KR20190114966A - 조작된 자연 살해 세포 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 조작된 자연 살해 세포가 본원에 제공된다. 세포는 선택적으로 종양 특이적 세포독성 및 종양 부위로의 회귀성을 개선하는 다른 변형을 함유한다. 조작된 자연 살해 세포를 사용하여 암 환자를 치료하는 방법이 또한 고려된다.
Description
본 발명은 암을 치료하기 위한 변형된 자연 살해(NK) 세포 또는 NK 세포주를 사용하는 요법에 관한 것이다. 치료 방법 및 세포 조성물은 또한, 특히 혈액암의 치료에서, 본 발명의 일부를 형성한다.
자연 살해 세포(NK 세포)는 선천적 면역 기능에서 역할을 하는 말초 혈액 림프구이다. NK 세포는 건강한 세포, 및 바이러스에 감염된 세포 또는 형질전환된(암) 세포를 구별하는 것을 담당하는 다양한 활성화 및 억제 수용체를 발현한다. T 세포와 달리, NK 세포는 항원 독립적인 방식으로 표적 세포에 세포독성 효과를 발휘한다. 그 결과, NK 세포는 항원 프라이밍(priming)을 필요로 하지 않으며 특정 항원의 부재시 강력한 세포독성을 나타낼 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 최근에 세포독성 T 세포를 특정 세포 유형 및 조직에 표적화하기 위해 개발되었다. 대부분의 CAR은 항체로부터 유래된 항원 인식 도메인, 및 T 세포 신호 전달에 관여하는 면역 신호전달 단백질로부터 유래된 막관통 및 세포내 부분을 가지므로, 표적 세포 집단에서 발현된 표적 항원에 결합시 T 세포의 세포독성 기능을 활성화시킨다.
보다 상세하게는, CAR은 면역 효과기 세포, 본 발명의 경우에 NK 세포에 특정 항원 특이성을 도입하는 재조합 항원 수용체이다. CAR은 면역 효과기 세포 내로 도입된 외인성 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 정의된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 키메라 항원 수용체는 리더 서열, 표적화 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 적합하게는, 표적화 도메인은 항체 분자로부터 유래되며, CAR에 항원 특이성을 부여하는 항체 분자로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 적합하게는, 본 발명의 조작된 NK 세포에서 사용하기 위한 CAR의 표적화 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)이다. scFv는 가요성 링커 폴리펩타이드에 의해 분리된 면역글로불린 경쇄, 및 면역글로불린 중쇄 분자의 가변 사슬 부분을 포함한다. 가요성 폴리펩타이드 링커는 중쇄와 경쇄를 서로 결합시켜 면역글로불린 항원 결합 도메인을 재구성한다.
NK-CAR 세포를 사용하는 대안적이고 바람직하게는 개선된 암 요법이 필요하다.
본 발명의 목적은 NK 세포에만 의존하는 요법보다 암 치료에 더 효과적인 NK-CAR 세포 및 NK-CAR 세포주를 제공하는 것이다. 보다 구체적인 구현예는 자가 표적화(self-targeting)과 같은 세포 기반 요법의 일반적인 문제를 피하면서 확인된 암, 예컨대 혈액암을 위한 치료를 제공하는 것을 목표로 한다.
발명의 요약
본 발명은 CD38 발현 암을 치료하는데 사용하기 위한 CD38에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해(NK) 세포를 제공한다.
본 발명은 CD38에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 KHYG-1 세포를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 CD38에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해(NK) 세포를 환자에게 투여함으로써 CD38 발현 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
발명의 세부 사항
본 발명은 적어도 하나의 키메라 항원 수용체로 조작된 일차 세포 및 세포주인 NK 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 고형 종양 및 혈액학적(혈액) 암인 암의 치료에 유용하다. 또한 이를 사용하고 제조하는 방법이 기재되어 있다. 본원에 기재된 약제학적 조성물은 키메라 항원 수용체를 발현하는 일차 NK 세포 및 NK 세포주, 예컨대 KHYG-1을 포함한다. 적합하게는, CAR은 암 관련 항원을 표적화한다. 예를 들어, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 CD38에 특이적일 수 있다. 선택적으로, NK 세포는 NK 세포의 세포독성 활성을 증가시키는 적어도 하나의 다른 변형을 포함한다. 적합하게는, 변형은 체크포인트 억제제의 결실 또는 발현 감소, 또는 DR4 또는 DR5와 같은 TRAIL 수용체에 대해 더 높은 친화도를 갖는 TRAIL 또는 TRAIL 수용체의 발현 증가를 포함한다. 유리하게도, 본 발명의 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴(E-selectin) 리간드의 발현 증가, 및/또는 DR4, DR5, 또는 둘 모두와 같은 TRAIL 수용체의 발현 감소를 나타낸다. 이러한 조작된 NK 세포는 정맥내 경로를 통한 입양 전달(adoptive transfer)에 의해 암으로 진단된 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 이들 NK 세포는 CAR를 발현하는 폴리뉴클레오타이드/벡터 및/또는 NK 세포의 세포독성 활성을 활성화시키는 분자, 예컨대 변이체 TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL) 단백질의 바이러스 형질도입 또는 전기천공에 의한 것; 또는 siRNA, shRNA 또는 CRISPR/Cas9 표적화 메커니즘을 통해 억제 수용체의 발현을 결실시키거나 감소시키는 벡터에 의한 것을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에서 조작될 수 있다. NK 세포는 일차 NK 세포의 기능 및 특징의 일부를 보유하는 일차 세포 또는 확립된 NK 세포주일 수 있다. 특정 구현예에서, 조작된 NK 세포주는 높은 E-셀렉틴 리간드 발현, 및 TARIL 수용체 DR4 및 DR5의 낮은 발현과 같은, NK-92와 같은 일반 세포와 구별되는 특성을 갖는 KHYG-1 세포, 또는 KHYG-1 유사 세포이다. 입양 전달은 자가(동계) 또는 이종(동종이계) NK 세포를 이용할 수 있다.
본 발명은 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 조작된 자연 살해 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 세포 표면 발현을 나타내고, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 HECA-452 항체에 의해 결합된 항원에 대해 25% 초과 양성인 복수의 조작된 자연 살해 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, TRAIL 수용체는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 일차 조작된 자연 살해 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 형질전환된 조작된 자연 살해 세포주를 포함한다. 특정 구현예에서, 형질전환된 조작된 자연 살해 세포주는 NK-92 세포주 또는 KHYG-1 세포주이다. 특정 구현예에서, 형질전환된 조작된 자연 살해 세포주는 KHYG-1 세포주이다. 특정 구현예에서, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD8 알파 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD3 제타 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙(Daratumumab)보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 제2 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 돌연변이성 TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL) 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 증가된 신호전달을 유도하거나 TRAIL 리간드에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 적합하게는, TRAIL 리간드는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함한다. 적합하게는, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 D269H/E195R 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 G131R/N199R/K201H 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, CAR 또는 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 조작된 자연 살해 세포의 게놈 내로 통합된다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체의 활성의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT 또는 TIM-3을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96, CD152, 또는 CD328을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96 을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD152를 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD328을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 조작된 자연 살해 세포 게놈으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, 또는 염색체 수준에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해 파괴된다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체를 표적화하는 siRNA를 포함한다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 안정화제, 또는 부형제를 추가로 포함한다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 복강내 투여를 위해 제제화된다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 복강내 투여를 위해 제제화된다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, 암은 백혈병, 림프종, 또는 골수종을 포함한다. 적합하게는, 암은 다발성 골수종을 포함한다.
본 발명은 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 가진 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 조작된 자연 살해 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 세포 표면 발현을 나타내고, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 HECA-452 항체에 의해 결합된 항원에 대해 25% 초과 양성인 복수의 조작된 자연 살해 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, TRAIL 수용체는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 일차 조작된 자연 살해 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 형질전환된 조작된 자연 살해 세포주를 포함한다. 특정 구현예에서, 형질전환된 조작된 자연 살해 세포주는 NK-92 세포주 또는 KHYG-1 세포주이다. 특정 구현예에서, 형질전환된 조작된 자연 살해 세포주는 KHYG-1 세포주이다. 특정 구현예에서, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 CD8 알파 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD3 제타 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 제2 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 돌연변이성 TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL) 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 증가된 신호전달을 유도하거나 TRAIL 리간드에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 적합하게는, TRAIL 리간드는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함한다. 적합하게는, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 D269H/E195R 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드 인간 TRAIL의 G131R/N199R/K201H 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, CAR 또는 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 조작된 자연 살해 세포의 게놈 내로 통합된다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체의 활성의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT 또는 TIM-3을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96, CD152, 또는 CD328을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD152를 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD328을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 조작된 자연 살해 세포 게놈으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, 또는 염색체 수준에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해 파괴된다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체를 표적화하는 siRNA를 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 조작된 자연 살해 세포 게놈으로부터 결실된다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 안정화제, 또는 부형제를 포함한다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화된다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 복강내 투여를 위해 제제화된다. 적합하게는, 암은 백혈병, 림프종, 또는 골수종을 포함한다. 적합하게는, 암은 다발성 골수종을 포함한다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 프로테아좀 억제제의 투여 이전, 동안 또는 이후에 투여된다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 저용량의 규칙적인 사이클로포스파미드 치료 요법 이전, 동안, 또는 이후에 투여된다.
본 발명은 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 조작된 자연 살해 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 세포 표면 발현을 나타내고, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하며, 방법은 자연 살해 세포를 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터를 포함한다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 레트로바이러스이다. 적합하게는, 폴리뉴클레오타이드는 mRNA를 포함한다. 적합하게는, 폴리뉴클레오타이드는 조작된 자연 살해 세포의 게놈 내로 통합된다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 조작된 자연 살해 세포의 푸코실화를 증가시키기 위해 화학물질로 처리된다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 HECA-452 항체에 의해 결합된 항원에 대해 25% 초과 양성인 복수의 조작된 자연 살해 세포를 포함한다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, TRAIL 수용체는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함한다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 일차 자연 살해 세포를 포함한다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 형질전환 자연 살해 세포주를 포함한다. 적합하게는, 형질전환 자연 살해 세포주는 NK-92 세포주 또는 KHYG-1 세포주이다. 적합하게는, 형질전환 자연 살해 세포주는 KHYG-1 세포주이다. 적합하게는, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD8 알파 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD3 제타 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 제2 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 돌연변이성 TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL) 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 증가된 신호전달을 유도하거나 TRAIL 리간드에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 적합하게는, TRAIL 리간드는 cTNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함한다. 적합하게는, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 D269H/E195R 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 G131R/N199R/K201H 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, CAR 또는 돌연변이성 TRAIL 폴리뉴클레오타이드는 조작된 자연 살해 세포의 게놈 내로 통합된다. 적합하게는, 방법은 조작된 자연 살해 세포를 체크포인트 억제 수용체의 활성을 결실시키거나 감소시키는 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT 또는 TIM-3을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96, CD152, 또는 CD328을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD152를 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD328을 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 조작된 자연 살해 세포 게놈으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, 또는 염색체 수준에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해 파괴된다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체를 표적화하는 siRNA를 포함한다. 적합하게는, 방법은 조작된 자연 살해 세포를 약제학적으로 허용가능한 담체, 안정화제, 또는 부형제와 혼합하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 기재되며, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질의 높은 수준의 발현을 나타내고, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD8 알파 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 폴리펩타이드로부터 유래된 세포내 도메인을 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 4-1BB 폴리펩타이드로부터 유래된 세포내 도메인을 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD3 제타 폴리펩타이드로부터 유래된 세포내 도메인을 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 제2 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다.
특정 양태에서, 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 가진 대상을 치료하는 방법이 제공되며, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질의 높은 수준의 발현을 나타내고, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 CD8 알파 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD3 제타 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 제2 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다.
바람직하게는, CD38-CAR 발현 NK 세포는 CD38 발현 암세포에 대한 친화도와 비교하여 CD38을 발현하는 정상(비악성) 세포에 대해 감소된 친화도를 갖는다. 이것은, 예를 들어, 암세포가 정상 세포보다 더 높은 수준의 CD38을 발현하기 때문에 및/또는 CD38-CAR이 암세포 상에서 발현된 CD38의 특정 형태에 대해 증가된 친화도 및/또는 정상 세포 상에서 발현된 CD38의 특정 형태에 대해 감소된 친화도를 갖기 때문에 초래될 수 있다. 암세포에 대한 CD38-CAR 발현 NK 세포의 친화도의 증가는 정상 세포에 대한 CD38-CAR 발현 NK 세포의 친화도와 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 100%인 것이 바람직하다. 정상 세포에 대한 CD38-CAR 발현 NK 세포의 친화도의 감소는 암세포에 대한 CD38-CAR 발현 NK 세포의 친화도와 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 100%인 것이 바람직하다. 암세포에 대한 CD38-CAR 발현 NK 세포의 친화도의 증가는 정상 세포에 대한 CD38-CAR 발현 NK 세포의 친화도보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배, 더욱 바람직하게는 적어도 1000배 큰 것이 바람직하다. 정상 세포에 대한 CD38-CAR 발현 NK 세포의 친화도의 감소는 암세포에 대한 CD38-CAR 발현 NK 세포의 친화도보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배, 더욱 바람직하게는 적어도 1000배 작은 것이 바람직하다. 바람직하게는, CD38-CAR 발현 NK 세포는 정상 CD38 발현 세포에 대해 낮은 친화도를 가지며, '낮은 친화도'는 CD38(예컨대, 다발성 골수종 세포)의 증가된 발현(정상 세포 대비)으로 표적 암세포에 대한 세포독성 반응을 효과적으로 일으키는데 충분히 높지만, 정상 CD38 발현 세포에 대해 세포독성 반응을 일으키는 것을 피하도록 충분히 낮은 친화도를 갖는 것으로 정의된다.
특정 양태에서, 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질의 높은 수준의 발현을 나타내고, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하며, 방법은 자연 살해 세포를 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD8 알파 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD3 제타 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 자연 살해 세포는 제2 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함한다.
도 1a는 본 발명의 키메라 항원 수용체의 비제한적인 개략도를 예시한다. 도면은 일정한 비율로 표현되지 않는다.
도 1b는 본 발명의 키메라 항원 수용체의 표적화 도메인의 비제한적인 개략도를 예시한다. 도면은 일정한 비율로 표현되지 않는다.
도 2a-b는 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같은 KHYG-1 세포(A) 및 NK-92 세포(B)에 대한 HECA-452 항체의 결합을 예시한다.
도 3은 NK-92 세포와 비교하여 SDF-1 구배에 따른 KHYG-1 세포의 이동을 예시한다.
도 4a-b는 유세포에서 KHYG-1 세포(A) 및 NK-92 세포(B)의 이동을 관찰하는 비디오의 정지 화면을 예시한다. 지연되거나 느리게 이동하는 세포는 별표로 표시되어 있다.
도 5는 CTLA4의 결실을 표적화하는데 사용된 gRNA 작제물(발현 벡터)을 예시한다.
도 6은 CRISPR/Cas9 gRNA로 형질감염 전후에, 모(parental) 및 돌연변이된 LIR2 DNA에 대한 겔 전기영동 밴드를 예시한다.
도 7은 CRISPR/Cas9 gRNA로 형질감염 전후에, 모 및 돌연변이된 CTLA4 DNA에 대한 겔 전기영동 밴드를 예시한다.
도 8a-b는 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 siRNA를 사용한 KHYG-1 세포에서의 CD96의 넉다운을 예시한다. 2개의 독립적 실험이 나타나 있다(A 및 B).
도 9는 상이한 효과기 대 표적 비율에서 CD96 감소를 갖는 KHYG-1 세포에 의한 사멸 증가를 예시한다.
도 10은 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 siRNA를 사용한 KHYG-1 세포에서의 CD328의 넉다운을 예시한다.
도 11은 상이한 효과기 대 표적 비율에서 CD328 감소를 갖는 KHYG-1 세포에 의한 증가된 사멸을 예시한다.
도 12는 KHYG-1 세포가 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 TRAIL의 낮은 또는 부재하는 발현을 나타낸다는 것을 예시한다.
도 13은 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 야생형 및 변이체 TRAIL로 형질감염된 세포에서 세포 표면 TRAIL 발현의 증가를 예시한다.
도 14는 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 야생형 및 변이체 TRAIL로 형질감염된 세포에서 증가된 세포 표면 107a 발현을 예시한다.
도 15는 야생형 또는 변이체 TRAIL로 형질감염된 KHYG-1 세포의 생존력을 예시한다.
도 16은 상이한 NK 세포주; KHYG1(상위 4위) 및 NK-92(하위 4위)에서의 TRAIL 수용체의 발현을 예시한다.
도 17은 야생형 TRAIL 또는 변이체 TRAIL을 발현하는 KHYG-1 세포가 K562 세포의 세포자멸사에 미치는 효과를 예시한다.
도 18은 야생형 TRAIL 또는 변이체 TRAIL을 발현하는 KHYG-1 세포가 RPMI8226 세포의 세포자멸사에 미치는 효과를 예시한다.
도 19는 야생형 TRAIL 또는 변이체 TRAIL을 발현하는 KHYG-1 세포가 MM1.S 세포의 세포자멸사에 미치는 효과를 예시한다.
도 20은 RPMI8226 세포 및 MM1.S 세포에서의 DR5 발현의 FACS 플롯을 각각 예시하며, DR5 발현에 대한 보르테조밉 처리의 효과가 나타나 있다.
도 21은 TRAIL 변이체를 갖거나(하부 2개) 갖지 않는(중간 2개) KHYG-1 세포와 공동배양된 보르테조밉으로 미리 처리된/처리되지 않은 MM1.S 세포의 2개의 FACS 플롯을 예시한다.
도 22는 다발성 골수종 세포주 UM9를 다양한 낮은 친화도 CD38 NK CAR로 처리하는 효과를 나타낸다.
도 23 및 24는 일차 다발성 골수종 세포를 다양한 낮은 친화도 CD38 NK CAR로 처리하는 효과를 나타낸다.
도 25 및 26은 CD38 및 CD138의 발현에 따라 게이팅(gating)된 세포 서브세트 FACS를 나타내며, 이는 낮은 친화도 CD38 CAR이 비암세포가 아닌 암세포를 효과적으로 표적화한다는 것을 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 키메라 항원 수용체의 표적화 도메인의 비제한적인 개략도를 예시한다. 도면은 일정한 비율로 표현되지 않는다.
도 2a-b는 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같은 KHYG-1 세포(A) 및 NK-92 세포(B)에 대한 HECA-452 항체의 결합을 예시한다.
도 3은 NK-92 세포와 비교하여 SDF-1 구배에 따른 KHYG-1 세포의 이동을 예시한다.
도 4a-b는 유세포에서 KHYG-1 세포(A) 및 NK-92 세포(B)의 이동을 관찰하는 비디오의 정지 화면을 예시한다. 지연되거나 느리게 이동하는 세포는 별표로 표시되어 있다.
도 5는 CTLA4의 결실을 표적화하는데 사용된 gRNA 작제물(발현 벡터)을 예시한다.
도 6은 CRISPR/Cas9 gRNA로 형질감염 전후에, 모(parental) 및 돌연변이된 LIR2 DNA에 대한 겔 전기영동 밴드를 예시한다.
도 7은 CRISPR/Cas9 gRNA로 형질감염 전후에, 모 및 돌연변이된 CTLA4 DNA에 대한 겔 전기영동 밴드를 예시한다.
도 8a-b는 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 siRNA를 사용한 KHYG-1 세포에서의 CD96의 넉다운을 예시한다. 2개의 독립적 실험이 나타나 있다(A 및 B).
도 9는 상이한 효과기 대 표적 비율에서 CD96 감소를 갖는 KHYG-1 세포에 의한 사멸 증가를 예시한다.
도 10은 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 siRNA를 사용한 KHYG-1 세포에서의 CD328의 넉다운을 예시한다.
도 11은 상이한 효과기 대 표적 비율에서 CD328 감소를 갖는 KHYG-1 세포에 의한 증가된 사멸을 예시한다.
도 12는 KHYG-1 세포가 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 TRAIL의 낮은 또는 부재하는 발현을 나타낸다는 것을 예시한다.
도 13은 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 야생형 및 변이체 TRAIL로 형질감염된 세포에서 세포 표면 TRAIL 발현의 증가를 예시한다.
도 14는 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 야생형 및 변이체 TRAIL로 형질감염된 세포에서 증가된 세포 표면 107a 발현을 예시한다.
도 15는 야생형 또는 변이체 TRAIL로 형질감염된 KHYG-1 세포의 생존력을 예시한다.
도 16은 상이한 NK 세포주; KHYG1(상위 4위) 및 NK-92(하위 4위)에서의 TRAIL 수용체의 발현을 예시한다.
도 17은 야생형 TRAIL 또는 변이체 TRAIL을 발현하는 KHYG-1 세포가 K562 세포의 세포자멸사에 미치는 효과를 예시한다.
도 18은 야생형 TRAIL 또는 변이체 TRAIL을 발현하는 KHYG-1 세포가 RPMI8226 세포의 세포자멸사에 미치는 효과를 예시한다.
도 19는 야생형 TRAIL 또는 변이체 TRAIL을 발현하는 KHYG-1 세포가 MM1.S 세포의 세포자멸사에 미치는 효과를 예시한다.
