 들면, 다이아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 다이아실포스파티딜에탄올아민 (diacylphosphatidylethanolamine), 세라마이드, 스핑고미엘린 (sphingomyelin), 세팔린 (cephalin), 콜레스테롤, 세레브로사이드 (cerebrosides), 및 디아실글리세롤을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 비-양이온성 지질은 임의의 양친매성 지질뿐만 아니라 임의의 다른 중성 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 음이온성 지질은 생리학적 pH 에서 음으로 하전된다. 이러한 지질은 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀 (cardiolipins), 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티딘산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤 (palmitoyloleyolphosphatidylglycerol, POPG), 및 중성 지질과 결합된 다른 음이온성 변형 그룹 (modifying groups)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 소수성 지질은 비극성 기를 가지며, 상기 비극성 기는 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기 및, 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로사이클릭 기에 의해 선택적으로 치환된 기를 포함하나 이에 제한되지 않다. 적합한 예로는, 다이아실글리세롤, 다이알킬글리세롤, N-N-다이알킬 아미노, 1,2-다이아실옥시-3-아미노프로판 및 1,2-다이알킬-3-아미노프로판을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 핵산-지질 입자는 다음을 포함한다: (a) 핵산 (예, 간섭 RNA); (b) 입자 내에 존재하는 총 지질 중 약 50 몰 % 내지 약 65 몰 %을 포함하는 양이온성 지질; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질 중 약 25 몰 % 내지 약 45 몰 %을 포함하는 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질 중 약 5 몰 % 내지 약 10 몰 %를 포함하는, 입자의 응집을 억제하는 복합 지질.
일부 실시 양태에서, 핵산-지질 입자는 다음을 포함한다: (a) 핵산 (예 , 간섭 RNA); (b) 입자 내에 존재하는 총 지질 중 약 50 몰 % 내지 약 60 몰 %를 포함하는 양이온성 지질; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질 중 약 35 몰 % 내지 약 45 몰 %를 포함하는, 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질 중 약 5 몰 % 내지 약 10 몰 %를 포함하는 PEG-지질 복합체.
일부 실시 양태에서, 핵산-지질 입자는 (a) 핵산 (예를 들어, 간섭 RNA); (b) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 55 몰 % 내지 약 65 몰 %를 포함하는 양이온 성 지질; (c) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 30 몰 % 내지 약 40 몰 %를 포함하는 콜레스테롤 또는 이의 유도체; 및 (d) 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰 % 내지 약 10 몰 %를 포함하는 PEG-지질 복합체. 일부 실시 양태에서, 크리스퍼/카스 시스템은, 예를 들어 WO2015/161276에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 발현의 감소 또는 억제와 같은 노킹 다운 (knocking down)을 위해 사용될 수 있다. 크리스퍼/카스 시스템의 전형적 특징은 하기에 기재되어 있으며, 효소적으로 비활성인 뉴클레아제를 사용하여 분자를 코딩하는 유전자를 파괴하거나 결실시키기보다는, 분자의 발현을 감소시키거나 억제하는데 사용하기 위해 적용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA (gRNA), 또는 프로모터, 인핸서 또는 기타 시스- 또는 트랜스-작용 조절 영역은, 변형된 카스9 단백질 또는 변형된 카스9 단백질을 함유하는 융합 단백질과 조합하여 도입하여 유전자(들)의 발현을 억제(예, 녹다운)할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 카스9 (Cas9) 분자는 효소적으로 불활성인 카스9 (eiCas9) 분자이고, 이는 카스9 분자를 불활성으로 만드는 돌연변이 (예, 점 돌연변이), 예를 들어 카스9 분자 절단 활성을 제거하거나 실질적으로 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, eiCas9 분자는 전사 활성 또는 억제 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다.
일부 실시 양태에서, 유전자의 프로모터 영역은 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 발현을 녹다운시키기 위해 표적화된다. 표적화된 녹다운 접근법은 기능적 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 제거한다. 일부 실시 양태에서, 표적화된 녹다운은, 유전자의 전사를 변경, 예를 들어 전사를 차단, 감소(reduce), 간섭 또는 감소(decrease)시키기 위해, 효소적으로 불활성인 카스9 (eiCas9), 또는 전사 억제자 도메인 (transcription repressor domain) 또는 염색질 개질 단백질 (chromatin modifying protein)에 융합된 eiCas9을 표적화하는 것에 의해 매개된다. eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질에 의해 표적화되는 경우, 유전자 내 또는 그 부근의 표적 서열을 표적화하는 gRNA는, IDO-매개 이화작용에 의해 양성적으로 조절되는 단백질 (예, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)과 같은 기능성 유전자 산물의 발현의 감소 또는 제거를 야기한다. 일부 실시 양태에서, 전사는 감소되거나 제거된다.
일부 실시 양태에서, gRNA 분자의 표적 영역은, 유전자의 발현을 감소 (reduce), 감소 (decrease) 또는 억제하는 게놈에서 표적 서열에 충분히 근접한, 효소적으로 비활성인 카스9 (eiCas9) 또는 eiCas9 융합 단백질 (예를 들어, 전사 억제 도메인에 융합된 eiCas9)을 표적하도록 구성된다. 일부 실시 양태에서, eiCas9는 전사 억제자 도메인 또는 염색질 개질 단백질 (chromatin modifying protein)에 융합되어 전사를 변경, 예를 들어 전사를 차단, 감소 (reduce), 간섭 또는 감소 (decrease)시킨다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 eiCas9가 하나 이상의 내인성 전사 인자의 결합을 차단하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, eiCas9는 염색질 개질 단백질 (chromatin modifying protein)에 융합될 수 있다. 염색질 상태를 변경하면 표적 유전자의 발현이 감소될 수 있다. 하나 이상의 염색질 개질 단백질에 융합된 하나 이상의 eiCas9가 염색질 상태를 변경시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 표적화 도메인은 전사 개시, 하나 이상의 전사 인핸서 또는 활성화제의 결합, 및/또는 RNA 폴리머라제를 차단하기 위해 유전자의 프로모터 영역을 표적화하도록 구성된다. 하나 이상의 gRNA는 eiCas9를 유전자의 프로모터 영역으로 표적화하는데 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 표적화 크리스퍼 gRNA 및 효소적으로 불활성인 뉴클레아제의 복합체 (예를 들어 iCas9 또는 eiCas9 융합 단백질)는, 크리스퍼/카스 (크리스퍼/Cas) 시스템과 관련하여, 하기에 기술된 것을 포함하여 당업자에게 공지된 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 크리스퍼 gRNA 및 효소적으로 비활성인 뉴클레아제 (예, iCas9 또는 eiCas9 융합 단백질)는, 예를 들어 리보핵산단백질 (RNP) 복합체의 일시적인 도입에 의해, 세포에 일시적으로 도입된다. 일부 실시 양태에서, gRNA를 코딩하는 핵산 분자 및/또는 eiCas9는 임의의 통상적인 발현 시스템, 예를 들어, 렌티 바이러스 발현 시스템을 사용하여 세포에 도입된다. 일부 실시 양태에서, 세포 내로의 도입 또는 전달 방법은 세포 내로 핵산-단백질 복합체 (예 : 리보핵산단백질 (RNP) 복합체)의 도입을 위하여 하기에서 기술된 방법과 동일하거나 유사할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 유전자 녹다운은 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자를 표적으로하는 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 ZFP를 함유하는 융합 단백질과 같은 DNA- 합 표적 단백질에 의해 달성된다. 일부 실시 양태에서, ZFP와 같은 DNA-결합 단백질은 표적 유전자의 발현을 간섭(방해)하거나 억제함으로써 표적 유전자 억제를 수행할 수 있다. ZFP를 포함하는 DNA-결합 단백질의 전형적 특징은 하기에 기재되어 있으며, 이펙터 단백질 (예, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)와 같은 엔도뉴클레아제)없이 도입함으로써, 분자를 코딩하는 유전자의 파괴 또는 결실 보다는, 분자의 발현을 감소 또는 억제하는데 사용하기에 적합할 수 있다.
b. 발현의 녹아웃 (knockout)
일부 측면에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절되는 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자의 파괴와 같은 녹아웃은, DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 사용하는 것과 같은, 유전자 편집에 의해 수행되고, 이는 파괴를 표적으로 하는 영역에서 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화한다. 일부 측면에서, 단백질 또는 핵산은, 키메라 또는 융합 단백질에서와 같이, 유전자 편집 뉴클레아제에 커플링되거나 복합체화된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 파괴는 DNA-표적화 단백질 및 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 TAL-이펙터 뉴클레아제 (TALEN)와 같은 뉴클레아제 또는 파괴되는 유전자에 특이적인 크리스퍼-카스9 시스템과 같은 RNA-유도 뉴클레아제의 융합물을 이용하여 수행된다. 일부 실시 양태에서, 유전자 편집은 IDO-매개 이화작용에 의해 양성적으로 조절되는 단백질 (예 : GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자의 게놈 파괴 또는 녹-아웃을 일으킨다.
일부 실시 양태에서, 억제는, 유전자와 특이적으로 결합하거나 혼성화하는, DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산과 같은 DNA-표적화 분자, 또는, 이를 포함하는 복합체, 화합물 또는 조성물을 사용하여 달성된다. 일부 실시 양태에서, DNA-표적화 분자는 DNA-결합 도메인, 예를 들어 징크 핑거 단백질 (ZFP) DNA-결합 도메인, 전사 활성제-유사 단백질 (TAL) 또는 TAL 이펙터 (TALE) DNA-결합 도메인, 크리스퍼 DNA-결합 도메인, 또는 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인을 포함한다.
징크 핑거, 테일 (TALE) 및 크리스퍼 (크리스퍼) 시스템 결합 도메인은, 예를 들어 자연 발생의 징크 핑거 또는 테일 (TALE) 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산 변경)을 통해, 소정의 염기 서열과 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 DNA-결합 단백질 (징크 핑거 또는 TALE)은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 합리적인 설계 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 디자인 정보를 저장하는 데이터베이스에서의 정보 처리 및 데이터의 바인딩(binding)을 위한 대체 규칙 (substituti rules) 및 컴퓨터 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및U.S. Publication No. 20110301073 및 US20140120622 를 참조한다.
일부 실시 양태에서, DNA-표적 분자, 복합체 또는 이들의 조합물은 DNA-결합 분자와 하나 이상의 추가 영역, 예를 들어 유전자의 억제 또는 파괴를 촉진시키는 이펙터 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 유전자 파괴 또는 억제는 DNA-결합 단백질 및 이종 조절 (heterologous regulatory) 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질에 의해 수행된다.
일부 측면에서, 도메인은 예를 들어, 활성화 인자, 억제 인자, 보조 활성화 인자, 보조 억제 인자, 사일런서, 종양 유전자 (oncogenes), DNA 수선 효소 및 이들과 관련된 인자 및 변경 인자 (modifier), 염색질 관련 단백질 및 이들의 변경 인자 (modifier), (예를 들어 키나아제, 아세틸라아제 및 디아세틸라아제) 및 DNA 개질 효소 (DNA modifying enzymes), 예를 들어 메틸트랜스퍼라아제, 토포이소머라아제, 헬리카아제, 리가아제, 키나아제, 포스파타아제, 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제 및 이들과 관련된 인자 및 변경 인자 (modifier)를 포함한다. DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인의 융합에 관한 상세한 내용은, 예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 인용된 미국 특허 출원 공보 Nos. 20050064474; 20060188987 및 2007/0218528를 참조한다. 일부 측면에서, 추가 도메인 (additional domain)은 뉴클레아제 도메인이다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 유전자 파괴는 뉴클레아제와 같은 비-특이적 DNA-절단 분자에 융합되거나 복합화된 서열 특이적 DNA-결합 도메인으로 구성된, 조작된 단백질(예를 들어, 유전자 편집 뉴클레아제 및 유전자 편집 뉴클레아제-함유 복합체 또는 융합 단백질)을 사용하고, 유전자 또는 게놈 편집에 의해 촉진된다.
일부 측면에서, 이들 표적 키메라 뉴클레아제 또는 뉴클레아제-함유 복합체는, 표적화된 이중-가닥 절단 또는 단일-가닥 절단을 유도, 세포-수선 메커니즘을 자극, 오류가 발생하기 쉬운 (error-prone) 비상동말단연결(NHEJ, non-homologous end joining) 및 상동직접수선 (HDR, homology-directed repair)을 유도함으로써, 정확한 유전적 변형을 수행한다.
일부 실시 양태에서, 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)와 같은 엔도뉴클레아제, TALE 뉴클레아제 (TALEN), 크리스퍼-관련 (Cas) 단백질과 같은 RNA-유도 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 메가뉴클레아제이다.
일부 실시 양태에서, 유전적으로 조작된 항원 수용체를 코딩하는 공여자 플라스미드 (donor plasmid) 또는 핵산과 같은 공여자 핵산 (donor nucleic acid)이 제공되며, DSBs의 도입 후 유전자 편집 자리 (site)에서 HDR에 의해 삽입된다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 유전자의 파괴 및 항원 수용체, 예를 들어 CAR 의 도입은 동시에 수행되고, 이로써 부분적으로 CAR-코딩 핵산의 녹-인 (knock-in) 또는 삽입에 의해 유전자가 부분적으로 파괴된다.
일부 실시 양태에서, 공여자 핵산 (donor nucleic acid )은 제공되지 않는다. 일부 측면에서, DSB 도입 후 NHEJ-매개 수선은, 예를 들어 미스센스 돌연변이 또는 격자이동(frameshifts)를 생성함으로써, 유전자 파괴를 일으킬 수 있는 삽입 또는 결실 돌연변이를 초래한다.
1) ZFP 및 ZFN; TAL, TALE 및 TALEN
일부 실시 양태에서, DNA-표적 분자는, 엔도뉴클레아제와 같은 이펙터 단백질에 융합된, 하나 이상의 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자-유사 단백질과 같은 DNA-결합 단백질을 포함한다. 예를 들면 ZFN, TALE 및 TALEN이 포함된다. Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221), 1-7 (2013)를 참조한다.
일부 실시 양태에서, DNA-표적 분자는 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 하나 이상의 징크 핑거 단백질 (ZFPs) 또는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 보다 큰 단백질 내의 단백질 또는 도메인이다. 용어 징크 핑거 DNA-결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
ZFPs 중에서 개별 핑거 (individual fingers)의 어셈블리에 의해 생성된, 통상 9-18 뉴클레오티드 길이인 특정 DNA 서열을 표적화하는 인공 도메인이 있다. ZFP는 단일 핑거 도메인이 약 30 개의 아미노산 길이이고, 단일 베타 방향 (turn)의 2 개의 시스테인으로 아연을 통해 배위된 2개의 불변의 히스티딘 잔기를 포함하고, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개의 핑거를 갖는 알파 나선을 포함하는 것을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 징크 핑거 인식 나선에서의 4 개의 나선 위치 (-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 자연적으로 발생하지 않으며, 예를 들어, 목적하는 표적 부위에 결합하도록 조작된다. 예를 들어, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; 미국 특허. Nos. 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 출원 공보 Nos. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061를 참조한다. 이들 모두는 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
일부 측면에서, 유전자의 억제는 유전자의 제 1 표적 부위를 제 1 ZFP와 접촉시킴으로써 수행되어, 유전자를 억제한다. 일부 실시 양태에서, 유전자 내의 표적 부위는 6 개 핑거 및 조절 도메인을 포함하는 융합 ZFP와 접촉되어, 이로써 유전자의 발현을 억제한다.
일부 실시 양태에서, 접촉 단계는 유전자 내의 제 2 표적 부위를 제 2 ZFP와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 제 1 및 제 2 표적 사이트들은 인접해 있다. 일부 실시 양태에서, 제 1 및 제 2 ZFP는 공유 결합으로 연결된다. 일부 측면에서, 제 1 ZFP는 조절 도메인 또는 적어도 2 개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시 양태에서, 제 1 및 제 2 ZFP는 각각 조절 도메인을 포함하거나 각각 적어도 2 개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시 양태에서, 조절 도메인은 전사 억제 인자, 전사 활성화 인자, 엔도뉴클레아제, 메틸트랜스퍼라아제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제 또는 히스톤 디아세틸라제이다.
일부 실시 양태에서, ZFP는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 ZFP 핵산에 의해 코딩된다. 상기 방법은 핵산을 지질 : 핵산 복합체 또는 네이키드 핵산 (naked nucleic acid)으로 세포에 먼저 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, ZFP는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 ZFP 핵산을 포함하는 발현 벡터에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, ZFP는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산에 의해 코딩된다. 일부 측면에서, ZFP는 약한 프로모터 (weak promoter)에 작동 가능하게 연결된 핵산에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 상류이다. 일부 측면에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위에 인접한다. 일부 측면에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위 하류의 RNA 폴리머라아제 정지 부위 (pause site)에 인접한다.
일부 실시 양태에서, DNA-표적 분자는 징크- 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성하기 위해 DNA 절단 도메인에 융합된 징크-핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS 유형 제한 효소 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인으로부터의 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인)을 포함하며, 이들은 조작되거나 또는 조작되지 않을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 절단 도메인은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제 Fok I에서 유래된다. Fok I은, 하나의 가닥의 인식 부위로부터 9 뉴클레오티드 및 다른 부위의 인식 부위로부터의 13 뉴클레오티드에서, 일반적으로 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 Nos. 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982를 참조한다.
일부 실시 양태에서, ZFN은 IDO-매개 이화작용에 의해 양성적으로 조절되는 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자를 표적으로 한다. 일부 측면에서, ZFN은, 예를 들어 유전자의 코딩 영역 내의 소정의 부위에서 이중-가닥 절단 (DSB)을 효율적으로 생성한다. 표적화된 전형적 영역은 엑손, N-말단 영역을 코딩하는 영역, 제 1 엑손, 제 2 엑손 및 프로모터 또는 인핸서 영역을 포함한다. 일부 실시 양태에서, ZFN의 일시적인 발현은 조작된 세포에서 표적 유전자의 매우 효율적이고 영구적인 파괴를 촉진시킨다. 특히, 일부 실시 양태에서, ZFN의 전달 (delivery)은 50 % 이상의 효율로 유전자를 영구적으로 파괴시킨다.
많은 유전자-특이적인 조작된 징크 핑거는 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어 Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)와 공동으로 징크-핑거 제조(construction)을 위한 플랫폼 (CompoZr)을 개발하여, 연구자가 징크-핑거 제조 및 유효성 검사를 모두 바이패스(bypass)하도록 하고, 수 천개의 단백질에 대해 특이적으로 표적화된 징크 핑거를 제공한다. Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405를 참조한다. 일부 실시 양태에서, 상업적으로 입수 가능한 징크 핑거가 사용되거나 맞춤설계된다. (예를 들어, Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 CSTZFND, CSTZFN, CTI1-1KT 및 PZD0020 참조).
2) TALE 및 TALEN
일부 실시 양태에서, DNA-표적화 분자는, 전사 활성화 인자-유사 단백질 이펙터(TALE) 단백질에서와, 같이 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생적) 전사 활성화 인자-유사 단백질 (TAL) DNA 결합 도메인을 포함한다 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 No. 20110301073 호를 참조한다. 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다.
TALE DNA 결합 도메인 또는 TALE은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/유닛을 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 도메인은 그것의 동족 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위 (repeat unit)"("반복 (repeat)"이라고도 함)는 일반적으로 33-35 아미노산의 길이이며 자연 발생 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 각 TALE 반복 단위는, 전형적으로 반복(repeat)의 12 및/또는 13 위치에서, RVD (Repeat Variable Diresidue)를 구성하는 1 또는 2 개의 DNA 결합 잔기를 포함한다. 이러한 TALE의 DNA 인식을 위한 자연적 (정규) 코드는 12 및 13 위치의 HD 서열이 시토신 (C)에 대한 결합을 유도, NG가 T에 결합, NI가 A에 결합, NN이 G 또는 A에 결합, 및 NG가 T에 결합하도록 결정되고, 비-정규(비정형) RVD도 알려져 있다. 미국 특허 공개 공보 제20110301073 호 참조. 일부 실시 양태에서, TALE은 표적 DNA 서열에 특이성이 있는 TAL 어레이의 설계에 의해 임의의 유전자를 표적으로 할 수 있다. 표적 서열은 일반적으로 티미딘으로 시작한다.
일부 실시 양태에서, 분자는 TALE-뉴클레아제 (TALEN)와 같은 DNA 결합 엔도 뉴클레아제이다. 일부 측면에서, TALEN은 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 TALE 및 뉴클레아제 촉매 도메인으로부터 유래된 DNA 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시 양태에서, TALE DNA-결합 도메인은 표적 항원 및/또는 면역 억제 분자를 코딩하는 유전자 내 표적 서열을 결합하도록 조작되었다.
예를 들어, 일부 측면에서, TALE DNA-결합 도메인은 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자를 표적으로 할 수 있다.
일부 실시 양태에서, TALEN는 유전자의 표적 서열을 인식하여 절단한다. 일부 측면에서, DNA의 절단은 이중-가닥 절단을 초래한다. 일부 측면에서, 절단 (break)은 동종 재조합 또는 비-동종말단결합 (NHEJ)의 속도를 자극한다. 일반적으로, NHEJ는 종종 절단 부위에서 DNA 서열을 변화시키는 불완전한 수리 과정이다. 일부 측면에서, 수리 메카니즘은 직접 재-결찰 (direct re-ligation) (Critchlow and Jackson, Trends Biochem Sci. 1998 Oct;23(10):394-8) 또는 이른바 미세상동성-매개 말단 결합 (microhomology-mediated end joining)을 통해 2 개의 DNA 말단에 남아있는 것을 재결합시키는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, NHEJ를 통한 수리는 작은 삽입 또는 결실을 초래하고, 유전자를 파괴시키고 이에 의해 억제하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가일 수 있다. 일부 측면에서, 절단- 유도된 돌연변이 유발 사건 (event), 즉 NHEJ 사건에 연속적인 돌연변이 유발 사건이 발생한 세포는 당업계의 잘 알려진 방법에 의해 확인 및/또는 선택될 수 있다.
일부 실시 양태에서, TALE 반복은 유전자를 특이적으로 표적하기 위해 조립된다. (Gaj et al. Trends in Biotechnology, 2013, 31 (7), 397-405). 18,740 개의 인간 단백질-코딩 유전자를 표적으로하는 TALEN의 라이브러리가 구축되었다 (Kim et al., Nature Biotechnology. 31, 251-258 (2013)). 맞춤-설계된 TALE 어레이는 Cellectis Bioresearch (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA), 및 Life Technologies (Grand Island, NY, USA)를 통해 상업적으로 이용가능하다. GCN2 또는 BLIMP-1을 표적으로하는 TALE-뉴클레오티드가 공지되어 있다 (예를 들어, 공개된 WO2015155341 참조).
일부 실시 양태는 TALEN는 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 코딩되는 도입유전자(transgene)로서 도입된다. 일부 측면에서, 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 수신한 세포의 동정 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 포함할 수 있다.
3) RGENs (크리스퍼/카스 시스템)
일부 실시 양태에서, 억제는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 (RGEN)를 통한 파괴 또는 다른 RNA-유도된 이펙터 분자에 의한 억제의 다른 형태와 같은 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 억제는 크리스퍼 (크리스퍼) 및 크리스퍼-관련 (Cas)단백질을 사용하여 수행된다. Sander and Joung, Nature Biotechnology, 32 (4) : 347-355를 참조한다.
일반적으로, "크리스퍼 시스템"은 전사체 및 크리스퍼-관련 ( "Cas") 유전자의 발현에 관련된 전사체 및 다른 요소를 집합적으로 지칭하며, 카스 유전자를 코딩하는 서열, tracr (trans-activating 크리스퍼) 서열 (예 : tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 (내인성 크리스퍼 시스템의 측면에서 "직접 반복 (direct repeat)" 및 tracrRNA-가공 부분 직접 반복을 포함하는), 가이드 서열 (내인성 크리스퍼 시스템의 측면에서 "스페이서", 또는 "표적화 서열"로도 지칭되는), 및/또는 크리스퍼 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 크리스퍼/카스 뉴클레아제 또는 크리스퍼/카스 뉴클레아제 시스템은, 뉴클레아제 기능성 (nuclease functionality) (예, 2개의 뉴클레아제 도메인) 또는 이의 변이체를 갖는, 서열 특이적으로 DNA에 결합하는 논-코딩 (non-coding) RNA 분자 (가이드) RNA (gRNA) 및 카스 단백질 (예 : Cas9)을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 크리스퍼 시스템의 하나 이상의 요소는 I 형, II 형 또는 III 형 크리스퍼 시스템으로부터 유래된다. 일부 실시 양태에서, 크리스퍼 시스템의 하나 이상의 요소는 화농연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes) 또는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)과 같은 내인성 크리스퍼 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다. 일부 실시 양태에서, 카스9 뉴클레아제 (예: 황색포도상구균 또는 화농연쇄상구균의 mRNA에 의해 인코딩되는, 예를 들어 pCW-Cas9, Addgene # 50661, Wang et al. (2014) Science, 3 : 343-80-4) 또는 Applied Biological Materials (ABM; Canada, Cat. No. K002, K003, K005 또는 K006)로부터 구입 가능한 뉴클레아제 또는 닉카아제 렌티바이러스 벡터) 및 표적 유전자 (예 : GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2와 같은, IDO 매개-면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자)에 특이적인 가이드 RNA가 세포 내로 도입된다.
일반적으로, 크리스퍼 시스템은 표적 서열의 부위에서 크리스퍼 복합체의 형성을 촉진하는 요소에 의해 특징지어진다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열 또는 표적 부위는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질 (예 : GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp , 4E-BP1, eIF4G , JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자이다. 예를 들어, 표적 서열은 GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2를 코딩하는 유전자 내에 또는 근처에 있다.
전형적으로, 크리스퍼 복합체의 형성과 관련하여, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열, 예를 들어 유전자 또는 게놈 서열을 지칭하며, 표적 서열과 가이드 서열의 혼성화는 크리스퍼 복합체의 형성을 촉진시킨다. 혼성화를 유발하고 크리스퍼 복합체의 형성을 촉진시키기에 충분한 상보성이 있다면, 완전 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 일부 실시 양태에서, 가이드 서열은 가이드 서열 내의 2 차 구조의 정도를 감소시키도록 선택된다. 2 차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘 (folding algorithm)에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 크리스퍼 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬된 경우, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 적어도 약 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % , 95 %, 97.5 %, 99 % 이거나 또는 그 이상이다. 일부 실시 양태에서, gRNA의 표적화 도메인은 표적 핵산 상의 표적 서열, 예들 들어 IDO 매개-이화작용에 의해 양성적으로 조절되는 단백질(예를 들어 GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자에서의 표적 서열에 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보적이거나, 완전히 상보적이다.
최적 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 비-제한적 예로 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler 변환 (예 : Burrows Wheeler Aligner)에 기반한 알고리즘, ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 사용 가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 사용 가능)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 가이드 서열은 적어도 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 이하 또는 더 적은 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 표적 서열에 대한 크리스퍼/카스 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석법에 의해 평가될 수 있다.
예를 들어, 테스트될 가이드 서열을 포함하여, 크리스퍼/카스 복합체를 형성하기에 충분한 크리스퍼/카스 시스템의 성분은, 예를 들어 크리스퍼/카스 복합체의 성분을 코딩하는 벡터로 형질감염시킴으로써, 상응하는 표적 서열을 갖는 세포에 제공될 수 있고, 이후 본원에 개시된 서베이어 분석(Surveyor assay)과 같은 표적 서열 내에서의 선택적(preferential) 절단(cleavage)의 평가가 이어진다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 절단은 테스트되는 가이드 서열을 포함하여, 표적 서열, 크리스퍼/카스 복합체의 성분 및 실험군 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 제공함으로써, 및 실험군 및 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서의 결합 또는 절단율을 비교함으로써, 시험관에서 평가될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 카스 뉴클레아제 및 gRNA (예를 들어, 표적 서열 및 고정된 tracrRNA에 특이적인 crRNA의 융합을 포함하는) 가 세포 내로 도입된다. 일반적으로, gRNA의 5 '말단의 표적 부위는 상보적인 염기쌍을 사용하여 표적 부위, 예를 들어 유전자에 대한 카스 뉴클레아제를 표적으로 한다. 일부 실시 양태에서, 표적 부위는 전형적으로 NGG, 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM, protospacer) 서열의 바로 5 '위치에 기초하여 선택된다. 이러한 관점에서, gRNA는 표적 DNA 서열에 상응하도록 가이드 RNA의 처음 20 뉴클레오티드를 변형시킴으로써 원하는 서열에 표적화된다.
일부 실시 양태에서, 표적 도메인에 상보적인 표적 핵산은 목적(interest) 유전자의 초기 코딩 영역에 위치한다. 초기 코딩 영역의 표적화는 목적 유전자를 녹아웃 (즉, 발현을 제거)하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 목적 유전자의 초기 코딩 영역은 개시 코돈 (예를 들어 , AUG) 직후 또는 또는 개시 코돈의 500 bp 이내의 서열 (예를 들어 , 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열은 유전자의 개시 코돈의 200, 150 또는 100 bp 이내이다. 프로모터 영역 또는 전사 개시 부위 근처의 영역의 표적화는 목적 유전자를 녹다운 (즉, 발현을 감소)시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전사 개시 부위 근처의 영역은 전사 개시 부위의 500bp 상류 내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 이하)의 영역을 포함 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열은 프로모터, 인핸서 또는 다른 시스- 또는 트랜스- 작용 조절 영역 내에 있을 수 있다.
프로모터 및 활성화 인자를 포함하는 엑손 서열 및 조절 영역의 서열을 포함하여, IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절되는 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 서열인 gRNA 서열 또는 이를 포함하는 gRNA 서열을 설계하거나 동정하는 것은 당업자 수준이다. 크리스퍼 게놈 편집을 위한 게놈-와이드 gRNA 데이터베이스는 공개적으로 이용 가능하며, 인간 게놈 또는 마우스 게놈에서 유전자의 구성 (constitutive) 엑손에서의 전형적 단일 가이드 RNA (sgRNA) 표적 서열을 포함한다 (예를 들어, http://genescript.com/gRNA-database.html; Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11: 783-4; http://www.e-crisp.org/E-CRISP/; http://crispr.mit.edu/; https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input 을 참조한다). 일부 실시 양태에서, gRNA 서열은 비-표적 유전자에 대한 최소의 오프-타겟 (off-target) 결합을 갖는 서열이거나 또는 이를 포함한다.
gRNA 표적화 도메인 서열에 상보적인 IDO-매개 면역 억제 신호 전달, 트립토판 고갈 또는 부족, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 의해 양성적으로 조절되는 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자에서의 전형적 표적 서열은 공지되어 있거나 또는 설계될 수 있다. gRNA 표적화 도메인 서열에 상보적인 AHR을 코딩하는 유전자에 대한 전형적 표적 서열은 서열 번호 24 내지 29에 기재되어 있다. gRNA 표적화 도메인 서열에 상보적인 ARNT를 코딩하는 유전자에 대한 전형적 표적 서열은 서열 번호 30-35에 기재되어 있다. gRNA 표적화 도메인 서열에 상보적인 GCN2를 코딩하는 유전자에 대한 전형적 표적 서열은 서열 번호 50 내지 55에 기재되어 있다. gRNA 표적화 도메인 서열에 상보적인 CHOP를 코딩하는 유전자에 대한 전형적 표적 서열은 서열 번호 56 내지 61에 기재되어 있다. gRNA 표적화 도메인 서열에 상보적인 ATF4를 코딩하는 유전자에 대한 전형적 표적 서열은 서열 번호 62 내지 67에 기재되어 있다. gRNA 표적화 도메인 서열에 상보적인 eIF2α를 코딩하는 유전자에 대한 전형적 표적 서열은 서열 번호 68-73에 기재되어 있다.
일부 실시 양태에서, 크리스퍼 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 끊어짐 (double stranded breaks, DSB)을 유도하고,이어서 본원에서 논의된 파괴를 유도한다. 다른 실시 양태에서, "닉카아제"라고 여겨지는 카스9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥에 흠을 내기 (nick) 위해 사용된다. 일부 측면에서, 예를 들어 특이성을 향상시키기 위해, 쌍을 이룬 닉카아제를 사용하는데, 이들은 닉(nick)을 동시에 도입할 때 5 '오버행이 도입되도록 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 각각 지시된다. 다른 실시 양태에서, 촉매적으로 불활성인 카스9는 유전자 발현에 영향을주기 위해 전사 억제 인자 또는 활성화 인자와 같은 이종 이펙터 도메인에 융합된다.
일부 실시 양태에서, 파괴는 서열을 유전자에 삽입하는 것을 포함한다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 템플릿 (template)은 "편집 템플릿" 또는 "편집 폴리뉴클레오티드"또는 "편집 서열"이라 지칭한다. 일부 측면에서, 외인성 템플릿 폴리뉴클레오티드는 편집 템플릿으로 지칭될 수 있다. 일부 측면에서, 재조합은 동종 재조합이다.
전형적으로, 내인성 크리스퍼 시스템과 관련하여, 크리스퍼 복합체 형성 (표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 카스 단백질과 복합체를 이루는 가이드 서열을 포함하는)은 표적 서열 내 또는 그 근처(예를 들어 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 또는 그 이상의 염기쌍 이내에)의 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 야기한다.
일부 실시 양태에서, 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부 (예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 또는 그 이상의 뉴클레오티드)를 포함할 수 있거나 이루어질 수 있는, 또한 예를 들어, 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 (mate) 서열의 전부 또는 일부에 대한 tracr 서열의 적어도 일부와의 혼성화에 의해, 크리스퍼 복합체의 일부를 형성할 수 있는, tracr 서열이 포함될 수 있다. 일부 실시 양태에서, tracr 서열은 CRISPR 복합체의 형성에서 혼성화 및 참여를 위한 tracr 메이트 (mate) 서열에 대해 충분한 상보성을 가진다. 표적 서열과 같이, 일부 실시 양태에서, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 일부 실시 양태에서, tracr 서열은, 최적으로 정렬된 경우, tracr 메이트 (mate) 서열의 길이에 따라 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 또는 99 %의 서열 상동상을 가진다.
일반적으로, tracr 메이트 (mate) 서열은 다음 중 하나 이상을 촉진하기 위한 tracr 서열과 충분한 상보성을 가지는 임의의 서열을 포함한다: (1) 상응하는 tracr 서열을 포함하는 세포에서 tracr 메이트 서열에 의해 플랭크된(flanked) 가이드 서열의 절단 (excision); 및 (2) 표적 서열에서의 크리스퍼 복합체의 형성. 여기서 크리스퍼 복합체는 trac 서열에 혼성화된 tracr 메이트 서열을 포함한다. 일반적으로 상보성의 정도는 tracr 메이트 서열과 tracr 서열의 최적 정렬을 기준으로 하여 두 서열 중 더 짧은 길이를 따른다.
최적 정렬은 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있으며, tracr 서열 또는 tracr 메이트 서열 중 어느 하나 내에서의 자가-상보성 (self-complementarity)과 같은 2 차 구조를 추가로 설명 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, tracr 서열과 tracr 메이트 서열 사이의 상보성의 정도는, 최적으로 정렬된 경우, 둘 중 짧은 것의 길이에 따라, 약 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97.5 %, 99 % 이상이거나 더 높다. 일부 실시 양태에서, tracr 서열은 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, tracr 서열 및 tracr 메이트 서열은, 둘 사이의 혼성화가 헤파린과 같은 2차 구조를 갖는 전사체를 생성하도록, 단일 전사체 내에 포함된다. 일부 측면에서, 헤어핀 구조에 사용하기 위한 루프 형성 서열은 4 뉴클레오티드의 길이이고, 서열 GAAA를 갖는다. 그러나, 더 길거나 더 짧은 루프 서열이 대체 서열 (alternative sequences)로 사용될 수 있다 . 일부 실시 양태에서, 서열은 뉴클레오티드 삼중항 (예 : AAA) 및 추가 뉴클레오티드 (예 : C 또는 G)를 포함한다. 루프 형성 서열의 예는 CAAA 및 AAAG를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 전사체 또는 전사된 폴리뉴클레오티드 서열은 2 개 이상의 헤어핀을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 전사체는 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 헤어핀을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 전사체는 최대 5 개의 헤어핀을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 단일 전사체는 폴리T 서열, 예컨대 6 개의 T 뉴클레오티드와 같은 전사 종결 서열을 추가로 포함한다 .
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 표적 부위에서 크리스퍼 시스템의 구성요소의 발현이 리스퍼 복합체의 형성을 유도하도록, 크리스퍼 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터가 세포 내로 도입된다. 예를 들어, 카스 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터에서 별도의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일한 또는 상이한 조절 요소로부터 발현된 2 개 이상의 요소는 단일 벡터 내에서 결합될 수 있으며, 제 1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성성분을 제공하는 하나 이상의 추가 벡터를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 단일 벡터에서 결합되는 크리스퍼 시스템 요소는 임의의 적합한 배향으로 (예를 들어, 두 번째 요소(의 "상류") 5' 또는 제 2 요소(의 "하류")에 대해 3 '에 위치된 하나의 요소와 같이) 배열될 수 있다. 하나의 요소의 코딩 서열은 제 2 요소의 코딩 서열의 동일하거나 반대의 가닥 상에 위치할 수 있고 동일하거나 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 단일 프로모터는 크리스퍼 효소 및 하나 이상의 가이드 서열, tracr 메이트 서열 (가이드 서열에 선택적으로 작동 가능하게 연결된) 및 하나 이상의 인트론 서열 내에 (예를 들어, 상이한 인트론에서 각각, 적어도 하나의 인트론에서 둘 이상 또는 단일 인트론에서 모두) 내장된 tracr 서열 중 하나 이상을 코딩하는 전사체의 발현을 유도한다. 일부 실시 양태에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 발현된다.
일부 실시 양태에서, 벡터는, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 ("클로닝 사이트"라고도 함)과 같은, 하나 이상의 삽입 부위를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 삽입 부위 (예를 들면, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 삽입 부위)가 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 일부 실시 양태에서, 삽입 부위에 가이드 서열을 삽입한 후 발현시 진핵 세포에서 가이드 서열이 표적 서열에 대해 크리스퍼 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하도록 하기 위하여, 벡터는 tracr 메이트 서열의 상류에 및 선택적으로 tracr 메이트 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소의 하류에 삽입 부위를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 벡터는 두 개 이상의 삽입 부위를 포함하며, 각각의 삽입 부위는 각 부위에서 가이드 서열의 삽입을 허용하기 위해 두 개의 tracr 메이트 서열 사이에 위치한다. 이러한 배열에서, 2 개 이상의 가이드 서열은 단일 가이드 서열, 2 개 이상의 상이한 가이드 서열 또는 이들의 조합의 2 개 이상의 복제물 (copies)을 포함할 수 있다.
다수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 구조물 (construct)이 세포 내의 다수한 상이한, 상응하는 표적 서열에 대한 크리스퍼 활성을 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 개 또는 그 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 또는 그 이상의 그러한 가이드 서열-함유 벡터가 제공될 수 있고, 선택적으로 세포에 전달될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 벡터는 카스 단백질과 같은 크리스퍼 효소를 코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. 카스 단백질의 비-제한적 예로, 카스1, 카스1B, 카스2, 카스3, 카스4, 카스5, 카스6, 카스7, 카스8, 카스9 (Csn1 및 Csx12로도 알려짐), 카스10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csx1, Cs2, Cs2, Cs2, Cs2, Cs2, Cs2, Cs2, Cs1, Cs2, Cs1, Cs2, Cs1, Cs2, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 동족체 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 이 효소는 알려져 있다; 화농연쇄상구균 (S. pyogenes) 카스9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2로 SwissProt 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 변형되지 않은 CRISPR 효소는 카스9와 같이 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 크리스퍼 효소는 카스9이고, 화농연쇄상구균 (S. pyogenes), 황색포도상구균 (S. aureus) 또는 폐렴구균 (S. pneumoniae)로부터 유래된 카스9일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 크리스퍼 효소는, 예를 들어 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 (complement) 내와 같은, 표적 서열의 위치에서 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 유도한다. 일부 실시 양태에서, 크리스퍼 효소는 표적 서열의 첫 번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 그 이상의 염기 쌍 이내의 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 유도한다.
일부 실시 양태에서, 벡터는, 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 한쪽 또는 양쪽 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 하기 위하여, 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이가 된 크리스퍼 효소를 코딩한다. 예를 들어, 화농연쇄상구균 (S. pyogenes)로부터 유래된 카스9의 RuvCⅠ 촉매 도메인에서의 아스파테이트-to-알라닌(aspartate-to-alanine) 치환 (D10A; 서열 번호 19)은 두 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 카스9을 닉카아제(단일 가닥을 절단한다)로 전환시킨다.
일부 실시 양태에서, 카스9 닉카아제는 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적으로하는 가이드 서열(들), 예를 들어, 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 이 조합은 양쪽 가닥을 흠집내어 NHEJ를 유도하는데 사용되게 할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 카스9 또는 스플릿 (split) 카스9은 엔도뉴클레아제 활성이 부족하다. 일부 실시 양태에서, 리절팅(resulting) 카스9 또는 스플릿 카스9은 표적 핵산 서열의 상보적인 서열, 예를 들어 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자를 포함하도록 설계된 가이드 RNA와 함께 발현된다. 일부 실시 양태에서, 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 카스9의 발현은 목적 유전자의 특이적인 침묵 (silencing) 또는 감소 (reduction)를 초래한다. 이 시스템을 크리스퍼 간섭(CRISPRi)이라고 한다 (Qi, Larson 외. 2013). 일부 실시 양태에서, 침묵 (silencing)은 전사 또는 번역 단계에서 발생할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 침묵은 전사를 직접 차단함으로써, 예를 들어 전사 신장 (transcription elongation)을 차단함으로써 또는 임의의 프로모터 내의 주요 시스-작용 모티프를 표적화함으로써 그의 동족의 트랜스-작용 전사 인자의 결합을 입체적으로 차단함으로써, 발생할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 카스9는 비-기능성 HNH 및 RuvC 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 카스9 또는 스플릿 카스9 폴리펩티드는 RuvC- 유사 및 HNH 도메인의 촉매 잔기에서 불활성화 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 클리비지 (cleavage) 카스9 활성에 필요한 촉매 잔기는 화농연쇄상구균 (S. pyogenes)의 카스9 (COG3513 - 서열 번호 : 18)의 C D10, D31, H840, H865, H868, N882 및 N891일 수 있거나 또는 카스 패밀리 구성원의 동족체 상에서 CLUSTALW 방법을 사용하여 위치를 정렬할 수 있다. 일부 실시 양태에서, HNH 또는 RuvC 모티프에 포함된 잔기는 상기 문단에 기재된 것들일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이들 잔기 중 임의의 것을 나머지 아미노산 중 임의의 하나, 예를 들어 알라닌 잔기로 대체할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 촉매 잔기에서의 돌연변이는 다른 아미노산에 의한 치환 또는 카스9의 촉매 도메인 중 하나 이상의 불활성화를 야기하는 아미노산의 결실 또는 부가를 의미한다.
카스9 단백질에서의 돌연변이의 비-제한적인 예는 당해 분야에 공지 (예, WO2015/161276를 참조)되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 제공된 방법에 따라 크리스퍼/카스9 시스템에 포함될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 크리스퍼 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 사람이 아닌 영장류를 포함하나 이에 한정되지 않는 포유 동물과 같은 특정 유기체의 것 또는 이로부터 유래한 것일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 갖는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈 (예, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개 또는 그 이상의 코돈)을 치환함으로써 목적하는 숙주 세포에서 발현을 증강시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 공정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 바이어스를 나타낸다. 코돈 바이어스 (유기체 간의 코돈 사용의 차이)는 종종 전령 RNA (mRNA)의 번역 효율과 관련이 있고, 이는 차례로 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA (tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존하는 것으로 여겨진다.
세포에서 선택된 tRNA의 우위는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 크리스퍼 효소를 코딩하다는 서열에서 하나 이상의 코돈 (예, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 또는 그 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
일부 실시 양태에서, 크리스퍼 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부이다 (예, 크리스퍼 효소 이외에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 도메인). 크리스퍼 효소 융합 단백질은 임의의 부가적인 단백질 서열 및 선택적으로 임의의 두 도메인 사이의 링커 서열을 포함 할 수 있다. 크리스퍼 효소에 융합될 수있는 단백질 도메인의 예로는 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하나 이상의 다음의 활성을 갖는 단백질 도메인을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다; 메틸라아제 활성, 디메틸라아제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활동, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 개질 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비-제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라아제 (GST), 겨자무과산화효소 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT) 베타-갈락토시다아제, 베타-글루쿠로니다아제, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed , DsRed , 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함한 자가 형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 크리스퍼 효소는 DNA 분자와 결합하거나 다른 세포 분자를 결합하는 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있으며, 말토오스 결합 단백질 (MBP), S-tag, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합물, GAL4A DNA 결합 도메인 융합물, 및 단순 포진 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합체를 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 크리스퍼 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수있는 부가적인 도메인은 US20110059502에 기재되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열의 위치를 확인하기 위해 태그된 크리스퍼 효소가 사용된다.
일부 실시 양태에서, 가이드 서열과 조합된 (경우에 따라 복합체화된) 크리스퍼 효소는 세포로 전달된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명에 따른 세포 내로 단백질 성분을 도입하는 방법 (예: 카스9 / gRNA RNP)은 물리적 전달 방법 (예를 들어 전기천공, 입자 총, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 세포 압축 또는 압착), 리포좀 또는 나노 입자를 통한 방법일 수 있다.
