JP7440489B2 - Ｔａｇ７２陽性腫瘍治療のためのｔａｇ７２標的化キメラ抗原受容体修飾ｔ細胞 - Google Patents
Ｔａｇ７２陽性腫瘍治療のためのｔａｇ７２標的化キメラ抗原受容体修飾ｔ細胞 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7440489B2 JP7440489B2 JP2021505687A JP2021505687A JP7440489B2 JP 7440489 B2 JP7440489 B2 JP 7440489B2 JP 2021505687 A JP2021505687 A JP 2021505687A JP 2021505687 A JP2021505687 A JP 2021505687A JP 7440489 B2 JP7440489 B2 JP 7440489B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- tag72
- car
- nucleic acid
- acid molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 124
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 94
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 title claims description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 37
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 37
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 123
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 88
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 65
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 42
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 39
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 23
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 13
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 7
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 131
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 68
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 56
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 53
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 48
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 35
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 30
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 22
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 21
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 16
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 14
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 13
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 13
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 12
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 description 12
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 11
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 10
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 9
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 9
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 9
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 8
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 7
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 7
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 102100035389 2'-5'-oligoadenylate synthase 3 Human genes 0.000 description 5
- 101100330285 Arabidopsis thaliana OASA2 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 5
- 101000597332 Homo sapiens 2'-5'-oligoadenylate synthase 3 Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 208000007571 Ovarian Epithelial Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 3
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000011198 co-culture assay Methods 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 2
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 2
- RMINQIRDFIBNLE-NNRWGFCXSA-N O-[N-acetyl-alpha-neuraminyl-(2->6)-N-acetyl-alpha-D-galactosaminyl]-L-serine Chemical compound O1[C@H](OC[C@H](N)C(O)=O)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1CO[C@@]1(C(O)=O)O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C1 RMINQIRDFIBNLE-NNRWGFCXSA-N 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RPROHCOBMVQVIV-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydro-1h-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1CCNC2 RPROHCOBMVQVIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150018757 CD19 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 101001024605 Homo sapiens Next to BRCA1 gene 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 101710112634 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100020793 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100508818 Mus musculus Inpp5k gene Proteins 0.000 description 1
- CZOGCRVBCLRHQJ-WHWAGLCYSA-N N-acetyl-alpha-neuraminyl-(2->6)-N-acetyl-alpha-D-galactosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@@H](O)O[C@@H]1CO[C@@]1(C(O)=O)O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C1 CZOGCRVBCLRHQJ-WHWAGLCYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101100366438 Rattus norvegicus Sphkap gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYRDHEJRPVSJFM-VSWVFQEASA-N [(1s,3r)-3-hydroxy-4-[(3e,5e,7e,9e,11z)-11-[4-[(e)-2-[(1r,3s,6s)-3-hydroxy-1,5,5-trimethyl-7-oxabicyclo[4.1.0]heptan-6-yl]ethenyl]-5-oxofuran-2-ylidene]-3,10-dimethylundeca-1,3,5,7,9-pentaenylidene]-3,5,5-trimethylcyclohexyl] acetate Chemical compound C[C@@]1(O)C[C@@H](OC(=O)C)CC(C)(C)C1=C=C\C(C)=C\C=C\C=C\C=C(/C)\C=C/1C=C(\C=C\[C@]23[C@@](O2)(C)C[C@@H](O)CC3(C)C)C(=O)O\1 UYRDHEJRPVSJFM-VSWVFQEASA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000005918 in vitro anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002642 intravenous therapy Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- UTIQDNPUHSAVDN-UHFFFAOYSA-N peridinin Natural products CC(=O)OC1CC(C)(C)C(=C=CC(=CC=CC=CC=C2/OC(=O)C(=C2)C=CC34OC3(C)CC(O)CC4(C)C)C)C(C)(O)C1 UTIQDNPUHSAVDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000011363 radioimmunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010242 retro-orbital bleeding Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical class [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/46447—Mucins, e.g. MUC-1
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70514—CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70521—CD28, CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/892—Reproductive system [uterus, ovaries, cervix, testes]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本開示は、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変されたＴ細胞、処方方法、及びＴＡＧ７２陽性細胞に対して選択的な抗がん剤として用いる方法に関する。
ＣＤ１９陽性Ｂ細胞悪性腫瘍患者におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞治療は、めざましい臨床反応を示し、最近、白血病及びリンパ腫患者に対する２つの画期的なＦＤＡ承認（非特許文献１及び２）が得られた。当該研究は、ＣＡＲ 極めて難治性疾患の症状であっても、がん患者におけるＴ細胞を、持続的及び完全奏効を誘導するように最適化しうることを示す。固形がんに対する効果的なＣＡＲ Ｔ細胞療法の開発における主な障害は、腫瘍抗原を真に制限できないための、腫瘍外でのオンターゲット毒性の回避、及びＴ細胞の持続性と腫瘍トラフィッキングにより制限された持続的応答の達成である。（非特許文献３及び４）。これまで、ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を指向する腫瘍抗原の大部分は、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、及びＩＬ１３Ｒα２（非特許文献３及び５）があげられるが、これらに限定されない、過剰発現タンパク質を標的としてきた。当該分野はまだ発展途上であるが、固形腫瘍における当該タンパク質を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞の臨床的効能はやや限定されており（非特許文献６）、さらなる標的の同定及び限定されたＴ細胞耐久性への対処が、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の成功を阻む顕著な問題であり続けている。
腫瘍上の細胞表面タンパク質の異常なグリコシル化は、長い間、腫瘍の発生に関与し、かつ、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、免疫療法の魅力的な標的である固有の糖タンパク質の特徴であった（非特許文献７及び８）。結腸、乳房、膵臓、及び卵巣を含む複数のがん種は、ムチンＭＵＣ１６及びＭＵＣ１、並びに腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ７２）を含む、糖タンパク質を過剰発現することが知られており、（非特許文献９）、これは、正常上皮と区別される。ＴＡＧ７２は、セリン及びトレオニン残基に大量のＯ－グリコシド結合がある、高分子量ムチンである（非特許文献１０）。当該３つの抗原の同時染色により、卵巣がんのほぼ１００％が同定され、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６の高発現が卵巣がん患者組織標本で示された（非特許文献１１）。重要なことに、上皮性卵巣がんの約９０％はＴＡＧ７２陽性であり、卵巣がんの複数の組織学的サブタイプにわたりＴＡＧ７２が存在することが示される。
ＴＡＧ７２の腫瘍関連シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）に特異的なモノクローナル抗体がいくつか開発されており、その中には、よく研究されているクローンＣＣ４９（非特許文献１２）が含まれる。ＣＣ４９は、その後、画像診断及び放射線治療を用いた複数の前臨床試験及び臨床試験に利用され、抗体ヒト化の複数の試みにも関与している（非特許文献１３～１９）。
Maude SL, Teachey DT, Porter DL,Grupp SA. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acutelymphoblastic leukemia. Blood. 2015; 125(26):4017-23
Jain MD, Davila ML. ConciseReview: Emerging Principles from the Clinical Application of Chimeric AntigenReceptor T Cell Therapies for B Cell Malignancies. Stem cells. 2018;36(1):36-44
Priceman SJ, Forman SJ, BrownCE. Smart CARs engineered for cancer immunotherapy. Current opinion inoncology. 2015;27(6):466-74
Chen N, Li X, Chintala NK, TanoZE, Adusumilli PS. Driving CARs on the uneven road of antigen heterogeneity insolid tumors. Current opinion in immunology. 2018; 51:103-10
Yong CSM, Dardalhon V, Devaud C,Taylor N, Darcy PK, Kershaw MH. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunologyand cell biology. 2017;9 5(4):356-63
Castellarin M, Watanabe K, JuneCH, Kloss CC, Posey AD, Jr. Driving cars to the clinic for solid tumors. Genetherapy. 2018. Epub 2018/06/09.
Steentoft C, Migliorini D, KingTR, Mandel U, June CH, Posey AD, Jr. Glycan-Directed Car-T Cells. Glycobiology.2018. Epub 2018/01/26
