CN116251088A - 3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肝细胞癌治疗技术领域，具体涉及一种3‑羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用。3‑羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用。本发明探讨了3‑HAA抑制肝癌肿瘤生长的机制，并采用质谱流式细胞术来确定HCC的免疫图谱；3‑HAA治疗不仅能提高CD45+Lin‑F4/80+CD39+CD11c+经典巨噬细胞的比例，降低CD45+Lin‑F4/80‑CD39+CD11c+非经典巨噬细胞的比例，还能调节免疫细胞功能标记物的表达。本发明精确地确定与肝癌相关的特定细胞亚群，3‑HAA疗法将是治疗肝癌的一种有前途的治疗策略。
Description
技术领域
本发明属于肝细胞癌治疗技术领域，具体涉及一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用。
背景技术
肝癌（HCC）是一种高度恶性的癌症，也是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。近5年HCC得生存率和总生存率均较低。大多数HCC发生在肝硬化、慢性肝炎病毒感染、酒精相关肝炎、脂肪性肝炎或药物相关性肝炎的背景下，通常在晚期时诊断确诊，致使其治疗难度较大。因此，非常有必要研究HCC进展的分子机制，并开发出新的预测生物标志物和治疗靶点，以提高HCC患者的生存率。
色氨酸（Tryptophan，Trp）是人体中参与蛋白质合成的必需八大氨基酸之一，也是调节免疫细胞功能的重要能源。色氨酸代谢紊乱可导致免疫细胞凋亡和功能障碍，进而影响HCC免疫治疗的疗效。其中，最重要的是犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）代谢途径，占色氨酸代谢的95%。已有文献报道：Kyn衍生物3-羟基邻氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid，3-HAA）影响T细胞的稳态，可通过激活caspase-8在体外诱导Th1细胞凋亡，不需要Fas/Fas配体相互作用。同样，Terness等人发现3-HAA在体外可以抑制T细胞的增殖和活化。而3-HAA在HCC中的确切作用在很大程度上尚不清楚。
综上所述，探讨3-HAA在抑制肝癌肿瘤生长的机制是非常必要和迫切的。
发明内容
本发明的目的是提供一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-HAA治疗不仅能提高CD45+Lin-F4/80+CD39+CD11c+经典巨噬细胞的比例，而且能降低CD45+Lin-F4/80-CD39+CD11c+非经典巨噬细胞的比例，还能调节免疫细胞功能标记物的表达。本发明精确地确定与肝癌相关的特定细胞亚群，3-HAA疗法将是治疗肝癌的一种有前途的治疗策略。
为了实现以上目的，本发明3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用所采取的技术方案为：
3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用。
优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞CD27呈正相关关系。
进一步优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞PD1呈正相关关系。
优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞CD127a呈负相关关系。
优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与巨噬细胞标记物F4/80的表达呈正相关关系。
进一步优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与巨噬细胞标记物ly6C和CD44的表达呈负相关关系。
优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+F4/80+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+经典巨噬细胞呈正相关关系。
进一步优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+F4/80+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+经典巨噬细胞的比例呈正相关关系。
优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+非经典巨噬细胞呈负相关关系。
进一步优选地，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+非经典巨噬细胞的比例呈负相关关系。
本发明的有益效果：
本发明探讨了3-HAA抑制肝癌肿瘤生长的机制，并采用质谱流式细胞术来确定HCC的免疫图谱。3-HAA治疗不仅能提高CD45+Lin-F4/80+CD39+CD11c+经典巨噬细胞的比例，降低CD45+Lin-F4/80-CD39+CD11c+非经典巨噬细胞的比例，还能调节免疫细胞功能标记物的表达。本发明精确地确定与肝癌相关的特定细胞亚群，3-HAA疗法将是治疗肝癌的一种有前途的治疗策略。
附图说明
图1为质谱流式分析3-HAA治疗对小鼠肝癌所有免疫组分的影响，其中，A为32种免疫细胞亚群表达的细胞标记物的热图；B为所有样本免疫细胞组分的t-SNE图，按照细胞类型着色；C为分布显示两组样本免疫细胞组分的t-SNE图；D为不同细胞亚群所占比例的统计图； E为不同免疫细胞亚型的比例分布图；F-H分别为细胞功能标记物CD27、PD-1 和CD172在两组样本中的t-SNE图和表达量的差异统计分析图；