크리스퍼를 이용한 IDO-매개 면역 신호 전달에 관여하는 단백질 (예, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)의 녹아웃을 위해 상업적으로 이용가능한 키트, RNA 벡터 및 공여자 벡터가 이용가능하며, 예를 들어 Santa Cruz Biotechnology (예 : GCN2 CRISPR / Cas9 KO 플라스미드, 카탈로그 번호 sc-402313; Blimp-1 CRISPR / Cas9 KO plasmid Cat. 번호 sc-400585; ARNT CRISPR / Cas9 KO 플라스미드, Cat. No. sc-401039); Origene (예 : AHR 녹아웃 키트 및 gRNA 벡터, 카탈로그 번호 KN209832, Blimp-1 (PRDM1) 녹아웃 키트 및 gRNA 벡터, Cat. No. KN217363, CHOP (DDIT3) 녹아웃 키트 및 gRNA 벡터, Cat. KN201301, ATF4 녹아웃 키트 및 gRNA 벡터, Cat. 번호 202233 및 EIF2S1 녹아웃 키트 및 gRNA 벡터, Cat. KN200368)에서 입수 가능하다.
일부 측면에서, 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 IDO 매개-면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질 (예, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자는 CRISPR 복합체가 도입된 세포에서 변형된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 크리스퍼 복합체를 표적 폴리뉴클레오티드에 결합시켜 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 절단함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함하며, 상기 크리스퍼 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열과 혼성화하는 가이드 서열과 복합체화된 크리스퍼 효소를 포함하고, 상기 가이드 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화하는 tracr 메이트 서열과 연결된다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합하여 상기 결합이 상기 폴리 뉴클레오티드의 발현을 증가 또는 감소시키도록 하는 단계를 포함한다; 여기서 CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하고, 상기 가이드 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화하는 tracr 메이트 서열과 연결된다.
c. 제제, 분자를 파괴하는 유전자를 코딩하는 핵산 및 복합체의 전달
일부 측면에서, 핵산 저해 분자, 예를 들어 RNA 간섭 분자, DNA-표적화 분자, 그의 복합체 (예를 들어, Cas9/gRNA RNP), 또는 이들의 조합물을 포함하거나 또는 코딩하는 핵산이 세포에 투여되거나 도입된다. 일부 실시 양태에서, 이러한 핵산 분자 또는 이의 복합체는 당업계에 공지된 방법에 의해 세포, 예를 들어 T 세포에 도입될 수 있다. 이러한 방법은 재조합 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스), 리포좀 또는 나노 입자의 형태로의 도입을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시 양태에서, 방법은 마이크로인젝션, 전기천공, 입자 충격, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 세포 압축, 압착을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 세포에서 발현된다는 관점에서, 벡터, 특히 플라스미드 또는 바이러스에 포함될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 바이러스 및 비-바이러스계 유전자 전달 방법은 T 세포와 같은 세포 내로 핵산을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 배양 중인 세포 또는 숙주 생물에 성분을 코딩하는 핵산을 투여하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA (예를 들어 , 본원에 기술 된 벡터의 전사체), 네이키드 (naked) 핵산 및 리포좀과 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 핵산의 비-바이러스 전달의 방법에는 리포펙션 , 뉴클레오펙션 , 마이크로인젝션, 바이오리스틱스 (biolistics) , 비로좀 (virosome) , 리포좀, 면역리포좀, 다가양이온 또는 지질:핵산 복합체 (lipid:nucleic acid conjugates), 네이키드 DNA, 인공 비리온 (artificial virion), 및 DNA의 제제-강화 흡수 (agent-enhanced uptake)를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어, 미국 특허 Nos. 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예, TransfectamTM 및 LipofectinTM). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포 (예 : 시험관 내 또는 생체 외 투여) 또는 표적 조직 (예 : 생체 내 투여)에 전달되는 것일 수 있다. 다른 전달 비히클은 천연의 엔도시토시스 또는 파고시토시스 경로를 촉발시키는 중합체성 담체, 화학 담체, 리포플렉스, 폴리플렉스, 덴드리머, 나노 입자, 에멀젼 및/또는 제제를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 전달은 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 계 시스템의 사용을 통한다. 바이러스성 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 세포로 전달된 후에 에피솜 또는 집적된 게놈을 갖는다. 유전자 치료 과정에 대한 리뷰는 Anderson, Science 256 : 808-813 (1992); Nabel & Felgner , TIBTECH 11 : 211-217 (1993); Mitani & Caskey , TIBTECH 11 : 162-166 (1993); 딜런. TIBTECH 11 : 167-175 (1993); Miller, Nature 357 : 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10) : 1149-1154 (1988); Vigne , Restorative Neurology and Neuroscience 8 : 35-36 (1995); Kremer & Perricaudet , British Medical Bulletin 51 (1) : 31-44 (1995); Haddada et al. , Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); 및 Yu et al. , Gene Therapy 1 : 13-26 (1994)를 참조한다. 일부 실시 양태에서 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 핵산은 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 발현 벡터의 형태로 투여된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 레트로 바이러스 발현 벡터, 아데노 바이러스 발현 벡터, DNA 플라스미드 발현 벡터 또는 AAV 발현 벡터이다. 일부 실시 양태에서, 바이러스 벡터와 같은 도입된 벡터는 또한 CAR와 같은 유전적으로 조작된 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 이로부터 별도의 발현을 제어하기 위해 프로모터에 작동 가능하게 연결된 별도의 발현 카세트 상에 제공될 수 있다.
일부 측면에서, 리포터 유전자는 글루타티온-5-트랜스퍼라아제 (GST), 겨자무과산화효소 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT) 베타-갈락토시다아제, 베타-글루쿠로니다아제, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed , DsRed , 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함한 자가 형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 유전자 산물의 발현의 변경 또는 변형을 측정하기 위한 마커로서 작용하는 유전자 산물을 코딩하기 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 추가의 실시 양태에서, 유전자 산물을 코딩하는 DNA 분자는 벡터를 통해 세포 내로 도입될 수있다. 일부 실시 양태에서, 유전자 산물은 루시퍼라아제이다. 추가의 실시 양태에서, 유전자 산물의 발현은 감소된다.
일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 신호 전달에 관여하는 단백질 (예, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자의 녹다운 또는 녹아웃과 같은 유전적 파괴를 유도할 수 있는 제제는 리보핵산단백질 (RNP)와 같은 복합체로서 도입된다. RNP 복합체는 RNA 또는 gRNA 분자 와 같은 리보 뉴클레오티드의 서열, 및 카스9 단백질 또는 그의 변이체와 같은 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에있서, 카스9 단백질은 카스9 단백질 및 gRNA 분자, 예를 들어 특정 유전자를 표적으로하는 gRNA를 포함하는 RNP 복합체로서 전달된다. 일부 실시 양태에서, 유전자를 표적으로하는 하나 이상의 gRNA 분자 및 Cas9 효소 또는 그의 변이체를 포함하는 RNP 복합체는 물리적 전달 (예, 전기천공, 입자 총, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 세포 압축 또는 압착), 리포좀 또는 나노 입자를 통해 세포 내로 직접 도입된다. 특정 실시 양태에서, RNP는 GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2를 코딩하는 유전자를 표적으로하는 하나 이상의 gRNA 분자를 포함하고, 카스9 효소 또는 그의 변이체는 전기 천공을 통해 도입된다.
일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 신호 전달에 관여하는 단백질 (예, . GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자의 녹아웃 정도는, 다양한 시점 예를 들어 제제(약제) 도입 후 24 내지 72 시간에서, 세포에서의 유전자 파괴를 평가하기 위한 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 분석은 전사 또는 단백질 발현 수준 또는 세포 표면 발현 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
3. 조건부 시스템 (Conditional Systems)
일부 실시 양태에서, 제공된 조작된 세포는, IDO-매개 이화작용에 의해 양성적으로 또는 음성적으로 조절되는 것을 포함하여, IDO-매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는, 조건성 예를 들어 유도성, 단백질 발현을 유도하도록 변형된 세포를 포함한다. 일부 실시 양태에서, IDO 매개-이화작용 (예 : mTOR 또는 PKC 세타) 또는 아미노산 운반체 (예 :CD98hc, LAT1, LAT2 또는 PAT4)에 의해 음성적으로 조절되는 IDO-매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질의 재조합, 조작 또는 이소성 발현을 코딩하는 유전자의 발현은 조건부이다. 실시 양태에서, IDO-매개 이화작용에 의해 양성적으로 조절되는 단백질 (예. GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, IFNγ-R2)을 코딩하는 유전자의 결실, 녹아웃, 파괴, 발현의 감소, 발현의 파괴,상향조절의 억제 및/또는 기능의 억제는 조건성이다. 일부 실시 양태에서, 유전자의 조건성 억제는, 항원 수용체 (예 : CAR)에 의해 유도된 신호 전달, 혈액 내 검출 가능한 항원 수용체-발현 세포 (예 : CAR-T 세포)의 감소(decrease) 또는 감소(reduction), 생체 시료에서의 IFN-감마 또는 TNFα의 증가, 생물학적 샘플에서의 트립토판의 감소 및/또는 키누레닌 또는 다른 트립토판 대사 산물의 증가, 항원 수용체 (예 : CAR)로 조작된 투여된 세포의 지속성 (persistence)의 감소 시에, 및/또는 본원 기술된 임의의 파라미터와 같은 완전 표현형 (exhaustive phenotype)을 나타내는 세포에서 개시되거나 유발될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 조건성 억제는 증가된 노출 기간을 나타내는 세포를 유도함으로써 및/또는 치료 시간 및/또는 투여량 조절을 가능하게함 으로써 치료 적용을 용이하게 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, IDO 면역-매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질의 발현 또는 활성은 지속적 (constitutive)이다; 일부 실시 양태에서, 그러한 발현 또는 활성 중 하나 이상은 조건적으로, 예를 들어 하나 이상의 천연 또는 비-천연적 사건(event) 또는 분자에 의해 유도되거나 억제되도록 조작된다. 일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 신호 전달에 관여하는 단백질은 하나이상의 인핸서(들) 및/또는 트랜스활성화인자(들) 또는 억제인자 또는 발현 조절용, 예를 들어 전사 또는 번역 조절을 통한 발현 조절용, 다른 서열 또는 분자와 같은 유도 또는 억제 요소와 작동 가능하게 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된 operably linked" 또는 "작동 가능하게 결합된 (operably associated)"은 적어도 2 개 이상의 서열의 기능적 연결에 대한 지칭을 포함한다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 것은 프로모터와 제 2 서열 사이의 결합을 포함하고, 상기 프로모터 서열은 상기 제 2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시하고 매개한다. 작동 가능하게 결합되는 것은 유도 또는 억제 요소와 프로모터 사이의 결합을 포함하며, 여기서 유도 또는 억제 요소는 프로모터의 전사 활성화인자로서 작용한다.
일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질의 발현은 구성 프로모터 (constitutive promoter), 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있다. 일부 실시 양태에서, 발현은 조건성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화 인자의 제어 하에 있다.
일부 실시 양태에서, 조건부 프로모터 (conditional promoter), 인핸서 또는 트랜스활성화인자는 유도성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자, 억제성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자, 또는 조직-특이적 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자이다.
예시적인 조직-특이적 프로모터는 심장, 폐, 식도, 근육, 내장, 유방, 전립선, 위, 방광, 간, 비장, 췌장, 신장, 뉴런, 근육 세포, 백혈구, 불멸화 세포 (immortalized cell), 종양성신생세포 (neoplastic cell), 종양 세포, 암세포, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 침샘, 담즙 방광, 방광, 기관지, 후두, 인두, 동맥 모세 혈관, 정맥, 흉선, 하악 림프절, 장간막 림프절, 골수, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 부신 동맥, 뇌, 대뇌, 소뇌, 수질, 폰, 척수, 좌골 신경, 골격근, 평활근, 뼈, 고환, 부고환, 전립선, 정액 소포, 음경, 난소, 자궁, 유선, 질, 피부, 눈 또는 시신경에허 활성인 것을 프로모터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전형적 세포-특이적 프로모터는, Zhao-Emonet, et al. (2000) J. Gene. Med., 2: 416-에 기재된, CD4ㅇp 미니-프로모터/인핸서와 같은 T 세포를 포함한다.
일부 실시 양태에서, IDO-매개 면역 억제 신호 전달에 관여하는 단백질의 발현은 특히 신체, 질환, 활성화 상태 또는 조직의 비교적 높은 수준에서 발견되는 하나 이상의 특정 조건, 이벤트 또는 분자에 의존하는 (예를 들어 유도성 프로모터 또는 다른 요소를 통해 유도되거나 억제되는) 조건부이다 .
예를 들어, 일부 실시 양태에서, 프로모터는 저산소증, 글루코오스-불량 (glucose-poor) 또는 기타 영양-불량 조건, 아미노산 (예 : 트립토판) 또는 핵산 또는 지질과 같은 대사 산물의 결핍, 종양 미세 환경의 요소, 또는 대사 경로 또는 대사 산물 또는 이의 수준 (level)의 다른 요소에 의해 유도성이거나 억제성일 수 있다. 예를들어, Cao, et al. (2001) Gene Ther., 8: 1357-1362 및 Dachs, et al. (2000) Eur. J. Cancer, 36:1649-1660, and Greco et al., (2002) Gene Ther., 9:1403-1411을 참조한다.
일부 실시 양태에서, 발현은 활성화 신호 또는 경로, 또는 사이토 카인 또는 항원 수용체 (예 : CAR 또는 TCR)와 같은 특정 수용체를 통한 신호 전달에 따라 조절된다. 일부 실시 양태에서, 발현은 활성화 또는 증식성 이벤트에 의해 조절된다. 전형적 유도성 시스템은 NFκB , NFAT 또는 Nur77에 의해 활성화될 수 있는 시스템이다.
일부 실시 양태는, 본원에 기재된 임의의 핵산의 발현은 세포를 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이의 유사체와 같은 조절 인자로 처리함으로써 외부적으로 조절될 수 있다. 테트라사이클린의 유사체는 예를 들어 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메틸클로로-테트라사이클린 (demethylchloro-tetracycline), 메타사이클린, 독시사이클린및 미노사이클린이다.
일부 실시 양태에서, 유도성 전사 및/또는 발현은 상기 트랜스활성화인자와 함께 트랜스활성화인자 유도 프로모터를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 트랜스활성화인자 유도 프로모터는 트랜스유전자 또는 목적 핵산의 전사의 강화 또는 억제를 위한 조절 요소를 포함한다. 조절 요소에는 리미테이션 (limitation), 오퍼레이터, 인핸서 및 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 트랜스활성화인자 유도성 프로모터는 트랜스 활성화 인자에 결합 될 때 전사 활성을 가지며, 이는 차례로, 일련의 특정 조건 예를 들어 화학 신호의 특정 조합의 존재 또는 비 존재 하에서, 예를 들어 이전 목록으로부터의 예에서 선택된 조절 인자에 의해 활성화된다. 트랜스활성화인자 유도 프로모터는 몇몇의 tet-작동자 서열과 같은 트랜스활성화인자 결합 서열, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 tet-작동자 서열을 포함하도록 변형된, 본원에 언급된, 임의의 프로모터일 수 있다. 일부 실시 양태에서, tet-작동자 서열은 탠덤식이다. 일부 실시 양태에서, 프로모터는 테트라사이클린 반응 요소 (TRE)이다. 이러한 서열은 예를 들어 인간 U6 프로모터를 포함하여, U6 프로모터의 원위 서열 요소 (DSE)에서 Staf 및 Oct-1에 대한 기능적 인식 부위를 대체할 수 있다.
조절 인자의 존재 하에 발현을 유도하는 전사 조절인자 도메인의 특정 예는다음의 전사 조절인자에서 발견되는 전사 조절 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: Tet-On 전사 조절인자; 및 Tet-On Advanced 전사 조절인자 및 Tet-On 3G 전사 조절인자; 이들 모두는 Clontech Laboratories, Mountain View, CA로부터 입수 가능하다. 조절 인자의 존재 하에 발현을 유도하는 전사 조절인자 도메인의 특정 예는 다음의 전사 조절인자에서 발견되는 전사 조절 도메인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: Tet-Off 전사 조절인자; 및 Tet-Off Advanced 전사 조절인자, 둘 다 Clontech Laboratories, Mountain View, CA로부터 입수할 수 있다. 이들 시스템은 당업계에 공지되어 있고 당업자에게 친숙한 절차에 따라 적용되고 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 트랜스활성화인자 유도 프로모터는 억제성 핵산 분자에 에 작동가능하게 연결된 복수의 트랜스활성화인자 결합 서열을 포함한다.
트랜스활성화인자는, 트랜스활성화인자를 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 인자-의존성 프로모터를 포함하는 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터에서, 핵산 서열에 의해 제공될 수 있다.
용어 "상이한 발현 벡터 (different expression vector)"는 핵산 전달용 비히클 (예, 바이러스, 플라스미드, 코스미드 또는 트랜스포존)을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 핵산 서열에 사용하기에 적합한 프로모터는 예를 들어, 구성적, 조절 된, 조직-특이적 또는 유비쿼터스 프로모터를 포함하고, 이는 CMV, RSV, PGK, EF1α, NSE, 시냅신, β-액틴, GFAP와 같은 세포성, 바이러스성 또는 합성 유래 (synthetic origin)일 수 있다.
일부 실시 형태에 따른 전형적 트랜스활성화인자는 rtTA2-M2 및 Oct-2Q (Q → A) 활성화 도메인의 DNA 결합 도메인으로 구성된 rtTA-Oct2 트랜스활성화인자이다. 일부 실시 형태에 또 따른 전형적 트랜스활성화인자는 Tet-억제성 단백질 (E.coli) 및 Oct-2Q (Q → A) 활성화 도메인의 DNA 결합 도메인으로 구성된 rtTA-Oct3 트랜스활성화인자이다. 둘 모두 특허 출원 WO 2007/004062에 기술되어 있다.
일부 실시 양태는 조절 융합 단백질 (regulatory fusion protein, RPR)을 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 융합 단백질은 (1) 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있는 전사 차단 도메인, 및 (2) 리간드-결합 도메인을 포함하고, 리간드-결합 도메인에 결합할 수 있는 동족체 리간드의 존재 하에서, 상기 융합 단백질이 안정화된다.
일부 실시 양태에서, 전사 차단 도메인은 박테리아, 박테리오파지, 진핵 세포 또는 효모 억제자 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 전사 차단 도메인은 예를 들어, TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc, 및 LambdaCI와 같은 박테리아 또는 박테리오파지 억제자 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 양태에서, 전사 차단 도메인은 예를 들어 GAL4와 같은 진핵 세포 억제자 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 양태에서, 전사 차단 도메인은 DNA에 결합할 수 있지만 DNA를 절단할 수 없는 돌연변이된 제한 효소이다. 작동자 (operator)는 제한 효소의 인식 부위이다. 일부 실시 양태에서, 예를 들어, 전사 차단 도메인은 돌연변이 NotI이다.
일부 실시 양태에서, 리간드-결합 도메인은 스테로이드, 갑상선 또는 레티노이드 수용체로부터 유래된다. 일부 실시 양태에서, 리간드-결합 도메인은 에스트로겐 수용체로부터 유도되고, 동족체 리간드는 에스트로겐이다. 일부 실시 양태에서, 에스트로겐 수용체는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 T2 돌연변이를 함유하고, 동족체 리간드는 타목시펜이다. 이들 시스템은 당업계에 공지되어 있고 당업자에게 친숙한 절차에 따라 적용되고 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 RheoSwitch의 시스템은 전사를 조절하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, RheoSwitch 시스템은 Rheo수용체 및 Rheo활성화인자 단백질을 포함하고, 이는 RSH1 리간드의 존재에 의해 활성화될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 수용체 및 활성화인자는 RSL1 리간드의 존재 하에서 안정하게 이량화하고 반응 요소에 안정하게 결합하여 전사를 작동시킨다 (예를 들어, the Instruction Manual for "RheoSwitch® Mammalian Inducible Expression System," New England BioLabs® Inc., Version 1.3, November 2007; Karzenowski, D. et al., BioTechiques 39:191-196 (2005); Dai, X. et al., Protein Expr. Purif 42:236-245 (2005); Palli, S. R. et al., Eur. J. Biochem. 270:1308-1515 (2003); Dhadialla, T. S. et al., Annual Rev. Entomol. 43:545-569 (1998); Kumar, M. B, et al., J. Biol. Chem. 279:27211-27218 (2004); Verhaegent, M. 및 Christopoulos, T. K., Annal. Chem. 74:4378-4385 (2002); Katalam, A. K., et al., Molecular Therapy 13:S103 (2006); 및 Karzenowski, D. et al., Molecular Therapy 13:S194 (2006)를 참조한다).
일부 실시 양태에서, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 WO 2014/018423에 기술된 시스템 및 방법을 포함하여, 전자기 에너지가 전사를 조절하는데 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, RNA 전사의 제어 가능한 조절은, 예를 들어 포유류용으로 변형된 lac 억제자/작동자 시스템으로부터의, 억제자 결합 부위를 포함함으로써 달성될 수 있다. Hu 및 Davidson, 1987, 및 Kozak, 1986을 참조한다.
일부 실시 양태에서, 억제제이거나 또는 억제제를 코딩하는 것과 같은 도입 된 핵산은, 예를 들어 부위-특이적 재조합 방법을 사용함으로써, 숙주 게놈에서 통합 후 제거될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 억제제, 예를 들어 크리스퍼, gRNA, 카스, ZFP, ZFN, TALE, TALEN, RNAi, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA 및/또는 리보자임인 핵산 또는 이를 코딩하는 핵산은 loxP와 같은 재조합 부위 서열 사이에 위치한다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 부위-특이적 재조합 효소에 의해 매개되는 재조합을 위한 적어도 하나의 (전형적으로 2 개의) 부위를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 부위-특이적 재조합 효소는 보다 긴 DNA 분자로부터의 DNA 단편의 도입 또는 제거를 촉매한다. 일부 실시 양태에서, 이들 효소는 비교적 짧고 독특한 핵산 서열을 인식하며, 이는 인식과 재조합 모두에 도움이 된다. 일부 구체 예에서, 재조합 부위는 짧은 역위 반복 (6, 7 또는 8 개의 염기 쌍의 길이)을 포함하고 DNA 결합 요소의 길이는 길이가 약 11 내지 약 13bp 일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 벡터는 임의의 다양한 부위-특이적 재조합 효소에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위-특이적 재조합 효소에 대한 표적 부위는 바이러스성, 예를 들어 렌티바이러스성, 게놈의 통합에 필요한 임의의 부위에 추가로 존재한다는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시 양태에서, 핵산은 Cre , XerD, HP1 및 Flp 로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 효소를 위한 하나 이상의 부위를 포함한다. 이들 효소 및 이들의 재조합 부위는 당업계에 잘 알려져있다 (예를 들어, Sauer et al., 1989, Nucleic Acids Res., 17:147; Gorman et al., 2000, Curr. Op. Biotechnol, 11 :455; O'Gorman et al., 1991, Science, 251 : 1351; Kolb, 2002, Cloning Stem Cells, 4:65; Kuhn et al., 2002, Methods MoI. Biol, 180:175를 참조한다).
일부 실시 양태에서, 이들 재조합 효소는 2 개의 34-bp 인식 부위 (각각 loxP 및 FRT) 사이의 보존적 DNA 재조합 이벤트 (recombination event)를 촉매한다. 일부 실시 양태에서, 2 개의 loxP 부위 (이 경우, 서열이 "플록화 (floxed)"됨) 사이에서 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결된 이종 핵산 서열을 배치함으로써, 본원에 기술된 것과 같이, 세포로의 전달 후에 억제제를 코딩하는 도입된 핵산의 조절된 발현을 가능하게 한다. 세포 내에서 Cre의 발현의 유도에 의해, 이종 핵산 서열이 절제되어 (excised), 전사를 더 방지하고 및/또는 서열의 발현을 효과적으로 제거한다. 일부 실시 양태는 이종 또는 내인성 유전자가 예를 들어 억제 요소 또는 폴리아데 닐화 부위의 제거에 의해 활성화될 수있는 Cre-매개 유전자 활성화를 포함한다.
전술한 바와 같이, 이종 핵산 서열을 loxP 부위 사이에 위치시키는 것은 세포로의 전달 후에 이종 서열의 조절된 발현을 허용한다. 세포 내에서의 Cre 발현의 유도에 의해, 이종 핵산 서열이 절제되어 추가 전사를 방지하고 및/또는 서열의 발현을 효과적으로 제거 할 수 있다. Cre 발현은 다양한 방법으로 유도될 수 있다.
예를 들어, Cre는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 세포에 존재할 수 있고, Cre 발현은 프로모터를 활성화시킴으로써 유도될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, Cre 발현은 세포 내로 Cre의 발현을 유도하도록 하는 발현 벡터를 도입함으로써 유도될 수 있다. 임의의 적합한 발현 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에서 사용된 "Cre 발현의 유도 (inducing Cre expression)"라는 문구는 세포 내 Cre의 수준이 증가하는 임의의 과정을 의미한다.
2 개의 loxP 부위를 포함하는 렌티바이러스 전달 플라스미드는 2 개의 loxP 부위를 포함하는 표준 벡터 (standard vectors)가 사용될 수 있는 임의의 어플레케이션에서 유용하다. 예를 들어, 선택 가능한 마커가 loxP 부위 사이에 위치할 수 있다. 이것은 하나의 세포 (또는 그 자손)에 대한 다수의 유전자의 순차적 및 반복적 표적화를 허용한다. 플록화된 (floxed) 선택가능한 마커를 포함하는 플라스미드의 세포 내로의 도입 후, 안정한 형질감염체가 선택될 수 있다. 안정한 형질감염체를 단리 후, Cre의 유도에 의해 마커를 절제할 수 있다. 그런 다음 마커를 사용하여 세포 또는 그 자손에게 두 번째 유전자를 표적으로 할 수 있다. 전달 플라스미드로부터 유래된 렌티바이러스 게놈을 포함하는 렌티바이러스 입자는 동일한 방식으로 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 전달 플라스미드 및 렌티바이러스 입자가 세포, 조직 또는 유기체에서 구성적, 조건적, 가역적 또는 조직-특이적 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시 양태는 다음을 포함하는 세포에서 전사체를 가역적으로 발현시키는 방법을 포함한다: (i) 세포에 렌티바이러스 벡터를 전달하는 단계, 여기서 렌티바이러스 벡터는 이종 핵산을 포함하고, 이종 핵산은 부위-특이적 재조합 효소를 위한 부위 사이에 위치한다; 및 (ii) 세포 내에서 부위-특이적 재조합 효소의 발현을 유도함으로써, 이들 세포 내에서의 전사체의 합성을 방지하는 단계. 일부 실시 형태에 따르면, 부위-특이적 재조합 효소를 코딩하는 핵산은 유도 성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 유도 단계는 상기에서 기재된 바와 같이 프로모터를 유도하는 단계를 포함한다.
D. 유전적 조작(유전공학)을 위한 벡터 및 방법
재조합 수용체를 코딩하는 핵산 분자 및/또는 세포에서의 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 세포에서의 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 키누레닌-매개 면역-억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 단백질의 발현을 조절하는 제제를 코딩하는 핵산 분자의 도입은 임의의 다수의 공지된 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 그러한 벡터로는, 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템을 비롯하여 PiggyBac와 같은 트랜스포존 기반 시스템 또는 Sleeping Beauty 기반 유전자 전달 시스템을 포함하여, 바이러스 및 비-바이러스 시스템을 포함한다. 전형적 방법으로 바이러스 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질도입, 트랜스포존, 및 전기천공을 포함하여, 수용체를 코딩하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 유전자 전달은 예를 들어 반응 (예, 사이토카인 또는 활성화 마커에 의해 측정된 증식, 생존 및/또는 활성화)을 유도하는 자극과의 조합에 의해, 세포를 먼저 자극함으로써 달성되며, 이후 활성화된 세포의 형질도입 및 배양에서 임상 적용에 충분한 수로의 증식 (expansion) 이어진다.
일부 실시 양태에서, 유전자 전달 이전 또는 도중에, 본원에 기술된 임의의 것을 비롯한, 키누레린 경로 조절인자와 같은 트립토판 대사 경로의 조절인자의 존재 하에서, 세포가 항온 배양되거나 배양된다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 조절인자 (예 : IDO1 억제제)는 세포 제조 공정 중에, 예를 들어 CAR-T 세포를 조작하는 공정 중에 첨가된다. 일부 측면에서, 조절인자의 존재는 생산된 세포 집단의 품질을 향상시킬 수있다. 일부 측면에서, 조절인자 (예 : IDO1 억제제)는 세포의 증식 또는 체적증대를 증가시킬 수 있고, 또는 하나 이상의 신호 전달 경로를 변경시켜, 상당한 증식 및/또는 이펙터 기능을 나타냄에도 불구하고, 덜 분화되거나 덜 활성화된 표면 표현형을 갖는 세포를 유도할 있다.
일부 측면에서, 자극 인자 (예, 림포카인 또는 사이토카인)의 과발현은 대상에게 독성일 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 조작된 세포는, 입양면역요법(adoptive immunotherapy)에서의 투여 시와 같이, 생체 내에서 음성적인 선택(선별)을 받기 쉬운 유전자 단편을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포는 그들이 투여되는 환자의 생체 내 조건의 변화의 결과로서 제거될 수 있도록 설계된다. 음성의 선택가능한 표현형 (negative selectable phenotype)은 투여된 약제, 예를 들면 화합물에 감수성을 부여하는 유전자의 삽입에 기인할 수 있다.
음성의 선택가능한 유전자 (negative selectable genes)는 간시클로비르 (ganciclovir) 감수성을 부여하는 헤르페스 심플렉스 바이러스 I 형 티미딘 키나아제 (HSV-1 TK) 유전자 (Wigler et al., Cell II : 223, I977); 세포 내 히포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라아제 (HPRT, hypoxanthine phosphribosyltransferase) 유전자, 세포 내 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT, adenine phosphoribosyltransferase) 유전자, 박테리아 시토신 탈아미노효소 (bacterial cytosine deaminase)를 포함한다(Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
일부 실시 양태에서, 재조합 핵산은 예를 들어, 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달된다. 일부 실시 양태에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다 (예, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557을 참조한다).
일부 실시 양태에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(LTR)을 가지며, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (Moloney murine leukemia virus, MoMLV)로부터 유래된 레트로 바이러스 벡터와 같은 긴 말단 반복 서열(LTR), 골수증식성 육종 바이러스 (myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 쥐 배아 줄기 세포 바이러스 (murine embryonic stem cell virus, MESV), 쥐 줄기 세포 바이러스 (murine stem cell virus, MSCV), 비장 포커스 형성 바이러스 (spleen focus forming virus, SFFV) 또는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 유래의 레트로바이러스 벡터이다. 대부분의 레트로 바이러스 벡터는 쥐 레트로바이러스 (murine retroviruses) 유래 벡터이다. 일부 실시 양태에서, 레트로바이러스는 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유도된 것들을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 인간을 포함하여 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는 양쪽성 (amphotropic)이다. 일부 실시 양태에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기재되어 있다 (예, 미국 특허 Nos. 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller 및 Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).
렌티바이러스 형질 도입 방법이 알려져있다. 전형적 방법은 예를 들어, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; and Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505에 기재되어 있다.
일부 실시 양태에서, 재조합 핵산은 전기천공을 통해 T 세포 내로 전달된다 (예, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 and Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437를 참조한다).
일부 실시 양태에서, 재조합 핵산은 전위 (transposition)를 통해 T 세포 내로 전달된다 (예, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126을 참조한다).
면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법으로는 칼슘 포스페이트 형질감염 (예, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y), 원형질체 융합, 양이온성 리포좀-매개 형질감염; 텅스텐 입자-촉진 미세입자 충격 (Johnston, Nature, 346 : 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공-침전 (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
재조합 산물을 코딩하는 핵산의 전달을 위한 다른 방법 및 벡터는 예를 들어 국제 특허 출원, 공개 No.: WO2014055668, 및 미국 특허 No. 7,446,190에 기재되어 있다.
일부 실시 양태에서, 세포, 예를 들어, T 세포는 예를 들어 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 함께 증식 도중 또는 증식 후에 형질감염될 수 있다. 바람직한 수용체 유전자의 도입을 위한 이러한 형질감염은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포 집단은 초기 (제 1 ) 자극 (예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자극)으로부터 유리될 수 있고,이어서 예를 들어 de novo 도입된 수용체를 통해 제 2 유형의 자극으로 자극될 수 있다. 이러한 제 2 유형의 자극은 펩티드/MHC 분자, 유전적으로 도입된 수용체의 동족 (가교) 리간드 (예 : CAR의 천연 리간드) 또는 새로운 수용체의 골격 내에 직접 결합 (예를 들어, 수용체 내의 불변 영역을 인식함으로써)하는 임의의 리간드 (항체와 같은)의 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)를 참조한다.
일부 경우에서, 세포, 예를 들어 T 세포가 활성화되는 것을 요구하지 않는 벡터가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 활성화 전에 선택 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는 세포 배양 전 또는 배양 후, 경우에 따라서는 적어도 일부의 배양 기간과 동시에 또는 그 동안에 조작될 수 있다.
일부 측면에서, 세포는 추가로 사이토카인 또는 다른 인자의 발현을 촉진하도록 조작된다. 부가적인 핵산 중에서, 예를 들어, 도입 유전자는 세포의 생존력 및 또는 기능을 촉진시킴으로써 치료 활성 또는 치료 결과를 개선시키는 유전자; 생체 내 생존 또는 국소화 (localization)를 평가하는 것과 같은 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전적 마커를 제공하는 유전자; 예를 들어, 세포를 생체 내에서 음성적 선택(선별)에 민감하게 함으로써 안정성을 향상시킬 수 있는 유전자이다 (described by Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992) 참조); 우위의(우성의) 양성 선별 마커와 음성 선별 마커의 융합으로부터 유래된 2관능성 선택가능한 융합 유전자의 사용에 대해 기술하고 있는 공개공보 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601 by Lupton et al. 를 참조한다. 예를 들어, Riddell et al., 미국 특허 No. 6,040,177, 컬럼 14-17를 참조한다.
V. 제품 및 키트
또한 제공되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자(예를 들어 IDO1 억제제 및 면역 치료용 성분, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 또는 T 세포 치료(예를 들어 조작된 세포) 및/또는 이의 조성물을 포함하는 키트 및 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 실시 양태에서 용기는 조성물 그 자체로 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 유효한 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유한다. 일부 실시 양태에서, 용기는 무균 엑세스 포트(sterile access port)를 갖는다. 전형적 용기는 정맥 내 용액 봉지, 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 것을 포함하는 바이알, 또는 경구 투여용 보틀 또는 바이알을 포함한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 질환 또는 증상을 치료하는데 사용됨을 나타낼 수 있다. 제품은 (a) 면역 치료 예를 들어 T 세포 치료에 사용되는 항체 또는 조작된 세포를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 예를 들어, IDO1 억제제와 같은 제 2 제제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 제품은 조성물이 특정 증상을를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제를 포함하는 다른 또는 동일한 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및/또는 주사기와 같은 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 키트 또는 제품은 임의의 조작된 세포, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 조합물, 조성물, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 세트, 폴리뉴클레오티드 세트를 함유하는 조성물, 벡터, 벡터 세트, 벡터 세트를 함유하는 조성물, 키트, 추가의 치료제, 진단 및 또는 평가에 사용되는 제제 및 또는 면역치료를 위한 세포 조작을 위해 사용되는 제제를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 키트 또는 제품은 병용 치료 예를 들면, 면역 치료 (예, CAR-T 세포 치료와 같은 T 세포 치료) 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 위한 지침을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 키트 또는 제품은 병용 치료(요법)에 대한 적합성을 결정, 병용 치료(요법)로 치료하기 하기 위한 대상을 확인하는 것에 대한 스크리닝 및 평가 단계를 위한 지침 및/또는 병용 치료를 계속하면서, 치료 결과의 평가 및/또는 치료 결과를 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Ⅵ. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 용어, 표기법 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 기타 모든 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 몇몇 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이 한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에서의 그러한 정의의 포함은 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "약학적 제제 (pharmaceutical formulation)"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로서, 제제가 투여될 대상에게 허용되지 않는 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그것이 링크된(연결된) 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 벡터 중에는 레트로바이러스 (예, 감마 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터)와 같은 바이러스 벡터가 있다.
용어 "숙주 세포 (host cell)", "숙주 세포주 (host cell line)" 및 "숙주 세포 배양물 (host cell culture)"은 상호 교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입 된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체 (transformants)" 및 "형질전환된 세포 (transformed cells)"를 포함하는데, 여기에는 최초의 형질전환된 세포 및 계대의 수에 관계없이 그로부터 유래된 자손이 포함된다. 자손은 핵산이 모세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본원에 포함된다.
본원에서 사용되는, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성 (positive)"이라는 설명은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 상 또는 세포 내에서의 검출 가능한 존재를 지칭한다. 표면 마커를 언급 할 때, 상기 용어는 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 유동 세포 계측법에 의해 검출되는 표면 발현의 존재를 의미하며, 여기서 상기 염색은 동일한 조건 하에서 이소타입-정합된 (isotype-matched) 대조군과 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 상당히 높은 수준으로, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 상당히 유사한 수준으로, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 상당히 높은 수준으로 유동 세포 계측법에 의해 검출가능하다.
본원에서 사용되는, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성 (negative)"이라는 설명은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 상 또는 세포 내에서 실질적으로 검출 가능한 존재가 부재함을 지칭한다. 표면 마커를 언급 할 때, 상기 용어는 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 유동 세포 계측법에 의해 검출되는 표면 발현의 부재를 의미하고, 여기서 상기 염색은, 유동 세포 계측법에 의해, 동일한 조건 하에서 이소타입-정합된 대조군과 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 상당히 높은 수준으로 검출되지 않고, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 염색 수준보다 상당히 낮은 수준으로, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 것과 비교하여 상당히 유사한 수준으로 검출되지 않는다.
본원에서, 아미노산 서열 (기준 폴리펩티드 서열)에 대해 사용되는 경우 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성 (percent (%) amino acid sequence identity)" 및 "퍼센트 동일성 (percent identity)"은, 서열을 정렬하고, 필요한 경우 갭 (gap)을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 이후의, 기준 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 (예, 대상 항체 또는 단편) 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당 업계의 기술 범위 내에있는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에서 사용된 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, "a"또는 "an"은 "적어도 하나"또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 명세서에 기술된 양상들 및 변형들은 양상들 및 변형들을 "구성하는 (consisting)" 및/또는 "본질적으로 이루어진 (consisting essentially of)"을 포함하는 것으로 해석된다.
이 개시를 통해, 청구된 주제의 다양한 양태가 범위 형식 (range format)으로 제시된다. 범위 형식의 설명은 편의상 및 간략화를 위한 것이며 청구대상의 범위에 대한 유연성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위-범위 및 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 기타 명시되거나, 명시된 범위 내의 개재된 값은 청구대상 내에 포함되는 것으로 이해된다. .
본원에서 사용되는 "약 (about)"이라는 용어는 이 기술 분야의 당업자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본원에서의 값 또는 파라미터에 대한 “약 (about)”의 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체를 지시하는 실시 양태를 포함한다 (및 설명한다). 예를 들어, "약 (about) X"에 대한 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다.
본원에서 사용되는, 조성물은 세포를 포함하는 2 종 이상의 산물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 활성 성분 이외의, 약제학적 제제의 성분으로서, 대상에게 비독성인 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상 (subject)"은 인간 또는 다른 동물과 같은 포유 동물이며 전형적으로는 인간이다. 일부 실시 양태에서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 조작된 세포 또는 조성물이 투여되는 대상, 예를 들어 환자는 포유류, 전형적으로 인간과 같은 영장류이다. 일부 실시양태에서, 영장류는 원숭이 (monkey) 또는 유인원 (ape)이다. 대상은 남성 또는 여성이 될 수 있으며 유아, 청소년, 청년, 성인 및 노인을 비롯하여 적절한 연령이 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대상은 설치류와 같은 영장류가 아닌 포유 동물이다.
본원에서 사용되는, "치료 (treatment)"(및 “treat” 또는 “treating”과 같은 문법적 변형)는 질환 또는 증상 또는 장애, 또는 징후, 부작용 또는 결과, 또는 그것과 관련된 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 지칭한다.
치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행률 감소, 질환 상태, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 용어는 질환의 완치 또는 임의의 증상 또는 모든 증상 또는 결과에 미치는 영향의 완전한 제거를 의미하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는, "질환 진행의 지연 (delaying development of a disease)"은 질환 (예컨대, 암)의 진행을 연기(defer), 방해, 지연(slow), 지연(retard), 안정화, 억제 및/또는 연기(postpone)하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질환 및/또는 치료받는 개인의 병력에 따라 다양한 기간이 될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 상당한 지연은 사실상 개체에게 질환을 발병시키지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전이의 진행과 같은 말기 암이 지연될 수 있다.
본원에서 사용되는 "예방 (preventing)"은 질환에 걸리기 쉽지만 아직 질환으로 진단되지 않은 대상에서 질환의 발생 또는 재발에 관한 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 제공된 세포 및 조성물은 질환의 진행을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추는데 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 기능 또는 활성을 "억제 (suppress)"시키는 것은, 대상(interest)의 조건 또는 매개 변수를 제외하고 동일한 조건과 비교할 때, 또는 대안적으로는 다른 조건과 비교하여 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는, 상기 세포가 없는 경우에 종양의 성장 속도와 비교하여, 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
투여의 측면에서의 제제, 예를 들어 약학적 제제, 세포 또는 조성물의 "유효량 (effective amount)"은 치료적 또는 예방적 결과와 같은 원하는 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안의 유효한 양을 의미한다.
제제, 예를 들어, 약학적 제제 또는 조작된 세포의 "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 원하는 치료 결과 예를 들어 질환, 증상 또는 장애의 치료, 및/또는 치료의 약물동력학적 또는 약력학적 효과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 치료적 유효량은 대상의 질환 상태, 연령, 성별 및 중량, 및 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 (예, IDO1 억제제 또는 조작된 세포)와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 제공된 방법은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자, 예를 들어, IDO1 억제제, 조작된 세포 또는 조성물을 유효량, 예를 들어, 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
Ⅶ. 예시적 실시 양태들
제공되는 실시 양태들:
1. 치료방법으로서,
(a) 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및
(b) 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 전 1일 이전의 시점에서, 및/또는 T 세포 치료의 투여 전 1일 이전의 시점에서 시작하는 것인, 방법.
2. 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계를 포함하는 치료방법으로서, 상기 대상은 T 세포 치료의 개시 전 1일 이전의 시점에서 시작되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량이 투여된 대상인, 방법.
3. 실시 양태 1 또는 실시 양태 2에 있어서, 상기 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 전 2일, 3일, 6일, 12일, 15일, 30일, 60일 또는 90일 내에 또는 그 이전 시점 내에, 또는 약 2일, 약 3일, 약 6일, 약 12일, 약 15일, 약 30일, 약 60일 또는 약 90일 내에 또는 그 이전 시점 내에 개시하는 것인, 방법.
4. 실시 양태 1-3 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료의 투여의 개시와 함께 또는 T 세포 치료의 투여의 개시 이후, 및/또는 T 세포 치료의 투여와 함께 또는 T 세포 치료의 투여 이후, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 연속적인 투여를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
5. 실시 양태 1-4 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료의 투여의 개시 이후 및/또는 T 세포 치료의 투여 이후, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
6. 치료방법으로서,
(a) 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및
(b) T 세포 치료의 투여의 개시 이후 및/또는 T 세포 치료의 투여 이후. 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계 및/또는 T 세포 치료를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
7. 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상은 이전에 T 세포 치료의 투여를 받는 대상인 치료방법.
8. 실시 양태 1-7 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 수행될 수 있는 것인, 방법.
9. 치료방법으로서,
(a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및
(b) 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 수행될 수 있는 것인, 방법.
10. T 세포 치료를 투여받은 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 수행될 수 있는 것인, 방법.
11. 실시 양태 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 증상이 암인, 방법.
12. 실시 양태 9 또는 실시 양태 11에 있어서, (b) 단계에서 수행되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여의 개시 및/또는 T 세포 치료의 투여 전, 이와 동시에 및/또는 이의 개시 후에 투여되는 것인, 방법.
13. 실시 양태 9, 11 또는 실시 양태 12 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 수행되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 전 2일, 3일, 6일, 12일, 15일, 30일, 60일 또는 90일 내에 또는 이 이전 시점 내에, 또는 약 2일, 약 3일, 약 6일, 약 12일, 약 15일, 약 30일, 약 60일 또는 약 90일 내에 또는 이 이전 시점 내에 시작하는 것인, 방법.