RodrIguez E, Schetters STT, vanKooyk Y. The tumour glyco-code as a novel immune checkpoint for immunotherapy.Nature reviews Immunology. 2018; 18(3):204-11. Epub 2018/02/06
Hollingsworth MA, Swanson BJ.Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nature reviewsCancer. 2004;4(1):45-60. Epub 2003/12/19
Julien S, Videira PA, DelannoyP. Sialyl-tn in cancer: (how) did we miss the target? Biomolecules. 2012;2(4):435-66. Epub 2012/01/01
Chauhan SC, Vinayek N, Maher DM,Bell MC, Dunham KA, Koch MD, Lio Y, Jaggi M. Combined staining of TAG72, MUC1,and CA125 improves labeling sensitivity in ovarian cancer: antigens formulti-targeted antibody-guided therapy. The journal of histochemistry andcytochemistry.2007; 55(8):867-75
Muraro R, Kuroki M, WunderlichD, Poole DJ, Colcher D, Thor A, Greiner JW, Simpson JF, Molinolo A, Noguchi P,et al. Generation and characterization of B72.3 second generationmonoclonal antibodies reactive with the tumor-associated glycoprotein 72antigen. Cancer research. 1988; 48(16):4588-96
Cheng KT. Radioiodinatedanti-TAG72 CC49 Fab' antibody fragment. Molecular Imaging and Contrast AgentDatabase (MICAD). Bethesda MD2004
Pavlinkova G, Booth BJ, BatraSK, Colcher D. Radioimmunotherapy of human colon cancer xenografts using adimeric single-chain Fv antibody construct. Clinical cancer research: anofficial journal of the American Association for Cancer Research.1999;5(9):2613-9
Kashmiri SV, Shu L, Padlan EA,Milenic DE, Schlom J, Hand PH. Generation, characterization, and in vivostudies of humanized anticarcinoma antibody CC49. Hybridoma. 1995; 14(5):461-73
De Pascalis R, Gonzales NR,Padlan EA, Schuck P, Batra SK, Schlom J, Kashmiri SV. In vitro affinitymaturation of a specificity-determining region-grafted humanized anticarcinomaantibody: isolation and characterization of minimally immunogenic high-affinityvariants. Clinical cancer research: an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research. 2003; 9(15):5521-31
Gonzales NR, Padlan EA, DePascalis R, Schuck P, Schlom J, Kashmiri SV. Minimizing immunogenicity of theSDR-grafted humanized antibody CC49 by genetic manipulation of the frameworkresidues. Molecular immunology. 2003;40(6):337-49
Pavlinkova G, Colcher D, BoothBJ, Goel A, Wittel UA, Batra SK. Effects of humanization and gene shuffling onimmunogenicity and antigen binding of anti-TAG72 single-chain Fvs.International journal of cancer. 2001;94(5):717-26
Hege KM, Bergsland EK, FisherGA, Nemunaitis JJ, Warren RS, McArthur JG, Lin AA, Schlom J, June CH, SherwinSA. Safety, tumor trafficking and immunogenicity of chimeric antigen receptor(CAR)-T cells specific for TAG72 in colorectal cancer. Journal forimmunotherapy of cancer. 2017; 5:22
本明細書では、様々ながん、例えば、卵巣がんの治療にＴＡＧ７２標的ＣＡＲ Ｔ細胞を用いる方法が記載される。
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が記載され、ここで前記キメラ抗原受容体は、ｓｃＦｖ標的Ｔａｇ－７２、スペーサー、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
様々な実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン若しくは１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン若しくは１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体、又はＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくは１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択され；前記スペーサーは２０～１５０個のアミノ酸を含み、かつ、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間に位置し；前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体であり；前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインであり；前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～２個のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～２個のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～２個のアミノ酸修飾を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメインを含み；前記スペーサー領域は、配列番号２～１２からなる群から選択されるアミノ酸配列又は１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含み；前記スペーサーは、１０～５０個のアミノ酸を含み；前記４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２４又は１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体のアミノ酸配列を含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；３～１５個のアミノ酸のリンカーは、４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体の間に位置し；前記ＣＡＲは、配列番号２９又は１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体のアミノ酸配列を含み；前記ｓｃＦｖは、配列番号１、配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
また、本明細書には、本明細書に記載される核酸分子を含むウイルスベクター；本明細書に記載される核酸分子を含むベクターにより形質導入されたヒトＴ細胞集団（例えば、セントラルメモリーＴ細胞を含む集団）が開示される。
また、本明細書にはまた、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターにより形質導入された自己又は同種のヒトＴ細胞集団の投与を含む、患者の固形腫瘍を治療する方法が記載され、前記固形腫瘍は、Ｔａｇ－７２を発現する細胞を含む。様々な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、局所的又は全身的に投与され；前記ＴＡＧ７２発現細胞は、卵巣がん細胞であり；前記キメラ抗原受容体は、単回又は反復投与により投与される。
様々な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、ＴＡＧ７２ ｓｃＦｖ（例えば、以下のアミノ酸配列：
様々な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、ＴＡＧ７２ Ｖ１５ ｓｃＦｖ（例えば、以下のアミノ酸配列：
様々な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、ＴＡＧ７２ Ｖ５９＿Ｖ１５ ｓｃＦｖ（例えば、以下のアミノ酸配列：
当該ＣＡＲを発現するベクターを有するＴ細胞もまた、記載される。様々な実施形態では、当該形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも２０％、３０％又は４０％は、セントラルメモリーＴ細胞であり；当該形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも３０％は、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；当該ヒトＴ細胞集団は、患者由来であり；かつ、当該ヒトＴ細胞集団は、患者の同種異系である。
ＴＡＧ７２標的ＣＡＲ
本明細書に記載されるＴＡＧ７２標的ＣＡＲは、ｓｃＦｖを標的化するＴＡＧ７２（例えば、以下のアミノ酸配列：
本明細書に記載されるＴＡＧ７２標的ＣＡＲは、ｓｃＦｖを標的化するＴＡＧ７２（例えば、以下のアミノ酸配列：
以下の配列：
以下の配列：
有用なＴＡＧ７２ ＣＡＲは、配列番号＿（シグナル配列欠失成熟ＣＡＲ）のアミノ酸配列からなるか、又はそれを含むことができ、又は当該ＴＡＧ７２ ＣＡＲは配列番号２９、３１、若しくは３２（ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を有する未成熟ＣＡＲ）のアミノ酸配列からなるか、又はそれを含みうる。当該ＣＡＲは、シグナル配列、例えば、ヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体αシグナル配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ；配列番号＿＿）を含む形態で発現しうる。当該ＣＡＲは、例えば、Ｔ２Ａスキップ配列及び切断型ＥＧＦＲｔ等の、発現の追跡に有用なさらなる配列で発現されうる。したがって、当該ＣＡＲは、配列番号２９、３１、又は３２のアミノ酸配列を含みうるか、又はそれらからなることができ、又は配列番号２９、３１、又は３２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含みうるか、又はそれらからなりうる。当該ＣＡＲは、１、２、３、４、又は５個までのアミノ酸変化（好ましくは保存的アミノ酸変化）を有する配列番号２９、３１、又は３２のいずれかのアミノ酸配列を含みうるか、又はそれからなりうる。
スペーサー領域
本明細書に記載されるＣＡＲは、スペーサーを、ＴＡＧ７２標的標的ドメイン（すなわち、ＴＡＧ７２標的ＳｃＦｖ又はその変異体）と膜貫通ドメインとの間に位置させて含みうる。様々な異なるスペーサーを用いうる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも部分、例えば、当該ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又はＣＨ３ドメイン若しくはその変異体を含む。以下の表１に、本明細書で提供されるＣＡＲにおいて用いられうる様々なスペーサーを記載する。
表１：スペーサー例
本明細書に記載されるＣＡＲは、スペーサーを、ＴＡＧ７２標的標的ドメイン（すなわち、ＴＡＧ７２標的ＳｃＦｖ又はその変異体）と膜貫通ドメインとの間に位置させて含みうる。様々な異なるスペーサーを用いうる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも部分、例えば、当該ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又はＣＨ３ドメイン若しくはその変異体を含む。以下の表１に、本明細書で提供されるＣＡＲにおいて用いられうる様々なスペーサーを記載する。
表１：スペーサー例
当該ヒンジ／リンカー領域はまた、配列がＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）であるＩｇＧ４ヒンジ領域を含みうる。当該ヒンジ／リンカー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号２）、続いてＩｇＧ４ ＣＨ３配列ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）を含みうる。従って、当該リンカー／スペーサー領域全体は、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１）という配列を含みうる。ある場合、当該スペーサーには、配列番号１１と比較して、１、２、３、４又は５個の単一アミノ酸変化（例えば、保存的変化）がある。ある場合、ＩｇＧ４ Ｆｃヒンジ／リンカー領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による結合が低下するように、２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で変異する。
膜貫通ドメイン
様々な膜貫通ドメインを用いうる。表２には、適当な膜貫通ドメインを例示する。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサー領域のカルボキシ末端にある。
例２：膜貫通ドメインの例
様々な膜貫通ドメインを用いうる。表２には、適当な膜貫通ドメインを例示する。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサー領域のカルボキシ末端にある。
例２：膜貫通ドメインの例
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適するいかなるドメインでありうる。ある場合、共シグナル伝達ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＭＲＰＶＱＴＱＥＥＤＧＣＲＦＥＥＥＧＣＥＬ（配列番号２４）と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はと同一である配列があげられる４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインである。ある場合、当該４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインは、配列番号２４と比較して、（好ましくは、保存的）１、２、３、４又は５個のアミノ酸変化がある。
当該共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置する。表３に、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に、適当な共刺激ドメインを例示する。
表３： ＣＤ３ζドメインと共刺激ドメインの例
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適するいかなるドメインでありうる。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、以下の配列：ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２１）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一又は同一である配列を含む。ある場合では、当該ＣＤ３ζシグナル伝達は、配列番号２１と比較して、１、２、３、４又は５個（好ましくは保存的）がアミノ酸変化する。
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適するいかなるドメインでありうる。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、以下の配列：ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２１）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一又は同一である配列を含む。ある場合では、当該ＣＤ３ζシグナル伝達は、配列番号２１と比較して、１、２、３、４又は５個（好ましくは保存的）がアミノ酸変化する。
切断型ＥＧＦＲ
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号２７）及び、以下の配列：ＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号２８）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一又は同一である配列を有する切断型ＥＧＦＲが続いてよい。ある場合、当該切断型ＥＧＦＲは、配列番号２８と比較して、１、２、３、４又は５個（好ましくは保存的）のアミノ酸が変化する。