图2为3-HAA重塑肝癌小鼠瘤内巨噬细胞表型，其中，A为16种髓系细胞亚群胞内和表面标记物的热图；B为髓系细胞亚群的比例分布图；C为各组肿瘤浸润髓系细胞亚群的t-SNE图；D为HCC组和3-HAA治疗组不同髓系细胞亚群所占比例的差异分析图；E为髓系细胞亚群在两组中的比例柱状图；
图3为髓系细胞亚群中不同功能标记物表达差异，其中，A为免疫调节分子CD39在两组样本中表达量的差异图；B为细胞活化标记物CD44在两组样本中表达量的差异图；C和D分别为细胞活化标记物CD44和细胞增殖标记物Ki67在两组样本中表达量的差异图；
图4为3-HAA改变了小鼠肝癌模型瘤内不同巨噬细胞亚群的比例，其中，A为HCC组和3-HAA治疗组不同巨噬细胞亚群所占比例的差异分析图；B为经典和非经典巨噬细胞多色流式分析的代表图和所占比例的统计图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步地限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞CD27呈正相关关系。
实施例2
一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞PD1呈正相关关系。
实施例3
一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-羟基邻氨基苯甲酸与疫细胞CD27和免疫细胞PD1均呈正相关关系。
实施例4
一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞CD127a呈负相关关系。
实施例5
一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-羟基邻氨基苯甲酸与巨噬细胞标记物F4/80的表达呈正相关关系。
实施例6
一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-羟基邻氨基苯甲酸与巨噬细胞标记物F4/80的表达呈正相关关系，3-羟基邻氨基苯甲酸与巨噬细胞标记物ly6C和CD44的表达呈负相关关系。
实施例7
一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+F4/80+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+经典巨噬细胞的比例呈正相关关系。
实施例8
一种3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+非经典巨噬细胞的比例呈负相关关系。
材料与方法
（1）原位肝癌小鼠模型的建立
小鼠肝肿瘤细胞系(Hepa1-6)购买自ATCC，培养在添加10 % FBS (Sigma-Aldrich)的DMEM中，5 % CO2的37 ℃湿度环境中保存。用PBS洗涤hepa1-6细胞后，用PBS重悬细胞。将200 ul康宁基质加入到细胞悬浮液中，1:1混合形成400 ul/2*10^7细胞。最后，细胞悬浮液被放在冰上以备后续使用。
用50 mg/kg戊巴比妥麻醉6周WT C57BL/6J小鼠。用胶布贴在胶板上，将小鼠平卧位固定，腹部消毒。用消过毒的镊子和剪刀切开小鼠腹腔。这一过程被小心地执行，以避免血管上出现任何伤口以及不必要的出血。用无菌棉签取出左肝叶。用500 ul注射器提取混合均匀的细胞悬液10 ul/3*10^5单位，注射至肝左叶。用无菌棉签止血后，缝合小鼠腹部。最后，让小鼠在培养箱中自然醒来。3-HAA购自阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)，以100mg/Kg的剂量腹腔内给药，每日1次，连续14天。
（2）质谱流式细胞技术（CyTOF）
从上述小鼠模型中手术取出新鲜的HCC组织。使用肿瘤解离试剂盒（Miltenyi,Germany, 130-105-807）在组织解离器中消化组织，然后过滤并洗涤细胞以进一步染色。研究中使用的共42种金属同位素标记抗体。在PBS盐溶液中制备终浓度为0.25 uM 194Pt（1mM）的死活染色溶液，取100 uL 194Pt死活染色溶液重悬细胞，在冰上染色5分钟（每个样品100 uL）。每个样品加入1 mL FACS Buffer（1.25 % BSA in PBS, BD Bioscience, NewJersey, USA），4 ℃，400 g，5分钟，弃上清。向每个样品中加入50 uL的Block mix，重悬细胞，并在冰上封闭20分钟。孵育后直接加入抗体混合物。通过轻轻吹打混合细胞并在冰上染色30分钟。使用Fix and Perm Buffer配制终浓度为250 nM的染色液，从每个样品中取出200 uL重悬细胞，室温放置1小时。所有CyTOF数据都在FlowJo（版本10）中进行了标准化和手动门控。圈出单个完整的所有活细胞，并标记CD45+免疫细胞。对x-shift算法进行了细胞亚群聚类、注释、tSNE降维可视化和统计分析。
（3）流式细胞技术
将小鼠肿瘤组织使用肿瘤分离试剂盒(Miltenyi Biotec, Germany)在组织分离器中消化组织。制备单细胞悬液以后与抗小鼠抗体CD45-FITC、LIN-(CD3-PE、CD19-PE、CD49B-PE、GR-1-PE、SiglecF-PE)、F4/80-BV421、CD11c-PE-CY7、CD39-BV711进行避光孵育15分钟。加入1 mlPBS后混匀，500g,10分钟离心去上清；最后加入7-AAD染色5分钟后上机。使用Fortessa细胞分析仪进行流式细胞术检测。
结果与分析
（1）质谱流式分析3-HAA治疗对小鼠肝癌免疫组分的影响
为了更好地理解3-HAA治疗对肿瘤免疫组分的影响，本申请从HCC模型组和接受3-HAA治疗组的小鼠中收集HCC组织，并用质谱流式分析肿瘤浸润免疫细胞特征，其测试结果如图1所示。