14. 실시 양태 9-12 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 T 세포 치료의 투여 개시 후 및/또는 T 세포 치료의 투여 후에 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
15. 실시 양태 5-12, 14 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 하기 시기에 투여되는 것인, 방법:
T 세포 치료의 투여 개시 전 및/또는 T 세포 치료 투여 전과 비교하여, 또는 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플 내의 트립토판의 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점, 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점의 대상과 비교하여 대상의 혈액에서 검출할 수 있는 T 세포 치료의 세포 수의 감소되기 전의 시기;
T 세포가 장시간의 트립토판 고갈, 소진, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 징후를 나타내기 전의 시기;
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출될 수 있기 전의 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 전 및/또는 T 세포 치료 투여 전과 비교하여, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점(투여 개시 후 시점 전) 및/또는 T 세포 치료 투여 후 이전 시점과 비교하여 대상의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFNγ)의 수준이 증가하는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에서의 대상과 비교하여 및/또는 T 세포 치료 투여 후 이전 시점의 대상과 비교하여, 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소되는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후의 대상 또는 T 세포 치료 투여 후의 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수와 비교하여, 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배 또는 100-배 또는 이 이상이거나, 약 1.5-배, 2-배, 3-배, 4- 배, 5-배, 10-배, 50-배 또는 100-배 또는 이 이상 감소되는 시기; 및/또는
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출 가능한 시기 이후에, 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 대상의 혈액에서의 총 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만 또는 0.1 % 미만이 되는 시기.
16. 실시 양태 15에 있어서, 상기 증가 또는 감소는 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
17. 실시 양태 5-12 및 14-16 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일 내에 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일 내에 투여되는 것인, 방법.
18. 실시 양태 5-12 및 14-17 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에 투여되는 것인, 방법.
19. 실시 양태 15 또는 16에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청 또는 혈장 또는 종양 샘플 또는 종양인, 방법.
20. 실시 양태 1-19 항 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시키는 것인, 방법.
21. 실시 양태 1-20 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 차단하거나 감소시키거나, 키누레닌 대 트립토판의 비를 감소시키는 것인, 방법.
22. 실시 양태 21에 있어서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산(3-HAA)에서 선택된 것인, 방법.
23. 실시 양태 1-22 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물 (antibody mimetic), 앱타머, 또는 핵산 분자인, 방법.
24.
실시 양태 1-23 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제인, 방법.
25. 실시 양태 1-23 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)의 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소의 억제제인, 방법.
26. 실시 양태 1-23 및 25 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 방법.
27. 실시 양태 1-23 및 25 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제인, 방법.
28. 실시 양태 6-23, 25 및 27 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 IDO1의 억제제이고, IDO1의 억제제는 T 세포 치료의 투여 개시 전 및/또는 T 세포 치료의 투여 전과 비교하여, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 샘플내의 IDO1의 발현 또는 활성이 증가되는 시기에 투여되는 것인, 방법.
29. 실시 양태 1-23 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인, 방법.
30. 실시 양태 1-29 중 어느 한 항에 있어서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 IDO1에 대해 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 IDO1 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않고/않거나;
암은 T 세포 치료의 투여 개시 전 및/또는 T 세포 치료 투여 전에 TDO에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 TDO 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않는 것인, 방법.
31. 실시 양태 30에 있어서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 IDO1에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 또는 T 세포 치료의 투여 전에 IDO1 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않는 것인, 방법.
32. 치료방법으로서,
(a) 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계로서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1) 또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 IDO1 양성 암 또는 TDO 양성 암의의 발현에 대해 선택되지 않고;
(b) IDO1 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
33. 실시 양태 32에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여의 개시 전, 개시와 동시 및/또는 개시 후에, 및/또는 T 세포 치료의 투여 전, 투여와 동시 및/또는 투여 후에 투여되는 것인, 방법.
34. IDO1 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을, 먼저 T 세포 치료를 투여 받은, 질환 또는 증상, 선택적으로 암을 갖는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1) 또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 IDO1 양성 암 또는 TDO 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않는 것인, 방법.
35. IDO1 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 먼저 투여 받은, 질환 또는 증상, 선택적으로 암을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1) 또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 IDO1 양성 암 또는 TDO 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않는 것인, 방법.
36. 실시 양태 32-35 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 증상이 암인, 방법.
37. 실시 양태 32-35 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치이며, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 수행될 수 있는 것인, 방법.
38. 실시 양태 32-35 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료 투여의 개시 후에, 및/또는 T 세포 치료의 투여 후에 투여되는 것을 포함하는 것인, 방법.
39. 실시 양태 32-34 및 36-38 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 하기 시기에 투여되는 것인, 방법:
T 세포 치료의 투여 개시 전 및/또는 T 세포 치료의 투여 전과 비교하여, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플내의 트립토판의 수치의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여 대상의 혈액에서 검출할 수 있는 T 세포 치료의 세포 수의 감소되기 전의 시기;
T 세포가 장시간의 트립토판 고갈, 소진, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 징후를 나타내기 전의 시기;
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출될 수 있기 전의 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 및/또는 T 세포 치료의 투여 전과 비교하여, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여 대상의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFNγ)의 수준이 증가하는 시기.
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에서의 대상과 비교하여 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점의 대상과 비교하여, 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소되는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후의 대상 또는 T 세포 치료의 투여 후의 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수와 비교하여, 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배 또는 100-배 또는 이 이상이거나, 약 1.5-배, 2-배, 3-배, 4- 배, 5-배, 10-배, 50-배 또는 100-배 또는 이 이상 감소되는 시기; 및/또는
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출 가능한 시기 이후에, 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 대상의 혈액에서의 총 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만 또는 0.1 % 미만이 되는 시기.
40. 실시 양태 39에 있어서, 증가 또는 감소는 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
41. 실시 양태 32-34 및 36-40 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 시작 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 내에 투여되는 것인, 방법.
42. 실시 양태 32-34 및 36-41 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 시작후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에 투여되는 것인, 방법.
43. 실시 양태 32, 33 및 35-37 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전, 0 내지 96시간, 0 내지 72 시간, 0 내지 48 시간, 0 내지 24 시간, 0 내지 12 시간 또는 0 내지 6 시간 또는 0 내지 2 시간 또는, 약 0 내지 96시간, 약 0 내지 72 시간, 약 0 내지 48 시간, 약 0 내지 24 시간, 약 0 내지 12 시간 또는 약 0 내지 6 시간 또는 약 0 내지 2 시간에 투여되거나; 또는
(b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전, 96 시간, 72 시간, 48 시간, 24 시간, 12 시간, 6 시간, 2 시간 또는 1 시간 이내에 투여되는 것인, 방법.
44. 실시 양태 1-23 및 25-43 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, epacadostat), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물(프로드러그) 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 방법.
45. 실시 양태 44에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)인, 방법.
46. 실시 양태 44에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인, 방법.
47. 실시 양태 32-43 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인, 방법.
48. 다음의 단계를 포함하는 치료방법:
(a) 질환 또는 증상, 선택적으로 암을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및
(b) 상기 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 단계로서, 상기 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 선택적으로 에파카도스타드이거나, 이를 포함하는 것인 단계.
49. 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 상기 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 선택적으로 에파카도스타트이거나 이를 포함하며, 대상은 T 세포 치료를 투여받았던 대상인, 방법.
50. 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 대상은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여받았던 대상이며, 여기서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 선택적으로 에파카도스타트이거나 이를 포함하는, 방법.
51. 실시 양태 48-50 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 증상이 암인, 방법.
52. 실시 양태 1-51 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료를 대상에게 투여할 때, T 세포 치료의 개시 전의 대상에게서의 IFN-감마(IFNγ)의 수준과 비교하여, 종양의 주위 환경에서 대상 내의 또는 대상의 혈청 또는 혈장 샘플 내의 IFN-감마의 수준을 증가 또는 상승시키는 것인, 방법.
53. 실시 양태 1-52 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료는 종양 침투성 림프구성(TIL) 치료 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 T 세포 치료이거나 이를 포함하는 것인, 방법.
54. 실시 양태 53에 있어서, T 세포 치료는 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 세포이거나 이를 포함하는 것인, 방법.
55. 실시 양태 54에 있어서, 유전적으로 조작된 세포는 IDO-매개된 면역 억제 신호 전달(시그널링)과 연관된 분자, 트립토판 고갈 또는 불충분의 감지 또는 반응과 연관된 분자 또는 세포 내에서 키누레닌-매개된 면역억제를 감지 또는 반응하는 분자의 발현의 변경을 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
56. 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 유전적으로 조작된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) IDO-매개된 면역 억제 신호전달과 연관된 분자, 트립토판 고갈 또는 불충분의 감지 또는 반응과 연관된 분자 또는 세포 내에서 키누레닌-매개된 면역 억제를 감지 또는 반응하는 분자의 발현의 변형을 포함하는 것인, 방법.
57. 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 유전적으로 조작된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) 재조합, 조작된 및/또는 이소적으로(ectopically) 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬, 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 단백질 또는 변이체를 포함하는 것인, 방법.
58. 실시 양태 57에 있어서, (b) 대상에게 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
59. 다음의 단계를 포함하는 치료방법:
(a) 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상에게 유전전으로 조작된 T 세포를 투여하는 단계로서, 상기 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) IDO-매개된 면역 억제 신호전달과 연관된 분자, 트립토판 고갈 또는 불충분의 감지 또는 반응과 연관된 분자 또는 세포 내에서 키누레닌-매개된 면역 억제를 감지 또는 반응하는 분자의 발현의 변형을 포함하는 것인 단계; 및
(b) 상기 대상에 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 단계.
60. 실시 양태 56-59 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 증상은 암인, 방법.
61. 실시 양태 56-60 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 L-타입 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), CD98 중쇄 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) 및/또는 양성자-보조 (proton-assisted) 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)의 발현에 대해 양성인 종양을 갖는 대상, 또는 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 대해 양성인 종양 미세환경에서 세포를 갖는 대상으로부터 선택된 것인, 방법.
62. 실시 양태 56-60 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시키는 것인, 방법.
63. 실시 양태 59-62 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판의 이화작용을 차단하거나 감소시키거나, 또는 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 차단하거나 감소시키는 것인, 방법.
64. 실시 양태 63에 있어서, 트립토판 대사 산물은, 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산(3-HAA)에서 선택된 것인, 방법.
65. 실시 양태 59-64 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 유사체, 앱타머, 또는 핵산 분자인, 방법.
66. 실시 양태 59-65 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 카누레니나아제(kynureninase)의 길항제인, 방법.
67. 실시 양태 59-66 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)의 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소의 억제제인, 방법.
68. 실시 양태 59-65 및 67 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 방법.
69. 실시 양태 59-65 및 67 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제인 방법.
70. 실시 양태 59-65 및 50-52 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 방법.
71. 실시 양태 70에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)인, 방법.
72. 실시 양태 70에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인, 방법.
73. 실시 양태 59-65 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인, 방법.
74. 실시 양태 48-73 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 조합하여 수행될 수 있는 것인, 방법.
75. 실시 양태 48-55 및 57-74 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여의 개시 전, 개시와 동시 및/또는 개시 후에, 및/또는 T 세포 치료의 투여 전, 투여와 동시 및/또는 투여 후에 투여되는 것인, 방법.
76. 실시 양태 48-55 및 57-75 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여의 개시 후에, 및/또는 T 세포 치료의 투여 후에 투여되는 것을 포함하는 것인, 방법.
77. 실시 양태 48-55 및 57-76 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 하기 시기에 투여되는 것인, 방법:
T 세포 치료의 투여 개시 전 및/또는 T 세포 치료의 투여 전과 비교하여, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플 내의 트립토판의 수치의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여, 대상의 혈액에서 검출할 수 있는 T 세포 치료의 세포 수가 감소되기 전의 시기;
T 세포가 장시간의 트립토판 고갈, 소진, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 징후를 나타내기 전의 시기;
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출될 수 있기 전의 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 전의 대상에게서와 비교하여 및/또는 T 세포 치료의 투여 전의 대상에게서와 비교하여, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFNγ)의 수준이 증가하는 시기.
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에서의 대상과 비교하여 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점의 대상과 비교하여, 대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 감소되는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후의 대상 및/또는 T 세포 치료의 투여 후의 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수와 비교하여, 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배 또는 100-배 또는 이 이상이거나, 약 1.5-배, 2-배, 3-배, 4- 배, 5-배, 10-배, 50-배 또는 100-배 또는 이 이상 감소되는 시기; 및/또는
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출 가능한 시기 이후에, 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 대상의 혈액에서의 총 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만 또는 0.1 % 미만이 되는 시기.
78. 실시 양태 77에 있어서, 증가 또는 감소는 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나, 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
79. 실시 양태 48-55 및 57-78 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 시작 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28일 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28일 내에 투여되는 것인, 방법.
80. 실시 양태 48-55 및 57-79 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 시작후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에 투여되는 것인, 방법.
81. 실시 양태 48-55 및 57-79 중 어느 한 항에 있어서,
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전, 0 내지 96시간, 0 내지 72 시간, 0 내지 48 시간, 0 내지 24 시간, 0 내지 12 시간 또는 0 내지 6 시간 또는 0 내지 2 시간, 또는 약 0 내지 96시간, 약 0 내지 72 시간, 약 0 내지 48 시간, 약 0 내지 24 시간, 약 0 내지 12 시간 또는 약 0 내지 6 시간 또는 약 0 내지 2 시간에 투여되거나; 또는
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전, 96 시간, 72 시간, 48 시간, 24 시간, 12 시간, 6 시간, 2 시간 또는 1 시간 이내에 투여되는 것인, 방법.
82. 실시 양태 55-81 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 분자, 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 일부 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현을 포함하는 것인, 방법.
83. 실시 양태 55-82 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 mTOR 또는 단백질 키나제 C 세타 (PKC-Θ)인, 방법.
84. 실시 양태 55-82 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체인, 방법.
85. 실시 양태 84에 있어서, 아미노산 수송체가 트립토판 수송체인, 방법.
83. 실시 양태 84 또는 실시 양태 85에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 rBAT (SLC3A1), CD98 중쇄 (4F2hc, SLC3A2), L 형 아미노산 수송체 1 (LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), Asc 형 아미노산 수송체 1 (Asc-1, SLC7A10), 소듐 및 클로라이드-의존성 중성 및 염기성 아미노산 수송체 B (0+) (ATB0,+; SLC6A14), 소듐-의존성 중성 아미노산 수송체 B (0) AT1 (B (0) AT1; SLC6A19), 모노카르복실레이트 수송체 10 (TAT1; SLC16A10) 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된 것인, 방법.
87. 실시 양태 84-86 중 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 서열 번호 36 내지 44 중 중 어느 하나 또는 이의 일부로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 36 내지 44 중 중 어느 하나 또는 이의 일부로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
88. 실시 양태 84-87 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된 것인, 방법.
89. 실시 양태 84-87 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 이의 일부를 포함하는 것인, 방법.
90. 실시 양태 84-88 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 서열 번호 37 내지 39 및 44 중 어느 하나 또는 그의 일부로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 37 내지 39 및 44 중 어느 하나 또는 그의 일부로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
91. 실시 양태 82-90 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서의 분자의 발현이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 방법.
92. 실시 양태 55-91 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 GCN2 키나아제, BLIMP-1, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 수송 체 (ARNT), 진핵세포 번역개시인자 2α (eIF2α), 활성화 번역인자 4 (ATF4), CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질 (CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein, CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및 IFNγ-R2 중에서 선택된 것인, 방법.
93. 실시 양태 92에 있어서, 분자가 GCN2 또는 CHOP인, 방법.
94. 실시 양태 55-81, 92 및 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 분자의 감소 된 발현을 포함하는 것인, 방법.
95. 실시 양태 94에 있어서, 조작된 세포가 억제성 핵산 또는 분자의 발현을 감소시키는 유전적 파괴를 포함하는 것인 방법.
96. 실시 양태 94 또는 실시 양태 95에 있어서, 세포에서 분자의 발현이, 억제성 핵산 또는 유전자 파괴가 없는 세포에서의 발현과 비교하여, 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 % 감소되는 것인, 방법.
97. 실시 양태 95 또는 실시 양태 96에 있어서, 억제성 핵산을 세포 내로 도입하여 분자 발현을 감소시키는 것을 포함하는 것인, 방법.
98. 실시 양태 96 또는 실시 양태 97에 있어서, 억제성 핵산을 코딩하거나 생산하는 핵산을 세포 내로 도입하여 분자 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
99. 실시 양태 96-98 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포가 억제성 핵산을 포함하고, 억제성 핵산이 RNA 간섭제를 포함하는 것인, 방법.
100. 실시 양태 95-99 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산은 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA-적응(adapted) shRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 헤어핀 siRNA, 마이크로 RNA (miRNA-전구체) 또는 마이크로 RNA (miRNA)이거나, 이를 포함하는 것인, 방법.
101. 실시 양태 95-100 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산의 발현은 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 방법.
102. 실시 양태 95 또는 실시 양태 96에 있어서, 조작된 세포는 유전적 파괴를 포함하고;
상기 파괴는 DNA 수준에서 분자를 코딩하는 유전자를 파괴시키는 것을 포함하고/하거나,
상기 파괴는 비가역적이고/이거나;
상기 파괴는 일시적이지 않은 것인, 방법.
103. 실시 양태 95, 96 및 102 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하거나 또는 혼성화화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 방법.
104. 실시 양태 95, 96, 102 및 103 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 (a) DNA-표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-유도 뉴클레아제를 도입하는 것인, 방법
105. 실시 양태 104에 있어서, DNA-표적화 단백질 및 RNA-유도 뉴클레아제는 징크 핑거 단백질 (ZFP), TAL 단백질, 또는 유전자에 특이적인 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid, CRISPR)를 포함하는 것인, 방법.
106. 실시 양태 95, 96 및 102-105 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 분자를 코딩하는 유전자에 결합, 인식, 또는 혼성화하는 크리스퍼-카스9 (CRISPR-Cas9) 조합물을 포함하는 제제를 세포 내로 도입시키는 것을 포함하는 것인, 방법.
107. 실시 양태 106에 있어서, 제제는 크리스퍼-카스9 조합물이고, 크리스퍼-카스9 조합물은 유전자에서의 표적 서열에 상보적이고/이거나 혼성화될 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 것인, 방법
108. 실시 양태 95, 96 및 102-107 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 파괴는 유도성인 것인, 방법.
109. 실시 양태 108에 있어서, 크리스퍼-카스9 조합물이 유도성 크리스퍼-카스9이고/이거나, 카스9이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 방법.
110. 실시 양태 95, 96 및 102-109 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 적어도 하나의 엑손의 적어도 일부의 결실을 포함하는 것인, 방법.
111. 실시 양태 95, 96 및 102-110 중 어느 한 항에 있어서,
파괴는 유전자 내의 조기 정지 코돈의 존재를 초래하는 유전자 내의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함하고/하거나;
파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 제 1 또는 제 2 엑손 내에서의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함하는 것인, 방법.
112. 실시 양태 91, 101 또는 109 중 어느 한 항에 있어서, 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자는 유도성 프로모터, 인핸서, 또는 트랜스활성화인자 또는 억제성 프로모터, 인핸서, 또는 트랜스활성화인자인, 방법.
113. 실시 양태 112에 있어서, 프로모터가 RNA pol I 프로모터; pol II 프로모터, 선택적으로 CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터; 또는 pol III 프로모터, 선택적으로 U6 또는 H1 프로모터 중에서 선택되는 것인, 방법.
114. 실시 양태 112 또는 실시 양태 113에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터인, 방법.
115. 실시 양태 114에 있어서, 프로모터가 NFκB 또는 NFAT에 대한 결합 부위를 포함하는 것인, 방법.
116. 실시 양태 114에 있어서, 프로모터가 Lac 작동 서열, 테트라사이클린 작동 서열, 갈락토스 작동 서열 또는 독시사이클린 작동 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체인, 방법.
117. 실시 양태 114에 있어서, 프로모터가 억제성 유전자인, 방법.
118. 실시 양태 117에 있어서, 프로모터가 Lac 억제자 또는 테트라사이클린 억제자 또는 그의 유사체에 의해 결합되거나 인식될 수 있는 것인, 조작된 세포.
119. 실시 양태 1-118 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 기능적 비 T-세포 수용체인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 것인, 방법.
120. 실시 양태 1-119 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 것인, 방법.
121. 실시 양태 120에 있어서, CAR가 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포 내 신호 전달 영역을 포함하는 것인, 방법.
122. 실시 양태 121에 있어서, 세포 내 신호 전달 영역이 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함하는 것인, 방법.
123. 실시 양태 121 또는 실시 양태 122에 있어서, CAR가 보조 자극 신호 전달 영역을 추가로 포함하는 것인, 방법.
124. 실시 양태 123에 있어서, 상기 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 신호 전달 도메인 또는 이의 신호 전달 부분(portion)을 포함하는 것인, 방법.
125. 실시 양태 123 또는 실시 양태 124에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역이 CD28의 신호 전달 도메인인, 방법.
126. 실시 양태 53-125 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 형질전환 T 세포 수용체 (TCR)인, 방법.
127. 실시 양태 53-125 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 방법.
128. 실시 양태 1-127 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 요법이 암과 관련된 항원을 인식하거나 표적화하는 것인, 방법.
129. 실시 양태 53-128 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 암과 관련된 항원에 결합하거나 이를 인식하거나 표적화하는 것인, 방법.
130. 실시 양태 129에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B 형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아성 아세틸콜린 e 수용체 (fetal acethycholine e receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄(kappa light chain), 루이스(Lewis) Y, L1-세포 접착 분자(cell adhesion molecule), MAGE-A1, 메소텔린(mesothelin), MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이항원(prostate specific antigen), PSMA, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), ephrinB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 윌름스 종양 1(Wilms Tumor 1, WT-1), 및 사이클린 A1 (CCNA1)으로부터 선택되는 것인, 방법.
131. 실시 양태 48-130에 있어서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)에 대한 음성 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 IDO1 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는 것인, 방법.
132. 실시 양태 48-131 중 어느 한 항에 있어서, 암은 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), CD98 중쇄 (4F2hc, CD98hc, SLC3A2) 및/또는 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)의 발현에 대해 양성인 종양을 포함하고/하거나, 암은 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 대해 양성인 종양 미세 환경 내의 세포를 포함하는 것인, 방법.
133. 실시 양태 1-132 중 어느 한 항에 있어서, 암이 골수종, 림프종, 백혈병인, 방법.
134. 실시 양태 1-133 중 어느 한 항에 있어서, 암이 비호즈킨성림프종 (non-Hodgkin lymphoma, NHL), 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia, CLL), 확산성 B-세포 림프종 (diffuse large B-Cell lymphoma, DLBCL) 및 골수종인, 방법.
135. 실시 양태 1-133 중 어느 한 항에 있어서, 암이 B 세포 항원을 발현시키지 않거나 B 세포 악성 종양이 아닌 것인, 방법.
136. 실시 양태 1-133 및 135 중 어느 한 항에 있어서, 암이 CD19를 발현하지 않고/않거나, T 세포 치료가 CD19와 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하지 않고/않거나, T 세포 치료가 항-CD19 항원-결합 도메인을 포함하지 않는 CAR-T 세포 치료인, 방법.
137. 실시 양태 1-133, 135 및 136 중 어느 한 항에 있어서, 암이 비-혈액 암이거나 고형 종양인, 방법.
138. 실시 양태 1-137 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에서 T 세포 치료의 투여를 포함하는 방법과 비교하여, 종양 또는 대상의 생물학적 샘플, 선택적으로 혈청, 혈장 또는 종양 샘플에서 트립토판 수준의 증가 및/또는 키누레닌 수준의 감소를 초래하는 것인, 방법.
139. 실시 양태 1-138 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에서 대상에게 투여되는 방법 또는 유사한 T 세포가 투여되는 방법으로서, T 세포가 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하지 않는 방법과 비교하여, T 세포 치료가 대상에서의 증가된 또는 장시간(prolonged)의 증식(체적증가, expansion) 및/또는 지속성(persistence)을 나타내는 것인, 방법.
140. 실시 양태 1-139 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 경구, 피하 또는 정맥 내 투여되는 것인, 방법.
141. 실시 양태 1-140 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 경구 투여되는 것인, 방법.
142. 실시 양태 1-141 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 약 2.5 mg 내지 약 5000 mg, 2.5 mg 내지 2000 mg, 2.5 mg 내지 1000 mg, 2.5 mg 내지 500 mg, 2.5 mg 내지 200 mg, 2.5 mg 내지 100 mg, 2.5 mg 내지 50 mg, 2.5 mg 내지 25 mg, 2.5 mg 내지 10 mg, 25 mg 내지 5000 mg, 25 mg 내지 2000 mg, 25 mg 내지 1000 mg, 25 mg 내지 500 mg, 25 mg 내지 200 mg, 25 mg 내지 100 mg, 25 mg 내지 50 mg, 50 mg 내지 5000 mg, 50 mg 내지 2000 mg, 50 mg 내지 1000 mg, 50 mg 내지 500 mg, 50 mg 내지 200 mg, 50 mg 내지 100 mg, 100 mg 내지 5000 mg, 100 mg 내지 2000 mg, 100 mg 내지 1000 mg, 100 mg 내지 500 mg, 100 mg 내지 200 mg, 200 mg 내지 5000 mg, 200 mg 내지 2000 mg, 200 mg 내지 1000 mg, 200 mg 내지 500 mg, 500 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 2000 mg, 500 mg 내지 1000 mg 또는 1000 mg 내지 2000 mg 각각을 포함하는 양으로 투여되는 것인, 방법.
143. 실시 양태 1-142 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1 일 6 회, 1 일 5 회, 1 일 4 회, 1 일 3 회, 1 일 2 회 또는 1 일 1 회 투여되는 것인, 방법.
144. 실시 양태 1-143 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 적어도 5 mg/일, 10 mg/일, 25 mg/일, 50 mg/일, 100 mg/일, 200 mg/일, 400 mg/일, 500 mg/일, 600 mg/일, 800 mg/일, 1000 mg/일, 1200 mg/일, 1600 mg/일, 2000 mg/일, 5000 mg/일 또는 10000 mg/일의 총 일일 투여량으로 투여되는 것인, 방법.
145. 실시 양태 1-144 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 후 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 다음의 시기까지 계속되는 것인 방법:
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전과 비교하여 또는 T-세포 치료의 투여 개시 직전과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 시료에서의 트립토판 수준의 증가, 키누레닌 수준의 감소 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 감소가 있는 시기;
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전의 이전 시점에서의 대상과 비교하여 또는 T-세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 증가하는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수의 2.0 배 이내(크거나 작음)인 시기; 및/또는
대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 대상의 혈액에서의 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 또는 60 % 이상이거나, 약 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 또는 60 % 이상인 시기.
146. 실시 양태 1-145 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 다음의 시기까지 투여되는 것인, 방법:
대상의 혈액 중의 조작된 세포의 농도 또는 수가 (i) 마이크로리터 당 적어도 약 10 개의 조작된 세포, (ii) 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 총 수의 적어도 20 %, 30 %, 40 % 또는 50 %, (iii) 적어도 또는 적어도 약 1 x 105 개의 조작된 세포이거나; 또는 (iv) 대상의 혈액이 적어도 5,000 카피의 마이크로그램 DNA 당 재조합 수용체-코딩 DNA를 포함하는 시기; 및/또는
(a)에서의 투여 개시 후 90 일째에, CAR-발현 세포가 대상의 혈액 또는 혈청에서 검출 가능가능한 시기; 및/또는
(a)에서 투여 개시 후 90 일째에, 대상의 혈액이 적어도 20 %의 CAR-발현 세포, 마이크로리터 당 적어도 10 개의 CAR-발현 세포 또는 적어도 1 × 104의 CAR-발현 세포를 함유하는 시기.
147. 실시 양태 1-146 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에서 대상에게 투여되는 방법 또는 유사한 T 세포가 투여되는 방법으로서, T 세포가 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하지 않는 방법에서의 발현 또는 수준과 비교하여, T 세포 치료의 세포의 표면 상의 CD25의 발현 또는 수준이, 대상에게 상기 투여 후에, 감소되는 것인, 방법.
148. 실시 양태 147에 있어서, 발현이 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나, 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상 감소되는 것인, 방법.
149. 실시 양태 1-148 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 후 최대 2 일까지, 7 일까지, 14 일까지, 21 일까지, 1 개월까지, 2 개월까지, 3 개월까지, 6 개월 까지 또는 1 년까지의 기간 동안 투여되는 것인, 방법.
150. 실시 양태 1-149 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 CD4+ 또는 CD8+ 인 T 세포를 포함하는 것인, 방법.
151. 실시 양태 1-150 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 대상에게 자가조직인(autologous) 세포를 포함하는 것인, 방법.
152. 실시 양태 1-150 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 대상과 동종이계인(allogeneic) T 세포를 포함하는 것인, 방법.
153. 실시 양태 1-152 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 종양 미세 환경에서 IDO1 발현을 상향 조절하는 양으로 투여되는 것인, 방법.
154. 실시 양태 153에 있어서, IDO1 발현이 골수 세포, 간질 세포 또는 종양 세포에서 또는 그로부터 상향 조절되는 것인, 방법.
155. 실시 양태 154에 있어서, IDO1 발현이 골수 간질 세포에서 또는 그로부터 상향 조절되는 것인, 방법.
156. 실시 양태 1-155 중 어느 한 항에 있어서, 세포 치료는 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 1 x 106 cell/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 1 x 106 cell/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이, 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 또는 3.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 3.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 (각각 포함)의 세포 수를 함유하는 투여량을 포함하는 것인, 방법.
157. 실시 양태 1-156 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 세포의 양이, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에서 세포 치료가 대상에게 투여되는 방법 또는 세포가 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하지 않는 방법에서의 투여량보다 적은 것인, 방법.
158. 실시 양태 157에 있어서, 투여량이 적어도 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 10-배 이하인, 방법.
159. 실시 양태 1-158 중 한 항에 있어서, T 세포 치료가 세포를 포함하는 단일 약학적 조성물로서 투여되는 것인, 방법.
160. 실시 양태 1-159 중 한 항에 있어서, T 세포 치료가 분할 투여량인 세포의 투여량을 포함하고, 상기 투여량의 세포는, 3일 이하의 기간에 걸쳐, 투여량의 세포를 집합적으로 포함하는 복수의 조성물로 투여되는 것인, 방법.
161. 실시 양태 1-159 중 한 항에 있어서, 방법이 T 세포 치료의 투여 전에 림프구고갈 화학치료 (lymphodepleting chemotherapy)를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
162. 실시 양태 161에 있어서, 방법이 대상에게 플루다라빈을 투여하는 것을 포함하지 않는 것인, 방법.
163. 실시 양태 1-160 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 차료의 투여 전에 대상에게 림프프고갈 화학치료를 투여하는 것을 포함하지 않는 것인, 방법.
164. 실시 양태 55-163 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열, 및 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나, 변형에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 내로 도입함으로써 조작된 것인, 방법.
165. 실시 양태 164에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 방법.
166. 실시 양태 164에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 방법.
167. 실시 양태 164-166 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 및 제 2 핵산은 하나 이상의 벡터(들), 선택적으로 바이러스 벡터(들)에 포함되는 것인, 방법.
168. 트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자의 투여를 위한 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상을 선택하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 것인 방법:
(a) 대상으로부터의 하나 이상의 생물학적 시료에서 트립토판 또는 트립토판 대사 산물의 수준, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준, 또는 인터페론 - 감마 (IFNγ) 수준을 평가하는 단계로서, 대상으로부터의 생물학적 시료가 T 세포 치료로 치료할 후보인 대상으로부터 유래된 것인, 단계; 및
(b) 다음의 대상을 선택하는 단계:
(ⅰ) 샘플 중의 트립토판 수준이 역치 수준 이하인 대상;
(ii) 트립토판 대사 산물의 수준이 역치 수준 이상이 대상;
(iii) IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 수준 또는 활동 수준이 역치 수준 이상인 대상; 또는
(iv) IFNγ의 수준이 역치 수준 이상인 대상.
169. 실시 양태 168에 있어서, 하나 이상의 생물학적 시료가 T 세포 치료의 투여 전에 수득되는 것인, 방법.
170. 실시 양태 168 또는 실시 양태 169에 있어서, T 세포 치료를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
171. 실시 양태 168-170 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 선택된 대상에게 투여되는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
172. 실시 양태 171에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가, T 세포 치료의 투여 개시 전에 또는 동시에, 및/또는 T 세포 치료의 투여 전에 또는 동시에, 선택된 대상에게 투여되는 것인, 방법.
173. 실시 양태 171에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가, T 세포 치료의 투여 개시 이후 및/또는 T 세포 치료의 투여 후에 투여되는 것인, 방법.
174. 트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자의 투여를 위한 질환 또는 증상, 선택적으로 암이 있는 대상을 선택하는 방법으로서, 다음을 포함하는 것인 방법:
(a) 대상으로부터의 하나 이상의 생물학적 시료에서 트립토판 또는 트립토판 대사 산물의 수준, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준, 또는 인터페론 - 감마 (IFNγ) 수준을 평가하는 단계로서, 대상으로부터의 생물학적 시료가 T 세포 치료를 투여받았던 대상으로부터 수득되는 것인, 단계; 및
(b) 다음의 대상을 선택하는 단계:
(i) 시료 중의 트립토판 수준이 역치 수준 이하이거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 이전의 시점, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 감소된 대상;
(ii) 트립토판 대사 산물의 수준이 역치 수준 이상이거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 시, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 시에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 대상;
(iii) IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준이 역치 수준 이상이거나, T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 전의 시점, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 대상; 또는
(iv) IFNγ의 수준이 역치 수준 이상이거나, T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 전 시점, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 대상.
175. 실시 양태 174에 있어서, 하나 이상의 생물학적 시료가 T 세포 치료의 투여 후에 수득된 것인, 방법.
176. 실시 양태 174 또는 실시 양태 175에 있어서, 상기 평가 전에, 세포 치료를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
177. 실시 양태 174-176 중 어느 한 항에 있어서, 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
178. 실시 양태 134-177 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 하기 시기에 투여되는 것인, 방법:
T 세포 치료의 투여 개시 전 및/또는 T 세포 치료의 투여 전과 비교하여, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플 내의 트립토판의 수치의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여 대상의 혈액에서 검출할 수 있는 T 세포 치료의 세포 수가 감소되기 전의 시기;
T 세포가 장시간의 트립토판 고갈, 소진, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 징후를 나타내기 전의 시기;
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출될 수 있기 전의 시기; 및/또는
T 세포 치료의 투여 개시 전 및/또는 T 세포 치료의 투여 전과 비교하거나, 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여 대상의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFNγ)의 수준이 증가되는 시기.
179. 실시 양태 178에 있어서, 증가 또는 감소가 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나, 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
180. 실시 양태 173-179 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료의 개시 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내에 투여되는 것인, 방법.
181. 실시 양태 173-180 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료의 개시 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 이내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 이내에 투여되는 것인, 방법.
182. 실시 양태 168-171 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 증상은 암인, 방법.
183. 실시 양태 168-172 중 어느 한 항에 있어서, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준이 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 이전의 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 경우, 대상이 선택되는 것인, 방법.
184. 실시 양태 168-183 중 어느 한 항에 있어서, 시료에서의 트립토판 수준이 역치 수준 이하이거나 감소된 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점 및/또는 T 세포 치료의 투여 이전의 시점에서 평가된 수준과 비교하여 감소된 경우, 대상이 선택되는 것인, 방법.
185. 실시 양태 168-184 중 어느 한 항에 있어서, 역치 수준 (threshold level)이 평균 수준 (average level), 농도 또는 양의 25 % 이내, 20 % 이내, 15 % 이내, 10 % 이내 또는 5 % 이내이고/이거나, 복수의 대조군 대상으로부터의 생물학적 시료에서의 평균 수준, 농도 EH는 양의 표준 편차 이내인 것인, 방법.
186. 실시 양태 185에 있어서, 대조군 대상은, 암이 없고/없거나 T 세포 치료의 투여를 받기 이전인, 건강한 또는 정상인 대상인, 방법.
187. 실시 양태 168-184 중 어느 한 항에 있어서, 증가 또는 감소가 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나, 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
188. 실시 양태 168-187 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가 이전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 조합하여 수행될 수 있는 것인, 방법.
189. 실시 양태 168-184 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 시료가 혈청, 혈장 또는 종양 샘플이거나, 이로부 수득되는 것인, 방법.
190. 실시 양태 168-170 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산(3-HAA)에서 선택된 것인 방법.
191. 실시 양태 168-190 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물 (antibody mimetic), 앱타머, 또는 핵산 분자인, 방법.
192. 실시 양태 168-191 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제인, 방법.
193. 실시 양태 168-192 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)의 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소의 억제제인, 방법.
194. 실시 양태 168-191 및 193 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 방법.
195. 실시 양태 168-191 및 193 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제인, 방법.
196. 실시 양태 168-191 및 193-195 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 방법.
197. 실시 양태 196에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)인, 방법.
198. 실시 양태 196에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인, 방법.
199. 실시 양태 168-191 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인, 방법.
200. 실시 양태 168-199 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 기능성 비(non)-T 세포 수용체인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 것인, 방법.
201. 실시 양태 168-200 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 것인, 방법.
202. 실시 양태 201에 있어서, CAR가 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포 내 신호 전달 영역을 포함하는 것인, 방법.
203. 실시 양태 202에 있어서, 세포 내 신호 전달 영역이 CD3- 제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함하는 것인, 방법.
204. 실시 양태 202 또는 실시 양태 203에 있어서, CAR가 보조 자극 신호 전달 영역을 추가로 포함하는 것인, 방법.
205. 실시 양태 204에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 신호 전달 도메인 또는 이의 신호 전달 부분을 포함하는 것인, 방법.
206. 실시 양태 204 또는 실시 양태 205에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역이 CD28의 신호 전달 도메인인, 방법.
207. 실시 양태 53-206 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 형질전환 T 세포 수용체 (TCR)인, 방법.
208. 실시 양태 53-206 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 방법.
209. 실시 양태 1-208 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 요법이 암과 관련된 항원을 인식하거나 표적화하는 것인, 방법.
210. 실시 양태 53-209 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 암과 관련된 항원에 결합하거나 이를 인식하거나 표적화하는 것인, 방법.
211. 실시 양태 210에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B 형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아성 아세틸콜린 e 수용체 (fetal acethycholine e receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄(kappa light chain), 루이스(Lewis) Y, L1-세포 접착 분자(cell adhesion molecule), MAGE-A1, 메소텔린(mesothelin), MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이항원(prostate specific antigen), PSMA, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), ephrinB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 윌름스 종양 1(Wilms Tumor 1, WT-1), 및 사이클린 A1 (CCNA1)으로부터 선택되는 것인, 방법.
212. 다음을 포함하는 조작된 세포:
(a) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및
(b) IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형.
213. 실시 양태 212에 있어서, 변형이 분자, 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 일부 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 세포에서의 이소성 발현을 포함하는 것인, 조작된 세포.
214. 실시 양태 212 또는 213 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 mTOR 또는 단백질 키나제 C 세타 (PKC-Θ)인, 조작된 세포.
215. 실시 양태 212 또는 실시 양태 213에 있어서, 분자가 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체인, 조작된 세포.
216. 다음을 포함하는 조작된 세포:
(a) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및
(b) 재조합, 조작된 및/또는 이소적으로 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및 또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체.
217. 실시 양태 215 또는 216에있어서, 아미노산 수송체는 트립토판 수송체인, 조작된 세포.
218. 실시 양태 215-217 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 rBAT (SLC3A1), CD98 중쇄 (4F2hc, SLC3A2), L 형 아미노산 수송체 1 (LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), Asc 형 아미노산 수송체 1 (Asc-1, SLC7A10), 소듐 및 클로라이드-의존성 중성 및 염기성 아미노산 수송체 B (0+) (ATB0,+; SLC6A14), 소듐-의존성 중성 아미노산 수송체 B (0) AT1 (B (0) AT1; SLC6A19), 모노카르복실레이트 수송체 10 (TAT1; SLC16A10) 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된 것인, 조작된 세포.
219. 실시 양태 215-218 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 서열 번호 36 내지 115 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 36 내지 115 중 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조작된 세포.
220. 실시 양태 215-219 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된 것인, 조작된 세포.
221. 실시 양태 215-219 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 이의 일부를 포함하는 것인, 조작된 세포.
222. 실시 양태 215-220 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 서열 번호 37 내지 39 및 115 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 37 내지 39 및 115 중 어느 하나로 부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조작된 세포.
223. 실시 양태 215-222 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서의 분자 또는 아미노산 수송체의 발현이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 조작된 세포.
224. 실시 양태 212에 있어서, 분자가 GCN2 키나아제, BLIMP-1, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 수송체 (ARNT), 진핵세포 번역개시인자 2α (eIF2α), 활성화 번역인자 4 (ATF4), CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질 (CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein, CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및 IFNγ-R2 중에서 선택된 것인, 조작된 세포.
225. 실시 양태 224에 있어서, 분자가 GCN2 또는 CHOP인, 조작된 세포.
226. 실시 양태 224 또는 실시 양태 225에 있어서, 변형이 세포에서의 분자의 감소된 발현을 포함하는 것인, 조작된 세포.
227. 실시 양태 224-226 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포가 억제성 핵산 또는 분자의 발현을 감소시키는 유전적 파괴를 포함하는 것인, 조작된 세포.
228. 실시 양태 226 또는 실시 양태 227에 있어서, 세포에서의 분자의 발현이, 억제성 핵산 또는 유전자 파괴가 없는 세포에서의 발현과 비교하여, 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 % 감소되는 것인, 방법.
229. 실시 양태 226-228 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 억제성 핵산을 포함하여, 이로써 분자의 발현 감소를 초래하는 것인, 조작된 세포.
230. 실시 양태 229에 있어서, 억제성 핵산은 RNA 간섭제를 포함하는 것인, 조작된 세포.
231. 실시 양태 229 또는 230에 있어서, 억제성 핵산은 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA-적응 shRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 헤어핀 siRNA, 마이크로 RNA (miRNA 전구체) 또는 마이크로 RNA (miRNA)이거나 이를 포함하는 것인, 조작된 세포.
232. 실시 양태 229-231 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산의 발현이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스액티베이터의 제어 하에 있는 것인, 조작된 세포.
233. 실시 양태 229-231 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포는 분자를 코딩하는 파괴 유전자, 분자를 코딩하는 유전자의 파괴용 제제 및/또는 분자를 코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 것인, 조작된 세포.
234. 실시 양태 233에 있어서, 파괴는 DNA 수준에서 분자를 코딩하는 유전자를 파괴시키는 것을 포함하고/하거나,
상기 파괴는 비가역적이고/이거나;
상기 파괴는 일시적이지 않은 것인, 조작된 세포.
235. 실시 양태 233 또는 234에 있어서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하거나 또는 혼성화화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산에 의해 매개되는 것인, 조작된 세포.
236. 실시 양태 233 내지 235 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 (a) DNA 표적 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-유도 뉴클레아제에 의해 매개되는 것인, 조작된 세포.
237. 실시 양태 233 내지 236 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 유전자 편집 뉴 클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 크리스퍼/카스9 (CRISPR/Cas9)에 의해 매개되는 것인, 조작된 세포.
238. 실시 양태 237에 있어서, 파괴는 크리스퍼/카스9 (CRISPR/Cas9)에 의해 매개되고, 상기 크리스퍼/카스9은 유전자 내의 표적 서열에 상보적이고 및/또는 혼성화될 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 것인, 조작된 세포.
239. 실시 양태 233 내지 238 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 파괴는 조건부 또는 유도성인, 조작된 세포.
240. 실시 양태 239에 있어서, 크리스퍼-카스9(CRISPR-Cas9) 복합체가 유도성 크리스퍼-카스9이고/이거나 카스9이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 조작된 세포.
241. 실시 양태 233 내지 240 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 적어도 하나의 엑손의 적어도 일부의 결실을 포함하는 것인, 조작된 세포.
242. 실시 양태 233 내지 241 중 어느 한 항에 있어서,
파괴는 유전자 내에 조기 종료 코돈 (premature stop codon)의 존재를 초래하는 유전자 내의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함하고/하거나;
파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 제 1 또는 제 2 엑손 내에서의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함하는 것인, 조작된 세포.
243. 실시 양태 196, 232, 239 및 240 중 어느 한 항에 있어서,
조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자가 유도성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자 또는 억제성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자 인, 조작된 세포.
244. 실시 양태 243에 있어서, 프로모터가 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택되는 것인, 조작된 세포.
245. 실시 양태 244에 있어서, 프로모터가
U6 또는 H1 프로모터 인 pol III 프로모터; 또는
CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터인 pol II 프로모터부터로 부터 선택되는 것인, 조작된 세포.
246. 실시 양태 243-245 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터인, 조작된 세포.
247. 실시 양태 246에 있어서, 프로모터가 NFκB 또는 NFAT에 대한 결합 부위를 포함하는 것인, 조작된 세포.
248. 실시 양태 246에 있어서, 프로모터가 Lac 작동 서열, 테트라사이클린 작동 서열, 갈락토오스 작동 서열 또는 독시사이클린 작동 서열을 포함하거나 또는 그의 유사체인, 조작된 세포.
249. 실시 양태 243-245 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 억제성 프로모터 인, 조작된 세포.
250. 실시 양태 249 에 있어서, 프로모터가 Lac 억제자 또는 테트라사이클린 억제자 또는 그의 유사체에 의해 결합되거나 인식될 수 있는 것인, 조작된 세포.
251. 실시 양태 212-250 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 T 세포인, 조작된 세포.
252. 실시 양태 251에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포인, 조작된 세포.
253. 실시 양태 251에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포인, 조작된 세포.
254. 실시 양태 212-250 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 자연 살해 세포 (NK 세포)인, 조작된 세포.
255. 실시 양태 212-250 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 iPS-유래 세포인, 조작된 세포.