도 20은 RPMI8226 세포 및 MM1.S 세포에서의 DR5 발현의 FACS 플롯을 각각 예시하며, DR5 발현에 대한 보르테조밉 처리의 효과가 나타나 있다.
도 21은 TRAIL 변이체를 갖거나(하부 2개) 갖지 않는(중간 2개) KHYG-1 세포와 공동배양된 보르테조밉으로 미리 처리된/처리되지 않은 MM1.S 세포의 2개의 FACS 플롯을 예시한다.
도 22는 다발성 골수종 세포주 UM9를 다양한 낮은 친화도 CD38 NK CAR로 처리하는 효과를 나타낸다.
도 23 및 24는 일차 다발성 골수종 세포를 다양한 낮은 친화도 CD38 NK CAR로 처리하는 효과를 나타낸다.
도 25 및 26은 CD38 및 CD138의 발현에 따라 게이팅(gating)된 세포 서브세트 FACS를 나타내며, 이는 낮은 친화도 CD38 CAR이 비암세포가 아닌 암세포를 효과적으로 표적화한다는 것을 나타낸다.
특정 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 본원에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 명시된 양에 가까운 양, 예를 들어 10%, 5%, 또는 1%를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "개체," "대상," 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되며, 암 또는 다른 신생물로 진단받거나 걸릴 것으로 의심되는 인간을 포함한다.
본원에서, 달리 언급되지 않는 한, NK 세포 또는 NK 세포들에 대한 언급은 NK 세포주 및 일차 NK 세포 모두를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "NK 세포주"는 하나 이상의 자연 살해 세포 특성을 보유하는 임의의 형질전환된 또는 불멸화된 세포주를 지칭한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 보유된 하나 이상의 자연 살해 세포 특성은 CD 56 발현, 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR) 발현, 또는 K562 세포와 같은 표적 세포주에 대한 항원 독립적인 세포독성이다. 일반적인 NK 세포주는, 예를 들어, NK-92 또는 KHYG-1 세포주이다.
자연 살해 세포
조작된 자연 살해 세포는 이를 비조작된 자연 살해 세포와 구별하는 하나 이상의 조작을 포함한다. 적합하게는, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체, TRAIL 변이체, FUT6 또는 FUT 7 단백질 중 어느 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 체크포인트 억제제 결실 또는 감소된 발현을 포함하도록 조작된다. 본 발명의 조작된 자연 살해 세포(NK 세포)는 일차 세포 또는 확립된 세포주를 포함하는 임의의 NK 세포 집단으로부터 제조될 수 있다. 적합하게는, NK 세포는 인간 NK 세포이다. 인간에서의 일차 자연 살해 세포는 세포 표면 마커 CD56을 발현하며, 특정 구현예에서, 조작된 자연 살해 세포는 비제한적인 예로서, 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 CD56 양성 세포로부터 생산될 수 있다. 적합하게는, 자연 살해 세포는 자가 공급원(동일한 유전적 배경의 공급원 세포 및 수여자), 또는 이종 공급원(상이한 유전적 배경의 공급원 세포 및 수여자)으로부터 유래될 수 있다. 적합하게는, NK 세포는 세포 분리(cell sorting)와 같은 방법 또는 자기 비드를 사용하여 처리될 공여자 또는 개체의 말초 혈액으로부터 단리된다. 공여자로부터 단리된 NK 세포는 7일 초과 동안 인터루킨-2 및 인터루킨-15에서 배양함으로써 생체외에서 확장될 수 있다. NK 세포는 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 시험관내 배양에서 줄기 또는 선조 세포로부터 분화될 수 있다. 적합하게는, NK 세포는 골수 유래 줄기 세포로부터 분화된다. 적합하게는, NK 세포는 성체 다분화능 세포로부터 분화된다. 적합하게는, NK 세포는 배아 줄기 세포로부터 분화된다.
조작된 NK 세포는 또한 형질전환 NK 세포주로부터 제조될 수 있다. 적합하게는, 형질전환 NK 세포주는 인간 세포주이다. 사용될 수 있는 일반적인 NK 세포주는 NK-92 세포주(ATCC로부터 이용가능함; CRL-2497), 또는 KHYG-1 세포주이다. 적합하게는, 조작된 NK 세포주는 KHYG-1 세포주로부터 제조된다. 문헌[Yagita et al., "A novel natural killer cell line (KHYG-1) from a patient with aggressive natural killer cell leukemia carrying a p53 point mutation." Leukemia 14(5):922-30]을 참고한다. CD56의 발현과 같은 일반적인 NK 세포주 사이의 공통점에도 불구하고, 상이한 세포주는 세포 기반 요법의 개발에 대해 다른 NK 세포주(예컨대, 변이체 TRAIL 단백질을 발현하는 CAR NK 또는 NK 세포)와 비교하여 특정 NK 세포주의 더 큰 적합성을 허용할 수 있는 상이한 표현형 및 유전자형 특성을 보유한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포주는 NK-92 세포주 또는 유도체를 포함하지 않는다.
본원에 기재된 특정 구현예에서, 조작된 NK 세포는 혈액학적 악성 종양을 치료하는데 유용하다. 이러한 치료를 용이하게 하기 위해, 특정 구현예에서, 세포는 골수로의 회귀성(homing) 증가를 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 발현을 나타낸다. E-셀렉틴은 CD62 항원 유사 패밀리 구성원 E(CD62E); 내피-백혈구 부착 분자 1(ELAM-1); 또는 백혈구-내피 세포 부착 분자 2(LECAM2)로도 공지되어 있다. E-셀렉틴은 4당류 시알릴 루이스 X(SLex)를 발현하는 당단백질 및/또는 당지질인 세포 표면 상의 E-셀렉틴 리간드에 결합한다. SLex는 α-푸코실트랜스퍼라아제, α2-3-시알릴트랜스퍼라아제, β-갈락토실트랜스퍼라아제, 및 N-아세틸-β-글루코사미닐트랜스퍼라아제의 조합 작용에 의해 합성된다. HECA-452 항체는 E-셀렉틴 리간드를 인식한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 HECA-452 항체로 양성으로 염색되는 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 이상의 세포를 나타내는 조작된 NK 세포의 집단을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 HECA-452 항체로 양성으로 염색되는 적어도 50% 이상의 세포를 나타내는 NK 세포의 집단을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 HECA-452 항체로 양성으로 염색되는 적어도 75% 이상의 세포를 나타내는 NK 세포의 집단을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 HECA-452 항체로 양성으로 염색되는 적어도 80% 이상의 세포를 나타내는 NK 세포의 집단을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 HECA-452 항체로 양성으로 염색되는 적어도 90% 이상의 세포를 나타내는 NK 세포의 집단을 포함한다. 양성은, 예를 들어, 세포를 형광 접합된 HECA-452 항체를 이용하여 시험관내에서 염색하고 HECA-452 염색된 세포를 아이소타입 대조군 염색된 세포와 비교하는 유세포 분석법에 의해 양성을 분석함으로써 평가될 수 있다. 적합하게는, HECA-452 양성을 나타내는 조작된 NK 세포의 집단은 세포 표면 단백질의 푸코실화를 증가시키기 위해 화학적으로 처리되었다. 적합하게는, 화학적 처리는 GDP-푸코스 기질 및 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라아제-VI 효소를 포함한다.
적합하게는, 조작된 NK 세포는 당조작된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준은 아이소타입 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합의 적어도 6배 증가에 의해 나타난다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준은 아이소타입 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합의 적어도 7배 증가에 의해 나타난다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준은 아이소타입 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합의 적어도 8배 증가에 의해 나타난다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준은 아이소타입 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합의 적어도 9배 증가에 의해 나타난다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준은 아이소타입 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합의 적어도 10배 증가에 의해 나타난다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준은 아이소타입 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합의 적어도 20배 증가에 의해 나타난다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준은 아이소타입 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합의 적어도 50배 증가에 의해 나타난다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준은 아이소타입 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합의 적어도 100배 증가에 의해 나타난다. 이러한 결합 증가는, 예를 들어, HECA-452 항체 결합의 평균 형광 강도를 유세포 분석법을 사용하여 아이소타입 대조군 항체의 것과 비교함으로써 분석될 수 있다. 적합하게는, HECA-452 항체 결합의 높은 수준을 나타내는 NK 세포는 KHYG-1 세포주이다. 적합하게는, HECA-452 항체 결합의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포의 집단은 세포 표면 단백질의 푸코실화 또는 시알릴화를 증가시키기 위해 화학적으로 처리되었다. 적합하게는, 화학적 처리는 GDP-푸코스 기질 및 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라아제-VI 효소를 포함한다. 적합하게는, NK 세포는 FUT6, FUT7, 또는 둘 모두를 발현함으로써 HECA-452 항체 결합의 높은 수준을 나타내도록 조작되었다. 적합하게는, FUT6, 또는 FUT7 발현은 mRNA 또는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 HECA-452 항체 결합의 낮은 수준을 나타내는 NK 세포, 예를 들어 NK-92 세포에 도입함으로써 달성된다. 적합하게는, 불멸화된 NK 세포주, 예컨대 NK-92 세포는 FUT6, FUT7, 또는 둘 모두를 코딩하는 핵산으로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 적합하게는, FUT 6 또는 FUT7의 높은 수준의 발현은 mRNA, 웨스턴 블롯, 또는 효소 분석에 의해 모니터링되는 바와 같이 FUT6 또는 FUT7 발현 또는 활성의 적어도 2, 5, 또는 10배 증가이다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD65를 발현한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD65s를 발현한다.
적합하게는, 조작된 NK 세포는 TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현을 나타낸다. 적합하게는, TRAIL 수용체는 DR4 또는 DR5이다. 적합하게는, TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현은 검출가능한 TRAIL 수용체 활성의 결여를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현은 아이소타입 대조군과 대등한 항-TRAIL 항체 반응성에 의해 표시되는 수준을 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현은 아이소타입 대조군과 비교하여 5배 미만인 항-TRAIL 항체 반응성에 의해 표시되는 수준을 포함한다. 적합하게는, 세포 표면 TRAIL 수용체의 낮은 수준은 아이소타입 대조군과 비교하여 2배 미만인 항-TRAIL 항체 반응성에 의해 표시되는 수준을 포함한다. 세포 표면 TRAIL 수용체 발현은, 예를 들어, 실시예에 상세히 설명된 바와 같이 유세포 분석법을 사용하여 정량화될 수 있다.
키메라
항원 수용체
키메라 항원 수용체(CAR)는 면역 효과기 세포에 특정 항원 특이성을 도입하고자 하는 재조합 항원 수용체이다. CAR은 게놈 내로 일시적으로 또는 통합된 면역 효과기 세포 내로 도입된 외인성 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 정의된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일반적인 CAR에 대한 개략도가 도 1a에 예시되어 있다. 키메라 항원 수용체는 리더 서열 101, 표적화 도메인 102, 막관통 도메인 103, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(104 및 105)을 포함한다. 적합하게는, 표적화 도메인은 항체 분자로부터 유래되며, CAR에 항원 특이성을 부여하는 항체 분자로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 적합하게는, 본 발명의 조작된 NK 세포에서 사용하기 위한 CAR의 표적화 도메인은 도 1b에 나타낸 바와 같은 단쇄 가변 단편(scFv)이다. scFv는 가요성 링커 폴리펩타이드 107에 의해 분리된 면역글로불린 경쇄 106, 및 면역글로불린 중쇄 분자 108의 가변 사슬 부분을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 순서는 제한되지 않으며, 역전될 수 있다. 가요성 폴리펩타이드 링커는 중쇄 및 경쇄를 서로 결합시켜 면역글로불린 항원 결합 도메인을 재구성한다. 적합하게는, 경쇄 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 3개의 CDR을 포함한다. 적합하게는, 표적화 도메인에서 사용하기 위한 CDR은 임의의 종(예컨대, 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양)의 항체 분자로부터 유래되며, CDR 사이의 프레임워크 영역은 인간화되거나 인간 프레임워크 영역과 적어도 85%, 90%, 95 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
CAR의 표적화 도메인이 scFv를 포함하는 경우, 면역글로불린 경쇄 및 면역글로불린 중쇄는 다양한 길이의 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 10 아미노산 이상의 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 10, 15, 20, 또는 25 아미노산 초과의 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 30 아미노산 이하의 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 15, 20, 25, 또는 30 아미노산 미만의 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 10 내지 30 아미노산 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 10 내지 25 아미노산 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 10 내지 20 아미노산 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 10 내지 15 아미노산 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 15 내지 30 아미노산 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 20 내지 30 아미노산 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 25 내지 30 아미노산 길이를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 친수성 아미노산을 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 친수성 아미노산으로 구성된다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 아미노산 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG를 포함한다. 적합하게는, 폴리펩타이드 링커는 G4S 서열(GGGGS)을 포함한다. G4S 링커는 링커의 가요성 및 프로테아제 내성을 허용한다. 적합하게는, G4S 링커는 폴리펩타이드 링커에서 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 또는 8번 연속적으로 반복된다.
본 발명의 CAR은 NH2-말단 리더 서열 101을 추가로 포함한다. 리더 서열(신호 펩타이드로도 공지됨)은 발현된 CAR 작제물이 소포체(ER)에 들어가 세포 표면을 표적화하게 한다. 리더 서열은 ER에서 절단되고, 성숙한 세포 표면 CAR은 리더 서열을 갖지 않는다. 일반적으로, 리더 서열 길이는 5 내지 30 아미노산의 범위일 것이며, 소수성 아미노산의 구간을 포함할 것이다. 적합하게는, 리더 서열은 5, 10, 15, 20, 또는 25 아미노산 초과의 길이를 포함한다. 적합하게는, 리더 서열은 10, 15, 20, 25, 또는 30 아미노산 미만의 길이를 포함한다. 적합하게는, 리더 서열은 임의의 분비 단백질로부터 유래된 서열을 포함한다. 적합하게는, 리더 서열은 CD8 알파 리더 서열로부터 유래된 서열을 포함한다.
본 발명의 CAR은 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 도 1a 특징 103을 참고한다. 막관통 도메인은 소수성 아미노산 잔기를 포함하고, CAR이 조작된 NK 세포의 세포 막에 고정되게 한다. 적합하게는, 막관통 도메인은 막관통 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 사슬, CD27, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 및 CD154의 막관통 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 CD8의 막관통 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 막관통을 포함한다. 적합하게는, CAR은 인간 CD8 알파의 막관통 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
본 발명의 CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 도 1a 특징 104 및 105를 참고한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR의 효능을 증가시키고, 면역 세포 신호 전달과 관련된 단백질로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 적합하게는, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 CD28, OX-40, 4-1BB, DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 적합하게는, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 CD28, OX-40, 4-1BB, DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 이의 임의의 조합 중 임의의 2개로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 적합하게는, CAR은 CD3 제타 및 4-1BB로부터 유래된 적어도 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본 발명의 CAR은 또한 표적화 도메인 및 막관통 도메인 사이에 위치한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 친수성 아미노산을 포함하고, 세포 표면에 대한 표적화 도메인의 가용성을 허용한다. 적합하게는, 힌지 영역은 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30 초과의 아미노산을 포함한다. 적합하게는, 힌지 영역은 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35 미만의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 CD38 CAR은 서열번호: 1을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 갖는 것이 바람직하다. 선택적으로, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7을 포함한다. CD38 CAR 결합 도메인은 서열번호: 23 또는 서열번호: 28을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이 바람직하다.
예시적인 바람직한 CD38 CAR은 서열번호: 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 갖는다.
CD38 CAR 결합 도메인은 서열번호: 29, 서열번호: 30 및 서열번호: 31로부터 선택된 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것이 바람직하다. 선택적으로, CAR은 서열번호: 32, 서열번호: 33 및 서열번호: 34로부터 선택된 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것이 바람직하다.
CD38 CAR 결합 도메인은 서열번호: 35, 서열번호: 36 및 서열번호: 37, 또는 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로부터 선택된 경쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 전술한 중쇄 및 경쇄의 단편 및 변이체는 실질적으로 동일한 CD38 결합 활성을 갖는 CAR 결합 도메인을 제공하며, 단편은 절단되고/되거나 아미노산이 결실 및/또는 변형된 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 따른 임의의 단편/변이체는 예시적인 바람직한 CAR의 결합 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%를 보유하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 임의의 단편/변이체는 바람직한 CAR의 결합 활성을 10% 초과, 20% 초과, 50% 초과, 바람직하게는 100% 이하로 초과하지 않는 결합 활성을 갖는 것이 더 바람직하다.
CD38 CAR 결합 도메인은 서열번호: 1과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 선택적으로, CD38 CAR은 서열번호: 7과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
CD38 CAR 결합 도메인은 서열번호: 23 또는 서열번호: 28과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이 바람직하다.
CD38 CAR 결합 도메인은 서열번호: 29, 서열번호: 30 및 서열번호: 31과 적어도 70%, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것이 바람직하다. 선택적으로, CD38 CAR은 서열번호: 32, 서열번호: 33 및 서열번호: 34와 적어도 70%, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것이 바람직하다.
CD38 CAR 결합 도메인은 서열번호: 35, 서열번호: 36 및 서열번호: 37, 또는 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40과 적어도 70%, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 경쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것이 바람직하다.
CD38 CAR은 서열번호: 41, 서열번호: 42 및 서열번호: 43으로부터 선택된 하나 이상의 공자극 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. CAR이 서열번호: 41, 서열번호: 42 또는 서열번호: 43과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 공자극 도메인을 포함하는 것이 바람직하다.
CD38 CAR 결합 도메인은 적어도 60 아미노산, 적어도 70 아미노산, 적어도 80 아미노산, 적어도 90 아미노산, 적어도 100 아미노산, 적어도 110 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 120 아미노산 길이인 서열번호: 1의 단편인 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 선택적으로, CD38 CAR은 적어도 60 아미노산, 적어도 70 아미노산, 적어도 80 아미노산, 적어도 90 아미노산, 적어도 100 아미노산, 적어도 110 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 120 아미노산 길이인 서열번호: 7의 단편인 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것이 바람직하다.
CD38 CAR 결합 도메인은 적어도 50 아미노산, 적어도 60 아미노산, 적어도 70 아미노산, 적어도 80 아미노산, 적어도 90 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 100 아미노산 길이인 서열번호: 23 또는 서열번호: 28의 단편인 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이 바람직하다.
CAR
표적화
도메인
적합하게는, 본원에 제공된 "암 관련 항원"은 정상 세포에 의해 발현되는 것보다 더 큰 정도로 암세포에 의해 발현되는 암의 분자 마커를 지칭한다. 암 관련 항원은 일반적으로 이로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드이지만, 글리칸, 지질, 또는 다른 작은 유기 분자일 수 있다. 또한, 암 항원은 정상 세포와 비교하여 암세포가 나타내는 번역후 가공, 예를 들어, 단백질 글리코실화, 단백질 지질화, 단백질 인산화, 또는 단백질 아세틸화의 증가 또는 감소를 통해 발생할 수 있다. 암 관련 항원의 비제한적인 예는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, HERV-K를 포함한다.
적합하게는, 본원에 제공된 "혈액암 관련 항원"은 혈액학적 세포 상에서 발현되는 것보다 더 큰 정도로 백혈병, 림프종, 골수종에 의해 발현되는 암의 분자 마커를 지칭한다. 혈액암 관련 항원은 일반적으로 이들로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드이지만, 글리칸, 지질, 또는 다른 작은 유기 분자일 수 있다. 또한, 혈액암 항원은 정상 세포와 비교하여 백혈병, 림프종, 또는 골수종 세포가 나타내는 번역후 가공, 예를 들어, 단백질 글리코실화, 단백질 지질화, 단백질 인산화, 또는 단백질 아세틸화의 증가 또는 감소를 통해 발생할 수 있다. 혈액암 관련 항원의 비제한적인 예는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, GD2, CLL-1, HERV-K를 포함한다. 혈액암의 비제한적인 예는 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 확산성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포 백혈병, T-세포 전림프성 백혈병, 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 경쇄 골수종, 또는 거대 과립 림프성 백혈병을 포함한다.
적합하게는, 조작된 NK 세포는 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 표적화 도메인을 갖는 CAR을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 2개 이상의 구별되는 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 표적화 도메인을 갖는 2개 이상의 CAR을 포함한다. 적합하게는, CAR 표적화 도메인은 암세포의 세포 표면 상의 암 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 적합하게는, CAR은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, HERV-K에 특이적으로 결합한다.
사이클릭 ADP 리보스 가수분해효소로도 공지된 CD38은 주로 면역 세포 상에서 발견되는 세포 표면 당단백질이다. CD38은 세포내 칼슘의 조절에 관여하며, 백혈병, 골수종, 및 많은 고형 종양을 포함하는 많은 상이한 암에서 과발현된다. 적합하게는, 본 발명의 조작된 NK 세포는 CD38에 특이적인 표적화 도메인 102을 갖는 CAR을 발현한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
적합하게는, 조작된 NK 세포는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 CAR을 발현한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1에 제시된 것과 80% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1에 제시된 것과 90% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1에 제시된 것과 95% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 1에 제시된 것과 98% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다 적합하게는, CAR은 서열번호: 1에 제시된 것과 99% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, 서열번호: 1 및 서열번호: 2는 가요성 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된다. 적합하게는, 가요성 폴리펩타이드 링커는 서열번호: 1에 제시된 폴리펩타이드의 COOH 말단을 서열번호: 2에 제시된 폴리펩타이드의 NH2 말단에 연결한다. 적합하게는, 가요성 폴리펩타이드 링커는 서열번호: 2에 제시된 폴리펩타이드의 COOH 말단을 서열번호: 1에 제시된 폴리펩타이드의 NH2 말단에 연결한다.
