RU2777284C2

RU2777284C2 - Сконструированные клетки - естественные киллеры и их применение

Info

Publication number: RU2777284C2
Application number: RU2019121509A
Authority: RU
Inventors: Майкл Имон Питер О'ДВАЙЕР
Original assignee: Онк Терапьютикс Лимитед
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2022-08-02

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к NK-клетке, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (CAR) к CD38. Изобретение эффективно для лечения рака, экспрессирующего CD38. 11 з.п. ф-лы, 26 ил., 18 пр.

Description

Область техники изобретения

[0001] Настоящее изобретение относится к видам терапии, в которых используют модифицированные клетки естественные киллеры (NK-клетки) или линии NK-клеток для лечения рака. Методы лечения и строение клеток также формируют часть настоящего изобретения, в частности, в лечении раковых заболеваний крови.

Уровень техники изобретения

[0002] Клетки естественные киллеры (NK-клетки) представляют собой лимфоциты периферической крови, которые играют определенную роль во врожденном иммунитете. NK-клетки экспрессируют активирующие и ингибирующие рецепторы, которые отвечают за разграничение между здоровыми клетками и клетками, инфицированными вирусом, или трансформированными (раковыми) клетками. В отличие от Т-клеток, NK-клетки проявляют свою антиген-независимую цитотоксичную активность на клетках-мишенях. В результате NK-клетки не требуют примирования с антигеном и могут проявлять повышенную цитотоксичность при отсутствии определенного антигена.

[0003] За последнее время получены химерные антигенные рецепторы (CAR) для целенаправленного введения цитотоксичных Т-клеток в определенные типы клеток и тканей. Большинство CAR обладают доменом распознавания антигена, полученного из антитела, а также трансмембранной и внутриклеточной частью, полученной из иммунного сигнального белка, задействованного в сигнальной трансдукции Т-клетки, таким образом, позволяя активацию цитотоксичной функции Т-клетки при связывании с целевым антигеном, экспрессированным на популяции клеток-мишеней.

[0004] Более подробно, CAR представляют собой рецепторы рекомбинирующего антигена, которые вводят определенную специфичность антигена в иммунные эффекторные клетки, в случае настоящего изобретения, NK-клетки. CAR включает определенную полипептидную последовательность, полученную из экзогенного полинуклеотида, введенного в иммунную эффекторную клетку. Химерные антигенные рецепторы включают лидерную последовательность, целенаправленно воздействующий домен, трансмембранный домен и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов. Соответственно, целенаправленно воздействующий домен выводится из молекулы антитела и включает один или несколько гипервариабельных участков (CDR) от молекулы антитела, которые придают CAR специфичность антигена. Соответственно, целенаправленно воздействующий домен CAR для использования в выведенных NK-клетках по настоящему изобретению представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). scFv включает различные части легкой цепи иммуноглобулина и тяжелой цепи иммуноглобулина, которые разделены посредством гибкого полипептидного линкера. Гибкий полипептидный линкер позволяет обеспечить взаимосвязь тяжелых и легких цепей и восстановление антигенсвязывающего домена иммуноглобулина.

[0005] Существует необходимость альтернативных и предпочтительно улучшенных видов терапии раковых заболеваний с применением NK-CAR-клеток.

[0006] Цель настоящего изобретения обеспечение NK-CAR-клеток и линий NK-CAR-клеток, которые являются более эффективными при лечении раковых заболеваний, чем виды терапии, которые основываются только на NK-клетках. Конкретные варианты осуществления направлены на обеспечение методов лечения определенных раковых заболеваний, например, раковых заболеваний крови, избегая распространенные проблемы с видами терапии на основании клеток, таких как, самонаведение.

Сущность изобретения

[0007] В настоящем изобретении предлагаются клетки-естественные киллеры (NK), экспрессирующие химерные рецепторы антигена (CAR) для CD38 в целях использования в лечении видов рака с экспрессией CD38.

[0008] В настоящем изобретении дополнительно предлагаются композиции, включающие клетки KHYG-1, экспрессирующие химерные рецепторы антигена (CAR) для CD38.

[0009] В настоящем изобретении дополнительно предлагаются методы лечения раковых заболеваний с экспрессией CD38 посредством введения пациенту клеток-естественных киллеров (NK), экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR) для CD38.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] В настоящем изобретении предлагаются фармацевтические композиции, включающие NK-клетки: как первичные клетки, так и линии клеток, выведенные как минимум с одним химерным антигенным рецептором. Данные композиции являются полезными в лечении рака, как солидных опухолей, так и гематологических злокачественных опухолей (системы крови). Также описываются методы использования и получения. Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, включает первичные NK-клетки и линии NK-клеток, такие как KHYG-1, которые экспрессируют химерные антигенные рецепторы. Соответственно, CAR выявляют раковые специфические антигены. Например, раковый специфический антиген может включать CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. В конкретных вариантах осуществления химерный антигенный рецептор может быть специфическим в отношении CD38. Дополнительно NK-клетки включают как минимум одну другую модификацию, которая приводит к увеличению цитотоксичной активности NK-клетки. Соответственно, модификация включает удаление или понижение экспрессии ингибитора контрольных точек или повышения экспрессии TRAIL или варианта TRAIL с высокой аффинностью к рецептору TRAIL, например, DR4 или DR5. Предпочтительно, чтобы выведенные NK-клетки по настоящему изобретению проявляли повышенную экспрессию лигандов для Е-селектина и/или пониженную экспрессию рецепторов TRAIL, например, DR4, DR5 или обоих. Эти выведенные NK-клетки могут использоваться для лечения лиц, у которых обнаружили рак, посредством адоптивного переноса при внутривенном введении. Эти NK-клетки могут выводиться разнообразными способами, известными на существующем уровне техники, включая вирусную трансдукцию или электроимпульсное открытие клеточных пор полинуклеотидов/векторов, которые экспрессируют CAR и/или молекулы, вызывающие цитотоксичную активность NK-клеток, например, вариантный белок TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL), или векторы, которые обеспечивают делецию или понижение уровня экспрессии ингибирующих рецепторов посредством малой интерферирующей РНК, короткой шпилечной РНА или целенаправленно действующего механизма CRISPR/Cas9. NK-клетки могут быть первичными клетками или устойчивыми линиями NK-клеток, которые сохраняют некоторые функции и характеристики первичных NK-клеток. В конкретном варианте осуществления выведенная линия NK-клеток представлена клеткой KHYG-1 или клеткой наподобие KHYG-1, которая обладает отличительными свойствами от общей клетки типа NK-92, например, высоким уровнем экспрессии лиганда для Е-селектина и низкой экспрессией рецепторов TARIL DR4 и DR5. Адоптивный перенос может выполняться с аутологичными (изологичными) или гетерологичными (аллогенными) NK-клетками.

[0011] В настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, включающая выведенную клетку-естественного киллера; при этом выведенная клетка естественный киллер демонстрирует высокий уровень экспрессии лиганда для Е-селектина на клеточной поверхности; при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR). В определенном варианте осуществления под выведенной естественной клеткой-киллером понимается множество выведенных естественных клеток-киллеров, более 25% которых демонстрируют положительную реакцию на связь с антигеном посредством антитела НЕСА-452. В определенном варианте осуществления выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует низкий уровень экспрессии рецептора TRAIL на клеточной поверхности, при этом рецептор TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5). В определенном варианте осуществления выведенная клетка-естественный киллер включает первичную выведенную клетку-естественного киллера. В определенном варианте осуществления выведенная клетка-естественный киллер включает трансформированную линию клеток-естественных киллеров. В определенном варианте осуществления трансформированная линия выведенных естественных клеток-киллеров представляет собой линии клеток NK-92 или KHYG-1. В определенном варианте осуществления трансформированная линия выведенных естественных клеток-киллеров представляет собой линии клеток KHYG-1. В определенном варианте осуществления CAR специфические связывается с раковым антигеном. В определенном варианте осуществления раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. Соответственно, раковый специфический антиген включает антиген, специфический для рака крови. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 80% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, при этом CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. В определенном варианте осуществления CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает полипептид С08-альфа человека. Соответственно, CAR включает DAP10, DAP12, 2В4 (CD244) или полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека CD3-дзета. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. В дополнительном аспекте выведенная клетка-естественный киллер включает второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. В дополнительном аспекте выеденные клетки-естественные киллеры включают мутантный полипетид TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL), при этом мутантный полипептид TRAIL приводит к более интенсивной сигнализации или обладает увеличенной аффинностью связывания с лигандом TRAIL. Соответственно, лиганд TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5). Соответственно, мутантный полипептид TRAIL включает мутацию D269H/E195R TRAIL человека. Соответственно, мутантный полипептид TRAIL включает мутацию G131R/N199R/K201H TRAIL человека. Соответственно, CAR или мутантный полипептид TRAIL встраивается в геном выведенной клетки-естественного киллера. Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер дополнительно включает делецию или уменьшение активности ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT или TIM-3. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD96, CD152 или CD328. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD96. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD152. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD328. Соответственно, выполняется полная или частичная делеция ингибирующего рецептора контрольной точки из генома выведенной клетки-естественного киллера или его разрыв посредством вставки или делеции одного или нескольких нуклеотидов на хромосомном уровне. Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер включает малую интерферирующую РНК, которая выявляет ингибирующий рецептор контрольной точки. Соответственно, фармацевтическая композиция дополнительно включает в себя фармацевтически приемлемый носитель, стабилизирующий агент или эксципиент. Соответственно, фармацевтическая композиция формулируется для интраперитонеального введения. Соответственно, фармацевтическая композиция формулируется для интраперитонеального введения. Соответственно, фармацевтическая композиция предназначена для применения в лечении раковых заболеваний. Соответственно, к раковым заболеваниям относятся лейкемия, лимфома или миелома. Соответственно, к раковым заболеваниям относится множественная миелома.

[0012] В настоящем изобретении предлагается способ лечения рака, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, включающей в себя выведенную естественную клетку-киллер а; при этом выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует высокий уровень экспрессии лиганда для E-селектина на клеточной поверхности; при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR). В определенном варианте осуществления под выведенной естественной клеткой-киллером понимается множество выведенных естественных клеток-киллеров, более 25% которых демонстрируют положительную реакцию на связь с антигеном посредством антитела НЕСА-452. В определенном варианте осуществления выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует низкий уровень экспрессии рецептора TRAIL на клеточной поверхности, при этом рецептор TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5). В определенном варианте осуществления выведенная естественная клетка-киллер включает первичную выведенную естественную клетку-киллера. В определенном варианте осуществления выведенная естественная клетка-киллер включает трансформированную линию естественных клеток-киллеров. В определенном варианте осуществления трансформированная линия выведенных естественных клеток-киллеров представляет собой линии клеток NK-92 или KHYG-1. В определенном варианте осуществления трансформированная линия выведенных естественных клеток-киллеров представляет собой линии клеток KHYG-1. В определенном варианте осуществления CAR специфические связывается с раковым антигеном. В определенном варианте осуществления раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. Соответственно, раковый специфический антиген включает антиген, специфический для рака крови. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 80% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, при этом CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. В определенном варианте осуществления CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает полипептид CDS-альфа. Соответственно, CAR включает DAP10, DAP12, 2В4 (CD244) или полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека CD3-дзета. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. В дополнительном аспекте выведенная клетка-естественный киллер включает второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. В дополнительном аспекте выеденные клетки-естественные киллеры включают мутантный полипетид TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL), при этом мутантный полипептид TRAIL приводит к более интенсивной сигнализации или обладает увеличенной аффинностью связывания с лигандом TRAIL. Соответственно, лиганд TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5). Соответственно, мутантный полипептид TRAIL включает мутацию D269H/E195R TRAIL человека. Соответственно, мутантный полипептид TRAIL включает мутацию G131R/N199R/K201H TRAIL человека. Соответственно, CAR или мутантный полипептид TRAIL встраивается в геном выведенной естественной клетки-киллера. Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер дополнительно включает делецию или уменьшение активности ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT или TIM-3. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD96, CD152 или CD328. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD96. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD152. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD328. Соответственно, выполняется полная или частичная делеция ингибирующего рецептора контрольной точки из генома выведенной естественной клетки-киллера или его разрыв посредством вставки или делеции одного или нескольких нуклеотидов на хромосомном уровне. Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер включает малую интерферирующую РНК, которая выявляет ингибирующий рецептор контрольной точки. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки подвергается делеции из генома выведенных естественных клеток-киллеров. Соответственно, фармацевтическая композиция включает в себя фармацевтически приемлемый носитель, стабилизирующий агент или эксципиент. Соответственно, фармацевтическая композиция формулируется для внутривенного введения. Соответственно, фармацевтическая композиция формулируется для интраперитонеального введения. Соответственно, к раковым заболеваниям относятся лейкемия, лимфома или миелома. Соответственно, к раковым заболеваниям относится множественная миелома. Соответственно, фармацевтическая композиция вводится до, во время или после введения ингибитора протеасом. Соответственно, фармацевтическая композиция вводится до, во время или после курса лечения с периодическим приемом циклофосфамида в малых дозах.

[0013] В настоящем изобретении предлагается способ получения фармацевтической композиции, включающей в себя выведенную естественную клетку-киллера; при этом выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует высокий уровень экспрессии лиганда для Е-селектина на клеточной поверхности; при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR); при этом способ включает выдерживание естественной клетки-киллера с полинуклеотидом, кодирующим CAR. Соответственно, полинуклеотид включает вирусный вектор. Соответственно, вирусный вектор представляет собой лентивирус. Соответственно, вирусный вектор представляет собой ретровирус. Соответственно, полинуклеотид включает мРНК. Соответственно, полинуклеотид встраивается в геном выведенной естественной клетки-киллера. Соответственно, выеденная естественная клетка-киллер подвергается химической обработке для увеличения ее фукозилирования. Соответственно, под выведенной естественной клеткой-киллером понимается множество выведенных естественных клеток-киллеров, более 25% которых демонстрируют положительную реакцию на связь с антигеном посредством антитела НЕСА-452. Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует низкий уровень экспрессии рецептора TRAIL на клеточной поверхности, при этом рецептор TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5). Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер включает в себя первичную естественную клетку-киллера. Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер включает трансформированную линию первичной естественной клетки-киллера. Соответственно, трансформированная линия естественных клеток-киллеров представляет собой линии клеток NK-92 или KHYG-1. Соответственно, трансформированная линия естественных клеток-киллеров представляет собой линии клеток KHYG-1. Соответственно, CAR специфически связывается с раковым антигеном. Соответственно, раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. Соответственно, раковый специфический антиген включает антиген, специфический для рака крови. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 80% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, при этом CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает полипептид CD8-альфа человека. Соответственно, CAR включает DAP10, DAP12, 2В4 (CD244) или полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека CD3-дзета. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. В дополнительном аспекте выведенная естественная клетка-киллер включает второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. В дополнительном аспекте выеденные естественные клетки-киллеры включают мутантный полипетид TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL), при этом мутантный полипептид TRAIL приводит к более интенсивной сигнализации или обладает увеличенной аффинностью связывания с лигандом TRAIL. Соответственно, лиганд TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5). Соответственно, мутантный полипептид TRAIL включает мутацию D269H/E195R TRAIL человека. Соответственно, мутантный полипептид TRAIL включает мутацию G131R/N199R/K201H TRAIL человека. Соответственно, CAR или мутантный полинуклеотид TRAIL встраивается в геном выведенной естественной клетки-киллера. Соответственно, способ дополнительно включает выдерживание выведенной естественной клетки-киллера с полинуклеотидом, обеспечивающим делецию или снижение активности ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT или TIM-3. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD96, CD152 или CD328. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD96. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD152. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает CD328. Соответственно, выполняется полная или частичная делеция ингибирующего рецептора контрольной точки из генома выведенной естественной клетки-киллера или его разрыв посредством вставки или делеции одного или нескольких нуклеотидов на хромосомном уровне. Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер включает малую интерферирующую РНК, которая выявляет ингибирующий рецептор контрольной точки. Соответственно, способ дополнительно включает смешивание выведенных естественных клеток-киллеров с фармацевтически приемлемым носителем, стабилизирующим агентом или эксципиентом.

[0014] В определенном аспекте, описанном в настоящем документе, предлагается фармацевтическая композиция, включающая выведенную естественную клетку-киллера; при этом выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует высокий уровень протеина FUT6 или FUT7; при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR). Соответственно, выведенная естественная клетка- киллер включает экзогенный полинуклеотид, кодирующий протеин FUT6 или FUT7. Соответственно, CAR специфические связывается с раковым антигеном. Соответственно, раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF 17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. Соответственно, раковый специфический антиген включает антиген, специфический для рака крови. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 80% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, при этом CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает полипептид CD8-альфа человека. Соответственно, CAR включает внутриклеточный домен, полученный из DAP10, DAP12, 2В4 (CD244) или полипептида человека 4-1 ВВ. Соответственно, CAR включает внутриклеточный домен, полученный из полипептида человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает внутриклеточный домен, полученный из полипептида человека CD3-дзета. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. В дополнительном аспекте выведенная естественная клетка-киллер включает второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

[0015] В определенном аспекте, представленном в настоящем документе, приводится способ лечения рака, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, включающей в себя выведенную естественную клетку-киллера; при этом выведенная клетка-естественная киллер демонстрирует высокий уровень экспрессии протеина FUT6 или FUT7; при этом выведенная естественный клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR). Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер включает экзогенный полинуклеотид, кодирующий протеин FUT6 или FUT7. Соответственно, CAR специфические связывается с раковым антигеном. Соответственно, раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. Соответственно, раковый специфический антиген включает антиген, специфический для рака крови. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 80% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, при этом CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает полипептид CDS-альфа. Соответственно, CAR включает DAP10, DAP12, 2В4 (CD244) или полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека CD3-дзета. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. В дополнительном аспекте выведенная естественная клетка-киллер включает второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

[0016] Предпочтительно, чтобы NK-клетки с экспрессией CD38-CAR имели пониженную аффинность к нормальным (незлокачественным) клеткам с экспрессией CD38 в сравнении с их аффинностью к раковым клеткам с экспрессией CD38. Это может произойти, например, из-за того, что раковые клетки экспрессируют более высокий уровень CD38 чем нормальные клетки и/или из-за того, что CD38-CAR обладают увеличенной аффинностью к определенной форме CD38, экспрессируемого на раковых клетках, и/или пониженную аффинность к определенной форме CD38, экспрессируемого на нормальных клетках. Предпочтительно, чтобы повышение аффинности NK-клетки с экспрессией CD38-CAR к раковой клетке составляло как минимум 10%, 20%, 50% и более предпочтительно 100% в сравнении с аффинностью NK-клетки с экспрессией CD38-CAR к нормальной клетке. Предпочтительно, чтобы понижение аффинности NK-клетки с экспрессией CD38-CAR к нормальной клетке составляло как минимум 10%, 20%, 50% и более предпочтительно 100% в сравнении с аффинностью NK-клетки с экспрессией CD38-CAR к раковой клетке. Предпочтительно, чтобы повышение аффинности NK-клетки с экспрессией CD38-CAR к раковой клетке было как минимум в 1,5, 2, 5, 100 и более предпочтительно 100 раз больше в сравнении с аффинностью NK-клетки с экспрессией CD38-CAR к нормальной клетке. Предпочтительно, чтобы понижение аффинности NK-клетки с экспрессией CD38-CAR к нормальной клетке было как минимум в 1,5, 2, 5, 100 и более предпочтительно 100 раз меньше в сравнении с аффинностью NK-клетки с экспрессией CD38-CAR к раковой клетке. Предпочтительно, чтобы NK-клетки с экспрессией CD38-CAR обладали низкой аффинностью к нормальным клеткам с экспрессией CD38; при этом «низкая аффинность» определяется как наличие достаточно высокой аффинности для закрепления цитотоксической реакции на раковые клетки-мишени с увеличенной экспрессией (в отношении нормальных клеток) CD38 (например, клетки миеломной болезни), но достаточно низкой для избежания закрепления цитотоксической реакции на нормальные клетки с экспрессией CD38.

[0017] В определенном аспекте, представленном в настоящем документе, предлагается способ получения фармацевтической композиции, включающей себя выведенную естественную клетку-киллера; при этом выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует высокий уровень экспрессии протеина FUT6 или FUT7; при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR); при этом способ включает выдерживание естественной клетки-киллера с полинуклеотидом, кодирующим CAR. Соответственно, выведенная естественная клетка-киллер включает экзогенный полинуклеотид, кодирующий протеин FUT6 или FUT7. Соответственно, CAR специфические связывается с раковым антигеном. Соответственно, раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K. Соответственно, раковый специфический антиген включает антиген, специфический для рака крови. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1. Соответственно, антиген, специфический для рака крови, включает CD38. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 80% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1-6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, при этом CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 1 и 2. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 3 и 4. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно действующего домена, которая идентична указанной в SEQ ID №: 5 и 6. Соответственно, CAR включает полипептид CD8-альфа человека. Соответственно, CAR включает DAP10, DAP12, 2В4 (CD244) или полипептид человека 4-1 ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека 4-1ВВ. Соответственно, CAR включает полипептид человека CD3-дзета. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. В дополнительном аспекте выведенная клетка-естественный киллер включает второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0018] На ФИГУРЕ 1А представлено неограничивающее схематическое изображение химерного антигенного рецептора по настоящему изобретению. Данная фигура выполнена не в масштабе.

[0019] На ФИГУРЕ 1В представлено неограничивающее схематическое изображение целенаправленно воздействующего домена химерного антигенного рецептора по настоящему изобретению. Данная фигура выполнена не в масштабе.

[0020] На ФИГУРАХ 2А-В показано связывание антитела НЕСА-452 с клетками KHYG-1 (А) и NK-92 (В) в соответствии с анализом посредством проточной цитометрии.

[0021] На ФИГУРЕ 3 показана миграция клеток KHYG-1 по градиенту SDF-1 в сравнении с клетками NK-92.

[0022] На ФИГУРАХ 4А-В приведено изображение отдельного кадра из видеозаписи наблюдения за миграцией клеток KHYG-1 (А) и NK-92 (В) в проточной ячейке. Клетки без движения или мигрирующие клетки отмечены звездочкой.

[0023] На ФИГУРЕ 5 представлена структура «руководящей» РНК (экспрессирующий вектор), используемая для выявления делеции CTLA4.