256. 실시 양태 212-255 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체가 기능적 비-T 세포 수용체인, 조작된 세포.
257. 실시 양태 212-256 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 조작된 세포.
258. 실시 양태 257에 있어서, CAR가 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인을 포함하고, 및 상기 세포 내 신호 전달 영역이 ITAM을 포함하는 것인, 조작된 세포.
259. 실시 양태 258에 있어서, 세포 내 신호 전달 영역이 CD3- 제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함하는 것인, 조작된 세포.
260. 실시 양태 258 또는 259에 있어서, CAR는 보조 자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는 것인, 조작된 세포.
261. 실시 양태 260에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 신호 전달 도메인 또는 이의 신호 전달 부분을 포함하는 것인, 조작된 세포.
262. 실시 양태 260 또는 261에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28의 신호 전달 도메인인, 조작된 세포.
263. 실시 양태 212-262 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체가 기능적 비-T 세포 수용체인, 조작된 세포.
264. 실시 양태 212-262 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체가 형질 전환 T 세포 수용체 (TCR)인, 조작된 세포.
265. 실시 양태 212-264 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열 및 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나, 변형에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 내로 도입함으로써 조작되는 것인, 조작된 세포.
266. 실시 양태 265에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 조작된 세포.
267. 실시 양태 265에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 조작된 세포.
268. 실시 양태 265-267 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 벡터(들), 선택적으로 바이러스 벡터(들)에 포함되는 것인, 조작된 세포.
269. 실시 양태 212-268 중 어느 한 항의 조작된 세포를 포함하는 조성물.
270. 실시 양태 269에 있어서, 세포가 CD4+ 또는 CD8+ 세포인, 조성물.
271. 실시 양태 270에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
272. 조합물로서,
리간드에 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 세포; 및
트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자를 포함하고,
상기 재조합 수용체가 선택적으로 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 조합물.
273. 조합물로서,
실시 양태 212 내지 268 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 실시 양태 199 내지 201 중 어느 한 항의 조성물; 및
트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자를 포함하는 조합물.
274. 실시 양태 272 또는 273에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시키는 것인, 조합물.
275. 실시 양태 272 또는 274에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 트립토판의 이화작용을 방지 또는 감소시키거나 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시키는 것인, 조합물.
276. 실시 양태 275에 있어서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시 키누레닌 및 3-하이드록시 안트라닐산 (3-HAA)으로부터 선택되는 것인, 조합물.
277. 실시 양태 272-276 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩타이드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물, 앱타머 또는 핵산 분자인, 조합물.
278. 실시 양태 272-277 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제의 길항제인, 조합물.
279. 실시 양태 272-277 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3- 디옥시게나아제의 억제제(TDO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 억제제인, 조합물.
280. 실시 양태 272-277 및 279 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 조합물.
281. 실시 양태 272-277, 279 및 280 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민- 피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제인 것인, 조합물.
282. 실시 양태 272-277 및 279-281 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, epacadostat), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 조합물.
283. 실시 양태 282에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)인 것인, 조합물.
284. 실시 양태 282에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인 것인, 조합물.
285. 실시 양태 272 내지 277 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인 것인, 조합물.
286. 키트와 같은 제품으로 포장된 실시 양태 272-285 중 어느 한 항의 조합물.
287. 실시 양태 286에 있어서, 상기 제품 및/또는 키트는 조작된 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 제공하는 지침 또는 문서를 추가로 포함하는 것인, 조합물.
288. 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법으로서,
면역 세포를 포함하는 세포 집단을 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 접촉시키는 단계; 및
재조합 수용체가 발현되는 조건 하에서 재조합 수용체를 코딩하는 핵산을 세포 집단 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
289. 실시 양태 288에 있어서, 재조합 수용체가 리간드, 선택적으로 항원에 결합하는 것인, 방법.
290. 실시 양태 288 또는 289에 있어서, 재조합 수용체가 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 방법.
291. 실시 양태 288-290 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 말초 혈액 단핵 세포인, 방법.
292. 실시 양태 288-290 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 T 세포이거나 T 세포를 포함하는 것인, 방법.
293. 실시 양태 292에 있어서, T 세포가 CD4+ 및/또는 CD8+인, 방법.
294. 실시 양태 288-293 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 집단이 대상, 선택적으로 인간 대상체부터 분리된 것인, 방법.
295. 실시 양태 288-294 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 도입 이전 및/또는 도입 중에 발생하는 것인, 방법.
296. 실시 양태 288-295 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시키는 것인, 방법.
297. 실시 양태 288-296 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 트립토판의 이화작용을 방지 또는 감소시키거나 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시키는 것인, 방법.
298. 실시 양태 297에 있어서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA)으로부터 선택되는 것인 방법.
299. 실시 양태 288-298 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩타이드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물, 앱타머 또는 핵산 분자인, 방법.
300. 실시 양태 288-299 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제의 길항제인, 방법.
301. 실시 양태 288-299 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3- 디옥시게나아제의 억제제(TDO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 억제제인, 방법.
302. 실시 양태 288-299 및 301 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 방법.
303. 실시 양태 288-299 및 301 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제인 것인, 방법.
304. 실시 양태 288-299 및 301-303 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사 디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, epacadostat), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 방법
305. 실시 양태 304에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)인 것인, 방법.
306. 실시 양태 304에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인 것인, 방법.
307. 실시 양태 288 내지 299 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인 것인, 방법.
308. 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체가 발현되는 조건 하에서, 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 세포 집단에 도입하는 단계; 및
제제가 발현되는 조건 하에서 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나, 변형에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 집단에 도입하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
309. 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체가 발현되는 조건 하에서, 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 세포 집단에 도입하는 단계; 및
재조합, 조작된 및/또는 이소적으로 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
310. 실시 양태 308에 있어서, 변형은 분자 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 부분 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현을 포함하는 것인, 방법.
311. 실시 양태 308에 있어서, 변형은 상기 분자의 감소된 발현을 포함하는 것인, 방법.
312. 실시 양태 311에 있어서, 방법은 분자의 발현을 감소시키는 억제성 핵산 또는 유전적 파괴를 포함하는 것인, 방법.
313. 실시 양태 308 내지 312에 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 방법.
314. 실시 양태 308 내지 312에 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 방법.
315. 실시 양태 308 내지 314에 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 벡터(들), 선택적으로 바이러스 벡터(들)에 포함되는 것인, 방법.
1.
Ⅷ. 실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시하기위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자하는 것은 아니다.
실시예 1 : 인터페론-감마 (IFNγ) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 T 세포의 존재 하에 종양 세포를 배양한 후, 인돌아민-피롤 2,3-다이옥시게나아제 (IDO1) 발현의 평가
종양 세포가 발현하는 항원에 특이적인 인터페론-감마 (IFNγ) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포와 함께 배양 한 후 다양한 종양 세포에서 인돌아민-피롤 2,3-다이옥시게나아제 1 (IDO1)의 발현을 평가하였다.
A. 인터페론 - 감마 (IFNγ) 자극
인간 CD19로 형질전환된 A549 선암 (adenocarcinoma) 인간 폐포 기저 상피 세포 (CD19.A549 세포, A549.CD19 세포로도 지칭됨)를 인터페론-감마 (IFNγ)로 자극 후 인돌아민-피롤 2,3-다이옥시게나아제 1 (IDO1)의 발현에 대해 평가하였다. CD19.A549 세포를 IFNγ로 24 시간 또는 48 시간 동안 자극시키고 IDO1 수준을 항-IDO 항체를 사용하는 유동 세포 계측법으로 평가하였다. 도 1A에서 나타내는 바와 같이, 24 시간 및 48 시간 동안 IFNγ 자극 후에, 세포는 자극되지 않은 세포와 비교하여 내인성 IDO1의 발현을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 비슷한 조건에서 IFNγ와 함께 배양한 후, 이 분석에서, JeKo-1, Daudi, Raji 및 Nalm-6 세포를 포함하여, 다른 CD19+ 종양 세포주에서 증가된 IDO1 발현은 검출되지 않았다 .
또한, 인터페론-감마 (IFNγ)로 세포를 배양한 후 수용체 티로신 키나아제-유사 희귀 수용체 1 (orphan receptor 1, ROR1) 항원을 발현하는 다양한 세포주에서 IDO1 발현을 평가 하였다. HCC1806 (ATCC® CRL-2335 ™) 인간 유방암 세포주; H2286 (ATCC® CRL-5938 ™) 인간 소형 세포 폐암 세포주; H1975 (ATCC® CRL-5908 ™) 인간 비소 세포 폐암 세포주; H1299 (ATCC® CRL-5803 ™) 인간 비소 세포 폐암 림프절 전이 세포주; BT-549 (ATCC HTB-122 ™) 인간 유방암 세포주; 내인성 ROR1을 발현하는 상기 CD19.A549 세포를 20ng/mL의 재조합 인간 IFNγ의 존재하에 하룻밤 동안 배양하였다. IDO1 발현은 전술 한 바와 같이 유동 세포 계측법을 사용하여 평가 하였다. 결과를 도 1B에 나타내었다.
다양한 CD19-발현 종양 세포주 (Daudi, K562.CD19 또는 A549.CD19), ROR1- 발현 종양 세포주 (A549.CD19 또는 BT-549) 및 HS-5 인간 골수 기질 세포주에서의 IDO1 발현 수준을 20ng/mL의 재조합 인간 IFNγ의 존재 하에 하룻밤 동안 배양한 후 평가하였다. 결과를 도 1C에 나타내었다.
B. 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포와의 공배양
키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포의 존재 하에서의 배양이 IDO1 발현을 조절하는지 평가하기 위해, 항-CD19 CAR 발현 세포를 CD19.A549 세포와 함께 공배양 하였다. CAR는 항-CD19 scFv, Ig-유래 스페이서, 인간 CD28-유래 막관통성 (transmembrane) 도메인, 인간 4-1BB-유래 세포 내 도메인 및 인간 CD3 제타-유래 신호 전달 도메인을 포함하였다. CAR을 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, 아페레시스 (apheresis)에 의해 건강한 공여자의 혈액으로부터 분리된 1차 (primary) 인간 T 세포를 형질도입하였다.
유전적으로 조작된 항 CD19 CAR-발현 T 세포를 24 시간 또는 48 시간 동안 1 : 1 의 이펙터 : 표적 (E : T) 세포 비율로 CD19.A549 세포와 함께 배양하고, IDO1 발현을 유동 세포 계측법을 통해 세포 내 염색으로 평가 하였다. 배양은 차단 (blocking) 항-IFN-γ 항체 (10 ㎍/mL 농도)의 존재 또는 부재 하에서 수행되었다. 도 1D 및 1E에서 나타내는 바와 같이, 단독으로 배양된 CD19.A549 세포의 수준과 비교하여, CAR을 발현하는 세포의 존재 하에서 배양된 CD19.A549 세포에서 증가된 IDO1 발현 수준이 관찰되었다. 결과는 CAR-표적 항원-양성 세포에서 IDO1 발현을 유도하는 CAR-발현 T 세포의 능력과 일치하였다. 항-IFN-감마 차단 항체의 첨가는 IDO1 발현의 증가된 수준을 감소시키는 것으로 관찰되었다 (도 1D 및 1E). 이들 세포의 IDO1 발현 수준의 증가는 CD19-표적 CAR-발현 T 세포와의 공배양 개시 후 96 시간에서 관찰되었다.
또 다른 연구에서, 항-인터페론 감마 수용체 (IFNγR) 항체 또는 이소타입 (isotype) 대조군의 농도의 증가 (0.75 내지 2.0 ㎍ / mL)가 존재하는 하에서, IDO + A549.CD19 표적 세포를 이펙터 : 표적 (E : T) 비율 1 : 1에서 항-CD19 CAR T 세포 (또는 비(nom)-형질전환 대조 T 세포)와 함께 24 시간 동안 공배양하였다. 표적 세포 상의 IDO1 발현은 유동 세포 계측법으로 측정하였다.
도 1F (mfi = 평균 형광 강도)에서 나타내는 바와 같이, 증가하는 농도의 항-IFNγR 차단 항체의 존재 하에서, CAR-T 세포의 존재시 (비-형질감염된 대조세포와 비교하여)의 증가된 IDO 발현 수준에서의 투여량-의존적인 감소가 관찰되었다.
또 다른 연구에서, 내인성 ROR1 또는 A549 (CD19-) 모세포를 발현하는 CD19.A549 세포를, 단독으로 (처리하지 않음) 또는 항 CD19 CAR 또는 항 -ROR1 CAR (항-ROR1 scFv, Ig-유래 스페이서, 인간 4-1BB-유래 세포 내 도메인 및 인간 CD3 제타-유래 신호 전달 도메인을 포함하는)를 발현하도록 조작된 1차 인간 T 세포와 함께 24 시간 동안 배양하였다. 인터페론 감마 (IFNγ)를 평가하기 위해 세포 상등액이 수확되고, 표적 세포는 유동 세포 계측법에 의해 IDO1 발현에 대해 평가되었다.
대표적인 히스토그램을 도 1G 및 1H에 나타내었다. 도 1G에 나타내는 바와 같이, 항-CD19 CAR 세포와 공배양 시, 항-CD19 또는 항-ROR1 CAR T 세포와 함께 배양 후 CD19.A549 세포에서 IDO1 발현의 증가가 관찰되었지만, 항-CD19 CAR T 세포와 함께 배양 후 A549 모(CD19-)세포에서는 관찰되지 않았다. 유사하게, 도 1H에서 나타내는 바와 같이, 증가된 IFNγ 농도는, A549 모 대조군과 비교하여, 항-CD19 CAR+ T 세포와 CD19.A549 세포 (CAR 표적 항원 CD19를 발현하는)를 함께 배양 한 후의 상등액에서 관찰되었다.
C. IFNγ 생성과 IDO1 발현
다양한 수준의 CD19 항원을 발현하도록 조작된 표적 세포를 항-CD19 CAR T 세포와 함께 공배양하고 CAR-T 세포에 의한 IFNγ 생성 및 항원-발현 세포에 의한 IDO1 유도를 평가하였다.
항-CD19 CAR-T 세포를 상이한 2개의 프로모터 중 하나의 제어 하에서 내인성 CD19를 발현하는 A549 표적 세포와 함께 공배양하여, 상이한 수준의 CD19 발현을 유도하였다 (도 1I 참조 ). 상술한 바와 같이 IDO1 발현 및 IFNγ의 생산량을 측정 하였다. 결과를 도 1J-1K에 나타내었다.
CD19.A549 세포를 다양한 농도의 재조합 인간 IFNγ와 배양하였다. 도 1L에서 나타내는 바와 같이, 유동 세포 계측법에 의한 평균 형광 강도 (MFI)에 의해 측정된 IDO1 발현에서 투여량-반응성 (dose-responsive) 증가가 IFNγ 농도의 증가와 함께 관찰되었다.
실시예 2: 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포와 종양 세포의 공배양 후의 트립토판 및 트립토판 대사 산물 수준
IDO1은 트립토판에서 키누레닌으로의 산화에 관여한다. 트립토판 대사 산물 수준은 IDO1 억제제, 에파카도스타트 (epacadostat)의 존재 또는 부재 하에서 항원 특이적-CAR T 세포와 항원-발현 세포의 공배양 후 평가되었다.
A. IDO1 억제제의 존재 하에서의 트림토판 및 키누레닌 수준
실질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 생성된, 항-CD19 CAR-발현 T 세포를, 0, 0.1, 10 또는 1000nM의 에파카도스타트 존재 하에서, 0.3 : 1, 1 : 1 또는 3 : 1의 이펙터 : 표적 (E : T)의 비율로, 96 시간 동안, CD19.A549 세포와 함께 공배양하였다. 공배양물의 상등액 중의 트립토판 (및 키누레닌, 3 : 1의 E : T 비율 샘플에 대해)의 양을 ELISA로 측정하고, 새로운 배양 배지에서 관찰된 양과 비교하였다.
도 2A에서 나타내는 바와 같이, 모든 E : T 비율에서, 공배양물로부터 상등액에서 측정된 트립토판의 양은 배지 단독에서 관찰된 것보다 낮았다. 이 결과는 IDO1 발현 및/또는 CAR 표적-발현 CD19.A549 세포에서의 기능을 촉진시키는 CAR-발현 T 세포의 능력과 일치한다. 에파카도스타트 (예, 1000 nM)의 존재 하에서의 공배양은 트립토판 수준을 회복시키는 것으로 관찰되었다. 도 2B는 또한 CAR-발현 T 세포 및 항원-발현 CD19.A549 세포의 공배양물로부터의 상등액에서 관찰된 키누레닌 양은 배지 단독에서 배양한 것보다 높았다는 것을 보여준다. 이 결과는 또한 표적-발현 CD19.A549 세포에서 IDO1을 유도하거나 증강시키는 CAR-발현 T 세포의 능력과 일치한다. 1,000 nM의 에파카도스타트는 공배양물 상등액에서 키누레닌 수준을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 CAR-발현 T 세포가 기능성 IDO1의 발현을 유도할 수 있다는 것, 및 이러한 증가의 기능적 결과 (예, 키누레닌 경로 조절)가 효소 억제제에 의해 조절될 수 있다는 것과 일치한다.
또 다른 연구에서 항-CD19 CAR+ T 세포와 A549.CD19 IDO+ 표적 세포를, 에파카도스타트 농도를 증가시키면서, 96 시간 동안 공배양하였다. 결과를 도 2C에 나타내었다.
B. IDO1
+
또는 IDO1
-
표적 세포와의 공배양에서의 트립토판과 키누레린 수준
실질적으로 실시예 1에서 기재된 바와 같이 생성된 항-CD19 CAR-발현 T 세포와, CD19.A549 세포 (IDO1 발현을 일으킬 수 있는 IDO1+ 표적 세포) 또는 CD19.Daudi 세포 (자극에 대한 반응으로 IDO를 발현하는 것으로 또는 IDO1 발현을 유는 것으로 관찰되지 않는 IDO1- 표적 세포)인, CD19- 발현 표적 세포를 1 : 1의 이펙터 : 표적 (E : T) 비율로 공배양 후 배양 상등액에서의 트립토판 및 키누레린 수준을 측정하였다.
도 2D에서 나타내는 바와 같이, 검출된 트립토판의 수준은, A549 세포를 함유하는 공배양물과 비교할 때, Daudi 세포를 함유하는 공배양물에서 더 높았다. 반대로, 키누레닌의 양은, Daudi 세포를 함유하는 공배양물에서와 비교할 때, A549 세포를 함유하는 공배양물에서 더 높게 관찰되었다. 이러한 결과는 CAR-발현 T 세포가, 예를 들어 CAR 항원과의 접촉에 반응하여 활성화될 때, A549 표적 세포와 같은 특정 종양 세포주 또는 다른 세포와 같은 특정 세포에서의 증가된 IDO1 발현을 촉진시킬 수 있다는 결론과 일치한다. 일부 측면에서 증가된 IDO1 발현은 트립토판을, 예를 들어 키누레닌으로 대사할 수 있으며, 이는 종양 미세 환경 (TME)과 같은 환경에서 트립토판의 결핍 및/또는 키누레닌 또는 다른 트립토판 대사 산물의 축적을 초래할 수 있다.
C. 표적의 공배양에서의 트립토판 및 키누레닌 수준
단독으로 또는 항-CD19 CAR-발현 T 세포 (α-CD19 CAR)와 함께 24 시간 동안 배양된 A549.CD19 세포 (IDO+ 표적 세포)로부터의 배양 상등액 중의 트립토판 및 키누레닌 수준을 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 2E (n.d .: 검출 할 수 없음)에 나타내었다. 단독으로 배양된 A549.CD19 세포로부터의 상등액은 높은 트립토판 및 검출되지 않는 수준의 키누레닌을 포함하였다. 그러나 항 CD19 CAR+ T 세포와 IDO+ A549.CD19 표적 세포의 공배양에서 얻은 상등액에는 검출할 수 없는 수준의 트립토판이 포함되어 있지만 증가된 수준의 키누레닌을 포함하였다.
실시예 3: CD19-발현성 종양 세포와 함께 배양된 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 기능적 반응에 대한 IDO1 억제제 에파카도스타트의 효과
항원-발현 종양 세포와 함께 배양한 후 CAR-T 세포 기능적 반응에 대한 IDO1 억제 효과를 평가하기 위한 연구가 수행되었다. 항-CD19 CAR-발현 T 세포에서의 증식, 사이토카인 생성 및 세포 표면 마커 발현은 표적 (CD19)-발현 종양 세포주와의 공배양 후 평가하였다. CAR-발현 T 세포는 실질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 생성되었다.
A. IDO1 억제제 및 / 또는 IDO+ 표적 세포의 존재 하에서의 항-CD19 CAR T 세포의 증식 평가
항-CD19 CAR-발현 T 세포를 CellTrace ™ 바이올렛 (ThermoFisher) 세포 증식 분석 염료로 표지하고, 세척하였고, 0, 0.1, 10 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에서, 0.3 : 1, 1 : 1 또는 3 : 1의 이펙터 : 표적의 비율로, CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 함께 96 시간 동안 배양하였다. CellTrace ™ 바이올렛 염료의 희석 정도에 기초하여, 유동 세포 계측법에 의해 결정된 T 세포 집단의 CD4 및 CD8의 발현 및 증식을 위해 세포를 염색 하였다. 도 3에서 나타내는 바와 같이, CD4+ 및 CD8+ CAR-발현 T 세포 모두에서, 증식에서의 IDO1 억제제 투여량-의존성 증가가 관찰되었다.
유사한 방법을 사용하여 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와의 공배양 후 3 명의 상이한 건강한 공여자로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 증식을 평가하였다. 다양한 농도의 IDO 억제제 에파카도스타트의 존재 하에서, 각 공여자로부터의 표지된 항 CD19 CAR- 발현 T 세포를 CD19.A549와 함께 96 시간 동안 공배양하고, 상기에서 기재된 바와 같이 증식을 평가하였다.
도 4A 및 4B에서 나타내는 바와 같이, 억제제의 존재는 3 명의 모든 공여자로부터 유래된 CD4+ 및 CD8+ CAR-발현 T 세포의 증식을 투여량-의존적으로 증가시키는 것으로 관찰되었다.
유사한 실험을 3 명의 상이한 건강한 공여자 중 하나로부터 생성된 항-CD19 CAR-발현 T 세포를 250 nM의 에파카도스타트 존재 하에서 96 시간 동안 CD19.A549 세포와 공배양함으로써 수행하였다. CountBright Absolute Counting beads를 사용하여 각 웰에서 CAR T 세포의 수를 결정하였다. 도 4C에서 나타내는 바와 같이, IDO1 억제제의 존재는, 모든 3 명의 공여자로부터의 CAR T 세포에 대해, 억제제의 부재와 비교하여, 더 많은 수의 CAR T 세포를 야기하였다. 유동 세포 계측법에 의한 T 세포 서브세트 (subset), CD3, CD4 및 CD8에 대한 염색은, 억제제가 존재하지 않는 경우에 비하여, 에파카도스타트의 존재 하에서의 항온 배양(인큐베이션) 후 각 CAR T 세포 서브세트의 수에 있어서 유사한 배수 증가 (similar fold increase) 를 나타내었다. 그 결과는 IDO1 억제제가 IDO1 발현의 억제 효과를 상쇄하여 CAR T 세포의 증식을 증가시킨다는 것과 일치한다.
B. IDO1 억제제 및 IDO+ 표적 세포의 존재 하에서의 항-ROR1 CAR T 세포의 증식
유사한 방법을 사용하여 항원-발현 표적 세포의 존재하에서 배양된 항-ROR1 CAR-발현 T 세포의 증식에 대한 IDO1 억제제의 효과를 평가하였다. 실시예 1에 기술된 항-ROR1 CAR-발현 세포를 250nM의 에파카도스타트 존재 하에서, 96 시간 동안, 3 : 1의 E : T 비율로, 내인성 ROR1을 발현하는 CD19.A549 세포와 공배양하였다. 도 4C에서 나타내는 바와 같이, IDO1 억제제의 존재는 억제제의 부재 하에서 배양 된 세포에 비해 CAR T 세포의 수가 더 많았다.
C. IDO1 억제제 및 IDO+ 및 IDO- 표적 세포의 존재 하에의 항 CD19 CAR T 세포의 증식
1:1의 E:T 비율에서, IDO1+ 세포 (CD19.A549) 또는 IDO1- 세포 (CD19.Daudi)와 항-CD19 CAR-발현 세포의 공배양 후 CAR-발현 T 세포의 증식에 대한 에파카도스타트의 효과를 비교하였다. 증식은 여러 가지 농도의 에파카도스타트의 부재 또는 존재 하에서 상기에서 기술한 바와 같이 평가되었다. 도 5A,도 5B 및 도 5C에서 나타내는 바와 같이, IDO1+ (A549) 세포와 공배양하였을 때, 공배양에서 억제제의 존재가 CD4+ 및 CD8+ CAR-발현 T 세포의 증식을 투여량-의존적 방식으로 증가시키는 것으로 관찰되었으나, IDO1- 세포 (Daudi)와 공배양한 경우에는 그렇지 않았다. A549 세포에서 에파카도스타트에 대한 추정 (estimated) EC50은 약 223nM이었다.
유사한 방법을 사용하여 항-CD19 CAR-발현 세포를 IDO1+ 세포 (A549.CD19) 또는 IDO1- 세포 (K5622.CD19)와 공배양한 후 CAR-발현 T 세포의 증식에 대한 IDO1 억제제의 효과를 평가하였다. 증식은 다양한 농도의 에파카도스타트 (0, 15.6, 62.5, 250 또는 1000 nM에서)의 부재 또는 존재 하에서, A549.CD19 세포의 경우 1 : 1 의 E:T 비율 또는 K562.CD19 세포의 경우 5 : 1의 E : T 비율로, 상기에서 기술 된 바와 같이 평가되었다. CAR T 세포의 평균 분열 수를 염료 희석 (dye dilution)에서의 피크에 기초하여 계산하고, CD4+ 및 CD8+ 서브세트의 증식을 비교 하였다. IDO1+ 세포와 공배양 하였을 때, 공배양물에서 억제제의 존재는, CD4+ 및 CD8+ 집단을 포함하여, CAR-발현 T 세포의 증식을 투여량-의존적으로 증가시키는 것으로 관찰되었으나, IDO1- 세포와 공배양한 경우는 그렇지 않았다.
1 μM 에파카도스타트의 존재 하에서 또는 억제제가 없는 상태에서, 1 : 1의 이펙터 : 표적 비율로, 표지되지 않은 CAR-발현 T 세포와 표지된 CD19-A549 표적 세포의 공배양 후, 배양물에서의 CAR T 세포의 증식(proliferation) 및 체적증대(expansion)에 대한 억제제의 관찰된 투여량-의존성 효과는 현미경에 의해 또한 가시화되었다. 세포는 72 시간 120 시간에서 가시화되었다. 120 시간에서, 억제제의 부재 하에서 배양된 대조세포와 비교하여, 억제제의 존재 하에서 항온배양(인큐베이션) 후, 상대적으로 더 적은 수의 표지된 이펙터 세포와 관련된, CAR-발현 T 세포 (표지되지 않은)의 큰 증가가 관찰되었다.
이러한 결과는 순차로 IDO1 기능에 의존하는 방식으로 CAR- 발현 T 세포의 증식 및/또는 생존을 감소시키는 (IDO1 억제제의 존재 하에서 이러한 효과의 반전 (reversal)에 의해 입증된 바와 같이), 본원에서 CAR-발현 T 세포에의 노출에 의해 유도된 것으로 관찰된, IDO1의 능력과 일치한다.
D. IDO1 억제제의 존재 하에서 항-CD19 CAR T 세포의 지속적 증식
인간 CD19 (CD19.A549 세포)로 형질 전환된 A549 선암 (adenocarcinoma) 인간 폐포 기저 상피 세포와의 공배양 후 항-CD19 발현 CAR 세포의 증식을 10 일 이상 평가 하였다. 각각의 공여자로부터의 항-CD19 CAR-발현 T 세포를, 0, 3.9, 15.6, 62.5, 250 및 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에서, 1 : 1, 0.5 : 1 또는 0.25 : 1의 E : T 비율로, CD19.A549 와 함께 최대 약 340 시간 동안 공배양하였다. 증식(expansion)은 시간의 경과에 따라 결정된 배양물에서의 % 컨플루언시 (confluency)에 기초하여 평가되었다. CAR-발현 T 세포의 증식(expansion)이 증가함에 따라 억제제의 투여량-의존적 효과가 관찰되었으며, 이는 이후 시점에서 더욱 명백해 졌고 배양에서 5일 이상 증식을 연장시켰다. 증식(체적증대, expansion)에서의 IDO1 억제제-촉진 증가(inhibitor-promoted increase)는 배양에서 10 일 이상 지속되었다. 이러한 결과는 CAR-T 항원-특이적 활성화 후 IDO-상향 조절 및/또는 IDO-의존성 신호 전달이 발생하거나 촉진되어, 예를 들어 5- 또는 10- 일의 기간에 걸쳐 CAR-T 세포의 증식의 저해를 야기하고, IDO의 억제가 어떤 상황에서는 그러한 억제를 구제할 수 있다는 결론과 일치하였다.
E. 사이토카인 방출
다양한 농도의 에파카도스타트의 존재 하에서, 1 : 1 의 E : T 비율로, 48 시간 동안, CD19.A549와 공배양된 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 상등액으로부터 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 양을 평가하였다. 도 6에서 나타내는 바와 같이, 공배양물에서 억제제의 존재는 TNFα 생성을 투여량-의존적으로 증가시키는 것으로 관찰되었다. TNFα 수준은 IDO1 - CD19.Daudi 세포의 존재 하에서의 배양물에서 관찰된 것보다 낮았으며, 이는 시험된 모든 조건에 대해 이 분석에서의 검출 한계 (detection limits) 이상이었다.
F. 세포 표현형 마커 발현
CD25의 세포 표면 발현은, 다양한 농도의 에파카도스타트 존재 하에서, IDO1+ CD19.A549 세포 또는 IDO1- CD19 Daudi 세포와, 1 : 1 의 E : T 비율로, T 세포를 공배양 후, CD4+ 및 CD8+ CAR-발현 T 세포에 대한 유동 세포 계측법으로 평가되었다.
도 7A 및 7B 에서 나타내는 바와 같이, T 세포와 IDO1+ CD19.A549의 공배양 후 96 시간에서, CD4+ 및 CD8+ CAR-발현 T 세포 집단 모두에서, CD25의 관찰된 표면 발현 수준 (평균 형광 강도 (MFI))은 배양물 내의 에파카도스타트의 존재에 의해 투여량-의존적으로 감소하였다. 대조적으로, 96 시간에서 관찰된 CD25의 표면 발현은 CAR-발현 세포와 IDO1- 표적 세포 (CD19.Daudi 세포)의 공배양물 내의 에파카도스타트의 존재에 의해 영향을 받지 않았다.
도 8A 및 8B에서 나타내는 바와 같이, CD25 발현에 대한 유사한 영향은, CD19.A549 세포와 공배양한 후, 3 명의 상이한 건강한 공여자로부터 생성된, CCD4+ 및 CD8+ 항-CD19 CAR-발현 T 세포에서도 관찰되었다 .
G. 세포용해 활성
다양한 농도의 에파카도스타트 존재 하에서, 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 세포 용해 활성을 측정하였다. 각각의 공여자로부터의 T 세포로부터 개별적으로 생성 된 항-CD19 CAR-발현 T 세포를, 0, 3.9, 15.6, 62.5, 250 및 1000 nM의 에파카도스타트의 존재 하에서,0.25 : 1의 E : T 비율로, 최대 약 340 시간 동안, NucRed 염료로 표지된 CD19.A549와 공배양하였다. 표적 세포의 용해는 Incucyte 정량적 세포 분석 시스템 (Essen BioScience)을 이용하여, NucRed 염료에 대한 세포의 염색 강도를 평가함으로써 시간 경과에 따라 측정하였다. 용해가 발생한 세포는 염료의 염색 강도가 감소하였다. 각 에파카도스타트 농도에 대해, 최대 대략 340 시간 동안, NucRed dye+ 세포에 대한 곡선 하 면적 (area under the curve, AUC)을 측정하였다.
도 8C에서 나타내는 바와 같이, 에파카도스타트 존재 하에서 배양한 배양액은, AUC의 감소에 의해 관찰된 바와 같이, NucRed 염료 강도의 투여량-의존성 감소를 보였다. 상기 결과는 에파카도스타트 존재가 CD19.A549 (IDO+)와의 배양물에서 항-CD19 CAR+ 세포의 기능 및/또는 증식 및/또는 생존을 투여량-의존적으로 증진 시켰다는 해석과 일치하였다 .
실시예 4: 종양 세포주에서 IDO1 발현 및 세포 생존력에 대한 플루다라빈의 효과 평가
IDO1의 발현 및 종양 세포의 세포 생존 능력에 대한 플루다라빈 (화학치료 및/또는 입양T세포치료 (예, 그와 관련하여 lymphodepleting 전처리에서)에서 사용되는 퓨린 유사체)의 효과를 평가하였다. CD19.A549 세포를 IFNγ의 존재 또는 부재 하에서 48 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 플라다라빈의 농도를 증가시키면서 배양물에 첨가하였다. IDO1 발현 수준을, 실시예 1A에 기재된 바와 같이, 유동 세포 계측법에 의해 측정하고, 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하였다. 세포 생존력도 평가되었다.
도 9A에서 나타내는 바와 같이, 플루다라빈의 첨가는 투여량-의존적으로 IDO1 수준을 감소시켰다. 플루다라빈의 효과는 자극받지 않은 CD19.A549 세포에서의 IDO1의 기저 수준 (basal level)보다 낮은 수준으로 IDO1 수준의 IFNγ-매개 상향조절의 감소 뿐만 아니라 자극받지 않은 CD19.A549 세포에서의 IDO1의 기저 수준 (basal level)의 감소를 가져왔다. 도 9B에서 나타내는 바와 같이, 24 시간의 플루다라빈 치료는 CD19.A549 세포의 생존 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않았다.
시간 경과에 따른, CD19.A549 세포의 생존력과 세포자연사 (apoptosis)에 대한 고용량의 플라다라빈의 영향도 평가되었다. CD19.A549 세포를 IFNγ의 존재 또는 부재 하에 48 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후, 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 200 또는 1000μM의 플루다라빈의 용량을 첨가했다. IDO1 발현 및 % 생존율을 상기에서 기재한 바와 같이 측정하고, 아넥신 V 염색을 사용하여 96 시간 동안, 24 시간마다, 세포자연사를 측정하였다. 플루다라빈의 더 높은 투여량은, 24 시간 이상의 배양 후에, 세포 생존력을 감소시키고 세포자연사를 증가시키는 것으로 관찰되었고 (도 9C), 플루다라빈의 더 낮은 투여량은 IFNγ-자극된 CD19.A549 세포에서 시간 경과에 따른 IDO1 발현 수준에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다 (도 9D).
실시예 5: 항-CD19 CAR-발현 T 세포 및 CAR-T 활성에 반응하여 IDO 발현을 유도할 수 있는 CD19-발현 종양 세포의 공배양에서의 트립토판 보충
표적 세포 및 IDO1 억제제 에파카도스타트 또는 보충 트립토판과 함께 CAR T 세포를 공배양하였다. CAR-발현 T 세포는 실질적으로 실시예 1에 기술된 바와 생성되었다.
A. IDO1 억제제 또는 트립토판의 존재 하에서의 CAR T 세포의 증식
공배양의 초기에 첨가된 0, 10, 100 및 1000 nM 에파카도스타트 또는 24 시간마다 배양물에 첨가된 5 μg/mL의 트립토판의 존재 하에서, 1 : 1의 이펙터 : 표적 (E : T) 비율로, 항-CD19 CAR-발현 T 세포를 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 96 시간 동안 항온배양하였다.
도 10A는 개별 웰에 대해 관찰된 총 CD3+ 세포 수 (count)를 나타낸다. 도 10A에서 나타내는 바와 같이, 보충된 트립토판 또는 100 nM 또는 1000 nM 에파카도스타트와 함께 세포의 배양 후, 유사한 T 세포 수가, 시간의 경과에 따라, 관찰되었다. 이러한 결과는 보충 트립토판이 트립토판-고갈 환경 및/또는 CAR 활성에 대한 반응과 같은 환경에서 세포에 IDO 발현이 유도된 환경에서 CAR T 세포 증식 및/또는 생존을 회복시킬 수 있다는 결과 및 트립토판 고갈이 TME에서와 같은 종양 또는 관련 세포에서 IDO 유도의 억제 효과를 설명할 수 있다는 결과와 일치하였다.
일부 측면에서, 트립토판 및/또는 IDO 억제제 또는 다른 트립토판 대사 또는 경로 조절인자를 통한 복원은, 예를 들어, CAR-T 세포 유도 활성에 반응하여, IDO가 유도된 환경에서, CAR T 세포 기능 및/또는 활성의 억제를 상쇄시키는데 사용될 수 있다.
B. 사이토카인 방출
상기 실시예 5.A에 기재된 공배양물의 상등액에서, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-감마 (IFNγ), 인터루킨-2 (IL-2) 또는 종양 괴사 인자-알파 (TNFα)의 양을 측정하였다.
도 10B, 10C 및 10E에서 나타내는 바와 같이, 공배양물에서의 에파카도스타트 (10, 100 또는 1000 또는 보충 트립토판의 존재는, 첨가된 에파카도스타트 또는 보충 트립토판의 부재 하에서의 공배양물과 비교하여, GM-CSF, IFNγ 및 TNFα 각각의 수준의 증가를 가져온다. 도 10D에서 나타내는 바와 같이, 에파카도스타트 (10, 100 또는 1000nM) 또는 보충 트립토판을 함유하는 최대 72 시간 동안의 공배양물에서 IL-2 수준이 감소되었고, 96 시간에서 감소되었다. 이러한 결과는 보충 트립토판이 트립토판-고갈 환경 및/또는 CAR 활성에 대한 반응과 같은 환경에서 세포에 IDO 발현이 유도된 환경에서 CAR T 세포 증식 및/또는 생존을 회복시킬 수 있다는 결과, 및 트립토판 고갈이 TME에서와 같은 종양 또는 관련 세포에서 IDO 유도의 억제 효과를 설명할 수 있다는 결과와 일치한다.
C. 세포 표현형 마커 발현
CD25의 세포 표면 발현은, 상기 실시예 5.A에 기술된 CD4+ 및 CD8+ CAR-발현 T 세포에 대한 유동 세포 계측법으로 평가되었다.
도 10F 및 10G에 나타내는 바와 같이, CD4+ 또는 CD8+ 와 CD19.A549 세포( IDO1 발현 유도 가능한 IDO1+ 표적 세포)의 공배양 후, 관찰된 CD25의 표면 발현 수준 (평균 형광 강도 (MFI))은 배양물 내의 보충 트립토판 또는 100 nM 또는 1000 nM 에파카도스타트의 존재 하에서 감소되었다. 이러한 결과는 보충 트립토판이 트립토판-고갈 환경 및/또는 CAR 활성에 대한 반응과 같은 환경에서 세포에 IDO 발현이 유도된 환경에서 CAR T 세포 증식 및/또는 생존을 회복시킬 수 있다는 결과, 및 트립토판 고갈이 TME에서와 같은 종양 또는 관련 세포에서 IDO 유도의 억제 효과를 설명할 수 있다는 결과와 일치한다.
실시예 6: 다양한 세포에서의 인돌아민-피롤 2,3-다이옥시게나아제 1 (IDO1) 발현의 평가
A. 인터페론 감마 (IFNγ) 또는 CAR T 세포의 존재 하의 골수 기질 세포에서의 IDO1의 발현
인터페론-감마 (IFNγ)에 의한 자극한 골수 간질 세포에서 또는 CAR-발현 T 세포와 공배양한 골수 간질 세포에서 인돌아민-피롤 2,3-다이옥시게나아제 1 (IDO1)의 발현 수준을 측정하였다. 골수 기질 세포는, TME에 존재하는, 비-종양 세포와 같은 방관자 (bystander) 세포의 예이다. HS-5 인간 골수 기질 세포를 20 ng/mL 재조합 인간 IFNγ로 24 시간 동안 자극하였다.
도 11A에서 나타내는 바와 같이, IFNγ와 HS-5 골수 간질 세포의 공동 배양은 세포에서 IDO1 발현을 증가시켰다. HS-5 세포와, 표적 암 세포 및 CAR+ T 세포의 공동 배양은 또한 HS-5 세포에서 IDO1 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 IFNγ 또는 표적 세포 및 CAR+ T 세포와, 비-종양 방관자세포의 공동 배양이 방관자 세포에 의한 IDO1 발현을 촉진시킬 수 있다는 결과와 일치하였다.
B. 인터페론 감마 (IFNγ) 의 존재 하의 수지상 세포 및 대식세포에서의 IDO1의 발현
종양-관련 대식세포 및 수지상 세포를 비롯한 TME에 존재하는 골수성 세포가 IDO1을 발현하도록 유도될 수 있는지를 평가하기 위해, 인터페론-감마 (IFNγ) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 의한 자극에 의한 수지상 세포 및 대식세포에서의 IDO1의 발현 수준을 유동 세포 계측법으로 측정하였다. 수지상 세포는 GM-CSF 및 인터루킨-4 (IL-4)와 6일 동안 단일 배양 (monoculture)하였고, 대식세포는 M-CSF와 6일 동안 단일 배양하였다. 단일 배양 후, 세포를 IFNγ 및/또는 LPS로 24 시간 동안 자극하고, IDO1 발현을 유동 세포 계측법으로 측정하였다. 도 11B에서 나타내는 바와 같이, 수지상 세포 (DC)는 IFNγ에 의한 자극 시 IDO1 발현을 유도하였고, M1 대식세포 (Mφ)는 LPS 자극 부재 시에 IDO1 발현을 유도하였다.
C. IDO
+
골수 간질 세포의 존재 하에서의 CAR T 세포의 증식
IDO1-발현 골수 간질 세포 또는 IDO1 억제제의 존재 하에서의 CAR T 세포의 증식이 측정되었다. CAR T 세포 및 CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는 표적 암세포를, HS-5 세포 (IDO1 발현 유도 가능한 IDO1+ 방관자 세포)의 존재 또는 부재 하에서, 96 시간 동안, 다양한 농도의 에파카도스타트의 존재 하에서, 공배양하였다. CAR T 세포의 증식은, IDO1 억제제 에파카도스타트의 존재 또는 부재 하에서, IDO1+ 골수 줄기 세포의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않았다.
실시예 7: 표적 세포, 1차 인간 T 세포, 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포, 수지상 세포 및 대식세포에서 L-형 아미노산 수송체 (LAT) 발현 평가
A. LAT1의 발현 수준
다양한 세포에 의한 L- 타입 아미노산 수송체 1 (LAT1, 인간의 SLC7A5 유전자에 의해 코딩되는)의 발현 수준을 평가하였다.
Daudi, K562, HS-5 (인간 골수 간질 세포) 및 A549 세포에서의 LAT1 발현을 항-LAT1 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 측정하였다. 그 결과를 도 12A에 나타내었다. 전형적 mRNA 발현 수준은 하기 표 1에 기재되어 있다 (암세포주 백과사전 (Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE) 데이터베이스 참조).
| 세포_ID | SLC7A5 (FPKM) |
| A549_LUNG | 602.5735 |
| DAUDI_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 44.94462 |
| GRANTA519_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 159.1588 |
| JURKAT_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 180.9491 |
| K562_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 122.664 |
| MM1S_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 73.09056 |
| NALM6_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 106.7949 |
| OPM2_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 173.9881 |
| RAJI_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 127.4476 |
| RPMI8226_HAEMATOPOIETIC_및_LYMPHOID_TISSUE | 82.51015 |
| SKMEL28_SKIN | 137.2393 |
수용체 티로신 키나아제-유사 희귀 수용체 1 (ROR1)를 발현하는 세포주에서 LAT1 발현은 인터페론 감마 (IFNγ) 자극 이후, 항 LAT1 항체를 사용하여 유동 세포 계측법으로 측정하였다. 상기 실시예 1C에 기재된 HCC1806, H2286, H1975, H1299, BT-549 및 CD19.A549를 20ng/mL의 재조합 인간 IFN γ로 하룻밤 동안 자극하고 LAT1 발현에 대해 평가하였다. 그 결과를 도 12B에 나타내었다. B. 수지상 세포 및 대식세포에서의 LAT1 발현 수준
실시예 6B에 기술된 바와 같이, 인터페론 감마 (IFNγ), 또는 리포폴리사카 라이드 (LPS)로 자극한 다음 수상 세포와 대식세포에서 LAT1 발현 수준을 유동 세포 계측법으로 측정하였다. 그 결과를 도 12C에 나타내었다. LAT1 발현은 또한 활성화 후, CAR-발현 T 세포를 포함하여, T 세포에서 증가하는 것으로 관찰되었다. C. CAR T 세포 상의 LAT1 및 CD98hc의 발현 수준
다양한 항-CD19 CAR-발현 T 세포 집단을 비롯한 다양한 1차 인간 T 세포 집단에서, SLC7A5 (LAT1에 대해 코딩하는) mRNA 수준의 발현을 RNAseq를 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 3 가지 상이한 항-CD19 CAR+ T 세포 조성물 각각에 대해 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단을 개별적으로 평가하였다. 각각의 집단에 대해, 세포를 평가하기 위해 1차 인간 T 세포를 조작하여 (일반적으로 선별, 바이러스 형질도입, 증식 및 냉동보존 및 해동을 통해) 또는 CD19 항원을 발현하는 표적 세포의 존재 하에서 후속 (subsequent) 자극 후에 CAR를 발현시켰다. SLC7A5 mRNA 수준은 또한 상이한 CD19-표적된 CAR+ 세포 조성물 중 하나를 생성하도록 조작된 최초 (starting) 1차 인간 PBMC 샘플로부터의 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 평가되었다. 상기 결과는 인간 PBMC 샘플 세포와 비교하여 CAR-발현 세포에서 LAT1 mRNA가 증가된 각각의 샘플에서의 LAT1 mRNA의 발현을 나타내었고, CAR-표적화 항원을 발현하는 세포의 존재 하에서 CAR-T 세포의 자극 후의 증가된 수준을 보였다. 유사한 결과가 관찰되었다.