적합하게는, 조작된 NK 세포는 서열번호: 3에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 CAR을 발현한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3에 제시된 것과 80% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3에 제시된 것과 90% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3에 제시된 것과 95% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3에 제시된 것과 98% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 3에 제시된 것과 99% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, 서열번호: 3 및 서열번호: 4는 가요성 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된다. 적합하게는, 가요성 폴리펩타이드 링커는 서열번호: 3에 제시된 폴리펩타이드의 COOH 말단을 서열번호: 4에 제시된 폴리펩타이드의 NH2 말단에 연결한다. 적합하게는, 가요성 폴리펩타이드 링커는 서열번호: 4에 제시된 폴리펩타이드의 COOH 말단을 서열번호: 3에 제시된 폴리펩타이드의 NH2 말단에 연결한다.
적합하게는, 조작된 NK 세포는 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 CAR을 발현한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5에 제시된 것과 80% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5에 제시된 것과 90% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5에 제시된 것과 95% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5에 제시된 것과 98% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, CAR은 서열번호: 5에 제시된 것과 99% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, 서열번호: 5 및 서열번호: 6은 가요성 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된다. 적합하게는, 가요성 폴리펩타이드 링커는 서열번호: 5에 제시된 폴리펩타이드의 COOH 말단을 서열번호: 6에 제시된 폴리펩타이드의 NH2 말단에 연결한다. 적합하게는, 가요성 폴리펩타이드 링커는 서열번호: 6에 제시된 폴리펩타이드의 COOH 말단을 서열번호: 5에 제시된 폴리펩타이드의 NH2 말단에 연결한다.
본 발명의 조작된 NK 세포는 또한 비암 또는 비종양 세포 상에서 발현되는 CD38에 대한 반응성을 최소화시키면서, 최적 암 반응을 위해 조정된 친화도를 나타내는 CD38 특이적 CAR을 포함할 수 있다. 다라투무맙은 CD38 수용체에 대해 높은 친화도를 나타내는 단클론 항체이다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 25% 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 50% 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 2배 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 항체 친화도는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(예컨대, Biacore)의 사용에 의해 측정될 수 있다.
이중특이적
CAR
조작된 NK 세포는 이중특이적일 수 있으며, 즉 이중특이적 CAR 또는 다수의 상이한 CAR을 발현하며, 이들의 친화도는 2개의 구별되는 리간드/항원에 대한 것이다. 이중특이적 CAR-NK는 암세포 상의 잠재적인 결합 부위의 수를 증가시키거나, 대안적으로, NK-CAR에 특이적인 리간드를 발현하는 다른 면역 효과기 세포에 암세포를 국소화시키기 위해 사용될 수 있다. 암 요법에 사용하기 위해, 이중특이적 CAR은 표적 종양 세포에 결합할 수 있고, 효과기 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 또는 대식세포에 결합할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 다발성 골수종의 경우, 이중특이적 CAR은 T 세포 항원(예컨대 CD3 등) 및 종양 세포 마커(예컨대 CD38 등)에 결합할 수 있다. 이중특이적 CAR은 대안적으로 2개의 개별 종양 세포 마커에 결합하여, 표적 종양 세포에 대한 NK 세포의 전체적인 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 이것은 표적 항원 중 하나를 하향조절함으로써 암세포가 내성을 나타낼 위험을 감소시킬 수 있다. 이 경우의 예는, 다발성 골수종에서, CD38 및 CS-1/SLAMF7 모두에 대한 CAR 결합일 것이다. CAR에 의해 적합하게 표적화된 또 다른 종양 세포 마커는 CD47에 의해 예시되는, 종양 상의 "나를 먹지 마세요(Don't eat me)" 유형 마커이다.
본 발명의 조작된 NK 세포는 동일한 NK 세포에 의해 발현된 이중특이적 CAR 또는 다수의 CAR을 포함할 수 있다. 이것은 NK 세포가 2개의 상이한 항원을 동시에 표적화할 수 있게 한다. 적합하게는, 이중특이적 CAR은 하기 항원 중 임의의 2개에 대해 특이성을 갖는다: CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, CD123/IL3-RA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, CD123, HERV-K. 적합하게는, CAR NK 세포의 이중특이적 특성은 종양 항원 및 또 다른 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 수지상 세포에 대한 결합을 허용할 수 있다. 적합하게는, CAR NK 세포의 이중특이적 특성은 체크포인트 억제제, 예컨대 PDL-1, 또는 CD47에 대한 결합을 허용할 수 있다. 적합하게는, 제1 CAR은 CD38 특이성을 가지며, 제2 CAR은 SLAMF-7, BCMA, CD138, CD229, PDL-1, 또는 CD47 중 어느 하나에 대해 특이성을 갖는다. 적합하게는, 제1 CAR은 CD38에 대해 특이성을 가지며, 제2 CAR은 SLAMF-7, BCMA, CD138, CD229에 대해 특이성을 갖는다. 적합하게는, 제1 CAR은 CD38에 대해 특이성을 가지며, 제2 CAR은 SLAMF-7에 대해 특이성을 갖는다. 적합하게는, 제1 CAR은 CD38에 대해 특이성을 가지며, 제2 CAR은 BCMA에 대해 특이성을 갖는다. 적합하게는, 제1 CAR은 CD38에 대해 특이성을 가지며, 제2 CAR은 CD138 에 대해 특이성을 갖는다. 적합하게는, 제1 CAR은 CD38에 대해 특이성을 가지며, 제2 CAR은 CD229에 대해 특이성을 갖는다.
TNF
관련
세포자멸사
유도 리간드
종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 10으로도 공지된 TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL)는 세포자멸사의 개시를 통해 세포 사멸을 유도하는 단백질 리간드이다. 세포자멸사는 암세포를 포함하는 많은 상이한 유형의 세포의 세포 표면 상에서 발현된 TRAIL 수용체에 대한 TRAIL의 결합을 통해 개시된다. 본 발명의 조작된 NK 세포는 디코이(decoy) 수용체, 예컨대 DcR1 또는 DcR2에 대한 결합 친화도를 감소시키면서, 사멸 유도 수용체 DR4, DR5 또는 둘 모두에 대한 결합 친화도를 증가시키기 위해 야생형 TRAIL 단백질 서열로부터 변형된 변이체 TRAIL 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CAR 및 변이체 TRAIL 폴리펩타이드를 발현한다. 적합하게는, TRAIL 변이체는 하나 이상의 TRAIL 수용체에 대해 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 적합하게는, TRAIL 변이체는 TRAIL 수용체 DR4에 대해 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 적합하게는, TRAIL 변이체는 TRAIL 수용체 DR5에 대해 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 적합하게는, TRAIL 변이체는 TRAIL 수용체 DR4 및 DR5에 대해 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 야생형 TRAIL은 전형적으로 DR4에 대해 >2 nM, DR5에 대해 >5 nM 및 디코이 수용체 DcR1에 대해 >20 nM(WO 제2009/077857호; 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정됨), 또는 DR4에 대해 약 50 내지 100 nM, DR5에 대해 1 내지 10 nM 및 DcR1에 대해 175 내지 225 nM(Truneh, A. et al. 2000; 등온 적정 열량계 및 ELISA에 의해 측정됨)의 KD를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, DR4에 대한 증가된 친화도는 각각 <2 nM 또는 <50 nM의 KD로서 적합하게 정의되는 반면, DR5에 대한 증가된 친화도는 각각 <5 nM 또는 <1 nM의 KD로서 적합하게 정의된다. 디코이 수용체 DcR1에 대한 감소된 친화도는 각각 >50 nM 또는 >225 nM의 KD로서 적합하게 정의된다. 임의의 경우에, TRAIL 변이체/돌연변이가 나타내는 친화도의 증가 또는 감소는 야생형 TRAIL이 나타내는 기준 친화도에 비례한다. 적합하게는, TRAIL 수용체에 대한 TRAIL 변이체의 친화도는 야생형 TRAIL이 나타내는 것과 비교하여 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 50% 증가된다. 특정 구현예에서, TRAIL 변이체는 표적 세포에서 카스파아제 8 활성화에 의해 측정된 바와 같이 야생형과 비교하여 세포자멸사를 증가시킨다. 적합하게는, TRAIL 변이체는 표적 세포에서 야생형과 비교하여 카스파아제 8 활성화를 적어도 2배 증가시킨다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 D269H, S159R, E195R, G131R, N199R, K201H, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 인간 TRAIL의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 인간 TRAIL, D269H 및 E195R 중 2개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 D269H 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 E195R 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 인간 TRAIL, G131R, N199R, 및 K201H 중 3개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, 돌연변이성 TRAIL 수용체는 일차 T 세포 또는 T 세포주 상에서 발현된다. 적합하게는, TRAIL 수용체는 T 세포주 내로 형질감염된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.
체크포인트 억제 수용체
체크포인트 억제 수용체는 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 효과기 세포의 표면 상에서 발현되며, 이들 세포의 세포독성을 부정적으로 조절한다. 체크포인트 억제 수용체의 예는 PD-1, CTLA-4 및 CD96을 포함하며, 이들 모두는 NK 세포 상에서 발현된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 감소되거나 부재된 체크포인트 억제 수용체 기능을 포함한다. 적합하게는, 감소되거나 부재된 기능을 갖는 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT, 및/또는 TIM-3 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), 또는 CD328(SIGLEC7) 중 하나 이상을 포함한다. 적합하게는, NK 세포는 2개 이상의 체크포인트 억제 수용체에 대해 감소되거나 부재된 체크포인트 억제 수용체 기능을 포함한다. 적합하게는, 2개 이상의 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), 또는 CD328(SIGLEC7)을 포함한다. 적합하게는, NK 세포는 3개의 체크포인트 억제 수용체에 대해 감소되거나 부재된 체크포인트 억제 수용체 기능을 나타낸다. 적합하게는, 3개의 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), 또는 CD328(SIGLEC7)을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD38 CAR, 및 체크포인트 억제제 수용체의 결실 또는 감소를 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD38 CAR, 변이체 TRAIL 단백질, 및 체크포인트 억제제 수용체의 결실 또는 감소를 포함한다.
적합하게는, 조작된 NK 세포는 CRISPR/Cas9 또는 TALEN 메커니즘을 통한 유전적 결실에 의해 체크포인트 억제 수용체를 감소시키도록 변형되었다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 유전적 결실을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 유전적 결실을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD152(CTLA4)의 유전적 결실을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 유전적 결실을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CD152(CTLA4), 또는 CD279(PD-1) 중 어느 2개 이상의 유전적 결실을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CD152(CTLA4), 또는 CD279(PD-1) 중 어느 3개 이상의 유전적 결실을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 RNA에 의해 체크포인트 억제 수용체 발현을 감소시키도록 변형되었다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 감소된 발현을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 감소된 발현을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD152(CTLA4)의 감소된 발현을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 감소된 발현을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CD152(CTLA4), 또는 CD279(PD-1) 중 어느 2개 이상의 감소된 발현을 포함한다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CD152(CTLA4), 또는 CD279(PD-1) 중 어느 3개 이상의 감소된 발현을 포함한다.
적합하게는, 상기 상세히 설명된 바와 같이 HECA-452 항체의 결합에 의해 입증된 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 발현하는 조작된 NK 세포는 CD38 CAR, TRAIL 변이체 폴리펩타이드, 또는 체크포인트 억제제 수용체의 결실 또는 감소를 포함한다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 발현하는 조작된 NK 세포는 CD38 CAR 및 TRAIL 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 발현하는 조작된 NK 세포는 CD38 CAR 및 체크포인트 억제제 수용체의 결실 또는 감소를 포함한다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 발현하는 조작된 NK 세포는 CD38 CAR, TRAIL 변이체 폴리펩타이드, 및 하나 이상의 체크포인트 억제제의 결실 또는 감소를 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 서열을 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 인간 TRAIL, D269H 및 E195R 중 2개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 인간 TRAIL, G131R, N199R, 및 K201H 중 3개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 D269H 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 E195R 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT, 및/또는 TIM-3 중 하나 이상 또는 모두이다.
적합하게는, HECA-452 항체의 결합에 의해 입증된 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 발현하는 조작된 NK 세포는 KHYG-1 세포이다. 적합하게는, KHYG-1 세포는 CD38 CAR, TRAIL 변이체 폴리펩타이드, 또는 체크포인트 억제제 수용체의 기능의 결실 또는 감소를 포함한다. 적합하게는, KHYG-1 세포는 CD38 CAR 및 TRAIL 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. 적합하게는, KHYG-1 세포는 CD38 CAR, 및 체크포인트 억제제 수용체의 기능의 결실 또는 감소를 포함한다. 적합하게는, KHYG-1 세포는 CD38 CAR, TRAIL 변이체 폴리펩타이드, 및 체크포인트 억제제 수용체의 기능의 결실 또는 감소를 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 적합하게는, CD38 CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 서열을 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 인간 TRAIL, D269H 및 E195R 중 2개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 인간 TRAIL, G131R, N199R, 및 K201H 중 3개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 D269H 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, TRAIL 수용체 변이체는 E195R 돌연변이를 포함한다. 적합하게는, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT, 및/또는 TIM-3 중 하나 이상 또는 모두이다.
조작된 자연 살해 세포를 제조하는 방법
조작된 자연 살해 세포는 당업계에 공지된 몇 가지 상이한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 적합하게는, CD38 CAR 또는 TRAIL 변이체 단백질은 바이러스 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 또는 레트로바이러스를 포함한다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스를 포함한다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 렌티바이러스를 포함한다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 레트로바이러스를 포함한다. 바이러스 벡터는 일차 NK 세포 또는 NK 세포주를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 일차 NK 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 NK 세포주를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 NK-92 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 적합하게는, 바이러스 벡터는 KHYG-1 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 적합하게는, 세포는 전기천공, 바이러스 벡터 또는, 생체내 사용과 양립가능한 지질 기반 형질감염 시약과 같은 상기 기재된 방법 중 어느 것을 사용하여 일시적으로 형질감염될 수 있다.
적합하게는, CD38 CAR 또는 TRAIL 변이체 단백질은 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 적합하게는, 폴리뉴클레오타이드는 DNA 플라스미드 또는 선형화된 DNA 폴리뉴클레오타이드이다. 적합하게는, 폴리뉴클레오타이드는 mRNA 분자이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 어느 것은 전기천공에 의해 일차 NK 세포 집단 또는 NK 세포주 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 맥스사이트 유동 전기천공(MaxCyte Flow Electroporation) 플랫폼이 조작된 NK 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
체크포인트 억제제 수용체의 결실 또는 감소된 발현을 포함하는 조작된 자연 살해 세포는 당업계에 공지된 몇 가지 상이한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 수용체는 CRISPR/Cas9 표적화 메커니즘을 사용하여(gRNA 표적화 뉴클레오타이드를 사용하여) 결실되거나 감소될 수 있다. gRNA는 일차 NK 세포 또는 세포주 내로 형질감염될 수 있다. 적합하게는, gRNA는 일차 NK 세포, 또는 일차 세포의 집단 내로 형질감염되어, 집단에서 체크포인트 억제 수용체의 발현을 감소시킬 수 있다. 적합하게는, gRNA는 NK 세포주 내로 형질감염된다. 적합하게는, gRNA는 KHYG-1 세포주 내로 형질감염되고, 체크포인트 억제 수용체의 동형접합 결실을 포함하는 클론이 선택된다.
자연 살해 세포를 투여하는 방법
본 발명은 대상에게 정맥내 투여하기에 적합한 조작된 NK 세포의 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 구상한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 CAR을 발현하는 NK 세포 또는 복수의 NK 세포를 포함하며; 선택적으로 NK 세포는 TRAIL 변이체 또는 체크포인트 억제제의 결실을 포함할 수 있다. 적합하게는, CAR 발현 NK 세포는 투여를 위해 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 제제화된다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 중성 완충 식염수, 정상 식염수, 또는 인산 완충 식염수와 같은 완충제를 포함할 수 있다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 글루코스, 덱스트로스, 락토스, 갈락토스, 만노스, 수크로스 또는 만니톨과 같은 탄수화물을 포함할 수 있다. 적합하게는, 약제학적 조성물은 단백질, 폴리펩타이드, 또는 아미노산, 예컨대 글리신을 포함하며; 적합하게는, 약제학적 조성물은 추가의 안정화제 및 보존제, 예컨대 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 EGTA, 또는 글루타티온을 포함한다. 적합하게는, NK 세포는 -70℃ 이하와 같은 저온에서 글리세롤에서 보존된 동결 스톡으로부터 확장된다. 적합하게는, NK 세포는 인터루킨-2 및 인터루킨-15와 같은 사이토카인을 사용하여 확장되고, 1주 이상 배양된다.
적합하게는, 투여되는 NK 세포 및 세포주는 세포를 받는 개체에 투여하기 전에 감마 조사된다. 적합하게는, 세포는 생체내에서 세포가 성장하고 분열하는 것을 방지하기 위해 조사된다. 적합하게는, 세포는 적어도 5 Gy, 10 Gy, 20 Gy, 30 Gy, 40 Gy, 50 Gy 이상의 선량으로 조사된다. 적합하게는, 세포는 20 Gy, 30 Gy, 40 Gy, 50 Gy, 60 Gy 이하의 선량으로 조사된다. 적합하게는, 세포는 이들의 생체내 반감기가 약 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 미만이 되도록 처리된다. 적합하게는, 세포 및 세포주는 세포 분열을 방지하거나 세포에 독성인 단백질을 발현하는 자살 유전자를 포함하여, 단축된 반감기를 허용하거나, 세포가 화합물의 투여시에 사멸되게 한다. 일반적인 자살 유전자의 예는 헤르페스 티미딘 키나아제 및 유도성 카스파아제 9를 포함한다. 헤르페스 티미딘 키나아제를 포함하는 세포는 아시클로비르 또는 간시클로비르와 같은 항헤르페스 항바이러스제를 사용하여 사멸될 수 있다.
본 발명의 대상인 조작된 NK 세포는 특정 암 또는 신생물의 발달을 방지하거나 또는 차도를 유도하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 약 1x106 세포/m2, 약 1x107 세포/m2, 약 1x108 세포/m2, 약 1x109 세포/m2, 및 약 1x1010 세포/m2 초과의 양으로 투여된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 약 1x106 내지 약 1x1010 세포/m2의 양으로 투여된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 약 1x107 내지 약 1x1010 세포/m2의 양으로 투여된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 약 1x108 내지 약 1x1010 세포/m2의 양으로 투여된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 약 1x109 내지 약 1x1010 세포/m2의 양으로 투여된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 약 1x107 내지 약 1x109 세포/m2의 양으로 투여된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 약 1x107 내지 약 1x108 세포/m2의 양으로 투여된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 약 1x108 내지 약 1x109 세포/m2의 양으로 투여된다. 조작된 NK 세포는 매일, 매주, 또는 매월 투여될 수 있다. 적합하게는, 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주 이상 동안 매주 투여된다. 적합하게는, 매주 투여 후, 조작된 NK 세포는 유지를 위해 매월 투여될 수 있다. 세포는 치료되는 암에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 혈액학적 암의 경우, 세포는 정맥내로 투여될 수 있다. 예를 들어, 고형 조직 암의 경우, 세포는 종양내 또는 복강내로 투여될 수 있다.
치료 보조제
조작된 NK 세포의 투여의 이전, 함께, 또는 이후 치료 보조제의 투여는 치료의 효능을 증가시킬 수 있다. 적합하게는, 보조제는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨 8(IL-8), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 또는 프로테아좀 억제제를 포함한다. 적합하게는, 프로테아좀 억제제는 보르테조밉, 카르필조밉, 익사조밉, 또는 이의 조합이다. 적합하게는, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, 또는 프로테아좀 억제제 중 어느 것은 조작된 NK 세포의 투여 이전에 환자에게 투여될 수 있다. 적합하게는, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, 또는 프로테아좀 억제제 중 어느 것은 조작된 NK 세포의 투여 동안 환자에게 투여될 수 있다. 적합하게는, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, 또는 프로테아좀 억제제 중 어느 것은 조작된 NK 세포의 투여 이후에 환자에게 투여될 수 있다. 적합하게는, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15의 활성은 IL-2, IL8, IL-12, 및 IL-15 수용체에 대한 비인터루킨 작용제에 의해 공급될 수 있다. 예를 들어, 인터루킨-12 작용제는 ALT-803 또는 ALT-801일 수 있으며; 인터루킨-15 작용제는 NIZ985일 수 있다.
