CN103070868B - 一种含nh-1,2,3-三氮唑的ido抑制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物合成技术领域，具体涉及一种含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂及其制备方法。本发明以含有乙炔基的抗肿瘤药物厄洛替尼(Erolotinib)为原料，在亚铜催化下，与叠氮基三甲基硅烷或对甲苯磺酰叠氮反应后，引入一个NH-1,2,3-三氮唑基团，合成新型含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂。本发明合成的新型1,2,3-三氮唑可作为高效IDO抑制剂，可望应用于治疗具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，该类疾病至少包括肿瘤性疾病、癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、白内障、心境障碍、抑郁症、焦虑症。本发明方法具有操作简单、条件温和、成本低廉、收率高等优点，具有广阔应用前景，易于工业化生产。

Description

一种含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于药物及中间体合成技术领域，具体涉及一种含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂及其制备方法。

背景技术

吲哚胺2，3-双加氧酶（Indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO）是一种细胞内含有亚铁血红素的酶，是肝脏以外唯一可催化色氨酸代谢使其沿犬尿氨酸途径分解生成包括喹啉酸在内的一系列代谢产物的限速酶（MacKenzie, C. R. et. al. Current Drug Metabolism, 2007, 8: 237-244）。

IDO与很多生理病理过程有关。对怀孕小鼠模型的研究发现母胎界面的合胞体滋养层细胞和抗原提呈细胞可以合成IDO并且IDO表达的动态变化与胚胎形成一致，如果特异性阻断IDO的作用，则可导致小鼠流产，表明IDO 可以使胎儿免于母体的排斥，维持母胎界面免疫偏离的形成（David, H. M.; et al., Science, 1998, 281: 5380）。说明IDO与机体免疫系统的免疫耐受有关，是一种免疫调节酶。IDO与肿瘤细胞逃避机体免疫系统对其监视和杀伤的免疫逃逸现象有关。Uyttenhove等发现多种人实体肿瘤细胞 (宫颈癌、胃癌、结肠癌、黑素瘤和胰腺癌等) 高表达IDO使局部T 细胞的增殖受抑, 从而介导肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击（Uyttenhov, C, et al. Nat Med, 2003, 9: 1269-1274）。IDO参与调节T细胞的反应。T细胞对色氨酸耗竭特别敏感，当色氨酸浓度较低时，T细胞增殖就会静止在G1期，IDO通过降解色氨酸，可切断T细胞的活化。基于这种机制，IDO保护胎儿免受母体排斥，也介导了肿瘤免疫逃逸。

色氨酸代谢的犬尿氨酸途径异常, 通常伴随着IDO 活性的提高和喹啉酸水平的上调，与神经系统炎症和神经退行性紊乱密切相关(Heyes, M. P., et al., Brain, 1992, 115: 1249-1273)。直接和间接地证据都表明IDO 和犬尿氨酸途径在阿尔茨海默病的发病机制中发挥重要作用(Guillemin, G.J. et al. Redox Rep 2002, 7, 199–20; Stone, T.W., et al., J. Alzheimers Dis. 2001, 3: 355–66)。阿尔茨海默病患者血液中的色氨酸浓度与其认知缺陷的程度成负相关(Widner B, et al., Adv Exp Med Biol 1999, 467: 133–8), 血清中犬尿氨酸浓度高于正常人，而且升高的程度与认知缺陷的水平密切相关(Baran H, et al., J. Neural Transm 1999, 106:165–81; Widner B, et al., J Neural Transm  2000, 107: 343–53)。阿尔茨海默病患者大脑中IDO含量比正常人丰富：IDO 和喹啉酸在阿尔茨海默病患者海马体皮质层的小胶质细胞、星形细胞及神经元细胞中均有表达，在老年斑周围的小胶质细胞、星形细胞中含量最高(Guillemin, G. J. et al., Neuropathology and Applied Neurobiology 2005, 31: 395–404)。β淀粉样多肽Aβ(1-42)能够激活原代培养的人小胶质细胞，诱导IDO 的表达(Guillemin G. J., et al., Neuro Report 2003, 14: 2311-2315; Walker D. G.,et al., J. Leukoc. Biol. 2006, 79: 596-610)。