또한, SLC7A5 (LAT1, 경쇄에 대해 코딩하는)의 mRNA 및 SLC3A2 (CD98 중쇄 에 대해 코딩하는) mRNA가 전형적 항-CD19 CAR+ T 세포 조성물 중 하나에서 유사한 수준으로 관찰되었다.
LAT1 단백질 발현 수준은 2 가지 상이한 CAR를 발현하는 세포, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플의 CD4+ 및 CD8+ 집단, 및 A549 종양 세포주에서, 항-LAT1 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 비교되었다. 그 결과는 PBMC 샘플과 비교하여 CAR T 세포에서 더 높은 LAT1 발현을 보여주었고, PBMC 및 CAR+ 집단과 비교하여 종양 세포 (A549 세포)에서 상당히 증가된 LAT1 발현을 보여주었다.
실시예 8: IDO1
+
LAT1
-
골수 기질 세포와 공배양된 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포의 증식
높은 수준의 LAT1을 발현하지 않은 IDO1+ 세포와 함께 배양된 CAR-발현 T 세포의 증식을 평가하였다.
CAR-발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 CellTrace ™의 바이올렛 (ThermoFisher) 염료로 표지되고, CAR (1 : 1의 E : T 비율), HS-5 인간 골수 기질 세포 (IDO1 + IDO1 발현을 유도할 수 있는 방관자 세포; 1 : 1의 CAR+ : 방관자 세포 비율), 또는 표적 세포와 HS-5 세포 모두 (1 : 1 : 1의 CAR+ : 표적 : 방관자 세포 비율)에 의해 인식되는 항원을 발현하는 표적 세포와 96 시간 동안 공배양되었다. HS-5 방관자 세포는 높은 IDO1 및 낮은 LAT1을 발현한다. CD4+ 및 CD8+ CAR-발현 T 세포의 증식은 CellTrace ™ 바이올렛 염료의 희석에 의해 측정되었다.
도 13에 나타내는 바와 같이, 상기 결과는 표적 세포와 CAR T 세포의 배양이 CAR T 세포의 증식을 유도하는 반면, HS-5 방관자 세포 단독 및 CAR T 세포의 공배양은 CAR T 세포의 증식을 유도하지 않았다. 표적 세포 및 HS-5 세포 모두와의 공배양은 표적 세포와의 공배양과 유사한 증식을 보였다. 상기 결과는, HS-5 세포의 존재가, 인터페론 - 감마 (IFNγ)로 자극 시, IDO1을 발현하도록 유도할 수 있지만 높은 LAT1을 발현하지는 않으며, 자극 시 CAR T 세포의 증식에 영향을 미치지 않는다는 결과와 일치하였다.
실시예 9: 트립토판 고갈 및 보충
A. IDO1-발현 표적 세포에 의한 억제 후 CAR T 세포에 대해 보충 트립토판 첨가
실질적으로 실시예 1에서 기재된 바와 같이 생성된 항-CD19 CAR-발현 세포를 CellTrace ™ 바이올렛 염료로 표지하고, IDO1+ A549.CD19 세포와 함께 96 시간 동안, 단독으로 또는 5μg/mL 보충 트립토판 (24 시간마다 첨가된) 또는 250nM IDO 억제제, 에파카도스타트의 존재 하에서 배양하였다. 증식은 유동 세포 계측법으로 평가하였고, 각 웰에서 CAR+ T 세포 수를 측정하였다.
결과를 도 14a 및 도 14b에 나타내었다. 표적 세포 (IDO1을 상향 조절하고 증식을 억제하는 것으로 관찰되는)의 존재하에서 공배양된 CAR-T 세포의 트립토판 보충이, 처리하지 않은 것 (no treatment, no Tx)과 비교하여, IDO- 억제제의 첨가에 의해 관찰된 것과 유사한 정도로, CAR-T 세포의 증식을 회복시키는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 트립토판 고갈이 CAR-T 세포에 의한 IDO의 상향 조절에 따른 IDO1- 발현 표적 세포의 억제 효과를 매개한다는 결론과 일치한다.
B. CAR-T 항원-특이적 기능에 대한 트립토판 고갈의 영향
CAR-T 세포의 항원-유도 기능에 대한 트립토판 고갈의 영향을 평가하였다. CellTrace ™ 바이올렛으로 표지된 CAR-발현 T 세포를, 다양한 농도의 보충 트립토판을 첨가하거나 첨가하지 않은, 트립토판-결핍 배지에서, IDO1 발현을 유도하지 않는 것으로 관찰된 표적 세포 (CD19 (K192)로 형질도입 된 K562 인간 골수성 백혈병 표적 세포)와 공배양하였다. 트립토판-함유 배지를 대조군 (Trp 대조군)으로 사용하였다. 표적 세포 수와 증식 (CTV 염료 희석을 통한 유동 세포 계측법에 의해 평가, MFI = 평균 형광 강도).
도 15A, 도 15B 및 도 15C에서 그 결과를 나타내었다. 이러한 결과는, 상향조절된 IDO1의 존재 하에서 관찰된 것과 유사하게, 배양 중 보충 트립토판의 첨가에 의해 반전될(reversed) 수 있는, CAR T 세포의 항원-특이적 기능에 대한 트립토판 고갈의 저해 효과와 일치한다.
유사한 연구가 트립토판-고갈의 효과를 평가하기 위해 수행되었지만, 항원 - 발현 표적 세포와 대조적으로, CAR에 특이적인 항진(agonistic) 항-이디오타입 항체를 사용하여 CAR-매개 기능이 유도되었다. 실질적으로 실시예 1에서 기술 된 바와 같이 생성된, 항-CD19 CAR-발현 세포를, 트립토판-결핍 배지에서, 단독 또는 다양한 농도의 트립토판으로 보충하여, 플레이트-바운드(plate-bound) 항-이디오타입 항진 항체를 사용하여 96 시간 동안 자극시켰다. 웰 당 CD3+ 세포의 수를 측정하였다. 전형적 연구의 대표적 결과를 도 15d 및 도 15E (3 명의 상이한 공여자로부터의 결과)에 나타내었다. 유사한 결과가 다른 항원에 대한 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 유사한 실험에서 관찰되었다. 상기 결과는, 보충 트립토판에 의해 회복될 수 있는, 트립토판 고갈에 의한 CAR-매개 기능의 억제와 일치한다.
C. 트립토판-고갈 또는 트립토판-충분 조건 하에서 항원에 대한 재-노출 후 CAR-T 기능에 미치는 트립토판-고갈 조건의 영향
실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된, 항-CD19의 CAR-발현 세포는 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549) (기재된 바와 같이 CAR-T 공배양 후 IDO1 발현을 나타내는 것으로 관찰된)와 함께 96 시간 동안 배양하였다. 공배양은 0, 15.6, 62.5, 250 또는 1000nM의 IDO 억제제, 에파카도스타트의 존재 하에서 96 시간 동안 수행되었다. 그 결과를 도 16A에 나타내었다.
에파카도스타트 (0 ㎚)없이 배양된 세포는, 이후 추가로 96 시간 동안, 보충 트립토판의 첨가 (24 시간마다 배양물에 첨가) 또는 첨가없이, 새로운 표적 세포 또는 다른 부가적인 자극제의 첨가 없이 배양되었다. 결과를 도 16B에 나타내었다.
도 16B에서 나타내는 바와 같이, 에파카도스타트 없이 배양된 트립토판 보충 CAR+ T 세포의 증식 후에, 보충 트립토판 첨가 또는 첨가 없이 96 시간 동안 후속 배양한 배양물에서 시간 경과에 따라 T 세포 수의 유사한 증가 경향이 나타나는 것으로 관찰되었다.
항원에 연속적으로 재-노출 후에 CAR-T 기능 (증식, 사이토카인 생산)에 미치된 트립토판 고갈의 효과를 평가하였다. 실질적으로 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 2 개의 상이한 공여자로부터부터의 T 세포를 사용하여 생성된, 항-CD19 CAR-발현 세포를, 에파카도스타트 (처리 없음 (no Tx))의 부재 하에서 또는 250nM 에파카도스타트와 함께, 세포 배지에서 96 시간 동안, IDO1 유도 가능한 것으로 확인된 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 함께 공배양하였다.
세포를 수확하고, 계수하고, 보충 트립토판이 첨가되거나 첨가되지 않은 트립토판-결핍 배지 (96 시간에서 "no tx" 배양물부터의 배지)에서, 새로운 CD19-발현 A549 표적 세포 (CD19.A549)와 재배양하였다. 인터페론-감마 (IFNγ) 및 인터루킨-2 (IL-2)의 세포 내 수준을 세포 내 사이토카인 염색에 의해 평가하고, 주어진 세포 내 사이토카인 생산에 대해 양성으로 여겨지는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 비율(percentage)을 측정하였다.
결과를 도 16C 및 16D에 나타내었다. 도시된 바와 같이, 트립토판 고갈인 것으로 생각되는 CAR-T 세포 (항온배양 조건 하에서, IDO 억제제 없이(Tx 없음), IDO-1 발현을 유도하는 것으로 보이는 표적 세포와 함께 배양된 것들)는, 표적 세포로 세포를 재-접종 (re-encounter)한 이후에, 사이토카인 생산의 감소 (IDO1 억제제의 존재하에 배양 된 것들과 비교하여)를 나타내었다.
실시예 10: CD19-발현 종양 세포와 함께 배양된 CAR-발현 T 세포의 증식에 미치는 증가된 트립토판 대사 산물의 영향
트립토판 대사 산물을, CAR+ T 세포 및 IDO-표적 세포의 공배양물에 첨가하여, 트립토판 대사 산물의 존재가 CAR T 세포의 증식에 영향을 주는지 여부를 측정하였다.
실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된, 항-CD19 CAR-발현 T 세포는 CellTrace ™의 바이올렛 (ThermoFisher) 염료로 표지되고, 세척되었고, 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 μM L-키누레닌, 3-하이드록시 안트라닐산 (3-HAA), 또는 각각 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 μM의 L-키누레닌 및 3-HAA의 존재 하에서, 1 : 1의 이펙터 : 표적 (E : T) 비율로, CD19.Daudi 표적 세포 (IDO1- IDO1 발현을 유도하지 않는 것으로 관찰된 IDO1- 표적 세포)와 공배양되었다.
L-키누레닌과 3-HAA는 트립토판의 IDO1-매개 산화의 결과로 생성되는 대사 산물입니다. CD4 및 CD8의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. T 세포 집단의 증식은 CellTrace ™ 바이올렛 염료의 희석 정도에 근거하여 유동 세포 계측법에 의해 측정되었다.
도 17A에서 나타내는 바와 같이, 트립토판 대사 산물인 L-키누레닌 및 3-HAA의 존재는, CD19.Daudi 표적 세포와 공배양될 때, CAR T 세포 증식을 억제하지 않았다.
6.25 ~ 100 μM L-키누레닌, 3-하이드록시 안트라닐산 (3-HAA) 또는 6.25 ~ 100 μM의 키누레닌 및 3-HAA의 존재 하에서, 96 시간 동안, 항-CD19의 CAR-발현 세포와 IDO1- CD19.K562 세포를 공배양함으로써 유사한 연구를 수행하였다. 웰 당 CD3+ 세포의 수는 CountBright 비즈(beads)를 사용하여 측정하였다. 도 17B에서 나타내는 바와 같이, 트립토판 대사 산물인 L-키누레닌 및 3-HAA의 존재는 CD19.K562 표적 세포와 함께 배양될 때 CAR T 세포 수에 실질적으로 영향을 미치지 않았다.
실시예 11: 트립토판 고갈로부터의 회복 평가
CAR-발현 T 세포에서 다양한 기간 동안 트립토판을 고갈시키고, 트립토판 고갈 후 세포 증식 및 사이토카인 생산성의 회복을 평가하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된, 항-CD19 CAR-발현 T 세포를 트립토판 고갈 조건 (화학적으로 정의된 트립토판-프리(free) 배지)에서 24, 48, 72 또는 96 시간 동안 배양하였다 (24, 48, 72 또는 96 hr Trp starv.). 표시된 시간 동안 트립토판 고갈 후, 보충 트립토판을 배양물에 첨가하였다. 이후 24, 48, 72 또는 96 시간에서 세포가 수확될 때까지, 트립토판의 존재 하에서 세포를 배양하였다. 트립토판 충분 조건을 반영하는 대조군으로서, 트립토판-충분 배지 (tryptophan-sufficient media)에서 각각의 시간 동안 세포를 배양하였다 (완전 배지). 웰 당 CD3+ 세포의 수를 평가하였다. 인터페론 - 감마 (IFNγ) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 세포 내 생성을 세포 내 사이토카인 염색에 의해 평가하고, 사이토 카인 축적에 양성인 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 백분율(percentage)을 결정하였다
결과를 도 18A에 나타내었다. 상기 결과는 적어도 48 시간 이상의 트립토판 의 고갈이 세포 증식 능력을 감소시킨다는 관찰과 일치하였다. 보충 트립토판을 첨가해도 96 시간까지는 증식 능력을 완전히 회복시키지 못하는 것으로 관찰되었다. 트립토판이 고갈된 CD4+ 또는 CD8+ 세포 (IFNγ (각각, 도 18B 또는 18C) 또는 TNFα (각각 도 18D 또는 18E)의 사이토카인 생산성을 평가할 때, 유사한 결과가 관찰되었다. 이러한 결과는 24 시간 이상, 예를 들어 48 시간 또는 그 이상 동안 CAR-T 세포의 트립토판 고갈이, 정상 또는 충분한 트립토판 수준의 복원에 의해 반드시 회복되지 않을 수 있는 기능 손상을 초래할 수 있다는 발견과 일치하였다.
실시예 12 : 트립토판 고갈 조건에서의 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포에 대한 유전자 발현 분석
CAR 표적 항원의 존재 하의 트립토판 고갈 조건에서, 유전자 발현의 변화 및 신호 경로의 변화를 평가하기 위해, RNASeq에 의해 CAR-발현 T 세포를 분석하였다.
실질적으로 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 7 개의 상이한 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 생성된, CAR-발현 T 세포를, 플레이트 바운드 (plate bound) 항-이디오타입 항체로 2 일 동안, 최적 (5μg/mL, 트립토판 충분) 또는 준최적 (suboptimal) (0.625μg / mL; 트립토판 고갈)의 농도의 트립토판이 보충된 트리토판-프리 배지에서 자극시켰다. 수확된 세포로부터 RNA가 분리되었다. 가닥-특이적 바코드 (strand-specific, barcoded) cDNA 라이브러리를 제조하였다. 샘플을 시퀀싱하여 75-염기, 단일 말단 (single end) RNAseq 판독 값 (reads)을 얻었다.
RNASeq 판독 값은 인간 게놈에 매핑되어 정렬되었다. 공여자 및 치료를 고려하여, 유전자 수준의 발현 차이 분석(differential expression analysis) 을 수행하였다. 발현 차이 분석에 앞서, 유전자 세트를 단백질-코딩 유전자용으로 필터링하였다. 차별 발현된 유전자는 log2 배수 변화 컷오프 (fold change cutoff)의 ± 1 및 0.01의 Benjamini-Hochberg 조정된 FDR (false discovery rate) 컷오프를 둠으로써 확인되었다 .
현저히 상향조절된 (우측) 또는 하향조절된 (좌측) 유전자 산물을 포함하는 각 유전자 산물의 log2 배수-변화 (fold-change)로, 트립토판 충분 (Ctrl)과 트립토판 고갈 (Tryp) 조건 사이의 유전자 산물의 발현 차이의 통계적 유의성 (조정된 p 값의 로그 10)을 나타내는 볼케이노 플롯 (volcano plot)을 도 19A에 나타내었다. eIF2α/ATF4 통합 스트레스 반응 경로, ATF4 및 DDIT3 (또한 CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질 (CHOP)로 알려진)의 구성원(멤버)을 코딩하는 2 개의 예시적인 유전자에 대해, 킬로베이스 만 당 전사체 (transcripts per kilobase million, TPM) 값으로 나타낸 RNAseq 결과를 도 19B에 나타내었다. 도시된 바와 같이, 이들 유전자는 낮은 트립토판 조건에서 유의하게 상향 조절되었다. DDIT3 (CHOP)의 단백질 발현은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다.
도 19C는 트립토판 고갈 상태에서 영향을 받는 발현 분석에 기초하여 확인된 세포 신호 전달 경로를 평가하는 유전자 온톨로지 분석, 및 발현이 변경된 ATF4 경로에 관련된 유전자를 나타내는 전형적 도식 (exemplary schematic)에 기초한 결과를 나타낸다.
이러한 결과는 트립토판 고갈이 스트레스 반응 경로 및 다른 경로에 관련된 유전자를 비롯한 다양한 유전자의 유전자 발현 변화를 유도한다는 발견과 일치하였다.
실시예 13: 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포의 투여 후에 종양 이종 이식 마우스 모델에서의 인돌아민-피롤 2,3-다이옥시게나아제 (IDO1) 발현의 평가
마우스 이종이식 모델에서 종양에 의해 발현된 항원을 표적으로 하는 CAR- 발현 T 세포로 처리 (또는 비처리 (no treatment) (나이브))한 후 종양에서 IDO1의 발현을 평가하였다.
종양 이종 이식 마우스 모델은 5 × 106 A549.CD19 세포 (IDO+)를 피하 이식하여 생성하였다. 종양 이식 19 일 후, 처리군의 동물에게 항-CD19 CAR-발현 T 세포를 투여하였다. CAR+ T 세포 투여 후 9 일째에, 종양이 수확되었다. 종양 샘플을 단일 세포 현탁액으로 가공하여 유동 세포 계측법으로 평가 하였다. 살아있는 비(non)-마우스 세포, CD3, CD8 및 IDO 발현에 대한 게이팅을 평가하였다.
결과를 도 20에 나타내었다. 이러한 결과는 CAR+ T 세포로 처리된 동물에서 CD8+ 및 CD8- 음성 CAR+ T 세포 (비 마우스 CD3 + 세포)의 존재를 나타내었지만, 처리되지 않은 동물에서는 그렇지 않았다. 처리된 비(non)-CD3+ 비(non)-마우스 세포 집단 (A549.CD19+ 종양 세포를 함유하는 것으로 추정되는)에서 IDO1의 발현이 관찰되었지만, 처리되지 않은 동물에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과는 종양 내 종양-특이적 CAR-T 세포가 있는 종양에서의 IDO의 상향 조절과 일치한다.
포르말린-고정된 종양조직의 절편을 염색하고 CD3, CD19 및 IDO1에 대하여 면역 형광 현미경을 이용하여 평가하였다. 인간 CD3-발현 세포에 의해 둘러싸이고 침윤된 종양에서 CD19의 견고한 염색이 관찰되었다 (종양을 둘러싸고 침윤하는 항-CD19 CAR+ T 세포의 존재와 일치). 또한, IDO1 염색은 CD19+ 종양 및 CD3+ 집단의 계면에서 관찰되었다. 이러한 결과는 종양-표적화 CAR+ T 세포 투여 후 마우스 이종 이식 종양 모델에서의 IDO1-발현의 상향 조절과 일치하였다.
실시예 14: 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포의 투여 후 인간 대상체 생검에서의 인돌아민-피롤 2,3-다이옥시게나아제 (IDO1) 발현 및 적응 면역 저항의 평가
41BB 및 CD3 제타 세포질 신호 전달 도메인을 함유하는 항-CD19 CAR을 발현하는 자가 T 세포의 단일 주입 (single infusion) 전후에, 미만성거대B세포림프종 (Diffuse Large B-Cell Lymphoma, DLBCL)을 갖는 인간 대상체( human subjects)로부터 수득한 종양 생검 샘플에서 IDO1의 발현을 평가하였다.
CAR+ T 세포 투여 이전에, 및 CAR+ T 세포 투여 후 7 내지 20 일에 대상(피험자)로부터 얻은 종양 생검을 평가 하였다. 종양 생검 절편을 헤마톡실린과 에오신 (H & E)으로 염색하고 조직의 질과 종양의 ID (identification)을 평가하였다. 생검에서 CAR+ 세포 침윤은 항-CD19 CAR을 코딩하는 mRNA에 특이적인 ISH (in situ hybridization) 프로브를 사용하여 평가하였다. 면역 형광 염색법은 IDO1 및 PD-L1 (programmed death-ligand 1) 단백질 발현을 평가하는데 사용되었다.
도 21에서 나타내는 바와 같이, CAR+ T 세포 투여 및 종양에 대한 CAR+ T 세포의 국소화 (localization) 이후, 일부 DLBCL 환자의 종양에서 IDO1 및 PD-L1 발현이 증가하였다.
실시예 15 : 아미노산 수송체의 과발현을 위한 CAR T 세포의 조작
예시적 방법에서, 인간 대상체로부터 분리된 T 세포는, 예컨대 항-CD19 CAR 같은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하고, 아미노산 수송체 또는 하나 이상의 이의 사슬 (chain), 예를 들어 경쇄로서 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 및 경우에 따라 중쇄로서 CD98 중쇄 (CD98hc; 4F2hc; SLC3A2)를 포함하는 수송체를 과발현하도록 조작된다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 대상 (피험자)으로부터의 아페레시스(apheresis) 산물 시료 (product sample)로부터 선택된다.
일부 실시예에서, CAR를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 세포 내로 도입된다. 일부 실시예에서, CAR을 코딩하는 핵산 서열은 형질 도입을 확인하기 위해 표면 마커 (예 : EGFRt)에 연결될 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 핵산, 예를 들어 아미노산 수송체 또는 하나 이상의 아미노산 수송체의 하나 이상의 사슬을 코딩하는 하나 이상의 바이러스 벡터에 포함된 핵산이 세포 내로 도입된다. 일부 경우에는 코딩된 아미노산 수송체는 단량체이다. 일부 경우, 코딩된 아미노산 수송체는 이합체 (heteroer)와 같은 이량체 (dimer)이다. 일부 실시예에서, 아미노산 수송체의 사슬은 LAT1 (SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 또는 양성자-보조 (proton-assisted) 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)일 수 있다. 일부 실시예에서, 아미노산 수송체를 코딩하는 핵산 서열은 또한 CD98 중쇄 (CD98hc; 4F2hc; SLC3A2)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 아미노산 수송체(들) 또는 사슬(들)을 코딩하는 핵산 서열은, 아미노산을 코딩하는 핵산 서열의 형질도입을 확인하기 위해, 상이한 표면 마커 (예, Thy1.1)를 코딩하는 핵산 서열에 연결된다.
CAR 및/또는 아미노산 수송체(들) 또는 사슬(들)을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 하나 이상의 바이러스 벡터는 바이러스 형질 도입에 의해 CD4+ 및 CD8+ 세포 내로 도입된다. 일부 실시예에서, 도입 후, 예를 들어 세포 증식을 허용하기 위해, 세포는 일반적으로 37 ℃에서 추가로 배양된다. 생성된 T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하고 아미노산 수송체를 과발현한다.
일부 실시예에서, 조작된 세포, 예컨대 CAR LAT1/CD98hc+ 세포의 기능은 트립토판 고갈 상태 (예, 제한량 (limiting amounts)의 트립토판이 보충된 트립토판-프리(free) 배지 및/또는 IDO1+ 및/ 또는 LAT1+ 세포의 존재 하에서)에서 평가된다 .
실시예 16: 아미노산 고갈 조절 인자의 발현 감소를 위한 CAR+ T 세포의 조작
예시적인 방법에서, 인간 대상체로부터 단리된 T 세포는 항-CD19 CAR과 같은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키고 아미노산 고갈 조절인자의 발현을 감소 또는 철폐(abolish)하도록 조작된다. 일부 실시예에서, T 세포는 GCN2 (general control nonderepressible 2), eIF2α (eukaryotic translation initiation factor 2 α), ATF4 (activating transcription factor 4), 또는 CHOP (CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein)과 같은 아미노산 고갈 조절인자의 철폐하거나 감소시키도록 조작된다. 일부 실시예에서, T 세포는 GCN2에 의해 조절되는 경로의 성분, 예를 들어 CHOP, Gadd45α, Herp 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 또는 IFNγ-R2의 발현을 철폐 또는 감소시키도록 조작된다. 일부 실시예에서, GCN2, eIF2α, ATF4 또는 CHOP의 발현은 RNA 간섭제, 예컨대 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA (siRNA)와 같은 억제성 핵산에 의해 철폐되거나 감소된다. 일부 실시예에서, 억제성 핵산 또는 억제성 핵산을 코딩하는 핵산 분자는 CAR-발현 세포 내로 도입된다. 일부 실시예에서, GCN2, eIF2α, ATF4 또는 CHOP는 단백질을 코딩하는 유전자의 파괴를 통해 철폐되거나 감소된다.
일부 실시예에서, 유전자 조작에 의해 파괴가 이루어진다. 예를 들어, GCN2, eIF2α, ATF4 또는 CHOP의 파괴는 유전자 편집 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 크리스퍼/카스9 (clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid (CRISPR)/Cas9) 및/또는 TAL-이펙터 뉴클레아제 (TALEN)의 도입에 이해 달성된다. 일부 실시예에서, 유전자를 표적으로하는 핵산, 예를 들어, 가이드 RNA가 또한 조작된 T 세포 내로 도입된다. 일부 경우, 유전자 편집 뉴클레아제 및 표적화 핵산, 예를 들어, 가이드 RNA를 포함하는 리보뉴클레오티드 복합체 (RNP)가 세포 내로 도입된다.
일부 실시예에서, 조작된 세포, 예를 들어, CAR-발현 GCN2-세포의 기능은 트립토판 고갈 상태 (예, 제한량의 트립토판이 보충된 트립토판-프리 배지 및/또는 IDO1+ 및/또는 LAT1+ 세포의 존재 하)에서 평가된다.
본 발명은 개시된 특정 실시 양태의 범위로 제한되지 않으며, 이는 예를 들어 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위하여 제공된다. 기술된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시될 수 있으며 본 발명의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Juno Therapeutics, Inc.
Ports, Michael
Thomas, Evan P
Levitsky, Hyam I
<120> IMMUNOTHERAPY METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING TRYPTOPHAN
METABOLIC PATHWAY MODULATORS
<130> 735042007540
<150> US 62/407,776
<151> 2016-10-13
<150> US 62/514,767
<151> 2017-06-02
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
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<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> spacer derived from IgG4 hinge of Homo sapiens
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Hinge-CH3 spacer derived from
Homo sapiens
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<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgD-hinge-Fc Homo sapiens
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A sequence artificial
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR artificial
<400> 7
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28 (amino acids 153-179 of Accession No. P10747)
Homo sapiens
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747)
Homo sapiens
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747)
Homo sapiens
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (LL to GG) Homo sapiens
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1) Homo sapiens
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3 zeta Homo sapiens
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3 zeta Homo sapiens
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3 zeta Homo sapiens
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker sequence
<400> 16
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
20 25 30
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 17
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 18
<211> 1368
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> S. Pyogenes Cas9 Q99ZW2
<400> 18
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 19
<211> 1368
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> S. Pyogenes Cas9 D10A
<400> 19
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 20
<211> 2549
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MTOR_HUMAN Serine/threonine-protein kinase mTOR; UniProt No.
P42345
<400> 20
Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser
1 5 10 15
Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg
20 25 30
Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val
35 40 45
Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr
50 55 60
Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala
65 70 75 80
Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val
85 90 95
Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg
100 105 110
Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys
115 120 125
Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr
130 135 140
Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg
145 150 155 160
Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp
180 185 190
Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly
195 200 205
Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu
210 215 220
Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu
225 230 235 240
Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn
245 250 255
Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val
260 265 270
Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu
275 280 285
Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu Met
290 295 300
Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln
305 310 315 320
Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly Tyr
325 330 335
Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala
340 345 350
Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu
355 360 365
Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys
370 375 380
Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala
385 390 395 400
Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Thr
405 410 415
Met Asn His Val Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr Ala
420 425 430
Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu Phe
435 440 445
Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala Met Gln Val Asp Ala
465 470 475 480
Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser Met Leu Ala Arg Ala Met Gly Pro Gly
485 490 495
Ile Gln Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Pro Met Leu Ala Val Gly
500 505 510
Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Ile
515 520 525
Pro Gln Leu Lys Lys Asp Ile Gln Asp Gly Leu Leu Lys Met Leu Ser
530 535 540
Leu Val Leu Met His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly Met Pro Lys Gly
545 550 555 560
Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala
565 570 575
Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Phe
580 585 590
Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala Asp
595 600 605
His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg Met Glu Ala Ala Arg
610 615 620
Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly His
625 630 635 640
Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val Leu
645 650 655
Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile Arg
660 665 670
Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu Ala
675 680 685
Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Leu Phe Val Ala Leu Asn Asp Gln Val
690 695 700
Phe Glu Ile Arg Glu Leu Ala Ile Cys Thr Val Gly Arg Leu Ser Ser
705 710 715 720
Met Asn Pro Ala Phe Val Met Pro Phe Leu Arg Lys Met Leu Ile Gln
725 730 735
Ile Leu Thr Glu Leu Glu His Ser Gly Ile Gly Arg Ile Lys Glu Gln
740 745 750
Ser Ala Arg Met Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu Ile
755 760 765
Arg Pro Tyr Met Glu Pro Ile Leu Lys Ala Leu Ile Leu Lys Leu Lys
770 775 780
Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Gly Val Ile Asn Asn Val Leu Ala
785 790 795 800
Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu Met Arg Lys Trp
805 810 815
Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile Met Asp Met Leu Gln Asp Ser Ser
820 825 830
Leu Leu Ala Lys Arg Gln Val Ala Leu Trp Thr Leu Gly Gln Leu Val
835 840 845
Ala Ser Thr Gly Tyr Val Val Glu Pro Tyr Arg Lys Tyr Pro Thr Leu
850 855 860
Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly Thr
865 870 875 880
Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp Pro
885 890 895
Tyr Lys His Lys Val Asn Ile Gly Met Ile Asp Gln Ser Arg Asp Ala
900 905 910
Ser Ala Val Ser Leu Ser Glu Ser Lys Ser Ser Gln Asp Ser Ser Asp
915 920 925
Tyr Ser Thr Ser Glu Met Leu Val Asn Met Gly Asn Leu Pro Leu Asp
930 935 940
Glu Phe Tyr Pro Ala Val Ser Met Val Ala Leu Met Arg Ile Phe Arg
945 950 955 960
Asp Gln Ser Leu Ser His His His Thr Met Val Val Gln Ala Ile Thr
965 970 975
Phe Ile Phe Lys Ser Leu Gly Leu Lys Cys Val Gln Phe Leu Pro Gln
980 985 990
Val Met Pro Thr Phe Leu Asn Val Ile Arg Val Cys Asp Gly Ala Ile
995 1000 1005
Arg Glu Phe Leu Phe Gln Gln Leu Gly Met Leu Val Ser Phe Val
1010 1015 1020
Lys Ser His Ile Arg Pro Tyr Met Asp Glu Ile Val Thr Leu Met
1025 1030 1035
Arg Glu Phe Trp Val Met Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile
1040 1045 1050
Leu Leu Ile Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys
1055 1060 1065
Leu Tyr Leu Pro Gln Leu Ile Pro His Met Leu Arg Val Phe Met
1070 1075 1080
His Asp Asn Ser Pro Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala
1085 1090 1095
Ala Ile Gln Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu
1100 1105 1110
Leu Leu Pro Pro Ile Val Lys Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro
1115 1120 1125
Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala Leu Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr
1130 1135 1140
Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Ala Ser Arg Ile Ile His Pro
1145 1150 1155
Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu Leu Arg Ser Thr Ala
1160 1165 1170
Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu Gly Lys Lys Tyr
1175 1180 1185
Gln Ile Phe Ile Pro Met Val Asn Lys Val Leu Val Arg His Arg
1190 1195 1200
Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg Ile Val Lys
1205 1210 1215
Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile Tyr Gln
1220 1225 1230
His Arg Met Leu Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala Ser Gly
1235 1240 1245
Pro Val Glu Thr Gly Pro Met Lys Lys Leu His Val Ser Thr Ile
1250 1255 1260
Asn Leu Gln Lys Ala Trp Gly Ala Ala Arg Arg Val Ser Lys Asp
1265 1270 1275
Asp Trp Leu Glu Trp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Leu Lys
1280 1285 1290
Asp Ser Ser Ser Pro Ser Leu Arg Ser Cys Trp Ala Leu Ala Gln
1295 1300 1305
Ala Tyr Asn Pro Met Ala Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ala Phe Val
1310 1315 1320
Ser Cys Trp Ser Glu Leu Asn Glu Asp Gln Gln Asp Glu Leu Ile
1325 1330 1335
Arg Ser Ile Glu Leu Ala Leu Thr Ser Gln Asp Ile Ala Glu Val
1340 1345 1350
Thr Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Glu Phe Met Glu His Ser Asp
1355 1360 1365
Lys Gly Pro Leu Pro Leu Arg Asp Asp Asn Gly Ile Val Leu Leu
1370 1375 1380
Gly Glu Arg Ala Ala Lys Cys Arg Ala Tyr Ala Lys Ala Leu His
1385 1390 1395
Tyr Lys Glu Leu Glu Phe Gln Lys Gly Pro Thr Pro Ala Ile Leu
1400 1405 1410
Glu Ser Leu Ile Ser Ile Asn Asn Lys Leu Gln Gln Pro Glu Ala
1415 1420 1425
Ala Ala Gly Val Leu Glu Tyr Ala Met Lys His Phe Gly Glu Leu
1430 1435 1440
Glu Ile Gln Ala Thr Trp Tyr Glu Lys Leu His Glu Trp Glu Asp
1445 1450 1455
Ala Leu Val Ala Tyr Asp Lys Lys Met Asp Thr Asn Lys Asp Asp
1460 1465 1470
Pro Glu Leu Met Leu Gly Arg Met Arg Cys Leu Glu Ala Leu Gly
1475 1480 1485
Glu Trp Gly Gln Leu His Gln Gln Cys Cys Glu Lys Trp Thr Leu
1490 1495 1500
Val Asn Asp Glu Thr Gln Ala Lys Met Ala Arg Met Ala Ala Ala
1505 1510 1515
Ala Ala Trp Gly Leu Gly Gln Trp Asp Ser Met Glu Glu Tyr Thr
1520 1525 1530
Cys Met Ile Pro Arg Asp Thr His Asp Gly Ala Phe Tyr Arg Ala
1535 1540 1545
Val Leu Ala Leu His Gln Asp Leu Phe Ser Leu Ala Gln Gln Cys
1550 1555 1560
Ile Asp Lys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Ala Glu Leu Thr Ala Met
1565 1570 1575
Ala Gly Glu Ser Tyr Ser Arg Ala Tyr Gly Ala Met Val Ser Cys
1580 1585 1590
His Met Leu Ser Glu Leu Glu Glu Val Ile Gln Tyr Lys Leu Val
1595 1600 1605
Pro Glu Arg Arg Glu Ile Ile Arg Gln Ile Trp Trp Glu Arg Leu
1610 1615 1620
Gln Gly Cys Gln Arg Ile Val Glu Asp Trp Gln Lys Ile Leu Met
1625 1630 1635
Val Arg Ser Leu Val Val Ser Pro His Glu Asp Met Arg Thr Trp
1640 1645 1650
Leu Lys Tyr Ala Ser Leu Cys Gly Lys Ser Gly Arg Leu Ala Leu
1655 1660 1665
Ala His Lys Thr Leu Val Leu Leu Leu Gly Val Asp Pro Ser Arg
1670 1675 1680
Gln Leu Asp His Pro Leu Pro Thr Val His Pro Gln Val Thr Tyr
1685 1690 1695
Ala Tyr Met Lys Asn Met Trp Lys Ser Ala Arg Lys Ile Asp Ala
1700 1705 1710
Phe Gln His Met Gln His Phe Val Gln Thr Met Gln Gln Gln Ala
1715 1720 1725
Gln His Ala Ile Ala Thr Glu Asp Gln Gln His Lys Gln Glu Leu
1730 1735 1740
His Lys Leu Met Ala Arg Cys Phe Leu Lys Leu Gly Glu Trp Gln
1745 1750 1755
Leu Asn Leu Gln Gly Ile Asn Glu Ser Thr Ile Pro Lys Val Leu
1760 1765 1770
Gln Tyr Tyr Ser Ala Ala Thr Glu His Asp Arg Ser Trp Tyr Lys
1775 1780 1785
Ala Trp His Ala Trp Ala Val Met Asn Phe Glu Ala Val Leu His
1790 1795 1800
Tyr Lys His Gln Asn Gln Ala Arg Asp Glu Lys Lys Lys Leu Arg
1805 1810 1815
His Ala Ser Gly Ala Asn Ile Thr Asn Ala Thr Thr Ala Ala Thr
1820 1825 1830
Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ser Thr Glu Gly Ser Asn
1835 1840 1845
Ser Glu Ser Glu Ala Glu Ser Thr Glu Asn Ser Pro Thr Pro Ser
1850 1855 1860
Pro Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu
1865 1870 1875
Met Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly Phe Phe Arg Ser Ile Ser
1880 1885 1890
Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu Arg Val Leu Thr
1895 1900 1905
Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val Asn Glu Ala Leu
1910 1915 1920
Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp Leu Gln Val
1925 1930 1935
Ile Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro Leu Val
1940 1945 1950
Gly Arg Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr His
1955 1960 1965
Pro Gln Ala Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr
1970 1975 1980
Thr Thr Ala Arg His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn Met
1985 1990 1995
Cys Glu His Ser Asn Thr Leu Val Gln Gln Ala Met Met Val Ser
2000 2005 2010
Glu Glu Leu Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His
2015 2020 2025
Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn
2030 2035 2040
Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met
2045 2050 2055
Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala
2060 2065 2070
Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr
2075 2080 2085
Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu
2090 2095 2100
Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln Leu Pro Gln Leu
2105 2110 2115
Thr Ser Leu Glu Leu Gln Tyr Val Ser Pro Lys Leu Leu Met Cys
2120 2125 2130
Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Pro Gly Thr Tyr Asp Pro Asn Gln
2135 2140 2145
Pro Ile Ile Arg Ile Gln Ser Ile Ala Pro Ser Leu Gln Val Ile
2150 2155 2160
Thr Ser Lys Gln Arg Pro Arg Lys Leu Thr Leu Met Gly Ser Asn
2165 2170 2175
Gly His Glu Phe Val Phe Leu Leu Lys Gly His Glu Asp Leu Arg
2180 2185 2190
Gln Asp Glu Arg Val Met Gln Leu Phe Gly Leu Val Asn Thr Leu
2195 2200 2205
Leu Ala Asn Asp Pro Thr Ser Leu Arg Lys Asn Leu Ser Ile Gln
2210 2215 2220
Arg Tyr Ala Val Ile Pro Leu Ser Thr Asn Ser Gly Leu Ile Gly
2225 2230 2235
Trp Val Pro His Cys Asp Thr Leu His Ala Leu Ile Arg Asp Tyr
2240 2245 2250
Arg Glu Lys Lys Lys Ile Leu Leu Asn Ile Glu His Arg Ile Met
2255 2260 2265
Leu Arg Met Ala Pro Asp Tyr Asp His Leu Thr Leu Met Gln Lys
2270 2275 2280
Val Glu Val Phe Glu His Ala Val Asn Asn Thr Ala Gly Asp Asp
2285 2290 2295
Leu Ala Lys Leu Leu Trp Leu Lys Ser Pro Ser Ser Glu Val Trp
2300 2305 2310
Phe Asp Arg Arg Thr Asn Tyr Thr Arg Ser Leu Ala Val Met Ser
2315 2320 2325
Met Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly Asp Arg His Pro Ser Asn
2330 2335 2340
Leu Met Leu Asp Arg Leu Ser Gly Lys Ile Leu His Ile Asp Phe
2345 2350 2355
Gly Asp Cys Phe Glu Val Ala Met Thr Arg Glu Lys Phe Pro Glu
2360 2365 2370
Lys Ile Pro Phe Arg Leu Thr Arg Met Leu Thr Asn Ala Met Glu
2375 2380 2385
Val Thr Gly Leu Asp Gly Asn Tyr Arg Ile Thr Cys His Thr Val
2390 2395 2400
Met Glu Val Leu Arg Glu His Lys Asp Ser Val Met Ala Val Leu
2405 2410 2415
Glu Ala Phe Val Tyr Asp Pro Leu Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp
2420 2425 2430
Thr Asn Thr Lys Gly Asn Lys Arg Ser Arg Thr Arg Thr Asp Ser
2435 2440 2445
Tyr Ser Ala Gly Gln Ser Val Glu Ile Leu Asp Gly Val Glu Leu
2450 2455 2460
Gly Glu Pro Ala His Lys Lys Thr Gly Thr Thr Val Pro Glu Ser
2465 2470 2475
Ile His Ser Phe Ile Gly Asp Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala Leu
2480 2485 2490
Asn Lys Lys Ala Ile Gln Ile Ile Asn Arg Val Arg Asp Lys Leu
2495 2500 2505
Thr Gly Arg Asp Phe Ser His Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr
2510 2515 2520
Gln Val Glu Leu Leu Ile Lys Gln Ala Thr Ser His Glu Asn Leu
2525 2530 2535
Cys Gln Cys Tyr Ile Gly Trp Cys Pro Phe Trp
2540 2545
<210> 21
<211> 8733
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Homo sapiens mechanistic target of rapamycin (MTOR), mRNA; Acc.