적합하게는, 조작된 NK 세포는 조작된 NK 세포의 투여 이전에 인터루킨-12, 인터루킨-15, 또는 프로테아좀 억제제와 함께 배양될 수 있다. 적합하게는, CD38 CAR NK 세포는 투여 전에 인터루킨-12, 인터루킨-15, 또는 보르테조밉과 함께 배양될 수 있다. 적합하게는, TRAIL 변이체 NK 세포는 투여 이전에 IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, 또는 프로테아좀 억제제와 함께 배양될 수 있다. 적합하게는, 배양은 적어도 4, 6, 8, 12, 또는 24시간 동안이다.
본 발명의 치료 방법은 조작된 NK 세포를 이용한 치료를 개선하기 위한 보조제로서 저용량 사이클로포스파미드의 투여를 구상한다. 사이클로포스파미드는 경구로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 적합하게는, 사이클로포스파미드는 규칙적인 방식으로 투여되며, 예를 들어, 지속된 저용량의 사이클로포스파미드가 투여된다. 적합하게는, 사이클로포스파미드는 1, 2, 3, 4주 이상 동안 매일 또는 격일로 약 100 mg 내지 약 25 mg의 용량으로 경구 투여된다. 적합하게는, 사이클로포스파미드는 1, 2, 3, 4주 이상 동안 매일 약 50 mg의 용량으로 경구 투여된다. 적합하게는, 사이클로포스파미드는 1, 2, 3, 4주 이상 동안 매주 약 1000 mg 내지 약 250 mg의 용량으로 정맥내로 투여된다. 적합하게는, 사이클로포스파미드는 1, 2, 3, 4주 이상 동안 매주 약 750 mg, 500 mg, 250 mg 이하의 용량으로 정맥내로 투여된다. 적합하게는, 사이클로포스파미드는 조작된 NK 세포의 투여 이전에 투여되며, 조작된 NK 세포가 투여되면 중단된다. 적합하게는, 사이클로포스파미드는 조작된 NK 세포의 투여와 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 중첩되도록 투여된다. 적합하게는, 사이클로포스파미드는 조작된 NK 세포의 투여와 동시에 투여된다.
본 발명의 치료 방법은 조작된 NK 세포를 이용한 치료를 개선하기 위한 보조제로서 메탈로프로테아제 억제제의 투여를 구상한다. 적합하게는, 메탈로프로테아제 억제제는 테트라사이클린 항생제, 예컨대 독시사이클린, 미노사이클린, 티게사이클린, 데메클로사이틀린, 메타사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 리메사이클린, 메클로사이클린 또는 롤리테트라사이클린이다. 적합하게는, 테트라사이클린 항생제는 독시사이클린이다. 적합하게는, 본 발명의 조작된 NK 세포로 치료되는 개체는 매일 약 50 mg 내지 약 300 mg의 농도, 또는 매일 약 100 mg 내지 200 mg의 농도의 독시사이클린으로 미리 치료되거나 동시에 치료된다. 독시사이클린은 경구로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 적합하게는, 개체는 조작된 NK 세포와 동시에 독시사이클린으로 치료될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 조작된 NK 세포에 의해 세포를 사멸에 감작시키고 조작된 NK 세포와 함께 또는 이와 별도로 환자에게 투여될 수 있는 추가의 보조제를 구상한다. 예를 들어, 암세포는 TRAIL 유도된 세포자멸사에 내성일 수 있다. 적합하게는, 보조제는 TRAIL 유도된 세포자멸사에 대한 민감도를 회복시키는 작은 분자이다. 적합하게는, 화합물은 SMAC 모방체, 예를 들어 TL32711, LCL161, GDC-0917, HGS1029; NF-κB 억제제, 예를 들어(-)-DHMEQ, PBS-1086, IT-603, 또는 IT-901; 네딜화(neddylation) 억제제, 예를 들어 MLN4924; 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 억제제, 예를 들어 파노비노스타트, 보리노스타트, 로미뎁신, 킬다미드, 벨리노스타트, 발프로산, 모세티노스타트, 아벡시노스타트, 에티노스타트, SB939, 지비노스타트, 퀴시노스타트, 레스미노스타트이다. 또한 세포자멸사 억제 단백질의 억제제인 치료 보조제, 예를 들어: BCL-2 억제제, 예를 들어, 베네토클락스(ABT-199), 또는 오바토클락스(GX15-070); 수르비빈(survivin) 억제제, 예를 들어 YM15 또는 쉐페르딘(shepherdin)이 구상된다. 적합하게는, 보조제는 조작된 NK 세포의 투여 이전에 투여된다. 적합하게는, 보조제는 조작된 NK 세포의 투여와 동시에 투여된다.
치료 징후
본 발명의 CD38 CAR을 발현하는 조작된 자연 살해 세포는 암의 치료학적 치료에 유용하다. 적합하게는, 암은 혈액학적(혈액) 암을 포함한다. 적합하게는, 혈액학적 암은 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 또는 경쇄 골수종을 포함한다. 적합하게는, 혈액학적 암은 백혈병이다. 적합하게는, 백혈병은 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포 백혈병, T-세포 전림프성 백혈병, 또는 거대 과립 림프성 백혈병을 포함한다.
적합하게는, 치료될 암은 고형 조직 종양이다. 적합하게는, 고형 조직 종양은 간세포 암종을 포함하는 간 종양; 폐 종양; 비소세포 폐암; 췌장 선암 또는 췌장의 선방 세포 암종을 포함하는 췌장 종양; 결장암; 위암; 신장 세포 암종(RCC) 및 이행 세포 암종(TCC, 요로상피 세포 암종)을 포함하는 신장암; 난소암; 전립선암; 유방암; 또는 난소암이다.
일반 CAR
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드 결합의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 높은 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다.
암 관련 항원
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다.
혈액암 관련 항원
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드 결합의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 혈액암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다.
CD319
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD319/SLAMF-7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다.
TNFRSF17
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, HECA E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, TNFRSF17/BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다.
CD123
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD123/IL3-RA에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다.
CD138
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, SYND1/CD138에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD229
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD229에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD47
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD47에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD20
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드 결합의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD19
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD19에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD22
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD22에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
MUC1
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
MUC16
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, MUC16에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
Her2
/
Neu
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, Her2/Neu에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
표피 성장 인자 수용체(
EGFR
)
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
메소텔린
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CLL
-1
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CLL-1에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD38
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD38(서열번호: 1 및 2)
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 1에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 1에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 1에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 1에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 1에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 2에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD38(서열번호: 3 및 4)
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 3에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 3에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 3에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 3에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 3에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 4에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
CD38(서열번호: 5 및 6)
적합하게는, 조작된 NK 세포가 본원에 기재된다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타낸다. 적합하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준을 나타내는 조작된 NK 세포는 NK-92 세포보다 큰 HECA-452 결합의 수준을 나타낸다. 적합하게는, 조작된 NK 세포는 CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 5에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 5에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 5에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 5에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 서열번호: 5에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열, 및 서열번호: 6에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 표적화 도메인을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 3개의 아미노산 돌연변이; G131R, N199R, 및 K201H를 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 NK 세포는 변이체 인간 TRAIL 분자를 추가로 포함하며, 변이체 인간 TRAIL 분자는 2개의 아미노산 돌연변이; D269H 및 E195R을 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 체크포인트 억제제 분자의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD328(SIGLEC7)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CTLA-4의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD279(PD-1)의 발현의 결실 또는 감소를 추가로 포함한다. 적합하게는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 및 변이체 인간 TRAIL 분자를 포함하는 조작된 NK 세포는 CD96(TACTILE), CD328(SIGLEC7), CTLA-4, 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 적어도 2개의 체크포인트 억제제의 발현의 결실 또는 감소를 포함한다.
본 발명은 특히 다음의 구현예를 제공한다:
1. 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 조작된 자연 살해 세포는 바람직하게는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
2. 구현예 1에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 HECA-452 항체에 의해 결합된 항원에 대해 25% 초과 양성인 복수의 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
3. 구현예 1에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, TRAIL 수용체는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 일차 자연 살해 세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
5. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 형질전환된 자연 살해 세포주를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
6. 구현예 5에 있어서, 형질전환된 자연 살해 세포주는 NK-92 세포주 또는 KHYG-1 세포주인 것인 약제학적 조성물.
7. 구현예 5에 있어서, 형질전환된 자연 살해 세포주는 KHYG-1 세포주인 것인 약제학적 조성물.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 것인 약제학적 조성물.
9. 구현예 8에 있어서, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
10. 구현예 8에 있어서, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
11. 구현예 10에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
12. 구현예 10에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
13. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
14. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
15. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
16. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
17. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
18. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
19. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
20. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
21. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
22. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
23. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
24. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
25. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
26. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
27. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
28. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
29. 구현예 12에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 CD8 알파 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 단백질을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 4-1BB 단백질을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 CD3 제타 단백질을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 제2 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 돌연변이성 TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL) 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 증가된 신호전달을 유도하거나 TRAIL 리간드에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 것인 약제학적 조성물.
37. 구현예 36에 있어서, TRAIL 리간드는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
38. 구현예 36에 있어서, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 D269H/E195R 돌연변이를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
39. 구현예 36에 있어서, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 G131R/N199R/K201H 돌연변이를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR 또는 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 조작된 자연 살해 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 약제학적 조성물.
41. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체의 활성의 결실 또는 감소를 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
42. 구현예 41에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT 또는 TIM-3을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
43. 구현예 42에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96, CD152, 또는 CD328을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
44. 구현예 42에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
45. 구현예 42에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD152를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
46. 구현예 42에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD328을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
47. 구현예 41 내지 46 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 조작된 자연 살해 세포 게놈으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, 또는 염색체 수준에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해 파괴되는 것인 약제학적 조성물.
48. 구현예 41 내지 46 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체를 표적화하는 siRNA를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
49. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 안정화제, 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
50. 구현예 49에 있어서, 약제학적 조성물은 복강내 투여를 위해 제제화되는 것인 약제학적 조성물.
51. 구현예 49에 있어서, 정맥내 투여를 위해 제제화되는 것인 약제학적 조성물.
52. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 암을 치료하는데 사용하기 위한 것인 약제학적 조성물.
53. 구현예 52에 있어서, 암은 백혈병, 림프종, 또는 골수종을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
54. 구현예 52에 있어서, 암은 다발성 골수종을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
55. 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 가진 대상을 치료하는 방법으로서, 조작된 자연 살해 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 것인 방법.
56. 구현예 55에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 HECA-452 항체에 의해 결합된 항원에 대해 25% 초과 양성인 복수의 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 것인 방법.
57. 구현예 55에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, TRAIL 수용체는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함하는 것인 방법.
58. 구현예 55 내지 57 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 일차 자연 살해 세포를 포함하는 것인 방법.
59. 구현예 55 내지 57 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 형질전환된 자연 살해 세포주를 포함하는 것인 방법.
60. 구현예 59에 있어서, 형질전환된 자연 살해 세포주는 NK-92 세포주 또는 KHYG-1 세포주인 것인 방법.
61. 구현예 59에 있어서, 형질전환된 자연 살해 세포주는 KHYG-1 세포주인 것인 방법.
62. 구현예 55 내지 61 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
63. 구현예 62에 있어서, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 방법.
64. 구현예 62에 있어서, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함하는 것인 방법.
65. 구현예 64에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함하는 것인 방법.
66. 구현예 64에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함하는 것인 방법.
67. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
68. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
69. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
70. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
71. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
72. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
73. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
74. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
75. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
76. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
77. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
78. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
79. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
80. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
81. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
82. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
83. 구현예 66에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
84. 구현예 55 내지 83 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 CD8 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하는 것인 방법.
85. 구현예 55 내지 84 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 단백질을 포함하는 것인 방법.
86. 구현예 55 내지 85 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 4-1BB 단백질을 포함하는 것인 방법.
87. 구현예 55 내지 86 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 CD3 제타 단백질을 포함하는 것인 방법.
88. 구현예 55 내지 87 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함하는 것인 방법.
89. 구현예 55 내지 88 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포 제2 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 방법.
90. 구현예 55 내지 89 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 돌연변이성 TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL) 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 증가된 신호전달을 유도하거나 TRAIL 리간드에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 것인 방법.
91. 구현예 90에 있어서, TRAIL 리간드는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함하는 것인 방법.
92. 구현예 90에 있어서, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 D269H/E195R 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
93. 구현예 90에 있어서, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 G131R/N199R/K201H 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
94. 구현예 55 내지 93 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR 또는 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 조작된 자연 살해 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
95. 구현예 55 내지 94 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체의 활성의 결실 또는 감소를 추가로 포함하는 것인 방법.
96. 구현예 95에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT 또는 TIM-3을 포함하는 것인 방법.
97. 구현예 96에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96, CD152, 또는 CD328을 포함하는 것인 방법.
98. 구현예 97에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96을 포함하는 것인 방법.
99. 구현예 97에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD152를 포함하는 것인 방법.
100. 구현예 97에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD328을 포함하는 것인 방법.
101. 구현예 41 내지 46 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 조작된 자연 살해 세포 게놈으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, 또는 염색체 수준에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해 파괴되는 것인 방법.
102. 구현예 95 내지 101 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체를 표적화하는 siRNA를 포함하는 것인 방법.
103. 구현예 95 내지 102 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 조작된 자연 살해 세포 게놈으로부터 결실되는 것인 방법.
104. 구현예 55 내지 103 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 안정화제, 또는 부형제를 포함하는 것인 방법.
105. 구현예 104에 있어서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화되는 것인 방법.
106. 구현예 104에 있어서, 약제학적 조성물은 복강내 투여를 위해 제제화되는 것인 방법.
107. 구현예 55 내지 106 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 암은 백혈병, 림프종, 또는 골수종을 포함하는 것인 방법.
108. 구현예 55 내지 107 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 암은 다발성 골수종을 포함하는 것인 방법.
109. 구현예 55 내지 108 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 약제학적 조성물은 프로테아좀 억제제의 투여 이전, 동안 또는 이후에 투여되는 것인 방법.
110. 구현예 55 내지 108 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 약제학적 조성물은 저용량의 규칙적인 사이클로포스파미드 치료 요법의 이전, 동안, 또는 이후에 투여되는 것인 방법.
111. 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 조작된 자연 살해 세포는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 방법은 자연 살해 세포를 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
112. 구현예 111에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 HECA-452 항체에 의해 결합된 항원에 대해 25% 초과 양성인 복수의 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 것인 방법.
113. 구현예 111에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 TRAIL 수용체의 낮은 수준의 세포 표면 발현을 나타내며, TRAIL 수용체는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함하는 것인 방법.
114. 구현예 111 내지 113 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 일차 자연 살해 세포를 포함하는 것인 방법.
115. 구현예 111 내지 113 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 형질전환 자연 살해 세포주를 포함하는 것인 방법.
116. 구현예 115에 있어서, 형질전환 자연 살해 세포주는 NK-92 세포주 또는 KHYG-1 세포주인 것인 방법.
117. 구현예 115에 있어서, 형질전환 자연 살해 세포주는 KHYG-1 세포주인 것인 방법.
118. 구현예 111 내지 117 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
119. 구현예 118에 있어서, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 방법.
120. 구현예 118에 있어서, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함하는 것인 방법.
121. 구현예 120에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함하는 것인 방법.
122. 구현예 120에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함하는 것인 방법.
123. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
124. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
125. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
126. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
127. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
128. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
129. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
130. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
131. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
132. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
133. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
134. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
135. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
136. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
137. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
138. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
139. 구현예 122에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
140. 구현예 111 내지 139 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 CD8 알파 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하는 것인 방법.
141. 구현예 111 내지 140 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 DAP10, DAP12, 2B4(CD244), 또는 인간 4-1BB 단백질을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 것인 방법.
142. 구현예 111 내지 141 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 4-1BB 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
143. 구현예 111 내지 142 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 인간 CD3 제타 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
144. 구현예 111 내지 143 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 항체로부터 유래된 표적화 도메인을 포함하는 것인 방법.
145. 구현예 111 내지 144 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포를 제2 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 제2 키메라 항원 수용체는 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 방법.
146. 구현예 111 내지 145 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포를 돌연변이성 TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL) 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 증가된 신호전달을 유도하거나 TRAIL 리간드에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 것인 방법.
147. 구현예 146에 있어서, TRAIL 리간드는 TNFRSF10A(DR4) 또는 TNFRSF10B(DR5)를 포함하는 것인 방법.
148. 구현예 146에 있어서, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 D269H/E195R 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
149. 구현예 146에 있어서, 돌연변이성 TRAIL 폴리펩타이드는 인간 TRAIL의 G131R/N199R/K201H 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
150. 구현예 111 내지 149 중 어느 하나의 구현예에 있어서, CAR 또는 돌연변이성 TRAIL 폴리뉴클레오타이드는 조작된 자연 살해 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
151. 구현예 111 내지 150 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포를 체크포인트 억제 수용체의 활성을 결실시키거나 감소시키는 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
152. 구현예 151에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT 또는 TIM-3을 포함하는 것인 방법.
153. 구현예 151에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96, CD152, 또는 CD328을 포함하는 것인 방법.
154. 구현예 153에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96을 포함하는 것인 방법.
155. 구현예 153에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD152를 포함하는 것인 방법
156. 구현예 153에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD328을 포함하는 것인 방법.
157. 구현예 111 내지 156 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 조작된 자연 살해 세포 게놈으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, 또는 염색체 수준에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해 파괴되는 것인 방법.
158. 구현예 111 내지 157 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 체크포인트 억제 수용체를 표적화하는 siRNA를 포함하는 것인 방법.
159. 구현예 111 내지 158 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
160. 구현예 159에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스인 것인 방법.
161. 구현예 159에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스인 것인 방법.
162. 구현예 111 내지 161 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 mRNA를 포함하는 것인 방법.
163. 구현예 111 내지 162 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 조작된 자연 살해 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
164. 구현예 111 내지 163 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 세포는 조작된 자연 살해 세포의 푸코실화를 증가시키기 위해 화학물질로 처리되는 것인 방법.
165. 구현예 111 내지 163 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 조작된 자연 살해 세포를 약제학적으로 허용가능한 담체, 안정화제, 또는 부형제와 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
166. 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질의 발현을 나타내며, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
167. 구현예 166에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
168. 구현예 166에 있어서, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 것인.
169. 구현예 167에 있어서, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
170. 구현예 167에 있어서, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
171. 구현예 170에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
172. 구현예 170에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
173. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
174. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
175. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
176. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
177. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
178. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
179. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
180. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
181. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
182. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
183. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
184. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
185. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
186. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
187. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
188. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
189. 구현예 172에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
190. 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 가진 대상을 치료하는 방법으로서, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질의 발현을 나타내며, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 것인 방법.
191. 구현예 190에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
192. 구현예 190에 있어서, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
193. 구현예 192에 있어서, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 방법.
194. 구현예 192에 있어서, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함하는 것인 방법.
195. 구현예 194에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함하는 것인 방법.
196. 구현예 195에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함하는 것인 방법.
197. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
198. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
199. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
200. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
201. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
202. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
203. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
204. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
205. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
206. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
207. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
208. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
209. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
210. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
211. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
212. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
213. 구현예 196에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
214. 조작된 자연 살해 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질의 발현을 나타내며, 조작된 자연 살해 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 방법은 자연 살해 세포를 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
215. 구현예 214에 있어서, 조작된 자연 살해 세포는 FUT6 또는 FUT7 단백질을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
216. 구현예 214에 있어서, CAR은 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
217. 구현예 216에 있어서, 암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, 또는 HERV-K를 포함하는 것인 방법.
218. 구현예 216에 있어서, 암 관련 항원은 혈액암 관련 항원을 포함하는 것인 방법.
219. 구현예 218에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 또는 CLL-1을 포함하는 것인 방법.
220. 구현예 218에 있어서, 혈액암 관련 항원은 CD38을 포함하는 것인 방법.
221. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 80% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
222. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
223. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
224. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
225. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1-6 중 어느 것에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
226. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
227. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
228. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
229. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 1 및 2에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
230. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
231. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
232. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
233. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 3 및 4에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
234. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
235. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 95% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
236. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 적어도 98% 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
237. 구현예 220에 있어서, CAR은 서열번호: 5 및 6에 제시된 것과 동일한 표적화 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시예
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 실시예에서 예시된다.
실시예
1 -
NK
세포주
KHYG
-1은
NK
-92 세포주보다 E-
셀렉틴
리간드의 더 높은 수준 발현을
나타낸다
상이한 NK 세포주에서의 E-셀렉틴 리간드의 발현을 결정하기 위해, 10% FBS 및 10 ng/ml의 IL-2가 보충된 RPMI 1640 배지에서 NK-92 및 KHYG-1 세포를 배양하였다. 세포를 배양물로부터 취하고, 세척하고, PE 접합된 HECA-452 항체 또는 PE-아이소타입 대조군으로 염색하였다. 이후, 세포를 유세포 분석기에서 실행시키고, 대조군과 비교하여 각 세포주에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 결정하였다. 도 2a는 대표적인 실험이며, KHYG-1 세포가 아이소타입 대조군 201과 비교할 때 훨씬 더 높은 HECA-452 반응성 202을 나타낸다는 것을 보여준다(2772 대 221의 MFI). 도 2b는 아이소타입 대조군 203과 비교할 때 낮은 HECA-452 반응성 204을 나타내는 NK-92 세포의 반대 결과를 보여준다(545 대 121의 MFI).