本申请混合了来自所有样本的免疫细胞，并用表面和功能标记进行聚类分析。如图1A所示，32个细胞集群分别为：CD4+TN C01（简称C01），CD8+TN C02（简称C02），CD4+TEC03（简称C03），CD4+Treg C04（简称C04），CD4+TE C05（简称C05），CD4+TE06（简称C06），Bcells C07（简称C07），B cells C08（简称C08），B cells C09（简称C09），DC C10（简称C10），B cells C11（简称C11），MoMF C12（简称C12），MoMF C13（简称C13），MoMF C14（简称C14），NKC15（简称C15），NK C16（简称C16），Others C17（简称C17），Neutrophils C18（简称C18），Eosinophils C19（简称C19），Eosinophils C20（简称C20），Eosinophils C21（简称C21），MoMF C22（简称C22），MoMF C23（简称C23），MoMF C24（简称C24），NK C25（简称C25），NK C26（简称C26），pDC C27（简称C27），Others（简称C28），gdT（简称C29），CD8+T（简称C30），CD8+TNC31（简称C31），CD8+TN（简称C32）。
此外，使用tSNE散点图来展示上述32个细胞集群结构，用表型图方法分析HCC模型组和接受3-HAA治疗组小鼠的细胞丰度和多样性。如图1B和图1C所示，免疫细胞集群在tSNE散点图中如预期出现CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、DC、NK、中性粒细胞、pDC、gdT、Mfmo和嗜酸性粒细胞。由图1D和图1E可知，虽然3-HAA治疗组与未治疗组间T细胞、B细胞、DN细胞、NK细胞、中性粒细胞等大细胞亚群数量无统计学差异，但研究发现：3-HAA治疗组免疫细胞CD27、PD1的功能制造者较HCC组增加；由图1F和图1G所示可知，而免疫细胞CD127a减少（如图1H所示）。
综上所述：3-HAA可能通过调节免疫细胞功能影响肝癌的进展。
（2）3-HAA对小鼠肝癌模型中经典巨噬细胞的影响
髓系细胞是实体肿瘤的重要细胞成分，包括许多不同的细胞亚型，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。值得注意的是，髓系细胞具有高度的可塑性，可以分化为多种表型，包括免疫抑制型和免疫刺激型。
本申请使用CyTOF分析进一步分析髓系来源细胞亚群的变化，其结果如图2A和图2B所示。由图2C和图2D可知，t-SNE图显示HCC组和3-HAA治疗组之间有显著差异。通过比较两组细胞标记物的表达，结果发现3-HAA可以显著增加F4/80（巨噬细胞标记物）的表达，而降低ly6C和CD44标记物的表达，由图2E可知。
为了进一步研究不同亚群的功能，本申请比较了16个巨噬细胞亚群之间的功能标志物(CD39、CD44、CD172a和Ki67)的差异，结果显示不同巨噬细胞亚群在增殖和激活方面存在明显的功能异质性, 如图3所示。
（3）CyTOF对HCC组和3-HAA治疗组HCC的免疫表征
通过比较两组间的亚群百分比，发现了2个差异显著的巨噬细胞亚群，包括CD45+F4/80+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+经典巨噬细胞CD45+F4/80-CD64+CD39+ CD11b+CD11c+非经典巨噬细胞（如图4A所示）。
为了进一步验证CyTOF的结果，本申请进行了流式细胞术分析。3-HAA可显著增加CD45+F4/80+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+PDL+经典巨噬细胞的比例，并降低CD45+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+非经典巨噬细胞的比例（如图4B、图4C和图4D所示）。
以上研究结果表明，3-HAA可通过上调经典巨噬细胞和下调非经典巨噬细胞发挥抗肿瘤作用。
本发明探讨了3-HAA抑制肝癌肿瘤生长的机制，并采用质谱流式细胞术来确定HCC的免疫图谱。3-HAA治疗不仅能提高CD45+Lin-F4/80+CD39+CD11c+经典巨噬细胞的比例，降低CD45+Lin-F4/80-CD39+CD11c+非经典巨噬细胞的比例，还能调节免疫细胞功能标记物的表达。本发明精确地确定与肝癌相关的特定细胞亚群，3-HAA疗法将是治疗肝癌的一种有前途的治疗策略。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用。
2.根据权利要求1所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞CD27呈正相关关系。
3.根据权利要求1或2所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞PD1呈正相关关系。
4.根据权利要求1所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与免疫细胞CD127a呈负相关关系。
5.根据权利要求1所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与巨噬细胞标记物F4/80的表达呈正相关关系。
6.根据权利要求1或5所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与巨噬细胞标记物ly6C和CD44的表达呈负相关关系。
7.根据权利要求1所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+F4/80+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+经典巨噬细胞呈正相关关系。
8.根据权利要求7所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+F4/80+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+经典巨噬细胞的比例呈正相关关系。
9.根据权利要求1或7所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+非经典巨噬细胞呈负相关关系。
10.根据权利要求9所述的3-羟基邻氨基苯甲酸在抑制肝癌生长中的应用，其特征在于，所述3-羟基邻氨基苯甲酸与CD45+CD64+CD39+CD44+CD11b+CD11c+非经典巨噬细胞的比例呈负相关关系。
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