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号２７）及び、以下の配列：ＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号２８）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一又は同一である配列を有する切断型ＥＧＦＲが続いてよい。ある場合、当該切断型ＥＧＦＲは、配列番号２８と比較して、１、２、３、４又は５個（好ましくは保存的）のアミノ酸が変化する。
「アミノ酸修飾」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することをいう。当該置換は、非保存的（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸に変化させることにより）に、又は保存的（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸に変化させることにより）に、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行いうる。当該保存的変化では、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより少なくなる。以下に、アミノ酸の様々な群分けを例示する：１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で正に荷電）。他の群はフェニル基をもつアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。
ある場合、ＴＡＧ７２ ＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列と、細胞質シグナル伝達テイルが欠失した切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）が続くベクターを用いて産生されうる。
当該配列では、ＥＧＦＲｔの共発現により、遺伝子修飾細胞が正確に測定されえ、遺伝子修飾細胞の正の選択、並びに養子移入後の治療用Ｔ細胞のインビボで効率的に細胞追跡しうる不活性な非免疫原性表面マーカーが提供される。サイトカインストーム及び標的外毒性を回避するための効率的な増殖制御は、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。ＴＡＧ７２ ＣＡＲレンチウイルスベクターに組み込まれたＥＧＦＲｔは、自殺遺伝子として作用し、治療関連毒性の場合には、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を除去しうる。
当該配列では、ＥＧＦＲｔの共発現により、遺伝子修飾細胞が正確に測定されえ、遺伝子修飾細胞の正の選択、並びに養子移入後の治療用Ｔ細胞のインビボで効率的に細胞追跡しうる不活性な非免疫原性表面マーカーが提供される。サイトカインストーム及び標的外毒性を回避するための効率的な増殖制御は、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。ＴＡＧ７２ ＣＡＲレンチウイルスベクターに組み込まれたＥＧＦＲｔは、自殺遺伝子として作用し、治療関連毒性の場合には、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を除去しうる。
本明細書中に記載されるＣＡＲは、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されるが、当技術分野で公知のいかなる手段により製造されうる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発等）により、簡便に調製し、完全なコード配列に組み立てうる。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球細胞系、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞系の形質転換に用いられる。
患者から単離された様々なＴ細胞サブセットを、ＣＡＲ発現用ベクターで形質導入しうる。セントラルメモリーＴ細胞は、有用なＴ細胞サブセットの１つである。セントラルメモリーＴ細胞は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離して、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択しうる。セントラルメモリーＴ細胞のために濃縮された細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化され得、例えば、ＴＡＧ７２ ＣＡＲの発現を指向するレンチウイルスベクター、並びにインビボ検出、アブレーション、及び潜在的ｅｘ ｖｉｖｏ選択のための非免疫原性表面マーカーで形質導入されうる。活性化された／遺伝子修飾されたＴＡＧ７２セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５を用いてインビトロで増殖させ、次いで凍結保存しうる。
本開示では、ヒト化抗ヒトＴＡＧ７２ ｓｃＦｖ抗原結合ドメイン及び４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＴＡＧ７２－ＢＢζ）を有する第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞の生成及び抗腫瘍効果を記載する。ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞は、複数のＴＡＧ７２を発現するヒト卵巣がん細胞株及び細胞培養で増殖した患者卵巣がん腹水由来の上皮細胞に対して強力な抗原依存性細胞毒性を示した。腹膜卵巣腫瘍モデルでは、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞をインビボ局所送達すると、抗原陽性疾患が除去され、かつ、マウスの全生存期間が延びた。対照的に、ＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内送達は疾患のコントロールには効果がなかった。さらに、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の局所反復注入により、単独治療と比較して疾患制御がより持続的に促進された。当該前臨床所見は、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞が、卵巣がんの実行可能な治療選択肢であることを裏付けるとともに、ＴＡＧ７２を発現する複数の固形がんへのより広範な適用を強調する。
〔実施例〕
本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
〔材料及び方法〕
以下の材料及び方法を、本明細書に記載した実施例で用いた。
以下の材料及び方法を、本明細書に記載した実施例で用いた。
細胞株
上皮性卵巣がん株ＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１６１）を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Hyclone）及び１Ｘ抗生物質抗真菌剤（１ＸＡＡ、Gibco）（完全ＲＰＭＩ）含有ＲＰＭＩ－１６４０（Lonza）で培養した。転移性腹水由来の上皮性卵巣がん株ＯＶ９０（ＣＲＬ１１７３２）を、水酸化ナトリウム（Sigma）及び最終濃度２０％ＦＢＳ及び１×ＡＡを用いてｐＨ７．０に調整したＭＣＤＢ１０５培地（Sigma）及び培地１９９（Thermo）の１：１混合液中で培養した。上皮性類子宮類卵巣がん株ＣＯＶ３６２．４（Sigma）を、１０％ＦＢＳ、１ＸＡＡ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Irvine Scientific）及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Fisher Scientific）（完全ＤＭＥＭ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、LifeTechnologies）で培養した。上皮性卵巣がん株ＯＶＣＡＲ８は、寛大にもシティオブホープのＣａｒｌｏｔｔａ Ｇｌａｃｋｉｎ博士から供与されたものであり、完全ＲＰＭＩ－１６４０で培養した。上皮性卵巣がん株ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ‐７７）と結腸上皮がん株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＬ‐１８８）を完全ＤＭＥＭで培養した。すべての細胞を５％ ＣＯ２３７℃で培養した。
上皮性卵巣がん株ＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１６１）を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Hyclone）及び１Ｘ抗生物質抗真菌剤（１ＸＡＡ、Gibco）（完全ＲＰＭＩ）含有ＲＰＭＩ－１６４０（Lonza）で培養した。転移性腹水由来の上皮性卵巣がん株ＯＶ９０（ＣＲＬ１１７３２）を、水酸化ナトリウム（Sigma）及び最終濃度２０％ＦＢＳ及び１×ＡＡを用いてｐＨ７．０に調整したＭＣＤＢ１０５培地（Sigma）及び培地１９９（Thermo）の１：１混合液中で培養した。上皮性類子宮類卵巣がん株ＣＯＶ３６２．４（Sigma）を、１０％ＦＢＳ、１ＸＡＡ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Irvine Scientific）及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Fisher Scientific）（完全ＤＭＥＭ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、LifeTechnologies）で培養した。上皮性卵巣がん株ＯＶＣＡＲ８は、寛大にもシティオブホープのＣａｒｌｏｔｔａ Ｇｌａｃｋｉｎ博士から供与されたものであり、完全ＲＰＭＩ－１６４０で培養した。上皮性卵巣がん株ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ‐７７）と結腸上皮がん株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＬ‐１８８）を完全ＤＭＥＭで培養した。すべての細胞を５％ ＣＯ２３７℃で培養した。
ＤＮＡ構築物とレンチウイルス産生
腫瘍細胞を、既報（２２；Ｐｒｉｃｅｍａｎ ＳＪ， Ｇｅｒｄｔｓ ＥＡ， Ｔｉｌａｋａｗａｒｄａｎｅ Ｄ，Ｋｅｎｎｅｗｉｃｋ ＫＴ， Ｍｕｒａｄ ＪＰ， Ｐａｒｋ ＡＫ， Ｊｅａｎｇ Ｂ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｙ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｕｒａｋ Ｒ， Ｗｅｎｇ Ｌ， Ｃｈａｎｇ ＷＣ， Ｗｒｉｇｈｔ Ｓ， Ｐａｌ Ｓ， Ｒｅｉｔｅｒ ＲＥ， Ｗｕ ＡＭ， Ｂｒｏｗｎ ＣＥ， Ｆｏｒｍａｎ ＳＪ． Ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＳＣＡ＋ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２０１８； ７（２）：ｅ１３８０７６４）のＥＦ１αプロモーターの制御下でｅＧＦＰ／ｆｌｕｃ融合を担持するｅＨＩＶ７レンチウイルスを用いた形質導入により、増強緑色蛍光タンパク質及びホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ／ｆｌｕｃ）を発現するように改変した。当該ＣＡＲ構築物に用いたヒト化ｓｃＦｖ配列は、ＴＡＧ７２を標的とするモノクローナル抗体クローンｈｕＣＣ４９から得られた（１７）。細胞外スペーサードメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃスペーサーの１２９アミノ酸の中長ＣＨ２欠失型（ΔＣＨ２）を含んでいた（Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ Ｍ， Ｍａｒｄｉｒｏｓ Ａ， Ｕｒａｋ Ｒ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｈｏｆｆｍａｎ ＬＪ， Ｂｅｒｎａｎｋｅ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｅｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ ｓｐａｃｅｒ ａｖｏｉｄ ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． （２０１５） ２３：７５７－６８）。含まれる細胞内の補助刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインを有する４－１ＢＢであった。ＣＤ３ζ細胞溶解ドメインは、既報である（２２）。当該ＣＡＲ配列を、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列により切断ＣＤ１９遺伝子（ＣＤ１９ｔ）から分離し、ＥＦ１αプロモーターの制御下で、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルス骨格中でクローニングした。
腫瘍細胞を、既報（２２；Ｐｒｉｃｅｍａｎ ＳＪ， Ｇｅｒｄｔｓ ＥＡ， Ｔｉｌａｋａｗａｒｄａｎｅ Ｄ，Ｋｅｎｎｅｗｉｃｋ ＫＴ， Ｍｕｒａｄ ＪＰ， Ｐａｒｋ ＡＫ， Ｊｅａｎｇ Ｂ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｙ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｕｒａｋ Ｒ， Ｗｅｎｇ Ｌ， Ｃｈａｎｇ ＷＣ， Ｗｒｉｇｈｔ Ｓ， Ｐａｌ Ｓ， Ｒｅｉｔｅｒ ＲＥ， Ｗｕ ＡＭ， Ｂｒｏｗｎ ＣＥ， Ｆｏｒｍａｎ ＳＪ． Ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＳＣＡ＋ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２０１８； ７（２）：ｅ１３８０７６４）のＥＦ１αプロモーターの制御下でｅＧＦＰ／ｆｌｕｃ融合を担持するｅＨＩＶ７レンチウイルスを用いた形質導入により、増強緑色蛍光タンパク質及びホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ／ｆｌｕｃ）を発現するように改変した。当該ＣＡＲ構築物に用いたヒト化ｓｃＦｖ配列は、ＴＡＧ７２を標的とするモノクローナル抗体クローンｈｕＣＣ４９から得られた（１７）。細胞外スペーサードメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃスペーサーの１２９アミノ酸の中長ＣＨ２欠失型（ΔＣＨ２）を含んでいた（Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ Ｍ， Ｍａｒｄｉｒｏｓ Ａ， Ｕｒａｋ Ｒ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｈｏｆｆｍａｎ ＬＪ， Ｂｅｒｎａｎｋｅ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｅｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ ｓｐａｃｅｒ ａｖｏｉｄ ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． （２０１５） ２３：７５７－６８）。含まれる細胞内の補助刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインを有する４－１ＢＢであった。ＣＤ３ζ細胞溶解ドメインは、既報である（２２）。当該ＣＡＲ配列を、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列により切断ＣＤ１９遺伝子（ＣＤ１９ｔ）から分離し、ＥＦ１αプロモーターの制御下で、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルス骨格中でクローニングした。
レンチウイルスは、既報（２２、Ｐｒｉｃｅｍａｎ ＳＪ， Ｔｉｌａｋａｗａｒｄａｎｅ Ｄ， Ｊｅａｎｇ Ｂ， Ａｇｕｉｌａｒ Ｂ， Ｍｕｒａｄ ＪＰ， Ｐａｒｋ ＡＫ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ＨＥＲ２（＋） ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （２０１８） ２４：９５－１０５）同様に作製した。簡潔には、２９３Ｔ細胞を、改変リン酸カルシウム法を用いてパッケージングプラスミド及びＣＡＲレンチウイルス骨格プラスミドでトランスフェクトした。３～４日後にウイルス上清を採取し、２ｍＭマグネシウム及び２５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（ＥＭＤミリポア）で処理した。高速遠心分離で上清を濃縮し、レンチウイルスペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）－乳糖溶液（ＰＢＳ１００ｍＬ当たり乳糖４ｇ）に再懸濁し、－８０℃で分注保存した。レンチウイルス力価は、ＣＤ１９ｔ発現に基づいてＨＴ１０８０細胞を用いて定量した。
Ｔ細胞単離、レンチウイルス形質導入、及びＥｘ ｖｉｖｏ増殖
白血球除去輸血製品は、シティオブホープ内部審査会（ＩＲＢ）により承認されたプロトコルに基づき、同意を得た研究参加者（健康なドナー）から入手した。白血球除去輸血の日に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ （ＧＥヘルスケア）上での密度勾配遠心分離、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡ （MiltenyiBiotec）で複数洗浄して単離した。細胞を室温（ＲＴ）で回転子上に一晩静置し、次いで洗浄し、１０％ ＦＢＳ（完全Ｘ－ＶＩＶＯ）を含むＸ－ＶＩＶＯ Ｔ細胞培地（Lonza）に再懸濁した。最大５．０×１０９個のＰＢＭＣを、抗ＣＤ１４及び抗ＣＤ２５マイクロビーズ（MiltenyiBiotec）と共に室温で３０分間インキュベートし、製造業者のプロトコルに従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム（MiltenyiBiotec）を用いて磁気的に除去し、これらを枯渇ＰＢＭＣ（ｄＰＢＭＣ）とした。ｄＰＢＭＣをＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（StemCell Technologies）で、次の処理まで凍結した。