실시예
2 -
NK
세포주
KHYG
-1은
감소된
E-
셀렉틴
리간드의
시험관내
표현형을
나타낸다
이 증가된 HECA-452 반응성이 KHYG-1 및 NK-92 세포의 이동의 표현형 차이로 번역되었는지 여부를 시험관내에서 조사하였다. 먼저, 기질 유래 인자-1(Stromal-derived factor-1, SDF-1) 구배에 따른 이동을 조사하였다. 도 3은 KHYG-1 세포(좌측 막대)가 NK-92 세포(우측 막대)와 비교할 때 이동의 약 6배 증가를 나타내었다는 것을 보여준다. 또한, E-셀렉틴 코팅된 유세포에서의 이동을 모니터링하였다. 도 4a 및 b는 유세포 분석 동안 촬영된 비디오의 정지 화면을 보여준다. 도 4a는 많은 KHYG-1 세포가 유세포 분석에서 움직이지 않거나 매우 느린 움직임을 나타낸다는 것을 보여준다(별표). 대조적으로, 도 4b는 NK-92가 유세포의 프레임을 통해 방해받지 않고 유동한다는 것을 보여준다.
이동 분석
대수기(log phase) NK-92 또는 KHYG1 세포를 채취하고, 세척하고, 10 ng/mL의 IL-2를 함유하는 무혈청 배양 배지(KHYG1의 경우 RPMI1640, NK-92의 경우 aMEM)에 현탁시켜 4시간 동안 고갈시켰다. 100 ng/mL의 SDF1 및 10 ng/mL의 IL-2를 함유하는 600 μL의 무혈청 배양 배지를 각 웰(12 웰 플레이트에 대해)에 첨가한 다음, 100 μL의 고갈된 세포 현탁액을 기공 크기가 5.0 μm인 상부 이동 챔버(Costar; Corning)에 로딩하였다. 이후, 세포를 CO2 배양기 내의 37℃ 셀에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후, 하부 구획의 배지(이동된 세포 함유)를 채취하고, 세포 수를 BD Accuri™ C6 유세포 분석기를 사용하여 계수하였다.
유세포
/롤링(rolling) 분석
롤링 분석을 미러스 에보 나노펌프(Mirus Evo NanoPump; Cellix Limited)를 사용하여 8채널 미세유체 바이오칩(Cellix Limited, Dublin, Ireland)에서 수행하였다. 바이오칩의 채널 Vena8 Fluoro+(Cellix Limited)를 1 mM CaCl2이 보충된 Tris·HCl pH 7.4 중의 15 μg/mL의 E-셀렉틴(PeProtech, Rocky Hill, US)으로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 각 채널을 1% BSA(소 혈청 알부민)로 차단하거나 또는 표시된 경우 15 μg/mL의 항-E-셀렉틴 차단 항체(클론 BBIG-E1, R&D System; Minneapolis, US)로 차단하고, 분석하기 전에 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 세척하고, 2x106 세포/ml로 롤링 분석 완충제(1% 열 불활성화된 FBS(우 태아 혈청), 5 mM HEPES 및 1 mM CaCl2가 보충된 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 배지)에 재현탁시켰다. 80 μL의 세포 현탁액을 마이크로채널에 로딩하고, 롤링 분석을 실온에서 0.5 dyne/cm2로 수행하였다. 세포를 AX10Vert.A1 현미경(Carl Zeiss Microscopy GmbH)의 A-Plan 10X/0.25 대물 렌즈(Carl Zeiss Microscopy GmbH; Jena, Germany)를 사용하여 채널을 따라 5개의 상이한 위치에서 모니터링하였다. 01 QIClick F-M-12 모노 12-비트 카메라(QImaging; Surrey, Canada)를 사용하여 위치당 30 프레임을 서로 0.5초 간격으로 수집하였다. 이미지를 베나 플럭스(Vena Flux) 분석 소프트웨어(Cellix Limited)를 사용하여 획득하고, 이미지-프로 프리미어(Image-Pro Premiere) 소프트웨어(Media Cybernetics; Rockville, US)를 사용하여 분석하였다. 롤링 세포는 그의 직경 초과에 상응하는 거리를 이동하는 세포로서 정의되었다. 채널당 5개의 상이한 위치의 총 세포 수를 계수한 다음, 모든 채널의 평균 수를 계산하였다.
실시예
3-
NK
세포주
KHYG
-1의
생체내
회귀성(homing)
생체내 마우스 모델에서, 본 발명자들은 원격 골수 환경(niche)으로의 NK 세포의 회귀성을 추적할 것이다. 이것은 골수 상에서 생체내 공초점 현미경 검사 또는 유세포 분석을 사용하여 수행될 것이다. 골수 회귀성에 대해 분석될 세포주는 KHYG-1(높은 HECA-452 결합) 및 NK-92 high(낮은 HECA-452 결합)일 것이다. 두 세포주는 동일한 마우스에 주입될 것이지만, 경쟁적인 골수 회귀성 분석을 수행하기 위해 2개의 상이한 형광단으로 표지될 것이다. 본 발명자들은 4, 8, 12, 또는 24시간과 같은 하나의 시점에 살펴볼 것이다.
NK 세포는 형광 염료(Calcein AM 또는 CellTracker Dyes)로 표지될 것이다. 이후, BM으로의 회귀성은 Zeiss 710 공초점 시스템(Carl Zeiss Microimaging, Jena, Germany)을 사용하여 생체내에서 이미지화되거나 FACS Aria II 유세포 분석기를 사용하여 정량화될 것이다. 공초점에서, 마우스의 두피에서 피부판(skin flap)이 만들어져 기저 등 두개골 표면(underlying dorsal skull surface)을 노출시킬 것이다. 종양의 이미지는 생체내 공초점 현미경 검사를 사용하여 약 1시간 내에 캡처될 것이다. 10x 0.45NA Plan-Apo 대물 렌즈(Carl Zeiss Microimaging)를 사용하여 두개골의 표면으로부터 최대 250 μm의 깊이에서 손상되지 않은 마우스 두개골을 통해 세포 세부사항을 갖는 이미지가 수득될 것이다. 다중 이미징 깊이가 획득될 것이고, 최대 강도 z-투영이 Image J에서 수행되어 이미지를 병합할 것이다. GFP는 아르곤 레이저에서 488nm 선으로 여기될 것이다. 혈관은 633 nm 레이저로 여기된 에반스 블루(Evans Blue, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 사용하여 이미지화될 것이다. 방출 신호는 Zeiss 내부 공초점 퀘이사(Quasar) 검출기에 의해 수집될 것이다.
실시예
4 - 다발성 골수종에 대한
NK
세포를 발현하는 CD38 CAR의
생체내
효능
고, 중간 및 저 친화도 CD38 CAR로
KHYG
-1 세포를
형질도입시킨다
2세대 CD38 CAR 작제물을 상이한 친화도의 표적화 도메인을 이용하여 생성한다: 고, 중간 및 저. CAR은 또한 CD3ζ 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하며, 2A 서열에 의해 형질도입 마커로서 분리된 △NGFR(CAR 형질도입된 세포를 추적하는데 사용될 마커 유전자)에 연결된다. 상이한 친화도 CD38 CAR이 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 작제물로서 생성될 것인데, 어떤 유형의 작제물이 KHYG-1 세포를 더 잘 형질도입할 것인지 잘 알려져 있지 않기 때문이다. 본 발명자들은 서열번호: 1-6으로부터 유래된 CAR 표적화 도메인에 대한 서열을 사용할 것이다. 이 문제를 해결할 파일럿 실험의 결과에 따라, 본 발명자들은 KHYG-1 세포를 상이한 CD38 CAR 작제물로 형질도입시키고, 이들을 높은 순도에 대해 선택하여 상기 기재된 바와 같이 다발성 골수종(MM) 세포주에 대한 이들의 기능적 효능을 시험할 것이다.
기능적 시험 단계에서, 본 발명자들은 CAR 형질도입된 KHYG-1 세포를 0일, 1주, 3주 및 6주(확장 말기)에 증식 및 확장(세포 계수), CD16, CD56, CD3, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1 및 NKG2A 발현에 대해 모니터링할 것이다. 세포자멸사 마커 아넥신-V의 발현을 또한 조사할 것이다. 본 발명자들은 CAR T 세포가 활성화된 상태에도 불구하고 CD38을 발현하지 않는다는 것을 관찰하였기 때문에, 또 다른 중요한 표현형 파라미터는 CD38의 발현이다. 이후, 본 발명자들은 CD38+ MM 세포에 대한 이들의 CD38 의존적 증식성 및 사이토카인(IFNγ 및 TNFα) 분비능을 평가할 것이다(CFSE 분석). BLI 기반 세포독성 분석은 다양한 루시퍼라아제 형질감염된 MM 세포주에 대한 CD38 CAR NK 세포의 세포독성 활성을 측정하는데 사용될 것이다. 본 발명자들은 또한 표적 세포로서 NK 세포 민감성 K562 세포주를 사용할 것이다.
유세포 분석법을 사용하여 △NGFR 양성 CAR NK 세포의 표면에서 CD107a의 상향조절을 분석함으로써 UM9(높은 CD38) 대 U266(CD38 음성)으로 자극시 NK 세포의 CD38 의존적 탈과립화를 분석할 것이다. 일차 MM 세포에 대한 세포독성 반응성을 이전에 기재된 바와 같이 환자로부터 유래된 BMMNC를 사용하여 FACS 기반 세포독성 분석에서 평가할 것이다. 간단하게, CD38 CAR NK 세포를 상이한 효과기 대 표적 비율로 5-50% MM 세포를 함유하는 BMMNC와 공동배양할 것이다. 24 내지 48시간 후, 정량적 유세포 분석법을 사용하여 CD138 양성 혈장 세포를 세어 MM 세포의 생존을 평가할 것이다. 이전에 기재된 바와 같이 이들 생존 데이터로부터 세포독성 활성을 추론할 것이다.
이 연구 단계에서, 비악성 CD38 양성 조혈 세포에 대한 반응성을 결정하는 것이 또한 중요하다. 이것은 건강한 개체 또는 환자의 PBMC 또는 BMMNC를 사용하는 FACS 기반 세포독성 분석에 의해 평가될 것이다. 24 내지 48시간 동안 CD38 CAR NK 세포를 PBMC 또는 BMMNC와 공동 배양한 후, CD34+ 조혈 선조 세포(BMMNC 샘플에서만), CD3+ T 세포, CD14+ 단핵구, CD56+ NK 세포, CD19/20+ B 세포를 포함하는 비악성 조혈 세포의 생존을 단일 플랫폼 정량적 FACS 분석에서 결정할 것이다. 이러한 모든 분석에서, 공(mock) 벡터 형질감염된 NK 세포를 음성 대조군으로서 사용할 것이고, 초기에 확립된 CD38 CART 세포를 양성 대조군으로서 사용할 것이다.
가장 최적의 CD38 CAR NK-92 세포를 TRAIL 변이체(TRAILv) 및 TRAIL 야생형(TRAILwt)으로 형질도입시킨다.
가장 최적의 CD38 CAR
KHYG
-1
세포를
TRAILv
및 TRAIL wt로 형질도입시킨다.
정상 CD38+ 세포에 영향을 미치지 않으면서 MM 세포를 사멸시키는데 가장 좋은 CD38 CAR NK 세포를 선택하고 야생형 TRAIL 및 TRAIL 변이체 작제물로 추가로 형질도입할 것이다. 전술한 유사한 환경에서, 이들의 CD38 및 DR-5 의존적 세포독성 활성을 비교하고 이들의 표적 세포 특이성을 비교하기 위해 이들 세포를 DR5+CD38+, DR5+CD38-, DR5-CD38+, DR5-,CD38- MM 세포주에 대해 시험할 것이다. 일차 MM 세포를 또한 이들 세포에 대한 민감성에 대해 연구할 것이다. 유도성 TRAILv 작제물을 생성하기 위해, 본 발명자들은 최소 (m)CMV 프로모터의 제어 및 NFAT 전사 반응 요소(TRE)의 탠덤 반복(tandem repeat)하의 복제 무능력 VSV-g 의사형(pseudotyped) 자가 불활성화 렌티바이러스 작제물 내에 TRAILv 유전자를 클로닝할 것이다. 이 방식에 의해, 본 발명자들은 CAR 촉발(triggering)시 TRAILv의 빠른 유도를 가능하게 할 것이고, 이는 NFAT 제어하에 유전자 발현을 유도한다. 결과적으로, CAR 촉발시, CD3제타 도메인은 NFAT를 활성화시키고, 이는 이후에 TRAILv의 신속한 전사 및 후속 발현을 유도할 것이다. 생성된 세포를 먼저 CD38 CAR 의존적 TRAILv 발현에 대해 평가할 것이다. 이 유도성 유전자의 온/오프 동력학을 연구한 후, 세포를 전술한 유사한 환경에서 DR5+CD38+, DR5+CD38-, DR5-CD38+, DR5-,CD38- MM 세포주 및 일차 MM 세포를 사멸시키는 능력에 대해 연구할 것이다.
생체내
항-MM 효능 및 MM 대 정상 조혈 세포 구별 능력에서 최상의 CD38 CAR을 평가한다
본 단계에서, 본 발명자들은 시험관내에서 기능하는 최상의 CD38 CAR NK 세포의 생체내 안전성 및 항-MM 효능을 결정할 것이다. 인간 골수 유래 MSC로 코팅된 스캐폴드의 피하 접종을 통해 생성된, 인간화된 미세환경에서 인간 종양이 성장하는, 본 발명자들의 최근 개발된 Rag2-/-γc-/--기반의 이종이식 모델에서 최상의 CD38 CAR(및 TRAILv)로 형질도입된 NK 세포의 생체내 활성을 평가할 것이다. 간략하게, 이 모델에서, CD38 양성 UM-9 및 CD38 음성 U266 MM 종양이 인간화된 BM 미세환경에서 확립될 것이다. BLI에 의해 인간화된 스캐폴드에서 MM 종양의 생착을 입증한 후(일반적으로 접종 1-2주 후), 마우스를 iCasp9-CD38 CAR NK 세포로 처리할 것이다. 세포를 증가하는 용량(정맥내에서 3, 6 및 30x106 세포/마우스; 스캐폴드 내에서 1,5, 3, 9x106 세포의 총 용량)으로 정맥내 또는 스캐폴드 내로 주입할 것이다. 총 CAR NK 세포 용량을 3개로 나누고, 각 용량을 일주일 간격으로 투여할 것이다. 종양 부담(tumor burden)을 BLI에 의해 모니터링할 것이다. 공(mock) 형질도입된 NK 세포 및 CD38 CART 세포를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용할 것이다.
실시예
5 - CD38 CAR
NK
세포 수용체에 의한 다발성 골수종 요법을 위한 프로토콜
상기에 나타낸 바와 같이, CD38 CAR NK 세포를 상이한 유형의 암을 가진 개체에게 투여할 것이다. 하기 프로토콜은 다발성 골수종 환자를 치료하는데 사용하기 위해 개발되었다. 다발성 골수종과 같은 CD38 양성 암을 가진 환자의 진단 후, 변형된 NK 세포의 분취물을 환자에게 투여하기 전에 해동하고 배양할 수 있다. 대안적으로, CD38 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 렌티바이러스를 사용하여, 또는 본원에 기재된 바와 같이 CAR을 코딩하는 mRNA을 이용한 전기천공을 사용하여 일시적 형질감염을 준비할 수 있다. 전기천공의 경우, 맥스사이트 유동 전기천공 플랫폼은 병원에서 빠른 대규모 형질감염을 달성하는데 적합한 용액을 제공한다. CD38 CAR 발현 NK 세포를 형질감염 후, 이를 배양하여 CAR를 발현시킨 다음 환자에게 정맥내로 투여한다.
실시예
6 - 다발성 골수종 및 급성 골수성 백혈병에 대한 TRAIL
변이체
발현 NK 세포의 시험관내 효능
다발성 골수종(MM), 급성 골수성 백혈병(AML), 및 신장 세포 암종(RCC)은 쇠약하게 하며 종종 치명적인 악성종양이다. RCC, MM 및 AML은 NK 세포 TRAIL을 포함하는 다수의 효과기 경로를 통해 NK 세포 세포독성에 민감하다. 보르테조밉을 이용한 악성 세포의 치료는 많은 악성 종양에서 DR5 발현을 상향조절하고, TRAIL 매개 세포자멸사에 대한 이들의 민감성을 향상시킨다. 중요하게도, EBV-LCL을 사용하여 생체외에서 확장된 NK 세포는 실질적으로 TRAIL의 표면 발현을 상향조절하여, 보르테조밉 노출된 종양의 NK 세포 매개 종양 사멸을 더 증가시킨다. 따라서, 전장의 돌연변이된 DR5 특이적 TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포의 유전적 변형은 과립 매개 세포독성에 독립적인 NK 세포의 종양 특이적 세포 독성을 향상시킬 수 있다. 또한, DR5를 상향조절하는 보르테조밉에 노출된 종양은 이들 유전적으로 변형된 NK 세포에 의한 사멸에 정교하게 감작될 것으로 예상될 것이다.
시험관내
실험 계획
DR-5 특이적 재조합 TRAIL(rhTRAIL D269H/E195R)을 발현하도록 유전적으로 변형된 생체외에서 확장된 NK 세포(GMP 조건 및 SMI-LCL 공급자(feeder) 세포주를 사용하여 확장된 NK 세포)를 이들이 시험관 내에서 RCC, AML 및 MM 종양 표적에 대한 NK 세포 매개 사멸을 강화시킬 수 있는지, 그리고 또한 종양 표적을 보르테조밉으로 전처리함으로써 종양 사멸이 개선될 수 있는지 살펴보기 위해 조사할 것이다. 종양 세포독성 실험을 보르테조밉 처리로 상향조절될 수 있는 DR-5를 발현하는 것으로 알려진 종양 세포주의 패널에 대한 생체외에서 확장된 NK 세포를 갖는 크롬 방출 분석(CRA) 및 NK 세포 탈과립화 분석(CD107a)을 사용하여 시험관내에서 수행할 것이다. NK 세포 종양 사멸이 NK 세포 집단 사이에서 상이하게 달성되는지 확인하기 위해, 상이한 NK 세포 제제를 이용하여 종양 세포독성 분석을 수행할 것이다. 집단은 하기를 포함한다: a) 새롭게 단리된 NK 세포; b) 밤새 IL-2 활성화된 NK 세포; c) EBV-LCL 공급자 세포를 사용하여 14일 생체외에서 확장된 NK 세포; d) DR-5 특이적 재조합 TRAIL을 발현하기 위해 맥스사이트 GT 시스템을 사용하여 전기천공된 14일 생체외에서 확장된 NK 세포 mRNA; 및 e) DR-5 특이적 재조합 TRAIL을 발현하기 위해 렌티바이러스 벡터(LV)를 사용하여 형질도입된 14일 생체외에서 확장된 NK 세포.
TRAIL 표면 발현을 최적화하기 위해 형질도입의 다양한 MOI를 시험할 것이다. 목표는 a) NK 세포 형질도입(시험관내) 후 4주 동안 TRAIL 표면 발현의 동역학을 정의하는 것; b) NK 세포 형질도입 후 여러 기간 동안 TRAIL을 통한 NK 세포 종양 사멸의 동역학을 정의하는 것; c) NK 세포의 표현형, 사이토카인 분비 잠재력, 및 기능적 세포독성에 대한 DR-5 특이적 TRAIL 형질도입의 효과를 평가하는 것; 시험관내 NK 세포 증식에 대한 DR-5 특이적 TRAIL 형질도입의 효과를 평가하는 것; 및 d) NK 세포 생존력에 대한 DR-5 특이적 TRAIL 형질도입의 효과를 평가하는 것일 것이다.
DR-5 특이적 재조합 TRAIL을 코딩하는 다양한 농도의 mRNA를 시험하여 재조합 TRAIL(시험관내)을 발현하기 위한 NK 세포의 형질감염을 최적화할 것이다. 목표는 a) mRNA 형질감염 후 4-7일 동안 재조합 TRAIL 발현의 동역학을 정의하는 것; b) 이러한 TRAIL 발현의 동역학을 대조군으로서 표면 발현된 CD34를 코딩하는 mRNA로 형질감염된 NK 세포와 비교하는 것; c) 1주일 동안 DR-5 재조합 TRAIL로 NK 세포를 형질감염 후 TRAIL을 통한 NK 세포 종양 사멸의 동역학을 정의하는 것; d) NK 세포의 표현형, 사이토카인 분비 잠재력, 및 기능적 세포독성에 대한 DR-5 특이적 TRAIL mRNA 형질감염의 효과를 평가하는 것; e) 시험관내 NK 세포 증식에 대한 DR-5 특이적 TRAIL mRNA 형질감염의 효과를 평가하는 것; 및 f) NK 세포 생존력에 대한 DR-5 특이적 TRAIL mRNA 형질감염의 효과를 평가하는 것일 것이다. 본 발명자들은 또한 DR5 수용체의 종양 표면 발현을 상향조절하기 위해 보르테조밉으로 미리 처리된 RCC, MM, 및 AML 종양 표적 +/-에 대한 NK 세포(유전적으로 조작 대 야생형)를 표적화할 것이다.