干扰素γ可诱导IDO的表达，在高水平干扰素γ刺激的持续活化期间，IDO降低了游离血清色氨酸的利用度。因而，也降低了5-羟色胺的产生。与诸如喹啉酸的具有神经活性的犬尿氨酸代谢物的蓄积相结合的这些变化有助于神经病学、精神病学病症的发生，而且是多种心境障碍的因素，也是具有IDO活化和色氨酸降解特征的一些慢性病相关症状的因素，所述慢性病例如获得性免疫缺陷综合症（AIDS）、多种类型抑郁症、阿尔茨海默病和癌症(Schroecksnadel K., et al., Clin Exp Immunol. 2005, 140(1): 41–45)。

IDO活性还涉及与年龄相关的核性白内障的发生。IDO是晶状体中紫外线滤器生物合成中的第一个酶，并且是限速酶。来自色氨酸降解的紫外线滤器化合物（犬尿氨酸和3-羟基犬尿氨酸葡萄苷）修饰存在于人晶状体中的蛋白质。这些紫外线滤器化合物的量随年龄而增加, 并且这些紫外线滤器化合物会导致与年龄相关的核性白内障的晶状体逐渐浑浊(Takikawa O, et al., Exp Eye Res. 2001, 72(3): 271-7)。

IDO抑制剂可以治疗肿瘤。已有研究表明目前公认的IDO抑制剂1-甲基色氨酸（1-MT）在体外能增强肿瘤细胞对T细胞的免疫刺激的敏感性，在体内的动物模型中能延缓肿瘤细胞的生长并增强化疗药物的抗肿瘤效果，而且对几乎所有的自发性肿瘤起作用(Friberg M, et al. Int J Cancer, 2002, 101: 151-155)。IDO抑制剂可以治疗心境障碍以及其他具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括：AIDS、神经退行性疾病（阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病）、抑郁症、白内障、与年龄相关的黄化以及自身免疫性疾病。

三氮唑类杂环化合物具有广泛的生物活性，在医学、农业和材料等领域有着广阔应用前景，一直以来备受药物化学家和生物化学家的重视。其中1,2,3-三氮唑化合物是近年来逐渐发展起来的，在抗菌、杀菌、免疫、治疗肿瘤、关节炎、软骨病、神经性精神错乱等方面有显著的作用(Michael J. G, et al. J. Med. Chem.,  2000, 43, 953-970)。

1,2,3-三氮唑化合物是一类重要的杂环化合物(Alvarez R, et al. J. Med. Chem., 1994, 37, 4185-4194)，化合物中的五元杂环作为药效基团比咪唑具有更低的毒性，已被广泛应用于有机化学、药物化学、材料化学及生物化学等领域。特别在药物化学方面，含有三氮唑环结构的化合物呈现出多种生物活性(Tron G. C, et al. Med. Res. Rev., 2008, 28, 278-308)，可用于合成HIV-I (Alvarez R, et al. J. Med. Chem., 1994, 37, 4185-4194; Matthew W, et al. J. Med. Chem., 2006, 49, 7697-7710; Giffin M. J, et al. J. Med.Chem., 2008, 51, 6263–6270; Cho J. H, et al. J. Med. Chem.,2006, 49, 1140-1148)、抗肿瘤(Kallander L. S, et al. J. Med. Chem., 2005, 48, 5644-5647)、抗真菌(Reck F, et al. J .Med. Chem., 2005, 48, 499-506)和抗惊厥等药物 (Scheme 1)。1,2,3-三氮唑化合物的合成近年来受到有机合成和药物化学研究者的高度重视。

l,2,3-三氮唑类结构作为一种重要的活性结构单元，在医药、农药和有机化工等领域已得到广泛应用。特别是在药物化学领域，l,2,3-三唑常作为主要的药效基团，在先导化合物的优化或候选药物的结构改造中被引入，常引起药理活性的增强。由于其良好的药理活性，近十年来已迅速成为药学研究领域的热点之一。目前已研制成功的l,2,3-三唑类药物有β-内酰胺酶抑制剂—他唑巴坦(Tazobactam)。他唑巴坦是一个青霉素的衍生物，是继克拉维酸、舒巴坦之后第三个应用于临床的β-内酰胺酶抑制剂，其抑制活性较前两者有了很大提高(Micetich R, et al. J. Med. Chem., 1987, 30, 1469-1474)。研究还发现，很多l,2,3-三唑化合物可以有效抑制肿瘤的转移和侵入，并且具有高效、低毒等特点，生理活性比结构修饰前大大提高。

厄洛替尼(Erolotinib)是一种表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor ) 酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhabitor）。厄洛替尼通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶胞内自身磷酸化，从而抑制了下游信号传导与细胞增殖。表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor , EFGR)是ErbB之一，具有酪氨酸酶活性，是一种重要的跨膜受体。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化、凋亡，EGFR的信号传导关乎细胞的凋亡/增殖、分化、迁移和细胞周期循环，其异常高表达常见于多种恶性肿瘤，与肿瘤的形成和恶化息息相关，已成为阳性表达肿瘤的治疗靶标，近年来受到研究者们的关注。通过对EGFR结构的分析，选择其特点部位作为靶点，干扰EGFR的信号传导。在头颈部鳞癌( HNSCC )与非小细胞肺癌的肿瘤体外移植瘤模型中，厄洛替尼通过抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤作用。厄洛替尼是目前唯一被证实的对晚期非小细胞肺癌具有生存优势的GER1/EGFR 酪氨酸激酶抑制剂，对各类别非小细胞肺癌患者均有效，且耐受性好，无骨髓抑制和神经毒性，能显著延长生存期，已经成为不少研究者的焦点。厄洛替尼可抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶细胞内磷酸化，用于治疗少1次化疗失败的局限性晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）。

含有乙炔基的抗肿瘤药物厄洛替尼(Erolotinib)结构为：

厄洛替尼 (Erolotinib, 特罗凯)

本发明方法以厄洛替尼为原料，引入一个三氮唑药效基团，合成新型含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂，以寻找有应用价值的IDO抑制剂。本发明合成的含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等药理活性，有广阔的应用前景。本发明方法具有操作简单、条件温和、收率高等优点，易于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂及其制备方法。

本发明提出的一种含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂，其结构通式如下：

I

厄洛替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制酸化，抑制下游信号传导与细胞增殖。用于治疗少1次化疗失败的局限性晚期或转移性非小细胞肺癌。美国FDA于2005年9月13日批准其用于胰腺癌的治疗。

本发明提出的含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂的制备方法，以厄洛替尼为原料，与三甲基硅烷叠氮或对甲苯磺酰叠氮，在亚铜催化下得到新型含NH-1,2,3-三氮唑化合物（I）。其合成路线为：

1                              2                            3

4                                   5

6                                  7

           I

具体步骤如下：

向干燥的圆底烧瓶中加入厄洛替尼、DMF/MeOH混合溶液、CuI、叠氮基三甲基硅烷（TMSN₃），反应温度为20-120^oC；反应时间为5-24h；其中：厄洛替尼与TMSN₃摩尔比为1：0.9～1：1.1；厄洛替尼与CuI摩尔比为1：0.1～1：0.6；DMF/MeOH的体积比为1：1～10：1。

或者：向干燥的圆底烧瓶中加入厄洛替尼、DMF与MeOH组成的混合溶液、CuI、对甲苯磺酰叠氮（TosN₃），其中厄洛替尼与TosN₃摩尔比为1：0.9～1：1.1；厄洛替尼与CuI摩尔比为1：0.1～1：0.6；DMF与MeOH的体积比为1：1～10：1；温度20-120^oC；时间5-24h。

本发明提出的含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂，其在制备治疗具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病的药品中的应用，该类疾病至少包括肿瘤性疾病、癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、白内障、心境障碍、抑郁症、焦虑症。

本发明公开的三氮唑衍生物可作为IDO抑制剂, 可以用于具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括癌症、艾滋病、阿尔茨海默病、抑郁症和白内障等重大疾病的治疗。三氮唑衍生物合成路线具有原料易得、操作简便、反应条件温和、反应时间短、节省溶剂和减少污染等优点，便于工业化生产。