[0024] На ФИГУРЕ 6 показаны полосы после электрофореза в геле для первичной и мутировавшей ДНК LIR2 перед и после трансфекции с «руководящей» ДНК CPJSPR/Cas9;

[0025] На ФИГУРЕ 7 показаны полосы после электрофореза в геле для первичной и мутировавшей ДНК CTLA4 перед и после трансфекции с «руководящей» ДНК CRISPR/Cas9;

[0026] На ФИГУРАХ 8А-В показан нокдаун CD96 в клетках KHYG-1 с использованием малой интерферирующей РНК в соответствии с анализом посредством проточной цитометрии. Показаны два независимых эксперимента (А и В).

[0027] На ФИГУРЕ 9 представлено повышенное уничтожения клетками KHYG-1 с уменьшением CD96 на различных соотношениях эффектора с мишенью.

[0028] На ФИГУРЕ 10 показан нокдаун CD328 в клетках KHYG-1 с использованием малой интерферирующей РНК в соответствии с анализом посредством проточной цитометрии.

[0029] На ФИГУРЕ 11 представлено повышенное уничтожение клетками KHYG-1 с уменьшением CD328 на различных соотношениях эффектора с мишенью.

[0030] На ФИГУРЕ 12 показано, что клетки KHYG-1 демонстрируют низкую экспрессию или отсутствие экспрессии TRAIL в соответствии с анализом посредством проточной цитометрии.

[0031] На ФИГУРЕ 13 представлена повышенная экспрессия TRAIL на клеточной поверхности в клетках, трансфицированных с помощью TRAIL дикого типа в соответствии с анализом посредством проточной цитометрии.

[0032] На ФИГУРЕ 14 представлена повышенная экспрессия 107а на клеточной поверхности в клетках, трансфицированных с помощью TRAIL дикого типа в соответствии с анализом посредством проточной цитометрии.

[0033] На ФИГУРЕ 15 представлена жизнеспособность клеток KHYG-1, трансфицированных с помощью TRAIL дикого типа.

[0034] На ФИГУРЕ 16 представлена экспрессия рецепторов TRAIL на различных линиях NK-клеток; KHYG1 (четыре верхние) и NK-92 (четыре нижние).

[0035] На ФИГУРЕ 17 представлено воздействие, которое оказывают клетки KHYG-1 с экспрессией TRAIL дикого типа или варианта TRAIL на апоптоз клеток K56.

[0036] На ФИГУРЕ 18 представлено воздействие, которое оказывают клетки KHYG-1 с экспрессией TRAIL дикого типа или варианта TRAIL на апоптоз клеток RPMI8226.

[0037] На ФИГУРЕ 19 представлено воздействие, которое оказывают клетки KHYG-1 с экспрессией TRAIL дикого типа или варианта TRAIL на апоптоз клеток MM1.S.

[0038] На ФИГУРЕ 20 показано два графика FACS экспрессии DR5 в клетках RPMI8226 и клетках MM1.S, соответственно; кроме того, показано воздействие обработки препаратом Бортезомиб на экспрессию DR5.

[0039] На ФИГУРЕ 21 показаны два графика FACS апоптоза в клетках MM1.S, прошедших предварительную обработку/непрошедших обработку препаратом Бортезомиб, культивированных с клетками KHYG-1, с вариантом (две нижние)/без (две средние) варианта TRAIL.

[0040] На ФИГУРЕ 22 показано воздействие лечения линии множественной миеломы UM9 различными CAR NK CD38 с низкой аффинностью.

[0041] На ФИГУРАХ 23 и 24 показано воздействие лечения первичных клеток множественной миеломы различными CAR NK CD38 с низкой аффинностью.

[0042] На ФИГУРАХ 25 и 26 показаны разновидности клеток в диапазоне отображения FACS в соответствии с их экспрессией CD38 и CD138 с указанием того, что CAR CD38 с низкой аффинностью эффективно выявляют раковые клетки, однако не выявляют клетки, не являющиеся раковыми.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Некоторые определения

[0043] Если не указано иное, все технические термины, используемые в настоящем документе, имеют общеупотребительное значение среди специалистов в данной области техники, к которым относится настоящее изобретение. Если по контексту явно не обозначено иное, под формой единственного числа, используемой в настоящем описании и прилагаемых пунктах, подразумеваются ссылки на множественное число. Если не указано иное, под «или» подразумевается «и/или».

[0044] Термин «примерно», используемый в настоящем документе, означает объем, близкий к указанному, например, на 10%, 5% или 1%.

[0045] Термины «лицо», «субъект» и «пациент», используемые в настоящем документе, являются взаимозаменяемыми и означают людей с диагнозом или подозрением на заболевание раком или другое новообразование.

[0046] В настоящем документе, если не указано иное, упоминания о NK-клетке или NK-клетках относится также к линиям NK-клеток и первичным NK-клеткам.

[0047] Термин «линия NK-клеток», используемый в настоящем документе, относится к любой трансформированной или имортализованной линии клеток, сохраняющей одно или несколько свойств клеток-естественных киллеров. Например, в определенных вариантах осуществления одним или несколькими сохраненными свойствами клеток-естественных киллеров являются экспрессия CD 56, экспрессия иммуноглобулиноподобного рецептора клетки-киллера (KIR) или антиген-независимая цитотоксичность в отношении линии клеток-мишеней, таких как клетки K562. Стандартными линиями NK-клеток являются, например, линии клеток NK-92 или KHYG-1.

Естественные клетки-киллеры

[0048] Для выведенных естественных клеток-киллеров требуется всего одна или несколько манипуляций, отличающих их от невыведенных естественных клеток-киллеров. Соответственно, вывод клетки-естественного киллера производится таким образом, что она включает полинуклеотид, кодирующий один или несколько химерных антигенных рецепторов, вариант TRAIL, белок FUT6 или FUT 7, а также имеет сниженную экспрессию ингибитора контрольных точек, или вовсе не имеет ее. Выведенные клетки-естественные киллеры (NK-клетки) по настоящему изобретению могут быть получены от любой популяции NK-клеток, включая первичные клетки или устойчивые линии клеток. Соответственно, NK-клетка представляет собой человеческую NK-клетку. Первичные клетки-естественные киллеры у людей экспрессируют маркер клеточной поверхности CD56, и в определенных вариантах осуществления выведенные клетки-естественные киллеры можно получить из CD56-положительных клеток, в соответствии с определением, в качестве неограничивающего примера, путем проточной цитометрии. Соответственно, клетку-естественного киллера можно получить из аутологичного источника (аналогичный генетический фон исходной клетки и реципиента) или из гетерологичного источника (отличный генетический фон исходной клетки и реципиента). Соответственно, NK-клетка изолируется от периферической крови донора или лица, подлежащего лечению, методом, например, сортировки клеток или магнитных микроносителей. NK-клетки, изолированные от донора, могут быть расширены ex vivo путем выращивания в интерлейкине-2 и интерлейкине-15 в течение более 7 дней. NK-клетки также могут быть отличены от стволовых клеток или клеток-предшественников в культуре in vitro методами, хорошо известными на существующем уровне техники. Соответственно, NK-клетка отличается от стволовой клетки, полученной из костного мозга. Соответственно, NK-клетка отличается от зрелой плюрипотенциальной клетки. Соответственно, NK-клетка отличается от эмбрионной стволовой клетки.

[0049] Выведенные NK-клетки также можно получить из трансформированной линии NK-клеток. Соответственно, трансформированная линия NK-клеток представляет собой линию клеток человека. Стандартными линиями NK-клеток, подходящими для использования, являются линия клеток NK-92 (может быть получена из АТСС; CRL-2497) или линия клеток KHYG-1. Соответственно, выведенная линия NK-клеток получается из линии клеток KHYG-1. См. Ягита и соавт., «Новая линия клеток-естественных киллеров (KHYG-1), полученная у пациента с агрессивной формой NK-клеточного лейкоза с мутацией р53». «Лейкоз» 14(5):922-30. Несмотря на общие черты между стандартными линиями NK-клеток, такими, как экспрессия CD56, разные линии клеток обладают разными фенотипическими и генотипическими характеристиками, благодаря чему конкретная линия NK-клеток может подходить больше в сравнении с другими линиями NK-клеток для разработки клеточной терапии (например, NK-клетки CAR или NK-клетки с экспрессией белков варианта TRAIL). Соответственно, выведенная линия NK-клеток не включает в себя линию клеток NK-92 или производную.

[0050] В определенном варианте осуществления, описанном в настоящем документе, выведенные NK-клетки могут использоваться для лечения гемастологической злокачественной опухоли. Для того, чтобы облегчить такое лечение, в клетках повышается уровень возврата в костный мозг. Соответственно, выведенные NK-клетки демонстрируют высокий уровень экспрессии лиганда для Е-селектина. Е-селектин также известен как: CD62-антигенподобный член семейства Е (CD62E), эндотелиальная молекула адгезии лейкоцитов 1 (ELAM-1) или молекула адгезии лейкоцитарно-эндотелиальных клеток 2 (LECAM2). Е-селектин связывается с лигандами для Е-селектина на поверхности клеток, представляющих собой гликопротеины и/или гликолипиды с экспрессией сиалированного антигена Lex (SLe^x). SLe^x синтезируется совместным действием α-фукозилтрансфераз, α2-3-сиалилтрансфераз, β-галактозилтрансфераз и N-ацетил-β-глюкозаменилтрансфераз. Антитело НЕСА-452 распознает лиганды для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки включают популяцию выведенных NK-клеток, из которых не менее 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% или более тех, у которых наблюдается положительное окрашивание при взаимодействии с антителом НЕСА-452. Соответственно, выведенные NK-клетки включают популяцию NK-клеток, из которых не менее 50% или более тех, у которых наблюдается положительное окрашивание при взаимодействии с антителом НЕСА-452. Соответственно, выведенные NK-клетки включают популяцию NK-клеток, из которых не менее 75% или более тех, у которых наблюдается положительное окрашивание при взаимодействии с антителом НЕСА-452. Соответственно, выведенные NK-клетки включают популяцию NK-клеток, из которых не менее 80% или более тех, у которых наблюдается положительное окрашивание при взаимодействии с антителом НЕСА-452. Соответственно, выведенные NK-клетки включают популяцию NK-клеток, из которых не менее 90% или более тех, у которых наблюдается положительное окрашивание при взаимодействии с антителом НЕСА-452. Положительную реакцию можно оценить, например, путем окрашивания клеток in vitro во флуоресцентно конъюгированное антитело НЕСА-452 и анализа проточной цитометрией, сравнивая клетки, окрашенные в НЕСА-452, с клетками, окрашенными для изотипичного контроля. Соответственно, популяция выведенных NK-клеток, демонстрирующих положительную реакцию на НЕСА-452, были химически обработаны для увеличения фукозилирования белков клеточной поверхности. Соответственно, во время химической обработки используются субстрат GDP-фукозы и фермент альфа-1,3-фукозилтрансферазы-VI.

[0051] Соответственно, выведенная NK-клетка является гликовыведенной. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е селектина. Соответственно, высокий уровень лиганда для Е-селектина проявляется в 6-ти кратном значении в связывании антитела НЕСА-452 по сравнению со связыванием антитела изотипического контроля. Соответственно, высокий уровень лиганда для Е-селектина проявляется в 7-ти кратном значении в связывании антитела НЕСА-452 по сравнению со связыванием антитела изотипического контроля. Соответственно, высокий уровень лиганда для Е-селектина проявляется в 8-ти кратном значении в связывании антитела НЕСА-452 по сравнению со связыванием антитела изотипического контроля. Соответственно, высокий уровень лиганда для Е-селектина проявляется в 9-ти кратном значении в связывании антитела НЕСА-452 по сравнению со связыванием антитела изотипического контроля. Соответственно, высокий уровень лиганда для Е-селектина проявляется в 10-ти кратном значении в связывании антитела НЕСА-452 по сравнению со связыванием антитела изотипического контроля. Соответственно, высокий уровень лиганда для Е-селектина проявляется в 20-ти кратном значении в связывании антитела НЕСА-452 по сравнению со связыванием антитела изотипического контроля. Соответственно, высокий уровень лиганда для Е-селектина проявляется в 50-ти кратном значении в связывании антитела НЕСА-452 по сравнению со связыванием антитела изотипического контроля. Соответственно, высокий уровень лиганда для Е-селектина проявляется в 100-ти кратном значении в связывании антитела НЕСА-452 по сравнению со связыванием антитела изотипического контроля. Данное увеличение в связывании может быть проанализировано, например, путем сравнения средней интенсивности флуоресценции связывания антитела НЕСА-452 с таковой у антитела изотипического контроля путем проточной цитометрии. Соответственно, NK-клетка, которая демонстрирует высокий уровень связывания антитела НЕСА-452, представляет собой линию клеток KHYG-1. Соответственно, популяция выведенных NK-клеток, демонстрирующих высокие уровни связывания НЕСА-452, были химически обработаны для увеличения фукозилирования или сиалирования белков клеточной поверхности. Соответственно, во время химической обработки используются субстрат GDP-фукозы и фермент альфа-1,3-фукозилтрансферазы-VI. Соответственно, NK-клетка была выведена для демонстрирования высокого уровня связывания антитела НЕСА-452 путем экспрессии FUT6, FUT7 или их обоих. Соответственно, экспрессия FUT6 или FUT7 достигается путем введения мРНК, плазмиды ДНК или вирусного вектора в NK-клетку, демонстрирующую низкий уровень связывания антитела НЕСА-452, например, клетку NK-92. Соответственно, иммортализованная линия NK-клеток, таких, как клетки NK-92, может стабильно трансфицироваться нуклеиновой кислотой, кодирующей FUT6, FUT7 или их обоих. Соответственно, высокий уровень экспрессии FUT6 или FUT7 имеет как минимум 2, 5 или 10-кратное увеличение в активности или экспрессии FUT6 или FUT7, что контролируется с помощью мРНК, вестерн-блоттинга или ферментативным анализом. Соответственно, выведенная NK-клетка экспрессирует CD65. Соответственно, выведенная NK-клетка экспрессирует несколько CD65.

[0052] Соответственно, выведенная NK-клетка имеет низкий уровень экспрессии рецептора TRAIL на клеточной поверхности. Соответственно, рецепторами TRAIL являются DR4 или DR5. Соответственно, низкий уровень экспрессии рецептора TRAIL на клеточной поверхности приводит к отсутствию обнаруживаемой активности рецептора TRAIL. Соответственно, под низким уровнем экспрессии рецептора TRAIL подразумевается уровень, отмеченный по реакционности анти-TRAIL антитела, сопоставимый с соответствующим значением по изотопическому контролю. Соответственно, под низким уровнем экспрессии рецептора TRAIL подразумевается уровень, отмеченный по реакционности анти-TRAIL антитела со значением не более чем в 5 раз больше такового по изотопическому контролю. Соответственно, под низким уровнем рецептора TRAIL подразумевается уровень, отмеченный по реакционности анти-TRAIL антитела со значением не более чем в 2 раза больше такового по изотопическому контролю. Экспрессия рецептора TRAIL на клеточной поверхности может быть определена количественно, например, путем проточной цитометрии, как подробно описано в примерах.

Химерные антигенные рецепторы

[0053] Химерный антигенный рецептор (CAR) представляет собой рецептор рекомбинирующего антигена, предназначенный для ввода определенной специфичности антигена в иммунную эффекторную клетку. CAR включает определенную полипептидную последовательность, полученную из экзогенного полинуклеотида, введенного в иммунную эффекторную клетку, временно введенную или интегрированную в геном. Схема типичного CAR представлена на фиг. 1А. Химерные антигенные рецепторы включают лидерную последовательность 101, целенаправленно воздействующий домен 102, трансмембранный домен 103 и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов (104 и 105). Соответственно, целенаправленно воздействующий домен выводится из молекулы антитела и включает один или несколько гипервариабельных участков (CDR) от молекулы антитела, которые придают CAR специфичность антигена. Соответственно, целенаправленно воздействующий домен CAR для использования в выведенных NK-клетках по настоящему изобретению представляют собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), как представлено на фиг. 1B. scFv включает различные части легкой цепи иммуноглобулина 106 и тяжелой цепи иммуноглобулина 108, которые разделены посредством гибкого полипептидного линкера 107. Порядок легких и тяжелых цепей не является ограниченным и может меняться. Гибкий полипептидный линкер позволяет обеспечить взаимосвязь тяжелых и легких цепей и восстановление антигенсвязывающего домена иммуноглобулина. Соответственно, вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи имеют по три CDR. Соответственно, CDR для использования в целенаправленно воздействующем домене получаются из молекулы антитела любого вида (например, человека, мыши, крысы, кролика, козы, овцы), а каркасные области между CDR являются гуманизированными или содержат последовательность, идентичную как минимум на 85%, 90%, 95 или 99% каркасной области человека.

[0054] Если целенаправленно воздействующий домен CAR содержит scFv, легкая цепь иммуноглобулина и тяжелая цепь иммуноглобулина соединяются полипептидными линкерами различной длины. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину, большую или равную 10 аминокислотам. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину, большую чем 10, 15, 20 или 25 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину, меньшую или равную 30 аминокислотам. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину, меньшую чем 15, 20, 25 или 30 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину от 10 до 30 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину от 10 до 25 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину от 10 до 20 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину от 10 до 15 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину от 15 до 30 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину от 20 до 30 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер имеет длину от 25 до 30 аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер включает в себя гидрофильные аминокислоты. Соответственно, полипептидный линкер состоит из гидрофильных аминокислот. Соответственно, полипептидный линкер включает в себя последовательность аминокислот GSTSGSGKPGSGEGSTKG. Соответственно, полипептидный линкер включает в себя последовательность G₄S (GGGGS). Линкер G₄S обеспечивает гибкость и устойчивость к действию протеазы линкера. Соответственно, линкер G4S последовательно повторяется в полипептидном линкере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 раз.

[0055] CAR по настоящему изобретению также включает NH₂-терминальную лидерную последовательность 101. Лидерная последовательность (также известная как сигнальный пептид) обеспечивает возможность ввода для экспрессируемой структуры CAR в эндоплазматический ретикулум (ER) и выявления клеточной поверхности. Лидерная последовательность расщепляется в ER, а CAR поверхности зрелой клетки не обладает лидерной последовательностью. В целом длина лидерной последовательности будет в диапазоне от 5 до 30 аминокислот и включит отрезок гидрофобных аминокислот. Соответственно, лидерная последовательность имеет длину более 5, 10, 15, 20 или 25 аминокислот. Соответственно, лидерная последовательность имеет длину менее 10, 15, 20, 25 или 30 аминокислот. Соответственно, лидерная последовательность включает в себя последовательность, получаемую из любого секреторного белка. Соответственно, лидерная последовательность включает в себя последовательность, получаемую из любой лидерной последовательности CDS-альфа.

[0056] CAR по настоящему изобретению также включают трансмембранный домен. См. фиг. 1А, отличительный признак 103. Трансмембранный домен включает в себя остатки гидрофобных аминокислот и обеспечивает возможность закрепления CAR в оболочке выведенной NK-клетки. Соответственно, трансмембранный домен включает в себя последовательность аминокислот, получаемую из трансмембранного белка. Соответственно, трансмембранный домен включает в себя последовательность аминокислот, получаемую из трансмембранного домена альфа-, бета- или дзета-цепи рецептора Т-клеток, CD27, CD28, CD3-эпсилона, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. Соответственно, CAR включает в себя трансмембрану с последовательностью аминокислот, получаемой из трансмембранного домена CD8. Соответственно, CAR включает в себя трансмембранный домен с последовательностью аминокислот, получаемой из трансмембранного домена CDS-альфа человека.

[0057] CAR по настоящему изобретению также включает один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов. См. фиг. 1А, отличительный признак 104 и 105. Внутриклеточный сигнальный домен увеличивает эффективность CAR и включает в себя внутриклеточный сигнальный домен, получаемый из белка, задействованного в сигнальной трансдукции иммунной клетки. Соответственно, один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов включают в себя внутриклеточный сигнальный домен, получаемый из CD-3-дзета CD28, ОХ-40, 4-1ВВ, DAP10, DAP12, 2В4 (CD244) или любого их сочетания. Соответственно, один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов включают в себя внутриклеточный сигнальный домен, получаемый из любых двух единиц CD3-дзета CD28, ОХ-40, 4-1ВВ, DAP10, DAP12, 2В4 (CD244) или любого их сочетания. Соответственно, CAR включает в себя как минимум два внутриклеточных сигнальных домена, получаемых из CD3-дзета и 4-1ВВ.

[0058] CAR по настоящему изобретению также может включать в себя шарнирную область, располагающуюся между целенаправленно воздействующим доменом и трансмембранным доменом. Шарнирная область включает в себя гидрофильные аминокислоты и обеспечивает гибкость целенаправленно воздействующего домена по отношению к клеточной поверхности. Соответственно, шарнирная область включает в себя более 5, 10, 15, 20, 25 или 30 аминокислот. Соответственно, шарнирная область включает в себя менее 10, 15, 20, 25, 30 или 35 аминокислот.

[0059] Предпочтительно, чтобы CAR CD38 по настоящему изобретению имел связывающий домен, включающий в себя вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID №: 1. Дополнительно вариабельная область тяжелой цепи включает в себя SEQ ID №: 7. Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал в себя вариабельную область легкой цепи с SEQ ID №: 23 или SEQ ID №: 28.

[0060] Предпочтительный вариант CAR CD38 в примерах имеет связывающий домен, включающий в себя вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID №: 1 и вариабельная область легкой цепи с SEQ ID №: 23.

[0061] Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал в себя один, несколько или все CDR тяжелой цепи из SEQ ID №: 29, SEQ ID №: 30 и SEQ ID №: 31. Дополнительно, CAR включает в себя один, несколько или все CDR тяжелой цепи из SEQ ID №: 32, SEQ ID №: 33 и SEQ ID №: 34.

[0062] Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал в себя один, несколько или все CDR легкой цепи из SEQ ID №: 35, SEQ ID №: 36 и SEQ ID №: 37 или SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 39 и SEQ ID №: 40.