생체내
실험 계획
다음으로, DR-5 특이적 재조합 TRAIL을 발현하도록 유전적으로 변형된 생체외 확장된 NK 세포를 이들이 생체내에서 RCC, AML 및 MM 종양 표적에 대한 NK 세포 사멸을 강화시킬 수 있는지 살펴보기 위해 조사할 것이다. DR-5 특이적 재조합 TRAIL을 발현하도록 유전적으로 변형된 생체외 확장된 NK 세포를 MM1S 종양을 갖는 마우스(NSG) 내로 입양 주입하여 생물발광 이미징(BLI)을 사용하여 처리되지 않은 마우스와 처리된 마우스의 결과를 비교할 것이다. 조건은 신선한, IL-2 활성화되고 확장된 NK 세포뿐만 아니라 바이러스 형질도입 및 mRNA 형질감염을 통해 DR-5 특이적 재조합 TRAIL을 발현하도록 유전적으로 변형된 확장된 NK 세포를 포함할 것이다. 동일한 접근법을 SAUJ-Luc를 갖는 RCC에서 그리고 MOLM14-Luc 종양을 갖는 마우스의 AML에서 평가할 것이다. 루시퍼라아제 형질도입된 종양 표적은 BLI 이미징을 사용하여 이들 모델에서 종양 부담을 평가할 수 있게 해줄 것이다.
치료 시기가 결과에 영향을 미치는지 조사할 것이다. TRAIL의 표면 발현이 최고인 시간까지 mRNA 형질감염 후 NK 세포의 주입을 지연시키는 것과 대비하여 NK 세포를 mRNA 형질감염 후 바로 주입할 것이다. 종양의 생체내 NK 세포 사멸에 대한 외인성 IL-2 및/또는 IL-15 투여의 영향을 또한 조사할 것이다. 재조합 DR-5 특이적 TRAIL을 발현하도록 유전적으로 변형된 NK 세포에 의한 종양 사멸에 대해 보르테조밉으로 미리 처리된 동물의 영향을 조사할 것이다. 본 발명자들은 a) 유전적 변형; b) 배양 변형; 또는 c) 골수로의 회귀성을 개선한 생체외 조작을 겪은 확장된 NK 세포 집단을 사용하여 DR-5를 발현하도록 유전적으로 변형된 생체외 확장된 NK 세포를 이용하여 MM 및 AML에서 상기 생체내 실험을 평가할 것이다.
실시예
7 - 억제 수용체 기능의
넉아웃
CRISPR
/
Cas9
억제 수용체 기능이 제거된 세포를 다음과 같이 제조하였다. gRNA 작제물을 NK 세포의 인간 게놈 내의 '고전적인' 억제 수용체 LIR2 및 '체크포인트' 억제 수용체 CTLA4를 코딩하는 유전자를 표적화하도록 디자인하고 제조하였다. 이후, CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 LIR2 및 CTLA4 표적 유전자를 넉아웃시켰다.
2개의 gRNA 후보를 각 표적 유전자에 대해 선택하고, K562 세포에서 이들의 절단 효능을 결정하였다. gRNA 후보의 서열이 표 1에 나타나 있다.
K562 세포를 제조된 gRNA 작제물(도 5)로 형질감염시키고, 이어서 PCR 증폭을 위해 채취하였다. GFP 발현의 존재를 K562 세포 내로 gRNA 작제물의 성공적인 혼입을 보고하는데 사용하였다. 이것은 Cas9 유전자의 발현 및 따라서 LIR2 및 CTLA4 유전자의 발현을 넉아웃시키는 능력을 확인시켜 주었다. gRNA 작제물의 절단 활성을 시험관내 미스매치 검출 분석을 사용하여 결정하였다. T7E1 엔도뉴클레아제 I은 완벽하게 매치되지 않은 DNA를 인식하고 절단하여, 모 LIR2 및 CTLA4 유전자를 CRISPR/Cas9 형질감염 및 비상동성 말단 결합(NHEJ) 후 돌연변이된 유전자와 비교될 수 있게 해준다.
도 6은 g9 및 g18 gRNA 서열로 LIR2 유전자를 넉아웃한 후 아가로스 겔 전기영동 후 생성된 밴드를 보여준다. 각 돌연변이에 상응하는 3개의 밴드는 형질감염 후 DNA 서열 내의 미스매치의 검출 후 모 유전자(601) 및 2개의 생성된 가닥(602 및 603)과 관련된다. g9 gRNA 서열은 11%의 형질감염 성공률을 초래한 반면, g18 gRNA는 10%를 초래하였다.
도 7은 g7 및 g15 gRNA 서열로 CTLA4 유전자를 넉아웃한 후 아가로스 겔 전기영동 후 생성된 밴드를 보여준다. 701은 모 밴드를 보여주며, 702; 703은 미스매치 검출 후 2개의 생성된 밴드를 보여준다. g7 gRNA 서열은 32%의 형질감염 성공률을 초래한 반면, g15 gRNA는 26%를 초래하였다.
K562 세포에서 LIR2 및 CTLA4의 성공적인 넉아웃 후, KHYG-1 세포를 gRNA 작제물로 형질감염시켰다. 동형접합 결실을 갖는 KHYG-1 유도체 클론을 선택하였다. Cas9/푸로마이신 아세틸트랜스퍼라아제(PAC) 발현 벡터를 이 목적을 위해 사용하였다. 성공적으로 형질감염된 세포를 항생제 푸로마이신에 대한 내성에 기초하여 선택하였다.
Cas9
RNP
NK 세포에서 체크포인트 억제 수용체의 넉아웃을 위해 사용된 또 다른 프로토콜은 Cas9 RNP 형질감염의 프로토콜이었다. 이 프로토콜을 사용하는 이점은 CRISPR/Cas9 프로토콜의 DNA 플라스미드를 사용하는 것과 비교하여 유의하게 더 낮은 독성으로 유사한 형질감염 효율을 달성할 수 있다는 점이었다. 1x106 KHYG1 세포를 각 형질감염 실험을 위해 채취하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리기에서 회전시켰다. 이후, 상층액을 버렸다. 이후, CRISPR RNP(RNA 결합 단백질) 물질을 하기와 같이 제조하였다: (1) 필요한 합성된 crRNA 및 tRNA(Dharmacon으로부터 구입)의 20 μM 용액을 제조하였다; (2) 4 μl의 crRNA(20 μM) 및 4 μl의 tRNA(20 μM)를 함께 혼합하였다; (3) 이후, 혼합물을 2 μl Cas9 단백질(5 μg/μl)에 첨가하였다; (4) 모든 성분을 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. Neon® 형질감염 시스템에 따라, 세포를 Cas9 RNP와 혼합하고, 전기천공을 하기 파라미터를 사용하여 수행하였다: 전압: 1450v; 펄스 폭, 30ms; 펄스 수: 1. 이후, 세포를 성장 배지(IL-2 및 IL-15 함유)를 함유하는 12-웰 플레이트의 하나의 웰로 옮겼다. 세포를 48-72시간 후에 채취하여 T7 엔도뉴클레아제 분석 및/또는 생어 시퀀싱에 의해 유전자 편집 효율을 확인하였다. 인델(Indel)의 존재를 확인하였고, 이는 KHYG1 세포에서 CTLA4, PD1 및 CD96의 성공적인 넉아웃을 나타낸다.
부위 특이적 뉴클레아제
NK 세포에서 체크포인트 억제 수용체의 넉아웃을 위해 사용된 또 다른 프로토콜은 XTN TALEN 형질감염의 프로토콜이었다. 이 프로토콜을 사용하는 이점은 야생형 CRISPR과 비교하여 특히 높은 수준의 특이성이 달성될 수 있다는 점이었다.
단계 1: 시약의 제조
KHYG-1 세포를 형질감염 효율, 단일 세포 클로닝 효율 및 핵형/복제수를 포함하는 특정 특성에 대해 분석하였다. 이후, 세포를 제조사의 권고에 따라 배양하였다. 넉아웃되는 체크포인트 억제 수용체에 따라, 적어도 2쌍의 XTN TALEN의 맞춤 디자인에 의해 뉴클레아제를 제조하였다. 맞춤 디자인의 단계는 유전자 좌의 평가, 복제수 및 기능적 평가(즉, 상동체, 오프-표적 평가)를 포함한다.
단계 2: 세포주 조작
세포를 단계 1의 뉴클레아제로 형질감염시켰고; 이 단계를 높은 수준의 절단을 얻기 위해 최대 3회 반복하였고, 배양액을 분할하고 중간 배양물을 각 형질 감염 전에 유지하였다. 초기 스크리닝은 각 형질감염 며칠 후에 발생하였고; 세포의 풀을 Cel-1 분석을 통한 절단 효율에 대해 시험하였다. 반복된 형질감염 후 허용가능한 수준 또는 정체기에 도달하는 절단 수준 후, 세포를 단일 세포 클로닝을 위한 준비가 되었다고 간주하였다. 모은 세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 하나의 세포로 분리(sorting)하였고; 각 풀에 대한 플레이트의 수는 단계 1에서 결정된 단일 세포 클로닝 효율에 의존하였다. 플레이트를 3-4주 동안 배양하였다.
단계 3: 스크리닝 및 확장
세포가 96-웰 플레이트에서 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 배양액을 합하여 3개의 96-웰 플레이트로 분할하였고; 하나의 플레이트를 백업(backup)으로서 동결시키고, 하나의 플레이트를 재도말하여 클론의 확장을 계속하였고, 마지막 플레이트를 유전자형 확인에 사용하였다. 유전자형 플레이트의 각 클론을 모든 대립유전자가 변형되었음을 나타내는 qPCR 신호의 손실에 대해 분석하였다. 음성 클론을 PCR 증폭 및 클로닝하여 인델의 특성 및 임의의 야생형 또는 인프레임(in-frame) 인델의 결실을 결정하였다. 확인된 넉아웃을 갖는 클론을 단지 하나의 24-웰 플레이트 내로 통합하고, 추가로 확장시켰고; 전형적으로 최대 5개의 개별 클론에 대해 바이알당 1x106 세포를 함유하는 5-10개의 동결된 냉동 바이알을 넉아웃당 생산하였다.
단계 4: 검증
세포를 무균 조건하에 보관하였다. 모든 보관된 세포에 대한 기본 방출 기준은 생존가능한 세포 수(동결전 및 해동후), STR을 통한 신원의 확인, 기본 멸균도 보장 및 마이코플라스마 시험을 포함하였고; 다른 방출 기준은 필요할 때 적용되었다(핵형, 표면 마커 발현, 높은 수준 멸균성, 전사체 또는 단백질 등의 넉아웃 평가).
실시예
8 -
RNAi를
통한 체크포인트 억제 수용체 CD96 기능의
넉다운
KHYG-1 세포에서 CD96의 siRNA 넉다운을 전기천공에 의해 수행하였다. 뉴클레오펙션(Nucleofection) 키트를 론자(Lonza)의 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector) II와 함께 사용하였는데, 그것이 세포주와 함께 사용하기에 적절하며, 분열 및 비분열 세포 모두를 성공적으로 형질감염시킬 수 있고, 최대 90%의 형질감염 효율을 달성하기 때문이다. 대조군 siRNA(카탈로그 번호: sc-37007) 및 CD96 siRNA(카탈로그 번호: sc-45460)를 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)으로부터 구입하였다. 10% FBS, 2 mM L-글루타민을 함유하는 무항생제 RPMI-1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다. 마우스 항인간 CD96-APC(카탈로그 번호: 338409)를 염색을 위해 바이오레전드(Biolegend)로부터 수득하였다
20 μM의 siRNA 스톡 용액을 제조하였다. 동결건조된 siRNA 이합체를 33 μl의 RNAse가 없는 물(siRNA 희석 완충제: sc-29527)에 재현탁시키고, FITC-대조군/대조군-siRNA를 표적 유전자 siRNA(siRNA CD96)에 대해 165μl의 RNAse가 없는 물에 재현탁시켰다. 튜브를 90℃에서 1분 동안 가열한 후, 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 그리고 나서, siRNA 스톡을 필요할 때까지 -20℃에 보관하였다.
세포가 로그 성장 단계에 있어야 하므로, KHYG-1 세포를 뉴클레오펙션 1 내지 2일 전에 계대배양하였다. 뉴클레오펙터 용액을 실온으로 가온하였다(샘플당 100 ul). 혈청 및 보충제를 함유하는 배양 배지의 분취물을 50 ml 튜브에서 37℃에서 예비 가온시켰다. 혈청 및 보충제를 함유하는 1.5 ml의 배양 배지를 첨가하여 6-웰 플레이트를 제조하였다. 플레이트를 가습된 37℃/5% CO2 배양기에서 예비 배양하였다. 100 μl 뉴클레오펙션 용액 중의 2x106 세포를 4 μl 20 μM siRNA 용액(1.5 μg siRNA)과 부드럽게 혼합하였다. 혼합하는 동안 기포를 피하였다. 혼합물을 Amaxa 인증 큐벳으로 옮기고, 뉴클레오펙터 큐벳 홀더에 넣고, 프로그램 U-001을 선택하였다. 프로그램을 끝내고, 큐벳 내의 샘플을 즉시 제거하였다. 그리고 나서, 500 μl 예비 평형화된 배양 배지를 각 큐벳에 첨가하였다. 그리고 나서, 웰당 2 ml의 최종 부피를 확립하기 위해, 각 큐벳 내의 샘플을 제조된 6-웰 플레이트의 상응하는 웰로 조심스럽게 옮겼다. 그리고 나서, 형질감염 분석을 수행할 때까지 세포를 가습된 37℃/5% CO2 배양기에서 배양하였다. CD96 발현 수준을 측정하기 위해, 전기천공 후 16-24시간에 유세포 분석을 수행하였다. 이 전기천공 프로토콜을 여러 번 수행하였다. 도 8a 및 8b는 이 프로토콜이 대조군 siRNA 802로 형질감염된 KHYG-1 세포(8a에서 2409; 8b에서 3002의 평균 형광 강도)와 비교하여 신뢰할만한 CD96 넉다운 801(8a에서 1107; 8b에서 810의 평균 형광 강도)을 초래하였음을 보여준다. 아이소타입이 800 802로 표시되어 있다(8a에서 90; 8b에서 76의 평균 형광 강도).
실시예
9 - CD96
넉다운을
갖는
NK
세포의 향상된 세포독성
CD96 넉다운을 갖거나 갖지 않는 KHYG-1 세포를 상이한 효과기:표적(E:T) 비율에서 K562 세포와 공동 배양하였다. 세포독성을 퍼킨엘머(PerkinElmer)의 DELFIA EuTDA 세포독성 키트(카탈로그 번호: AD0116)를 사용하여 공동 배양 4시간 후에 측정하였다. 표적 세포 K562를 10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 96-웰 V-바닥 플레이트(카탈로그 번호: 83.3926)를 사스테드(SARSTEDT)로부터 구입하였다. 에펜도르프 원심분리기 5810R(플레이트 로터를 가짐)을 사용하여 플레이트를 회전시켰다. VARIOSKAN FLASH(ScanIt 소프트웨어 2.4.3을 가짐)를 사용하여 용해된 K562 세포에 의해 생성된 형광 신호를 측정하였다. K562 세포를 배양 배지로 세척하고, 배양 배지로 세포의 수를 1x106 세포/mL로 조정하였다. 2-4 mL의 세포를 5 μl의 BATDA 시약에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 세포 내에서, 에스테르 결합은 가수분해되어 친수성 리간드를 형성하며, 이는 더 이상 막을 통과하지 않는다. 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 로딩된 K562 세포를 세척하였다. 이것을 1 mM 프로베네시드(Probenecid, Sigma P8761)를 함유하는 배지로 3-5회 반복하였다. 최종 세척 후, 세포 펠렛을 배양 배지에 재현탁시키고, 약 5 x104 세포/mL로 조정하였다. 웰을 배경, 자발적 방출 및 최대 방출의 검출을 위해 설정하였다. 100 μL의 로딩된 표적 세포(5,000개 세포)를 V-바닥 플레이트의 웰로 옮기고, 1:1 내지 20:1 범위의 효과기 대 표적 비율을 생성하기 위해 100 μL의 효과기 세포(KHYG-1 세포)를 다양한 세포 농도로 첨가하였다. 플레이트를 100xg에서 1분 동안 원심분리하고, 37℃에서 가습된 5% CO2 분위기에서 4시간 동안 배양하였다. 최대 방출 웰을 위해, 배지를 채취하기 15분 전에 각 웰에 10 μL의 용해 완충제를 첨가하였다. 플레이트를 500xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 20 μL의 상층액을 평바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 200 μL의 예비 가온된 유로퓸(Europium) 용액을 첨가하였다. 이것을 플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 15분 동안 배양하였다. K562 세포는 KHYG-1 세포에 의해 용해되기 때문에, 이들은 배지 내로 리간드를 방출한다. 그리고 나서, 이 리간드는 유로퓸 용액과 반응하여 용해된 세포의 양과 직접 상관관계가 있는 형광 킬레이트를 형성한다. 그리고 나서, 형광을 VARIOSKAN FLASH를 사용하여 시간 분해 형광측정기에서 측정하였다. 특이적 방출을 하기 식을 사용하여 계산하였다: % 특이적 방출 = 실험 방출 - 자발적 방출 / 최대 방출 - 자발적 방출. 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 6.04 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 쌍별 t 검정을 사용하여 siRNA CD96 넉다운 KHYG-1 세포 및 대조군(n=3) 사이의 차이를 비교하였다. 특이적 방출은 CD96 넉다운 KHYG-1 세포를 함유하는 공배양물에서 유의하게 증가되는 것으로 나타났다. 이것은 모든 E:T 비율에서 그러하였다(도 9 참고). 형광은 세포 용해와 직접 상관관계가 있기 때문에, KHYG-1 세포에서 CD96 발현을 넉다운시키는 것은 K562 암 표적 세포를 사멸시키는 능력의 증가를 초래하였음이 확인되었다.
실시예
10 - CD328(
Siglec
-7)
넉다운을
갖는
NK
세포의 향상된 세포독성
NK
-92 세포에서 CD328의
SiRNA
매개
넉다운
물질, 시약
및 기기
대조군 siRNA(카탈로그 번호: sc-37007) 및 CD328 siRNA(카탈로그 번호: sc-106757)를 산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터 구입하였다. 뉴클레오펙터™ 장치(뉴클레오펙터 II, Lonza)를 사용하여 NK-92 세포에서 높은 세포 생존력(>75%)으로 최대 90%의 형질감염 효율을 달성하기 위해, 론자(Lonza)의 뉴클레오펙터™ 키트 T를 사용하였다. 10% FBS, 2 mM L-글루타민을 함유하고 항생제가 없는 RPMI-1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다. 마우스 항인간 CD328-APC(카탈로그 번호: 339206)를 바이오레전드로부터 구입하였다.
프로토콜
10 μM의 siRNA 스톡 용액을 제조하는 것. 동결건조된 siRNA 이합체를 66 μl의 RNAse가 없는 물(siRNA 희석 완충제: sc-29527)에 재현탁시키고, FITC-대조군/대조군-siRNA를 표적 유전자 siRNA(siRNA CD328)에 대해 330 μl의 RNAse가 없는 물에 재현탁시킨다. 튜브를 1분 동안 90℃로 가열시킨다. 37℃에서 60분 동안 배양한다. 바로 사용하지 않으면, siRNA 스톡을 -20℃에 보관한다. 하나의 뉴클레오펙션 샘플은 함유한다(100 μl 표준 큐벳의 경우). 세포 수: 2x106 세포. siRNA: 4 μl의 10 μM 스톡. 뉴클레오펙터 용액: 100 μl.
뉴클레오펙션
필요한 수의 세포를 배양한다. (뉴클레오펙션 1일 또는 2일 전에 계대배양하고, 세포는 로그 성장 단계에 있어야 함). 각 샘플에 대해 siRNA를 제조한다. 뉴클레오펙터 용액을 실온으로 예비 가온시킨다(샘플당 100 μl). 혈청 및 보충제를 함유하는 배양 배지의 분취물을 50 ml 튜브에서 37℃에서 예비 가온시킨다. 혈청 및 보충제를 함유하는 1.5 ml의 배양 배지로 채워 6-웰 플레이트를 제조하고, 가습된 37℃/5% CO2 배양기에서 플레이트를 예비 배양한다. 세포 배양물의 분취물을 취하고, 세포를 계수하여 세포 밀도를 결정한다. 필요한 수의 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 잔류 배지가 세포 펠렛을 덮지 않도록 상층액을 완전히 버린다. 세포 펠렛을 실온 뉴클레오펙터 용액에 2x106 세포/100 μl의 최종 농도로 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 뉴클레오펙터 용액에서 15-20분 넘게 보관하는 것을 피하는데, 이것이 세포 생존력 및 유전자 전달 효율을 감소시키기 때문이다. 100 μl의 세포 현탁액을 siRNA와 혼합한다. 샘플을 Amaxa 인증 큐벳으로 옮긴다. 큐벳의 바닥을 샘플로 덮고, 피펫팅 동안 기포를 피한다. 파란색 마개로 큐벳을 닫는다. 적절한 뉴클레오펙터 프로그램(NK-92 세포의 경우 A-024)을 선택한다. 큐벳을 큐벳 홀더(뉴클레오펙터 II: 캐러셀(carousel)을 최종 위치로 시계 방향으로 회전시킴)에 삽입하고, "x" 버튼을 눌러 프로그램을 시작한다. 세포에 대한 손상을 피하기 위해, 프로그램이 끝난 즉시(디스플레이가 "OK"를 표시함) 큐벳으로부터 샘플을 꺼낸다. 500 μl의 예비 가온된 배양 배지를 큐벳에 넣고, 샘플을 제조된 6-웰 플레이트로 옮긴다. 세포를 가습된 37℃/5% CO2 배양기에서 배양한다. 16-24시간 후 유세포 분석 및 세포독성 분석을 수행한다.
결과
본 발명자들은 상기 프로토콜을 따랐고, NK-92 세포에서 CD328 발현 수준의 유세포 분석을 수행하였다. 하나의 대표적인 실험의 결과가 도 10에 나타나 있으며, 이는 성공적인 넉다운을 확인시켜 주었다(대조군 siRNA 1001의 경우 3048; CD328 siRNA 1002의 경우 679의 평균 형광 강도).
CD328을
넉다운시키는
것은 세포독성을
향상시킨다
물질, 시약
및 기기
형광 향상 리간드에 기초한 DELFIA EuTDA 세포독성 키트(카탈로그 번호: AD0116)를 퍼킨엘머로부터 구입하였다. 표적 세포 K562를 10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 96-웰 V-바닥 플레이트(카탈로그 번호: 83.3926)를 사스테드로부터 구입하였다. 에펜도르프 원심분리기 5810R(플레이트 로터를 가짐)을 사용하여 플레이트를 회전시켰다. VARIOSKAN FLASH(ScanIt 소프트웨어 2.4.3을 가짐)를 사용하여 용해된 K562 세포에 의해 생성된 형광 신호를 측정하였다.
프로토콜
표적 K562 세포를 형광 향상 리간드 DELFIA BATDA 시약과 함께 로딩한다. K562 세포를 배지로 세척하고, 배양 배지로 세포의 수를 1x106 세포/mL로 조정한다. 2-4 mL의 세포를 5 μl의 BATDA 시약에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 배양한다. 1500 rpm에서 5분 동안 회전시켜 로딩된 K562 세포를 1 mM 프로베네시드(Sigma P8761)를 함유하는 배지로 3-5회 세척한다. 최종 세척 후, 세포 펠렛을 배양 배지에 재현탁시키고, 약 5 x104 세포/mL로 조정한다.
세포독성 분석
배경, 자발적 방출 및 최대 방출의 검출을 위해 웰을 설정한다. 100 μL의 로딩된 표적 세포(5,000개 세포)를 V-바닥 플레이트에 피펫팅한다. 다양한 세포 농도의 100 μL의 효과기 세포(NK-92)를 첨가한다. 효과기 대 표적 비율은 1:1 내지 20:1의 범위이다. 플레이트를 100xg의 RCF에서 1분 동안 회전시킨다. 37℃에서 가습된 5% CO2 분위기에서 2시간 동안 배양한다. 최대 방출 웰을 위해, 배지를 채취하기 15분 전에 각 웰에 10 μL의 용해 완충제를 첨가한다. 플레이트를 500xg에서 5분 동안 회전시킨다. 20 μL의 상층액을 평바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 200 μL의 예비 가온된 유로퓸 용액을 첨가하고, 플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 15분 동안 배양한다. VARIOSKAN FLASH를 사용하여 시간 분해 형광측정기에서 형광을 측정한다. 특이적 방출을 하기 식을 사용하여 계산한다: % 특이적 방출 = 실험 방출 - 자발적 방출 / 최대 방출 - 자발적 방출
결과
본 발명자들은 상기를 따라 CD328 넉다운의 세포독성에 대한 효과를 결정하였다. 하나의 대표적인 실험의 결과가 도 11에 나타나 있다. 관찰된 바와 같이, 표적 세포에 대한 세포독성은 CD328 넉다운을 갖는 세포에서 증가하였다.
실시예
11 - 체크포인트 억제 수용체의
넉다운
/
넉아웃에
의한 혈액암 요법을 위한 프로토콜
상기 실시예에서 입증된 바와 같이, 체크포인트 억제 수용체 기능은 다양한 방식으로 넉다운 또는 넉아웃될 수 있다. 하기 프로토콜은 혈액암 환자를 치료하는데 사용하기 위해 개발되었다: 본 발명으로 적합하게 치료된 암을 가진 환자의 진단 후, 변형된 NK 세포의 분취물은 환자에게 투여하기 전에 해동되고 배양될 수 있다. 대안적으로, 일시적 돌연변이는 상기 기재된 바와 같이 1일 또는 2일 내에, 예컨대 siRNA를 사용하여 제조될 수 있다. 맥스사이트 유동 전기천공 플랫폼은 병원에서 빠른 대규모 형질감염을 달성하기 위한 적합한 용액을 제공한다. 특정 체크포인트 억제 수용체의 제거는 다른 것보다 더 유익할 수 있다. 이것은 환자 및 암에 좌우될 가능성이 높다. 이러한 이유 때문에, 암은 선택적으로 생검되고, 암세포는 생체외 배양에서 성장된다. 따라서, 상이한 체크포인트 억제 수용체 변형을 갖는 다양한 NK 세포가 특정 암에 대한 세포독성에 대해 시험될 수 있다. 이 단계는 요법을 위한 가장 적절한 NK 세포 또는 이의 유도체를 선택하는데 사용될 수 있다. 성공적인 변형 후, 세포는 환자 내로 정맥내 및/또는 종양내 주사를 위해 적합한 담체(예컨대, 식염수)에 재현탁된다.
실시예
12 - TRAIL/TRAIL
변이체의
KHYG
-1 넉인
KHYG-1 세포를 형질감염 후 생존력 및 암세포를 사멸시키는 능력을 평가하기 위해, TRAIL 및 TRAIL 변이체 모두로 형질감염시켰다. 사용된 TRAIL 변이체는 WO 제2009/077857호에 기재된 것이다. 그것은 D269H/E195R 돌연변이를 함유하는 야생형 TRAIL 유전자에 의해 코딩된다. 이 돌연변이는 디코이 수용체 모두(DcR1 및 DcR2)에 대한 친화도를 감소시키면서, DR5에 대한 TRAIL 변이체의 친화도를 유의하게 증가시킨다.
기준선(baseline) TRAIL 발현
KHYG-1 세포에서의 기준선 TRAIL(CD253) 발현을 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. 마우스 항인간 CD253-APC(바이오레전드 카탈로그 번호: 308210) 및 아이소타입 대조군(바이오레전드 카탈로그 번호: 400122)을 사용하여 세포 샘플을 염색하고, BD FACS Canto II 유세포 분석기 상에서 분석하였다. KHYG-1 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린(100 U/mL)/스트렙토마이신(100 mg/mL) 및 IL-2(10 ng/mL)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 0.5-1.0 x 106 세포/시험을 원심분리(1500 rpm x 5분)에 의해 수집하고, 상층액을 흡인하였다. 세포(단일 세포 현탁액)를 4 mL 빙냉 FACS 완충제(PBS, 0.5-1% BSA, 0.1% NaN3 나트륨 아지드)로 세척하였다. 세포를 100 μL 빙냉 FACS 완충제에 재현탁시키고, 5 uL 항체를 각 튜브에 첨가하고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 3회 세척하였다. 그리고 나서, 세포를 500 μL 빙냉 FACS 완충제에 재현탁시키고, 얼음 위에서 암실에서 일시적으로 유지시켰다. 이후, 세포를 유세포 분석기(BD FACS Canto II) 상에서 분석하고, 생성된 데이터를 FlowJo 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, FACS 분석은 KHYG-1 세포 표면 상에서 TRAIL의 약한 기준선 발현을 나타내었다.
전기천공에 의한 TRAIL/TRAIL
변이체
넉인
야생형 TRAIL mRNA 및 TRAIL 변이체(D269H/195R) mRNA를 트리링크 바이오테크놀로지스(TriLink BioTechnologies)에 의해 합성하고, 분취하고, -80℃에서 보관하였다. 마우스 항인간 CD253-APC(바이오레전드 카탈로그 번호: 308210) 및 아이소타입 대조군(바이오레전드 카탈로그 번호: 400122), 및 마우스 항인간 CD107a-PE(이바오이사이언스(eBioscience) 카탈로그 번호: 12-1079-42) 및 아이소타입 대조군(이바이오사이언스카탈로그 번호: 12-4714) 항체를 사용하여 세포 샘플을 염색하고, BD FACS Canto II 유세포 분석기 상에서 분석하였다. DNA 염료 SYTOX-그린(라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 카탈로그 번호: S7020; DMSO 중에서 5 mM 용액)을 사용하였다. 뉴클레오펙터™ 장치(뉴클레오펙터 II, Lonza)를 사용하여 KHYG-1 세포에서 높은 세포 생존력으로 최대 90%의 형질감염 효율을 달성하기 위해, 론자(Lonza)의 뉴클레오펙터™ 키트 T를 사용하였다. 10% FBS, L-글루타민(2 mM) 및 IL-2(10 ng/mL)를 함유하는 무항생제 RPMI 1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다.
KHYG-1 및 NK-92 세포를 뉴클레오펙션 1일 또는 2일 전에 계대배양시켰는데, 세포가 로그 성장 단계에 있어야 하기 때문이다. 뉴클레오펙터 용액을 50 mL 튜브에서 37℃에서 혈청 및 보충제를 함유하는 배양 배지의 분취물과 함께 실온(샘플당 100 μl)으로 예비 가온시켰다. 혈청 및 보충제를 함유하는 1.5 mL 배양 배지로 채워 6-웰 플레이트를 제조하고 가습된 37℃/5% CO2 배양기에서 예비 배양하였다. 세포 배양의 분취물을 제조하고, 세포를 계수하여 세포 밀도를 결정하였다. 필요한 수의 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 완전히 버렸다. 세포 펠렛을 2x106 세포/100 μl의 최종 농도로 실온 뉴클레오펙터 용액에 재현탁시켰다(최대 현탁 시간 = 20분). 100 μl 세포 현탁액을 10 μg mRNA(RNA < 10 μL의 부피)와 혼합하였다. 샘플을 Amaxa 인증 큐벳으로 옮겼다(샘플이 큐벳의 바닥을 덮게 하고 기포를 피함). 적절한 뉴클레오펙터 프로그램을 선택하였다(즉, KHYG-1 세포의 경우 U-001). 그리고 나서, 큐벳을 큐벳 홀더에 삽입하였다. 500 μl 예비 가온된 배양 배지를 큐벳에 첨가하였고, 세포에 대한 손상을 피하기 위해, 프로그램이 끝난 직후 샘플을 제조된 6-웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 가습된 37℃/5% CO2 배양기에서 배양하였다. 유세포 분석 및 세포독성 분석을 전기천공 후 12-16시간에 수행하였다. 유세포 분석법 염색을 상기와 같이 수행하였다. 도 13 및 14에서 볼 수 있는 바와 같이, TRAIL/TRAIL 변이체 및 CD107a(NK 활성화 마커)의 발현은 형질감염 후 증가하였고, 이는 KHYG-1 세포 내로의 TRAIL 유전자의 성공적인 넉인을 확인시켜 주었다.
도 15는 전기천공을 통한 형질감염 전후의 KHYG-1 세포 생존력의 증거를 제공한다. TRAIL/TRAIL 변이체를 이용한 세포의 형질감염 후 세포 생존력의 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않는다는 것을 볼 수 있으며, 이는 야생형 또는 변이체 TRAIL의 발현이 세포에 독성이 아니라는 것을 확인시켜 준다. 이 관찰은 TRAIL 변이체 유전자 넉인이 세포에 독성이라는 것을 시사하는 NK-92 세포에서의 상응하는 발견과 모순된다(데이터는 나타내지 않음). 그럼에도 불구하고, 이것은 NK-92 세포 표면 상에서 TRAIL 수용체 DR4 및 DR5의 상대적으로 높은 발현 수준에 의해 설명될 가능성이 높다(도 16 참고).
KHYG
-1 세포 세포독성에 대한 TRAIL/TRAIL
변이체의
효과
마우스 항인간 CD2-APC 항체(비디 파미노겐(BD Pharmingen) 카탈로그 번호: 560642)를 사용하였다. 아넥신 V-FITC 항체(이뮤노툴즈(ImmunoTools) 카탈로그 번호: 31490013)를 사용하였다. DNA 염료 SYTOX-그린(라이프 테크놀로지스 카탈로그 번호: S7020)을 사용하였다. 24-웰 세포 배양 플레이트(사스테드 AG 카탈로그 번호: 83.3922)를 사용하였다. 골수성 백혈병 세포주 K562, 다발성 골수종 세포주 RPMI8226 및 MM1.S를 표적 세포로서 사용하였다. K562, RPMI8226, MM1.S를 10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 페니실린(100 U/mL)/스트렙토마이신(100 mg/mL)을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 상기 설명된 바와 같이, KHYG-1 세포를 TRAIL/TRAIL 변이체로 형질감염시켰다. 표적 세포를 세척하고, 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리를 통해 펠렛화하였다. 형질감염된 KHYG-1 세포를 0.5x106/mL로 희석시켰다. 그리고 나서, 1:1의 효과기:표적(E:T) 비율을 생성하기 위해, 표적 세포 밀도를 예비 가온된 RPMI 1640 배지에서 조정하였다. 그리고 나서, 0.5 mL KHYG-1 세포 및 0.5 mL 표적 세포를 24-웰 배양 플레이트에서 혼합하고, 가습된 37℃/5% CO2 배양기에 12시간 동안 두었다. 그리고 나서, 유세포 분석을 사용하여 KHYG-1 세포 세포독성을 분석하고; 공동 배양된 세포(상이한 시점에)를 세척한 다음 아넥신 V 결합 완충제를 사용하여 CD2-APC 항체(5 μL/시험), 아넥신 V-FITC(5 μL/시험) 및 SYTOX-그린(5 μL/시험)으로 염색하였다. FlowJo 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 데이터를 더 분석하였다. 각각 KHYG-1 세포 및 표적 세포 집단을 나타내는 CD2-양성 및 CD2-음성 게이트를 설정하였다. 그리고 나서, CD2-음성 집단 내의 아넥신 V-FITC 및 SYTOX-그린 양성 세포를 TRAIL 유도된 세포자멸사에 대해 분석하였다.
도 17, 18 및 19는 3개의 표적 세포주의 세포자멸사에 대한 TRAIL 또는 TRAIL 변이체를 발현하는 KHYG-1 세포 모두의 효과를 보여준다: K562(도 17), RPMI8226(도 18) 및 MM1.S(도 19). KHYG-1 세포 상에서의 TRAIL 발현이 정상 KHYG-1 세포(TRAIL로 형질감염되지 않음)와 비교하여 세포자멸사 수준을 증가시켰음이 모든 표적 세포 집단에서 명백하다. 더욱이, KHYG-1 세포에서의 TRAIL 변이체 발현은 야생형 TRAIL로 형질감염된 KHYG-1 세포와 비교하여 모든 표적 세포주에서 세포자멸사를 더 증가시켰다.
TRAIL 변이체를 발현하는 본 발명의 세포는, 사멸 수용체 DR5에 대해 더 높은 친화도를 나타내기 때문에 암 요법에서 유의한 이점을 제공한다. 이러한 본 발명의 세포가 투여되는 경우, 암세포는 특정 경로를 통해 사멸을 피하는 방어 전략을 발달시키지 못한다. 따라서 암은 TRAIL 디코이 수용체를 상향조절함으로써 TRAIL 유도된 세포 사멸을 효과적으로 피할 수 없는데, 본 발명의 세포가 변형되어 이들 상황에서 세포독성을 유지하기 때문이다.
실시예
13 -
넉인된
TRAIL
변이체를
갖는
NK
세포를 사용한 혈액암 요법을 위한 프로토콜
KHYG-1 세포를 실시예 6에 전술한 바와 같이 TRAIL 변이체로 형질감염시켰다. 하기 프로토콜은 혈액암 환자를 치료하는데 사용하기 위해 개발되었다:
본 발명으로 적합하게 치료된 암을 가진 환자의 진단 후, DR5 유도제, 예컨대 보르테조밉은 변형된 NK 세포의 투여 전에 투여되며, 따라서 암에서 DR5의 발현을 상향조절하기 위해 저용량으로 사용되어, 변형된 NK 세포 요법을 더 효과적으로 만든다. 그리고 나서, 변형된 NK 세포의 분취물을 해동시키고, 배양하고, 환자에게 투여한다. 요법에서 사용된 NK 세포에 의해 발현된 TRAIL 변이체는 야생형 TRAIL보다 디코이 수용체에 대해 더 낮은 친화도를 가지므로, 암세포 표면에서 사멸 수용체의 결합이 증가하고, 따라서 결과적으로 더 많은 암세포 세포자멸사가 있다. 상기 프로토콜을 구현하기 전에, 또 다른 옵션은 암을 생검하고 생체외에서 암세포를 배양하는 것이다. 이 단계는 DR5 유도제가 주어진 환자에게 적절한지 결정하는 것을 돕기 위해 특히 높은 수준의 디코이 수용체, 및/또는 낮은 수준의 사멸 수용체를 발현하는 암을 확인하는데 사용될 수 있다. 주어진 암이 예컨대 DR5의 발현을 감소시키기 위해 적응될 수 있기 때문에, 이 단계는 또한 상기 프로토콜을 이용하여 요법 동안 수행될 수 있으며, 따라서 요법을 통해 도중에 DR5 유도제로 치료하는 것이 적합해질 수 있다.
실시예
14 -
NK
세포 TRAIL 매개 세포독성에 대한
프로테아좀
억제의 효과
보르테조밉(Bt)은 다발성 골수종(MM)의 치료에 유용한 프로테아좀 억제제(화학요법 유사 약물)이다. 보르테조밉은 MM 세포를 포함하는 몇 가지 상이한 유형의 암세포에서 DR5 발현을 상향조절하는 것으로 알려져 있다. KHYG-1 세포를 실시예 12에 전술한 바와 같이 TRAIL 변이체로 형질감염시킨 다음, 보르테조밉에의 노출로 또는 노출 없이 MM 세포를 표적화하는데 사용하였다.
보르테조밉
유도된 DR5 발현
보르테조밉을 밀레니움 파마슈티칼스(Millennium Pharmaceuticals)로부터 구입하였다. 마우스 항인간 DR5-AF647(카탈로그 번호: 565498)을 비디 파미노겐(BD Pharmingen)으로부터 구입하였다. 염색된 세포 샘플을 BD FACS Canto II 상에서 분석하였다. 프로토콜은 하기를 포함하였다: (1) MM 세포주 RPMI8226 및 MM1.S를 37℃에서 5% CO2 분위기에서 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 24 mM 중탄산 나트륨, 0.01%의 항생제 및 10% 우태아 혈청(Sigma, St Louis, MO, USA)이 보충된 RPMI1640 배지(Sigma, St Louis, MO, USA)에서 성장시켰다. (2) MM 세포를 1x106/mL, 2 mL/웰로 6-웰 플레이트에 시딩하였다. (3) 그리고 나서, MM 세포를 24시간 동안 상이한 용량의 보르테조밉으로 처리하였다. (4) 그리고 나서, 보르테조밉 처리된/처리되지 않은 MM 세포에서의 DR5 발현을 유세포 분석법에 의해 분석하였다(도 20). 도 20에 나타낸 바와 같이, 저용량 보르테조밉 처리는 MM 세포주 및 RPMI 8226 세포(상부) 모두에서 10 nm 보르테조밉으로 273의 MFI로부터 679로; MM1.S 세포(하부)에서 2.5 nm의 보르테조밉으로 214의 MFI로부터 662로 DR5 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. DR5 상향조절은 세포자멸사의 작은 유도와 관련되었다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, DR5 발현은 대부분의 MM 세포를 사멸시키는 높은 독성으로 인해 고용량의 보르테조밉에 의해 상향조절될 수 없는 것으로 나타났다.