白血球除去輸血製品は、シティオブホープ内部審査会（ＩＲＢ）により承認されたプロトコルに基づき、同意を得た研究参加者（健康なドナー）から入手した。白血球除去輸血の日に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ （ＧＥヘルスケア）上での密度勾配遠心分離、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡ （MiltenyiBiotec）で複数洗浄して単離した。細胞を室温（ＲＴ）で回転子上に一晩静置し、次いで洗浄し、１０％ ＦＢＳ（完全Ｘ－ＶＩＶＯ）を含むＸ－ＶＩＶＯ Ｔ細胞培地（Lonza）に再懸濁した。最大５．０×１０９個のＰＢＭＣを、抗ＣＤ１４及び抗ＣＤ２５マイクロビーズ（MiltenyiBiotec）と共に室温で３０分間インキュベートし、製造業者のプロトコルに従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム（MiltenyiBiotec）を用いて磁気的に除去し、これらを枯渇ＰＢＭＣ（ｄＰＢＭＣ）とした。ｄＰＢＭＣをＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（StemCell Technologies）で、次の処理まで凍結した。
Ｔ細胞の活性化及び形質導入を、既報（２２）のように実施した。簡潔には、新たに解凍したｄＰＢＭＣを１回洗浄し、１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２、Novartis Oncology）及び０．５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－１５（ｒｈＩＬ－１５、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）含有完全Ｘ－ＶＩＶで培養した。ＣＡＲレンチウイルス形質導入のため、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ ダイナビーズ（登録商標）（LifeTechnologies）、硫酸プロタミン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、サイトカイン混合物（上記のように）、及びビーズ刺激の翌日の１の多重度又は感染（ＭＯＩ）で所望のレンチウイルスと共に培養した。次いで、細胞を培養し、２～３日毎にサイトカインを含む新鮮な完全Ｘ－ＶＩＶＯで補充した。７日後、ビーズを磁気的に除去し、細胞を、サイトカインを含む完全Ｘ－ＶＩＶＯ中でさらに増殖させて所望の細胞収率を達成させた。ＣＡＲ Ｔ細胞は、製造業者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＣＤ１９ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ Ｉ又はＩＩ（StemCell Technologies）を用いて、ＣＤ１９ｔ用に積極的に選択した。さらなる拡張後、細胞を、インビトロ機能アッセイ及びインビボ腫瘍モデルの前に、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標） ＣＳ５中で凍結した。ＣＡＲ Ｔ細胞の純度及び表現型をフローサイトメトリーで検証した。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析のため、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋又は２％ＦＢＳ及び１×ＡＡ含有フェノールレッド（ＨＢＳＳ－／－、LifeTechnologies）非含有Ｈａｎｋ平衡食塩溶液）に再懸濁した。細胞を一次抗体と共に暗所４℃で３０分間インキュベートした。二次染色には、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（ＢＶ５１０）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＰＥ－Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はＡＰＣ－Ｃｙ７（又はＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０）結合抗体を用いて、暗所で４℃３０分間インキュベートする前に細胞を２回洗浄した。ＣＤ３（BDBiosciences、クローン：ＳＫ７）、ＣＤ４（BDBiosciences、クローン：ＳＫ３）、ＣＤ８（BDBiosciences、クローン：ＳＫ１）、ＣＤ１４（BDBiosciences、クローン：ＭΦＰ９）、ＣＤ１９（BDBiosciences、クローン：ＳＪ２５Ｃ１）、ＣＤ２５（BDBiosciences、クローン：２Ａ３）、マウスＣＤ４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン：３０－Ｆ１１）、ＣＤ４５（BDBiosciences、クローン：２Ｄ１）、ＣＤ６９（BDBiosciences、クローン：Ｌ７８）、ＣＤ１３７（BDBiosciences、クローン：４Ｂ４－１）、ＭＵＣ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン１６Ａ）、ＭＵＣ１６（Ａｂｃａｍ、クローンＸ７５又はＥＰＳＩＳＲ２３）、ビオチン化Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌ（GenscriptUSA）（Ｚｈｅｎｇ Ｚ， Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ Ｎ， Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ： ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＣＡＲ） ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． （２０１２） １０：２９）、ＴＡＧ７２（クローン、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヤギ抗マウス免疫グロブリン（BDBiosciences）、及びストレプトアビジン（BDBiosciences）を用いた。細胞生存率は、４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Sigma）を用いて測定した。フローサイトメトリーをMACSQuantAnalyzer10（MiltenyiBiotec）で行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（v10、TreeStar）で分析した。
フローサイトメトリー分析のため、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋又は２％ＦＢＳ及び１×ＡＡ含有フェノールレッド（ＨＢＳＳ－／－、LifeTechnologies）非含有Ｈａｎｋ平衡食塩溶液）に再懸濁した。細胞を一次抗体と共に暗所４℃で３０分間インキュベートした。二次染色には、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（ＢＶ５１０）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＰＥ－Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はＡＰＣ－Ｃｙ７（又はＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０）結合抗体を用いて、暗所で４℃３０分間インキュベートする前に細胞を２回洗浄した。ＣＤ３（BDBiosciences、クローン：ＳＫ７）、ＣＤ４（BDBiosciences、クローン：ＳＫ３）、ＣＤ８（BDBiosciences、クローン：ＳＫ１）、ＣＤ１４（BDBiosciences、クローン：ＭΦＰ９）、ＣＤ１９（BDBiosciences、クローン：ＳＪ２５Ｃ１）、ＣＤ２５（BDBiosciences、クローン：２Ａ３）、マウスＣＤ４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン：３０－Ｆ１１）、ＣＤ４５（BDBiosciences、クローン：２Ｄ１）、ＣＤ６９（BDBiosciences、クローン：Ｌ７８）、ＣＤ１３７（BDBiosciences、クローン：４Ｂ４－１）、ＭＵＣ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン１６Ａ）、ＭＵＣ１６（Ａｂｃａｍ、クローンＸ７５又はＥＰＳＩＳＲ２３）、ビオチン化Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌ（GenscriptUSA）（Ｚｈｅｎｇ Ｚ， Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ Ｎ， Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ： ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＣＡＲ） ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． （２０１２） １０：２９）、ＴＡＧ７２（クローン、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヤギ抗マウス免疫グロブリン（BDBiosciences）、及びストレプトアビジン（BDBiosciences）を用いた。細胞生存率は、４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Sigma）を用いて測定した。フローサイトメトリーをMACSQuantAnalyzer10（MiltenyiBiotec）で行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（v10、TreeStar）で分析した。
インビトロ腫瘍殺傷及びＴ細胞機能アッセイ
腫瘍殺傷アッセイのため、ＣＡＲ Ｔ細胞及び腫瘍標的を、９６穴プレート中の外因性サイトカインの非存在下で、完全Ｘ－ＶＩＶＯ中の示されたエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比で２４～７２時間共培養し、上記のようにフローサイトメトリーで分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞による腫瘍殺傷は、標的をＭｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞との共培養で観察されたものと比較してＣＤ４５陰性細胞数を比較して、算出した。Ｔ細胞活性化アッセイのため、ＣＡＲ Ｔ細胞及び腫瘍標的を、所定の時点のため、９６穴プレート中の外因性サイトカインの非存在下で、完全Ｘ－ＶＩＶＯ中で示されたＥ：Ｔ比で共培養し、そしてＴ細胞活性化の特異的マーカーについてフローサイトメトリーで分析した。凍結培養されていない患者の原発性卵巣がん腹水（ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、及びＯＡＳ７）を解凍し、ＴＡＧ７２発現について直接分析し、Ｔ細胞機能アッセイで評価した。簡潔には、シティオブホープ国立医療センター（ＣＯＨ）の外科スタッフから、ＣＯＨ内部審査会（ＩＲＢ）及び検体保護局の承認を得て、滅菌真空容器で腹水を採取した。ＣＯＨ ＩＲＢは、既報のとおり（２６）、すべての検体は識別されず、腹水材料を廃棄したため、書面によるインフォームドコンセントの必要性を撤回した。
腫瘍殺傷アッセイのため、ＣＡＲ Ｔ細胞及び腫瘍標的を、９６穴プレート中の外因性サイトカインの非存在下で、完全Ｘ－ＶＩＶＯ中の示されたエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比で２４～７２時間共培養し、上記のようにフローサイトメトリーで分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞による腫瘍殺傷は、標的をＭｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞との共培養で観察されたものと比較してＣＤ４５陰性細胞数を比較して、算出した。Ｔ細胞活性化アッセイのため、ＣＡＲ Ｔ細胞及び腫瘍標的を、所定の時点のため、９６穴プレート中の外因性サイトカインの非存在下で、完全Ｘ－ＶＩＶＯ中で示されたＥ：Ｔ比で共培養し、そしてＴ細胞活性化の特異的マーカーについてフローサイトメトリーで分析した。凍結培養されていない患者の原発性卵巣がん腹水（ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、及びＯＡＳ７）を解凍し、ＴＡＧ７２発現について直接分析し、Ｔ細胞機能アッセイで評価した。簡潔には、シティオブホープ国立医療センター（ＣＯＨ）の外科スタッフから、ＣＯＨ内部審査会（ＩＲＢ）及び検体保護局の承認を得て、滅菌真空容器で腹水を採取した。ＣＯＨ ＩＲＢは、既報のとおり（２６）、すべての検体は識別されず、腹水材料を廃棄したため、書面によるインフォームドコンセントの必要性を撤回した。
プレート結合抗原でのＴ細胞活性化アッセイのため、精製された可溶性ＴＡＧ７２抗原（BioRad）を、９６穴平坦底高親和性プレート（Corning）中、１×ＰＢＳ中４℃にて指示されたＴＡＧ７２単位で一晩、二重に平板培養した。次いで、合計１０４個のＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を、１００μＬの固定容量で各ウェルに添加し、そしてフローサイトメトリーによる活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ１３７）分析用の細胞収集前に、所定の時間インキュベートした。サイトカイン産生の分析用に上清も採取した。
ＥＬＩＳＡサイトカインアッセイ
プレート結合ＴＡＧ７２抗原上の腫瘍殺傷アッセイ又はＣＡＲ Ｔ細胞活性化アッセイ由来の上清を、所定の時間に収集し、さらなる使用のために－２０℃で凍結した。次に、分泌されたヒトＩＦＮγ及びＩＬ－２について各々、ヒトＩＦＮγ及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ Ready-SET-GO!（登録商標）ＥＬＩＳＡキット製造業者のプロトコルに従って上清を分析した。WallacVictor3 1420 Counter(Perkin-Elmer)及びWallac 1420 Workstationソフトウェアを用いて、４５０ｎｍでプレートを読み取った。
プレート結合ＴＡＧ７２抗原上の腫瘍殺傷アッセイ又はＣＡＲ Ｔ細胞活性化アッセイ由来の上清を、所定の時間に収集し、さらなる使用のために－２０℃で凍結した。次に、分泌されたヒトＩＦＮγ及びＩＬ－２について各々、ヒトＩＦＮγ及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ Ready-SET-GO!（登録商標）ＥＬＩＳＡキット製造業者のプロトコルに従って上清を分析した。WallacVictor3 1420 Counter(Perkin-Elmer)及びWallac 1420 Workstationソフトウェアを用いて、４５０ｎｍでプレートを読み取った。
インビボ腫瘍試験
すべての動物実験は、シティオブホープ施設動物ケア・使用委員会が承認したプロトコルに基づいて実施した。インビボ腫瘍研究のため、ＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞（５．０×１０６）を最終容量の５００μｌのＨＢＳＳ－／－で調製し、６～８週齢の雌ＮＳＧマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により生着させた。腫瘍の増殖は、少なくとも週１回、バイオホトニック画像（Xenogen、LagoX）により追跡し、流束シグナルを生体画像ソフトウェア（Xenogen）で分析した。画像化のために、マウスに、４．２９ｍｇ／マウスのＰＢＳ中に懸濁した１５０μＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩（PerkinElmer）を腹腔内注射した。いったん流束シグナルが所望のレベルに達すると、ＯＶ９０については８日目、ＯＶＣＡＲ３については１４日目に、Ｔ細胞を１ＸＰＢＳ中で調製し、マウスに５．０×１０６Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を５００μＬ又は２００μＬ静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＯＶ９０腫瘍モデルでは、腹腔内投与による反復処理の効果を試験した。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を８日目に開始し、その後、腫瘍生着後追加の指示日に投与した場合の影響を検討した。人道的終点を用いて生存期間を決定した。腹水による腹部膨満、努力性又は呼吸困難、明確な体重減少、可動性障害、瀕死状態のエビデンス等の苦痛の徴候が認められた場合、マウスを安楽死させた。所定の時点又は瀕死状態で、マウスを安楽死させ、組織及び／又は腹水を収集し、以下に記載するようにフローサイトメトリー及び免疫組織化学用に処理した。