[0063] Предпочтительно, чтобы фрагменты и варианты вышеуказанных тяжелых и легких цепей имели связывающие домены CAR с главным образом аналогичной связывающей активностью CD38, при этом предпочтительно, чтобы фрагменты включали в себя пептиды, которые были усечены и/или имели аминокислоты, которые были удалены и/или изменены. Предпочтительно, чтобы любой фрагмент/вариант согласно настоящему изобретению сохранял как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 70%, и наиболее предпочтительно как минимум 90% связывающей активности предпочтительного варианта CAR в примерах. Кроме того, предпочтительно, чтобы любой фрагмент/вариант согласно настоящему изобретению имел связывающую активность, не превышающую связывающую активность предпочтительного CAR более чем на 10%, более чем на 20%, более чем на 50%, и наиболее предпочтительно - более чем на 100%.

[0064] Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал вариабельную область тяжелой цепи с гомологией последовательности как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 70%, как минимум 80%, и наиболее предпочтительно - как минимум 90% с SEQ ID №: 1. Дополнительно, CAR CD38 включает вариабельную область тяжелой цепи с гомологией последовательности как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 70%, как минимум 80%, и наиболее предпочтительно - как минимум 90% с SEQ ID №: 7.

[0065] Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал вариабельную область легкой цепи с гомологией последовательности как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 70%, как минимум 80%, и наиболее предпочтительно как минимум 90% с SEQ ID №: 23 или SEQ ID №: 28.

[0066] Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал один, несколько или все CDR тяжелой цепи с гомологией последовательности как минимум 70%, как минимум 80%, и наиболее предпочтительно - как минимум 90% с SEQ ID №: 29, SEQ ID №: 30 и SEQ ID №: 31. Дополнительно CAR CD38 включает один, несколько или все CDR тяжелой цепи с гомологией последовательности как минимум 70%, как минимум 80%, и наиболее предпочтительно - как минимум 90% с SEQ ID №: 32, SEQ ID №: 33 и SEQ ID №: 34.

[0067] Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал один, несколько или все CDR легкой цепи с гомологией последовательности как минимум 70%, как минимум 80%, и наиболее предпочтительно - как минимум 90% с SEQ ID №: 35, SEQ ID №: 36 и SEQ ID №: 37 или SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 39 и SEQ ID №: 40.

[0068] Предпочтительно, чтобы CAR CD38 включал в себя один или несколько костимулирующих доменов из SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 42 и SEQ ID №: 43. Предпочтительно, чтобы CAR включал костимулирующий домен с гомологией последовательности как минимум 50%, как минимум 60%, как минимум 70%, как минимум 80%, и наиболее предпочтительно - как минимум 90% с SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 42 или SEQ ID №: 43.

[0069] Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал в себя вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, представляющей собой фрагмент SEQ ID №: 1 длиной в как минимум 60 аминокислот, как минимум 70 аминокислот, как минимум 80 аминокислот, как минимум 90 аминокислот, как минимум 100 аминокислот, как минимум 110 аминокислот, и более предпочтительно - как минимум 120 аминокислот. Дополнительно CAR CD38 включает в себя вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, представляющей собой фрагмент SEQ ID №: 7 длиной в как минимум 60 аминокислот, как минимум 70 аминокислот, как минимум 80 аминокислот, как минимум 90 аминокислот, как минимум 100 аминокислот, как минимум 110 аминокислот, и более предпочтительно - как минимум 120 аминокислот.

[0070] Предпочтительно, чтобы связывающий домен CAR CD38 включал в себя вариабельную область легкой цепи с последовательностью, представляющей собой фрагмент SEQ ID №: 23 или SEQ ID №: 28 длиной в как минимум 50 аминокислот, как минимум 60 аминокислот, как минимум 70 аминокислот, как минимум 80 аминокислот, как минимум 90 аминокислот, и более предпочтительно - как минимум 100 аминокислот.

Целенаправленно воздействующие домены CAR

[0071] Соответственно, согласно настоящему документу, «раковый специфический антиген» означает молекулярный маркер рака, экспрессируемый раковой клеткой в большей степени, чем нормальной. Раковые специфические антигены, как правило, представляют собой белки или полипептиды, полученные из них, но могут представлять собой гликаны, липиды или другие небольшие органические молекулы. Кроме того, раковый специфический антиген может возникать в результате увеличения или уменьшения посттрансляционного процессинга, проявляемого раковой клеткой по сравнению с нормальной клеткой, например, гликозелирования белка, липидизация белка, фосфорилирование белка или ацетилирование белка. К неограничивающим примерам ракового специфического антигена относятся CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

[0072] Соответственно, согласно настоящему документу, «антиген, специфический для рака крови» означает молекулярный маркер рака, экспрессируемый лейкозом, лимфомой, миеломой в большей степени, чем гематологическая клетка. Антигены, специфические для рака крови, как правило, представляют собой белки или полипептиды, полученные из них, но могут представлять собой гликаны, липиды или другие небольшие органические молекулы. Кроме того, антиген, специфический для рака крови, может возникать в результате увеличения или уменьшения посттрансляционного процессинга, проявляемого клеткой лейкоза, лимфомы или миеломы, по сравнению с нормальной клеткой, например, во время гликозелирования белка, липидизации белка, фосфорилирования белка или ацетилирования белка. К неограничивающим примерам антигена, специфического для рака крови, относятся CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, GD2, CLL-1, HERV-K. К неограничивающим примерам рака крови относятся острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, диффузная В-крупноклеточная лимфома, фолликулярная лимфома, мантийноклеточная лимфома, острый миелогенный лейкоз, хронический миелолейкоз, лейкоз ворсистых клеток, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, множественная миелома, вялотекущая множественная миелома, миелома легкой цепи или лейкоз из больших зернистых лимфоцитов.

[0073] Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя CAR с целенаправленно воздействующим доменом, который специфически связывает белок клеточной поверхности. Соответственно, выведенная NK-клетка включает два или несколько CAR с целенаправленно воздействующими доменами, которые специфически связывают два или несколько явно выраженных белков клеточной поверхности. Соответственно, целенаправленно воздействующий домен CAR специфически связывает раковый специфический антиген на клеточной поверхности раковой клетки. Соответственно, CAR специфически связывает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

[0074] CD38, или также известная гидролаза циклической аденозиндифосфорибозы, представляет собой гликобелок клеточной поверхности, который преимущественно находится на иммунных клетках. CD38 используется в регулировании кальция внутри клеток и сверхэкспрессируется во многих различных типах рака, включая лейкоз, миелому и многие другие солидные опухоли. Соответственно, выведенные NK-клетки по настоящему изобретению экспрессируют CAR с использованием целенаправленно воздействующего домена 102, специфического для CD38. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность аминокислот, как минимум на 80% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность аминокислот, как минимум на 90% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность аминокислот, как минимум на 95% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность аминокислот, как минимум на 98% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность аминокислот, как минимум на 99% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6.

[0075] Соответственно, выведенная NK-клетка экспрессирует CAR с целенаправленно воздействующим доменом, включающим в себя последовательность аминокислот, изложенную в SEQ ID №:1 и последовательность аминокислот, изложенную в SEQ ID №: 2. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 80% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1 и последовательность аминокислот, идентичную на 80% той, которая изложена в SEQ ID №:2. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 90% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1 и последовательность аминокислот, идентичную на 90% той, которая изложена в SEQ ID №:2. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 95% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1 и последовательность аминокислот, идентичную на 95% той, которая изложена в SEQ ID №:2. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 98% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1 и последовательность аминокислот, идентичную на 98% той, которая изложена в SEQ ID №:2. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 99% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1 и последовательность аминокислот, идентичную на 99% той, которая изложена в SEQ ID №:2. Соответственно, SEQ ID №:1 и SEQ ID №:2 соединены гибким полипептидным линкером. Соответственно, гибкий полипептидный линкер соединяет конец СООН полипептида в SEQ ID №:1 до конца NEh полипептида в SEQ ID №:2. Соответственно, гибкий полипептидный линкер соединяет конец СООН полипептида в SEQ ID №:2 до конца NEh полипептида в SEQ ID №:1.

[0076] Соответственно, выведенная NK-клетка экспрессирует CAR с целенаправленно воздействующим доменом, включающим в себя последовательность аминокислот, изложенную в SEQ ID №:3 и последовательность аминокислот, изложенную в SEQ ID №:4. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 80% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:3 и последовательность аминокислот, идентичную на 80% той, которая изложена в SEQ ID №:4. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 90% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:3 и последовательность аминокислот, идентичную на 90% той, которая изложена в SEQ ID №:4. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 95% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:3 и последовательность аминокислот, идентичную на 95% той, которая изложена в SEQ ID №:4. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 98% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:3 и последовательность аминокислот, идентичную на 98% той, которая изложена в SEQ ID №:4. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 99% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:3 и последовательность аминокислот, идентичную на 99% той, которая изложена в SEQ ID №:4. Соответственно, SEQ ID №:3 и SEQ ID №:4 соединены гибким полипептидным линкером. Соответственно, гибкий полипептидный линкер соединяет конец СООН полипептида в SEQ ID №:3 до конца NEh полипептида в SEQ ID №:4. Соответственно, гибкий полипептидный линкер соединяет конец СООН полипептида в SEQ ID №:4 до конца NH2 полипептида в SEQ ID №:3.

[0077] Соответственно, выведенная NK-клетка экспрессирует CAR с целенаправленно воздействующим доменом, включающим в себя последовательность аминокислот, изложенную в SEQ ID №:5 и последовательность аминокислот, изложенную в SEQ ID №:6. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 80% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:5 и последовательность аминокислот, идентичную на 80% той, которая изложена в SEQ ID №:6. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 90% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:5 и последовательность аминокислот, идентичную на 90% той, которая изложена в SEQ ID №:6. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 95% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:5 и последовательность аминокислот, идентичную на 95% той, которая изложена в SEQ ID №:6. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 98% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:5 и последовательность аминокислот, идентичную на 98% той, которая изложена в SEQ ID №:6. Соответственно, CAR включает в себя последовательность аминокислот, на 99% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:5 и последовательность аминокислот, идентичную на 99% той, которая изложена в SEQ ID №:6. Соответственно, SEQ ID №:5 и SEQ ID №:6 соединены гибким полипептидным линкером. Соответственно, гибкий полипептидный линкер соединяет конец СООН полипептида в SEQ ID №:5 до конца NEh полипептида в SEQ ID №:6. Соответственно, гибкий полипептидный линкер соединяет конец СООН полипептида в SEQ ID №:6 до конца NEh полипептида в SEQ ID №:5.

[0078] Выведенная NK-клетка по настоящему изобретению, может включать CAR, специфический для CD38, демонстрирующий аффинность, приспособленную для оптимальной реакции на рак, а также максимального ограничения реактивности по отношению к CD38 с экспрессией на клетках, не являющихся раковыми или опухолевыми. Даратумумаб это моноклональное антитело, проявляющее высокую аффинность к рецептору CD38. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего на 25% более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего на 50% более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. Соответственно, CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего в 2 раза более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. Аффинность антитела можно измерить, например, с помощью поверхностного плазменного резонанса (например, Biacore).

Биспецифичный CAR

[0079] Выведенные NK-клетки могут быть биспецифичными, то есть, экспрессировать биспецифичные CAR или несколько различных CAR, при этом они будут иметь аффинность к двум явно выраженным лигандам / антигенам. Биспецифичные CAR-NK могут использоваться либо для увеличения количества потенциальных участков связывания на раковых клетках, либо, в качестве альтернативного варианта, для локализации раковых клеток для других иммунных эффекторных клеток, которые экспрессируют лиганды специально для NK-CAR. Для использования в терапии рака биспецифичный CAR может связываться с опухолевой клеткой-мишенью и эффекторной клеткой, например, Т-клеткой, NK-клеткой или макрофагоцитом. Так, например, в случае множественной миеломы биспецифичный CAR может сзываться с антигеном Т-клетки (например, CD3 и т.д.) и маркером опухолевой клетки (например, CD38 и т.д.). В качестве альтернативного варианта биспецифичный CAR может связываться с двумя отдельными маркерами опухолевых клеток, повышая аффинность связывания NK-клетки для опухолевых клеток мишеней. Это может снизить риск раковых клеток, развивая сопротивление с помощью одного или нескольких антигенов-мишеней. В качестве примера в данном случае (случае множественной меиломы) можно привести привязку CAR к CD38 и CS-1/SLAMF7. Другой маркер опухолевой клетки, на который нацелен CAR, является маркером типа «не ешь меня» на опухолях, примером которого является CD47.

[0080] Выведенные NK-клетки по настоящему изобретению могут включать биспецифичный CAR или несколько CAR, экспрессируемых аналогичной NK-клеткой. Это обеспечивает для NK-клеток возможность выявления двух различных антигенов одновременно. Соответственно, биспецифичный CAR имеет специфичность для двух любых из следующих антигенов: CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, CD123/IL3-RA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, CD123, HERV-K. Соответственно, бисецефичный характер NK-клетки CAR может обеспечить возможность связывания с опухолевым антигеном и другой иммунной клеткой, например, Т-клеткой или дендритной клеткой. Соответственно, биспецифичный характер NK-клетки CAR может обеспечить возможность для связывания с ингибитором контрольных точек, например, PDL-1 или CD47. Соответственно, первый CAR обладает специфичностью для CD38, а второй CAR обладает специфичностью для любого из SLAMF-7, ВСМА, CD138, CD229, PDL-1 или CD47. Соответственно, первый CAR обладает специфичностью для CD38, а второй CAR обладает специфичностью для SLAMF-7, ВСМА, CD 138, CD229. Соответственно, первый CAR обладает специфичностью для CD38, а второй CAR обладает специфичностью для SLAMF-7. Соответственно, первый CAR обладает специфичностью для CD38, а второй CAR обладает специфичностью для ВСМА. Соответственно, первый CAR обладает специфичностью для CD38, а второй CAR обладает специфичностью для CD 138. Соответственно, первый CAR обладает специфичностью для CD38, а второй CAR обладает специфичностью для CD229.

TNF-связанный апоптоз-индунирующий лиганд

[0081] TNF-связанный апоптоз-индуцирующего лиганд (TRAIL), также известный как элемент 10 семейства факторов некроза опухоли (лиганд) - это лиганд белка, вызывающий гибель клеток путем инициирования апоптоза. Апоптоз инициируется путем связывания TRAIL с рецепторами, экспрессируемыми на клеточной поверхности множества различных типов клеток, в том числе раковых клеток. Выведенные NK-клетки по настоящему изобретению могут экспрессировать полипептид варианта TRAIL, модифицированный из последовательности белка TRAIL дикого типа с использованием как минимум одного аминокислотного остатка для того, чтобы увеличить аффинность связывания к гибели, в том числе рецепторов DR4, DR5 или их обоих, при этом снижая аффинность связывания к рецепторам-приманкам, таким, как DcR1 или DcR2. Соответственно, выведенные NK-клетки экспрессируют CAR и полипептид варианта TRAIL. Соответственно, вариант TRAIL отражает увеличенную аффинность связывания к одному или нескольким рецепторам TRAIL. Соответственно, вариант TRAIL отражает увеличенную аффинность связывания к рецептору TRAIL DR4. Соответственно, вариант TRAIL отражает увеличенную аффинность связывания к рецептору TRAIL DR5. Соответственно, вариант TRAIL отражает увеличенную аффинность связывания к рецепторам TRAIL DR4 и DR5. TRAIL дикого типа обычно содержит KD>2 нМ для DR4, >5 нМ для DR5 и >20 нМ для рецептора-приманки DcRl (WO 2009/077857; измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса), или примерно 50-100 нМ для DR4, 1-10 нМ для DR5 и 175-225 нМ для DcR1 (Трунех, А. и соавт. 2000; измерено с помощью изотермической титрационной калориметрии и ELISA). Таким образом, повышенная аффинность к DR4 надлежащим образом определяется как KD<2 нМ или <50 нМ, соответственно, в то время как повышенная аффинность к DR5 надлежащим образом определяется как KD<5 нМ или <1 нМ, соответственно. Пониженная аффинность к рецептору-приманке DcRl надлежащим образом определяется как KD>50 нМ или >225 нМ, соответственно. В любом случае повышение или понижение аффинности, которая проявляется посредством варианта/мутации TRAIL, относится к базовой аффинности, которая проявляется посредством TRAIL дикого типа. Соответственно, аффинность варианта TRAIL для рецептора TRAIL увеличивается как минимум на 10%, 15%, 20%, 25% или 50% в сравнении со значением, которое наблюдается у TRAIL дикого типа. В определенном варианте осуществления вариант TRAIL увеличивает апоптоз по сравнению со значением, наблюдаемым у TRAIL дикого типа, согласно измерениям, выполненным путем активации каспазы 8 в клетке-мишени. Соответственно, вариант TRAIL способствует увеличению уровня активации каспазы 8 по сравнению со значением, наблюдаемым у TRAIL дикого типа, в клетке-мишени как минимум в 2 раза. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет мутацию аминокислот TRAIL человека, включая D269H, S159R, E195R, G131R, N199R, К201Н или любое их сочетание. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет две мутации аминокислот человека TRAIL, D269H и E195R. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет мутацию D269H. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет мутацию E195R. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет три мутации аминокислот человека TRAIL, G131R, N199R и K201H. Соответственно, мутировавший рецептор TRAIL экспрессируется на первичной Т-клетке или линии первичных клеток. Соответственно, рецептор TRAIL кодируется полинуклеотидом, трансфицированным в линию Т-клеток.

Ингибирующие рецепторы контрольной точки.

[0082] Ингибирующие рецепторы контрольной точки экспрессируются на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких, как Т-клетки и NK-клетки, и отрицательно регулируют цитотоксичность данных клеток. К примерам ингибирующих рецепторов контрольной точки относятся PD-1, CTLA-4 и CD96, каждый из которых экспрессируется на NK-клетках. Соответственно, выведенные NK-клетки имеют пониженную функцию ингибирующих рецепторов контрольной точки или не имеют ее вовсе. Соответственно, ингибирующие рецепторы контрольной точки с замененной или отсутствующей функцией включают в себя один или несколько CD96 (TACTILE), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG-3), CD279 (PD-1), CD328 (SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT и/или TIM-3. Соответственно, ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя один или несколько CD96 (TACTILE), CD152 (CTLA4) или CD328 (SIGLEC7). Соответственно, NK-клетки имеют пониженную функцию ингибирующих рецепторов контрольной точки или не имеют ее вовсе по отношению к двум или нескольким ингибирующим рецепторам контрольной точки. Соответственно, два или несколько ингибирующих рецепторов контрольной точки включают в себя CD96 (TACTILE), CD152 (CTLA4) или CD328 (SIGLEC7). Соответственно, NK-клетки имеют пониженную функцию ингибирующих рецепторов контрольной точки или не имеют ее вовсе по отношению к трем ингибирующим рецепторам контрольной точки. Соответственно, три ингибирующих рецептора контрольной точки включают в себя CD96 (TACTILE), CD152 (CTLA4) или CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя CAR CD38, а также делецию или уменьшение ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя CAR CD38, белок варианта TRAIL, а также делецию или уменьшение ингибирующего рецептора контрольной точки.

[0083] Соответственно, выведенные NK-клетки были изменены для того, чтобы уменьшить ингибирующие рецепторы контрольной точки путем генетический делеции через механизм TALEN или Cas9/CRISPR. Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя генетическую делецию CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя генетическую делецию CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя генетическую делецию CD152 (CTLA4). Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя генетическую делецию CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя генетическую делецию любых двух или нескольких D96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CD152 (CTLA4) или CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка включает в себя генетическую делецию любых трех или нескольких D96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CD152 (CTLA4) или CD279 (PD-1). Соответственно, выведенные NK-клетки были изменены для того, чтобы уменьшить экспрессию ингибиторующего рецептора контрольной точки при помощи малой интерферирующей РНК, короткой шпилечной РНК или антисмысловой РНК. Соответственно, выведенная NK-клетка имеет уменьшенную экспрессию CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка имеет уменьшенную экспрессию CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка имеет уменьшенную экспрессию CD 152 (CTLA4). Соответственно, выведенная NK-клетка имеет уменьшенную экспрессию CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка имеет уменьшенную экспрессию любых двух или нескольких D96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CD152 (CTLA4) или CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка имеет уменьшенную экспрессию любых трех или нескольких D96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CD 152 (CTLA4) или CD279 (PD-1).

[0084] Соответственно, выведенные NK-клетки, экспрессирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, что подтверждается связыванием с антителом НЕСА-452, как описывается выше, включают в себя CAR CD38, полипептид варианта TRAIL, делецию или уменьшение ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, выведенные NK-клетки, экспрессирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, включают в себя CAR CD38 и полипептид варианта TRAIL. Соответственно, выведенные NK-клетки, экспрессирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, включают в себя CAR CD38 и делецию или уменьшение ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, выведенные NK-клетки, экспрессирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, включают в себя CAR CD38, полипептид варианта TRAIL и делецию или уменьшение одного или нескольких ингибирующих рецепторов контрольной точки. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность целенаправленно воздействующего домена, как минимум на 80% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность целенаправленно воздействующего домена, как минимум на 90% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, как минимум на 95% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, как минимум на 98% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, как минимум на 99% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет две мутации аминокислот человека TRAIL, D269H и E195R. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет три мутации аминокислот человека TRAIL, G131R, N199R и К201Н. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет мутацию D269H. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет мутацию E195R. Соответственно один, несколько или все из ингибирующих рецепторов контрольной точки принадлежали к CD96 (TACTILE), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG-3), CD279 (PD-1), CD328 (SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT и/или TIM-3.

[0085] Соответственно, выведенные NK-клетки, экспрессирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, что подтверждается связыванием антитела НЕСА-452, представляет собой клетку KHYG-1. Соответственно, клетка KHYG-1 включает в себя CAR CD38, полипептид варианта TRAIL, делецию или уменьшение в функции ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, клетка KHYG-1 включает в себя CAR CD38 и полипептид варианта TRAIL. Соответственно, клетка KHYG-1 включает в себя CAR CD38, делецию или уменьшение в функции ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, клетка KHYG-1 включает в себя CAR CD38, полипептид варианта TRAIL, делецию или уменьшение в функции ингибирующего рецептора контрольной точки. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность целенаправленно воздействующего домена, как минимум на 80% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность целенаправленно воздействующего домена, как минимум на 90% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, как минимум на 95% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, как минимум на 98% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, как минимум на 99% идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, CAR CD38 включает в себя последовательность, идентичную той, которая изложена в SEQ ID №:1-6. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет две мутации аминокислот человека TRAIL, D269H и E195R. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет три мутации аминокислот человека TRAIL, G131R, N199R и K201H. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет мутацию D269H. Соответственно, вариант рецептора TRAIL имеет мутацию E195R. Соответственно один, несколько или все из ингибирующих рецепторов контрольной точки принадлежали к CD96 (TACTILE), CD 152 (CTLA4), CD223 (LAG-3), CD279 (PD-1), CD328 (SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT и/или TIM-3.

Метод получения выведенных клеток-естественных киллеров

[0086] Выведенные клетки-естественные киллеры можно получить с помощью нескольких разных методик, известных на существующем уровне техники. Соответственно, CAR CD38 или протеин варианта TRAIL, кодируются полинуклеотидом, вставленным в вирусный вектор. Соответственно, вирусный вектор включает аденовирус, адено-ассоциированный вирус, лентивирус или ретровирус. Соответственно, вирусный вектор включает лентивирус или ретровирус. Соответственно, вирусный вектор включает лентивирус. Соответственно, вирусный вектор включает ретровирус. Вирусный вектор может использоваться для трансдуцирования первичных NK-клеток или линии NK-клеток. Соответственно, вирусный вектор может использоваться для трансдуцирования первичных NK-клеток. Соответственно, вирусный вектор может использоваться для трансдуцирования линии NK-клеток. Соответственно, вирусный вектор может использоваться для трансдуцирования NK-92-клеток. Соответственно, вирусный вектор может использоваться для трансдуцирования KHYG-1-клеток. Соответственно, клетки могут временно трансфицироваться с помощью любого из описанных методов, например, эле ктро импульсного открытия клеточных пор, вирусного вектора или трансфекционного реагента на основе липидов, предназначенных для использования in vivo.

[0087] Соответственно, CAR CD38 или протеин варианта TRAIL, кодируются полинуклеотидом. Соответственно, полинуклеотид представляет собой плазмиду ДНК или линеаризованный полинуклеотид ДНК. Соответственно, полинуклеотид представляет собой молекулу мРНК. Любой из этих полинуклеотидов может вводиться в популяцию первичных NK-клеток или линию NK-клетки посредством эле ктро импульсного открытия клеточных пор. Например, допускается использование платформы MaxCyte Flow Electroporation для генерации выведенных NK-клеток.

[0088] Выеденные клетки-естественные киллеры, включающие делецию или пониженную экспрессию ингибирующего рецептора контрольной точки, можно получить с помощью нескольких разных методик, известных на существующем уровне техники. Рецепторы могут подвергаться делеции или уменьшению с помощью целенаправленно действующего механизма CRISPR/Cas9 (с помощью целенаправленно действующего полинуклеотида). «Руководящая» РНК может трансфицироваться в первичные NK-клетки или линии клеток. Соответственно, «руководящая» РНК трансфицируется в первичные NK-клетки или популяцию первичных клеток, что приводит к понижению экспрессии ингибирующих рецепторов контрольной точки в популяции. Соответственно, «руководящая» РНК трансфицируется в линии NK-клеток. Соответственно, «руководящая» РНК трансфицируется в линию клеток KHYG-1 и выбираются клоны, включающие гомозиготную делецию ингибирующего рецептора контрольной точки.

Метод введения клеток-естественных киллеров

[0089] В настоящем изобретении предусматриваются фармацевтические композиции, включающие составы выведенных NK-клеток, подходящих для внутривенного введения пациенту. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают NK-клетку или множество NK-клеток, экспрессирующих CAR; дополнительно NK-клетка может включать вариант TRAIL или делецию ингибитора контрольных точек. Соответственно, NK-клетка с экспрессией CAR формулируется с приемлемым носителем, дилюентом или эксципиентом для введения. Такие композиции могут включать буферы, такие как нейтральный забуференный физиологический раствор, нормальный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор. Соответственно, фармацевтическая композиция может включать углевод, например, глюкозу, декстрозу, лактозу, галактозу, маннозу, сахарозу или маннитол. Соответственно, фармацевтические композиции включают протеин, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин. Соответственно, фармацевтические композиции включают дополнительные стабилизаторы и консерванты, такие как антиоксиданты; хелатирующие агенты, такие как EDTA или EGTA или глутатион. Соответственно, NK-клетки могут размножаться из замороженного продукта, сохраняемого в глицероле при низкой температуре, например, ниже -70°С. Соответственно, NK-клетки размножаются с помощью цитокинов, таких как интерлейкин-2 и интерлейкин-15, с культивацией в течение недели или более.

[0090] Соответственно, вводимые NK-клетки и клеточные линии подвергаются гамма-облучению перед введением соответствующему лицу. Соответственно, клетки облучаются, чтобы предотвратить их рост и деление in vivo. Соответственно, клетки облучаются при дозе как минимум 5 Ер, 10 Ер, 20 Ер, 30 Ер, 40 Тр, 50 Ер или более. Соответственно, клетки облучаются при дозе максимум 20 Ер, 30 Гр, 40 Ер, 50 Гр, 60 Ер. Соответственно, клетки обрабатываются таким образом, чтобы их период полувыведения in vivo составлял менее 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 дня. Соответственно, клетки и клеточные линии включают «суицидальный» ген, экспрессирующий протеин, который предотвращает деление клеток или является токсичным для клеток, что позволяет сократить период полувыведения или обеспечивает возможность уничтожения клеток при введении соединения. Примеры общих «суицидальных» генов, включая тимидинкиназу вируса герпеса и индуцируемую каспазу 9. Клетки, включающие тимидинкиназу вируса герпеса могут уничтожаться с помощью соответствующих антивирусных препаратов, например, Ацикловира или Ганцикловира.

[0091] Выведенные NK-клетки, которые являются объектом настоящего изобретения, могут вводиться в количестве, достаточном для предотвращения перемещения или вызвать ремиссию определенного ракового заболевания или новообразования. Соответственно, полученные NK-клетки вводятся в количестве, примерно превышающем 1×10⁶ клеток/м², 1×10⁷ клеток/м², 1×10⁸ клеток/м², 1×10⁹ клеток/м² и 1×10¹⁰ клеток/м². Соответственно, NK-клетки вводятся в количестве примерно от 1×10⁶ до 1×10¹⁰ клеток/м². Соответственно, NK-клетки вводятся в количестве примерно от 1×10⁷ до 1×10¹⁰ клеток/м². Соответственно, NK-клетки вводятся в количестве примерно от 1×10⁸ до 1×10¹⁰ клеток/м². Соответственно, NK-клетки вводятся в количестве примерно от 1×10⁹ до 1×10¹⁰ клеток/м². Соответственно, NK-клетки вводятся в количестве примерно от 1×9⁷ до 1×10¹⁰ клеток/м². Соответственно, NK-клетки вводятся в количестве примерно от 1×8⁷ до 1×10¹⁰ клеток/м². Соответственно, NK-клетки вводятся в количестве примерно от 1×9⁸ до 1×10¹⁰ клеток/м². Выведенные NK-клетки могут вводиться ежедневно, еженедельно или ежемесячно. Соответственно, на еженедельной основе клетки вводятся в течение двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати и более недель. Соответственно, после еженедельного введения выведенные NK-клетки могут вводиться ежемесячно для поддержания достаточного уровня. Клетки могут вводиться способом, подходящим для определенного ракового заболевания. Например, в случае гематологической злокачественной опухоли клетки могут вводиться внутривенно. Например, в случае солидной опухоли тканей для введения клеток может применяться внутриопухолевый или внутрибрюшинный способ.

Вспомогательные лекарственные средства при лечении

[0092] Введение вспомогательного лекарственного средства при лечении перед, в процессе или после введения выведенной NK-клетки может увеличить эффективность лечения. Соответственно, вспомогательное лекарственное средство включает интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-12 (IL-12), интерлейкин-15 (IL-15) или ингибитор протеасом. Соответственно, ингибиторы протесаом представляют собой Бортезомиб, Карфилзомиб, Иксазомиб или их комбинацию. Соответственно, любой из IL-2, IL-8, IL-12, IL-15 или ингибитор протеасом можно вводить пациенту перед введением выведенной NK-клетки. Соответственно, любой из IL-2, IL-8, IL-12, IL-15 или ингибитор протеасом можно вводить пациенту в процессе введения выведенной NK-клетки. Соответственно, любой из IL-2, IL-8, IL-12, IL-15 или ингибитор протеасом можно вводить пациенту после введения выведенной NK-клетки. Соответственно, активность IL-2, IL-8, IL-12, IL-15 может обеспечиваться с помощью неинтерлейкинового агониста, для рецепторов L-2, IL8, IL-12 и IL-15. Например, агонист интерлейкина-12 может быть ALT-803 или ALT-801; агонист интерлейкина-15 может быть NIZ985.

[0093] Соответственно, выведенная NK-клетка может выдерживаться с интерлейкином-12, интерлейкином-15 или ингибитором протеасом перед введением выведенной NK-клетки. Соответственно, NK-клетка CAR CD38 может выдерживаться с интерлейкином-12, интерлейкином-15 или Бортезомибом перед введением. Соответственно, NK-клетка с вариантом TRAIL может выдерживаться с IL-2, IL-8, IL-12, IL-15 или ингибитором протеасом перед введением. Соответственно, выдержка длится как минимум 4, 6, 8, 12 или 24 часа.

[0094] Методы лечения по настоящему изобретению предусматривают введения малой дозы циклофосфамида в качестве вспомогательного лекарственного средства для улучшения лечения посредством выведенных NK-клеток. Циклофосфамид может вводиться перорально и внутривенно. Соответственно, ввод циклофосфамида осуществляется периодически, например, последовательными небольшими дозами. Соответственно, циклофосфамид вводится перорально при дозе примерно от 100 мг до 250 мг в день или через день в течение одной, двух, трех, четырех или более недель. Соответственно, циклофосфамид вводится перорально при дозе примерно 50 мг в день в течение одной, двух, трех, четырех или более недель. Соответственно, циклофосфамид вводится внутривенно при дозе примерно от 1000 мг до 250 мг в неделю в течение одной, двух, трех, четырех или более недель. Соответственно, циклофосфамид вводится внутривенно при дозе примерно 750 мг, 500 мг и 250 мг или менее в неделю в течение одной, двух, трех, четырех или более недель. Соответственно, циклофосфамид вводится перед введением выведенных NK-клеток и прекращается сразу после введения NK-клеток. Соответственно, циклофосфамид вводится для взаимодействия с введением выведенных NK-клеток на один, два, три, четыре, пять или шесть месяцев. Соответственно, циклофосфамид вводится одновременно с введением выведенных NK-клеток.

[0095] Методы лечения по настоящему изобретению предусматривают введение ингибитора металлопротеиназы в качестве вспомогательного лекарственного средства для улучшения лечения посредством выведенных NK-клеток. Соответственно, ингибитор металлопротеиназы представляет собой тетрациклиновый антибиотик, такой как Доксициклин, Миноциклин, Тайгециклин, Демеклоциклин, Метациклин, Хлортетрациклин, Окситетрациклин, Лимециклин, Меклоциклин или Ролитетрациклин. Соответственно, тетрациклиновый антибиотик представляет собой Доксициклин. Соответственно, лица, проходящие лечение с применением выведенных NK-клеток по настоящему изобретению, предварительно или параллельно проходят лечение с применением Доксициклина при концентрации примерно от 50 мг до 300 мг в день или при концентрации примерно от 100 мг до 200 мг в день. Доксициклин может вводиться перорально и внутривенно. Соответственно, лица могут проходить лечение с применением Доксициклина одновременно с применением выведенных NK-клеток.

[0096] Методы лечения по настоящему изобретению предусматривают дополнительные вспомогательные лекарственные средства, которые сенсибилизируют клетки для уничтожения NK-клетками и могут вводиться пациенту вместе с выведенными NK-клетками или отдельно. Например, раковая клетка может быть устойчивой к апоптозу, вызванному TRAIL. Соответственно, вспомогательное лекарственное средство представляет собой малую молекулу, которая восстанавливает восприимчивость к апоптозу, вызванному TRAIL. Соответственно, соединение представляет собой миметик SMAC, например, TL32711, LCL161, GDC-0917, HGS1029; ингибитор NF-кВ, например, (-)-DHMEQ, PBS-1086, IT-603 или IT-901; гистонде ацетил азу, например, MLN4924; ингибитор гистондеацетилазы (HDAC), например, Панобиностат, Вориностат, Ромидепсин, Хидамид, Белиностат, Вальпроевая кислота, Моцетиностат, Абексиностат, Энтиностат, SB939, Гивиностат, Квизиностат, Ресминостат. Также предусматривается вспомогательное лекарственное средство, которое представляет собой ингибитор апоптоза, ингибирующий протеин, например: ингибитор BCL-2, например, Венетоклакс (АВТ-199) или Обатоклакс (GX15-070); ингибитор сурвивина, например, YM15 или шефердин. Соответственно, вспомогательное лекарственное средство вводится перед введением выведенной NK-клетки. Соответственно, вспомогательное лекарственное средство вводится одновременно с введением выведенных NK-клеток.

Терапевтические показания

[0097] Выведенные клетки-естественные киллеры, экспрессирующие CAR CD38, по настоящему изобретению полезны для терапевтического воздействия на рак. Соответственно, раковое заболевание включает гематологическиую злокачественную опухоль (системы крови). Соответственно, гематологическая злокачественная опухоль включает множественную миелому, вялотекущую множественную миелому или миелому легкой цепи. Соответственно, гематологическая злокачественная опухоль относится к лейкозу. Соответственно, лейкоз включает острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелолейкоз, лейкоз ворсистых клеток, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз или лейкоз из больших зернистых лимфоцитов.

[0098] Соответственно, раковое заболевание, подлежащее лечению солидная опухоль тканей. Соответственно, солидная опухоль тканей представляет собой опухоль печени, включая гепатоцеллюлярную карциному; опухоль легкого; немелкоклеточный рак легкого; опухоль поджелудочной железы, включая аденокарциному или ацинозно-клеточную карциному поджелудочной железы; рак кишечника; рак желудка; рак почки, включая почечноклеточный рак (RCC) и переходно-клеточный рак (ТСС, также известен как карциома уротелиальной клетки); рак яичников; рак предстательной железы; рак молочной железы; или рак шейки матки.

Общая информация о химерных антигенных рецепторах

[0099] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень связывания лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор. Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и К201Н. Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор и вариантную молекулу TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор и вариантную молекулу TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор и вариантную молекулу TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор и вариантную молекулу TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор и вариантную молекулу TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, которая включает химерный антигенный рецептор и вариантную молекулу TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

Раковые специфические антигены

[00100] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и К201Н. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с раковым специфическим антигеном и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

Антигены, специфические для рака крови

[00101] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень связывания лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с антигеном, специфическим для рака крови, и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD319

[00102] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD319/SLAMF-7 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

TNFRSF17

[00103] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина НЕСА, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с TNFRSF17/BCMA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD123

[00104] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и К201Н. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD123/IL3-RA и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD138

[00105] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с SYND1/CD138 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD229

[00106] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD229 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD47

[00107] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD47 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD20

[00108] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень связывания лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD20 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD19

[00109] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD19. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD 19, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD19, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD19, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD19 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD19 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD19 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD 19 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD19 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD19 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD22

[00110] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD22 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

MUC1

[00111] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

MUC16

Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с MUC16 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

Her2/Neu

[00112] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и К201Н. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека; при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с Her2/Neu и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR)

[00113] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с EGFR и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

Мезотелин

[00114] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с мезотелином и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CLL-1

[00115] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и К201Н. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CLL-1 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD38

[00116] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD38 (SEQ ID №: 1 и 2)

[00117] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 2. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 1, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 2. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 1, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 2. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1, и последовательность аминокислот, идентичную изложенной в SEQ ID №:2. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 1, и последовательность аминокислот, идентичную изложенной в SEQ ID №: 2. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD38 (SEQ ID №: 3 и 4)

[00118] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 3, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 3, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3, и последовательность аминокислот, идентичную изложенной в SEQ ID №: 4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 3, и последовательность аминокислот, идентичную изложенной в SEQ ID №: 4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

CD38 (SEQ ID №: 5 и 6)

[00119] Соответственно, в настоящем документе описываются NK-клетки. Соответственно, выведенная NK-клетка демонстрирует высокий уровень лиганда для Е-селектина. Соответственно, выведенные NK-клетки, демонстрирующие высокий уровень лиганда для Е-селектина, показывают уровень связывания НЕСА-452, превышающий уровень клетки NK-92. Соответственно, выведенная NK-клетка включает химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 6. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 5, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 95% идентична указанной в SEQ ID №: 6. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 5, и последовательность аминокислот, которая как минимум на 98% идентична указанной в SEQ ID №: 6. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5, и последовательность аминокислот, идентичную изложенной в SEQ ID №: 6. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, включает целенаправленно воздействующий домен CAR, содержащий последовательность аминокислот, которая на 90% идентична указанной в SEQ ID №: 5, и последовательность аминокислот, идентичную изложенной в SEQ ID №: 6. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает три мутации аминокислот: G131R, N199R и K201H. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38, дополнительно включает вариантную молекулу TRAIL человека, при этом вариантная молекула TRAIL человека включает две мутации аминокислот: D269H и E195R. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии молекулы ингибитора контрольных точек. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD96 (TACTILE). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD328 (SIGLEC7). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CTLA-4. Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии CD279 (PD-1). Соответственно, выведенная NK-клетка, включающая химерный антигенный рецептор, который специфически связывается с CD38 и вариантной молекулой TRAIL человека, дополнительно включает делецию или снижение экспрессии как минимум двух ингибиторов контрольных точек, выбранных из CD96 (TACTILE), CD328 (SIGLEC7), CTLA-4 и CD279 (PD-1).

[00120] Настоящее изобретение обеспечивает, в частности, следующие варианты осуществления:

Фармацевтическая композиция, включающая выведенную естественную клетку-киллера, при этом выведенная естественная клетка-киллер преимущественно демонстрирует высокий уровень экспрессии лиганда для Е-селектина на клеточной поверхности, при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR).

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер включает множество выведенных естественных клеток-киллеров, более 25% которых демонстрируют положительную реакцию на связь с антигеном посредством антитела НЕСА-452.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует низкий уровень экспрессии рецептора TRAIL на клеточной поверхности, при этом рецептор TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5).

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер включает первичную выведенную естественную клетку-киллера.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер включает трансформированную линию первичной естественной клетки-киллера.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что трансформированная линия естественных клеток-киллеров представляет собой линии клеток NK-92 или KHYG-1.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что трансформированная линия естественных клеток-киллеров представляет собой линию клеток KHYG-1.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR специфически связывается с раковым антигеном.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что раковый специфический антиген включает антиген, специфический для рака крови.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что антиген, специфический для рака крови, включает CD38.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 80% идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая по крайней мере идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 1 и 2.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 1 и 2.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 1 и 2.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая идентична указанной в композициях SEQ ID №: 1 и 2.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 3 и 4.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 3 и 4.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 3 и 4.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая идентична указанной в композициях SEQ ID №: 3 и 4.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 5 и 6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 5 и 6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 5 и 6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая идентична указанной в композициях SEQ ID №: 5 и 6.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает в себя трансмембранный домен, получаемый из альфа-белка CD8 человека. Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает DAP 10, DAP12, 2В4 (CD244), или человеческий белок 4-1ВВ.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает человеческий белок 4-1ВВ.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает человеческий дзета-белок CD3.

Вариант осуществления фармацевтической композиции отличающийся тем, что CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, полученный из антитела, которое демонстрирует более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб.

Вариант осуществления фармацевтической композиции дополнительно включает второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

36. Вариант осуществления фармацевтической композиции по п.п. 1-35 дополнительно включает мутантный полипетид TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL), при этом мутантный полипептид TRAIL приводит к более интенсивной сигнализации или обладает увеличенной аффинностью связывания с лигандом TRAIL.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что лиганд TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5).

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что мутантный полипептид TRAIL включает мутацию D269H/E195R человеческого TRAIL. Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что мутантный полипептид TRAIL включает мутацию G131R/N199R/K201H человеческого TRAIL.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR или мутантный полипептид TRAIL встраивается в геном выведенной естественной клетки-киллера.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер дополнительно включает делецию или уменьшение активности ингибирующего рецептора контрольной точки.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT или TIM-3.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD96, CD152, или CD328.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD96.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD152.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD328.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что выполняется полная или частичная делеция ингибирующего рецептора контрольной точки из генома выведенной естественной клетки-киллера или его разрыв посредством вставки или делеции одного или нескольких нуклеотидов на хромосомном уровне.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер дополнительно включает малую интерферирующую РНК, которая выявляет ингибирующий рецептор контрольной точки.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, дополнительно включает в себя фармацевтически приемлемый носитель, стабилизирующий агент или эксципиент.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция формулируется для интраперитонеального введения. Вариант осуществления фармацевтической композиции, где она формулируется для внутривенного введения.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, где она применяется в лечении раковых заболеваний.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что к раковым заболеваниям относятся лейкемия, лимфома или миелома.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что к раковым заболеваниям относится множественная миелома.

Настоящее изобретение обеспечивает, в частности, также способ лечения рака, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, включающей в себя выведенную естественную клетку-киллера, при этом выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует высокий уровень экспрессии лиганда для Е-селектина на клеточной поверхности, при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR).

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер включает множество выведенных естественных клеток-киллеров, более 25% которых демонстрируют положительную реакцию на связь с антигеном посредством антитела НЕСА-452.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует низкий уровень экспрессии рецептора TRAIL на клеточной поверхности, при этом рецептор TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5).

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер включает первичную выведенную естественную клетку-киллера.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер включает трансформированную линию первичной естественной клетки-киллера.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что трансформированная линия естественных клеток-киллеров представляет собой линии клеток NK-92 или KHYG-1.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что трансформированная линия клеток - естественных киллеров представляет собой линию клеток KHYG-1.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR специфически связывается с раковым антигеном.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что раковый специфический антиген включает антиген, специфический для рака крови.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что антиген, специфический для рака крови, включает CD38.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 80% идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 1 и 2.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 1 и 2.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 1 и 2.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая идентична указанной в композициях SEQ ID №: 1 и 2.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 3 и 4.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 3 и 4.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 3 и 4.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая идентична указанной в композициях SEQ ID №: 3 и 4.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 90% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 5 и 6.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 95% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 5 и 6.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая как минимум на 98% идентична указанной в композициях SEQ ID №: 5 и 6.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая идентична указанной в композициях SEQ ID №: 5 и 6.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает в себя трансмембранный домен, получаемый из человеческого белка CD8.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает в себя DAP 10, DAP12, В4 (CD244) или человеческий белок 4-1ВВ.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает человеческий белок 4-1ВВ.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает человеческий дзета-белок CD3.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выведенная клетка-естественный киллер включает второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выведенная клетка-естественный киллер включает мутантный полипетид TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL), при этом мутантный полипептид TRAIL приводит к более интенсивной сигнализации или обладает увеличенной аффинностью связывания с лигандом TRAIL.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что лиганд TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5).

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что мутантный полипептид TRAIL включает мутацию D269H/E195R человеческого TRAIL.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что мутантный полипептид TRAIL включает мутацию G131R/N199R/K201H человеческого TRAIL.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR или мутантный полипептид TRAIL встраивается в геном выведенной клетки-естественного киллера.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выведенная клетка - естественный киллер дополнительно включает делецию или уменьшение активности ингибирующего рецептора контрольной точки.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD85d, CD85j, CD96, CD152, CD159a, CD223, CD279, CD328, SIGLEC9, TIGIT или TIM-3.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD96, CD152, или CD328.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD96.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD152.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки включает в себя CD328.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выполняется полная или частичная делеция ингибирующего рецептора контрольной точки из генома выведенной естественной клетки-киллера или его разрыв посредством вставки или делеции одного или нескольких нуклеотидов на хромосомном уровне.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер дополнительно включает малую интерферирующую РНК, которая выявляет ингибирующий рецептор контрольной точки.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что ингибирующий рецептор контрольной точки подвергается делеции из генома выведенных естественных клеток-киллеров.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция включает в себя фармацевтически приемлемый носитель, стабилизирующий агент или эксципиент.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция формулируется для внутривенного введения.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция формулируется для интраперитонеального введения.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что к раковым заболеваниям относятся лейкемия, лимфома или миелома.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что к раковым заболеваниям относится множественная миелома.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция вводится до, во время или после введения ингибитора протеасом.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция вводится до, во время или после курса лечения с периодическим приемом циклофосфамида в малых дозах.

Настоящее изобретение обеспечивает, в частности, также способ получения фармацевтической композиции, включающей в себя выведенную естественную клетку-киллера, при этом выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует высокий уровень экспрессии лиганда для Е-селектина на клеточной поверхности, при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR), при этом способ включает выдерживание естественной клетки-киллера с полинуклеотидом, кодирующим CAR.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что выведенная клетка-естественный киллер включает множество выведенных клеток-естественных киллеров, более 25% которых демонстрируют положительную реакцию на связь с антигеном посредством антитела НЕСА-452.

Способ в варианте, отличающийся тем, что выведенная клетка - естественный киллер демонстрирует низкий уровень экспрессии рецептора TRAIL на клеточной поверхности, при этом рецептор TRAIL включает TNFRSF10A (DR4) или TNFRSF10B (DR5). Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выведенная клетка - естественный киллер включает первичную выведенную клетку - естественного киллера. Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что выведенная клетка - естественный киллер включает трансформированную линию первичной клетки - естественного киллера.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что трансформированная линия клеток - естественных киллеров представляет собой линии клеток NK-92 или KHYG-1.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что раковый специфический антиген включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает в себя трансмембранный домен, получаемый из полипептида человека CDS-альфа. Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает внутриклеточный домен, включающий DAP10, DAP12, 2В4 (CD244), или человеческий белок 4-1ВВ.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает полипептид человека 4-1ВВ.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает полипептид человека CD3-дзета.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR включает в себя целенаправленно воздействующий домен, который получается из антитела, демонстрирующего более низкую аффинность к CD38, чем Даратумумаб. Способ в вариантах осуществления дополнительно включает выдерживание выведенной естественной клетки-киллера с полинуклеотидом, кодирующим второй химерный антигенный рецептор, представляющий собой CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, мезотелин, ЕрСАМ, MUC1, MUC16, антиген Tn, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1 или HERV-K.

Способ в вариантах осуществления дополнительно включает выдерживание выведенной клетки - естественного киллера с полинуклеотидом, кодирующим мутантный полипетид TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL), при этом мутантный полипептид TRAIL приводит к более интенсивной сигнализации или обладает увеличенной аффинностью связывания с лигандом TRAIL.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что CAR или мутантный полинуклеотид TRAIL встраивается в геном выведенной естественной клетки-киллера.

Способ в вариантах осуществления дополнительно включает выдерживание выведенной клетки-естественного киллера с полинуклеотидом, обеспечивающим делецию или снижение активности ингибирующего рецептора контрольной точки.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что полинуклеотид включает вирусный вектор.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирус.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой ретровирус.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что полинуклеотид включает мРНК.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что полинуклеотид встраивается в геном выведенной клетки - естественного киллера.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что клетка подвергается химической обработке для увеличения ее фукозилирования.

Способ в вариантах осуществления, отличающийся тем, что дополнительно включает смешивание выведенных естественных клеток-киллеров с фармацевтически приемлемым носителем, стабилизирующим агентом или эксципиентом.

Настоящее изобретение обеспечивает, в частности, также фармацевтическую композицию, включающую выведенную естественную клетку-киллера, при этом выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует экспрессию протеина FUT6 или FUT7, при этом выведенная клетка - естественный киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR).

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что выведенная естественный клетка-киллер включает экзогенный полинуклеотид, кодирующий протеин FUT6 или FUT7.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF 17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1.

Вариант осуществления фармацевтической композиции, отличающийся тем, что CAR включает последовательность аминокислот целенаправленно воздействующего домена, которая идентична указанной в любой из композиций SEQ ID №: 1-6.

Настоящее изобретение обеспечивает, в частности, также способ лечения рака, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, включающей в себя выведенную естественную клетку-киллера, при этом выведенная естественная клетка-киллер демонстрирует экспрессию протеина FUT6 или FUT7, при этом выведенная естественная клетка-киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR).

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что выведенная естественная клетка-киллер включает экзогенный полинуклеотид, кодирующий протеин FUT6 или FUT7.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что CAR специфически связывается с раковым антигеном.

Настоящее изобретение обеспечивает, в частности, также способ получения фармацевтической композиции, включающей себя выведенную клетку - естественного киллера, при этом выведенная клетка - естественный киллер демонстрирует экспрессию протеина FUT6 или FUT7, при этом выведенная клетка-естественный киллер включает химерный антигенный рецептор (CAR), при этом метод включает выдерживание клетки - естественного киллера с полинуклеотидом, кодирующим CAR.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что выведенная-клетка естественный киллер включает экзогенный полинуклеотид, кодирующий протеин FUT6 или FUT7.

Способ в варианте осуществления, отличающийся тем, что антиген, специфический для рака крови, включает CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF 17/ВСМА, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, или CLL-1.

ПРИМЕРЫ

[00121] Данное изобретение иллюстрируется с помощью примеров со ссылкой на прилагаемые фигуры.

Пример 1. Линия NK-клеток KHYG-1 демонстрирует более высокий уровень экспрессии лигандов для Е-селектина, чем линия клеток NK-92.

[00122] Для определения экспрессии лигандов для Е-селектина на различных линиях NK-клеток было проведено выращивание клеток NK-92 и KHYG-1 в среде RPMI 1640, дополненной 10% FBS и IL-2 в концентрации 10 нг/мл. Клетки брали из культуры, промывали и окрашивали РЕ-конъюгированным антителом НЕСА-452 или РЕ-антителом изотипического контроля. Затем клетки были расположены на проточном цитометре и определялась средняя интенсивность флуоресценции (MFI) для каждой линии клеток по сравнению с контролем. Фиг. 2А представляет собой наглядный эксперимент и показывает, что клетки KHYG-1 демонстрируют более высокую реактивность НЕСА-452 202 по сравнению с изотопическим контролем 201 (MFI 2772 в сравнении с 221). Фиг. 2В представляет противоположный результат для клеток NK-92, которые демонстрируют низкую реактивность НЕСА-452 204 по сравнению с изотопическим контролем 203 (MFI 545 в сравнении с 121).

Пример 2. Линия NK-клеток KHYG-1 демонстрирует фенотип in vitro лиганда для Е-селектина с пониженным уровнем.

[00123] Для определения, была ли повышенная реактивность НЕСА-452, преобразованная в фенотипическое различие миграции клеток KHYG-1 и NK-92, исследована in vitro. Сначала исследовали миграцию по градиенту со стромальным фактором-1 (SDF-1). На фиг. 3 показано, что клетки KHYG-1 (левая полоса) демонстрировали приблизительно 6-кратное увеличение миграции по сравнению с клетками NK-92 (правая полоса). Кроме того, контролировалась миграция в проточной ячейке, покрытой Е-селектином. На фиг. 4А и В показаны изображения отдельного кадра из видеозаписи во время анализа проточной ячейки. На фиг. 4А показано, что многие клетки KHYG-1 являются неподвижными или демонстрируют очень медленное движение при анализе проточной ячейки (звездочки). И наоборот, на фиг. 4В показано, что поток NK-92 беспрепятственно проходит через каркас проточной ячейки.

Миграционный анализ

[00124] Клетки логарифмической фазы NK-92 или KHYG1 отбирали, промывали и суспендировали в бессывороточной культуральной среде (RPMI1640 для KHYG1, аМЕМ для NK-92), содержащей 10 нг/мл IL-2 для обеднения в течение 4 часов. 600 мкл бессывороточной культуральной среды, содержащей 100 нг/мл SDF1 и 10 нг/мл IL-2, добавляли в каждую лунку (для 12-луночного планшета), затем 100 мкл обедненной суспензии клеток добавляли в верхние миграционные камеры с размером пор 5,0 мкм (Costar; Coming). Затем клетки культивировали в течение 4 часов при температуре 37°С в инкубаторе CO₂. Через 4 часа среду в нижнем отсеке (содержащую мигрированные клетки) собирали, а количество клеток подсчитывали с помощью проточного цитометра BD Accuri™ С6.

Анализ проточной ячейки/роллинга

[00125] Анализ роллинга проводился в 8-канальных микрофлюидных биочипах (Cellix Limited, Дублин, Ирландия) с использованием Mirus Evo NanoPump (Cellix Limited). Каналы биочипа Vena8 Fluoro+ (Cellix Limited) были покрыты 15 мкг/мл Е-селектина (PeProtech, Роки Хилл, США) в Трис-HCl с рН 7,4 с добавлением 1 мМ CaCl₂ и выдерживали на протяжении ночи при температуре 4°С. Каждый канал блокировали с помощью 1% BSA (альбумин бычьей сыворотки) или, где указано, 15 мкг/мл анти-Е-селектин-блокирующего антитела (клон BBIG-E1, R&D System; Миннеаполис, США) и выдерживали при температуре 37°С 1 ч перед анализом. Клетки промыли и повторно растворили в буфере для анализа роллинга (среда RPMI 1640 без фенолового красного с добавлением 1% термоинактивированной FBS (эмбриональной телячьей сыворотки), 5 мМ ГЭПЭС и 1 мМ CaCl₂) при 2×10⁶ клеток/мл. 80 мкл суспензии клеток добавляли в микроканалы, а анализ роллинга проводили при 0,5 дин/см² при комнатной температуре. Клетки контролировали в 5 различных положениях вдоль канала с использованием линзы объектива A-Plan 10X/0,25 (Carl Zeiss Microscopy GmbH; Йена, Германия) микроскопа AX10Vert.A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH). 30 кадров на положение было сделано с интервалом 0,5 с, с помощью 12-битной камеры 01 QIClick F-M-12 Mono (QImaging; Суррей, Канада). Изображения получили с использованием программного обеспечения для анализа Vena Flux (Cellix Limited) и анализировали с использованием программного обеспечения Image-Pro Premiere (Media Cybernetics; Роквилл, США). Клетка роллинга была определена как клетка, проходящая расстояние, соответствующее значению больше диаметра. Было подсчитано общее количество клеток в 5 различных положениях на канал, затем было рассчитано среднее количество всех каналов.

Пример 3. Возврат линии NK-клеток KHYG-1 in vivo

[00126] В мышиной модели in vivo мы будем отслеживать возврат NK-клеток в отдаленные ниши костного мозга. Это будет сделано с помощью конфокальной микроскопии in vivo или проточного цитометрического анализа в области костного мозга. Линиями клеток, которые необходимо проанализировать для возврата в костный мозг, будут KHYG-1 (высокий уровень связывания НЕСА-452) и NK-92 (низкий уровень связывания НЕСА-452). Обе линии клеток будут введены в организм мыши, но будут помечены двумя разными флуорофорами для проведения конкурентного анализа возврата в костный мозг. Мы будем наблюдать за одной временной точкой, например, 4, 8, 12 или 24 часа.

[00127] NK-клетки будут помечены флуоресцентными красителями (красители Calcein AM или CellTracker). Затем возврат к ВМ будет отображаться in vivo с использованием конфокальной системы Zeiss 710 (Carl Zeiss Microimaging, Йена, Германия) или количественно с использованием проточного цитометра FACS Aria II. В конфокальной области кожный лоскут будет взят с кожи головы мышей, чтобы обнажить нижнюю дорсальную поверхность черепа. Изображения опухолей будут получены приблизительно за 1 час с помощью конфокальной микроскопии in vivo. Изображения с клеточной детализацией будут получены через неповрежденный череп мыши на глубине до 250 мкм от поверхности черепа с использованием объектива Plan-Аро 10х 0,45NA (Carl Zeiss Microimaging). Глубина изображения будет обеспечена в нескольких точках, а в Image J будет обеспечена z-проекция с максимальной интенсивностью для объединения изображений. GFP будет обеспечивать возбуждение с использованием линии 488 нм на аргоновом лазере. Кровеносные сосуды будут отображаться с использованием голубого Эванса (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) с возбуждением с использованием лазера 633 нм. Сигналы о выделении будут собраны внутренними конфокальными детекторами Quasar Zeiss.

Пример 4. Эффективность NK-клеток с экспрессией CAR CD38 in vivo в отношении множественной миеломы

Трансдуцирование клеток KHYG-1 с CAR CD38 с высокой, средней и низкой аффинностью

[00128] Структуры CAR CD38 второго поколения генерируются с целенаправленно воздействующими доменами с различной аффинностью: высокой, средней и низкой. CAR также включает костимулирующий домен CD3ζ и 4-1 ВВ и связан последовательностью 2А с ΔNGFR (маркерный ген, который будет использоваться для отслеживания клеток, трансдуцированных CAR) с отделением в качестве маркера трансдукции. CAR CD38 с различной аффинностью будут генерироваться в виде ленти или ретровирусных структур, поскольку неизвестно, какой тип структур будет лучше трансдуцировать клетки KHYG-1. Мы будем использовать последовательности для целенаправленно воздействующего домена CAR, полученного из SEQ ID №: 1-6. В зависимости от результатов контрольных экспериментов, в процессе которых мы будем решать эту проблему, мы будем трансдуцировать клетки KHYG-1 с использованием различных структур CAR CD38 и отбирать их для обеспечения высокой степени чистоты, чтобы проверить их функциональную эффективность в отношении линий клеток множественной миеломы (ММ), как описано ниже.

[00129] На этапе функционального испытания мы будем контролировать клетки KHYG-1, трансдуцированные CAR, на предмет разрастания и наращивания (подсчет клеток), экспрессии CD16, CD56, CD3, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1 и NKG2A в день 0, неделя 1,3 и 6 (в конце наращивания). Также будет исследована экспрессия маркера апоптоза с аннексином V. Другим важным фенотипическим параметром является экспрессия CD38, поскольку мы заметили, что Т-клетки CAR не экспрессируют CD38, несмотря на их активированный статус. Затем мы оценим их способность к CD38-зависимому пролиферативному и цитокиновому выделению (IFNγ и TNFα) в отношении клеток CD38+ ММ (анализы CFSE). Анализы цитотоксичности на основе BLI будут использоваться для определения цитотоксичной активности NK-клеток CAR CD38 в отношении различных линий клеток ММ, трансдуцированных люциферазой. Кроме того, мы будем использовать чувствительную линию K562 NK-клеток в качестве клетки-мишени.

[00130] CD38-зависимую дегрануляцию NK-клеток при стимуляции UM9 (высокий уровень CD38) в сравнении с U266 (CD38-отрицательный) будут оценивать путем анализа регуляции CD107a с повышением на поверхности ΔNGFR-позитивных NK-клеток CAR посредством проточной цитометрии. Цитотоксичная реактивность в отношении первичных клеток ММ будет оцениваться при анализах цитотоксичности на основе FACS с использованием BMMNC, полученных от пациентов, как описано ранее. Вкратце, NK-клетки CAR CD38 будут подвержены совместной культивации с BMMNC, содержащими 5-50% клеток ММ на различных соотношениях эффектора с мишенью. Через 24-48 часов жизнестойкость клеток ММ будет оцениваться путем подсчета CD138-положительных плазматических клеток посредством количественной проточной цитометрии. Цитотоксичная активность будет получена из этих данных о жизнестойкости, как описано ранее.

[00131] На этом этапе исследований также важно определить реактивность в отношении незлокачественных CD38-позитивных гемопоэтических клеток. Она будет оцениваться путем проведения анализов цитотоксичности на основе FACS с использованием РВМС или BMMNC здоровых особей или пациентов. После совместной выдержки NK-клеток CAR CD38 с РВМС или BMMNC в течение 24-48 часов, жизнестойкость незлокачественных гемопоэтических клеток; включая CD34 + гемопоэтические клетки-предшественники (только в образцах BMMNC), CD3 + Т-клетки, CD14 + моноциты, CD56 + NK-клетки CD19/20 + В-клетки, будет определена при количественных анализах FACS на одной платформе. Во всех этих анализах в качестве негативного контроля будут использоваться NK-клетки, трансдуцированные ложным вектором, а ранее созданные Т-клетки CAR CD38 будут использоваться в качестве положительного контроля.

Трансдуцирование наиболее оптимальной клетки NK-92 CAR CD38 с вариантом TRAIL (TRAILv) и TRAIL дикого типа (TRAILwt).

Трансдуцирование наиболее оптимальной клетки KHYG-1 CAR CD38 с TRAILv и TRAIL wt.

[00132] NK-клетки CAR CD38, которые лучше всего убивают клетки ММ, не затрагивая нормальные клетки CD38+, будут отобраны и в дальнейшем трансдуцированы с использованием вариантов структур TRAIL дикого типа и TRAIL. При аналогичном установочном параметре, описанном выше, эти клетки будут тестироваться на линиях клеток MM DR5+CD38+, DR5+CD38-, DR5-CD38+, DR5-, CD38- для сравнения CD38 и DR-5-зависимой цитотоксичной активности и сравнения специфичности клеток-мишеней. Первичные клетки ММ также будут изучены на предмет чувствительности к этим клеткам. Для создания индуцируемой структуры TRAILv мы будем клонировать ген TRAILv в малоэффективной по репликации псевдотипированной самоактивирующейся лентивирусной структуре VSV-g под управлением минимального (m)CMV-промотора и тандемных повторов элемента транскрипционного отклика NFAT (TRE). Таким образом, мы обеспечим быструю индукцию TRAILv при стимуляции CAR, что вызывает экспрессию генов под управлением NFAT. Следовательно, при стимуляции CAR домен CD3zeta активирует NFAT, который затем вызывает быстрый перенос и последующую экспрессию TRAILv. Образованные клетки сначала будут оцениваться для CAR CD38-зависимой экспрессии TRAILv. После изучения кинетики включения/выключения этого индуцируемого гена, при аналогичном установочном параметре, описанном выше, будет проведено исследование клеток на предмет способности уничтожения линий клеток DR5+CD38+, DR5+CD38-, DR5-CD38+, DR5-, CD38- и первичных клеток ММ.

Оценка эффективности антител ММ лучших CAR CD38 in vivo и MM в сравнении с нормальной отличительной способностью гемопоэтических клеток

[00133] На этом этапе мы определим безопасность in vivo и эффективность антител ММ лучших NK-клеток CAR CD38 in vitro. Активность NK-клеток, трансдуцированных с лучшей CAR CD38 (и TRAILv) in vivo, будет оцениваться в нашей недавно разработанной модели ксенотрансплантата на основе Rag2-/-γc-/--, в которой опухоли ММ человека растут в гуманизированной микросреде, которая создается посредством подкожной инокуляции каркасов, которые покрыты MSC, полученными из костного мозга человека. Вкратце, в этой модели CD38-положительные опухоли UM-9 и CD38-отрицательные опухоли U266 ММ образуются в гуманизированной микросреде ВМ. После демонстрации приживления опухолей ММ в гуманизированных каркасах BLI (обычно через 1-2 недели после инокуляции) лечение мышей будет проводиться с использованием NK-клеток CAR CD38 iCasp9. Клетки будут введены внутривенно или внутри каркаса в увеличивающихся дозах (общая доза - 3, 6 и 30×10⁶ клеток/мышей, внутривенно; 1,5, 3, 9×10⁶ клеток, внутри каркаса). Общая доза NK-клеток CAR будет разделена на три, каждая доза будет вводиться с интервалом в одну неделю. Опухолевая масса будет контролироваться BLI. Ложно-трансдуцированные NK-клетки и Т-клетки CAR CD38 будут использоваться в качестве негативного и положительного контроля, соответственно.

Пример 5. Протокол терапии множественной миеломы рецепторами NK-клеток CAR CD38

[00134] Как отмечалось ранее, NK-клетки CAR CD38 можно вводить людям, у которых обнаружили рак различного типа. Следующий протокол был разработан для использования при лечении пациентов с множественной миеломой. После того как у пациента был диагностирован CD38-положительны и рак, например, множественная миелома, перед введением в организм пациента аликвоту модифицированных NK-клеток можно подвергать оттаиванию и культивации. В альтернативном варианте временная трансфекция может быть получена с использованием лентивируса с полинуклеотидом, кодирующим CAR CD38, или электроимпульсного открытия клеточных пор с мРНК с кодировкой CAR, как описано в настоящем документе. Для электроимпульсного открытия клеточных пор платформа MaxCyte Flow Electroporation предусматривает соответствующее решение для обеспечения в клинике быстрых крупномасштабных трансфекций. После трансфекции экспрессирующей NK-клетки CAR CD38 ее культивируют для обеспечения экспрессии CAR и затем вводят в организм пациента внутривенно.

Пример 6. Эффективность in vitro для экспрессирующих NK-клеток варианта TRAIL в отношении множественной миеломы и острого миелогенного лейкоза

[00135] Множественная миелома (ММ), острый миелоидный лейкоз (AML) и почечноклеточный рак (RCC) являются деструктивными и часто смертельными злокачественными новообразованиями. RCC, MM и AML чувствительны к цитотоксичности NK-клеток посредством множества эффекторных путей, включая TRAIL NK-клеток. Обработка злокачественных клеток препаратом Бортезомиб вызывает повышение экспрессии DR5 на многих злокачественных новообразованиях и повышает их чувствительность к TRAIL-зависимому апоптозу. Важным является то, что NK-клетки, расширенные ex vivo с использованием EBV-LCL, в значительной степени вызывают повышение поверхностной экспрессии TRAIL, дополнительно увеличивая опосредованное NK-клетками уничтожение опухолей, подвергнутых обработке препаратом Бортезомиб. Таким образом; генетическая модификация NK-клеток для экспрессии полноразмерного мутированного DR5-специфического варианта TRAIL может усиливать специфичную для опухолей цитотоксичность NK-клеток независимо от цитотоксичности, опосредованной гранулами. Кроме того, можно предположить, что опухоли, подвергнутые обработке препаратом Бортезомиб, которые вызывают повышение DR5, станут чрезвычайно чувствительными к уничтожению этими генетически модифицированными NK-клетками.

Экспериментальный план in vitro

[00136] NK-клетки, расширенные ex vivo (NK-клетки, расширенные с использованием условий GMP и линии питающих клеток SMI-LCL), генетически модифицированные для экспрессии специфичного для DR-5 рекомбинантного TRAIL (rhTRAIL D269H/E195R), будут исследованы, чтобы выяснить, могут ли они стимулировать уничтожение, опосредованное NK-клетками, в отношении опухолевых клеток мишеней RCC, AML и MM in vitro, и, кроме того, можно ли улучшить уничтожение опухолей путем предварительной обработки опухолевых клеток мишеней препаратом Бортезомиб. Эксперименты по цитотоксичности опухолей будут выполнены in vitro путем проведения теста с радиоактивным хромом (CRA) и анализов дегрануляции NK-клеток (CD107a) с NK-клетками, расширенными ех vivo, в отношении различных линий опухолевых клеток, которые, как известно, экспрессируют DR-5, который может быть увеличен путем обработки препаратом Бортезомиб. Чтобы определить, по-разному ли происходит уничтожение опухолевых NK-клеток в популяциях NK-клеток будут выполнены анализы цитотоксичности опухолей с использованием различных препаратов NK-клеток. Популяции включают: а) недавно изолированные NK-клетки; b) NK-клетки, активированные IL-2 на протяжении ночи; с) 14-дневные NK-клетки, расширенные ех vivo с использованием питающих клеток EBV-LCL; d) 14-дневные NK-клетки, расширенные ex vivo с мРНК, прошедшие электроимпульсное открытие клеточных пор с использованием системы Maxcyte GT для экспрессии специфичного для DR-5 рекомбинантного TRAIL; и е) 14-дневные NK-клетки, расширенные ех vivo и трансдуцированные с использованием лентивирусного вектора (LV) для экспрессии специфичного для DR-5 рекомбинантного TRAIL.

[00137] Различные MOI трансдукции будут протестированы для оптимизации поверхностной экспрессии TRAIL. Цели будут заключаться в следующем: а) определить кинетику поверхностной экспрессии TRAIL в течение 4-недельного периода после трансдукции NK-клеток (in vitro); b) определить кинетику уничтожения опухолевых NK-клеток посредством TRAIL в течение нескольких периодов после трансдукции NK-клеток; с) оценить воздействие специфичной для DR-5 трансдукции TRAIL по фенотипу, потенциалу цитокинового выделения и функциональной цитотоксичности NK-клеток; оценить воздействие специфичной для DR-5 трансдукции TRAIL по разрастанию NK-клеток in vitro; и d) оценить воздействие специфичной для DR-5 трансдукции TRAIL по жизнеспособности NK-клеток

[00138] Различные концентрации мРНК с кодировкой специфичного для DR-5 рекомбинантного TRAIL будут протестированы для оптимизации трансфекции NK-клеток для экспрессии рекомбинантного TRAIL (in vitro). Цели будут заключаться в следующем: а) определить кинетику экспрессии рекомбинантного TRAIL в течение 4-7 дней после трансфекции мРНК; b) сравнить кинетику экспрессии TRAIL с NK-клетками, трансфицированными с помощью мРНК с кодировкой CD34 с поверхностной экспрессией в качестве контроля; с) определить кинетику уничтожения опухолевых NK-клеток посредством TRAIL после трансфекции NK-клеток с использованием рекомбинантного TRAIL DR-5 в течение одной недели; d) оценить воздействие специфичной для DR-5 трансфекции мРНК TRAIL по фенотипу, потенциалу цитокинового выделения и функциональной цитотоксичности NK-клеток; е) оценить воздействие специфичной для DR-5 трансфекции мРНК TRAIL по разрастанию NK-клеток in vitro; f) и оценить воздействие специфичной для DR-5 трансфекции мРНК TRAIL по жизнеспособности NK-клеток. Мы также нацелим NK-клетки (генетически модифицированные в сравнении с диким типом) в отношении опухолевых клеток мишеней RCC, ММ и AML+/-, прошедших предварительную обработку препаратом Бортезомиб для повышения экспрессии на поверхности опухоли рецептора DR5.

Экспериментальный план in vivo

[00139] Затем NK-клетки, расширенные ex-vivo и генетически модифицированные для экспрессии специфичного для DR-5 рекомбинантного TRAIL, будут исследованы, чтобы выяснить, могут ли они стимулировать уничтожение в отношении опухолевых клеток мишеней RCC, AML и MM in vivo. NK-клетки, расширенные ех vivo и генетически модифицированные для экспрессии специфичного для DR-5 рекомбинантного TRAIL, будут адоптивно введены в организм мышей-опухоленосителей MM IS (NSG) для сравнения результатов в отношении мышей, которые не проходят и проходят лечение с использованием биолюминесцентной интраскопии (BLI). Сюда входят свежие, активированные IL-2 и расширенные NK-клетки, а также расширенные NK-клетки, генетически модифицированные для экспрессии специфичного для DR-5 рекомбинантного TRAIL посредством вирусной трансдукции и трансфекции мРНК. Тот же подход будет оцениваться в RCC с использованием sauj-luc и в AML у мышей-опухоленосителей MOLM14-Luc. Опухолевые клетки-мишени, трансдуцированные люциферазой, позволят нам использовать BLI для оценки опухолевой массы в этих моделях.

[00140] Будет изучен вопрос о том, будет ли время лечения влиять на результаты. NK-клетки будут введены в организм сразу же после трансфекции мРНК по сравнению с задержкой введения NK-клеток после трансфекции мРНК до тех пор, пока время при поверхностной экспрессии TRAIL не достигнет максимума. Также будет изучено воздействие экзогенного введения IL-2 и/или IL-15 на уничтожение опухолей NK-клетками in vivo. Будет изучено воздействие предварительного лечения животных препаратом Бортезомиб на уничтожение опухолей NK-клетками, генетически модифицированными для экспрессии специфичного для DR-5 рекомбинантного TRAIL. Мы также будем оценивать вышеописанные эксперименты in vivo в ММ и AML с NK-клетками, расширенными ех vivo и генетически модифицированными для экспрессии DR-5 с использованием популяции расширенных NK-клеток, которая была подвергнута следующему; а) генетическая модификация; b) модификация культур; или с) манипуляция ех vivo для повышения уровня возврата в костный мозг.

Пример 7. Нокаут функции ингибирующих рецепторов CRISPR/Cas9

[00141] Клетки подготавливались следующим образом, после удаления функции ингибирующих рецепторов. Структуры «руководящей» РНК были сконструированы и подготовлены для воздействия с генами, кодирующими «классический» ингибирующий рецептор LIR2 и ингибирующий рецептор «контрольной точки» CTLA4 в человеческом геноме NK-клеток. После этого для нокаута генов-мишеней LIR2 и CTLA4 использовалось редактирование генома CRISPR/Cas9.

[00142] Для каждого гена-мишени было выбрано два «руководящих» РНК-кандидата и определена их расщепляющая активность в K562. Последовательности «руководящих» РНК-кандидатов показаны в таблице 1.

[00143] Клетки K562 были трансфицированы с помощью подготовленных структур «руководящей» РНК (фиг. 5) и последовательно отобраны для амплификации PCR. Присутствие экспрессии GFP использовалось для сообщения об успешном вводе структуры «руководящей» РНК в клетки К562. Таким образом, была подтверждена экспрессия гена Cas9 и, следовательно, возможность нокаута экспрессии генов LIR2 и CTLA4. Расщепляющая активность структур «руководящей» РНК была определена in vitro с помощью анализа на обнаружение несовместимости. Т7Е1 эндонуклеаза I распознает и расщепляет неидеально совместимые ДНК, тем самым обеспечивая возможность сравнивания потенциальных генов LIR2 и CTLA4 с мутировавшими генами после трансфекции CRISPR/Cas9 и негомологичного соединения концов (NHEJ).

[00144] На фиг. 6 показаны полосы, полученные в результате электрофореза в агарозном геле после нокаута гена LIR2 с помощью последовательностей «руководящей» РНК g9 и g18. Три полосы, соответствующие каждой мутации, относятся к каждому исходному гену (601) и двум полученным структурам после обнаружения несовместимости в последовательности ДНК по завершению трансфекции (602 и 603). В результате последовательности «руководящей» РНК g9 коэффициент успешности выполнения трансфекции составил 11%, в то время как в результате последовательности «руководящей» РНК g18 коэффициент успешности составил 10%.

[00145] На фиг. 7 показаны полосы, полученные в результате электрофореза в агарозном геле после нокаута гена CTLA4 с помощью последовательностей «руководящей» РНК g7 и g15. 701 показывает первичные полосы, а 702; 703 показывают две полученные полосы после обнаружения несовместимости. В результате последовательности «руководящей» РНК g7 коэффициент успешности выполнения трансфекции составил 32%, в то время как в результате последовательности «руководящей» РНК g15 коэффициент успешности составил 26%.

[00146] После успешного нокаута LIR2 и CTLA4 в клетках K562, клетки KHYG-1 трансфицировались с помощью структур «руководящей» РНК. Были определены клоны, полученные из KHYG-1, имеющие гомозиотные делеции. С этой целью использовалась экспрессия Cas9 / пуромицин ацетилтрансфераза (РАС). Успешно трансфицированные клетки определялись основываясь на их сопротивлении антибиотическому пуромицину.

Cas9 RNP

[00147] Другим протоколом, используемым для нокаута ингибирующих рецепторов контрольной точки NK-клеток, является трансфекция Cas9 RNP. Преимущество использования данного протокола заключалось в том, что достигалась аналогичная эффективность трансфекции, но со значительно меньшим уровнем токсичности, по сравнению с использованием плазмид ДНК протокола CRISPR/Cas9. Клетки KHYG1 1×10⁶ отбирались для каждого эксперимента трансфекции. Клетки промывались с помощью PBS и раскручивались в центрифуге. После чего супернант удалялся. Затем материалы CRISPR RNP (связывающий белок РНК) подготавливались следующим образом: (1) готовился раствор 20 мкМ необходимых синтезированных крРНК и тРНК (приобретались в Dharmacon); (2) вместе смешивались 4 мкл крРНК (20 мкМ) и 4 мкл РНК (20 мкМ); (3) затем смесь добавлялась в 2 мкл белка Cas9 (5 мкг/мкл); (4) все компоненты смешивались и выдерживались при комнатной температуре в течение 10 минут. После обработки в системе трансфекции Neon®, клетки смешивались с Cas9 RNP, и производилось электроимпульсное открытие клеточных пор с помощью следующих параметров: Напряжение: 1450 В; длительность импульса, 30 мс; количество импульсов: 1. Затем клетки переносились в одну лунку 12-луночного планшета, содержащую среду для роста (включая IL-2 и IL-15). Клетки отбирались после 48 - 72 часов для подтверждения эффективности редактирования гена посредством анализа Т7 эндонуклеазы и/или метода Сэнгера. Было подтверждено наличие вставок, что указывает на успешный нокаут CTLA4, PD1 и CD96 в клетках KHYG1.

Сайт-специфичные нуклеазы

[00148] Другим протоколом, используемым для нокаута ингибирующих рецепторов контрольной точки NK-клеток, является трансфекция XTN TALEN. Преимущество использования данного протокола заключалось в том, что имелась возможность достижения особенно высокого уровня специфичности по сравнению с CRISPR дикого типа.

Этап 1: Подготовка реагентов

[00149] Клетки KHYG-1 анализировались на наличие определенных характерных особенностей, включая эффективность трансфекции, эффективность клонирования одной клетки и хромосомный набор/число копий. После этого клетки культивировались в соответствии с рекомендациями поставщика. В зависимости от ингибирующего рецептора контрольной точки, нокаут которого выполнялся, нуклеазы подготавливались с учетом индивидуальных требований, по меньшей мере, из двух пар XTN TALEN. Этап определения индивидуальных требований включает в себя оценку генного локуса, числа копий и функциональную оценку (т.е. оценка гомологов, нецелевая оценка).

Этап 2: Получение линии клетки

[00150] Клетки транс фицировались с помощью нуклеаз этапа 1; этот этап повторялся 3 раза, чтобы достичь высоких уровней резания, культуры разделялись, а промежуточные культуры поддерживались в определенном состоянии до начала трансфекции. Предварительный отбор происходил через несколько дней после каждой трансфекции; популяции клеток испытывались на эффективность резания посредством анализа Cel-1. По достижению приемлемых уровней или пологого участка характеристики резания после повторных трансфекции, клетки считались готовыми к клонированию одной клетки. Объединенные клетки сортировались по одной клетке на лунку 96-луночного планшета; число планшетов для каждой популяции зависело от эффективности клонирования одной клетки, которая определяется на этапе 1. Планшеты выдерживались в течение 34 недель.

Этап 3: Отбор и расширение

[00151] По завершению слияния клеток на 96-луночном планшете, культуры объединялись и разделялись на три 96-луночные планшета; один планшет замораживался в качестве резервного, на другом планшете была выполнена повторная посадка, чтобы продолжить наращивание клонов, а последний планшет использовался для подтверждения генотипа. Каждый клон в планшете для подтверждения генотипа анализировался на потерю сигнала количественной PCR, таким образом подтверждая то, что все аллеломорфы были изменены. Все клоны с отрицательным результатом проходили амплификацию PCR и клонировались, чтобы определить характер вставок и отсутствие любого дикого типа или вставок внутри рамки. Клоны с подтвержденным нокаутом объединялись на планшетах с количеством лунок не больше 24, а затем дополнительно наращивались; обычно, в результате одного нокаута получается от 5 до 10 криопробирок, содержащих 1×10⁶ на одну пробирку для 5 отдельных клонов.

Этап 4: Утверждение

[00152] Клетки хранились в асептических условиях. Основной критерий отбора для всех клеток, которые хранились, включал в себя число жизнеспособных клеток (перед заморозкой и после оттаивания), подтверждение идентификации посредством STR, обеспечение общей стерильности и испытание на присутствие микроплазмы; другие критерии выпуска применялись в случае необходимости (хромосомный набор, экспрессивность поверхностного маркера, стерильность высокого уровня, оценка матрицы или белка посредством нокаута, и т.д.).

Пример 8. Нокдаун функции ингибирующего рецептора контрольной точки CD96 посредством РНК-интерференции

[00153] Нокдаун CD96 в клетках KHYG-1 с использованием малой интерферирующей РНК производился посредством электроимпульсного открытия клеточных пор. Использовался набор Nucleofection, в сочетании с Amaxa Nucleofector II от компании Lonza, так как данное устройство подходит для использования с линиями клеток и может выполнять трансфекцию как реплицирующихся, так и нереплицирующихся клеток, а также достигает эффективности трансфекции до 90%. Контрольная малая интерферирующая РНК (номер по каталогу: sc-37007) и малая интерферирующая РНК CD96 (номер по каталогу: sc-45460) были получены от компании Santa Cruz Biotechnology. Безантибиотическая среда RPMI-1640, содержащая 10% FBS и 2 мМ L-глютамина использовались для культивирования после нуклеофекции. Мышиное антитело CD96-APC (номер по каталогу: 338409) было получено от компании Biolegend для окрашивания.

[00154] Было подготовлено 20 мкМ основного раствора малой интерферирующей РНК. Лиофилизированный дуплекс малой интерферирующей РНК перерастворялся в 33 мкл воды без РНКазы (буфер для разведения малой интерферирующей РНК: sc-29527) для контроля FITC/контрольной малой интерферирующей РНК, в 165 мкл воды без РНКазы для малой интерферирующей РНК гена-мишени (малая интерферирующая РНК CD96). Трубка нагревалась до 90°С в течение 1 минуты, а затем выдерживалась при 37°С в течение 60 минут. После этого основной раствор малой интерферирующей РНК хранился при -20°С до появления необходимости в нем.

[00155] Клетки KHYG-1 пассировались один или два дня перед нуклеофекцией, так как клетки должны находиться в фазе логарифмического роста. Раствор Nucleofector подогревался до комнатной температуры (100 мкл на один образец). Аликвота культурной среды, содержащей сыворотку и добавки, также предварительно нагревалась при 37°С в трубке 50 мл. В 6-луночные планшеты добавлялось 1,5 мл культурной среды, содержащей сыворотку и добавки. Планшеты предварительно выдерживались в инкубаторе CO₂; с влажностью 5%, при 37°С. 100 мкл раствора для нуклеофекции с клетками 2×10⁶ было смешано с 4 мкл раствора, содержащего 20 мкМ малой интерферирующей РНК (1,5 мкг малой интерферирующей РНК). Образование пузырей воздуха при смешивании избегалось. Смесь переносилась в кюветы, сертифицированные для работы с Amaxa, которые помещались в держатель кювет Nucleofector, и выбиралась программа U-001. Подтверждалось завершение программы, после чего образцы сразу изымались из кювет. Затем в каждую кювету добавлялось 500 мкл предварительно взвешенной культурной среды. После этого образцы в каждой кювете аккуратно переносились в соответствующую лунку подготовленного 6-луночного планшета, чтобы в каждой лунке получить 2 мл конечного объема. Потом клетки выдерживались в инкубаторе CO₂ с влажностью 5%, при 37°С, до начала выполнения анализа трансфекции. Анализ проточной цитометрии производился через 16 - 24 часа после электроимпульсного открытия клеточных пор для того, чтобы измерить уровни экспрессии CD96. Данный протокол электроимпульсного открытия клеточных пор выполнялся несколько раз. На фиг. 8А и 8В показано, что в результате всегда происходит нокдаун CD96 801 (средняя интенсивность флуоресценции 1107 на 8А; 810 на 8В) в сравнении с клетками KHYG-1, трансфицированными с помощью контрольной малой интерферирующей РНК 802 (средняя интенсивность флуоресценции 2409 на 8А; 3002 на 8В). Изотип показан на 800 802 (средняя интенсивность флуоресценции 90 на 8А; 76 на 8В).

Пример 9. Цитотоксичность NK-клеток, повышенная посредством нокдауна CD328

[00156] Клетки KHYG-1, как с, так и без нокдауна при помощи CD96, совместно культивировались с клетками K562 при разных эффекторах:мишень (Э:М). Цитотоксичность измерялась через 4 часа после совместной культивации, с использованием набора для измерения цитотоксичности DELFIA EuTDA от компании PerkinElmer (номер по каталогу: AD0116). Клетки-мишени K562 культивировались в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 2 мкл L-глютамина и антибиотики. 96-луночные планшеты с V-образным днищем (номер по каталогу: 83.3926) покупались у компании SARSTEDT. Для осаждения планшета использовалась центрифуга 5810R Eppendorf (с ротором для планшетов). Для измерения сигнала флуоресценции, который образовывается растворенными клетками K562, использовался VARIOSKAN FLASH (с программным обеспечением ScanIt версии 2.4.3). Клетки K562 промывались культурной средой, и с ее помощью число клеток доводилось до 1×10⁶ клеток/мл. От 2 до 4 мл клеток добавлялось в 5 мкл реагента BATDA и выдерживались в течение 10 минут при 37°С. Сложноэфирные связи в клетках подвергаются гидролизу и формируют легинду, легко поглощающую воду и растворяющуюся в воде, которая больше не выходит за пределы мембраны. Клетки центрифугировались на скорости 1 500 об/мин в течение 5 минут для промывки нагруженных клеток K562. Процедура повторялась от 3 до 5 раз с использованием среды, содержащей 1 мМ пробенецида (Sigma P8761). После окончательной промывки, клеточный осадок перерастворялся в культурной среде и доводился приблизительно до 5×10⁴ клеток/мл. Лунки подготавливались для обнаружения фона, спонтанных высвобождений и максимального высвобождения. 100 мкл нагруженных клеток-мишеней (5 000 клеток) переносилось в лунки планшета с V-образным днищем и 100 мкл эффекторных клеток (клетки KHYG-1) добавлялось при различных концентрациях клеток, чтобы получить эффектор для мишеней от 1:1 до 20:1. Планшет центрифугировался при 100 х г в течение 1 минуты, и выдерживались в течение 4 часов в атмосфере CO₂ с влажностью 5%, при 37°С. За 15 минут до сбора среды, в каждую лунку максимального высвобождения добавлялось 10 мкл лизирующего буфера. Планшет центрифугировался при 500 х г, в течение 5 минут. 20 мкл супернанта переносилось на 96-луночный планшет с плоским днищем, после чего добавлялось 200 мкл предварительно нагретого раствора европия. Планшет выдерживался при комнатной температуре, в течение 15 минут, с использованием планшетного шейкера. После растворения клеток K562 с помощью клеток KHYG-1, они выпускают в среду лиганду. Затем эта лиганда вступает в реакцию с раствором европия для того, чтобы сформировать флуоресцентный хелат, который напрямую связан с числом растворенных клеток. Флуоресценция измерялась в флуорометре с временным разрешением, с использованием VARIOSKAN FLASH. Специфическое высвобождение рассчитывалось с помощью следующих формул: % специфическое высвобождение = Экспериментальное высвобождение - Спонтанное высвобождение - Максимальное высвобождение - Спонтанное высвобождение. Статистический анализ производился с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 6.04. Парный t-критерий использовался для сравнения разницы между нокдауном CD96 в клетках KHYG-1 с использованием малой интерферирующей РНК и контрольных групп (n=3). Значительный рост специфического высвобождения был обнаружен в совместных культурах, содержащих нокдаун CD96 в клетках KHYG-1. Это происходило при всех мишенях Э:М (см. фиг. 9). Так как флуоресценция непосредственно связана с растворением клеток, было подтверждено, что нокдаун экспрессии CD96 в клетках KHYG-1 приводит к увеличению их способности к уничтожению раковых клеток-мишеней K562.

Пример 10. Цитотоксичность NK-клеток, повышенная посредством нокдауна CD328 (Siglec-7)

Нокдаун CD328 в клетках NK-92 с использованием среды интерферирующей РНК

Материалы, реагенты и приборы

[00157] Контрольная малая интерферирующая РНК (номер по каталогу: sc-37007) и малая интерферирующая РНК CD328 (номер по каталогу: sc-106757) покупались у компании Santa Cruz Biotechnology. Для достижения эффективности трансфекции до 90% с высокой жизнеспособностью клетки (>75%) в клетках NK-92, использовались устройство Nucleofector™ (Nucleofector II, Lonza) и набор Т Nucleofector™ от компании Lonza. RPMI-1640, содержащая 10% FBS и 2 мМ L-глютамина, без антибиотиков, использовались для культивирования после нуклеофекции. Мышиное антитело CD328-АРС (номер по каталогу: 339206) покупалось у компании Biolegend.

Протокол

[00158] Для получения 10 мкМ основного раствора интерферирующей РНК Перерастворить лиофилизированный дуплекс малой интерферирующей РНК в 66 мкл воды без РНКазы (буфер для разведения малой интерферирующей РНК: sc-29527) для контроля FITC/контрольной малой интерферирующей РНК, в 165 мкл воды без РНКазы для малой интерферирующей РНК гена-мишени (малая интерферирующая РНК CD328). Нагреть трубку до 90°С за 1 минуту. Выдерживать при 37°С в течение 60 минут. Хранить основной раствор малой интерферирующей РНК при -20°С, если не используется сразу после получения. Один образец Nucleofection содержит (на 100 мкл стандартных кювет). Число клеток: 2×10⁶ клеток. Малая интерферирующая РНК: 4 мкл от 10 мкМ основного раствора. Раствор Nucleofector: 100 мкл.

Нуклеофекция

[00159] Культивировать требуемое число клеток. (Пассировать один или два дня перед нуклеофекцией, так как клетки должны находиться в фазе логарифмического роста). Подготовить малую интерферирующую РНК для каждого образца. Предварительно нагреть раствор Nucleofector до комнатной температуры (100 мкл на образец). Предварительно нагреть аликвоту культурной среды, содержащей сыворотку и добавки, при 37°С в трубке 50 мл. Подготовить 6-луночные планшеты, наполнив их 1,5 мл культурной среды, содержащей сыворотку и добавки, а также предварительно выдерживать в инкубаторе CO₂ с уровнем влажности 5%, при 37°С. Взять аликвоту культуры клеток и подсчитать клетки, чтобы определить их плотность. Центрифугировать необходимое число клеток при 1 500 об/мин в течение 5 мин. Полностью удалить супернант, чтобы никакая остаточная среда не покрывала клеточный осадок. Повторно растворить клеточный осадок в растворе Nucleofector при комнатной температуре, чтобы получить окончательную концентрацию 2×10⁶ клеток/100 мкл. Избегать выдерживания суспензии клеток в растворе Nucleofector больше 15-20 мин., так как это снижает жизнеспособность клеток и эффективность переноса генов. Смешать 10 мкл суспензии клеток с малой интерферирующей РНК. Переместить образец в кювету; сертифицированную для работы с Amaxa. Убедиться, что образец покрывает днище кюветы, избегать образования пузырей воздуха при отмеривании пипеткой. Закрыть кювету синим колпачком. Выбрать соответствующую программу в устройстве Nucleofector (A-024 для клеток NK-92). Вставить кювету в держатель кювет (Nucleofector II: необходимо повернуть карусель по часовой стрелке в крайнее положение) и нажать кнопку «x» для запуска программы. Во избежание повреждения клеток, необходимо изъять образцы из кюветы сразу по завершению работы программы (на дисплее будет отображаться «ОК»). Добавить 500 мкл предварительно нагретой культурной среды в кювету и переместить образец на подготовленный 6-луночный планшет. Выдерживать клетки в инкубаторе CO₂ с влажностью 5%, при 37°С. Через 16 - 24 часа провести проточный цитометрический анализ и взять пробу на цитотоксичность.

Результаты

[00160] Был выполнен вышеизложенный протокол и произведен проточный цитометрический анализ уровня экспрессии CD328 в клетках NK-92. Результаты одного из наглядных экспериментов показаны на фиг. 10, подтверждая успешный нокдаун (средняя интенсивность флуоресценции 3048 для контрольной малой интерферирующей РНК 1001; 679 для малой интерферирующей РНК CD328 1002.

Нокдаун CD328 увеличивает цитотоксичность

Материалы, реагенты и приборы

[00161] Набор для измерения цитотоксичности DELFIA EuTDA на основе лиганды, усиливающей флуоресценцию (номер по каталогу: AD0116), покупался у компании PerkinElmer. Клетки-мишени K562 культивировались в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 2 мкл L-глютамина и антибиотики. 96-луночные планшеты с V-образным днищем (номер по каталогу: 83.3926) покупались у компании SARSTEDT. Для осаждения планшета использовалась центрифуга 5810R Eppendorf (с ротором для планшетов). Для измерения сигнала флуоресценции, который образовывается растворенными клетками K562, использовался VARIOSKAN FLASH (с программным обеспечением ScanIt версии 2.4.3).

Протокол

[00162] Нагрузить клетки K562 реагентом BATDA DELFIA лиганды, увеличивающей флуоресценцию. Промыть клетки K562 культурной средой и с ее помощью довести число клеток до 1×10⁶ клеток/мл. Добавить от 2 до 4 мл клеток в 5 мкл реагента BATDA, выдерживать в течение 10 минут при 37°С. Производить осаждение при скорости 1 500 об/мин в течение 5 минут для промывки нагруженных клеток K562 от 3 до 5 раз с использованием среды, содержащей 1 мМ пробенецида (Sigma P8761). После окончательной промывки, повторной растворить клеточный осадок в культурной среде и довести приблизительно до 5×10⁴ клеток/мл.

Взятие проб на цитотоксичностъ

[00163] Подготовить лунки для обнаружения фона, спонтанных высвобождений и максимального высвобождения. Отобрать пипеткой 100 мкл нагруженных клеток (5 000 клеток) в планшет с V-образным днищем. Добавить 100 мкл эффекторных клеток (NK-92) различных концентраций клеток. Получить эффектор для мишеней от 1:1 до 20:1. Производить осаждение планшета при 100 х г RCF в течение 1 минуты. Выдерживать в течение 2 часов в атмосфере CO₂ с влажностью 5%, при 37°С. За 15 минут до сбора среды, в каждую лунку максимального высвобождения добавить 10 мкл лизирующего буфера. Производить осаждение планшета при 500 х г в течение 5 минут. Переместить 20 мкл супернанта на 96-луночный планшет с плоским днищем, добавить 200 мкл предварительно нагретого раствора европия, выдерживать при комнатной температуре, в течение 15 минут, с использованием планшетного шейкера. Измерить флуоресценцию в флуорометре с временным разрешением, с использованием VARIOSKAN FLASH. Специфическое высвобождение рассчитывалось с помощью следующих формул: % специфическое высвобождение = Экспериментальное высвобождение - Спонтанное высвобождение - Максимальное высвобождение - Спонтанное высвобождение

Результаты

Был выполнен вышеизложенный протокол для определения воздействия нокдауна CD328 на цитотоксичность. Результаты одного из наглядных экспериментов показаны на фиг. 11. Как видно, цитотоксичность в отношении клеток-мишеней повысилась в клетках с нокдауном CD328.

Пример 11. Протокол терапии рака крови нокдауном / нокаутом ингибирующих рецепторов контрольной точки

[00164] Как показано в вышеприведенных примерах, нокдаун или нокаут функции ингибирующего рецептора контрольной точки может быть предусмотрен различными методами. Следующий протокол был разработан для использования при лечении пациентов, больных раком крови: После того как у пациента был диагностирован рак, подлежащий лечению по настоящему изобретению, перед введением в организм пациента аликвоту модифицированных NK-клеток можно подвергать оттаиванию и культивации. Как вариант, временная мутация может быть предусмотрена, например, с использованием малой интерферирующей РНК в течение одного или двух дней, как описано выше. Платформа MaxCyte Flow Electroporation предусматривает соответствующее решение для обеспечения в клинике быстрых крупномасштабных трансфекций. Исключение определенных ингибирующих рецепторов контрольной точки может быть более эффективным в сравнении с другими методами. Вероятно, это зависит от пациента и формы рака. По этой причине, метод диагностики рака не всегда относится к биопсийному, а раковые клетки выращиваются в культуре ex vivo. Таким образом, ряд NK-клеток с различными модификациями ингибирующих рецепторов контрольной точки может быть проверен на цитотоксичность в отношении конкретного вида раковых заболеваний. Эта стадия может быть использована для выбора наиболее подходящей NK-клетки или ее производной для терапии. После успешной модификации перерастворение клеток выполняется в соответствующем носителе (например, физиологический раствор) для внутривенного и/или внутриопухолевого введения в организм пациента.

Пример 12. Нокин KHYG-1 TRAIL / варианта TRAIL

[00165] Клетки KHYG-1 были трансфицированы с помощью TRAIL и варианта TRAIL для оценки жизнеспособности и способности уничтожения раковых клеток после трансфекции. Используемый вариант TRAIL представляет собой вариант, описанный в WO 2009/077857. Он кодируется по гену TRAIL дикого типа, который включает мутацию D269H/E195R. Данная мутация существенно повышает аффинность варианта TRAIL для DR5, снижая при этом аффинность для обоих рецепторов-приманок (DcR1 и DcR2).

Базовая экспрессия TRAIL

[00166] Базовая экспрессия TRAIL (CD253) в клетках KHYG-1 анализировалась с использованием проточной цитометрии. Мышиное антитело CD253-APC (номер по каталогу Biolegend: 308210) и изотипическое контрольное антитело (номер по каталогу Biolegend: 400122) использовались для окрашивания образцов клеток и анализировались посредством проточного цитометра BD FACS Canto II. Клетки KHYG-1 культивировались в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, пенициллин (100 ед/мл)/стрептомицин (100 мг/мл) и IL-2 (10 нг/мл). 0,5-1,0×10⁶6 клетки/пробы были собраны путем центрифугирования (1 500 об/мин × 5 минут), а супернатант был аспирирован. Клетки (суспензия отдельных клеток) промывались с помощью 4 мл охлажденного буфера FACS (PBS, 0,5-1% BSA, 0,1% NaN3 азида натрия). Клетки повторно суспендировались в 100 мкл охлажденного буфера FACS, в каждую трубку было добавлено 5 мкл антитела с выдержкой в заморозке в течение 30 минут. Клетки промывались 3 раза путем центрифугирования при 1 500 об/мин в течение 5 минут. Затем клетки повторно суспендировались в 500 мкл охлажденного буфера FACS и временно выдерживались в заморозке в темноте. Впоследствии клетки анализировались посредством проточного цитометра (BD FACS Canto II), а обработка полученных данных выполнялась с помощью ПО FlowJo 7.6.2. На фиг. 12 видно, что анализ FACS выявил слабую базовую экспрессию TRAIL на поверхности клетки KHYG-1.

Нокин TRAIL / варианта TRAIL путем электроимпульсного открытия клеточных пор

[00167] мРНК TRAIL дикого типа и мРНК варианта TRAIL (D269H/195R) синтезировались TriLink BioTechnologies, разделялись на аликвоты и хранились при температуре -80°С. Мышиное антитело CD253-APC (номер по каталогу Biolegend: 308210) и изотипическое контрольное антитело (номер по каталогу Biolegend: 400122), а также мышиное антитело CD107a-PE (номер по каталогу eBioscience: 12-1079-42) и изотипические контрольные антитела (номер по каталогу eBioscience: 12-4714) использовались для окрашивания образцов клеток и анализировались посредством проточного цитометра BD FACS Canto II. Использовался краситель ДНК SYTOX-Green (номер по каталогу Life Technologies: S7020; 5 мМ раствора в DMSO). Для достижения эффективности трансфекции до 90% с высокой жизнеспособностью клетки в клетках KHYG-1, использовались устройство Nucleofector™ (Nucleofector II, Lonza) и набор Т Nucleofector™ от компании Lonza. Безантибиотическая среда RPMI-1640, содержащая 10% FBS, L-глютамин (2 мМ) и IL-2 (10 нг/мл) использовалась для культивирования после нуклеофекции.

[00168] Клетки KHYG-1 и NK-92 пассировались один или два дня перед нуклеофекцией, так как клетки должны находиться в фазе логарифмического роста. Раствор Nucleofector был предварительно нагрет до комнатной температуры (100 мкл на образец) с аликвотой культурной среды, содержащей сыворотку и добавки при температуре 37°С в трубке 50 мл. В 6-луночные планшеты добавлялось 1,5 мл культурной среды, содержащей сыворотку и добавки и выполнялась предварительная выдержка в инкубаторе СО; с влажностью 5%, при 37°С. Была подготовлена аликвота культуры клеток и проведен подсчет клеток для определения их плотности. Перед полным удалением супернатанта необходимое количество клеток центрифугировалось при 1 500 об/мин в течение 5 минут. Клеточный осадок повторно растворялся в растворе Nucleofector комнатной температуры до получения окончательной концентрации 2×10⁶ клеток/100 мкл (максимальный период нахождения в суспензии - 20 минут). 100 мкл суспензии клеток смешали с 10 мкг мРНК (объем РНК<10 мкл). Образец был перенесен в кюветы, сертифицированные для работы с Amaxa (убедившись, что образец покрыл днище кюветы и избегая образования пузырей воздуха). Была выбрана соответствующая программа в устройстве Nucleofector (т.е. U-001 для клеток KHYG-1). Затем кюветы были вставлены в держатель кювет. В кювету было добавлено 500 мкл предварительно нагретой культурной среды, а в подготовленный 6-луночный планшет сразу по завершению работы программы был перемещен образец во избежание повреждения клеток. Клетки выдерживались в инкубаторе CO₂ с влажностью 5%, при 37°С. Проточный цитометрический анализ и взятие проб на цитотоксичность были выполнены через 12-16 часов после электроимпульсного открытия клеточных пор. Проточное цитометрическое окрашивание выполнено, как указано выше. На фиг. 13 и 14 видно, что экспрессия TRAIL / варианта TRAIL и CD107a (маркер активации NK-клетки) повысила посттрансфекцию, подтверждая успешный нокин генов TRAIL в клетках KHYG-1.

[00169] На фиг. 15 представлено доказательство жизнеспособности клеток KHYG-1 до и после трансфекции посредством электроимпульсного открытия клеточных пор. Видно, что статистически значимые расхождения в отношении жизнеспособности клеток после трансфекции клеток с использованием TRAIL / варианта TRAIL не наблюдаются, подтверждая нетоксичность экспрессии TRAIL дикого типа или варианта TRAIL в отношении клеток. Данное наблюдение противоречит соответствующим выводам относительно клеток NK-92, согласно которым нокин генов варианта TRAIL является токсичным для клеток (данные не показаны). Тем не менее, вероятно, это объясняется относительно высокими уровнями экспрессии рецепторов TRAIL DR4 и DR5 на поверхности клеток NK-92 (см. фиг. 16).

Воздействие TRAIL / варианта TRAIL на цитотоксичность клеток KHYG-1

[00170] Использовалось мышиное антитело CD2-APC (номер по каталогу BD Pharmingen: 560642). Использовалось антитело Annexin V-FITC (номер по каталогу ImmunoTools: 31490013). Использовался краситель ДНК SYTOX-Green (номер по каталогу Life Technologies: S7020). Использовался 24-луночный планшет для культуры клеток (номер по каталогу SARSTEDT AG: 83.3922). Линия клеток миелоидного лейкоза K562, линия клеток множественной миеломы RPMI8226 и MM1.S использовались в качестве клеток-мишеней. K562, RPMI8226, MM1.S культивировались в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 2 мкл L-глютамина и пенициллин (100 ед/мл)/стрептомицин (100 мг/мл). Как описано выше, клетки KHYG-1 были трансфицированы с помощью TRAIL / варианта TRAIL. Клетки-мишени были промыты и осаждены центрифугированием при 1 500 об/мин в течение 5 минут. Трансфицированные клетки KHYG-1 были разбавлены до 0,5×10⁶/мл. Затем плотность клеток-мишеней была отрегулирована в предварительно нагретой среде RPMI 1640, чтобы получить соотношение эффектор : мишень (Э:М) 1:1. 0,5 мл клеток KHYG-1 и 0,5 мл клеток-мишеней смешали в 24-луночном планшете для культур и поместили в инкубатор С02 с влажностью 5%, при 37°С на 12 часов. Затем проточный цитометрический анализ был предусмотрен для взятия проб на цитотоксичность клеток KHYG-1; клетки, культивированные вместе (в различные периоды времени) были промыты, а затем окрашены антителом CD2-APC (5 мкл/проба), Annexin V-FITC (5 мкл/проба) и SYTOX-Green (5 мкл/проба) с использованием буферного раствора AnnexinV. Далее данные были проанализированы с использованием ПО FlowJo 7.6.2. Были предусмотрены положительные и отрицательные «ворота» CD2, которые представляют популяции клеток KHYG-1 и клеток-мишеней, соответственно. Затем для апоптоза, вызванного TRAIL, были проанализированы клетки с положительной реакцией на Annexin V-FITC и SYTOX-Green в популяции с отрицательным показателем CD2.

[00171] На фиг. 17, 18 и 19 показано воздействие обоих клеток KHYG-1, экспрессирующих TRAIL или вариант TRAIL на апоптоз линий трех клеток-мишеней: K562 (фиг. 17), RPMI8226 (фиг. 18) и MM1.S (фиг. 19). Очевидно, что для всех популяций клеток-мишеней экспрессия TRAIL на клетках KHYG-1 повысила уровень апоптоза при сравнении с нормальными клетками KHYG-1 (не трансфицированы с помощью TRAIL). Кроме того, экспрессия варианта TRAIL на клетках KHYG-1 еще больше повысила уровень апоптоза во всех линиях клеток-мишеней при сравнении с клетками KHYG-1, трансфицированными с помощью TRAIL дикого типа.

[00172] Клетки в настоящем изобретении, экспрессирующие вариант TRAIL, характеризуются существенным преимуществом в терапии рака благодаря более высокой аффинности для рецептора смерти DR5. При задействовании клеток по настоящему изобретению исключается развитие защитных стратегий раковых клеток для предотвращения их гибели определенным методом. Таким образом, формы рака не могут обеспечить эффективное предотвращение гибели клеток, вызванной TRAIL, за счет увеличения количества рецепторов-приманок TRAIL, поскольку клетки по настоящему изобретению модифицированы таким образом, при котором в данных обстоятельствах они остаются цитотоксичными.

Пример 13. Протокол терапии рака крови с использованием NK-клеток с помощью вариантов TRAIL, подверженных накину

[00173] Клетки KHYG-1 были трансфицированы с помощью варианта TRAIL, как приводится в примере 6 выше. Следующий протокол был разработан для использования при лечении пациентов, больных раком крови:

[00174] После того как у пациента был диагностирован рак, подлежащий лечению по настоящему изобретению, перед введением модифицированных NK-клеток вводится агент, содержащий DR5, например, Бортезомиб, и, следовательно, используется в небольших дозах для повышения экспрессии DR5 на раковых клетках, делая терапию с использованием модифицированных NK-клеток более эффективной. Затем аликвота модифицированных NK-клеток подвергается оттаиванию, культивации и введению в организм пациента. Поскольку вариант TRAIL, который экспрессируется NK-клетками, используемыми в терапии, имеет низкую аффинность для рецепторов-приманок в сравнении с TRAIL дикого типа, на поверхности раковых клеток наблюдается повышенная привязка рецепторов смерти, и, следовательно, больший апоптоз раковых клеток. Перед внедрением вышеизложенного протокола, еще одним вариантом является биопсийный метод диагностики рака и культивация раковых клеток ex vivo. Эта стадия может быть использована для идентификации форм рака, экспрессирующих особо высокие уровни рецепторов-приманок и/или низкие уровни рецепторов смерти, чтобы определить, подходит ли агент, содержащий DR5, данному пациенту. Эта стадия также может быть предусмотрена во время терапии с использованием вышеизложенного протокола, поскольку данная форма рака может адаптироваться, например, для снижения экспрессии DR5, и, следовательно, может быть подходящей для лечения с помощью агента, содержащего DR5, в ходе терапии.

Пример 14. Влияние ингибитора протеасом на TRAIL-опосредованную цитотоксичность NK-клетки

[00175] Бортезомиб (Bt) - ингибитор протеасом (препарат с химиотерапевтическим эффектом), целесообразный для лечения множественной миеломы (ММ). Известно, что Бортезомиб может повышать экспрессию DR5 у некоторых типов раковых клеток, включая клетки ММ. Перед использованием для целевого воздействия на клетки ММ при воздействии Бортезомиба и без него клетки KHYG-1 были трансфицированы с помощью варианта TRAIL, как описывалось выше в примере 12.

Экспрессия DR5 под действием Бортезомиба

[00176] Бортезомиб был приобретен у компании Millennium Pharmaceuticals. Мышиное антитело DR5-AF647 (номер по каталогу: 565498) было приобретено у компании BD Pharmingen. Окрашенные образцы клеток были проанализированы на BD FACS Canto II. Протокол включает: (1) Линии клеток MM RPMI8226 и MM1.S были выращены в среде RPMI1640 (Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США) с добавлением 2 мМ L-глютамина, 10 мМ ГЭПЭС, 24 мМ бикарбоната натрия, 0,01% антибиотиков и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США) в атмосфере с 5% CO2 при 37°С. (2) Клетки ММ были отсеяны на 6-луночные планшеты 1×10⁶/мл, 2 мл/лунку. (3) Затем клетки ММ обрабатывались разными дозами Бортезомиба в течение 24 часов. (4) После этого экспрессия DR5 в клетках ММ, обработанных/необработанных Бортезомибом, была проанализирована посредством проточной цитометрии (фиг. 20). Как показано на фиг. 20, было установлено, что небольшая доза при лечении Бортезомибом повышает экспрессию DR5 в обеих линиях клеток ММ: в клетках RPMI 8226 (верх) при MFI 273-679 с применением 10 нМ Бортезомиба; в клетках MM1.S (низ) при MFI 214-662 с применением 2,5 нМ Бортеземиба. Повышение DR5 было связано со слабой индукцией апоптоза (данные не показаны). При этом было установлено, что экспрессию DR5 было невозможно повысить высокими дозами Бортезомиба из-за высокой токсичности, приводящей к гибели большинства клеток ММ.

Сенсибилизация раковых клеток под действием Бортезомиба

[00177] Клетки KHYG-1 были трансфицированы с помощью варианта TRAIL (D269H/E195R TRAIL), как приводится в примере 12 выше. Протокол включает следующие шаги: (1) В качестве клеток-мишеней были использованы клетки MM1.S, обработанные/необработанные Бортезомибом. Клетки MM1.S были обработаны 2,5 нМ Бортезомиба (правая колонка) или наполнителем (левая колонка) в течение 24 часов. (2) Через 6 часов после электроимпульсного открытия клеточных пор варианта TRAIL мРНК клетки KHYG-1 были культивированы клетками ММ в 12-луночных планшетах. После промывки концентрации клеток были отрегулированы до 1×10⁶/мл перед смешиванием клеток KHYG-1 и MM1.S в соотношении 1:1 для взращивания в течение 12 часов. (3) Был проведен проточный цитометрический анализ циотоксичности клеток KHYG-1. Клетки, культивированные вместе, были промыты, а затем окрашены антителом CD2-APC (5 мкл/проба), AnnexinV-FITC (5 мкл/проба) и SYTOX-Green (5 мкл/проба) с использованием буферного раствора AnnexinV. (4) Далее данные были проанализированы с использованием ПО FlowJo 7.6.2. Клетки MM1.S представлены популяцией с отрицательным показателем CD2. Клетки KHYG-1 демонстрируют выражение положительную реакцию на CD2. В заключение были проанализированы клетки с положительной реакцией на AnnexinV-FITC и SYTOX-Green в популяции с отрицательным показателем CD2. В отношении клеток MM1.S с предварительной обработкой/без обработки Бортезомибом, культивированных вместе с клетками KHYG-1, прошедших электроимпульсное открытие клеточных пор с помощью/без варианта TRAIL, был проведен проточный цито метрический анализ апоптоза. Как показано на фиг. 21, было установлено; что Бортезомиб вызвал восприимчивость клеток ММ к клеткам KHYG-1, экспрессирующим вариант TRAIL (уничтожение от 47,9 до 70,5%) в гораздо большей степени, чем к клеткам, эксрпессирующим TRAIL дикого типа (уничтожение от 41,8 до 51,4%). Следовательно, данные указали на то, что агент, вызвавший экспрессию DR5, был эффективен в модели увеличения цитотоксичности в отношении раковых клеток и, тем самым, может быть полезен при расширении терапии рака по настоящему изобретению.

Пример 15. Генерирование структур CAR

[00178] Вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела были клонированы в векторах на основе pcDNA3.3 (In vitro gen): p33G1f и p33Kappa соответственно. Все низкоаффинные антитела были получены в условиях бессывороточной среды посредством отдельной совместной трансфекции тяжелых цепей (SEQ ID №1) из высокоаффинных антител CD38 (описанных в WO2011154453 и WO2006099875) и легких цепей из случайных векторов экспрессии зародышевой линии в клетках HEK293F с помощью 293fectin (Invitrogen), как описывалось раннее (Винк и соавт.2014). Осуществлялся сбор бесклеточных супернатантов и определялась концентрация антител с помощью количественного определения Octet IgG (ForteBio). Результаты обмена легкой цепи в антителах (в случае scFvs) с пониженной аффинностью к CD38 в сравнении с Даратумумабом.

[00179] Аффинность измерялась и оценивалась посредством биослойной интерферометрии на измерительном приборе Octet HTX (ForteBio). Биосенсоры Anti-Human IgG Fc Capture (ForteBio) в течение 1 000 с загружались IgG человека типа 1 (hIgG1) с содержанием различных комбинаций тяжелых и легких цепей, направленных на CD38. После базовой линии (100 с) определялись ассоциация (1 000 с) и диссоциация (1 000 с) внеклеточного домена N-терминального His-меченного CD38 (His-CD38, 100 нМ) в разводящем буфере (ForteBio). Для расчетов использовалась теоретическая молекулярная масса His-CD38 на основании аминокислотной последовательности, т.е. 30,5 кДа. Одновременно с перемешиванием при 1 000 об/мин и 30°С выполнялись эксперименты. Осуществлялся анализ данных с помощью ПО Data Analysis версии 8.0 (ForteBio) посредством модели 1:1 и полного локального припасования при времени ассоциации 1 000 с и времени диссоциации 250 с. Отслеживание данных корректировалось посредством вычитания среднего из четырех эталонных биосенсоров, загруженных IgGI-3003-028 дикого типа и выдержанных только в разводящем буфере. Ось у согласовывалась с базовой линией в течение последних 5 с; применялась коррекция внутренних этапов и фильтрация методом Савицкого-Голея.

[00180] Гомогенный анализ связывания для CD38-специфического антитела человека выполнялся в 1 536-луночном титрационном микропланшете с дозозависимым эффектом с помощью жидкостного манипулятора Tecan Evo 200. Связывание антител IgGI с клетками ЯКХ, временно экспрессирующими CD38 человека с фоновым контролем ЯКХ дикого типа, и гранулами стрептавидина, покрытыми очищенным биотинилированным His-меченным CD38 человека, было обнаружено вместе с конъюгатом вторичного поликлонального козьего античеловеческого IgG (Fc)-Alexa Fluor 647 (Jackson ImmunoResearch). Параллельно связывание антител IgGI с гранулами стрептавидина, покрытыми очищенным биотинилированным His-меченным CD38 человека, также оценивалось с помощью конъюгата моновалентного вторичного Fab-специфического козьего античеловеческого IgG (H+L)-DyLight 649 (Jackson ImmunoResearch). Образцы IgGI были нормализованы и разбавлены в экспрессирующей среде Freestyle 293 (GIBCO). 2 мл разбавленного образца было добавлено к 5 мл клеток или суспензий гранул с содержанием вторичных конъюгатов при 200 нг/мл конъюгата IgG и 300 нг/мл конъюгата Fab соответственно. Суспензии клеток подготавливались в буфере FMAT (PBS, 0,1% BSA и 0,02% азида натрия) + 0,075% Pluronic F-68. Суспензии гранул подготавливались в НВВ (10 мМ HEPES [рН 7.4], 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1,8 мМ CaCl2, 0,5% BSA и 0,01% азида натрия + 0,075% Pluronic F-68). После 8 ч выдерживания при комнатной температуре (RT) в темноте были зафиксированы сигналы флуоресценции с помощью системы клеточной детекции Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System (ThermoFisher Scientific) с применимой малозначимой величиной 50 единиц. Полученные данные по общей интенсивности флуоресценции были обработаны и визуализированы с помощью ПО ActivityBase (IDBS).

[00181] Выбранная вариабельная легкая цепь B1 (SEQ ID №: 23) и вариабельная тяжелая цепь (SEQ ID №: 1) были амплифицированы праймерами посредством PCR (SEQ ID №: 8-22), содержащими гомологические плечи; применялся метод Gibson Assembly (NEB) для объединения обеих цепей с линкером G4S. Образованные scFvs клонировались в ретровирусном векторе SFG, сопровождающемся трансмембранным доменом CD8a и одним из нижеприведенных костимулирующих доменов согласно описанию Т-клеток в работе Жао и соавт. (2015). Структуры CAR связывались посредством последовательности 2А с усеченным NGFR или последовательностью dsRed (Ким и соавт. 2011).

Пример 16. Генерирование ретровирусных частиц

[00182] Феникс-амфо упаковывающие клетки были трансфицированы с использованием структур CAR, векторов (Roche) gag-pol (pHIT60) и envelope (pCOLT-GALV). Через 2 и 3 дня после трансфицирования бесклеточные супернанты, содержащие ретровирусные частицы, были собраны и сразу использованы для трансдукции.

[00183] Клетки KHYG-1 трансдуцировались ретровирусным способом путем центробежной инокуляции на планшетах, покрытых ретронектином (Takara). Вторая трансдукция производилась через 16 часов. Через 72 часа после трансдукции путем проточной цитометрии определялась экспрессия CD38. Были культивированы трансдуцированные клетки KHYG-1. Через 1 неделю CAR-трансдуцированные NK-клетки либо стимулировались облученными (5 Гр) UM9-клетками (соотношение эффектор:мишень [Э:М] 1:3), либо подвергались функциональной проверке.

Пример 17. Первичные клетки пациентов, у которых была обнаружена ММ, и здоровых субъектов

[00184] ВМ-мононуклеары (MNC) с содержанием 5-40% злокачественных плазматических клеток, отделялись от ВМ-аспиратов у пациентов, у которых была обнаружена ММ, посредством центрифугирования в плотности фиколл-пак и либо сразу использовались, либо проходили криоконсервацию в жидком азоте до использования. PBMC/MNC отделялись от лейкотромбоцитарных слоев здоровых зарегистрированных доноров крови путем центрифугирования в плотности фиколл-пак. Все первичные пробы получались после информированного согласия и подтверждения медицинской этической комиссией.

Пример 18. Повышенная цитотоксичность NK-клеток, экспрессирующих CAR CD38.

[00185] Клетки KHYG-1, с и без химического антигенного рецептора с низкой аффинностью для CD38 (CD38-CAR), совместно культивировались с клетками UM9 при разных соотношениях эффектор : мишень (Э:М). Проверялись три варианта клеток KHYG-1 CD38-CAR: BBz B1, 28z B1 и 28z BBL B1; данные варианты соответствуют костимулирующим доменам 41BB-CD3zeta, CD28-CD3zeta и CD28/4-1BB плюс лиганд, соответственно (41 ВВ = SEQ ID №: 42; CD3zeta = SEQ ID №: 41; и CD28 = SEQ ID №: 43).

[00186] Цитотоксичность измерялась через 4 часа после совместной культивации, с использованием набора для измерения цитотоксичности DELFIA EuTDA от компании PerkinElmer (номер по каталогу: AD0116). Клетки-мишени UM9 культивировались в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 2 мкл L-глютамина и антибиотики. 96-луночные планшеты с V-образным днищем (номер по каталогу: 83.3926) покупались у компании SARSTEDT. Для осаждения планшета использовалась центрифуга 5810R Eppendorf (с ротором для планшетов). Для измерения сигнала флуоресценции, который образовывается растворенными клетками UM9, использовался VARIOSKAN FLASH (с программным обеспечением ScanIt версии 2.4.3). Клетки UM9 промывались культурной средой, и с ее помощью число клеток доводилось до 1×10⁶ клеток/мл. От 2 до 4 мл клеток добавлялось в 5 мкл реагента BATDA и выдерживались в течение 10 минут при 37°С. Сложноэфирные связи в клетках подвергаются гидролизу и формируют лиганд, легко поглощающий воду и растворяющийся в воде, который больше не выходит за пределы мембраны. Клетки центрифугировались на скорости 1 500 об/мин в течение 5 минут для промывки нагруженных клеток UM9. Процедура повторялась от 3 до 5 раз с использованием среды, содержащей 1 мМ пробенецида (Sigma P8761). После окончательной промывки, клеточный осадок перерастворялся в культурной среде и доводился приблизительно до 5×10⁴ клеток/мл. Лунки подготавливались для обнаружения фона, спонтанных высвобождений и максимального высвобождения. 100 мкл нагруженных клеток-мишеней (5 000 клеток) переносилось в лунки планшета с V-образным днищем и 100 мкл эффекторных клеток (клетки KHYG-1) добавлялось при различных концентрациях клеток, чтобы получить соотношения Э:М от 0,5:1 до 2:1. Планшет центрифугировался при 100 х г в течение 1 минуты, и выдерживались в течение 4 часов в атмосфере CO2 с влажностью 5%, при 37°С. За 15 минут до сбора среды, в каждую лунку максимального высвобождения добавлялось 10 мкл лизирующего буфера. Планшет центрифугировался при 500 х г, в течение 5 минут. 20 мкл супернанта переносилось на 96-луночный планшет с плоским днищем, после чего добавлялось 200 мкл предварительно нагретого раствора европия. Планшет выдерживался при комнатной температуре, в течение 15 минут, с использованием планшетного шейкера. После растворения клеток UM9 с помощью клеток KHYG-1, они выпускают в среду лиганд. Затем этот лиганд вступает в реакцию с раствором европия для того, чтобы сформировать флуоресцентный хелат, который напрямую связан с числом растворенных клеток. Флуоресценция измерялась в флуорометре с временным разрешением, с использованием VARIOSKAN FLASH. Специфическое высвобождение рассчитывалось с помощью следующих формул: % специфическое высвобождение = Экспериментальное высвобождение - Спонтанное высвобождение - Максимальное высвобождение Спонтанное высвобождение. Статистический анализ производился с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 6.04. Парный t-критерий использовался для сравнения разницы между клетками KHYG-1 CD38-CAR с использованием малой интерферирующей РНК и контрольных групп.

Проба на цитотоксичностъ на основании биолюминесцентной интраскопии

Чтобы определить лизис линий Luc-GFP-трансдуцированных злокачественных клеток человека с помощью NK-клеток CAR CD38 через 7-10 дней после трансдукции, последовательные разбавления ложных клеток или NK-клеток CD38-CAR совместно выдерживались с линиями злокачественных клеток. Сигнал люциферазы, получаемый от выживших злокачественных клеток, был определен через 16-24 часа при помощи микропланшетного люминометра GloMax 96 (Promega) в течение 15 мин после добавление 125 мг/мл люциферина жука (Promega). % лизиса клеток = 1 (сигнал биолюминесцентной интраскопии [BLI] в обработанных лунках/сигнал BLI в необработанных лунках) 100%.

[00187] Было обнаружено, что специфическое высвобождение значительно увеличивается в совместных культурах, содержащих клетки KHYG-1 CD38-CAR, несмотря на то, что только около 50% клеток успешно трансдуцируются. Это наблюдалось во всех соотношениях Э:М, за исключением клеток KHYG-1 CD38-CAR с костимулирующим доменом 41BB-CD3zeta при соотношении Э:М 0,5:1 (см. фиг. 22). Более сильные цитотоксические эффекты можно было бы ожидать в более чистых образцах эффекторных клеток с CD38-CAR. Так как флуоресценция непосредственно связана с лизисом клеток, было подтверждено, что экспрессия CD38-CAR в клетках KHYG-1 приводит к увеличению их способности к уничтожению раковых клеток-мишеней UM9.

Проба на иитотоксичностъ на основании проточной цитометуии

Через 7-10 дней после трансдукции последовательные разведения CD38-CAR-KHYG-1-клеток выдерживались вместе с фиолетовым индикатором (Thermo Fisher), меченным BM-MNC или РВМС, в течение 14 часов. После добавления флуоросфер для проточного счета (Beckman 7547053) клетки были собраны и окрашены для CD38 и/или CD138. Затем жизнеспособные клетки количественно анализировались посредством измерений, скорректированных по проточному счету. Лизис клеток в процентном значении рассчитывался так, как описано ниже, и только в том случае, когда анализируемая популяция клеток-мишеней содержала >500 жизнеспособных клеток в необработанных образцах: % лизиса клеток = 1 (абсолютное количество жизнеспособных клеток-мишеней в обработанных лунках/абсолютное количество жизнеспособных клеток-мишеней в необработанных лунках) 100%.

Два типа «ворот» были использованы для анализа первичных клеток ММ: Очень яркие CD138/CD38+ клетки в сравнении со всеми CD138+/CD38 клетками (см. фиг. 25 и 26). Наблюдалась минимальная незначительная разница в результатах между разновидностями. Первичные клетки ММ были чувствительны к гибели клеток, вызванной CD38-CAR-KHYG-1. Как видно на фиг. 23 и 24, наиболее значительная гибель первичных клеток ММ наблюдалась при использовании CAR, содержащих CD28-CD3-дзета (28z B1). Наблюдалось минимальное или полное отсутствие гибели клеток CD38+/CD138- (нормальные незлокачественные клетки, экспрессирующие CD38) (см. фиг. 25 и 26) - следовательно, клетки не подверглись целевому воздействию от CAR-NK-клеток.

[00188] Таким образом; было показано, что CD38 CAR-NK-клетки с «низкой аффинностью» обладают способностью целевого воздействия и уничтожения CD38-экспрессирующих раковых клеток, не вызывая неблагоприятных эффектов на клетки-мишени, а не на раковые клетки, в нормальных незлокачественных клетках, экспрессирующих CD38.

[00189] Несмотря на то, что в настоящем документе были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет очевидно, что такие варианты осуществления представлены только в качестве примера. Для специалистов в данной области техники будут очевидны многочисленные вариации, изменения и замены без отступления от изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы для вариантов осуществления изобретения, описываемые в настоящем документе, могут использоваться при практическом применении изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ОНКИММЮНЕ ЛИМИТЕД

<120> ИНЖЕНЕРНЫЕ ЕСТЕСТВЕННЫЕ КЛЕТКИ-КИЛЛЕРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> P40307WO

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Ile Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Pro Ser Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Val Phe Leu Gly Lys Val Asn Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Gly Glu Pro Gly Ala Arg Asp Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Lys Thr Asn His Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Glu Pro Gly Asp Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro His Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Val Gly Trp Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

ctgctgctgc atgcggcgcg cccggacatc cagatgaccc agagc 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

ctgctgctgc atgcggcgcg cccggacatc cagctgaccc agagc 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

ctgctgctgc atgcggcgcg cccggccatc cagctgaccc agagc 45

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

ctgctgctgc atgcggcgcg cccggtgatc tggatgaccc agagc 45

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

ctgctgctgc atgcggcgcg cccggagatc gtgctgaccc agagc 45

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

ctgctgctgc atgcggcgcg cccggagatc gtgatgaccc agagc 45

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

ctgctgctgc atgcggcgcg cccggacatc gtgatgaccc agagc 45

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

gcggcggagg atctggggga ggcggctctc aggtgcagct ggtgcagagc g 51

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

gcggcggagg atctggggga ggcggctctg aagtgcagct ggtgcagtct gg 52

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

cagatcctcc gccgccagat ccgcctccgc ccttgatctc caccttggtg cc 52

<210> 18

<211> 52

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

cagatcctcc gccgccagat ccgcctccgc ccttgatttc cagcttggtg cc 52

<210> 19

<211> 52

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

cagatcctcc gccgccagat ccgcctccgc ccttgatgtc caccttggtg cc 52

<210> 20

<211> 52

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

cagatcctcc gccgccagat ccgcctccgc ccttgatttc cagccgggtg cc 52

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

ggggcgggtg taggcggccg cggagctggt gttgttgtgc tggacacggt gaccattgtg 60

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

ggggcgggtg taggcggccg cggagctggt gttgttgtgc tagacacggt cacgagggtg 60

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24

gagtcacagg tggcatttgg cgg 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

cgaatcgcag gtggtcgcac agg 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

cactcacctt tgcagaagac agg 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 27

ccttgtgccg ctgaaatcca agg 23

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile

1 5 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala Asn Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Cys Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp

1 5 10 15

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Trp Ile

1 5 10

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Ile Ile Tyr Pro His Asp Ser Asp Ala Arg Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Cys Ala Arg His Val Gly Trp Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10 15

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe

1 5

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Tyr Thr Phe

1 5 10

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln

1 5

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe

1 5 10

<210> 41

<211> 164

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys

20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

35 40 45

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

50 55 60

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

85 90 95

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

100 105 110

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

115 120 125

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

130 135 140

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

145 150 155 160

Leu Pro Pro Arg

<210> 42

<211> 255

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<210> 43

<211> 220

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr

20 25 30

Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser

35 40 45

Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu

50 55 60

Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr

85 90 95

Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys

100 105 110

Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

115 120 125

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

130 135 140

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

145 150 155 160

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

165 170 175

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

180 185 190

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

195 200 205

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

210 215 220

<---

Claims

1. Клетка естественный киллер (NK-клетка), экспрессирующая химерный антигенный рецептор (CAR) к CD38 для применения при лечении рака, экспрессирующего CD38, при этом указанный CAR к CD38 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 7, и при этом указанный CAR к CD38 содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 28.

2. NK-клетка для применения по п. 1, отличающаяся тем, что указанная NK-клетка экспрессирует лиганд Е-селектина.

3. NK-клетка для применения по пп. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная NK-клетка связывается с антителом HECA-452.

4. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанная NK-клетка представляет собой клетку KHYG-1.

5. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный рак, экспрессирующий CD38, представляет собой рак крови.

6. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный рак, экспрессирующий CD38, представляет собой множественную миелому (ММ).

7. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный CAR к CD38 содержит один или более или все CDR тяжелой цепи согласно SEQ ID NO: 29, 30 и 31.

8. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный CAR к CD38 содержит один или более или все CDR тяжелой цепи согласно SEQ ID NO: 32, 33 и 34.

9. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный CAR к CD38 содержит один или более или все CDR легкой цепи согласно SEQ ID NO: 35, 36 и 37.

10. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный CAR к CD38 содержит один или более или все CDR легкой цепи согласно SEQ ID NO: 38, 39 и 40.

11. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный CAR к CD38 содержит один или более костимулирующих доменов, выбранных из SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43.

12. NK-клетка для применения по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанная NK-клетка модифицирована для экспрессии варианта TRAIL с повышенной аффинностью к рецепторам гибели TRAIL по сравнению с TRAIL дикого типа.