具体实施方式

下述通过实施例进一步说明本发明，但不能限制本发明的内容。

实施例1：厄洛替尼（7）的制备

(1)、3,4-二(2-甲氧基乙氧基)苯甲酸乙酯（2）的合成

                         1                                 2

3,4-二羟基苯甲酸乙酯(1, 27.3g, 150mmol)、化合物1-氯-2-甲氧基乙烷(42.3g, 450mmol) 、无水丙酮(250mL)、三乙基苄基溴化铵(3.4g, 15mmol)、KI(8.3g, 50mmol)和无水碳酸钾(40g, 300mmol)加入到500mL反应瓶中，通氮气保护，在80℃左右回流72 h，冷却至室温，抽滤，用丙酮洗滤饼(125mL×2)，滤液经减压蒸馏去除丙酮，得158g油状物，加入石油醚，在0～5℃下重结晶得白色棉花状固体3,4-二（2-甲氧基乙氧基）苯甲酸乙酯（2）41.57g，收率93.2%。

(2)、4, 5-二(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯甲酸乙酯（3）的合成

2                           3

用30mL的乙酸溶解3,4-二（2-甲氧基乙氧基）苯甲酸乙酯（2, 14.9g, 50mmol），在0℃冰浴下加入20mL 65%浓HNO₃，滴定完毕后撤去冰浴，在室温下反应24h，随后用饱和碳酸钠溶液中和，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去溶剂得深红色油状液体4, 5-二(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯甲酸乙酯（3）14.75g，产率为86.1%。

(3)、4, 5-二(2-甲氧基乙氧基)-2-氨基苯甲酸乙酯（4）的合成

3                      4

将4, 5-二(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯甲酸乙酯（3, 14.75，43.05mmol）加入40ml 95%乙醇溶液中，加入10mL的乙酸，随后加入5倍摩尔当量的还原铁粉，在80℃下回流反应12h，随后滤去铁粉，旋蒸除去溶液中乙醇，利用乙酸乙酯萃取三遍，合并后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去溶剂得灰黑色油状液体化合物4, 5-二(2-甲氧基乙氧基)-2-氨基苯甲酸乙酯（4）。

(4)、6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-3-喹唑啉-4-酮（5） 的合成

4                                5

将4, 5-二(2-甲氧基乙氧基)-2-氨基苯甲酸乙酯（4, 6.26g, 20mmol）溶于甲酰胺（30mL）中，将温度升至160℃反应12h，反应完成后降至室温，随后冷却至0℃后溶液析出固体， 过滤后利用甲醇冲洗，真空干燥得3.56g灰白色固体6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-3-喹唑啉-4-酮（5），收率为64.0%。

(5)、4-氯-6, 7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉 （6） 的合成

5                            6

将6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-3-喹唑啉-4-酮（2.78,10mmol）加入30mL氯化亚砜中，并滴加1mL DMF，温度升到80℃，回流反应3h。将事先准备好的饱和碳酸氢钠溶液置于冰浴中，温度降至0℃附近。待反应完成后，减压蒸馏除去未反应的氯化亚砜，将二氯甲烷加入到上述减压蒸馏后的黄色油状液体中，并将溶液转移至冰碳酸氢钠溶液，以中和残留的氯化亚砜和氯化氢，待稳定分层，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，旋蒸后得2.56g黄色固体4-氯-6, 7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉（6），收率为82.0%

(6)、N-(3-乙炔苯基)-6,7-双(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺（7）的合成

6                                    7                  

将2.56g 4-氯-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉溶50mL异丙醇，并加入吡啶 （1.94g，24.54mmol），间氨基苯乙炔（1.06g，9mmol），在氮气保护下，温度升至80℃，回流反应约1h后，反应液变为深红色悬浊液体，过滤，用异丙醇冲洗滤饼，得到粉红色固体。随后取粉红色固体加入到CH₂C1₂-H₂O(25mL/25mL)中，滴25%氨水碱化，水相用CH₂Cl₂萃取3次，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸去溶剂得黄色晶体，用乙酸乙酯研磨得到3.06g N-(3-乙炔苯基)-6,7-双(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺，即为白色晶体厄洛替尼(7)，收率为95.35%。核磁数据：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.59 (s, 1H), 7.82(s, 1H), 7.69(d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.37(s, 1H), 7.23 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.18 (d, 1H, J =7.2 Hz), δ7.06 (s, 1H), 4.06 (s, 4H), 3.68 (s, 2H)，3.63 (s, 2H), 3.32(s, 3H), 3.29(s, 3H)。

实施例2：含NH-1,2,3-三氮唑化合物（I）的合成

7                                     I

将厄洛替尼（7）（80mg，0.2mmol）加入到2mL DMF/MeOH（9/1）混合溶液中，加入10mgCuI，0.3mmol TMSN₃，氮气保护，温度升至125 ℃，反应50min，用乙酸乙酯和水萃取反应液，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后，粗产物经柱层析（展开剂为二氯甲烷/甲醇=10/1）得到含NH-1,2,3-三氮唑化合物（I）。核磁数据：¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 9.66 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.90(d, 1H, J = 6.0 Hz), 7.60 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 7.48 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.23 (s, 1H), 4.31 (m, 4H), 3.80 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 3.76 (t, 2H, J = 4.4 Hz), 3.38 (s, 3H), 3.36(s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 156.93 (s), 154.15 (s), 153.26 (s), 148.61 (s), 140.45 (s), 129.51 (s), 121.42 (s), 121.36 (s),121.32 (s), 119.73 (s), 109.37 (s), 108.41 (s), 103.78 (s), 70.59 (s), 70.53 (s), 68.87 (s), 68.54 (s), 58.87 (s), 58.82 (s), 55.38 (s)。

实施例3：含NH-1,2,3-三氮唑化合物（I）的合成

7                                     I

将厄洛替尼（7）（80mg，0.2mmol）加入到2mL DMF/MeOH（9/1）混合溶液中，加入10mgCuI，0.3mmol TosN₃，氮气保护，温度升至100 ℃，反应12h，用乙酸乙酯和水萃取反应液，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后，粗产物经柱层析（展开剂为二氯甲烷/甲醇=10/1）得到含1,2,3-三氮唑化合物（I）。核磁数据：¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 9.66 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.90(d, 1H, J = 6.0 Hz), 7.60 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 7.48 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.23 (s, 1H), 4.31 (m, 4H), 3.80 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 3.76 (t, 2H, J = 4.4 Hz), 3.38 (s, 3H), 3.36(s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 156.93 (s), 154.15 (s), 153.26 (s), 148.61 (s), 140.45 (s), 129.51 (s), 121.42 (s), 121.36 (s),121.32 (s), 119.73 (s), 109.37 (s), 108.41 (s), 103.78 (s), 70.59 (s), 70.53 (s), 68.87 (s), 68.54 (s), 58.87 (s), 58.82 (s), 55.38 (s)。

实施例4：IDO抑制活性检测

含人IDO基因的质粒的构建、在大肠杆菌中的表达、提取及纯化均按Littlejohn等报道的方法进行（Takikawa O, Kuroiwa T, Yamazaki F, et al. J. Biol. Chem. 1988，263, 2041-2048）。各化合物对IDO的抑制活性按文献介绍的方法检测。在96孔板上将50 mM 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5)，40 mM 维生素C，400 μg/ml 过氧化氢酶，20 μM亚甲基蓝和IDO酶混合。向上述混合液内加入底物L-色氨酸和待测样品。反应在37℃下进行60分钟, 加入30% (w/v) 三氯乙酸使反应终止。96孔板在65℃下加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后6000g旋转5分钟。每孔取出100μl上清液转移到新的96孔板内，加入2%(w/v) 对-(二甲基氨基) 苯甲醛的乙酸溶液，犬尿氨酸与之反应产成的黄颜色可使用酶标仪在490nm观测。

实施例5：是否为可逆抑制剂的判定

在固定抑制剂浓度的情况下，用一系列不同浓度的酶与抑制剂反应并测定反应速度。以反应速度对酶浓度(ν～[E])作图，根据曲线的特征可以判定是否是可逆抑制剂。

反应条件：在500 μl的反应体系中，先加入50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），40 mM维生素C，400 μg/ml 过氧化氢酶，20 μM亚甲基蓝，300 mM底物L-色氨酸或同时加入100 mM抑制剂，混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内分别加入不同体积的IDO酶，反应在37℃下进行30分钟，加入30%（w/v）三氯乙酸200 μl使反应终止，反应体系在65 ℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm旋转10分钟，取上清与等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶标仪检测490 nm波长读数。以ν～[E]做图。

实施例6：抑制剂类型判断及Ki值测定

在500 μl的反应体系中， 先加入50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），40 mM维生素C，400 μg/ml 过氧化氢酶，20 μM亚甲基蓝，分别加入100、250、300 mM底物L-色氨酸，在一个底物浓度下，向各管反应体系中分别加入不同浓度的化合物，混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内加入10 μl IDO (约20 nM)，反应在37℃下进行30分钟，加入30%（w/v）三氯乙酸200 μl使反应终止，反应体系在65℃水浴加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm离心10分钟，取上清与等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混匀反应，用酶标仪检测490nm波长读数。以Dixon作图法（1/v~[I]）判定化合物的抑制剂类型，以S/v~[I]作图，得到抑制剂的Ki值。

实施例7：半数有效抑制浓度IC₅₀的测定

先将50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），40 mM维生素C，400 μg/ml 过氧化氢酶，20 μM亚甲基蓝，底物L-色氨酸150 mM和抑制剂混合。抑制剂浓度选用100，200，400，600，800，1000，1200 μM混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内加入IDO酶。反应在37℃下进行30分钟，加入30%（w/v）三氯乙酸200 μl使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm旋转10分钟，取200 μl上清与等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在490 nm检测，所得结果利用IC₅₀计算软件计算。

实施例8：细胞水平半数有效抑制浓度IC₅₀测定

利用脂质体Lipofectamin2000介导质粒pcDNA3.1-hIDO瞬转HEK 293细胞。细胞水平抑制剂活性测定采用的HEK 293细胞培养基为高糖DMEM，含50 U/mL青霉素， 50 U/mL 链霉素，10% FBS，37 ℃，5% CO₂培养。细胞转染质粒24 h后，加入待测化合物，孵育一段时间后，取上清到另一96孔板中，加入10 μL 30%（w/v）三氯乙酸，在65 ℃加热15 min使之完成甲酰犬尿氨酸向犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm离心10 min，取等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合显色，最后采用酶标仪在490 nm下检测吸光值。

利用上述方法，对NH-1,2,3-三氮唑化合物（I）的IDO抑制活性进行测定，并用目前体内外实验中通用的IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT，市售)作为对照物，各项指标如下。

上述实施例中合成含NH-1,2,3-三氮唑化合物（I）的IDO抑制活性如下：

ND: Not Detected。

Claims (4)

1.一种含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂，其特征在于结构通式如下：

                      I                              。

2.一种如权利要求1所述的含NH-1,2,3-三氮唑的IDO抑制剂的制备方法，其特征在于其合成路线为：

I

具体步骤如下：

向干燥的圆底烧瓶中加入厄洛替尼、DMF与MeOH组成的混合溶液、CuI、叠氮基三甲基硅烷（TMSN₃），在100-120^oC温度下；反应5-24h；其中：厄洛替尼与TMSN₃摩尔比为1：0.9～1：1.1；厄洛替尼与CuI摩尔比为1：0.1～1：0.6；DMF与MeOH的体积比为9：1；

或者：向干燥的圆底烧瓶中加入厄洛替尼、DMF与MeOH组成的混合溶液、CuI、对甲苯磺酰叠氮（ToSN₃），其中厄洛替尼与TosN₃摩尔比为1：0.9～1：1.1；厄洛替尼与CuI摩尔比为1：0.1～1：0.6；DMF与MeOH的体积比为9：1；温度100-120^oC；时间5-24h。

3.权利要求1所述的化合物作为IDO抑制剂在制备治疗具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病的药品中的用途。

4.权利要求3所述的用途，该类疾病为癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、白内障、心境障碍、抑郁症或焦虑症中任一种。