すべての動物実験は、シティオブホープ施設動物ケア・使用委員会が承認したプロトコルに基づいて実施した。インビボ腫瘍研究のため、ＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞（５．０×１０６）を最終容量の５００μｌのＨＢＳＳ－／－で調製し、６～８週齢の雌ＮＳＧマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により生着させた。腫瘍の増殖は、少なくとも週１回、バイオホトニック画像（Xenogen、LagoX）により追跡し、流束シグナルを生体画像ソフトウェア（Xenogen）で分析した。画像化のために、マウスに、４．２９ｍｇ／マウスのＰＢＳ中に懸濁した１５０μＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩（PerkinElmer）を腹腔内注射した。いったん流束シグナルが所望のレベルに達すると、ＯＶ９０については８日目、ＯＶＣＡＲ３については１４日目に、Ｔ細胞を１ＸＰＢＳ中で調製し、マウスに５．０×１０６Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を５００μＬ又は２００μＬ静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＯＶ９０腫瘍モデルでは、腹腔内投与による反復処理の効果を試験した。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を８日目に開始し、その後、腫瘍生着後追加の指示日に投与した場合の影響を検討した。人道的終点を用いて生存期間を決定した。腹水による腹部膨満、努力性又は呼吸困難、明確な体重減少、可動性障害、瀕死状態のエビデンス等の苦痛の徴候が認められた場合、マウスを安楽死させた。所定の時点又は瀕死状態で、マウスを安楽死させ、組織及び／又は腹水を収集し、以下に記載するようにフローサイトメトリー及び免疫組織化学用に処理した。
ヘパリン／ＰＢＳ溶液（１０００ユニット／ｍＬ、Sagent Pharmaceuticals）を含むポリスチレンチューブにヘパリン処理したキャピラリーチューブ（ChaseScientific）を通して、イソフルラン麻酔マウスから後眼窩出血により末梢血を採取した。各ＲＯ採血量（約１２０μＬ／マウス）を血液１μＬ当たりの細胞定量用に記録した。赤血球（ＲＢＣ）を、製造業者のプロトコルに従って１×赤血球溶解緩衝液（Sigma）で溶解し、次いで、洗浄し、染色し、上記のようにフローサイトメトリーで分析した。安楽死させたマウスから、５ｍＬの冷たい１×ＰＢＳを腹腔内に注入して、腹水由来の細胞を採取し、注射器で吸引し、次の処理まで氷上で保存した。赤血球除去腹水を洗浄し、染色し、上記の抗体及び方法を用いて、腫瘍関連糖タンパク質発現及びＣＡＲ Ｔ細胞についてフローサイトメトリーで分析した。
免疫組織化学
腫瘍組織を４％パラホルムアルデヒド（４％ＰＦＡ、BostonBioProducts）中で３日間まで固定し、次の処理まで７０％エタノール中で保存した。免疫組織化学はシティオブホープ病理学コアが行った。簡潔には、パラフィン包埋切片（１０μｍ）を、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ、Sigma-Aldrich）、マウス抗ヒトＣＤ３（ＤＡＫＯ）、マウス抗ヒトＴＡＧ７２（ＡＢ１６８３８、Abcam）、ウサギ抗ヒトＭＵＣ１（ＡＢ４５１６７、Abcam）、ＭＵＣ１６（ＡＢ１１０７、Abcam）で染色した。画像は、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ ２．０ＨＴデジタルスライドスキャナ及び関連するＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ソフトウェア（Hamamatzu）を用いて獲得した。
腫瘍組織を４％パラホルムアルデヒド（４％ＰＦＡ、BostonBioProducts）中で３日間まで固定し、次の処理まで７０％エタノール中で保存した。免疫組織化学はシティオブホープ病理学コアが行った。簡潔には、パラフィン包埋切片（１０μｍ）を、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ、Sigma-Aldrich）、マウス抗ヒトＣＤ３（ＤＡＫＯ）、マウス抗ヒトＴＡＧ７２（ＡＢ１６８３８、Abcam）、ウサギ抗ヒトＭＵＣ１（ＡＢ４５１６７、Abcam）、ＭＵＣ１６（ＡＢ１１０７、Abcam）で染色した。画像は、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ ２．０ＨＴデジタルスライドスキャナ及び関連するＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ソフトウェア（Hamamatzu）を用いて獲得した。
統計解析
データは、特断の限り、平均値±標準誤差で示す。別段の記載がない限り、対のない両側スチューデントのｔ検定を用いて群間の統計的比較を行い、ｐ値を算出した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ＮＳ（有意ではない）。
データは、特断の限り、平均値±標準誤差で示す。別段の記載がない限り、対のない両側スチューデントのｔ検定を用いて群間の統計的比較を行い、ｐ値を算出した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ＮＳ（有意ではない）。
４－１ＢＢ細胞内補助刺激ドメインを有するＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞の構築及びＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＡＧ７２に対して活性を示すことの検証
４－１ＢＢ細胞内補助刺激ドメインを含むＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞が精製されたＴＡＧ７２に対して効果的に活性化を示すか否かの決定のため、上記細胞を、可溶性ＴＡＧ７２又はプレート結合ＴＡＧ７２のいずれかで漸増量の存在下で増殖させ、活性化の指標であるＣＤ１３７発現を測定した。
４－１ＢＢ細胞内補助刺激ドメインを含むＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞が精製されたＴＡＧ７２に対して効果的に活性化を示すか否かの決定のため、上記細胞を、可溶性ＴＡＧ７２又はプレート結合ＴＡＧ７２のいずれかで漸増量の存在下で増殖させ、活性化の指標であるＣＤ１３７発現を測定した。
結果
既報２２のように、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲレンチウイルスを用いて、ＣＤ１４＋及びＣＤ２５＋細胞（ｄＰＢＭＣ）を除去したヒト健常ドナー由来の末梢血単核細胞を形質導入した。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、調製工程中（ＣＤ１９ｔ＋選択に基づく）に濃縮され、Ｔ細胞表面に安定に発現した（図１Ｂ）。ＣＡＲ Ｔ細胞はｅｘ ｖｉｖｏで増殖し、その動態は類似し、Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞に対するＣＤ４：ＣＤ８比は同等であった（図１Ｃ）。重要なことに、ＴＡＧ７２に対するＣＡＲ Ｔ細胞の活性化の最初の尺度として、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、プレート結合したが非可溶性精製ＴＡＧ７２と共に培養した場合、表面上で用量依存性のＣＤ１３７発現を示した（図１Ｄ）。さらに、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、血小板結合ＴＡＧ７２（非可溶性精製ＴＡＧ７２）と共に培養した場合、他の活性因子指標、特に細胞表面ＣＤ６９発現及びＩＦＮγ放出の用量依存的誘導を示した（図２）。
既報２２のように、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲレンチウイルスを用いて、ＣＤ１４＋及びＣＤ２５＋細胞（ｄＰＢＭＣ）を除去したヒト健常ドナー由来の末梢血単核細胞を形質導入した。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、調製工程中（ＣＤ１９ｔ＋選択に基づく）に濃縮され、Ｔ細胞表面に安定に発現した（図１Ｂ）。ＣＡＲ Ｔ細胞はｅｘ ｖｉｖｏで増殖し、その動態は類似し、Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞に対するＣＤ４：ＣＤ８比は同等であった（図１Ｃ）。重要なことに、ＴＡＧ７２に対するＣＡＲ Ｔ細胞の活性化の最初の尺度として、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、プレート結合したが非可溶性精製ＴＡＧ７２と共に培養した場合、表面上で用量依存性のＣＤ１３７発現を示した（図１Ｄ）。さらに、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、血小板結合ＴＡＧ７２（非可溶性精製ＴＡＧ７２）と共に培養した場合、他の活性因子指標、特に細胞表面ＣＤ６９発現及びＩＦＮγ放出の用量依存的誘導を示した（図２）。
ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がインビトロでＴＡＧ７２陽性卵巣がん細胞を選択的に標的とし、その活性化を示すことの検証
ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＡＧ７２陽性がん細胞に対して選択的活性を示すか否かの決定のため、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞をＴＡＧ７２陽性又はＴＡＧ７２陰性卵巣がん細胞の存在下で増殖させ、卵巣がん細胞の死滅率を定量した。
ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＡＧ７２陽性がん細胞に対して選択的活性を示すか否かの決定のため、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞をＴＡＧ７２陽性又はＴＡＧ７２陰性卵巣がん細胞の存在下で増殖させ、卵巣がん細胞の死滅率を定量した。
結果
ＴＡＧ７２陽性がん細胞に対するＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の選択的活性（標的細胞の標的化及び細胞死の付与を含む）の評価の第一段階として、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ８、ＣＯＶ３６２．４、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０を含むヒト卵巣がん細胞株及びＴＡＧ７２＋結腸がん細胞株ＬＳ１７４ＴにおけるＴＡＧ７２発現を評価し、ＴＡＧ７２陽性がん細胞株を同定した。以前の研究では、卵巣腫瘍患者サンプルの免疫組織化学及びヒト卵巣がん細胞株のウェスタンブロット法により、ＴＡＧ７２の発現が示された（非特許文献１１；Ｐｏｎｎｕｓａｍｙ ＭＰ， Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ Ｇ，Ｓｉｎｇｈ ＡＰ， Ｃｈａｕｈａｎ ＳＣ， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＳＬ， Ｊａｉｎ Ｍ， Ｓｍｉｔｈ Ｌ， Ｄａｖｉｓ ＪＳ， Ｒｅｍｍｅｎｇａ ＳＷ， Ｂａｔｒａ ＳＫ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＡＧ－７２ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ．２００７；２５１（２）：２４７－５７）。フローサイトメトリーで、ＴＡＧ７２はＯＶＣＡＲ３細胞（約４２％）及びＯＶ９０細胞（約９０％）でより多く発現され、ＣＯＶ３６２．４細胞では非常に低いレベルで検出された（図３Ａ）。ＴＡＧ７２は、ＳＫＯＶ３及びＯＶＣＡＲ８細胞上に存在しなかった。腫瘍細胞の免疫蛍光染色により、ＴＡＧ７２の発現及び細胞表面及び細胞内での細胞局在が確認された。特に、腫瘍動物の腹水から採取したＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞上のＴＡＧ７２の発現は、インビトロ培養細胞と比較して高かった（図４）。
ＴＡＧ７２陽性がん細胞に対するＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の選択的活性（標的細胞の標的化及び細胞死の付与を含む）の評価の第一段階として、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ８、ＣＯＶ３６２．４、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０を含むヒト卵巣がん細胞株及びＴＡＧ７２＋結腸がん細胞株ＬＳ１７４ＴにおけるＴＡＧ７２発現を評価し、ＴＡＧ７２陽性がん細胞株を同定した。以前の研究では、卵巣腫瘍患者サンプルの免疫組織化学及びヒト卵巣がん細胞株のウェスタンブロット法により、ＴＡＧ７２の発現が示された（非特許文献１１；Ｐｏｎｎｕｓａｍｙ ＭＰ， Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ Ｇ，Ｓｉｎｇｈ ＡＰ， Ｃｈａｕｈａｎ ＳＣ， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＳＬ， Ｊａｉｎ Ｍ， Ｓｍｉｔｈ Ｌ， Ｄａｖｉｓ ＪＳ， Ｒｅｍｍｅｎｇａ ＳＷ， Ｂａｔｒａ ＳＫ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＡＧ－７２ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ．２００７；２５１（２）：２４７－５７）。フローサイトメトリーで、ＴＡＧ７２はＯＶＣＡＲ３細胞（約４２％）及びＯＶ９０細胞（約９０％）でより多く発現され、ＣＯＶ３６２．４細胞では非常に低いレベルで検出された（図３Ａ）。ＴＡＧ７２は、ＳＫＯＶ３及びＯＶＣＡＲ８細胞上に存在しなかった。腫瘍細胞の免疫蛍光染色により、ＴＡＧ７２の発現及び細胞表面及び細胞内での細胞局在が確認された。特に、腫瘍動物の腹水から採取したＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞上のＴＡＧ７２の発現は、インビトロ培養細胞と比較して高かった（図４）。
本発明者らのＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗原依存性活性を評価するため、ＴＡＧ７２陽性及び陰性卵巣腫瘍標的との共培養アッセイを、Ｅ：Ｔ比１：１～１：２で行い、それらの殺傷能を測定した。２４時間後、抗原特異的Ｔ細胞媒介性殺傷活性は、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞と比較してＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で明らかであった（図３Ｂ）。ＴＡＧ７２発現標的中、平均５９％のＬＳ１７４Ｔ、７９％のＯＶＣＡＲ３、及び６７％のＯＶ９０細胞が殺傷された。７２時間後、同じ腫瘍株の殺傷は各々、７７％、９０％、９７％に増えた。ＴＡＧ７２Ｂζ ＣＡＲ Ｔ細胞の、ＴＡＧ７２陰性又は低発現ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ８、及びＣＯＶ３６２．４細胞の殺傷は最小限であった。７２時間後、ＴＡＧ７２陽性腫瘍細胞に対するＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖は２～３倍であった（図３Ｃ）。同様の腫瘍殺傷は、より低いＥ：Ｔ比１：１０で観察され、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の強力な殺傷能が示された。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍殺傷能が、腫瘍細胞から放出された可溶性ＴＡＧ７２により受けた影響は最小限であった（図５）。ＣＡＲ Ｔ細胞からのサイトカイン産生を、Ｔ細胞活性の付加的な尺度として測定した。ＩＦＮγ及びＩＬ－２サイトカイン産生は、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を抗原陽性腫瘍標的であるＯＶＣＡＲ３、ＬＳ１７４Ｔ及びＯＶ９０と共培養した場合にのみ観察された（図３Ｄ及び３Ｅ）。ＩＬ－２産生は初期時点（Ｔ＝２４時間）でピークに達し、その後の時点（Ｔ＝７２時間）ではＯＶＣＡＲ３に対してのみ検出可能であったのに対して、ＩＦＮγレベルは７２時間全体にわたって上昇を示した。
ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞が卵巣がん腹水由来のＴＡＧ７２陽性細胞をインビトロで選択的に標的とすることの検証
さらに、ＴＡＧ７２が卵巣がんＣＡＲ標的であり、本発明者らのＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を確認するため、ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞を３名の患者（ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、ＯＡＳ７）のヒト卵巣がん腹水の存在下で増殖させた。
さらに、ＴＡＧ７２が卵巣がんＣＡＲ標的であり、本発明者らのＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を確認するため、ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞を３名の患者（ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、ＯＡＳ７）のヒト卵巣がん腹水の存在下で増殖させた。
結果
ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、及びＯＡＳ７由来の、解凍されたばかりの腹水は、フローサイトメトリーで各々、６２％、８０％、及び６７％のＴＡＧ７２を発現したが、培養７２時間後には各々２％、５３％、及び１９％に低下した（図３Ｆ）。特定の理論に縛られることを望まないが、ＴＡＧ７２発現低下は、ＴＡＧ７２発現の維持に対するｅｘ ｖｉｖｏ培養条件の影響を反映しうる（Ｈｏｒａｎ Ｈａｎｄ Ｐ， Ｃｏｌｃｈｅｒ Ｄ， Ｓａｌｏｍｏｎ Ｄ， Ｒｉｄｇｅ Ｊ， Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｐ， Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． １９８５； ４５（２）：８３３－４０）。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腹水との共培養７２時間後に細胞溶解活性を示し、ＴＡＧ７２－陰性ＯＡＳ３細胞に対して検出可能な抗腫瘍活性を示さず、ＴＡＧ７２－陽性ＯＡＳ４及びＯＡＳ７細胞の強力かつ選択的なＣＡＲ媒介性殺傷を示した（図３Ｇ）。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＯＡＳ４に対してＩＦＮγ及びＩＬ－２を産生したが、ＯＡＳ３及びＯＡＳ７細胞に対しては産生しなかった（図３Ｈ）。これらのデータは、ＴＡＧ７２‐ＣＡＲ Ｔ細胞がインビトロで卵巣がん腹水由来のＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的化することを示唆する。
ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、及びＯＡＳ７由来の、解凍されたばかりの腹水は、フローサイトメトリーで各々、６２％、８０％、及び６７％のＴＡＧ７２を発現したが、培養７２時間後には各々２％、５３％、及び１９％に低下した（図３Ｆ）。特定の理論に縛られることを望まないが、ＴＡＧ７２発現低下は、ＴＡＧ７２発現の維持に対するｅｘ ｖｉｖｏ培養条件の影響を反映しうる（Ｈｏｒａｎ Ｈａｎｄ Ｐ， Ｃｏｌｃｈｅｒ Ｄ， Ｓａｌｏｍｏｎ Ｄ， Ｒｉｄｇｅ Ｊ， Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｐ， Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． １９８５； ４５（２）：８３３－４０）。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腹水との共培養７２時間後に細胞溶解活性を示し、ＴＡＧ７２－陰性ＯＡＳ３細胞に対して検出可能な抗腫瘍活性を示さず、ＴＡＧ７２－陽性ＯＡＳ４及びＯＡＳ７細胞の強力かつ選択的なＣＡＲ媒介性殺傷を示した（図３Ｇ）。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＯＡＳ４に対してＩＦＮγ及びＩＬ－２を産生したが、ＯＡＳ３及びＯＡＳ７細胞に対しては産生しなかった（図３Ｈ）。これらのデータは、ＴＡＧ７２‐ＣＡＲ Ｔ細胞がインビトロで卵巣がん腹水由来のＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的化することを示唆する。
マウスモデルにおいて、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がインビボで卵巣腹水に局所的に送達され、強力な抗腫瘍活性を示し、マウスの生存を延ばすことの検証
ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボにおける治療可能性を評価するため、免疫不全ＮＳＧマウスでＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３腫瘍を選択的に標的とする能力を試験した。このマウスモデルは、後期ヒト疾患で観察される腹膜卵巣腫瘍に類似する。ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により送達した。
ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボにおける治療可能性を評価するため、免疫不全ＮＳＧマウスでＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３腫瘍を選択的に標的とする能力を試験した。このマウスモデルは、後期ヒト疾患で観察される腹膜卵巣腫瘍に類似する。ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により送達した。
結果
ＯＶＣＡＲ３細胞をレンチウイルスで形質導入してｅＧＦＰ／ｆｆｌｕｃを発現させ、非侵襲的光学イメージングを介して腫瘍増殖を追跡させえた。腫瘍腹腔内投与注射の１４日後、マウスをＭｏｃｋ又はＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞（５．０×１０６）で全身静脈内（ｉ．ｖ．）又は局所腹腔内投与送達により処理した（図６Ａ）。局所腹腔内投与送達を介してＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスでは、迅速な抗腫瘍効果が観察され、処置の１～２週間後に最大の抗腫瘍反応に達した（図６Ｂ及び６Ｃ）。局所送達と比較して、ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞の経静脈投与送達の抗腫瘍応答は限定された。マウスの抗腫瘍反応は３～４週間持続したが、最終的にはマウスで腫瘍再発が観察された。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の局所腹腔内投与送達は、マウスの生存を有意に延び、経静脈投与送達により観察された利益は限定されていた（図６Ｄ）。
ＯＶＣＡＲ３細胞をレンチウイルスで形質導入してｅＧＦＰ／ｆｆｌｕｃを発現させ、非侵襲的光学イメージングを介して腫瘍増殖を追跡させえた。腫瘍腹腔内投与注射の１４日後、マウスをＭｏｃｋ又はＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞（５．０×１０６）で全身静脈内（ｉ．ｖ．）又は局所腹腔内投与送達により処理した（図６Ａ）。局所腹腔内投与送達を介してＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスでは、迅速な抗腫瘍効果が観察され、処置の１～２週間後に最大の抗腫瘍反応に達した（図６Ｂ及び６Ｃ）。局所送達と比較して、ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞の経静脈投与送達の抗腫瘍応答は限定された。マウスの抗腫瘍反応は３～４週間持続したが、最終的にはマウスで腫瘍再発が観察された。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の局所腹腔内投与送達は、マウスの生存を有意に延び、経静脈投与送達により観察された利益は限定されていた（図６Ｄ）。
腹腔内投与療法と経静脈投与療法の間で観察された潜在的な相違に対処するため、マウスの血中及び腹水中のＣＡＲ Ｔ細胞を定量した。注目すべきことに、腹腔内投与後６日目のマウスの血中にはかなりの数のＣＡＲ Ｔ細胞（ｈｕＣＤ４５＋ＣＤ１９ｔ＋）が認められ、同じ時点で静脈内投与されたマウスの血中のＣＡＲ Ｔ細胞は５倍以上も少なかった（図６Ｅ及び図７）。しかし、腹腔内投与したマウスと腹腔内投与したマウスの血中ＣＡＲ Ｔ細胞数は、投与後１～２週間で増加し、投与後４週間で有意に減少した。処置したマウスの腹水中のＣＡＲ Ｔ細胞は、腹腔内処置後６日目に腫瘍部位に維持され、同時点で静脈内処置したマウスでは検出可能なＣＡＲ Ｔ細胞は検出されなかった。しかし、投与後１３日目に、静脈内投与及び腹腔内投与したマウスでは、ＣＡＲ Ｔ細胞のレベルは同程度であった（図６Ｆ）。特定の理論に縛られることを望まないが、当該データは、ＣＡＲ Ｔ細胞が経静脈投与送達後に最終的に腫瘍に到達するが、腹腔内投与送達と比較して動態が遅延することを示唆しており、これがこの投与経路による観察された治療の欠如の一因でありうる。大部分はＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞である可能性が高いＣＤ４５陰性細胞は、腹腔内投与ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞処理マウスでは有意に枯渇したが、腹腔内投与又は経静脈投与したＭｏｃｋＴ細胞又はＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与したマウスでは枯渇しなかった。当該データは、マウスの腹膜卵巣腫瘍を標的とする効果的な方法として、ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞の局所的な腹腔内送達を支持する。
ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がＯＶ９０腹腔内投与モデルにおいてＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的とすることの検証及び単回投与と反復投与との効能の比較
ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の効能を評価するため、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回又は複数回反復投与し、経時的に腫瘍サイズを評価した。
ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の効能を評価するため、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回又は複数回反復投与し、経時的に腫瘍サイズを評価した。
結果
特に、ＯＶ９０腹腔内投与モデルは、ＯＶＣＡＲ３と比較して、インビトロでより均一なＴＡＧ７２発現を示す（図３Ａ）。ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける局所ＣＡＲ Ｔ細胞送達は、ＯＶＣＡＲ３モデル腹腔内投与と比較してＴＡＧ７２細胞の選択的標的化を示した。対照的に、静脈内投与のＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞処理は、ＯＶ９０モデルでは抗腫瘍効果を示さなかった（図８）。このモデルでは、おそらくこのモデルの積極的な性質により、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の腹腔内投与により、全生存期間が約２５日延びただけであった（図８）。この観察結果を踏まえて、単回投与と比較したＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の反復投与の効能が評価され、治療応答が明らかに改善された（図９Ａ）。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与と比較して、１ヵ月にわたる反復投与は、ＯＶ９０モデルにおいてより持続的な抗腫瘍反応を示した（図９Ｂ及び９Ｃ）。相対腫瘍増殖動態としてプロットすると、反復投与は単回投与と比較して腫瘍のより広範な退縮を促進し、腫瘍のより持続的な制御を促進した（図９Ｄ）。
特に、ＯＶ９０腹腔内投与モデルは、ＯＶＣＡＲ３と比較して、インビトロでより均一なＴＡＧ７２発現を示す（図３Ａ）。ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける局所ＣＡＲ Ｔ細胞送達は、ＯＶＣＡＲ３モデル腹腔内投与と比較してＴＡＧ７２細胞の選択的標的化を示した。対照的に、静脈内投与のＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞処理は、ＯＶ９０モデルでは抗腫瘍効果を示さなかった（図８）。このモデルでは、おそらくこのモデルの積極的な性質により、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の腹腔内投与により、全生存期間が約２５日延びただけであった（図８）。この観察結果を踏まえて、単回投与と比較したＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の反復投与の効能が評価され、治療応答が明らかに改善された（図９Ａ）。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与と比較して、１ヵ月にわたる反復投与は、ＯＶ９０モデルにおいてより持続的な抗腫瘍反応を示した（図９Ｂ及び９Ｃ）。相対腫瘍増殖動態としてプロットすると、反復投与は単回投与と比較して腫瘍のより広範な退縮を促進し、腫瘍のより持続的な制御を促進した（図９Ｄ）。
本試験では、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を反復投与したマウス（５５日間の利益）では、単回投与（３０日間の利益）と比較して、全生存期間が有意に延長した（図９Ｅ）。反復投与したマウスの腹膜腫瘍では、Ｔ細胞数が増加した（図９Ｆ）。しかし、重要なことは、ＯＶＣＡＲ３モデルと比較して、ＯＶ９０保有マウスの血中ＣＡＲ Ｔ細胞数、増殖性及び持続性の低下が観察されたことである（図１０）。これらの結果は、特定の理論に縛られることを望まないが、このより侵攻的な腫瘍モデルは、Ｔ細胞の機能及び全体的なＣＡＲ Ｔ細胞の効力を妨げる抑制メカニズムも有しうることを示唆する。まとめると、これらのデータは、卵巣がん異種移植モデルにおいてＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の強力な抗腫瘍活性を実証し、また、局所送達されたＣＡＲ Ｔ細胞の反復投与は、単回投与と比較して、腫瘍をより強く制御しうることも示唆する。
ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞療法後の腫瘍再発が抗原逃避を示すことの判定
上記実施例でＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍再発前に低下することが観察されたことを考慮し、腫瘍におけるＴＡＧ７２の発現を経時的に定量化し、ＴＡＧ７２発現の消失がＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞数の低下と相関するかを判定した。
上記実施例でＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍再発前に低下することが観察されたことを考慮し、腫瘍におけるＴＡＧ７２の発現を経時的に定量化し、ＴＡＧ７２発現の消失がＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞数の低下と相関するかを判定した。
結果
ＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する主要な耐性機序の一つは、最終的な抗原喪失又は逃避を促進する固形腫瘍に存在する腫瘍抗原の不均一性である（非特許文献４）。２つのインビボモデル（上記実施例の）におけるＣＡＲ Ｔ細胞の消失が腫瘍再発前におこったことを考えると、腫瘍におけるＴＡＧ７２発現の潜在的消失は、ＣＡＲ Ｔ細胞の消失と相関する。前者を評価するため、Ｍｏｃｋ及びＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞処理マウス由来の腫瘍におけるＴＡＧ７２の発現を、治療前及び治療後で経時的に測定した。ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６は全て卵巣がんの潜在的標的として同定されたので、ＴＡＧ７２陰性ＯＶＣＡＲ８、及びＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞上の当該細胞表面抗原の発現を定量した。ＯＶＣＡＲ８によるＭＵＣ１の発現はわずかに低レベルであり、ＴＡＧ７２及びＭＵＣ１６では存在しなかったが、ＯＶＣＡＲ３は３種類の抗原すべてを様々なレベルで発現し、ＯＶ９０によるＭＵＣ１の発現は低く、ＭＵＣ１６では発現しなかった（図１１Ａ）。したがって、Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理したマウス由来のＯＶＣＡＲ３腫瘍における当該抗原の発現を定量した。Ｔ細胞注入の１２週間後に、Ｍｏｃｋ処理マウス由来の腫瘍は、ＴＡＧ７２（細胞系のフローサイトメトリー分析に類似）、ＭＵＣ１６、及びＭＵＣ１の発現は不均一であった（図１１Ｂ）。しかし、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理したマウスからの初期時点での腫瘍再発は、ＭＵＣ１６及びＭＵＣ１の発現を維持しつつ、ＴＡＧ７２発現が劇的に低下した。同様に、ＯＶ９０腫瘍モデルにおけるＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の反復処理によってもまた、治療後の早期再発腫瘍におけるＴＡＧ７２発現が低下した（図１１Ｅ）。特に、ＴＡＧ７２の発現は、後の時点での腫瘍再発、固形腫瘍及び腹水において高レベルで検出された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。この所見をさらにインビトロで確認するため、ＣＡＲ Ｔ細胞共培養後の腫瘍細胞におけるＴＡＧ７２の発現を定量化し、ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養の非存在下で増殖した腫瘍細胞と比較して低下していることが見いだされた（図１１Ｅ）。全体として、当該データは、抗原逃避がＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞療法後の腫瘍再発に重要な機能を担いうることを示唆する。
ＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する主要な耐性機序の一つは、最終的な抗原喪失又は逃避を促進する固形腫瘍に存在する腫瘍抗原の不均一性である（非特許文献４）。２つのインビボモデル（上記実施例の）におけるＣＡＲ Ｔ細胞の消失が腫瘍再発前におこったことを考えると、腫瘍におけるＴＡＧ７２発現の潜在的消失は、ＣＡＲ Ｔ細胞の消失と相関する。前者を評価するため、Ｍｏｃｋ及びＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞処理マウス由来の腫瘍におけるＴＡＧ７２の発現を、治療前及び治療後で経時的に測定した。ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６は全て卵巣がんの潜在的標的として同定されたので、ＴＡＧ７２陰性ＯＶＣＡＲ８、及びＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞上の当該細胞表面抗原の発現を定量した。ＯＶＣＡＲ８によるＭＵＣ１の発現はわずかに低レベルであり、ＴＡＧ７２及びＭＵＣ１６では存在しなかったが、ＯＶＣＡＲ３は３種類の抗原すべてを様々なレベルで発現し、ＯＶ９０によるＭＵＣ１の発現は低く、ＭＵＣ１６では発現しなかった（図１１Ａ）。したがって、Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理したマウス由来のＯＶＣＡＲ３腫瘍における当該抗原の発現を定量した。Ｔ細胞注入の１２週間後に、Ｍｏｃｋ処理マウス由来の腫瘍は、ＴＡＧ７２（細胞系のフローサイトメトリー分析に類似）、ＭＵＣ１６、及びＭＵＣ１の発現は不均一であった（図１１Ｂ）。しかし、ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理したマウスからの初期時点での腫瘍再発は、ＭＵＣ１６及びＭＵＣ１の発現を維持しつつ、ＴＡＧ７２発現が劇的に低下した。同様に、ＯＶ９０腫瘍モデルにおけるＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の反復処理によってもまた、治療後の早期再発腫瘍におけるＴＡＧ７２発現が低下した（図１１Ｅ）。特に、ＴＡＧ７２の発現は、後の時点での腫瘍再発、固形腫瘍及び腹水において高レベルで検出された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。この所見をさらにインビトロで確認するため、ＣＡＲ Ｔ細胞共培養後の腫瘍細胞におけるＴＡＧ７２の発現を定量化し、ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養の非存在下で増殖した腫瘍細胞と比較して低下していることが見いだされた（図１１Ｅ）。全体として、当該データは、抗原逃避がＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞療法後の腫瘍再発に重要な機能を担いうることを示唆する。
ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞がインビトロでＴＡＧ７２陽性卵巣がん細胞を選択的に標的とし、その活性化を示すことの検証
ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞もまたＴＡＧ７２陽性がん細胞を効果的に殺傷するかを判定するため、ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞をＴＡＧ７２陽性卵巣がん細胞の存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。
ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞もまたＴＡＧ７２陽性がん細胞を効果的に殺傷するかを判定するため、ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞をＴＡＧ７２陽性卵巣がん細胞の存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。
結果
抗ＴＡＧ－７２抗体クローンＣＣ４９のヒト化変異体（ＩＤＥＣ－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ、Ｖ１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ、又はＶ５９／１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ）から、ＩＤＥＣ、Ｖ１５、又は複合Ｖ５９／Ｖ１５抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）のいずれかを発現する一連の代表的な４－１ＢＢＢ共刺激ＣＡＲ Ｔ細胞；図１９－２１（カルボキシ末端に存在するＴ２Ａ及びＣＤ１ｔ配列なしで示される）を作製した。当該ＣＡＲはすべて、同じ細胞外ドメイン（ヒンジのアミノ酸１０におけるＰへの変異を伴うＩｇＧ４ヒンジ；配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ及びヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインを有するリンカー）、ＣＤ４膜貫通ドメイン、及び４－１ＢＢ細胞内補助刺激シグナル伝達ドメインを利用する。これらのヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＯＶ９０又はＯＶＣＡＲ３卵巣がん細胞のいずれかの存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。インビトロでは、ＩＤＥＣ及びＶ１５ ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＡＧ７２を発現する卵巣がん細胞株への曝露後に、同等の強力なＴ細胞媒介性抗原依存性細胞傷害、活性化及びＴ細胞増殖を示す（図１３Ａ－１３Ｃ）。Ｖ５９／１５ ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲは、このアッセイではほとんど活性を示さかったため、次の実験から除した。
抗ＴＡＧ－７２抗体クローンＣＣ４９のヒト化変異体（ＩＤＥＣ－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ、Ｖ１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ、又はＶ５９／１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ）から、ＩＤＥＣ、Ｖ１５、又は複合Ｖ５９／Ｖ１５抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）のいずれかを発現する一連の代表的な４－１ＢＢＢ共刺激ＣＡＲ Ｔ細胞；図１９－２１（カルボキシ末端に存在するＴ２Ａ及びＣＤ１ｔ配列なしで示される）を作製した。当該ＣＡＲはすべて、同じ細胞外ドメイン（ヒンジのアミノ酸１０におけるＰへの変異を伴うＩｇＧ４ヒンジ；配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ及びヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインを有するリンカー）、ＣＤ４膜貫通ドメイン、及び４－１ＢＢ細胞内補助刺激シグナル伝達ドメインを利用する。これらのヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＯＶ９０又はＯＶＣＡＲ３卵巣がん細胞のいずれかの存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。インビトロでは、ＩＤＥＣ及びＶ１５ ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＡＧ７２を発現する卵巣がん細胞株への曝露後に、同等の強力なＴ細胞媒介性抗原依存性細胞傷害、活性化及びＴ細胞増殖を示す（図１３Ａ－１３Ｃ）。Ｖ５９／１５ ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲは、このアッセイではほとんど活性を示さかったため、次の実験から除した。
ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおいてＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的とすることの検証及びＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与と反復投与による効能の比較
ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の効能評価のため、ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回又は複数回反復投与して、経時的に腫瘍サイズを評価した。
ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の効能評価のため、ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回又は複数回反復投与して、経時的に腫瘍サイズを評価した。
結果
ＯＶ９０腫瘍細胞株上のＴＡＧ７２抗原の内因性発現をフローサイトメトリーで測定した。ＯＶ９０－ｆｆｌｕｃ細胞をＮＳＧマウスの腹腔（ｉ．ｐ．）内腔に注入し、生物発光イメージングにより追跡し、流束（写真／秒）として報告した。腫瘍注射後８日目に、腫瘍マウスの腹腔内にＴＡＧ７２ ＣＡＲ Ｔ細胞の５．０×１０６ Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ、又はＶ１５変異体を局所的に投与した（図１４Ａ）。単一又は反復Ｔ細胞処理マウスの腫瘍量を生物発光イメージングにより定量した。破線はＴ細胞による初回治療と反復治療の時点を示す。興味深いことに、発明者らにより、インビボ卵巣腫瘍モデルを用いた、Ｖ１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚによる局所腹腔内投与により、ＩＤＥＣ－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲよりも抗原陽性標的（ＯＶ９０移植腫瘍）の腫瘍量が大幅に低下したことが示された（図１４Ａ－１４Ｂ）。この観察結果を踏まえて、単回投与と比較したＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の反復投与の効能を評価したところ、治療応答が明らかに改善された（図１４Ｂ）。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与と比較して、５０日間以上にわたる反復投与により、ＯＶ９０モデルにおける抗腫瘍反応は持続された（図１４Ｂ）。
ＯＶ９０腫瘍細胞株上のＴＡＧ７２抗原の内因性発現をフローサイトメトリーで測定した。ＯＶ９０－ｆｆｌｕｃ細胞をＮＳＧマウスの腹腔（ｉ．ｐ．）内腔に注入し、生物発光イメージングにより追跡し、流束（写真／秒）として報告した。腫瘍注射後８日目に、腫瘍マウスの腹腔内にＴＡＧ７２ ＣＡＲ Ｔ細胞の５．０×１０６ Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ、又はＶ１５変異体を局所的に投与した（図１４Ａ）。単一又は反復Ｔ細胞処理マウスの腫瘍量を生物発光イメージングにより定量した。破線はＴ細胞による初回治療と反復治療の時点を示す。興味深いことに、発明者らにより、インビボ卵巣腫瘍モデルを用いた、Ｖ１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚによる局所腹腔内投与により、ＩＤＥＣ－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲよりも抗原陽性標的（ＯＶ９０移植腫瘍）の腫瘍量が大幅に低下したことが示された（図１４Ａ－１４Ｂ）。この観察結果を踏まえて、単回投与と比較したＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の反復投与の効能を評価したところ、治療応答が明らかに改善された（図１４Ｂ）。ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与と比較して、５０日間以上にわたる反復投与により、ＯＶ９０モデルにおける抗腫瘍反応は持続された（図１４Ｂ）。
ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞が、OVCAR3腹腔内投与モデルにおいてＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的とすることの検証及び単回投与レジメンとして投与したＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性の比較
ＯＶＣＡＲ３腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の効能を評価するため、ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回投与し、経時的に腫瘍サイズを評価した。
ＯＶＣＡＲ３腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の効能を評価するため、ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回投与し、経時的に腫瘍サイズを評価した。
結果
内因性表面ＴＡＧ７２発現を、ＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞上のフローサイトメトリーで分析した。次に、ＯＶＣＡＲ３－ｆｆｌｕｃ腫瘍をＮＳＧマウスの腹腔内に注入し、５．０×１０６Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ又はＶ１５変異型ＴＡＧ７２ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回投与して静脈内投与した（図１５Ａ）。単回投与マウスの腫瘍量を生物発光イメージングにより定量化し、流束（写真／秒）として報告した。破線はＴ細胞による治療の時点を示す。興味深いことに、Ｖ１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、ＩＤＥＣ－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は投与しない場合、ＯＶＣＡＲ３担がんマウスに対する強力な抗腫瘍反応を媒介することができる（図１５Ｂ）。Ｖ１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲのインビボにおけるこの抗腫瘍反応は、ある部分、ＩＤＥＣ－ＴＡＧ７２－ＢＢｚと比較した、増殖増加が介在し、その結果、反応寿命が延びた（図１５Ｃ）。（図１５Ｃ）。
内因性表面ＴＡＧ７２発現を、ＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞上のフローサイトメトリーで分析した。次に、ＯＶＣＡＲ３－ｆｆｌｕｃ腫瘍をＮＳＧマウスの腹腔内に注入し、５．０×１０６Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ又はＶ１５変異型ＴＡＧ７２ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回投与して静脈内投与した（図１５Ａ）。単回投与マウスの腫瘍量を生物発光イメージングにより定量化し、流束（写真／秒）として報告した。破線はＴ細胞による治療の時点を示す。興味深いことに、Ｖ１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、ＩＤＥＣ－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は投与しない場合、ＯＶＣＡＲ３担がんマウスに対する強力な抗腫瘍反応を媒介することができる（図１５Ｂ）。Ｖ１５－ＴＡＧ７２－ＢＢｚ ＣＡＲのインビボにおけるこの抗腫瘍反応は、ある部分、ＩＤＥＣ－ＴＡＧ７２－ＢＢｚと比較した、増殖増加が介在し、その結果、反応寿命が延びた（図１５Ｃ）。（図１５Ｃ）。
ヒト化ＴＡＧ７２－ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞設計が腫瘍殺傷、Ｔ細胞増殖、活性化、枯渇、及びサイトカイン産生に影響することの判定
ヒト化ＴＡＧ７２ ＣＡＲ Ｔ細胞の設計評価のため、Ｖ１５ ｓｃＦｖを特徴とし、リンカー、膜貫通及び共刺激ドメインを変化させた、一連の代表的なＴＡＧ７２ ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。
ヒト化ＴＡＧ７２ ＣＡＲ Ｔ細胞の設計評価のため、Ｖ１５ ｓｃＦｖを特徴とし、リンカー、膜貫通及び共刺激ドメインを変化させた、一連の代表的なＴＡＧ７２ ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。
結果
Ｖ１５ ｓｃＦｖクローンを有する７つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体は全て、ＣＡＲ発現安定性を示した（図１６Ａ）。インビトロ腫瘍殺傷活性では、ヒト化ＴＡＧ７２ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ）又はＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）卵巣がん細胞のいずれかの存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。７つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体は全て、ＴＡＧ７２－陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ細胞の強力で選択的なＣＡＲ介在性の殺傷を示し、ＴＡＧ７２－陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞に対する検出可能な抗腫瘍活性は示されなかった（図１６Ｂ）。Ｔ細胞の増殖は様々で、ＴＡＧ７２陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞よりもＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ細胞の方が高かった（図１６Ｃ）。ＣＤ１３７＋活性化指標は、代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体が、ＴＡＧ７２－陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞よりも、ＴＡＧ７２－陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ細胞において多様であり、より高いことが示された（図１６Ｄ）。腫瘍細胞を発現するＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ）に対するＣＡＲ Ｔ細胞のＰＤ－１＋枯渇標識（７２時間）。
Ｖ１５ ｓｃＦｖクローンを有する７つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体は全て、ＣＡＲ発現安定性を示した（図１６Ａ）。インビトロ腫瘍殺傷活性では、ヒト化ＴＡＧ７２ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ）又はＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）卵巣がん細胞のいずれかの存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。７つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体は全て、ＴＡＧ７２－陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ細胞の強力で選択的なＣＡＲ介在性の殺傷を示し、ＴＡＧ７２－陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞に対する検出可能な抗腫瘍活性は示されなかった（図１６Ｂ）。Ｔ細胞の増殖は様々で、ＴＡＧ７２陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞よりもＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ細胞の方が高かった（図１６Ｃ）。ＣＤ１３７＋活性化指標は、代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体が、ＴＡＧ７２－陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞よりも、ＴＡＧ７２－陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ細胞において多様であり、より高いことが示された（図１６Ｄ）。腫瘍細胞を発現するＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ）に対するＣＡＲ Ｔ細胞のＰＤ－１＋枯渇標識（７２時間）。