암세포의
보르테조밉
유도된
감작
KHYG-1 세포를 실시예 12에 전술한 바와 같이 TRAIL 변이체(TRAIL D269H/E195R)로 형질감염시켰다. 프로토콜은 하기 단계를 포함하였다: (1) 보르테조밉 처리된/처리되지 않은 MM1.S 세포를 표적 세포로서 사용하였다. MM1.S 세포를 2.5 nM의 보르테조밉(우측 컬럼) 또는 비히클(좌측 컬럼)로 24시간 동안 처리하였다. (2) 그리고 나서, TRAIL 변이체 mRNA의 전기 천공 6시간 후, KHYG-1 세포를 12-웰 플레이트에서 MM 세포와 함께 배양하였다. 세척 후, 세포 농도를 1x106/mL로 조정한 다음, KHYG-1 및 MM1.S 세포를 1:1 비율로 혼합하여 12시간 동안 배양하였다. (3) KHYG-1 세포의 세포독성의 유세포 분석을 수행하였다. 공동 배양된 세포를 수집하고, 세척한 다음, AnnexinV 결합 완충제를 사용하여 CD2-APC 항체(5 uL/시험), AnnexinV-FITC(5 uL/시험) 및 SYTOX-그린(5 uL/시험)으로 염색하였다. (4) FlowJo 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 데이터를 더 분석하였다. CD2-음성 집단은 MM1.S 세포를 나타낸다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 매우 양성이다. 마지막으로, CD2-음성 집단 내의 AnnexinV-FITC 및 SYTOX-그린 양성 세포를 분석하였다. 세포자멸사의 유세포 분석을 TRAIL 변이체로/없이 전기천공된 KHYG-1 세포와 공동 배양된 보르테조밉 전처리된/처리되지 않은 MM1.S 세포에서 수행하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 보르테조밉은 야생형 TRAIL을 발현하는 세포(41.8% 사멸 내지 51.4% 사멸)보다 훨씬 더 큰 정도로 TRAIL 변이체를 발현하는 KHYG-1 세포(47.9% 사멸 내지 70.5% 사멸)에 대한 MM 세포의 감작을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 데이터는 DR5 발현을 유도한 제제가 모델에서 암세포에 대한 세포독성을 증가시키는데 효과적이었으며, 따라서 본 발명의 암 요법을 향상시키는데 유용할 수 있음을 나타내었다.
실시예
15 - CAR
작제물의
생성
가변 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 각각 pcDNA3.3(Invitrogen) 기반 벡터 p33G1f 및 p33Kappa에 클로닝하였다. 이전에 기재된 바와 같이(Vink et al. 2014), 293fectin(Invitrogen)을 사용하여 HEK293F 세포에서 높은 친화도 CD38 항체(WO제2011154453호 및 WO제2006099875호에 기재됨)로부터의 중쇄(서열번호 1) 및 무작위 생식계열 경쇄 발현 벡터로부터의 경쇄를 개별적으로 동시 형질감염시킴으로써 모든 낮은 친화도 항체를 무혈청 조건하에 생성하였다. 무세포 상층액을 채취하고, 항체 농도를 옥텟(Octet) IgG 정량(Forte Bio)에 의해 결정하였다. 이 경쇄 교환은 다라투무맙과 비교하여 CD38에 대해 감소된 친화도를 갖는 항체(이 경우 scFv)를 초래한다.
옥텟 HTX 기기(ForteBio)에서 생물층 간섭법(biolayer interferometry)을 사용하여 친화도를 측정하고 순위를 매겼다. 항인간 IgG Fc 캡처 바이오센서(ForteBio)를 CD38에 대한 상이한 중쇄 및 경쇄 조합을 함유하는 인간 IgG 유형 1(hIgG1)과 함께 1,000초 동안 로딩하였다. 기준선(100초) 후, 샘플 희석제(ForteBio)에서 N-말단 His-태그된 CD38(His-CD38, 100 nM)의 세포외 도메인의 결합(1,000초) 및 해리(1,000초)를 결정하였다. 계산을 위해, 아미노산 서열에 기초한 His-CD38의 이론 분자량, 즉, 30.5 kDa을 사용하였다. 1,000 rpm 및 30℃에서 쉐이킹하면서 실험을 수행하였다. 1,000초의 결합 시간 및 250초의 해리 시간으로, 1:1 모델 및 로컬 전체 피트(local full fit)를 사용하여 데이터 분석 소프트웨어 v8.0(ForteBio)로 데이터를 분석하였다. IgG1-3003-028 WT가 로딩되고 샘플 희석제 단독과 함께 배양된 4개의 기준 바이오센서의 평균을 차감하여 데이터 추적(data trace)을 보정하였다. y축을 기준선의 마지막 5초에 정렬하고, 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 필터링뿐만 아니라 단계간 보정(interstep correction)을 적용하였다.
인간 CD38 특이적 항체에 대한 균질 결합 분석을 Tecan Evo 200 액체 처리기를 사용하여 용량 반응으로 1,536-웰 마이크로타이터 플레이트에서 수행하였다. 인간 CD38을 일시적으로 발현하는 CHO 세포, CHO wt 배경 대조군, 및 정제된 바이오티닐화된 히스태그된 인간 CD38로 코팅된 스트렙타비딘 비드에 대한 IgG1 항체의 결합을 2차 다클론 염소 IgG 항인간 IgG(Fc)-알렉사 플루오르 647 접합체(Jackson ImmunoResearch)로 검출하였다. 동시에, 정제된 바이오티닐화된 히스태그된 인간 CD38로 코팅된 스트렙타비딘 비드에 대한 IgG1 항체의 결합을 또한 1가 2차 염소 Fab 항인간 IgG(H+L)-DyLight 649 접합체(Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 평가하였다. IgG1 샘플을 표준화하고 프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지(GIBCO)에서 희석하였다. 2 mL의 희석된 샘플을 각각 200 ng/mL IgG 접합체 또는 300 ng/mL Fab 접합체로 2차 접합체를 함유하는 5 mL의 세포 또는 비드 현탁액에 첨가하였다. 세포 현탁액을 FMAT 완충제(PBS, 0.1% BSA, 및 0.02% 나트륨 아지드) + 0.075% Pluronic F-68에서 제조하였다. 비드 현탁액을 HBB(10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.5% BSA, 및 0.01% 나트륨 아지드 + 0.075% Pluronic F-68)에서 제조하였다. 암실에서 실온(RT)에서 8시간 배양 후, 형광 신호를 50-카운트 컷오프 값이 적용된 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 8200 세포 검출 시스템(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 기록하였다. 수득된 총 형광 강도 데이터를 ActivityBase 소프트웨어(IDBS)를 사용하여 처리하고 시각화하였다.
선택된 가변 경쇄 B1(서열번호: 23) 및 가변 중쇄(서열번호: 1)를 상동성 암(arm)을 함유하는 프라이머(서열번호: 8-22)를 갖는 PCR을 사용하여 증폭시키고, 및 깁슨 조립(Gibson assembly, NEB)을 사용하여 G4S 링커와 연결된 두 사슬을 조합하였다. 생성된 scFv를 SFG 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝한 다음, 문헌[Zhao et al.(2015)]에서 T 세포에 대해 기재된 바와 같이, CD8a 막관통 도메인 및 하기 언급된 공자극 도메인 중 하나를 클로닝하였다. CAR 작제물을 2A 서열에 의해 절단된 NGFR 또는 dsRed 서열에 연결하였다(Kim et al. 2011).
실시예
16 -
레트로바이러스 입자의 생성
피닉스-암포(Phoenix-Ampho) 패키징 세포를 CAR 작제물, 개그-폴(gag-pol)(pHIT60), 및 외피(envelope)(pCOLT-GALV) 벡터(Roche)로 형질감염시켰다. 형질감염 2 및 3일 후, 레트로바이러스 입자를 함유하는 무세포 상층액을 수집하고, 형질도입에 직접 사용하였다.
KHYG-1 세포를 레트로넥틴(Takara) 코팅된 플레이트 상에서 원심분리 접종(spinoculation)을 사용하여 레트로바이러스로 형질도입시켰다. 제2 형질도입을 16시간 후에 수행하였다. 72시간 형질도입 후 72시간에, CD38 발현을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 형질도입된 KHYG-1 세포를 배양하였다. 1주 후, CAR-형질도입된 NK 세포를 조사된(5 Gy) UM9 세포(효과기 대 표적 [E:T] 비율 1:3)로 자극시키거나 기능적으로 시험하였다.
실시예
17 - MM 환자 및 건강한 개체로부터의 일차 세포
5%-40% 악성 혈장 세포를 함유하는 BM-단핵 세포(MNC)를 피콜-파크(Ficoll-Paque) 밀도 원심분리를 통해 MM 환자의 BM 흡인액으로부터 단리하였고, 바로 사용하거나 사용할 때까지 액체 질소에 동결보관하였다. PBMC/MNC를 피콜-파크 밀도 원심분리에 의해 건강한 혈액-은행 공여자의 버피 코트(Buffy coat)로부터 단리하였다. 모든 일차 샘플은 의료 윤리위원회의 고지에 입각한 동의 및 승인 후에 수득하였다.
실시예
18 - CD38-CAR 발현
NK
세포의 향상된 세포독성
CD38에 대한 낮은 친화도 키메라 항원 수용체(CD38-CAR)를 갖거나 갖지 않는 KHYG-1 세포를 상이한 효과기:표적(E:T) 비율로 UM9 세포와 공동 배양하였다. CD38-CAR KHYG-1 세포의 3개의 변이체를 시험하였고: BBz B1, 28z B1 및 28z BBL B1; 이들 변이체는 각각 공자극 도메인 41BB-CD3제타, CD28-CD3제타 및 CD28/4-1BB 플러스 리간드에 상응한다(41BB = 서열번호: 42; CD3제타 = 서열번호: 41; 및 CD28 = 서열번호: 43).
세포독성을 퍼킨엘머(PerkinElmer)의 DELFIA EuTDA 세포독성 키트(카탈로그 번호: AD0116)를 사용하여 공동 배양 4시간 후에 측정하였다. 표적 세포 UM9를 10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 96-웰 V-바닥 플레이트(카탈로그 번호: 83.3926)를 사스테드(SARSTEDT)로부터 구입하였다. 에펜도르프 원심분리기 5810R(플레이트 로터를 가짐)을 사용하여 플레이트를 회전시켰다. VARIOSKAN FLASH(ScanIt 소프트웨어 2.4.3을 가짐)를 사용하여 용해된 UM9 세포에 의해 생성된 형광 신호를 측정하였다. UM9 세포를 배양 배지로 세척하고, 배양 배지로 세포의 수를 1x106 세포/mL로 조정하였다. 2-4 mL의 세포를 5 μl의 BATDA 시약에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 세포 내에서, 에스테르 결합은 가수분해되어 친수성 리간드를 형성하며, 이는 더 이상 막을 통과하지 않는다. 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 로딩된 UM9 세포를 세척하였다. 이를 1 mM 프로베네시드(Probenecid, Sigma P8761)를 함유하는 배지로 3-5회 반복하였다. 최종 세척 후, 세포 펠렛을 배양 배지에 재현탁시키고, 약 5 x104 세포/mL로 조정하였다. 웰을 배경, 자발적 방출 및 최대 방출의 검출을 위해 설정하였다. 100 μL의 로딩된 표적 세포(5,000개 세포)를 V-바닥 플레이트의 웰로 옮기고, 0.5:1 내지 2:1 범위의 E:T 비율을 생성하기 위해 100 μL의 효과기 세포(KHYG-1 세포)를 다양한 세포 농도로 첨가하였다. 플레이트를 100xg에서 1분 동안 원심분리하고, 37℃에서 가습된 5% CO2 분위기에서 4시간 동안 배양하였다. 최대 방출 웰을 위해, 배지를 채취하기 15분 전에 각 웰에 10 μL의 용해 완충제를 첨가하였다. 플레이트를 500xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 20 μL의 상층액을 평바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 200 μL의 예비 가온된 유로퓸(Europium) 용액을 첨가하였다. 이것을 플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 15분 동안 배양하였다. UM9 세포는 KHYG-1 세포에 의해 용해되기 때문에, 이들은 배지 내로 리간드를 방출한다. 그리고 나서, 이 리간드는 유로퓸 용액과 반응하여 용해된 세포의 양과 직접 상관관계가 있는 형광 킬레이트를 형성한다. 그리고 나서, 형광을 VARIOSKAN FLASH를 사용하여 시간 분해 형광측정기에서 측정하였다. 특이적 방출을 하기 식을 사용하여 계산하였다: % 특이적 방출 = 실험 방출 - 자발적 방출 / 최대 방출 - 자발적 방출. 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 6.04 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 쌍별 t 검정을 사용하여 CD38-CAR KHYG-1 세포 및 대조군 사이의 차이를 비교하였다.
생물발광 이미지 기반 세포독성 분석
CD38 CAR NK 세포에 의한 Luc-GFP 형질도입된 인간 악성 세포주의 용해를 결정하기 위해, 형질도입 7-10일 후, 공(mock) 또는 CD38-CAR NK 세포의 연속 희석물을 악성 세포주와 공동 배양하였다. 생존하는 악성 세포에 의해 생성된 루시퍼라아제 신호를 125 mg/mL 딱정벌레 루시페린(Promega)의 첨가 후 15분 이내에 GloMax 96 마이크로-플레이트 발광분석기(Luminometer, Promega)로 16-24시간 후 결정하였다. % 용해 세포 = 1(처리된 웰에서의 생물발광 이미징[BLI] 신호/처리되지 않은 웰에서의 BLI 신호) 100%.
세포의 약 50%만이 성공적으로 형질도입되었음에도 불구하고, 특이적 방출은 CD38-CAR KHYG-1 세포를 함유하는 공동 배양물에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 이것은 0.5:1의 E:T 비율에서 41BB-CD3제타 공자극 도메인을 갖는 CD38-CAR KHYG-1 세포를 제외하고는 모든 E:T 비율에서 그러하였다(도 22 참고). 보다 강력한 세포독성 효과는 CD38-CAR을 갖는 효과기 세포의 더 높은 순도 샘플에서 예상될 것이다. 형광이 세포 용해와 직접 상관관계가 있기 때문에, KHYG-1 세포에서의 CD38-CAR 발현이 UM9 암 표적 세포를 사멸시키는 능력의 증가를 초래하였음이 확인되었다.
유세포
분석법 기반 세포독성 분석
형질도입 7-10일 후, sCD38-CAR-KHYG-1 세포의 연속 희석물을 바이올렛 추적자(Violet tracer, Thermo Fisher) 표지된 BM-MNC 또는 PBMC와 14시간 동안 배양하였다. 유동 계수 플루오로스피어(flow-count fluorospheres(Beckman 7547053))의 첨가 후, 세포를 채취하고, CD38 및/또는 CD138에 대해 염색하였다. 이후, 생존가능 세포를 유동 계수 균등화 측정을 통해 정량적으로 분석하였다. 백분율 세포 용해를 하기와 같이 그리고 분석된 표적 세포 집단이 처리되지 않은 샘플에서 >500 생존가능 세포를 함유한 경우에만 계산하였다: % 용해 세포 = 1(처리된 웰에서의 생존가능 표적 세포의 절대 수/처리되지 않은 웰에서의 생존가능 표적 세포의 절대 수) 100%.
두 가지 유형의 게이트를 사용하여 일차 MM 세포를 분석하였다: 매우 밝은 CD138+/CD38+ 세포 대 모든 CD138+/CD38 세포(도 25 및 26 참고). 서브세트 사이에 결과의 최소한의 유의미하지 않은 차이가 있었다. 일차 MM 세포는 CD38-CAR-KHYG-1 유도 세포 사멸에 민감하였다. 도 23 및 24에서 볼 수 있는 바와 같이, CD28-CD3 제타(28z B1)를 함유하는 CAR을 사용할 때 일차 세포의 가장 유의한 사멸이 관찰되었다. CD38+/CD138- 세포(정상 비악성 CD38 발현 세포)의 최소 사멸이 관찰되거나 사멸이 관찰되지 않았으며(도 25 및 26 참고) - 따라서, 세포는 CAR-NK 세포에 의해 표적화되는 것으로 보이지 않았다.
따라서, '낮은 친화도' CD38 CAR-NK 세포는 CD38을 발현하는 정상 비악성 세포에서 온-표적 오프-암 효과를 유발하지 않으면서 CD38 발현 암세포를 표적화하고 사멸시키는 능력을 갖는 것으로 나타났다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 나타나고 설명되었지만, 이러한 구현예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 많은 변형, 변경, 및 대체가 본 발명을 벗어나지 않으면서 당업자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
서열번호
SEQUENCE LISTING
<110> Onkimmune Limited
<120> ENGINEERED NATURAL KILLER CELLS AND USES THEREOF
<130> P40307WO
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Ile Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Pro Ser Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Val Phe Leu Gly Lys Val Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Glu Pro Gly Ala Arg Asp Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Lys Thr Asn His Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Pro Gly Asp Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro His Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Val Gly Trp Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
ctgctgctgc atgcggcgcg cccggacatc cagatgaccc agagc 45
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
ctgctgctgc atgcggcgcg cccggacatc cagctgaccc agagc 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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ctgctgctgc atgcggcgcg cccggccatc cagctgaccc agagc 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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ctgctgctgc atgcggcgcg cccggtgatc tggatgaccc agagc 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
ctgctgctgc atgcggcgcg cccggagatc gtgctgaccc agagc 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ctgctgctgc atgcggcgcg cccggagatc gtgatgaccc agagc 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
ctgctgctgc atgcggcgcg cccggacatc gtgatgaccc agagc 45
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
gcggcggagg atctggggga ggcggctctc aggtgcagct ggtgcagagc g 51
<210> 16
<211> 52
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gcggcggagg atctggggga ggcggctctg aagtgcagct ggtgcagtct gg 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
cagatcctcc gccgccagat ccgcctccgc ccttgatctc caccttggtg cc 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
cagatcctcc gccgccagat ccgcctccgc ccttgatttc cagcttggtg cc 52
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
cagatcctcc gccgccagat ccgcctccgc ccttgatgtc caccttggtg cc 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
cagatcctcc gccgccagat ccgcctccgc ccttgatttc cagccgggtg cc 52
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
ggggcgggtg taggcggccg cggagctggt gttgttgtgc tggacacggt gaccattgtg 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
ggggcgggtg taggcggccg cggagctggt gttgttgtgc tagacacggt cacgagggtg 60
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<210> 24
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gagtcacagg tggcatttgg cgg 23
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<211> 23
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<213> Homo sapiens
<400> 25
cgaatcgcag gtggtcgcac agg 23
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<213> Homo sapiens
<400> 26
cactcacctt tgcagaagac agg 23
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
ccttgtgccg ctgaaatcca agg 23
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala Asn Tyr
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Cys Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp
1 5 10 15
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Trp Ile
1 5 10
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Ile Ile Tyr Pro His Asp Ser Asp Ala Arg Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Cys Ala Arg His Val Gly Trp Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 41
<211> 164
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 42
<211> 255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 43
<211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
Claims (38)
- CD38 발현 암의 치료에 사용하기 위한 CD38에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해(NK) 세포.
- 제1항에 있어서, E-셀렉틴 리간드를 발현하는 것인 NK 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, HECA-452 항체에 결합하는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, KHYG-1 세포인 NK 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 다라투무맙보다 CD38에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR 발현 NK 세포는, CD38 발현 암세포에 대한 그의 친화도와 비교하여, CD38을 발현하는 정상(비악성) 세포에 대해 감소된 친화도를 갖는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 발현 암은 혈액암인 NK 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 발현 암은 다발성 골수종(MM)인 NK 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 1 또는 서열번호: 7을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 29, 30 및 31의 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 32, 33 및 34의 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 23 또는 서열번호: 28을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 35, 36 및 37의 경쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 38, 39 및 40의 경쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 41, 서열번호: 42 및 서열번호: 43으로부터 선택된 하나 이상의 공자극 도메인을 포함하는 것인 NK 세포.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 야생형 TRAIL에 비해 TRAIL 사멸 수용체에 대해 증가된 친화도를 갖는 TRAIL 변이체를 발현하도록 변형된 것인 NK 세포.
- CD38에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 KHYG-1 세포를 포함하는 조성물.
- 제17항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 32, 33 및 34의 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 조성물.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 35, 36 및 37의 경쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 조성물.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 야생형 TRAIL에 비해 TRAIL 사멸 수용체에 대해 증가된 친화도를 갖는 TRAIL 변이체를 발현하도록 변형된 것인 조성물.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 조성물.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물인 조성물.
- CD38에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해(NK) 세포를 환자에게 투여함으로써 CD38 발현 암을 치료하는 방법.
- 제23항에 있어서, NK 세포는 E-셀렉틴 리간드를 발현하는 것인 치료 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, NK 세포는 HECA-452 항체에 결합하는 것인 치료 방법.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 KHYG-1 세포인 치료 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 혈액암인 치료 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 발현 암은 다발성 골수종(MM)인 치료 방법.
- 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 1 또는 서열번호: 7을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 치료 방법.
- 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 29, 30 및 31의 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 치료 방법.
- 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 32, 33 및 34의 중쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 치료 방법.
- 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 23 또는 서열번호: 28을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 치료 방법.
- 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 35, 36 및 37의 경쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 치료 방법.
- 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 38, 39 및 40의 경쇄 CDR 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 것인 치료 방법.
- 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 CAR은 서열번호: 41, 서열번호:42 및 서열번호:43으로부터 선택된 하나 이상의 공자극 도메인을 포함하는 것인 치료 방법.
- 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포는 야생형 TRAIL에 비해 TRAIL 사멸 수용체에 대해 증가된 친화도를 갖는 TRAIL 변이체를 발현하도록 변형된 것인 치료 방법.
- CD38에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해(NK) 세포를 환자에게 투여함으로써 CD38 발현 다발성 골수종을 치료하는 방법으로서, CD38 CAR은 서열번호: 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 CD38 발현 다발성 골수종의 치료 방법.
- CD38에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해(NK) 세포를 환자에게 투여함으로써 CD38 발현 다발성 골수종을 치료하는 방법으로서, CD38 CAR은 서열번호: 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 CD38 발현 다발성 골수종의 치료 방법.
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