No. NM_004958.3
<400> 21
gctcccggct tagaggacag cggggaaggc gggcggtggg gcagggggcc tgaagcggcg 60
gtaccggtgc tggcggcggc agctgaggcc ttggccgaag ccgcgcgaac ctcagggcaa 120
gatgcttgga accggacctg ccgccgccac caccgctgcc accacatcta gcaatgtgag 180
cgtcctgcag cagtttgcca gtggcctaaa gagccggaat gaggaaacca gggccaaagc 240
cgccaaggag ctccagcact atgtcaccat ggaactccga gagatgagtc aagaggagtc 300
tactcgcttc tatgaccaac tgaaccatca catttttgaa ttggtttcca gctcagatgc 360
caatgagagg aaaggtggca tcttggccat agctagcctc ataggagtgg aaggtgggaa 420
tgccacccga attggcagat ttgccaacta tcttcggaac ctcctcccct ccaatgaccc 480
agttgtcatg gaaatggcat ccaaggccat tggccgtctt gccatggcag gggacacttt 540
taccgctgag tacgtggaat ttgaggtgaa gcgagccctg gaatggctgg gtgctgaccg 600
caatgagggc cggagacatg cagctgtcct ggttctccgt gagctggcca tcagcgtccc 660
taccttcttc ttccagcaag tgcaaccctt ctttgacaac atttttgtgg ccgtgtggga 720
ccccaaacag gccatccgtg agggagctgt agccgccctt cgtgcctgtc tgattctcac 780
aacccagcgt gagccgaagg agatgcagaa gcctcagtgg tacaggcaca catttgaaga 840
agcagagaag ggatttgatg agaccttggc caaagagaag ggcatgaatc gggatgatcg 900
gatccatgga gccttgttga tccttaacga gctggtccga atcagcagca tggagggaga 960
gcgtctgaga gaagaaatgg aagaaatcac acagcagcag ctggtacacg acaagtactg 1020
caaagatctc atgggcttcg gaacaaaacc tcgtcacatt acccccttca ccagtttcca 1080
ggctgtacag ccccagcagt caaatgcctt ggtggggctg ctggggtaca gctctcacca 1140
aggcctcatg ggatttggga cctcccccag tccagctaag tccaccctgg tggagagccg 1200
gtgttgcaga gacttgatgg aggagaaatt tgatcaggtg tgccagtggg tgctgaaatg 1260
caggaatagc aagaactcgc tgatccaaat gacaatcctt aatttgttgc cccgcttggc 1320
tgcattccga ccttctgcct tcacagatac ccagtatctc caagatacca tgaaccatgt 1380
cctaagctgt gtcaagaagg agaaggaacg tacagcggcc ttccaagccc tggggctact 1440
ttctgtggct gtgaggtctg agtttaaggt ctatttgcct cgcgtgctgg acatcatccg 1500
agcggccctg cccccaaagg acttcgccca taagaggcag aaggcaatgc aggtggatgc 1560
cacagtcttc acttgcatca gcatgctggc tcgagcaatg gggccaggca tccagcagga 1620
tatcaaggag ctgctggagc ccatgctggc agtgggacta agccctgccc tcactgcagt 1680
gctctacgac ctgagccgtc agattccaca gctaaagaag gacattcaag atgggctact 1740
gaaaatgctg tccctggtcc ttatgcacaa accccttcgc cacccaggca tgcccaaggg 1800
cctggcccat cagctggcct ctcctggcct cacgaccctc cctgaggcca gcgatgtggg 1860
cagcatcact cttgccctcc gaacgcttgg cagctttgaa tttgaaggcc actctctgac 1920
ccaatttgtt cgccactgtg cggatcattt cctgaacagt gagcacaagg agatccgcat 1980
ggaggctgcc cgcacctgct cccgcctgct cacaccctcc atccacctca tcagtggcca 2040
tgctcatgtg gttagccaga ccgcagtgca agtggtggca gatgtgctta gcaaactgct 2100
cgtagttggg ataacagatc ctgaccctga cattcgctac tgtgtcttgg cgtccctgga 2160
cgagcgcttt gatgcacacc tggcccaggc ggagaacttg caggccttgt ttgtggctct 2220
gaatgaccag gtgtttgaga tccgggagct ggccatctgc actgtgggcc gactcagtag 2280
catgaaccct gcctttgtca tgcctttcct gcgcaagatg ctcatccaga ttttgacaga 2340
gttggagcac agtgggattg gaagaatcaa agagcagagt gcccgcatgc tggggcacct 2400
ggtctccaat gccccccgac tcatccgccc ctacatggag cctattctga aggcattaat 2460
tttgaaactg aaagatccag accctgatcc aaacccaggt gtgatcaata atgtcctggc 2520
aacaatagga gaattggcac aggttagtgg cctggaaatg aggaaatggg ttgatgaact 2580
ttttattatc atcatggaca tgctccagga ttcctctttg ttggccaaaa ggcaggtggc 2640
tctgtggacc ctgggacagt tggtggccag cactggctat gtagtagagc cctacaggaa 2700
gtaccctact ttgcttgagg tgctactgaa ttttctgaag actgagcaga accagggtac 2760
acgcagagag gccatccgtg tgttagggct tttaggggct ttggatcctt acaagcacaa 2820
agtgaacatt ggcatgatag accagtcccg ggatgcctct gctgtcagcc tgtcagaatc 2880
caagtcaagt caggattcct ctgactatag cactagtgaa atgctggtca acatgggaaa 2940
cttgcctctg gatgagttct acccagctgt gtccatggtg gccctgatgc ggatcttccg 3000
agaccagtca ctctctcatc atcacaccat ggttgtccag gccatcacct tcatcttcaa 3060
gtccctggga ctcaaatgtg tgcagttcct gccccaggtc atgcccacgt tccttaacgt 3120
cattcgagtc tgtgatgggg ccatccggga atttttgttc cagcagctgg gaatgttggt 3180
gtcctttgtg aagagccaca tcagacctta tatggatgaa atagtcaccc tcatgagaga 3240
attctgggtc atgaacacct caattcagag cacgatcatt cttctcattg agcaaattgt 3300
ggtagctctt gggggtgaat ttaagctcta cctgccccag ctgatcccac acatgctgcg 3360
tgtcttcatg catgacaaca gcccaggccg cattgtctct atcaagttac tggctgcaat 3420
ccagctgttt ggcgccaacc tggatgacta cctgcattta ctgctgcctc ctattgttaa 3480
gttgtttgat gcccctgaag ctccactgcc atctcgaaag gcagcgctag agactgtgga 3540
ccgcctgacg gagtccctgg atttcactga ctatgcctcc cggatcattc accctattgt 3600
tcgaacactg gaccagagcc cagaactgcg ctccacagcc atggacacgc tgtcttcact 3660
tgtttttcag ctggggaaga agtaccaaat tttcattcca atggtgaata aagttctggt 3720
gcgacaccga atcaatcatc agcgctatga tgtgctcatc tgcagaattg tcaagggata 3780
cacacttgct gatgaagagg aggatccttt gatttaccag catcggatgc ttaggagtgg 3840
ccaaggggat gcattggcta gtggaccagt ggaaacagga cccatgaaga aactgcacgt 3900
cagcaccatc aacctccaaa aggcctgggg cgctgccagg agggtctcca aagatgactg 3960
gctggaatgg ctgagacggc tgagcctgga gctgctgaag gactcatcat cgccctccct 4020
gcgctcctgc tgggccctgg cacaggccta caacccgatg gccagggatc tcttcaatgc 4080
tgcatttgtg tcctgctggt ctgaactgaa tgaagatcaa caggatgagc tcatcagaag 4140
catcgagttg gccctcacct cacaagacat cgctgaagtc acacagaccc tcttaaactt 4200
ggctgaattc atggaacaca gtgacaaggg ccccctgcca ctgagagatg acaatggcat 4260
tgttctgctg ggtgagagag ctgccaagtg ccgagcatat gccaaagcac tacactacaa 4320
agaactggag ttccagaaag gccccacccc tgccattcta gaatctctca tcagcattaa 4380
taataagcta cagcagccgg aggcagcggc cggagtgtta gaatatgcca tgaaacactt 4440
tggagagctg gagatccagg ctacctggta tgagaaactg cacgagtggg aggatgccct 4500
tgtggcctat gacaagaaaa tggacaccaa caaggacgac ccagagctga tgctgggccg 4560
catgcgctgc ctcgaggcct tgggggaatg gggtcaactc caccagcagt gctgtgaaaa 4620
gtggaccctg gttaatgatg agacccaagc caagatggcc cggatggctg ctgcagctgc 4680
atggggttta ggtcagtggg acagcatgga agaatacacc tgtatgatcc ctcgggacac 4740
ccatgatggg gcattttata gagctgtgct ggcactgcat caggacctct tctccttggc 4800
acaacagtgc attgacaagg ccagggacct gctggatgct gaattaactg cgatggcagg 4860
agagagttac agtcgggcat atggggccat ggtttcttgc cacatgctgt ccgagctgga 4920
ggaggttatc cagtacaaac ttgtccccga gcgacgagag atcatccgcc agatctggtg 4980
ggagagactg cagggctgcc agcgtatcgt agaggactgg cagaaaatcc ttatggtgcg 5040
gtcccttgtg gtcagccctc atgaagacat gagaacctgg ctcaagtatg caagcctgtg 5100
cggcaagagt ggcaggctgg ctcttgctca taaaacttta gtgttgctcc tgggagttga 5160
tccgtctcgg caacttgacc atcctctgcc aacagttcac cctcaggtga cctatgccta 5220
catgaaaaac atgtggaaga gtgcccgcaa gatcgatgcc ttccagcaca tgcagcattt 5280
tgtccagacc atgcagcaac aggcccagca tgccatcgct actgaggacc agcagcataa 5340
gcaggaactg cacaagctca tggcccgatg cttcctgaaa cttggagagt ggcagctgaa 5400
tctacagggc atcaatgaga gcacaatccc caaagtgctg cagtactaca gcgccgccac 5460
agagcacgac cgcagctggt acaaggcctg gcatgcgtgg gcagtgatga acttcgaagc 5520
tgtgctacac tacaaacatc agaaccaagc ccgcgatgag aagaagaaac tgcgtcatgc 5580
cagcggggcc aacatcacca acgccaccac tgccgccacc acggccgcca ctgccaccac 5640
cactgccagc accgagggca gcaacagtga gagcgaggcc gagagcaccg agaacagccc 5700
caccccatcg ccgctgcaga agaaggtcac tgaggatctg tccaaaaccc tcctgatgta 5760
cacggtgcct gccgtccagg gcttcttccg ttccatctcc ttgtcacgag gcaacaacct 5820
ccaggataca ctcagagttc tcaccttatg gtttgattat ggtcactggc cagatgtcaa 5880
tgaggcctta gtggaggggg tgaaagccat ccagattgat acctggctac aggttatacc 5940
tcagctcatt gcaagaattg atacgcccag acccttggtg ggacgtctca ttcaccagct 6000
tctcacagac attggtcggt accaccccca ggccctcatc tacccactga cagtggcttc 6060
taagtctacc acgacagccc ggcacaatgc agccaacaag attctgaaga acatgtgtga 6120
gcacagcaac accctggtcc agcaggccat gatggtgagc gaggagctga tccgagtggc 6180
catcctctgg catgagatgt ggcatgaagg cctggaagag gcatctcgtt tgtactttgg 6240
ggaaaggaac gtgaaaggca tgtttgaggt gctggagccc ttgcatgcta tgatggaacg 6300
gggcccccag actctgaagg aaacatcctt taatcaggcc tatggtcgag atttaatgga 6360
ggcccaagag tggtgcagga agtacatgaa atcagggaat gtcaaggacc tcacccaagc 6420
ctgggacctc tattatcatg tgttccgacg aatctcaaag cagctgcctc agctcacatc 6480
cttagagctg caatatgttt ccccaaaact tctgatgtgc cgggaccttg aattggctgt 6540
gccaggaaca tatgacccca accagccaat cattcgcatt cagtccatag caccgtcttt 6600
gcaagtcatc acatccaagc agaggccccg gaaattgaca cttatgggca gcaacggaca 6660
tgagtttgtt ttccttctaa aaggccatga agatctgcgc caggatgagc gtgtgatgca 6720
gctcttcggc ctggttaaca cccttctggc caatgaccca acatctcttc ggaaaaacct 6780
cagcatccag agatacgctg tcatcccttt atcgaccaac tcgggcctca ttggctgggt 6840
tccccactgt gacacactgc acgccctcat ccgggactac agggagaaga agaagatcct 6900
tctcaacatc gagcatcgca tcatgttgcg gatggctccg gactatgacc acttgactct 6960
gatgcagaag gtggaggtgt ttgagcatgc cgtcaataat acagctgggg acgacctggc 7020
caagctgctg tggctgaaaa gccccagctc cgaggtgtgg tttgaccgaa gaaccaatta 7080
tacccgttct ttagcggtca tgtcaatggt tgggtatatt ttaggcctgg gagatagaca 7140
cccatccaac ctgatgctgg accgtctgag tgggaagatc ctgcacattg actttgggga 7200
ctgctttgag gttgctatga cccgagagaa gtttccagag aagattccat ttagactaac 7260
aagaatgttg accaatgcta tggaggttac aggcctggat ggcaactaca gaatcacatg 7320
ccacacagtg atggaggtgc tgcgagagca caaggacagt gtcatggccg tgctggaagc 7380
ctttgtctat gaccccttgc tgaactggag gctgatggac acaaatacca aaggcaacaa 7440
gcgatcccga acgaggacgg attcctactc tgctggccag tcagtcgaaa ttttggacgg 7500
tgtggaactt ggagagccag cccataagaa aacggggacc acagtgccag aatctattca 7560
ttctttcatt ggagacggtt tggtgaaacc agaggcccta aataagaaag ctatccagat 7620
tattaacagg gttcgagata agctcactgg tcgggacttc tctcatgatg acactttgga 7680
tgttccaacg caagttgagc tgctcatcaa acaagcgaca tcccatgaaa acctctgcca 7740
gtgctatatt ggctggtgcc ctttctggta actggaggcc cagatgtgcc catcacgttt 7800
tttctgaggc ttttgtactt tagtaaatgc ttccactaaa ctgaaaccat ggtgagaaag 7860
tttgactttg ttaaatattt tgaaatgtaa atgaaaagaa ctactgtata ttaaaagttg 7920
gtttgaacca actttctagc tgctgttgaa gaatatattg tcagaaacac aaggcttgat 7980
ttggttccca ggacagtgaa acatagtaat accacgtaaa tcaagccatt cattttgggg 8040
aacagaagat ccataacttt agaaatacgg gttttgactt aactcacaag agaactcatc 8100
ataagtactt gctgatggaa gaatgaccta gttgctcctc tcaacatggg tacagcaaac 8160
tcagcacagc caagaagcct caggtcgtgg agaacatgga ttaggatcct agactgtaaa 8220
gacacagaag atgctgacct cacccctgcc acctatccca agacctcact ggtctgtgga 8280
cagcagcaga aatgtttgca agataggcca aaatgagtac aaaaggtctg tcttccatca 8340
gacccagtga tgctgcgact cacacgcttc aattcaagac ctgaccgcta gtagggaggt 8400
ttattcagat cgctggcagc ctcggctgag cagatgcaca gaggggatca ctgtgcagtg 8460
ggaccaccct cactggcctt ctgcagcagg gttctgggat gttttcagtg gtcaaaatac 8520
tctgtttaga gcaagggctc agaaaacaga aatactgtca tggaggtgct gaacacaggg 8580
aaggtctggt acatattgga aattatgagc agaacaaata ctcaactaaa tgcacaaagt 8640
ataaagtgta gccatgtcta gacaccatgt tgtatcagaa taatttttgt gccaataaat 8700
gacatcagaa ttttaaacat atgtaaaaaa aaa 8733
<210> 22
<211> 706
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HUMAN Protein kinase C theta UniProt No. Q04759
<400> 22
Met Ser Pro Phe Leu Arg Ile Gly Leu Ser Asn Phe Asp Cys Gly Ser
1 5 10 15
Cys Gln Ser Cys Gln Gly Glu Ala Val Asn Pro Tyr Cys Ala Val Leu
20 25 30
Val Lys Glu Tyr Val Glu Ser Glu Asn Gly Gln Met Tyr Ile Gln Lys
35 40 45
Lys Pro Thr Met Tyr Pro Pro Trp Asp Ser Thr Phe Asp Ala His Ile
50 55 60
Asn Lys Gly Arg Val Met Gln Ile Ile Val Lys Gly Lys Asn Val Asp
65 70 75 80
Leu Ile Ser Glu Thr Thr Val Glu Leu Tyr Ser Leu Ala Glu Arg Cys
85 90 95
Arg Lys Asn Asn Gly Lys Thr Glu Ile Trp Leu Glu Leu Lys Pro Gln
100 105 110
Gly Arg Met Leu Met Asn Ala Arg Tyr Phe Leu Glu Met Ser Asp Thr
115 120 125
Lys Asp Met Asn Glu Phe Glu Thr Glu Gly Phe Phe Ala Leu His Gln
130 135 140
Arg Arg Gly Ala Ile Lys Gln Ala Lys Val His His Val Lys Cys His
145 150 155 160
Glu Phe Thr Ala Thr Phe Phe Pro Gln Pro Thr Phe Cys Ser Val Cys
165 170 175
His Glu Phe Val Trp Gly Leu Asn Lys Gln Gly Tyr Gln Cys Arg Gln
180 185 190
Cys Asn Ala Ala Ile His Lys Lys Cys Ile Asp Lys Val Ile Ala Lys
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Ala Ile Asn Ser Arg Glu Thr Met Phe His Lys Glu
210 215 220
Arg Phe Lys Ile Asp Met Pro His Arg Phe Lys Val Tyr Asn Tyr Lys
225 230 235 240
Ser Pro Thr Phe Cys Glu His Cys Gly Thr Leu Leu Trp Gly Leu Ala
245 250 255
Arg Gln Gly Leu Lys Cys Asp Ala Cys Gly Met Asn Val His His Arg
260 265 270
Cys Gln Thr Lys Val Ala Asn Leu Cys Gly Ile Asn Gln Lys Leu Met
275 280 285
Ala Glu Ala Leu Ala Met Ile Glu Ser Thr Gln Gln Ala Arg Cys Leu
290 295 300
Arg Asp Thr Glu Gln Ile Phe Arg Glu Gly Pro Val Glu Ile Gly Leu
305 310 315 320
Pro Cys Ser Ile Lys Asn Glu Ala Arg Pro Pro Cys Leu Pro Thr Pro
325 330 335
Gly Lys Arg Glu Pro Gln Gly Ile Ser Trp Glu Ser Pro Leu Asp Glu
340 345 350
Val Asp Lys Met Cys His Leu Pro Glu Pro Glu Leu Asn Lys Glu Arg
355 360 365
Pro Ser Leu Gln Ile Lys Leu Lys Ile Glu Asp Phe Ile Leu His Lys
370 375 380
Met Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Phe Lys
385 390 395 400
Lys Thr Asn Gln Phe Phe Ala Ile Lys Ala Leu Lys Lys Asp Val Val
405 410 415
Leu Met Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu
420 425 430
Ser Leu Ala Trp Glu His Pro Phe Leu Thr His Met Phe Cys Thr Phe
435 440 445
Gln Thr Lys Glu Asn Leu Phe Phe Val Met Glu Tyr Leu Asn Gly Gly
450 455 460
Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Ser Cys His Lys Phe Asp Leu Ser Arg
465 470 475 480
Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ile Leu Gly Leu Gln Phe Leu His
485 490 495
Ser Lys Gly Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Ile Leu Leu
500 505 510
Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu
515 520 525
Asn Met Leu Gly Asp Ala Lys Thr Asn Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp
530 535 540
Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu Leu Gly Gln Lys Tyr Asn His Ser Val
545 550 555 560
Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ile Gly Gln
565 570 575
Ser Pro Phe His Gly Gln Asp Glu Glu Glu Leu Phe His Ser Ile Arg
580 585 590
Met Asp Asn Pro Phe Tyr Pro Arg Trp Leu Glu Lys Glu Ala Lys Asp
595 600 605
Leu Leu Val Lys Leu Phe Val Arg Glu Pro Glu Lys Arg Leu Gly Val
610 615 620
Arg Gly Asp Ile Arg Gln His Pro Leu Phe Arg Glu Ile Asn Trp Glu
625 630 635 640
Glu Leu Glu Arg Lys Glu Ile Asp Pro Pro Phe Arg Pro Lys Val Lys
645 650 655
Ser Pro Phe Asp Cys Ser Asn Phe Asp Lys Glu Phe Leu Asn Glu Lys
660 665 670
Pro Arg Leu Ser Phe Ala Asp Arg Ala Leu Ile Asn Ser Met Asp Gln
675 680 685
Asn Met Phe Arg Asn Phe Ser Phe Met Asn Pro Gly Met Glu Arg Leu
690 695 700
Ile Ser
705
<210> 23
<211> 3295
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Homo sapiens protein kinase C theta (PRKCQ, mRNA; Acc. No.
NM_006257.4
<400> 23
ccgccagccc cgccagtccc cgcgcagtcc ccgcgcagtc cccgcgcagt cccagcgcca 60
ccgggcagca gcggcgccgt gctcgctcca gggcgcaacc atgtcgccat ttcttcggat 120
tggcttgtcc aactttgact gcgggtcctg ccagtcttgt cagggcgagg ctgttaaccc 180
ttactgtgct gtgctcgtca aagagtatgt cgaatcagag aacgggcaga tgtatatcca 240
gaaaaagcct accatgtacc caccctggga cagcactttt gatgcccata tcaacaaggg 300
aagagtcatg cagatcattg tgaaaggcaa aaacgtggac ctcatctctg aaaccaccgt 360
ggagctctac tcgctggctg agaggtgcag gaagaacaac gggaagacag aaatatggtt 420
agagctgaaa cctcaaggcc gaatgctaat gaatgcaaga tactttctgg aaatgagtga 480
cacaaaggac atgaatgaat ttgagacgga aggcttcttt gctttgcatc agcgccgggg 540
tgccatcaag caggcaaagg tccaccacgt caagtgccac gagttcactg ccaccttctt 600
cccacagccc acattttgct ctgtctgcca cgagtttgtc tggggcctga acaaacaggg 660
ctaccagtgc cgacaatgca atgcagcaat tcacaagaag tgtattgata aagttatagc 720
aaagtgcaca ggatcagcta tcaatagccg agaaaccatg ttccacaagg agagattcaa 780
aattgacatg ccacacagat ttaaagtcta caattacaag agcccgacct tctgtgaaca 840
ctgtgggacc ctgctgtggg gactggcacg gcaaggactc aagtgtgatg catgtggcat 900
gaatgtgcat catagatgcc agacaaaggt ggccaacctt tgtggcataa accagaagct 960
aatggctgaa gcgctggcca tgattgagag cactcaacag gctcgctgct taagagatac 1020
tgaacagatc ttcagagaag gtccggttga aattggtctc ccatgctcca tcaaaaatga 1080
agcaaggccg ccatgtttac cgacaccggg aaaaagagag cctcagggca tttcctggga 1140
gtctccgttg gatgaggtgg ataaaatgtg ccatcttcca gaacctgaac tgaacaaaga 1200
aagaccatct ctgcagatta aactaaaaat tgaggatttt atcttgcaca aaatgttggg 1260
gaaaggaagt tttggcaagg tcttcctggc agaattcaag aaaaccaatc aatttttcgc 1320
aataaaggcc ttaaagaaag atgtggtctt gatggacgat gatgttgagt gcacgatggt 1380
agagaagaga gttctttcct tggcctggga gcatccgttt ctgacgcaca tgttttgtac 1440
attccagacc aaggaaaacc tcttttttgt gatggagtac ctcaacggag gggacttaat 1500
gtaccacatc caaagctgcc acaagttcga cctttccaga gcgacgtttt atgctgctga 1560
aatcattctt ggtctgcagt tccttcattc caaaggaata gtctacaggg acctgaagct 1620
agataacatc ctgttagaca aagatggaca tatcaagatc gcggattttg gaatgtgcaa 1680
ggagaacatg ttaggagatg ccaagacgaa taccttctgt gggacacctg actacatcgc 1740
cccagagatc ttgctgggtc agaaatacaa ccactctgtg gactggtggt ccttcggggt 1800
tctcctttat gaaatgctga ttggtcagtc gcctttccac gggcaggatg aggaggagct 1860
cttccactcc atccgcatgg acaatccctt ttacccacgg tggctggaga aggaagcaaa 1920
ggaccttctg gtgaagctct tcgtgcgaga acctgagaag aggctgggcg tgaggggaga 1980
catccgccag caccctttgt ttcgggagat caactgggag gaacttgaac ggaaggagat 2040
tgacccaccg ttccggccga aagtgaaatc accatttgac tgcagcaatt tcgacaaaga 2100
attcttaaac gagaagcccc ggctgtcatt tgccgacaga gcactgatca acagcatgga 2160
ccagaatatg ttcaggaact tttccttcat gaaccccggg atggagcggc tgatatcctg 2220
aatcttgccc ctccagagac aggaaagaat ttgccttctc cctgggaact ggttcaagag 2280
acactgcttg ggttcctttt tcaacttgga aaaagaaaga aacactcaac aataaagact 2340
gagacccgtt cgcccccatg tgacttttat ctgtagcaga aaccaagtct acttcactaa 2400
tgacgatgcc gtgtgtctcg tctcctgaca tgtctcacag acgctcctga agttaggtca 2460
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ttgatactgc aataaattat ggctcttcac ctgggcgcca actgctgatc aatgaaatgc 2580
ttgttgaatc aggggcaaac ggagtacaga cgtctcaaga ctgaaacggc cccattgcct 2640
ggtctagtag cggatctcac tcagccgcag acaagtaatc actaacccgt tttattctat 2700
tcctatctgt ggatgtgtaa atggctgggg ggccagccct ggataggttt ttatgggaat 2760
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cgcttgttat cttgtcaaga tagaaaagat agtatcattt cacccttgcc agtaaaaacc 2940
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acactataac aagaaaagaa atgaagtgca taagtctcct gggaaaagaa ccttaacccc 3060
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atcaatggcc catgcatgct gtttgcagca gtcaattgag ttgaattaga attccaacca 3180
tacattttaa aggtatttgt gctgtgtgta tattttgata aaatgttgtg acttcatggc 3240
aaacaggtgg atgtgtaaaa atggaataaa aaaaaaaaaa gagtcaaaaa aaaaa 3295
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AHR CRISPR gRNA target sequence
<400> 25
ttgctgctct acagttatcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AHR CRISPR gRNA target sequence
<400> 26
aatttcagcg tcagctacac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AHR CRISPR gRNA target sequence
<400> 28
tccgtttctt tcagtagggg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AHR CRISPR gRNA target sequence
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARNT CRISPR gRNA target sequence
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gtcgccgctt aatagccctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARNT CRISPR gRNA target sequence
<400> 31
tgatcagatg tctaacgata 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARNT CRISPR gRNA target sequence
<400> 32
gacatcagat gtaccatcac 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARNT CRISPR gRNA target sequence
<400> 33
ctcagcctat tcacagaaac 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARNT CRISPR gRNA target sequence
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tgaataggct gagctttgtg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARNT CRISPR gRNA target sequence
<400> 35
gtggaggagc cattgtccag 20
<210> 36
<211> 685
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human Neutral and basic amino acid transport protein rBAT
(SLC3A1) isoform 1 Uniprot Q07837
<400> 36
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Arg Gly Ile Leu Gly Ser Gln Glu Pro Asp Phe Lys Gly Val Gln Pro
50 55 60
Tyr Ala Gly Met Pro Lys Glu Val Leu Phe Gln Phe Ser Gly Gln Ala
65 70 75 80
Arg Tyr Arg Ile Pro Arg Glu Ile Leu Phe Trp Leu Thr Val Ala Ser
85 90 95
Val Leu Val Leu Ile Ala Ala Thr Ile Ala Ile Ile Ala Leu Ser Pro
100 105 110
Lys Cys Leu Asp Trp Trp Gln Glu Gly Pro Met Tyr Gln Ile Tyr Pro
115 120 125
Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Lys Asp Gly Asn Gly Asp Leu Lys Gly
130 135 140
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145 150 155 160
Trp Ile Thr Ser Phe Tyr Lys Ser Ser Leu Lys Asp Phe Arg Tyr Gly
165 170 175
Val Glu Asp Phe Arg Glu Val Asp Pro Ile Phe Gly Thr Met Glu Asp
180 185 190
Phe Glu Asn Leu Val Ala Ala Ile His Asp Lys Gly Leu Lys Leu Ile
195 200 205
Ile Asp Phe Ile Pro Asn His Thr Ser Asp Lys His Ile Trp Phe Gln
210 215 220
Leu Ser Arg Thr Arg Thr Gly Lys Tyr Thr Asp Tyr Tyr Ile Trp His
225 230 235 240
Asp Cys Thr His Glu Asn Gly Lys Thr Ile Pro Pro Asn Asn Trp Leu
245 250 255
Ser Val Tyr Gly Asn Ser Ser Trp His Phe Asp Glu Val Arg Asn Gln
260 265 270
Cys Tyr Phe His Gln Phe Met Lys Glu Gln Pro Asp Leu Asn Phe Arg
275 280 285
Asn Pro Asp Val Gln Glu Glu Ile Lys Glu Ile Leu Arg Phe Trp Leu
290 295 300
Thr Lys Gly Val Asp Gly Phe Ser Leu Asp Ala Val Lys Phe Leu Leu
305 310 315 320
Glu Ala Lys His Leu Arg Asp Glu Ile Gln Val Asn Lys Thr Gln Ile
325 330 335
Pro Asp Thr Val Thr Gln Tyr Ser Glu Leu Tyr His Asp Phe Thr Thr
340 345 350
Thr Gln Val Gly Met His Asp Ile Val Arg Ser Phe Arg Gln Thr Met
355 360 365
Asp Gln Tyr Ser Thr Glu Pro Gly Arg Tyr Arg Phe Met Gly Thr Glu
370 375 380
Ala Tyr Ala Glu Ser Ile Asp Arg Thr Val Met Tyr Tyr Gly Leu Pro
385 390 395 400
Phe Ile Gln Glu Ala Asp Phe Pro Phe Asn Asn Tyr Leu Ser Met Leu
405 410 415
Asp Thr Val Ser Gly Asn Ser Val Tyr Glu Val Ile Thr Ser Trp Met
420 425 430
Glu Asn Met Pro Glu Gly Lys Trp Pro Asn Trp Met Ile Gly Gly Pro
435 440 445
Asp Ser Ser Arg Leu Thr Ser Arg Leu Gly Asn Gln Tyr Val Asn Val
450 455 460
Met Asn Met Leu Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro Ile Thr Tyr Tyr
465 470 475 480
Gly Glu Glu Ile Gly Met Gly Asn Ile Val Ala Ala Asn Leu Asn Glu
485 490 495
Ser Tyr Asp Ile Asn Thr Leu Arg Ser Lys Ser Pro Met Gln Trp Asp
500 505 510
Asn Ser Ser Asn Ala Gly Phe Ser Glu Ala Ser Asn Thr Trp Leu Pro
515 520 525
Thr Asn Ser Asp Tyr His Thr Val Asn Val Asp Val Gln Lys Thr Gln
530 535 540
Pro Arg Ser Ala Leu Lys Leu Tyr Gln Asp Leu Ser Leu Leu His Ala
545 550 555 560
Asn Glu Leu Leu Leu Asn Arg Gly Trp Phe Cys His Leu Arg Asn Asp
565 570 575
Ser His Tyr Val Val Tyr Thr Arg Glu Leu Asp Gly Ile Asp Arg Ile
580 585 590
Phe Ile Val Val Leu Asn Phe Gly Glu Ser Thr Leu Leu Asn Leu His
595 600 605
Asn Met Ile Ser Gly Leu Pro Ala Lys Met Arg Ile Arg Leu Ser Thr
610 615 620
Asn Ser Ala Asp Lys Gly Ser Lys Val Asp Thr Ser Gly Ile Phe Leu
625 630 635 640
Asp Lys Gly Glu Gly Leu Ile Phe Glu His Asn Thr Lys Asn Leu Leu
645 650 655
His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Asp Arg Cys Phe Val Ser Asn Arg Ala
660 665 670
Cys Tyr Ser Ser Val Leu Asn Ile Leu Tyr Thr Ser Cys
675 680 685
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<211> 630
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human 4F2 cell-surface antigen heavy chain (CD98hc; SLC3A2)
isoform 1 Uniprot P08195
<400> 37
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65 70 75 80
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Leu Ala Gly Leu Lys Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val
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610 615 620
Arg Phe Pro Tyr Ala Ala
625 630
<210> 38
<211> 507
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human Large neutral amino acids transporter small subunit 1
(LAT1; SLC7A5) isoform 1 Uniprot Q01650
<400> 38
Met Ala Gly Ala Gly Pro Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Glu Lys Met Leu Ala Ala Lys Ser Ala
20 25 30
Asp Gly Ser Ala Pro Ala Gly Glu Gly Glu Gly Val Thr Leu Gln Arg
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50 55 60
Gly Ser Gly Ile Phe Val Thr Pro Thr Gly Val Leu Lys Glu Ala Gly
65 70 75 80
Ser Pro Gly Leu Ala Leu Val Val Trp Ala Ala Cys Gly Val Phe Ser
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Ile Val Gly Ala Leu Cys Tyr Ala Glu Leu Gly Thr Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Met Leu Glu Val Tyr Gly Ser Leu Pro
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Ala Phe Leu Lys Leu Trp Ile Glu Leu Leu Ile Ile Arg Pro Ser Ser
130 135 140
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Leu Cys Val Leu Leu Leu Thr Ala Val Asn Cys Tyr Ser Val Lys Ala
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Ala Thr Arg Val Gln Asp Ala Phe Ala Ala Ala Lys Leu Leu Ala Leu
195 200 205
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210 215 220
Ser Asn Leu Asp Pro Asn Phe Ser Phe Glu Gly Thr Lys Leu Asp Val
225 230 235 240
Gly Asn Ile Val Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Phe Ala Tyr Gly Gly
245 250 255
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Gly Val Met Ser Trp Ile Ile Pro Val Phe Val Gly Leu Ser Cys Phe
325 330 335
Gly Ser Val Asn Gly Ser Leu Phe Thr Ser Ser Arg Leu Phe Phe Val
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Gly Ser Arg Glu Gly His Leu Pro Ser Ile Leu Ser Met Ile His Pro
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Leu Leu Tyr Ala Phe Ser Lys Asp Ile Phe Ser Val Ile Asn Phe Phe
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Ser Phe Phe Asn Trp Leu Cys Val Ala Leu Ala Ile Ile Gly Met Ile
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420 425 430
Leu Ala Leu Pro Val Phe Phe Ile Leu Ala Cys Leu Phe Leu Ile Ala
435 440 445
Val Ser Phe Trp Lys Thr Pro Val Glu Cys Gly Ile Gly Phe Thr Ile
450 455 460
Ile Leu Ser Gly Leu Pro Val Tyr Phe Phe Gly Val Trp Trp Lys Asn
465 470 475 480
Lys Pro Lys Trp Leu Leu Gln Gly Ile Phe Ser Thr Thr Val Leu Cys
485 490 495
Gln Lys Leu Met Gln Val Val Pro Gln Glu Thr
500 505
<210> 39
<211> 535
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human Large neutral amino acids transporter small subunit 2
(LAT2; SLC7A8) isoform 1
Uniprot Q9UHI5
<400> 39
Met Glu Glu Gly Ala Arg His Arg Asn Asn Thr Glu Lys Lys His Pro
1 5 10 15
Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ala Ser Pro Glu Ala Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Val Ala Leu Lys Lys Glu Ile Gly Leu Val Ser Ala Cys Gly Ile
35 40 45
Ile Val Gly Asn Ile Ile Gly Ser Gly Ile Phe Val Ser Pro Lys Gly
50 55 60
Val Leu Glu Asn Ala Gly Ser Val Gly Leu Ala Leu Ile Val Trp Ile
65 70 75 80
Val Thr Gly Phe Ile Thr Val Val Gly Ala Leu Cys Tyr Ala Glu Leu
85 90 95
Gly Val Thr Ile Pro Lys Ser Gly Gly Asp Tyr Ser Tyr Val Lys Asp
100 105 110
Ile Phe Gly Gly Leu Ala Gly Phe Leu Arg Leu Trp Ile Ala Val Leu
115 120 125
Val Ile Tyr Pro Thr Asn Gln Ala Val Ile Ala Leu Thr Phe Ser Asn
130 135 140
Tyr Val Leu Gln Pro Leu Phe Pro Thr Cys Phe Pro Pro Glu Ser Gly
145 150 155 160
Leu Arg Leu Leu Ala Ala Ile Cys Leu Leu Leu Leu Thr Trp Val Asn
165 170 175
Cys Ser Ser Val Arg Trp Ala Thr Arg Val Gln Asp Ile Phe Thr Ala
180 185 190
Gly Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Ile Ile Met Gly Ile Val Gln
195 200 205
Ile Cys Lys Gly Glu Tyr Phe Trp Leu Glu Pro Lys Asn Ala Phe Glu
210 215 220
Asn Phe Gln Glu Pro Asp Ile Gly Leu Val Ala Leu Ala Phe Leu Gln
225 230 235 240
Gly Ser Phe Ala Tyr Gly Gly Trp Asn Phe Leu Asn Tyr Val Thr Glu
245 250 255
Glu Leu Val Asp Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Arg Ala Ile Phe Ile Ser
260 265 270
Ile Pro Leu Val Thr Phe Val Tyr Val Phe Ala Asn Val Ala Tyr Val
275 280 285
Thr Ala Met Ser Pro Gln Glu Leu Leu Ala Ser Asn Ala Val Ala Val
290 295 300
Thr Phe Gly Glu Lys Leu Leu Gly Val Met Ala Trp Ile Met Pro Ile
305 310 315 320
Ser Val Ala Leu Ser Thr Phe Gly Gly Val Asn Gly Ser Leu Phe Thr
325 330 335
Ser Ser Arg Leu Phe Phe Ala Gly Ala Arg Glu Gly His Leu Pro Ser
340 345 350
Val Leu Ala Met Ile His Val Lys Arg Cys Thr Pro Ile Pro Ala Leu
355 360 365
Leu Phe Thr Cys Ile Ser Thr Leu Leu Met Leu Val Thr Ser Asp Met
370 375 380
Tyr Thr Leu Ile Asn Tyr Val Gly Phe Ile Asn Tyr Leu Phe Tyr Gly
385 390 395 400
Val Thr Val Ala Gly Gln Ile Val Leu Arg Trp Lys Lys Pro Asp Ile
405 410 415
Pro Arg Pro Ile Lys Ile Asn Leu Leu Phe Pro Ile Ile Tyr Leu Leu
420 425 430
Phe Trp Ala Phe Leu Leu Val Phe Ser Leu Trp Ser Glu Pro Val Val
435 440 445
Cys Gly Ile Gly Leu Ala Ile Met Leu Thr Gly Val Pro Val Tyr Phe
450 455 460
Leu Gly Val Tyr Trp Gln His Lys Pro Lys Cys Phe Ser Asp Phe Ile
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Glu Leu Leu Thr Leu Val Ser Gln Lys Met Cys Val Val Val Tyr Pro
485 490 495
Glu Val Glu Arg Gly Ser Gly Thr Glu Glu Ala Asn Glu Asp Met Glu
500 505 510
Glu Gln Gln Gln Pro Met Tyr Gln Pro Thr Pro Thr Lys Asp Lys Asp
515 520 525
Val Ala Gly Gln Pro Gln Pro
530 535
<210> 40
<211> 523
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human Asc-type amino acid transporter 1 (Asc-1; SLC7A10) isoform
1
Uniprot Q9NS82
<400> 40
Met Ala Gly His Thr Gln Gln Pro Ser Gly Arg Gly Asn Pro Arg Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Thr Val Pro Gly Ala Ser Glu
20 25 30
Arg Val Ala Leu Lys Lys Glu Ile Gly Leu Leu Ser Ala Cys Thr Ile
35 40 45
Ile Ile Gly Asn Ile Ile Gly Ser Gly Ile Phe Ile Ser Pro Lys Gly
50 55 60
Val Leu Glu His Ser Gly Ser Val Gly Leu Ala Leu Phe Val Trp Val
65 70 75 80
Leu Gly Gly Gly Val Thr Ala Leu Gly Ser Leu Cys Tyr Ala Glu Leu
85 90 95
Gly Val Ala Ile Pro Lys Ser Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Val Thr Glu
100 105 110
Ile Phe Gly Gly Leu Ala Gly Phe Leu Leu Leu Trp Ser Ala Val Leu
115 120 125
Ile Met Tyr Pro Thr Ser Leu Ala Val Ile Ser Met Thr Phe Ser Asn
130 135 140
Tyr Val Leu Gln Pro Val Phe Pro Asn Cys Ile Pro Pro Thr Thr Ala
145 150 155 160
Ser Arg Val Leu Ser Met Ala Cys Leu Met Leu Leu Thr Trp Val Asn
165 170 175
Ser Ser Ser Val Arg Trp Ala Thr Arg Ile Gln Asp Met Phe Thr Gly
180 185 190
Gly Lys Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ile Ile Gly Val Gly Leu Leu Gln
195 200 205
Ile Phe Gln Gly His Phe Glu Glu Leu Arg Pro Ser Asn Ala Phe Ala
210 215 220
Phe Trp Met Thr Pro Ser Val Gly His Leu Ala Leu Ala Phe Leu Gln
225 230 235 240
Gly Ser Phe Ala Phe Ser Gly Trp Asn Phe Leu Asn Tyr Val Thr Glu
245 250 255
Glu Met Val Asp Ala Arg Lys Asn Leu Pro Arg Ala Ile Phe Ile Ser
260 265 270
Ile Pro Leu Val Thr Phe Val Tyr Thr Phe Thr Asn Ile Ala Tyr Phe
275 280 285
Thr Ala Met Ser Pro Gln Glu Leu Leu Ser Ser Asn Ala Val Ala Val
290 295 300
Thr Phe Gly Glu Lys Leu Leu Gly Tyr Phe Ser Trp Val Met Pro Val
305 310 315 320
Ser Val Ala Leu Ser Thr Phe Gly Gly Ile Asn Gly Tyr Leu Phe Thr
325 330 335
Tyr Ser Arg Leu Cys Phe Ser Gly Ala Arg Glu Gly His Leu Pro Ser
340 345 350
Leu Leu Ala Met Ile His Val Arg His Cys Thr Pro Ile Pro Ala Leu
355 360 365
Leu Val Cys Cys Gly Ala Thr Ala Val Ile Met Leu Val Gly Asp Thr
370 375 380
Tyr Thr Leu Ile Asn Tyr Val Ser Phe Ile Asn Tyr Leu Cys Tyr Gly
385 390 395 400
Val Thr Ile Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Arg Arg Pro Ala Leu
405 410 415
His Arg Pro Ile Lys Val Asn Leu Leu Ile Pro Val Ala Tyr Leu Val
420 425 430
Phe Trp Ala Phe Leu Leu Val Phe Ser Phe Ile Ser Glu Pro Met Val
435 440 445
Cys Gly Val Gly Val Ile Ile Ile Leu Thr Gly Val Pro Ile Phe Phe
450 455 460
Leu Gly Val Phe Trp Arg Ser Lys Pro Lys Cys Val His Arg Leu Thr
465 470 475 480
Glu Ser Met Thr His Trp Gly Gln Glu Leu Cys Phe Val Val Tyr Pro
485 490 495
Gln Asp Ala Pro Glu Glu Glu Glu Asn Gly Pro Cys Pro Pro Ser Leu
500 505 510
Leu Pro Ala Thr Asp Lys Pro Ser Lys Pro Gln
515 520
<210> 41
<211> 642
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human Sodium- and chloride-dependent neutral and basic amino acid
transporter B(0+)(ATB0,+; SLC6A14) isoform 1 Uniprot Q9UN76
<400> 41
Met Asp Lys Leu Lys Cys Pro Ser Phe Phe Lys Cys Arg Glu Lys Glu
1 5 10 15
Lys Val Ser Ala Ser Ser Glu Asn Phe His Val Gly Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Asn Gln Asp Arg Gly Asn Trp Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Leu Leu Ser
35 40 45
Met Ile Gly Tyr Ala Val Gly Leu Gly Asn Val Trp Arg Phe Pro Tyr
50 55 60
Leu Thr Tyr Ser Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu Ile Pro Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Met Leu Ala Leu Ala Gly Leu Pro Leu Phe Phe Leu Glu Cys Ser Leu
85 90 95
Gly Gln Phe Ala Ser Leu Gly Pro Val Ser Val Trp Arg Ile Leu Pro
100 105 110
Leu Phe Gln Gly Val Gly Ile Thr Met Val Leu Ile Ser Ile Phe Val
115 120 125
Thr Ile Tyr Tyr Asn Val Ile Ile Ala Tyr Ser Leu Tyr Tyr Met Phe
130 135 140
Ala Ser Phe Gln Ser Glu Leu Pro Trp Lys Asn Cys Ser Ser Trp Ser
145 150 155 160
Asp Lys Asn Cys Ser Arg Ser Pro Ile Val Thr His Cys Asn Val Ser
165 170 175
Thr Val Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ile Ile Gln Met Asn Lys Ser Trp
180 185 190
Val Asp Ile Asn Asn Phe Thr Cys Ile Asn Gly Ser Glu Ile Tyr Gln
195 200 205
Pro Gly Gln Leu Pro Ser Glu Gln Tyr Trp Asn Lys Val Ala Leu Gln
210 215 220
Arg Ser Ser Gly Met Asn Glu Thr Gly Val Ile Val Trp Tyr Leu Ala
225 230 235 240
Leu Cys Leu Leu Leu Ala Trp Leu Ile Val Gly Ala Ala Leu Phe Lys
245 250 255
Gly Ile Lys Ser Ser Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Leu Phe Pro
260 265 270
Tyr Val Val Leu Leu Ile Leu Leu Val Arg Gly Ala Thr Leu Glu Gly
275 280 285
Ala Ser Lys Gly Ile Ser Tyr Tyr Ile Gly Ala Gln Ser Asn Phe Thr
290 295 300
Lys Leu Lys Glu Ala Glu Val Trp Lys Asp Ala Ala Thr Gln Ile Phe
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Ser Val Ala Trp Gly Gly Leu Val Ala Leu Ser Ser Tyr
325 330 335
Asn Lys Phe Lys Asn Asn Cys Phe Ser Asp Ala Ile Val Val Cys Leu
340 345 350
Thr Asn Cys Leu Thr Ser Val Phe Ala Gly Phe Ala Ile Phe Ser Ile
355 360 365
Leu Gly His Met Ala His Ile Ser Gly Lys Glu Val Ser Gln Val Val
370 375 380
Lys Ser Gly Phe Asp Leu Ala Phe Ile Ala Tyr Pro Glu Ala Leu Ala
385 390 395 400
Gln Leu Pro Gly Gly Pro Phe Trp Ser Ile Leu Phe Phe Phe Met Leu
405 410 415
Leu Thr Leu Gly Leu Asp Ser Gln Phe Ala Ser Ile Glu Thr Ile Thr
420 425 430
Thr Thr Ile Gln Asp Leu Phe Pro Lys Val Met Lys Lys Met Arg Val
435 440 445
Pro Ile Thr Leu Gly Cys Cys Leu Val Leu Phe Leu Leu Gly Leu Val
450 455 460
Cys Val Thr Gln Ala Gly Ile Tyr Trp Val His Leu Ile Asp His Phe
465 470 475 480
Cys Ala Gly Trp Gly Ile Leu Ile Ala Ala Ile Leu Glu Leu Val Gly
485 490 495
Ile Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Asn Arg Phe Ile Glu Asp Thr Glu Met
500 505 510
Met Ile Gly Ala Lys Arg Trp Ile Phe Trp Leu Trp Trp Arg Ala Cys
515 520 525
Trp Phe Val Ile Thr Pro Ile Leu Leu Ile Ala Ile Phe Ile Trp Ser
530 535 540
Leu Val Gln Phe His Arg Pro Asn Tyr Gly Ala Ile Pro Tyr Pro Asp
545 550 555 560
Trp Gly Val Ala Leu Gly Trp Cys Met Ile Val Phe Cys Ile Ile Trp
565 570 575
Ile Pro Ile Met Ala Ile Ile Lys Ile Ile Gln Ala Lys Gly Asn Ile
580 585 590
Phe Gln Arg Leu Ile Ser Cys Cys Arg Pro Ala Ser Asn Trp Gly Pro
595 600 605
Tyr Leu Glu Gln His Arg Gly Glu Arg Tyr Lys Asp Met Val Asp Pro
610 615 620
Lys Lys Glu Ala Asp His Glu Ile Pro Thr Val Ser Gly Ser Arg Lys
625 630 635 640
Pro Glu
<210> 42
<211> 634
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human Sodium-dependent neutral amino acid transporter B(0)AT1
(B(0)AT1; SLC6A19) isoform 1 Uniprot Q695T7
<400> 42
Met Val Arg Leu Val Leu Pro Asn Pro Gly Leu Asp Ala Arg Ile Pro
1 5 10 15
Ser Leu Ala Glu Leu Glu Thr Ile Glu Gln Glu Glu Ala Ser Ser Arg
20 25 30
Pro Lys Trp Asp Asn Lys Ala Gln Tyr Met Leu Thr Cys Leu Gly Phe
35 40 45
Cys Val Gly Leu Gly Asn Val Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Gln Ser
50 55 60
His Gly Gly Gly Ala Phe Met Ile Pro Phe Leu Ile Leu Leu Val Leu
65 70 75 80
Glu Gly Ile Pro Leu Leu Tyr Leu Glu Phe Ala Ile Gly Gln Arg Leu
85 90 95
Arg Arg Gly Ser Leu Gly Val Trp Ser Ser Ile His Pro Ala Leu Lys
100 105 110
Gly Leu Gly Leu Ala Ser Met Leu Thr Ser Phe Met Val Gly Leu Tyr
115 120 125
Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Trp Ile Met Trp Tyr Leu Phe Asn Ser Phe
130 135 140
Gln Glu Pro Leu Pro Trp Ser Asp Cys Pro Leu Asn Glu Asn Gln Thr
145 150 155 160
Gly Tyr Val Asp Glu Cys Ala Arg Ser Ser Pro Val Asp Tyr Phe Trp
165 170 175
Tyr Arg Glu Thr Leu Asn Ile Ser Thr Ser Ile Ser Asp Ser Gly Ser
180 185 190
Ile Gln Trp Trp Met Leu Leu Cys Leu Ala Cys Ala Trp Ser Val Leu
195 200 205
Tyr Met Cys Thr Ile Arg Gly Ile Glu Thr Thr Gly Lys Ala Val Tyr
210 215 220
Ile Thr Ser Thr Leu Pro Tyr Val Val Leu Thr Ile Phe Leu Ile Arg
225 230 235 240
Gly Leu Thr Leu Lys Gly Ala Thr Asn Gly Ile Val Phe Leu Phe Thr
245 250 255
Pro Asn Val Thr Glu Leu Ala Gln Pro Asp Thr Trp Leu Asp Ala Gly
260 265 270
Ala Gln Val Phe Phe Ser Phe Ser Leu Ala Phe Gly Gly Leu Ile Ser
275 280 285
Phe Ser Ser Tyr Asn Ser Val His Asn Asn Cys Glu Lys Asp Ser Val
290 295 300
Ile Val Ser Ile Ile Asn Gly Phe Thr Ser Val Tyr Val Ala Ile Val
305 310 315 320
Val Tyr Ser Val Ile Gly Phe Arg Ala Thr Gln Arg Tyr Asp Asp Cys
325 330 335
Phe Ser Thr Asn Ile Leu Thr Leu Ile Asn Gly Phe Asp Leu Pro Glu
340 345 350
Gly Asn Val Thr Gln Glu Asn Phe Val Asp Met Gln Gln Arg Cys Asn
355 360 365
Ala Ser Asp Pro Ala Ala Tyr Ala Gln Leu Val Phe Gln Thr Cys Asp
370 375 380
Ile Asn Ala Phe Leu Ser Glu Ala Val Glu Gly Thr Gly Leu Ala Phe
385 390 395 400
Ile Val Phe Thr Glu Ala Ile Thr Lys Met Pro Leu Ser Pro Leu Trp
405 410 415
Ser Val Leu Phe Phe Ile Met Leu Phe Cys Leu Gly Leu Ser Ser Met
420 425 430
Phe Gly Asn Met Glu Gly Val Val Val Pro Leu Gln Asp Leu Arg Val
435 440 445
Ile Pro Pro Lys Trp Pro Lys Glu Val Leu Thr Gly Leu Ile Cys Leu
450 455 460
Gly Thr Phe Leu Ile Gly Phe Ile Phe Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr
465 470 475 480
Trp Leu Ser Leu Leu Asp Ser Tyr Ala Gly Ser Ile Pro Leu Leu Ile
485 490 495
Ile Ala Phe Cys Glu Met Phe Ser Val Val Tyr Val Tyr Gly Val Asp
500 505 510
Arg Phe Asn Lys Asp Ile Glu Phe Met Ile Gly His Lys Pro Asn Ile
515 520 525
Phe Trp Gln Val Thr Trp Arg Val Val Ser Pro Leu Leu Met Leu Ile
530 535 540
Ile Phe Leu Phe Phe Phe Val Val Glu Val Ser Gln Glu Leu Thr Tyr
545 550 555 560
Ser Ile Trp Asp Pro Gly Tyr Glu Glu Phe Pro Lys Ser Gln Lys Ile
565 570 575
Ser Tyr Pro Asn Trp Val Tyr Val Val Val Val Ile Val Ala Gly Val
580 585 590
Pro Ser Leu Thr Ile Pro Gly Tyr Ala Ile Tyr Lys Leu Ile Arg Asn
595 600 605
His Cys Gln Lys Pro Gly Asp His Gln Gly Leu Val Ser Thr Leu Ser
610 615 620
Thr Ala Ser Met Asn Gly Asp Leu Lys Tyr
625 630
<210> 43
<211> 515
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human Monocarboxylate transporter 10 (TAT1; SLC16A10) isoform 1
Uniprot Q8TF71
<400> 43
Met Val Leu Ser Gln Glu Glu Pro Asp Ser Ala Arg Gly Thr Ser Glu
1 5 10 15
Ala Gln Pro Leu Gly Pro Ala Pro Thr Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gly
20 25 30
Pro Gly Pro Ser Asp Ser Pro Glu Ala Ala Val Glu Lys Val Glu Val
35 40 45
Glu Leu Ala Gly Pro Ala Thr Ala Glu Pro His Glu Pro Pro Glu Pro
50 55 60
Pro Glu Gly Gly Trp Gly Trp Leu Val Met Leu Ala Ala Met Trp Cys
65 70 75 80
Asn Gly Ser Val Phe Gly Ile Gln Asn Ala Cys Gly Val Leu Phe Val
85 90 95
Ser Met Leu Glu Thr Phe Gly Ser Lys Asp Asp Asp Lys Met Val Phe
100 105 110
Lys Thr Ala Trp Val Gly Ser Leu Ser Met Gly Met Ile Phe Phe Cys
115 120 125
Cys Pro Ile Val Ser Val Phe Thr Asp Leu Phe Gly Cys Arg Lys Thr
130 135 140
Ala Val Val Gly Ala Ala Val Gly Phe Val Gly Leu Met Ser Ser Ser
145 150 155 160
Phe Val Ser Ser Ile Glu Pro Leu Tyr Leu Thr Tyr Gly Ile Ile Phe
165 170 175
Ala Cys Gly Cys Ser Phe Ala Tyr Gln Pro Ser Leu Val Ile Leu Gly
180 185 190
His Tyr Phe Lys Lys Arg Leu Gly Leu Val Asn Gly Ile Val Thr Ala
195 200 205
Gly Ser Ser Val Phe Thr Ile Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Val Leu
210 215 220
Ile Asp Ser Val Gly Leu Phe Tyr Thr Leu Arg Val Leu Cys Ile Phe
225 230 235 240
Met Phe Val Leu Phe Leu Ala Gly Phe Thr Tyr Arg Pro Leu Ala Thr
245 250 255
Ser Thr Lys Asp Lys Glu Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Leu Phe Ser
260 265 270
Arg Lys Lys Phe Ser Pro Pro Lys Lys Ile Phe Asn Phe Ala Ile Phe
275 280 285
Lys Val Thr Ala Tyr Ala Val Trp Ala Val Gly Ile Pro Leu Ala Leu
290 295 300
Phe Gly Tyr Phe Val Pro Tyr Val His Leu Met Lys His Val Asn Glu
305 310 315 320
Arg Phe Gln Asp Glu Lys Asn Lys Glu Val Val Leu Met Cys Ile Gly
325 330 335
Val Thr Ser Gly Val Gly Arg Leu Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Tyr
340 345 350
Val Pro Gly Val Lys Lys Val Tyr Leu Gln Val Leu Ser Phe Phe Phe
355 360 365
Ile Gly Leu Met Ser Met Met Ile Pro Leu Cys Ser Ile Phe Gly Ala
370 375 380
Leu Ile Ala Val Cys Leu Ile Met Gly Leu Phe Asp Gly Cys Phe Ile
385 390 395 400
Ser Ile Met Ala Pro Ile Ala Phe Glu Leu Val Gly Ala Gln Asp Val
405 410 415
Ser Gln Ala Ile Gly Phe Leu Leu Gly Phe Met Ser Ile Pro Met Thr
420 425 430
Val Gly Pro Pro Ile Ala Gly Leu Leu Arg Asp Lys Leu Gly Ser Tyr
435 440 445
Asp Val Ala Phe Tyr Leu Ala Gly Val Pro Pro Leu Ile Gly Gly Ala
450 455 460
Val Leu Cys Phe Ile Pro Trp Ile His Ser Lys Lys Gln Arg Glu Ile
465 470 475 480
Ser Lys Thr Thr Gly Lys Glu Lys Met Glu Lys Met Leu Glu Asn Gln
485 490 495
Asn Ser Leu Leu Ser Ser Ser Ser Gly Met Phe Lys Lys Glu Ser Asp
500 505 510
Ser Ile Ile
515
<210> 44
<211> 504
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> human Proton-coupled amino acid transporter 4 (PAT4; SLC36A4)
isoform 1 Uniprot Q6YBV0
<400> 44
Met Glu Ala Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ala Arg Arg Glu
1 5 10 15
Glu Leu Asp Met Asp Val Met Arg Pro Leu Ile Asn Glu Gln Asn Phe
20 25 30
Asp Gly Thr Ser Asp Glu Glu His Glu Gln Glu Leu Leu Pro Val Gln
35 40 45
Lys His Tyr Gln Leu Asp Asp Gln Glu Gly Ile Ser Phe Val Gln Thr
50 55 60
Leu Met His Leu Leu Lys Gly Asn Ile Gly Thr Gly Leu Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Ala Ile Lys Asn Ala Gly Ile Val Leu Gly Pro Ile Ser Leu
85 90 95
Val Phe Ile Gly Ile Ile Ser Val His Cys Met His Ile Leu Val Arg
100 105 110
Cys Ser His Phe Leu Cys Leu Arg Phe Lys Lys Ser Thr Leu Gly Tyr
115 120 125
Ser Asp Thr Val Ser Phe Ala Met Glu Val Ser Pro Trp Ser Cys Leu
130 135 140
Gln Lys Gln Ala Ala Trp Gly Arg Ser Val Val Asp Phe Phe Leu Val
145 150 155 160
Ile Thr Gln Leu Gly Phe Cys Ser Val Tyr Ile Val Phe Leu Ala Glu
165 170 175
Asn Val Lys Gln Val His Glu Gly Phe Leu Glu Ser Lys Val Phe Ile
180 185 190
Ser Asn Ser Thr Asn Ser Ser Asn Pro Cys Glu Arg Arg Ser Val Asp
195 200 205
Leu Arg Ile Tyr Met Leu Cys Phe Leu Pro Phe Ile Ile Leu Leu Val
210 215 220
Phe Ile Arg Glu Leu Lys Asn Leu Phe Val Leu Ser Phe Leu Ala Asn
225 230 235 240
Val Ser Met Ala Val Ser Leu Val Ile Ile Tyr Gln Tyr Val Val Arg
245 250 255
Asn Met Pro Asp Pro His Asn Leu Pro Ile Val Ala Gly Trp Lys Lys
260 265 270
Tyr Pro Leu Phe Phe Gly Thr Ala Val Phe Ala Phe Glu Gly Ile Gly
275 280 285
Val Val Leu Pro Leu Glu Asn Gln Met Lys Glu Ser Lys Arg Phe Pro
290 295 300
Gln Ala Leu Asn Ile Gly Met Gly Ile Val Thr Thr Leu Tyr Val Thr
305 310 315 320
Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Met Cys Phe His Asp Glu Ile Lys Gly Ser
325 330 335
Ile Thr Leu Asn Leu Pro Gln Asp Val Trp Leu Tyr Gln Ser Val Lys
340 345 350
Ile Leu Tyr Ser Phe Gly Ile Phe Val Thr Tyr Ser Ile Gln Phe Tyr
355 360 365
Val Pro Ala Glu Ile Ile Ile Pro Gly Ile Thr Ser Lys Phe His Thr
370 375 380
Lys Trp Lys Gln Ile Cys Glu Phe Gly Ile Arg Ser Phe Leu Val Ser
385 390 395 400
Ile Thr Cys Ala Gly Ala Ile Leu Ile Pro Arg Leu Asp Ile Val Ile
405 410 415
Ser Phe Val Gly Ala Val Ser Ser Ser Thr Leu Ala Leu Ile Leu Pro
420 425 430
Pro Leu Val Glu Ile Leu Thr Phe Ser Lys Glu His Tyr Asn Ile Trp
435 440 445
Met Val Leu Lys Asn Ile Ser Ile Ala Phe Thr Gly Val Val Gly Phe
450 455 460
Leu Leu Gly Thr Tyr Ile Thr Val Glu Glu Ile Ile Tyr Pro Thr Pro
465 470 475 480
Lys Val Val Ala Gly Thr Pro Gln Ser Pro Phe Leu Asn Leu Asn Ser
485 490 495
Thr Cys Leu Thr Ser Gly Leu Lys
500
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A sequence
<400> 45
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 46
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A sequence
<400> 46
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A sequence
<400> 47
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A sequence
<400> 48
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro Ser Glu
20
<210> 49
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A sequence
<400> 49
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GCN2 CRISPR gRNA target sequence
<400> 50
cgctgagaaa tgactgcacg 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GCN2 CRISPR gRNA target sequence
<400> 51
catatacttc ttcaccagtt 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GCN2 CRISPR gRNA target sequence
<400> 52
atgtactcac acatctggat 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GCN2 CRISPR gRNA target sequence
<400> 53
ttaggtgatg atctttgaac 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GCN2 CRISPR gRNA target sequence
<400> 54
tacctcccca cagtgtttct 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GCN2 CRISPR gRNA target sequence
<400> 55
aaaatctcgc ctagaagaac 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHOP CRISPR gRNA target sequence
<400> 56
ccgagctctg attgaccgaa 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHOP CRISPR gRNA target sequence
<400> 57
aggaaatcga gcgcctgacc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHOP CRISPR gRNA target sequence
<400> 58
ccagctggac agtgtcccga 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHOP CRISPR gRNA target sequence
<400> 59
ctcttgcagg tcctcatacc 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHOP CRISPR gRNA target sequence
<400> 60
gcgagtcgcc tctacttccc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHOP CRISPR gRNA target sequence
<400> 61
ggctggaaag cagcgcatga 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATF4 CRISPR gRNA target sequence
<400> 62
aggatcgtaa ggtttgggac 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATF4 CRISPR gRNA target sequence
<400> 63
taataagcag cccccccaga 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATF4 CRISPR gRNA target sequence
<400> 64
ccactcaccc ttgctgttgt 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATF4 CRISPR gRNA target sequence
<400> 65
tctcttagat gattacctgg 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATF4 CRISPR gRNA target sequence
<400> 66
gcaacgtaag cagtgtagtc 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATF4 CRISPR gRNA target sequence
<400> 67
tttgcagagg atgccttctc 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eIF2alpha CRISPR gRNA target sequence
<400> 68
caggctgtca aaattcgagc 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eIF2alpha CRISPR gRNA target sequence
<400> 69
cattcttcgt catgttgctg 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eIF2alpha CRISPR gRNA target sequence
<400> 70
gtacttgtca tcaaagaccc 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eIF2alpha CRISPR gRNA target sequence
<400> 71
gtaaaagaag ccctaagagc 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eIF2alpha CRISPR gRNA target sequence
<400> 72
gaccagagac ccatctattt 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eIF2alpha CRISPR gRNA target sequence
<400> 73
tacagaaaac atgcccatta 20
Claims (315)
- 치료방법으로서,
(a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및
(b) 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 전 1일 이전의 시점에서 시작하는 것인, 방법.
- 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계를 포함하는 치료방법으로서, 상기 대상은 T 세포 치료의 개시 전 1일 이전의 시점에서 시작되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량이 투여된 대상인, 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 전 2일, 3일, 6일, 12일, 15일, 30일, 60일 또는 90일 내에 또는 그 이전 시점 내에, 또는 약 2일, 약 3일, 약 6일, 약 12일, 약 15일, 약 30일, 약 60일 또는 약 90일 내에 또는 그 이전 시점 내에 개시하는 것인, 방법.
- 청구항 1-3 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료의 투여의 개시와 함께 또는 T 세포 치료의 투여의 개시 이후, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 연속적인 투여를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료의 투여의 개시 이후 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
- 치료방법으로서,
(a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및
(b) T 세포 치료의 투여의 개시 이후 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상은 이전에 T 세포 치료의 투여를 받는 대상인 치료방법.
- 청구항 1-7 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 수행될 수 있는 것인, 방법.
- 치료방법으로서,
(a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및
(b) 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 수행될 수 있는 것인, 방법.
- T 세포 치료를 투여받은 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 선투여로 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 수행될 수 있는 것인, 방법.
- 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 증상이 암인, 방법.
- 청구항 9 또는 청구항 11에 있어서, (b) 단계에서 수행되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여의 개시 전, 이와 동시에 및/또는 이의 개시 후에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 9, 11 또는 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 수행되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 전 2일, 3일, 6일, 12일, 15일, 30일, 60일 또는 90일 내에 또는 이 이전 시점 내에, 또는 약 2일, 약 3일, 약 6일, 약 12일, 약 15일, 약 30일, 약 60일 또는 약 90일 내에 또는 이 이전 시점 내에 시작하는 것인, 방법.
- 청구항 9-12 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 수행되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 개시 후에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 5-12, 14 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 하기 시기에 투여되는 것인, 방법:
T 세포 치료의 투여 개시 전 또는 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플 내의 트립토판의 수준의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여 대상의 혈액에서 검출할 수 있는 T 세포 치료의 세포 수의 감소되기 전의 시기;
T 세포가 장시간의 트립토판 고갈, 소진, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 징후를 나타내기 전의 시기;
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출될 수 있기 전의 시기; 및/또는
T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하거나 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점(투여 개시 후 시점 전)과 비교하여 대상의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFNγ)의 수준이 증가하는 시기.
- 청구항 15에 있어서, 상기 증가 또는 감소는 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
- 청구항 5-12 및 14-16 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일 내에 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일 내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 5-12 및 14-17 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 15 또는 16에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청 또는 혈장 또는 종양 샘플 또는 종양인, 방법.
- 청구항 1-19 항 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시키는 것인, 방법.
- 청구항 1-20 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 차단하거나 감소시키거나, 키누레닌 대 트립토판의 비를 감소시키는 것인, 방법.
- 청구항 21에 있어서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산(3-HAA)에서 선택된 것인, 방법.
- 청구항 1-22 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물 (antibody mimetic), 앱타머, 또는 핵산 분자인, 방법.
- 청구항 1-23 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제인, 방법.
- 청구항 1-23 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)의 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소의 억제제인, 방법.
- 청구항 1-23 및 25 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 방법.
- 청구항 1-23 및 25 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제인, 방법.
- 청구항 6-23, 25 및 27 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 IDO1의 억제제이고, IDO1의 억제제는 T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하여 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 샘플내의 IDO1의 발현 또는 활성이 증가되는 시기에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-23 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인, 방법.
- 청구항 1-29 중 어느 한 항에 있어서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1에 대해 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않고/않거나;
암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 TDO에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 TDO 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않는 것인, 방법.
- 청구항 30에 있어서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않는 것인, 방법.
- 치료방법으로서,
(a) 질환 또는 증상를 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계로서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1) 또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 암 또는 TDO 양성 암의의 발현에 대해 선택되지 않고;
(b) IDO1 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 32에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여의 개시 전, 개시와 동시 및/또는 개시 후에 투여되는 것인, 방법.
- IDO1 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을, 먼저 T 세포 치료를 투여 받은, 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1) 또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 암 또는 TDO 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않는 것인, 방법.
- IDO1 억제제인 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 먼저 투여 받은, 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1) 또는 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)에 음성인 암을 포함하고/포함하거나, 대상은 T 세포 치료의 투여 시작 전에 IDO1 양성 암 또는 TDO 양성 암의 발현에 대해 선택되지 않는 것인, 방법.
- 청구항 32-35 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 증상이 암인, 방법.
- 청구항 32-35 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치이며, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 수행될 수 있는 것인, 방법.
- 청구항 32-35 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료 투여의 개시 후에 투여되는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 32-34 및 36-38 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 하기 시기에 투여되는 것인, 방법:
T 세포 치료의 투여 개시 전 또는 T세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플내의 트립토판의 수치의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여 대상의 혈액에서 검출할 수 있는 T 세포 치료의 세포 수의 감소되기 전의 시기;
T 세포가 장시간의 트립토판 고갈, 소진, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 징후를 나타내기 전의 시기;
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출될 수 있기 전의 시기; 및/또는
T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하거나 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여 대상의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFNγ)의 수준이 증가하는 시기.
- 청구항 39에 있어서, 증가 또는 감소는 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
- 청구항 32-34 및 36-40 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 시작 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 32-34 및 36-41 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 시작후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 32, 33 및 35-37 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전, 0 내지 96시간, 0 내지 72 시간, 0 내지 48 시간, 0 내지 24 시간, 0 내지 12 시간 또는 0 내지 6 시간 또는 0 내지 2 시간 또는, 약 0 내지 96시간, 약 0 내지 72 시간, 약 0 내지 48 시간, 약 0 내지 24 시간, 약 0 내지 12 시간 또는 약 0 내지 6 시간 또는 약 0 내지 2 시간에 투여되거나; 또는
(b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전, 96 시간, 72 시간, 48 시간, 24 시간, 12 시간, 6 시간, 2 시간 또는 1 시간 이내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-23 및 25-43 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, epacadostat), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물(프로드러그) 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 방법.
- 청구항 44에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)인, 방법.
- 청구항 44에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인, 방법.
- 청구항 32-43 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인, 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 치료방법:
(a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 단계; 및
(b) 상기 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 단계로서, 상기 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)이거나, 이를 포함하는 것인 단계.
- 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 상기 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)이거나 이를 포함하며, 대상은 T 세포 치료를 투여받았던 대상인, 방법.
- 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 T 세포 치료를 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 대상은 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여받았던 대상이며, 여기서 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)이거나 이를 포함하는, 방법.
- 청구항 48-50 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 증상이 암인, 방법.
- 청구항 1-51 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료를 대상에게 투여할 때, T 세포 치료의 개시 전의 대상에게서의 IFN-감마(IFNγ)의 수준과 비교하여, 종양의 주위 환경에서 대상 내의 또는 대상의 혈청 또는 혈장 샘플 내의 IFN-감마의 수준을 증가 또는 상승시키는 것인, 방법.
- 청구항 1-52 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료는 종양 침투성 림프구성(TIL) 치료 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 T 세포 치료이거나 이를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 53에 있어서, T 세포 치료는 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 세포이거나 이를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 54에 있어서, 유전적으로 조작된 세포는 IDO-매개된 면역 억제 신호 전달(시그널링)과 연관된 분자, 트립토판 고갈 또는 불충분의 감지 또는 반응과 연관된 분자 또는 세포 내에서 키누레닌-매개된 면역억제를 감지 또는 반응하는 분자의 발현의 변경을 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
- 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 유전적으로 조작된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) IDO-매개된 면역 억제 신호전달과 연관된 분자, 트립토판 고갈 또는 불충분의 감지 또는 반응과 연관된 분자 또는 세포 내에서 키누레닌-매개된 면역 억제를 감지 또는 반응하는 분자의 발현의 변형을 포함하는 것인, 방법.
- 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 유전적으로 조작된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료방법으로서, 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) 재조합, 조작된 및/또는 이소적으로(ectopically) 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬, 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 단백질 또는 변이체를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 57에 있어서, (b) 대상에게 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 치료방법:
(a) 질환 또는 증상을 갖는 대상에게 유전전으로 조작된 T 세포를 투여하는 단계로서, 상기 유전적으로 조작된 T 세포는 (i) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 및 (ii) IDO-매개된 면역 억제 신호전달과 연관된 분자, 트립토판 고갈 또는 불충분의 감지 또는 반응과 연관된 분자 또는 세포 내에서 키누레닌-매개된 면역 억제를 감지 또는 반응하는 분자의 발현의 변형을 포함하는 것인 단계; 및
(b) 상기 대상에 치료적 유효량의 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 단계.
- 청구항 56-59 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 증상은 암인, 방법.
- 청구항 56-60 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 L-타입 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), CD98 중쇄 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) 및/또는 양성자-보조 (proton-assisted) 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)의 발현에 대해 양성인 종양을 갖는 대상, 또는 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 대해 양성인 종양 미세환경에서 세포를 갖는 대상으로부터 선택된 것인, 방법.
- 청구항 56-60 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시키는 것인, 방법.
- 청구항 59-62 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판의 이화작용을 차단하거나 감소시키거나, 또는 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 차단하거나 감소시키는 것인, 방법.
- 청구항 63에 있어서, 트립토판 대사 산물은, 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산(3-HAA)에서 선택된 것인, 방법.
- 청구항 59-64 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 유사체, 앱타머, 또는 핵산 분자인, 방법.
- 청구항 59-65 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 카누레니나아제(kynureninase)의 길항제인, 방법.
- 청구항 59-66 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)의 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소의 억제제인, 방법.
- 청구항 59-65 및 67 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 방법.
- 청구항 59-65 및 67 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제인 방법.
- 청구항 59-65 및 50-52 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 방법.
- 청구항 70에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)인, 방법.
- 청구항 70에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인, 방법.
- 청구항 59-65 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인, 방법.
- 청구항 48-73 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물의 투여의 개시 전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 조합하여 수행될 수 있는 것인, 방법.
- 청구항 48-55 및 57-74 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여의 개시 전, 개시와 동시 및/또는 개시 후에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 48-55 및 57-75 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 투여되는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여의 개시 후에 투여되는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 48-55 및 57-76 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 하기 시기에 투여되는 것인, 방법:
T 세포 치료의 투여 개시 전 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플 내의 트립토판의 수치의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여 대상의 혈액에서 검출할 수 있는 T 세포 치료의 세포 수가 감소되기 전의 시기;
T 세포가 장시간의 트립토판 고갈, 소진, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 징후를 나타내기 전의 시기;
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출될 수 있기 전의 시기; 및/또는
T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하거나 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여 대상의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFNγ)의 수준이 증가하는 시기.
- 청구항 77에 있어서, 증가 또는 감소는 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나, 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
- 청구항 48-55 및 57-78 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 시작 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28일 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28일 내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 48-55 및 57-79 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 시작후 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 48-55 및 57-79 중 어느 한 항에 있어서,
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전, 0 내지 96시간, 0 내지 72 시간, 0 내지 48 시간, 0 내지 24 시간, 0 내지 12 시간 또는 0 내지 6 시간 또는 0 내지 2 시간, 또는 약 0 내지 96시간, 약 0 내지 72 시간, 약 0 내지 48 시간, 약 0 내지 24 시간, 약 0 내지 12 시간 또는 약 0 내지 6 시간 또는 약 0 내지 2 시간에 투여되거나; 또는
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 개시 전, 96 시간, 72 시간, 48 시간, 24 시간, 12 시간, 6 시간, 2 시간 또는 1 시간 이내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 55-81 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 분자, 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 일부 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 55-82 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 mTOR 또는 단백질 키나제 C 세타 (PKC-Θ)인, 방법.
- 청구항 55-82 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체인, 방법.
- 청구항 84에 있어서, 아미노산 수송체가 트립토판 수송체인, 방법.
- 청구항 84 또는 청구항 85에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 rBAT (SLC3A1), CD98 중쇄 (4F2hc, SLC3A2), L 형 아미노산 수송체 1 (LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), Asc 형 아미노산 수송체 1 (Asc-1, SLC7A10), 소듐 및 클로라이드-의존성 중성 및 염기성 아미노산 수송체 B (0+) (ATB0,+; SLC6A14), 소듐-의존성 중성 아미노산 수송체 B (0) AT1 (B (0) AT1; SLC6A19), 모노카르복실레이트 수송체 10 (TAT1; SLC16A10) 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된 것인, 방법.
- 청구항 84-86 중 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 서열 번호 36 내지 44 중 중 어느 하나 또는 이의 일부로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 36 내지 44 중 중 어느 하나 또는 이의 일부로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 84-87 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된 것인, 방법.
- 청구항 84-87 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 이의 일부를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 84-88 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 서열 번호 37 내지 39 및 44 중 어느 하나 또는 그의 일부로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 37 내지 39 및 44 중 어느 하나 또는 그의 일부로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 82-90 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서의 분자의 발현이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 방법.
- 청구항 55-91 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 GCN2 키나아제, BLIMP-1, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 수송 체 (ARNT), 진핵세포 번역개시인자 2α (eIF2α), 활성화 번역인자 4 (ATF4), CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질 (CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein, CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및 IFNγ-R2 중에서 선택된 것인, 방법.
- 청구항 92에 있어서, 분자가 GCN2 또는 CHOP인, 방법.
- 청구항 55-81, 92 및 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 분자의 감소 된 발현을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 94에 있어서, 조작된 세포가 억제성 핵산 또는 분자의 발현을 감소시키는 유전적 파괴를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 94 또는 청구항 95에 있어서, 세포에서 분자의 발현이, 억제성 핵산 또는 유전자 파괴가 없는 세포에서의 발현과 비교하여, 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 % 감소되는 것인, 방법.
- 청구항 95 또는 청구항 96에 있어서, 억제성 핵산을 세포 내로 도입하여 분자 발현을 감소시키는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 96 또는 청구항 97에 있어서, 억제성 핵산을 코딩하거나 생산하는 핵산을 세포 내로 도입하여 분자 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 96-98 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포가 억제성 핵산을 포함하고, 억제성 핵산이 RNA 간섭제를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 95-99 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산은 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA-적응(adapted) shRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 헤어핀 siRNA, 마이크로 RNA (miRNA-전구체) 또는 마이크로 RNA (miRNA)이거나, 이를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 95-100 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산의 발현은 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 방법.
- 청구항 95 또는 청구항 96에 있어서, 조작된 세포는 유전적 파괴를 포함하고;
상기 파괴는 DNA 수준에서 분자를 코딩하는 유전자를 파괴시키는 것을 포함하고/하거나,
상기 파괴는 비가역적이고/이거나;
상기 파괴는 일시적이지 않은 것인, 방법.
- 청구항 95, 96 및 102 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하거나 또는 혼성화화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 95, 96, 102 및 103 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 (a) DNA-표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-유도 뉴클레아제를 도입하는 것인, 방법
. - 청구항 104에 있어서, DNA-표적화 단백질 및 RNA-유도 뉴클레아제는 징크 핑거 단백질 (ZFP), TAL 단백질, 또는 유전자에 특이적인 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid, CRISPR)를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 95, 96 및 102-105 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 분자를 코딩하는 유전자에 결합, 인식, 또는 혼성화하는 크리스퍼-카스9 (CRISPR-Cas9) 조합물을 포함하는 제제를 세포 내로 도입시키는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 106에 있어서, 제제는 크리스퍼-카스9 조합물이고, 크리스퍼-카스9 조합물은 유전자에서의 표적 서열에 상보적이고/이거나 혼성화될 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 것인, 방법
- 청구항 95, 96 및 102-107 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 파괴는 유도성인 것인, 방법.
- 청구항 108에 있어서, 크리스퍼-카스9 조합물이 유도성 크리스퍼-카스9이고/이거나, 카스9이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 방법.
- 청구항 95, 96 및 102-109 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 적어도 하나의 엑손의 적어도 일부의 결실을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 95, 96 및 102-110 중 어느 한 항에 있어서,
파괴는 유전자 내의 조기 정지 코돈의 존재를 초래하는 유전자 내의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함하고/하거나;
파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 제 1 또는 제 2 엑손 내에서의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 91, 101 또는 109 중 어느 한 항에 있어서, 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자는 유도성 프로모터, 인핸서, 또는 트랜스활성화인자 또는 억제성 프로모터, 인핸서, 또는 트랜스활성화인자인, 방법.
- 청구항 112에 있어서, 프로모터가 RNA pol I 프로모터; pol II 프로모터, 선택적으로 CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터; 또는 pol III 프로모터, 선택적으로 U6 또는 H1 프로모터 중에서 선택되는 것인, 방법.
- 청구항 112 또는 청구항 113에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터인, 방법.
- 청구항 114에 있어서, 프로모터가 NFκB 또는 NFAT에 대한 결합 부위를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 114에 있어서, 프로모터가 Lac 작동 서열, 테트라사이클린 작동 서열, 갈락토스 작동 서열 또는 독시사이클린 작동 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체인, 방법.
- 청구항 114에 있어서, 프로모터가 억제성 유전자인, 방법.
- 청구항 117에 있어서, 프로모터가 Lac 억제자 또는 테트라사이클린 억제자 또는 그의 유사체에 의해 결합되거나 인식될 수 있는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 1-118 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 기능적 비 T-세포 수용체인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 1-119 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 120에 있어서, CAR가 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포 내 신호 전달 영역을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 121에 있어서, 세포 내 신호 전달 영역이 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 121 또는 청구항 122에 있어서, CAR가 보조 자극 신호 전달 영역을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 123에 있어서, 상기 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 신호 전달 도메인 또는 이의 신호 전달 부분(portion)을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 123 또는 청구항 124에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역이 CD28의 신호 전달 도메인인, 방법.
- 청구항 53-125 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 형질전환 T 세포 수용체 (TCR)인, 방법.
- 청구항 53-125 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 방법.
- 청구항 1-127 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 요법이 암과 관련된 항원을 인식하거나 표적화하는 것인, 방법.
- 청구항 53-128 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 암과 관련된 항원에 결합하거나 이를 인식하거나 표적화하는 것인, 방법.
- 청구항 129에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B 형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아성 아세틸콜린 e 수용체 (fetal acethycholine e receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄(kappa light chain), 루이스(Lewis) Y, L1-세포 접착 분자(cell adhesion molecule), MAGE-A1, 메소텔린(mesothelin), MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이항원(prostate specific antigen), PSMA, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), ephrinB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 윌름스 종양 1(Wilms Tumor 1, WT-1), 및 사이클린 A1 (CCNA1)으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 청구항 48-130에 있어서, 암은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)에 대한 음성 종양을 포함하고/하거나 대상은 T 세포 치료의 투여 개시 전에 IDO1 양성 종양의 발현을 위해 선택되지 않는 것인, 방법.
- 청구항 48-131 중 어느 한 항에 있어서, 암은 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), CD98 중쇄 (4F2hc, CD98hc, SLC3A2) 및/또는 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4)의 발현에 대해 양성인 종양을 포함하고/하거나, 암은 LAT1, LAT2, CD98hc 및/또는 PAT4의 발현에 대해 양성인 종양 미세 환경 내의 세포를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 1-132 중 어느 한 항에 있어서, 암이 골수종, 림프종, 백혈병인, 방법.
- 청구항 1-133 중 어느 한 항에 있어서, 암이 비호즈킨성림프종 (non-Hodgkin lymphoma, NHL), 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia, CLL), 확산성 B-세포 림프종 (diffuse large B-Cell lymphoma, DLBCL) 및 골수종인, 방법.
- 청구항 1-133 중 어느 한 항에 있어서, 암이 B 세포 항원을 발현시키지 않거나 B 세포 악성 종양이 아닌 것인, 방법.
- 청구항 1-133 및 135 중 어느 한 항에 있어서, 암이 CD19를 발현하지 않고/않거나, T 세포 치료가 CD19와 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하지 않고/않거나, T 세포 치료가 항-CD19 항원-결합 도메인을 포함하지 않는 CAR-T 세포 치료인, 방법.
- 청구항 1-133, 135 및 136 중 어느 한 항에 있어서, 암이 비-혈액 암이거나 고형 종양인, 방법.
- 청구항 1-137 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에서 T 세포 치료의 투여를 포함하는 방법과 비교하여, 종양 또는 대상의 생물학적 샘플, 선택적으로 혈청, 혈장 또는 종양 샘플에서 트립토판 수준의 증가 및/또는 키누레닌 수준의 감소를 초래하는 것인, 방법.
- 청구항 1-138 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에서 대상에게 투여되는 방법 또는 유사한 T 세포가 투여되는 방법으로서, T 세포가 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하지 않는 방법과 비교하여, T 세포 치료가 대상에서의 증가된 또는 장시간(prolonged)의 증식(체적증가, expansion) 및/또는 지속성(persistence)을 나타내는 것인, 방법.
- 청구항 1-139 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 경구, 피하 또는 정맥 내 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-140 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 경구 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-141 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 약 2.5 mg 내지 약 5000 mg, 2.5 mg 내지 2000 mg, 2.5 mg 내지 1000 mg, 2.5 mg 내지 500 mg, 2.5 mg 내지 200 mg, 2.5 mg 내지 100 mg, 2.5 mg 내지 50 mg, 2.5 mg 내지 25 mg, 2.5 mg 내지 10 mg, 25 mg 내지 5000 mg, 25 mg 내지 2000 mg, 25 mg 내지 1000 mg, 25 mg 내지 500 mg, 25 mg 내지 200 mg, 25 mg 내지 100 mg, 25 mg 내지 50 mg, 50 mg 내지 5000 mg, 50 mg 내지 2000 mg, 50 mg 내지 1000 mg, 50 mg 내지 500 mg, 50 mg 내지 200 mg, 50 mg 내지 100 mg, 100 mg 내지 5000 mg, 100 mg 내지 2000 mg, 100 mg 내지 1000 mg, 100 mg 내지 500 mg, 100 mg 내지 200 mg, 200 mg 내지 5000 mg, 200 mg 내지 2000 mg, 200 mg 내지 1000 mg, 200 mg 내지 500 mg, 500 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 2000 mg, 500 mg 내지 1000 mg 또는 1000 mg 내지 2000 mg 각각을 포함하는 양으로 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-142 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1 일 6 회, 1 일 5 회, 1 일 4 회, 1 일 3 회, 1 일 2 회 또는 1 일 1 회 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-143 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 적어도 5 mg/일, 10 mg/일, 25 mg/일, 50 mg/일, 100 mg/일, 200 mg/일, 400 mg/일, 500 mg/일, 600 mg/일, 800 mg/일, 1000 mg/일, 1200 mg/일, 1600 mg/일, 2000 mg/일, 5000 mg/일 또는 10000 mg/일의 총 일일 투여량으로 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-144 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여는 T 세포 치료의 투여 개시 후 다음의 시기까지 계속되는 것인 방법:
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전과 비교하여 또는 T-세포 치료의 투여 개시 직전과 비교하여, 대상으로부터의 생물학적 시료에서의 트립토판 수준의 증가, 키누레닌 수준의 감소 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 감소가 있는 시기;
트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자 투여 직전의 이전 시점에서의 대상과 비교하여 또는 T-세포 치료의 투여 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 증가하는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포 수가 대상의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수의 2.0 배 이내(크거나 작음)인 시기; 및/또는
대상으로부터의 혈액에서 검출 가능한 T 세포 치료의 세포의 수가 대상의 혈액에서의 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 또는 60 % 이상이거나, 약 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 또는 60 % 이상인 시기.
- 청구항 1-145 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 다음의 시기까지 투여되는 것인, 방법:
대상의 혈액 중의 조작된 세포의 농도 또는 수가 (i) 마이크로리터 당 적어도 약 10 개의 조작된 세포, (ii) 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 총 수의 적어도 20 %, 30 %, 40 % 또는 50 %, (iii) 적어도 또는 적어도 약 1 x 105 개의 조작된 세포이거나; 또는 (iv) 대상의 혈액이 적어도 5,000 카피의 마이크로그램 DNA 당 재조합 수용체-코딩 DNA를 포함하는 시기; 및/또는
(a)에서의 투여 개시 후 90 일째에, CAR-발현 세포가 대상의 혈액 또는 혈청에서 검출 가능가능한 시기; 및/또는
(a)에서 투여 개시 후 90 일째에, 대상의 혈액이 적어도 20 %의 CAR-발현 세포, 마이크로리터 당 적어도 10 개의 CAR-발현 세포 또는 적어도 1 × 104의 CAR-발현 세포를 함유하는 시기.
- 청구항 1-146 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에서 대상에게 투여되는 방법 또는 유사한 T 세포가 투여되는 방법으로서, T 세포가 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하지 않는 방법에서의 발현 또는 수준과 비교하여, T 세포 치료의 세포의 표면 상의 CD25의 발현 또는 수준이, 대상에게 상기 투여 후에, 감소되는 것인, 방법.
- 청구항 147에 있어서, 발현이 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나, 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상 감소되는 것인, 방법.
- 청구항 1-148 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 T 세포 치료의 투여 개시 후 최대 2 일까지, 7 일까지, 14 일까지, 21 일까지, 1 개월까지, 2 개월까지, 3 개월까지, 6 개월 까지 또는 1 년까지의 기간 동안 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-149 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 CD4+ 또는 CD8+ 인 T 세포를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 1-150 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 대상에게 자가조직인(autologous) 세포를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 1-150 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 대상과 동종이계인(allogeneic) T 세포를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 1-152 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 치료가 종양 미세 환경에서 IDO1 발현을 상향 조절하는 양으로 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 153에 있어서, IDO1 발현이 골수 세포, 간질 세포 또는 종양 세포에서 또는 그로부터 상향 조절되는 것인, 방법.
- 청구항 154에 있어서, IDO1 발현이 골수 간질 세포에서 또는 그로부터 상향 조절되는 것인, 방법.
- 청구항 1-155 중 어느 한 항에 있어서, 세포 치료는 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이, 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 1 x 106 cell/kg 사이 또는 약 0.5 x 106 세포/kg 대상의 체중과 1 x 106 cell/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이 또는 약 1.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 2 x 106 세포/kg 사이, 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이, 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이 또는 약 2.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 3 x 106 세포/kg 사이, 또는 3.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 또는 약 3.0 x 106 세포/kg 대상의 체중과 5 x 106 세포/kg 사이 (각각 포함)의 세포 수를 함유하는 투여량을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 1-156 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 세포의 양이, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 부재 하에서 세포 치료가 대상에게 투여되는 방법 또는 세포가 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 포함하지 않는 방법에서의 투여량보다 적은 것인, 방법.
- 청구항 157에 있어서, 투여량이 적어도 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 10-배 이하인, 방법.
- 청구항 1-158 중 한 항에 있어서, T 세포 치료가 세포를 포함하는 단일 약학적 조성물로서 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-159 중 한 항에 있어서, T 세포 치료가 분할 투여량인 세포의 투여량을 포함하고, 상기 투여량의 세포는, 3일 이하의 기간에 걸쳐, 투여량의 세포를 집합적으로 포함하는 복수의 조성물로 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1-159 중 한 항에 있어서, 방법이 T 세포 치료의 투여 전에 림프구고갈 화학치료 (lymphodepleting chemotherapy)를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 161에 있어서, 방법이 대상에게 플루다라빈을 투여하는 것을 포함하지 않는 것인, 방법.
- 청구항 1-160 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 차료의 투여 전에 대상에게 림프프고갈 화학치료를 투여하는 것을 포함하지 않는 것인, 방법.
- 청구항 55-163 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열, 및 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나, 변형에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 내로 도입함으로써 조작된 것인, 방법.
- 청구항 164에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 방법.
- 청구항 164에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 방법.
- 청구항 164-166 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 및 제 2 핵산은 하나 이상의 벡터(들), 선택적으로 바이러스 벡터(들)에 포함되는 것인, 방법.
- 트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자의 투여를 위한 질환 또는 증상을 갖는 대상을 선택하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 것인 방법:
(a) 대상으로부터의 하나 이상의 생물학적 시료에서 트립토판 또는 트립토판 대사 산물의 수준, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준, 또는 인터페론 - 감마 (IFNγ) 수준을 평가하는 단계로서, 대상으로부터의 생물학적 시료가 T 세포 치료로 치료할 후보인 대상으로부터 유래된 것인, 단계; 및
(b) 다음의 대상을 선택하는 단계:
(ⅰ) 샘플 중의 트립토판 수준이 역치 수준 이하인 대상;
(ii) 트립토판 대사 산물의 수준이 역치 수준 이상이 대상;
(iii) IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 수준 또는 활동 수준이 역치 수준 이상인 대상; 또는
(iv) IFNγ의 수준이 역치 수준 이상인 대상.
- 청구항 168에 있어서, 하나 이상의 생물학적 시료가 T 세포 치료의 투여 전에 수득되는 것인, 방법.
- 청구항 168 또는 청구항 169에 있어서, T 세포 치료를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 168-170 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 선택된 대상에게 투여되는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 171에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가, T 세포 치료의 투여 개시 전에 또는 동시에, 선택된 대상에게 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 171에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가, T 세포 치료의 투여 개시 이후에, 투여되는 것인, 방법.
- 트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자의 투여를 위한 질환 또는 증상을 갖는 대상을 선택하는 방법으로서, 다음을 포함하는 것인 방법:
(a) 대상으로부터의 하나 이상의 생물학적 시료에서 트립토판 또는 트립토판 대사 산물의 수준, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준, 또는 인터페론 - 감마 (IFNγ) 수준을 평가하는 단계로서, 대상으로부터의 생물학적 시료가 T 세포 치료를 투여받았던 대상으로부터 수득되는 것인, 단계; 및
(b) 다음의 대상을 선택하는 단계:
(i) 시료 중의 트립토판 수준이 역치 수준 이하이거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 감소된 대상;
(ii) 트립토판 대사 산물의 수준이 역치 수준 이상이거나 T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 대상;
(iii) IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준이 역치 수준 이상이거나, T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 대상; 또는
(iv) IFNγ의 수준이 역치 수준 이상이거나, T 세포 치료의 투여 개시 이전의 시점 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 대상.
- 청구항 174에 있어서, 하나 이상의 생물학적 시료가 T 세포 치료의 투여 후에 수득된 것인, 방법.
- 청구항 174 또는 청구항 175에 있어서, 상기 평가 전에, 세포 치료를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 174-176 중 어느 한 항에 있어서, 키누레닌 경로 조절인자를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 134-177 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 하기 시기에 투여되는 것인, 방법:
T 세포 치료의 투여 개시 전 또는 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여, 대상의 생물학적 샘플 내의 트립토판의 수치의 감소, 키누레닌 수준의 증가 및/또는 IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성의 증가가 있는 시기;
T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점의 대상에게서와 비교하여 대상의 혈액에서 검출할 수 있는 T 세포 치료의 세포 수가 감소되기 전의 시기;
T 세포가 장시간의 트립토판 고갈, 소진, 이펙터 기능의 감소, 억제 수용체의 발현 및/또는 증식 능력의 상실의 징후를 나타내기 전의 시기;
T 세포 치료의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상의 혈액에서 검출될 수 있기 전의 시기; 및/또는
T 세포 치료의 투여 개시 전과 비교하거나 T 세포 치료의 투여 개시 후 이전 시점과 비교하여 대상의 생물학적 샘플에서 인터페론-감마(IFNγ)의 수준이 증가되는 시기.
- 청구항 178에 있어서, 증가 또는 감소가 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나, 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
- 청구항 173-179 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료의 개시 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 이내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 173-180 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는, T 세포 치료의 개시 후, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 이내에, 또는 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 또는 48 시간 이내에 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 168-171 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 증상은 암인, 방법.
- 청구항 168-172 중 어느 한 항에 있어서, IDO1, IDO2 또는 TDO의 발현 또는 활성 수준이 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 증가된 경우, 대상이 선택되는 것인, 방법.
- 청구항 168-183 중 어느 한 항에 있어서, 시료에서의 트립토판 수준이 역치 수준 이하이거나 감소된 T 세포 치료의 투여 개시 이전 시점에서 평가된 수준과 비교하여 감소된 경우, 대상이 선택되는 것인, 방법.
- 청구항 168-184 중 어느 한 항에 있어서, 역치 수준 (threshold level)이 평균 수준 (average level), 농도 또는 양의 25 % 이내, 20 % 이내, 15 % 이내, 10 % 이내 또는 5 % 이내이고/이거나, 복수의 대조군 대상으로부터의 생물학적 시료에서의 평균 수준, 농도 EH는 양의 표준 편차 이내인 것인, 방법.
- 청구항 185에 있어서, 대조군 대상은, 암이 없고/없거나 T 세포 치료의 투여를 받기 이전인, 건강한 또는 정상인 대상인, 방법.
- 청구항 168-184 중 어느 한 항에 있어서, 증가 또는 감소가 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상이거나, 약 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배 또는 이 이상인, 방법.
- 청구항 168-187 중 어느 한 항에 있어서, 상기 평가 이전에, 상기 대상이 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료에 완전히 반응하지 않거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 의한 치료 후 차도 후 재발되거나, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 선투여에 난치인 경우, 선택적으로 상기 선투여는 면역조절제, 선택적으로 관문 억제제와 함께 조합하여 수행될 수 있는 것인, 방법.
- 청구항 168-184 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 시료가 혈청, 혈장 또는 종양 샘플이거나, 이로부 수득되는 것인, 방법.
- 청구항 168-170 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산(3-HAA)에서 선택된 것인 방법.
- 청구항 168-190 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물 (antibody mimetic), 앱타머, 또는 핵산 분자인, 방법.
- 청구항 168-191 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제(kynureninase)의 길항제인, 방법.
- 청구항 168-192 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)의 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소의 억제제인, 방법.
- 청구항 168-191 및 193 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 방법.
- 청구항 168-191 및 193 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1(IDO1)의 억제제인, 방법.
- 청구항 168-191 및 193-195 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 방법.
- 청구항 196에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, 에파카도스타트)인, 방법.
- 청구항 196에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인, 방법.
- 청구항 168-191 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인, 방법.
- 청구항 168-199 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 기능성 비(non)-T 세포 수용체인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 168-200 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 201에 있어서, CAR가 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포 내 신호 전달 영역을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 202에 있어서, 세포 내 신호 전달 영역이 CD3- 제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 202 또는 청구항 203에 있어서, CAR가 보조 자극 신호 전달 영역을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 204에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 신호 전달 도메인 또는 이의 신호 전달 부분을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 204 또는 청구항 205에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역이 CD28의 신호 전달 도메인인, 방법.
- 청구항 53-206 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 형질전환 T 세포 수용체 (TCR)인, 방법.
- 청구항 53-206 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 방법.
- 청구항 1-208 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 요법이 암과 관련된 항원을 인식하거나 표적화하는 것인, 방법.
- 청구항 53-209 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체가 암과 관련된 항원에 결합하거나 이를 인식하거나 표적화하는 것인, 방법.
- 청구항 210에 있어서, 항원은 ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B 형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아성 아세틸콜린 e 수용체 (fetal acethycholine e receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄(kappa light chain), 루이스(Lewis) Y, L1-세포 접착 분자(cell adhesion molecule), MAGE-A1, 메소텔린(mesothelin), MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원(oncofetal antigen), TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이항원(prostate specific antigen), PSMA, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor), ephrinB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 윌름스 종양 1(Wilms Tumor 1, WT-1), 및 사이클린 A1 (CCNA1)으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 다음을 포함하는 조작된 세포:
(a) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및
(b) IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형.
- 청구항 212에 있어서, 변형이 분자, 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 일부 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 세포에서의 이소성 발현을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 212 또는 213 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 mTOR 또는 단백질 키나제 C 세타 (PKC-Θ)인, 조작된 세포.
- 청구항 212 또는 청구항 213에 있어서, 분자가 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체인, 조작된 세포.
- 다음을 포함하는 조작된 세포:
(a) 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체; 및
(b) 재조합, 조작된 및/또는 이소적으로 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및 또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체.
- 청구항 215 또는 216에있어서, 아미노산 수송체는 트립토판 수송체인, 조작된 세포.
- 청구항 215-217 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬은 rBAT (SLC3A1), CD98 중쇄 (4F2hc, SLC3A2), L 형 아미노산 수송체 1 (LAT1, SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), Asc 형 아미노산 수송체 1 (Asc-1, SLC7A10), 소듐 및 클로라이드-의존성 중성 및 염기성 아미노산 수송체 B (0+) (ATB0,+; SLC6A14), 소듐-의존성 중성 아미노산 수송체 B (0) AT1 (B (0) AT1; SLC6A19), 모노카르복실레이트 수송체 10 (TAT1; SLC16A10) 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된 것인, 조작된 세포.
- 청구항 215-218 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 서열 번호 36 내지 115 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 36 내지 115 중 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 215-219 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2), L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) 및 양성자-보조 아미노산 수송체 4 (PAT4; SLC36A4) 또는 이의 일부 중 하나 이상으로부터 선택된 것인, 조작된 세포.
- 청구항 215-219 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 CD98 중쇄 (4F2hc; SLC3A2) 및 L-형 아미노산 수송체 1 (LAT1; SLC7A5) 또는 이의 일부를 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 215-220 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 수송체 또는 이의 사슬이 서열 번호 37 내지 39 및 115 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 37 내지 39 및 115 중 어느 하나로 부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 215-222 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서의 분자 또는 아미노산 수송체의 발현이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 212에 있어서, 분자가 GCN2 키나아제, BLIMP-1, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), AHR 핵 수송체 (ARNT), 진핵세포 번역개시인자 2α (eIF2α), 활성화 번역인자 4 (ATF4), CCAAT/인핸서 결합 단백질-상동 단백질 (CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein, CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 및 IFNγ-R2 중에서 선택된 것인, 조작된 세포.
- 청구항 224에 있어서, 분자가 GCN2 또는 CHOP인, 조작된 세포.
- 청구항 224 또는 청구항 225에 있어서, 변형이 세포에서의 분자의 감소된 발현을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 224-226 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포가 억제성 핵산 또는 분자의 발현을 감소시키는 유전적 파괴를 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 226 또는 청구항 227에 있어서, 세포에서의 분자의 발현이, 억제성 핵산 또는 유전자 파괴가 없는 세포에서의 발현과 비교하여, 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 % 감소되는 것인, 방법.
- 청구항 226-228 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 억제성 핵산을 포함하여, 이로써 분자의 발현 감소를 초래하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 229에 있어서, 억제성 핵산은 RNA 간섭제를 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 229 또는 230에 있어서, 억제성 핵산은 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA-적응 shRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 헤어핀 siRNA, 마이크로 RNA (miRNA 전구체) 또는 마이크로 RNA (miRNA)이거나 이를 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 229-231 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산의 발현이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스액티베이터의 제어 하에 있는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 229-231 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포는 분자를 코딩하는 파괴 유전자, 분자를 코딩하는 유전자의 파괴용 제제 및/또는 분자를 코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 233에 있어서, 파괴는 DNA 수준에서 분자를 코딩하는 유전자를 파괴시키는 것을 포함하고/하거나,
상기 파괴는 비가역적이고/이거나;
상기 파괴는 일시적이지 않은 것인, 조작된 세포.
- 청구항 233 또는 234에 있어서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하거나 또는 혼성화화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산에 의해 매개되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 233 내지 235 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 (a) DNA 표적 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-유도 뉴클레아제에 의해 매개되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 233 내지 236 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 유전자 편집 뉴 클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 크리스퍼/카스9 (CRISPR/Cas9)에 의해 매개되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 237에 있어서, 파괴는 크리스퍼/카스9 (CRISPR/Cas9)에 의해 매개되고, 상기 크리스퍼/카스9은 유전자 내의 표적 서열에 상보적이고 및/또는 혼성화될 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 233 내지 238 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 파괴는 조건부 또는 유도성인, 조작된 세포.
- 청구항 239에 있어서, 크리스퍼-카스9(CRISPR-Cas9) 복합체가 유도성 크리스퍼-카스9이고/이거나 카스9이 조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자의 제어 하에 있는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 233 내지 240 중 어느 한 항에 있어서, 파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 적어도 하나의 엑손의 적어도 일부의 결실을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 233 내지 241 중 어느 한 항에 있어서,
파괴는 유전자 내에 조기 종료 코돈 (premature stop codon)의 존재를 초래하는 유전자 내의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함하고/하거나;
파괴는 분자를 코딩하는 유전자의 제 1 또는 제 2 엑손 내에서의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 196, 232, 239 및 240 중 어느 한 항에 있어서,
조건부 프로모터 또는 인핸서 또는 트랜스활성화인자가 유도성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자 또는 억제성 프로모터, 인핸서 또는 트랜스활성화인자 인, 조작된 세포.
- 청구항 243에 있어서, 프로모터가 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 244에 있어서, 프로모터가
U6 또는 H1 프로모터 인 pol III 프로모터; 또는
CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터인 pol II 프로모터부터로 부터 선택되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 243-245 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터인, 조작된 세포.
- 청구항 246에 있어서, 프로모터가 NFκB 또는 NFAT에 대한 결합 부위를 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 246에 있어서, 프로모터가 Lac 작동 서열, 테트라사이클린 작동 서열, 갈락토오스 작동 서열 또는 독시사이클린 작동 서열을 포함하거나 또는 그의 유사체인, 조작된 세포.
- 청구항 243-245 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 억제성 프로모터 인, 조작된 세포.
- 청구항 249 에 있어서, 프로모터가 Lac 억제자 또는 테트라사이클린 억제자 또는 그의 유사체에 의해 결합되거나 인식될 수 있는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 212-250 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 T 세포인, 조작된 세포.
- 청구항 251에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포인, 조작된 세포.
- 청구항 251에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포인, 조작된 세포.
- 청구항 212-250 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 자연 살해 세포 (NK 세포)인, 조작된 세포.
- 청구항 212-250 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 iPS-유래 세포인, 조작된 세포.
- 청구항 212-255 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체가 기능적 비-T 세포 수용체인, 조작된 세포.
- 청구항 212-256 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 조작된 세포.
- 청구항 257에 있어서, CAR가 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인을 포함하고, 및 상기 세포 내 신호 전달 영역이 ITAM을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 258에 있어서, 세포 내 신호 전달 영역이 CD3- 제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 258 또는 259에 있어서, CAR는 보조 자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 260에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 신호 전달 도메인 또는 이의 신호 전달 부분을 포함하는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 260 또는 261에 있어서, 보조 자극 신호 전달 영역은 CD28의 신호 전달 도메인인, 조작된 세포.
- 청구항 212-262 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체가 기능적 비-T 세포 수용체인, 조작된 세포.
- 청구항 212-262 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체가 형질 전환 T 세포 수용체 (TCR)인, 조작된 세포.
- 청구항 212-264 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열 및 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련된 분자, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나, 변형에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 내로 도입함으로써 조작되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 265에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 265에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 265-267 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 벡터(들), 선택적으로 바이러스 벡터(들)에 포함되는 것인, 조작된 세포.
- 청구항 212-268 중 어느 한 항의 조작된 세포를 포함하는 조성물.
- 청구항 269에 있어서, 세포가 CD4+ 또는 CD8+ 세포인, 조성물.
- 청구항 270에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
- 조합물로서,
리간드에 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 세포; 및
트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자를 포함하고,
상기 재조합 수용체가 선택적으로 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 조합물.
- 조합물로서,
청구항 212 내지 268 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 청구항 199 내지 201 중 어느 한 항의 조성물; 및
트립토판 대사 및/또는 키누레인 경로 조절인자를 포함하는 조합물.
- 청구항 272 또는 273에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시키는 것인, 조합물.
- 청구항 272 또는 274에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 트립토판의 이화작용을 방지 또는 감소시키거나 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시키는 것인, 조합물.
- 청구항 275에 있어서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시 키누레닌 및 3-하이드록시 안트라닐산 (3-HAA)으로부터 선택되는 것인, 조합물.
- 청구항 272-276 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩타이드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물, 앱타머 또는 핵산 분자인, 조합물.
- 청구항 272-277 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제의 길항제인, 조합물.
- 청구항 272-277 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3- 디옥시게나아제의 억제제(TDO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 억제제인, 조합물.
- 청구항 272-277 및 279 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 조합물.
- 청구항 272-277, 279 및 280 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민- 피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제인 것인, 조합물.
- 청구항 272-277 및 279-281 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, epacadostat), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 조합물.
- 청구항 282에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, epacadostat)인 것인, 조합물.
- 청구항 282에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인 것인, 조합물.
- 청구항 272 내지 277 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인 것인, 조합물.
- 키트와 같은 제품으로 포장된 청구항 272-285 중 어느 한 항의 조합물.
- 청구항 286에 있어서, 상기 제품 및/또는 키트는 조작된 세포 및/또는 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자의 투여를 제공하는 지침 또는 문서를 추가로 포함하는 것인, 조합물.
- 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법으로서,
면역 세포를 포함하는 세포 집단을 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자와 접촉시키는 단계; 및
재조합 수용체가 발현되는 조건 하에서 재조합 수용체를 코딩하는 핵산을 세포 집단 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 288에 있어서, 재조합 수용체가 리간드, 선택적으로 항원에 결합하는 것인, 방법.
- 청구항 288 또는 289에 있어서, 재조합 수용체가 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 방법.
- 청구항 288-290 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 말초 혈액 단핵 세포인, 방법.
- 청구항 288-290 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 T 세포이거나 T 세포를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 292에 있어서, T 세포가 CD4+ 및/또는 CD8+인, 방법.
- 청구항 288-293 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 집단이 대상, 선택적으로 인간 대상체부터 분리된 것인, 방법.
- 청구항 288-294 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 도입 이전 및/또는 도입 중에 발생하는 것인, 방법.
- 청구항 288-295 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 키누레닌 경로의 효소 및/또는 대사 산물의 형성, 농도, 유효성, 대사 및/또는 효과를 차단하거나 감소시키는 것인, 방법.
- 청구항 288-296 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자가 트립토판의 이화작용을 방지 또는 감소시키거나 트립토판 대사 산물의 합성 또는 축적을 방지 또는 감소시키는 것인, 방법.
- 청구항 297에 있어서, 트립토판 대사 산물은 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌 및 3-하이드록시안트라닐산 (3-HAA)으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 288-298 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 소분자, 펩타이드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 모방물, 앱타머 또는 핵산 분자인, 방법.
- 청구항 288-299 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 효소 키누레니나아제의 길항제인, 방법.
- 청구항 288-299 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3- 디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제, IDO2의 억제제 및 트립토판 2,3- 디옥시게나아제의 억제제(TDO)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 억제제인, 방법.
- 청구항 288-299 및 301 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 이중-작용 IDO/TDO 억제제인, 방법.
- 청구항 288-299 및 301 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제 1 (IDO1)의 억제제인 것인, 방법.
- 청구항 288-299 및 301-303 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D 트립토판 (1-MT) (인독시모드), 4-({2-[(아미노 술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사 디아졸-3-카르복시미드아미드 (INCB024360, epacadostat), 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[4-플루오로-3-(트리플루오로 메틸)페닐]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N'-하이드록시-N-[3-(트리플루오로 메틸)페닐]-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-시아노-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-{2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-브로모-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드, 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-[(4-클로로-2-푸릴)메틸]-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시 미드아미드, 1-시클로헥실-2-(5H-이미다조[5,1-a]이소인돌-5-일)에탄올 (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 것인, 방법
- 청구항 304에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 4-({2-[(아미노술포닐)아미노]에틸}아미노)-N-(3-브로모-4-플루오로페닐)-N'-하이드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미드아미드(INCB024360, 에파카도스타트)인 것인, 방법.
- 청구항 304에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 1-메틸-D-트립토판 (1-MT) (인독시모드)인 것인, 방법.
- 청구항 288 내지 299 중 어느 한 항에 있어서, 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로 조절인자는 트립토판인 것인, 방법.
- 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체가 발현되는 조건 하에서, 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 세포 집단에 도입하는 단계; 및
제제가 발현되는 조건 하에서 IDO-매개 면역 억제 신호 전달과 관련, 트립토판 고갈 또는 부족에 대한 감지 또는 반응과 관련, 및/또는 세포에서 키누레닌 매개 면역 억제에 대한 감지 또는 반응과 관련된 분자의 발현의 변형을 가능하게 하거나, 변형에 관여하는 제제를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 세포 집단에 도입하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 재조합 수용체를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체가 발현되는 조건 하에서, 재조합 수용체를 코딩하는 제 1 핵산 서열을 세포 집단에 도입하는 단계; 및
재조합, 조작된 및/또는 이소적으로 발현된 아미노산 수송체 또는 이의 사슬 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 부분 또는 변이체를 코딩하는 하나 이상의 제 2 핵산 서열(들)을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 308에 있어서, 변형은 분자 또는 이의 기능적 및/또는 촉매적 활성 사슬, 부분 또는 변이체의 재조합, 조작 및/또는 이소성 발현을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 308에 있어서, 변형은 상기 분자의 감소된 발현을 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 311에 있어서, 방법은 분자의 발현을 감소시키는 억제성 핵산 또는 유전적 파괴를 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 308 내지 312에 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 방법.
- 청구항 308 내지 312에 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열은 2 개의 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것인, 방법.
- 청구항 308 내지 314에 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 상기 제 2 핵산 서열(들)은 하나 이상의 벡터(들), 선택적으로 바이러스 벡터(들)에 포함되는 것인, 방법.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021049862A1 (ko) * | 2019-09-10 | 2021-03-18 | 고려대학교 세종산학협력단 | 인돌아민 2,3-이산소화 효소를 포함하는 전립선암 진단용 마커 |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| MA42895A (fr) | 2015-07-15 | 2018-05-23 | Juno Therapeutics Inc | Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive |
| GB201701332D0 (en) * | 2017-01-26 | 2017-03-15 | Tc Biopharm Ltd | Immune cells with modified metabolism and their use thereof |
| WO2018204427A1 (en) * | 2017-05-01 | 2018-11-08 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination of a cell therapy and an immunomodulatory compound |
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| WO2019138114A1 (en) * | 2018-01-15 | 2019-07-18 | Universität Heidelberg | Nfat binding polynucleotides |
| US20190284553A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| WO2019227090A1 (en) * | 2018-05-25 | 2019-11-28 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Diagnosis and treatment of immunotherapy-induced neurotoxicity |
| WO2019231805A1 (en) * | 2018-05-30 | 2019-12-05 | The Johns Hopkins University | NF-κB p50 DEFICIENT IMMATURE MYELOID CELLS AND THEIR USE IN TREATMENT OF CANCER |
| CN111035623B (zh) * | 2018-10-12 | 2021-11-23 | 国家纳米科学中心 | 一种ido1多肽纳米抑制剂及其制备方法和应用 |
| CN110592014A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-12-20 | 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 | 一种在nk细胞治疗中免辐照体外体内持续去除饲养细胞的方法 |
| JP2022554348A (ja) | 2019-11-05 | 2022-12-28 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 治療用ｔ細胞組成物の属性を決定する方法 |
| US20230218669A1 (en) * | 2020-03-31 | 2023-07-13 | Fred Hutchinson Cancer Center | Augmenting antigen-negative cell death in antigen-targeted immunotherapies |
| WO2021222451A2 (en) * | 2020-04-28 | 2021-11-04 | City Of Hope | Tagged gene editing technology for clinical cell sorting and enrichment |
| US20230348585A1 (en) * | 2020-05-05 | 2023-11-02 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Methods for treating or reducing the severity of a viral infection |
| CN115803824A (zh) | 2020-05-13 | 2023-03-14 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 鉴定与临床反应相关的特征的方法及其用途 |
| US20220010028A1 (en) * | 2020-07-09 | 2022-01-13 | The Lundquist Institute for Biomedical Innovation at Harbor-UCLA Medical Center | Compositions and methods for treating fibroids |
| US20220064596A1 (en) * | 2020-08-25 | 2022-03-03 | Kite Pharma, Inc. | T cells with improved functionality |
| CN114306601A (zh) * | 2020-09-28 | 2022-04-12 | 中国科学院上海营养与健康研究所 | 一种l型氨基酸转运蛋白抑制剂或拮抗剂有效干预糖尿病的方法 |
| GB202018554D0 (en) * | 2020-11-25 | 2021-01-06 | Cancer Research Tech Ltd | Nucleic acid constructs and cells |
| WO2022236099A1 (en) * | 2021-05-06 | 2022-11-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Assessing and treating cancer |
| WO2023080788A1 (en) * | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut-Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis | Tryptophan depletion induces production and presentation of tryptophan to phenylalanine substitutions |
| WO2023166492A2 (en) * | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Antido Therapeutics International Sàrl | Dual inhibitors of tryptophan dioxygenases (ido1 and tdo) and their use in therapy |
| WO2023230548A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Celgene Corporation | Method for predicting response to a t cell therapy |
| CN114657158B (zh) * | 2022-05-25 | 2022-10-21 | 深圳吉诺因生物科技有限公司 | Ido1相关疫苗及其应用 |
| CN114878723B (zh) * | 2022-07-04 | 2022-09-23 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 快速诊断多发性骨髓瘤的代谢标志物及应用 |
| CN116251088A (zh) * | 2022-12-19 | 2023-06-13 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用 |
Family Cites Families (154)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
| US4452773A (en) | 1982-04-05 | 1984-06-05 | Canadian Patents And Development Limited | Magnetic iron-dextran microspheres |
| US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
| US5019369A (en) | 1984-10-22 | 1991-05-28 | Vestar, Inc. | Method of targeting tumors in humans |
| US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4690915A (en) | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| US4795698A (en) | 1985-10-04 | 1989-01-03 | Immunicon Corporation | Magnetic-polymer particles |
| US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| US5219740A (en) | 1987-02-13 | 1993-06-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy |
| AU4746590A (en) | 1988-12-28 | 1990-08-01 | Stefan Miltenyi | Methods and materials for high gradient magnetic separation of biological materials |
| US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| AU7979491A (en) | 1990-05-03 | 1991-11-27 | Vical, Inc. | Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes |
| US5200084A (en) | 1990-09-26 | 1993-04-06 | Immunicon Corporation | Apparatus and methods for magnetic separation |
| JP3150340B2 (ja) | 1990-11-13 | 2001-03-26 | イムネクス コーポレイション | 二機能選択可能融合遺伝子 |
| US5487994A (en) | 1992-04-03 | 1996-01-30 | The Johns Hopkins University | Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease |
| US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
| US5356802A (en) | 1992-04-03 | 1994-10-18 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease |
| EP0804590A1 (en) | 1993-05-21 | 1997-11-05 | Targeted Genetics Corporation | Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene |
| US5827642A (en) | 1994-08-31 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes |
| WO1996013593A2 (en) | 1994-10-26 | 1996-05-09 | Procept, Inc. | Soluble single chain t cell receptors |
| WO1996018105A1 (en) | 1994-12-06 | 1996-06-13 | The President And Fellows Of Harvard College | Single chain t-cell receptor |
| DE19608753C1 (de) | 1996-03-06 | 1997-06-26 | Medigene Gmbh | Transduktionssystem und seine Verwendung |
| WO1997034634A1 (en) | 1996-03-20 | 1997-09-25 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Single chain fv constructs of anti-ganglioside gd2 antibodies |
| GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
| GB9710807D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
| WO1999018129A1 (en) | 1997-10-02 | 1999-04-15 | Sunol Molecular Corporation | Soluble single-chain t-cell receptor proteins |
| PT1066380E (pt) | 1998-05-19 | 2002-05-31 | Avidex Ltd | Receptor de celula t soluvel |
| JP2002524081A (ja) | 1998-09-04 | 2002-08-06 | スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ | 前立腺−特異的膜抗原に特異的な融合受容体およびその使用 |
| US6140081A (en) | 1998-10-16 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger binding domains for GNN |
| US6410319B1 (en) | 1998-10-20 | 2002-06-25 | City Of Hope | CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies |
| US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
| US7070934B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-07-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression |
| US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
| US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
| US7030215B2 (en) | 1999-03-24 | 2006-04-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
| US6794136B1 (en) | 2000-11-20 | 2004-09-21 | Sangamo Biosciences, Inc. | Iterative optimization in the design of binding proteins |
| DE60023936T2 (de) | 1999-12-06 | 2006-05-24 | Sangamo Biosciences Inc., Richmond | Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen |
| EP1254369B1 (en) | 2000-02-08 | 2010-10-06 | Sangamo BioSciences, Inc. | Cells for drug discovery |
| US20020131960A1 (en) | 2000-06-02 | 2002-09-19 | Michel Sadelain | Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof |
| JP2002060786A (ja) | 2000-08-23 | 2002-02-26 | Kao Corp | 硬質表面用殺菌防汚剤 |
| EP1334188B1 (en) | 2000-11-07 | 2006-08-30 | City of Hope | Cd19-specific redirected immune cells |
| US7067317B2 (en) | 2000-12-07 | 2006-06-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| US7070995B2 (en) | 2001-04-11 | 2006-07-04 | City Of Hope | CE7-specific redirected immune cells |
| US20090257994A1 (en) | 2001-04-30 | 2009-10-15 | City Of Hope | Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers |
| DE60226970D1 (de) | 2001-06-05 | 2008-07-17 | Lilly Icos Llc | Pyrazinoä1',2':1,6ü-pyridoä3,4-bü indole-1,4-dionderivate |
| AU2002336373A1 (en) | 2001-08-20 | 2003-03-03 | The Scripps Research Institute | Zinc finger binding domains for cnn |
| ES2239246T3 (es) | 2001-08-31 | 2005-09-16 | Avidex Limited | Receptor soluble de celulas t. |
| US7939059B2 (en) | 2001-12-10 | 2011-05-10 | California Institute Of Technology | Method for the generation of antigen-specific lymphocytes |
| US7262054B2 (en) | 2002-01-22 | 2007-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
| US20030170238A1 (en) | 2002-03-07 | 2003-09-11 | Gruenberg Micheal L. | Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy |
| US7763251B2 (en) | 2002-04-12 | 2010-07-27 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Kits to assess the risk of tumor progression |
| US7446190B2 (en) | 2002-05-28 | 2008-11-04 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors |
| US7361635B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-04-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Simultaneous modulation of multiple genes |
| EP1549748B1 (en) | 2002-10-09 | 2014-10-01 | Immunocore Ltd. | Single chain recombinant t cell receptors |
| JP2006507841A (ja) | 2002-11-14 | 2006-03-09 | ダーマコン， インコーポレイテッド | 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ |
| CN1742086B (zh) | 2002-11-22 | 2010-05-12 | 生物智囊团株式会社 | Rna干扰的目标碱基序列的搜索方法 |
| US20050129671A1 (en) | 2003-03-11 | 2005-06-16 | City Of Hope | Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells |
| EP1606285A4 (en) | 2003-03-27 | 2009-03-18 | Lankenau Inst Medical Res | IDO INHIBITORS AND METHODS OF USE THEREOF |
| US20050186289A1 (en) | 2003-04-01 | 2005-08-25 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Regulation of T cell-mediated immunity by D isomers of inhibitors of indoleamine-2,3-dioxygenase |
| US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
| US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| JP4903689B2 (ja) | 2004-04-08 | 2012-03-28 | サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | 神経障害および神経変性症状を治療するための方法と組成物 |
| WO2005100392A2 (en) | 2004-04-08 | 2005-10-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins |
| EP1791865B1 (en) | 2004-06-29 | 2010-07-28 | Immunocore Ltd. | Cells expressing a modified t cell receptor |
| CN101098877A (zh) | 2004-07-13 | 2008-01-02 | 不列颠哥伦比亚大学 | 吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)抑制剂 |
| US20080312171A1 (en) | 2005-05-31 | 2008-12-18 | Centre National De La Recherche Scientifique | Tetracycline-Dependent Regulation of Rna Interference |
| ATE541517T1 (de) | 2005-08-10 | 2012-02-15 | Bard Inc C R | Transportsystem für biopsievorrichtung mit mehrfache probennahme durch einzeleinführung |
| US20110305713A1 (en) | 2005-10-21 | 2011-12-15 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc | Methods and compositions to enhance vaccine efficacy by reprogramming regulatory t cells |
| US7705022B2 (en) | 2005-10-27 | 2010-04-27 | Lankenau Institute For Medical Research | IDO inhibitors and methods of use thereof |
| DK2054397T3 (en) | 2006-08-16 | 2016-01-18 | J David Gladstone Inst A Testamentary Trust Established Under The Will Of J David Gladstone | SMALL MOLECULAR INHIBITORS OF KYNURENIN-3-MONOOXYGENASE |
| WO2008022286A2 (en) | 2006-08-16 | 2008-02-21 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Small molecule inhibitors of kynurenine-3-monooxygenase |
| WO2008052352A1 (en) | 2006-11-03 | 2008-05-08 | The University Of British Columbia | Substituted quinone indoleamine 2,3-dioxygenase (ido) inhibitors and syntheses and uses therefor |
| WO2008058178A1 (en) | 2006-11-08 | 2008-05-15 | Incyte Corporation | N-hydroxyamidinoheterocycles as modulators of indoleamine 2,3-dioxygenase |
| CA2967847C (en) | 2007-03-30 | 2023-08-01 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes |
| US10047066B2 (en) | 2007-11-30 | 2018-08-14 | Newlink Genetics Corporation | IDO inhibitors |
| EP2227271B1 (en) | 2007-12-07 | 2018-01-24 | Miltenyi Biotec GmbH | Sample processing system and methods |
| US8479118B2 (en) | 2007-12-10 | 2013-07-02 | Microsoft Corporation | Switching search providers within a browser search box |
| US20110159017A1 (en) | 2008-04-11 | 2011-06-30 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Trytophan catabolism in cancer treatment and diagnosis |
| US20120164718A1 (en) | 2008-05-06 | 2012-06-28 | Innovative Micro Technology | Removable/disposable apparatus for MEMS particle sorting device |
| JP5173594B2 (ja) | 2008-05-27 | 2013-04-03 | キヤノン株式会社 | 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法 |
| DK2824100T3 (en) | 2008-07-08 | 2018-04-16 | Incyte Holdings Corp | 1,2,5-oxadiazoles as inhibitors of indolamine-2,3-dioxygenase |
| US8691824B2 (en) | 2008-08-04 | 2014-04-08 | Chdi Foundation, Inc. | Certain kynurenine-3-monooxygenase inhibitors, pharmaceutical compositions, and methods of use thereof |
| BRPI0916576A2 (pt) | 2008-08-04 | 2017-06-27 | Chdi Inc | pelo menos uma entidade química, composição farmacêutica, e, método para tratar uma condição ou distúrbio. |
| PL3006459T3 (pl) | 2008-08-26 | 2022-01-17 | City Of Hope | Sposób i kompozycje dla wzmocnionego działania efektorowego komórek t przeciw guzowi nowotworowemu |
| US8889394B2 (en) | 2009-09-07 | 2014-11-18 | Empire Technology Development Llc | Multiple domain proteins |
| WO2011041093A1 (en) | 2009-10-01 | 2011-04-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer |
| EP2486049A1 (en) | 2009-10-06 | 2012-08-15 | The Board Of Trustees Of The UniversityOf Illinois | Human single-chain t cell receptors |
| GB0917927D0 (en) | 2009-10-13 | 2009-11-25 | Ludwig Inst For Cancer Res Ltd | Ido inhibitors and therapeutic uses thereof |
| ES2601226T3 (es) | 2009-10-28 | 2017-02-14 | Newlink Genetics Corporation | Derivados de imidazol como inhibidores de IDO |
| TR201904484T4 (tr) | 2009-11-03 | 2019-05-21 | Hope City | Transdüse T hücre seçimine yönelik kesik epiderimal büyüme faktörü reseptörü (EGFRt). |
| WO2011091153A1 (en) | 2010-01-25 | 2011-07-28 | Chdi, Inc. | Certain kynurenine-3-monooxygenase inhibitors, pharmaceutical compositions, and methods of use thereof |
| AU2011256838B2 (en) | 2010-05-17 | 2014-10-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Novel DNA-binding proteins and uses thereof |
| WO2012031744A1 (en) | 2010-09-08 | 2012-03-15 | Chemotherapeutisches Forschungsinstitut | Chimeric antigen receptors with an optimized hinge region |
| PT3214091T (pt) | 2010-12-09 | 2019-01-11 | Univ Pennsylvania | Utilização de células t modificadas por recetor de antigénio quimérico para tratar o cancro |
| BR112013024395B1 (pt) | 2011-03-23 | 2021-10-26 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Composições adotivas de imunoterapia celular e método para fabricação da dita composição |
| NO2694640T3 (ko) | 2011-04-15 | 2018-03-17 | ||
| US8398282B2 (en) | 2011-05-12 | 2013-03-19 | Delphi Technologies, Inc. | Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element |
| US9260422B2 (en) | 2011-07-28 | 2016-02-16 | Chdi Foundation, Inc. | Certain kynurenine-3-monooxygenase inhibitors, pharmaceutical compositions, and methods of use thereof |
| US20130078250A1 (en) | 2011-08-23 | 2013-03-28 | Oliver Ast | Bispecific t cell activating antigen binding molecules |
| EP3243515B1 (en) | 2011-08-30 | 2019-10-16 | CHDI Foundation, Inc. | Kynurenine-3-monooxygenase inhibitors, pharmaceutical compositions, and methods of use thereof |
| WO2013033068A1 (en) | 2011-08-30 | 2013-03-07 | Stephen Martin Courtney | Kynurenine-3-monooxygenase inhibitors, pharmaceutical compositions, and methods of use thereof |
| RU2644243C2 (ru) | 2011-10-20 | 2018-02-08 | Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез | Химерные антигенные рецепторы к cd22 |
| CN104080797A (zh) | 2011-11-11 | 2014-10-01 | 弗雷德哈钦森癌症研究中心 | 针对癌症的靶向细胞周期蛋白a1的t细胞免疫疗法 |
| CN102579452B (zh) | 2012-01-20 | 2014-05-14 | 辽宁思百得医药科技有限公司 | 色胺酮类化合物在制备ido抑制剂中的用途 |
| EP3594245A1 (en) | 2012-02-13 | 2020-01-15 | Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute | Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof |
| WO2013126726A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use |
| US9822058B2 (en) | 2012-04-05 | 2017-11-21 | Chdi Foundation, Inc. | Kynurenine-3-monooxygenase inhibitors, pharmaceutical compositions, and methods of use thereof |
| US9751928B2 (en) | 2012-05-03 | 2017-09-05 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Enhanced affinity T cell receptors and methods for making the same |
| GB201211120D0 (en) | 2012-06-22 | 2012-08-01 | Bessede Alban | Antagonist to an enzyme and/or a metabolite of the kynurenine pathway |
| JP2015527889A (ja) | 2012-07-25 | 2015-09-24 | ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド | 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用 |
| BR112015002816A8 (pt) | 2012-08-20 | 2023-04-18 | Hutchinson Fred Cancer Res | Método e composições para imunoterapia celular |
| CA2886859C (en) | 2012-10-02 | 2022-05-17 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Compositions and methods for immunotherapy |
| EP2906684B8 (en) | 2012-10-10 | 2020-09-02 | Sangamo Therapeutics, Inc. | T cell modifying compounds and uses thereof |
| WO2014097442A1 (ja) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | 三菱電機株式会社 | 車載装置及びプログラム |
| CN103070868B (zh) | 2013-01-08 | 2015-08-19 | 复旦大学 | 一种含nh-1,2,3-三氮唑的ido抑制剂及其制备方法 |
| MX361375B (es) | 2013-03-14 | 2018-12-05 | Newlink Genetics Corp | Compuestos triciclicos como inhibidores de la inmunosupresion mediada por el metabolismo del triptofano. |
| EA201591610A1 (ru) | 2013-03-14 | 2015-12-30 | Курадев Фарма Прайвит Лтд. | Ингибиторы кинуренинового пути |
| AU2014235816B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-17 | Bristol-Myers Squibb Company | IDO inhibitors |
| EA031470B1 (ru) | 2013-03-15 | 2019-01-31 | Бристол-Майерс Сквибб Компани | Ингибиторы ido |
| TWI654206B (zh) | 2013-03-16 | 2019-03-21 | 諾華公司 | 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症 |
| KR102452767B1 (ko) | 2013-05-14 | 2022-10-12 | 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 가공된 키메라 항원 수용체 (ｃａｒ) ｔ-세포의 인간 적용 |
| GB201309421D0 (en) | 2013-05-24 | 2013-07-10 | Imp Innovations Ltd | Polypeptides |
| MX2015017486A (es) | 2013-07-01 | 2016-03-21 | Squibb Bristol Myers Co | Inhibidores de indolamina 2,3-dioxigenasa (dio). |
| US9895330B2 (en) | 2013-07-11 | 2018-02-20 | Bristol-Myers Squibb Company | IDO inhibitors |
| US9108442B2 (en) | 2013-08-20 | 2015-08-18 | Ricoh Company, Ltd. | Image forming apparatus |
| AU2014312119B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-09-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy |
| ES2754473T3 (es) | 2013-09-26 | 2020-04-17 | Chdi Foundation Inc | Inhibidores de quinurenina-3-monooxigenasa, composiciones farmacéuticas, y método de uso de los mismos |
| WO2015082499A2 (en) | 2013-12-03 | 2015-06-11 | Iomet Pharma Ltd | Pharmaceutical compound |
| EP3102237B1 (en) | 2014-02-04 | 2020-12-02 | Incyte Corporation | Combination of a pd-1 antagonist and an ido1 inhibitor for treating cancer |
| ES2939760T3 (es) | 2014-03-15 | 2023-04-26 | Novartis Ag | Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos |
| MX2016013158A (es) | 2014-04-10 | 2017-04-27 | Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Res Institute) | Productos de celulas t modificadas de genes de composicion definida. |
| US10765728B2 (en) | 2014-04-11 | 2020-09-08 | Cellectis | Method for generating immune cells resistant to arginine and/or tryptophan depleted microenvironment |
| WO2015161276A2 (en) | 2014-04-18 | 2015-10-22 | Editas Medicine, Inc. | Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy |
| WO2015168613A2 (en) | 2014-05-02 | 2015-11-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods of chimeric autoantibody receptor t cells |
| GB201413162D0 (en) | 2014-07-24 | 2014-09-10 | Immusmol Sas | Prediction of cancer treatment based on determination of enzymes or metabolites of the kynurenine pathway |
| CN106794176A (zh) | 2014-08-13 | 2017-05-31 | 奥克兰联合服务有限公司 | 色氨酸双加氧酶(ido1和tdo)的抑制剂和其在治疗中的用途 |
| GB201414730D0 (en) * | 2014-08-19 | 2014-10-01 | Tpp Global Dev Ltd | Pharmaceutical compound |
| IL250833B (en) * | 2014-08-29 | 2022-09-01 | Univ Texas | Administering enzymes to reduce the level of kynurenine in the treatment of tumors |
| GB201417369D0 (en) | 2014-10-01 | 2014-11-12 | Redx Pharma Ltd | Compounds |
| WO2016061231A1 (en) | 2014-10-14 | 2016-04-21 | Deciphera Pharmaceuticals, Llc | Inhibition of tumor cell interactions with the microenvironment resulting in a reduction in tumor growth and disease progression |
| EP3215139B1 (en) | 2014-11-03 | 2020-08-19 | Cerus Corporation | Compositions and methods for improved car-t cell therapies |
| WO2016145578A1 (en) * | 2015-03-13 | 2016-09-22 | Syz Cell Therapy Co. | Methods of cancer treatment using activated t cells |
| AU2016297014B2 (en) | 2015-07-21 | 2021-06-17 | Novartis Ag | Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells |
| US10508143B1 (en) | 2015-10-30 | 2019-12-17 | Aleta Biotherapeutics Inc. | Compositions and methods for treatment of cancer |
| US11020429B2 (en) | 2015-11-05 | 2021-06-01 | Juno Therapeutics, Inc. | Vectors and genetically engineered immune cells expressing metabolic pathway modulators and uses in adoptive cell therapy |
| BR112017002594A2 (pt) * | 2015-12-17 | 2017-12-19 | Gilead Sciences Inc | compostos inibidores de cinase de ligação de tank |
| CN105567690B (zh) | 2016-02-02 | 2018-08-10 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 一种抑制ido1表达的抑制剂及其应用 |
| CN109071457A (zh) | 2016-03-09 | 2018-12-21 | 荷兰转化研究中心有限责任公司 | 吲哚胺2,3-双加氧酶的抑制剂 |
| US20210177896A1 (en) | 2016-06-02 | 2021-06-17 | Novartis Ag | Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells |
| SG11201900677SA (en) | 2016-07-28 | 2019-02-27 | Novartis Ag | Combination therapies of chimeric antigen receptors adn pd-1 inhibitors |
| CN110248678A (zh) | 2016-12-03 | 2019-09-17 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 调节car-t细胞的方法 |
-
2017
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2019
- 2019-04-04 IL IL265848A patent/IL265848A/en unknown
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-
2022
- 2022-08-18 JP JP2022130641A patent/JP2022166232A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021049862A1 (ko) * | 2019-09-10 | 2021-03-18 | 고려대학교 세종산학협력단 | 인돌아민 2,3-이산소화 효소를 포함하는 전립선암 진단용 마커 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018071873A3 (en) | 2018-10-04 |
| AU2017343780B2 (en) | 2023-08-31 |
| EP3525803B1 (en) | 2022-12-07 |
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| MA50839A (fr) | 2019-08-21 |
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| JP2019533676A (ja) | 2019-11-21 |
| BR112019006652A2 (pt) | 2019-07-02 |
| ES2939646T3 (es) | 2023-04-25 |
| EP4190335A1 (en) | 2023-06-07 |
| MX2019004181A (es) | 2019-10-30 |
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| US11896615B2 (en) | 2024-02-13 |
| RU2019113778A (ru) | 2020-11-13 |
| MA46649A (fr) | 2019-08-21 |
| AU2017343780A1 (en) | 2019-04-04 |
| EP3525803A2 (en) | 2019-08-21 |
| CA3037387A1 (en) | 2018-04-19 |
| US20200054673A1 (en) | 2020-02-20 |
| JP2022166232A (ja) | 2022-11-01 |
| CN110381963A (zh) | 2019-10-25 |
| PH12019500803A1 (en) | 2019-07-15 |
| RU2019113778A3 (ko) | 2021-07-15 |
| WO2018071873A2 (en) | 2018-04-19 |
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