様々なＶ１５－ＣＡＲデザインはまた、ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロサイトカイン産生に影響を及ぼす。腫瘍細胞を発現するＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、ＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ）に対するＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでのＩＦＮγ産生（２４時間）。ＣＤ２８ｔｍ－ＢＢｚ構築物を有するＣＡＲは、ＣＤ４ｔｍ－ＢＢｚ構築物と比較して同様の抗腫瘍活性を示すが、ＣＤ２８ｔｍは、いくつかのＴＡＧ７２陽性腫瘍細胞においてより大きなサイトカイン産生を与える（図１７）。
様々なＶ１５－ＣＡＲ設計はまた、ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロサイトカイン産生に影響を及ぼす。腫瘍細胞を発現するＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、ＯＶＣＡＲ８－ｓＴｎ）に対するＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロにおけるＩＦＮγ産生（２４時間）である。ＣＤ２８ｔｍ－ＢＢｚ構築物を有するＣＡＲは、ＣＤ４ｔｍ－ＢＢｚ構築物と比較して同様の抗腫瘍活性を示すが、ＣＤ２８ｔｍは、いくつかのＴＡＧ７２陽性腫瘍細胞において、サイトカイン産生が高まる（図１７）。ＯＶ９０細胞及び少数の代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体を用いたｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ法を用いて、リアルタイム細胞毒性アッセイを実施した。４つのＴ細胞集団をエフェクター対標的比１対２０で平板培養し、１０日間観察した。細胞指数は、生腫瘍数を示す。３つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体は全て、この長期殺傷アッセイにおいて強力な抗腫瘍活性を示した（図１８Ａ）。長期殺傷アッセイの終点にて、残存細胞を収集し、フローサイトメトリーで分析した。３つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２－ＣＡＲ Ｔ細胞変異体すべてについてＴ細胞増殖が示された（図１８Ｂ）。
Claims (28)
- キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体が、配列番号１、３３又は３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ標的Ｔａｇ－７２、スペーサー、膜貫通ドメイン、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、核酸分子。
- 膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項１に記載の核酸分子。
- ＣＤ２８膜貫通ドメインは配列番号１４を含む、請求項２に記載の核酸分子。
- ＣＤ４膜貫通ドメインは配列番号１６を含む、請求項２に記載の核酸分子。
- スペーサーの領域は、配列番号２～１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- スペーサーは、１０～５０個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- ４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- ３～１５個のアミノ酸のリンカーが、４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する、請求項１に記載の核酸分子。
- ｓｃＦｖは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- ｓｃＦｖは、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- ｓｃＦｖは、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 請求項１に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項１に記載の核酸分子を含むウイルスベクター。
- 請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターにより形質導入された、ヒトＴ細胞集団。
- セントラルメモリーＴ細胞を含む、請求項１６に記載のヒトＴ細胞集団。
- 請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターにより形質導入された自己又は同種のヒトＴ細胞集団の投与を含む、患者の固形腫瘍を治療するための医薬組成物であって、ここで、前記固形腫瘍は、Ｔａｇ－７２を発現する細胞を含む、医薬組成物。
- キメラ抗原受容体は、局所的又は全身的に投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
- 前記Ｔａｇ－７２を発現する細胞は、卵巣がん細胞である、請求項１８に記載の医薬組成物。
- 自己又は同種のヒトＴ細胞集団は、単回又は反復投与により投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
- 請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＣＡＲ。
- 請求項２２に記載のＣＡＲを発現するヒトＴ細胞集団。
- ヒトＴ細胞の集団がセントラルメモリーＴ細胞を含む、請求項２３に記載のヒトＴ細胞集団。
- 請求項２２に記載のＣＡＲを発現する自己又は同種のヒトＴ細胞集団を含む、患者の固形腫瘍を治療するための医薬組成物であって、ここで、前記固形腫瘍は、Ｔａｇ－７２を発現する細胞を含む、医薬組成物。
- 前記キメラ抗原受容体は、局所的又は全身的に投与される、請求項２５に記載の医薬組成物。
- 前記Ｔａｇ－７２を発現する細胞は、卵巣がん細胞である、請求項２５に記載の医薬組成物。
- 自己又は同種のヒトＴ細胞集団は、単回又は反復投与により投与される、請求項２５に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862713485P | 2018-08-01 | 2018-08-01 | |
| US62/713,485 | 2018-08-01 | ||
| PCT/US2019/044751 WO2020028721A1 (en) | 2018-08-01 | 2019-08-01 | Tag72 targeted chimeric antigen receptor modified t cells for treatment of tag72-positive tumors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021532793A JP2021532793A (ja) | 2021-12-02 |
| JP7440489B2 true JP7440489B2 (ja) | 2024-02-28 |
Family
ID=67770564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021505687A Active JP7440489B2 (ja) | 2018-08-01 | 2019-08-01 | Ｔａｇ７２陽性腫瘍治療のためのｔａｇ７２標的化キメラ抗原受容体修飾ｔ細胞 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210308184A1 (ja) |
| EP (1) | EP3830133A1 (ja) |
| JP (1) | JP7440489B2 (ja) |
| KR (1) | KR20210040396A (ja) |
| CN (1) | CN112771079A (ja) |
| AU (1) | AU2019312673A1 (ja) |
| CA (1) | CA3108381A1 (ja) |
| WO (1) | WO2020028721A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023173116A1 (en) | 2022-03-10 | 2023-09-14 | City Of Hope | Membrane-bound il-12 for cellular immunotherapy |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017040529A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Bluebird Bio, Inc. | Anti-sialyl tn chimeric antigen receptors |
| JP2017537627A (ja) | 2014-12-05 | 2017-12-21 | シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ | Ｃｓ１標的化キメラ抗原レセプター改変ｔ細胞 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1641826A2 (en) * | 2003-06-27 | 2006-04-05 | Biogen Idec MA Inc. | Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions |
| ES2862907T3 (es) * | 2015-11-27 | 2021-10-08 | Cartherics Pty Ltd | Células genéticamente modificadas y usos de las mismas |
-
2019
- 2019-08-01 US US17/264,911 patent/US20210308184A1/en active Pending
- 2019-08-01 KR KR1020217005543A patent/KR20210040396A/ko active Search and Examination
- 2019-08-01 CA CA3108381A patent/CA3108381A1/en active Pending
- 2019-08-01 EP EP19759454.2A patent/EP3830133A1/en active Pending
- 2019-08-01 AU AU2019312673A patent/AU2019312673A1/en not_active Abandoned
- 2019-08-01 WO PCT/US2019/044751 patent/WO2020028721A1/en unknown
- 2019-08-01 JP JP2021505687A patent/JP7440489B2/ja active Active
- 2019-08-01 CN CN201980059970.XA patent/CN112771079A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017537627A (ja) | 2014-12-05 | 2017-12-21 | シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ | Ｃｓ１標的化キメラ抗原レセプター改変ｔ細胞 |
| WO2017040529A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Bluebird Bio, Inc. | Anti-sialyl tn chimeric antigen receptors |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Kristen M. HEGE et al.，"Safety, tumortrafficking and immunogenicity of chimeric antigen receptor (CAR)-T cellsspecific for TAG-72 in colorectal cancer"，Journal forImmunoTherapy of Cancer，2017年03月21日，Vol. 5, No. 1，DOI: 10.1186/s40425-017-0222-9 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210308184A1 (en) | 2021-10-07 |
| JP2021532793A (ja) | 2021-12-02 |
| CA3108381A1 (en) | 2020-02-06 |
| WO2020028721A1 (en) | 2020-02-06 |
| KR20210040396A (ko) | 2021-04-13 |
| AU2019312673A1 (en) | 2021-02-25 |
| CN112771079A (zh) | 2021-05-07 |
| EP3830133A1 (en) | 2021-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Murad et al. | Effective targeting of TAG72+ peritoneal ovarian tumors via regional delivery of CAR-engineered T cells | |
| Schneider et al. | A tandem CD19/CD20 CAR lentiviral vector drives on-target and off-target antigen modulation in leukemia cell lines | |
| US11802163B2 (en) | Chimeric antigen receptors targeting glypican-3 or mesothelin | |
| CN107406517B (zh) | 包含cd19结合域的嵌合抗原受体(car) | |
| JP7228900B2 (ja) | 操作されたナチュラルキラー細胞およびその使用 | |
| JP2022025110A (ja) | 操作されたｔ細胞を用いて癌を処置するための方法 | |
| JP2019527696A (ja) | プロｍ２マクロファージ分子の阻害剤と組み合わせてキメラ抗原受容体を用いる癌の処置 | |
| CN109476722A (zh) | 用于改善免疫细胞的功效和扩张的方法 | |
| KR102412805B1 (ko) | 세포 면역 요법을 위한 조성물 및 방법 | |
| US20230149460A1 (en) | Methods for generating engineered memory-like nk cells and compositions thereof | |
| JPWO2012176765A1 (ja) | 抗ヒトｐ−カドへリン（ｃｄｈ３）遺伝子組み換え抗体 | |
| JP7338083B2 (ja) | 抗ｈＫ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ） | |
| WO2011129379A1 (ja) | 新規抗ｈｓｐ９０モノクローナル抗体 | |
| JP2022519377A (ja) | がんのバイオマーカーとしてのｉｌ－４ｒ | |
| JP2024510739A (ja) | 新規な細胞治療システム | |
| JP7440489B2 (ja) | Ｔａｇ７２陽性腫瘍治療のためのｔａｇ７２標的化キメラ抗原受容体修飾ｔ細胞 | |
| KR20220029292A (ko) | 이종성 표적화 구조체를 발현하는 림프구 | |
| Jilani et al. | CAR-T cell therapy targeting surface expression of TYRP1 to treat cutaneous and rare melanoma subtypes | |
| CN114457117B (zh) | 树突细胞肿瘤疫苗和其用途 | |
| US11111303B2 (en) | Compositions and methods for activation of NK cells killing of prostate cancer and breast cancer cells | |
| KR20240096884A (ko) | 조작된 기억-유사 nk 세포 및 이의 조성물을 생성하기 위한 방법 | |
| WO2023198744A1 (en) | Therapeutic t cell product | |
| JP2022550328A (ja) | 治療用抗体およびインターロイキン２（ｉｌ２）を含む治療 | |
| CN117750963A (zh) | 新的细胞疗法系统 | |
| Lee et al. | Identification and Targeting of Protein Tyrosine Kinase 7 (PTK7) as an Immunotherapy Candidate for Neuroblastoma Cellular Therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220801 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230630 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230704 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20231003 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231204 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240116 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240215 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7440489 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |