CN107106665A - 靶向间皮素的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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M·塞德莱恩
D·S·迪米特罗夫
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Abstract

本发明公开的主题提供用于增强对癌症和病原体的免疫应答的方法和组合物。其涉及特异性靶向人间皮素的嵌合抗原受体(CAR)和包含此类CAR的免疫应答细胞。本发明的靶向间皮素的CAR具有增强的免疫激活特性，包括抗肿瘤活性。

Description

靶向间皮素的嵌合抗原受体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年6月6日提交的序列号为62/008,851的美国临时专利申请的优先权，其中每个的全部内容引入本文以供参考，并要求每个的优先权。
资助信息
本发明是在美国国防部(Department of Defense)的基金号为W81XWH-11-1-0783和W81XWH-12-1-0230的政府资助下做出的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明公开的主题提供用于增强对癌症和病原体的免疫应答的方法和组合物。其涉及特异性靶向人间皮素(mesothelin)的嵌合抗原受体(CAR)和包含此类CAR的免疫应答细胞。本发明的靶向间皮素的CAR具有增强的包括抗肿瘤活性的免疫激活特性，同时具有使CAR诱发的毒性和免疫原性最小化的特征。
背景技术
基于细胞的免疫疗法是对癌症治疗具有治疗潜力的疗法。T细胞和其它免疫细胞通过引入编码针对抗原的人工或合成受体的遗传物质被修饰为靶向肿瘤抗原，所述受体称为嵌合抗原受体(CAR)，其对所选择的抗原具有特异性。使用CAR的靶向T细胞疗法已经显示最近在治疗一些血液恶性肿瘤中获得临床成功。然而，将表达CAR的T细胞疗法用于实体瘤产生了必须克服才能实现临床益处的几个障碍。恶性细胞适应为产生免疫抑制的微环境来保护自身免于免疫识别和清除。这种肿瘤微环境对涉及免疫应答激活的治疗方法，比如靶向T细胞疗法，具有挑战性。实体瘤也可限制在解剖层次内，阻碍有效的T细胞运输，缺乏激动性共刺激配体的表达，和/或表达T细胞功能的负调节剂。因此，成功清除实体瘤需要有效的肿瘤浸润并克服肿瘤诱导的免疫抑制。此外，实体瘤对选择最佳免疫靶点——其靶向将能够通过有效T细胞实现肿瘤根除，而对非肿瘤组织具有最小或可耐受毒性的抗原，具有挑战性。因此，需要新的治疗策略来设计用于治疗癌症、特别是实体瘤的CAR，其能够以最小的毒性和免疫原性诱导有效的肿瘤根除(CAR免疫原性可导致疗效降低或急性毒性，例如对次优CAR的过敏反应)。
发明内容
本发明公开的主题总体提供特异性靶向人间皮素的嵌合抗原受体(CAR)、包含此类CAR的免疫应答细胞、以及这些CAR和免疫应答细胞用于治疗癌症、病原体感染等的用途。
本发明公开的主题提供CAR。在一个非限制性实例中，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域以大约1nM至大约25nM的结合亲和力特异性结合人间皮素。在某些实施方式中，CAR识别间皮素表达水平为约1,000或更多个间皮素结合位点/细胞的人间皮素。
在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸1～119的重链可变区。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸1～107的轻链可变区。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有SEQ IDNO:3的氨基酸1～107的轻链可变区。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包含具有SEQ ID NO:11所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR1、包含具有SEQ IDNO:12所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR2、和包含具有SEQ ID NO:13所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR3。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包含具有SEQ ID NO:14所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:15所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR2、和包含具有SEQ IDNO:16所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR3。在某些非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含所述重链和轻链两者，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有接头序列，例如接头肽。例如，在某些非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸1～119的重链可变区和(ii)含有SEQ ID NO:5的氨基酸1～107的轻链可变区，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸1～119的重链可变区和(ii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸1～107的轻链可变区，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。例如，在某些非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：(i)包含具有SEQ ID NO:11所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:12所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR2、和包含具有SEQ ID NO:13所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR3，以及(ii)包含具有SEQ ID NO:14所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:15所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR2、和包含具有SEQ ID NO:16所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR3，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。在具体的非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv。在具体的非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域是任选交联的Fab。在具体的非限制性实施方式中，细胞外结合结构域是F(ab)2。在具体的非限制性实施方式中，任何前述分子能够包含在具有异源序列的融合蛋白中以形成细胞外抗原结合结构域。
根据本发明公开的主题，细胞外抗原结合结构域共价连接到跨膜结构域。CAR的细胞外抗原结合结构域能够在细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区之间包含接头。细胞外抗原结合结构域能够包含共价连接到细胞外抗原结合结构域的5’末端的前导序列。在一个实施方式中，前导序列包含CD8多肽。在一些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)，或其组合。在一个实施方式中，跨膜结构域包含CD8多肽。在一个实施方式中，跨膜结构域包含CD28多肽。
根据本发明公开的主题，细胞内结构域包含CD3ζ多肽。在一些实施方式中，细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区。在一些实施方式中，该至少一个共刺激信号传导区包含CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、PD-1多肽、CTLA-4多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)，或其组合。在一个实施方式中，跨膜结构域包含CD8多肽，并且细胞内结构域包含CD3ζ多肽。在另一个实施方式中，跨膜结构域包含CD28多肽，细胞内结构域包含CD3ζ多肽，并且共刺激信号传导区包含CD28多肽。在另一个实施方式中，跨膜结构域包含CD8多肽，细胞内结构域包含CD3ζ多肽，并且共刺激信号传导区包含4-1BB多肽。
在一个实施方式中，CAR是Mz。Mz包含含有CD8多肽的跨膜结构域和含有CD3ζ多肽的细胞内结构域。在一个实施方式中，CAR是M28z。M28z包含含有CD28多肽的跨膜结构域、含有CD3ζ多肽的细胞内结构域、以及含有CD28多肽的共刺激信号传导区。在一个实施方式中，CAR是MBBz。MBBz包含含有CD8多肽的跨膜结构域、含有CD3ζ多肽的细胞内结构域、以及含有4-1BB多肽的共刺激信号传导区。
在某些实施方式中，CAR是重组表达的。CAR能够由载体表达。在一个实施方式中，载体是γ-逆转录病毒载体。
本发明公开的主题还提供包含上述CAR的分离的免疫应答细胞。在某些实施方式中，分离的免疫应答细胞还包含至少一种外源的共刺激配体。在一些实施方式中，该至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14，及其组合。在一个实施方式中，共刺激配体是4-1BBL。在某些实施方式中，分离的免疫应答细胞还包含至少一种外源的细胞因子。在一些实施方式中，该至少一种细胞因子选自IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21，及其组合。在一个实施方式中，细胞因子是IL-12。在一些实施方式中，分离的免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞。在一个实施方式中，该细胞是T细胞。在某些实施方式中，免疫应答细胞表达的CAR为大约1至大约4个载体拷贝数/细胞。在某些实施方式中，分离的免疫应答细胞还包含结合不同于人间皮素的抗原的抗原识别受体。该抗原能够为肿瘤或病原体抗原。在一些实施方式中，该肿瘤抗原选自碳酸酐酶IX(CAIX)、癌胚抗原(CEA)、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(LlCAM)、黑色素瘤抗原家族A,1(MAGE-A1)、粘蛋白16(Muc-16)、粘蛋白1(Muc-1)、NKG2D配体、癌-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、Wilms肿瘤蛋白(WT-1)、1型酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1)，及其组合。在一些实施方式中，免疫应答细胞表达一种或多种粘附分子。粘附分子能够增加CAR的亲合力。在一些实施方式中，粘附分子选自CD2、VLA-4，及其组合。
此外，本发明公开的主题提供使用上述免疫应答细胞的各种方法。例如，本发明公开的主题提供减少受试者肿瘤负荷的方法，其中所述方法包括将有效量的本发明公开的免疫应答细胞施用于受试者，从而诱导受试者的肿瘤细胞死亡。在一个实施方式中，该方法减少肿瘤细胞的数量。在另一个实施方式中，该方法减少肿瘤大小。在另一个实施方式中，该方法根除受试者的肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤是实体瘤。在一些实施方式中，实体瘤选自间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜瘤、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastric cancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)、胆管癌，及其组合。
本发明公开的主题还提供增加或延长患有瘤形成的受试者的存活的方法，其中所述方法包括将有效量的本发明公开的免疫应答细胞施用于受试者，从而增加或延长受试者的存活。在某些实施方式中，瘤形成选自间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜癌、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastric cancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)、胆管癌，及其组合。该方法能够减少或根除受试者的肿瘤负荷。
此外，本发明公开的主题提供响应受试者的癌细胞或病原体而增加免疫激活细胞因子产生的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明公开的免疫应答细胞。在某些实施方式中，免疫激活细胞因子选自粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、干扰素调节因子7(IRF7)，及其组合。
根据本发明公开的主题，上述各种方法能够包括施用至少一种免疫调节剂。在某些实施方式中，该至少一种免疫调节剂选自免疫刺激剂、检查点免疫阻断剂、放射治疗剂、化疗剂，及其组合。在一些实施方式中，免疫刺激剂选自IL-12、激动性共刺激单克隆抗体(agonist costimulatory monoclonal antibody)，及其组合。在一个实施方式中，免疫刺激剂是IL-12。在一些实施方式中，激动性共刺激单克隆抗体选自抗4-1BB抗体、抗OX40抗体、抗ICOS抗体，及其组合。在一个实施方式中，激动性共刺激单克隆抗体是抗4-1BB抗体。在一些实施方式中，检查点免疫阻断剂选自抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体、抗TIM3抗体，及其组合。在一个实施方式中，检查点免疫阻断剂是抗PD-L1抗体。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，免疫应答细胞经胸膜施用于受试者。
本发明公开的主题还提供用于产生结合人间皮素的免疫应答细胞的方法。在一个非限制性实例中，该方法包括将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列引入到免疫应答细胞中，所述嵌合抗原受体(CAR)包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域以大约1nM至大约25nM的结合亲和力特异性结合人间皮素。在具体的非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv。在具体的非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域是任选交联的Fab。在具体的非限制性实施方式中，细胞外结合结构域是F(ab)2。在具体的非限制性实施方式中，任何前述分子可包含在具有异源序列的融合蛋白中以形成细胞外抗原结合结构域。
本发明公开的主题还提供编码本发明公开的CAR的核酸和包含该核酸的载体。在一个实施方式中，该载体是γ-逆转录病毒载体。
本发明公开的主题还提供包含有效量的本发明公开的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。还提供用于治疗瘤形成的药物组合物，其包含有效量的本发明公开的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，瘤形成选自间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜癌、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastriccancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)、胆管癌，及其组合。
本发明公开的主题还提供包含本发明公开的免疫应答细胞的用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、或移植排斥的试剂盒。还提供包含核酸的用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、或移植排斥的试剂盒，所述核酸包含本发明公开的CAR。在一些实施方式中，试剂盒还包括使用免疫应答细胞治疗患有瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、或移植排斥的受试者的书面说明书。
本发明公开的主题还提供预防或治疗受试者的炎性疾病的方法。在一个非限制性实例中，该方法包括将本发明公开的免疫应答细胞施用于受试者。在一个实施方式中，免疫应答细胞是免疫抑制性细胞。在一个非限制性实施方式中，免疫抑制性细胞是调节性T细胞。在一个实施方式中，炎性疾病是胰腺炎。在一个实施方式中，受试者是人。在一个实施方式中，受试者是器官移植的受者。在一个具体的实施方式中，受试者是胰腺移植的受者。
本发明公开的主题还提供预防作为器官移植受者的受试者中的移植排斥的方法。在一个非限制性实例中，该方法包括将本发明公开的免疫应答细胞施用于受试者。在一个实施方式中，免疫应答细胞是免疫抑制性细胞。在一个非限制性实施方式中，免疫抑制性细胞是调节性T细胞。在一个实施方式中，受试者是人。在一个实施方式中，受试者是胰腺移植的受者。
附图说明
以下可以结合附图理解以举例方式给出的具体实施方式，但并不意在将本发明限制为所描述的具体的实施方式。
图1描述“第二代”CAR。
图2A～F描述间皮素特异性构建体的体外效应物功能。(A)间皮素特异性构建体的产生。抗间皮素构建体包含单独的CD3ζ胞内结构域(Mz)或与CD3ζ胞内结构域与CD28共刺激结构域结合(M28z)。实验中包括具有CD28共刺激的PSMA定向的CAR(P28z)作为阴性对照。(B)用CAR有效转导CD4+和CD8+T-细胞亚群。转导百分比表示通过流式细胞术所测量的报告基因表达。M28z和Mz CAR通过绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达来检测。表达P28z CAR的T细胞通过低亲和力神经生长因子(LNGFR)报告基因表达来检测。未转导的细胞用于在活/死染色排除非存活细胞之后设置阳性门(positive gates)。在为CAR+细胞设门之后报告CD4+和CD8+百分比。(C)间皮素特异性T细胞证明抗原特异性裂解。以指定的效应物/靶标比率，将T细胞与转导过表达间皮素的51Cr负载的MSTO-211H靶细胞(MSTO MSLN+)一起孵育，并测量靶细胞裂解(铬释放)。误差棒表示三次重复的平均值的标准误差(s.e.m.)。(D)CD28共刺激增强抗原特异性细胞因子分泌。用未转导的MSTO-211H细胞(MSTO Empty)或MSTO MSLN+细胞刺激Mz或M28z转导的对照或T细胞，并使用Luminex珠阵列(Luminex bead array)测量细胞因子。(E)在重复抗原刺激时，CD28共刺激促进强烈的T细胞聚集。T细胞与MSTO Empty或MSTO MSLN+肿瘤细胞共培养(箭头表示用新辐照的肿瘤细胞的再刺激)。左图，不添加外源IL-2的抗原刺激。右图，加入外源IL-2(20IU/mL)。使用通过流式细胞术确定的GFP+百分比校正的手动血细胞计数器，计算指定时间间隔的绝对CAR+T细胞数。误差棒表示三次重复的平均值的标准误差。(F)在连续抗原刺激时，间皮素特异性CAR转导的T细胞获得62 L效应物表型。用连续多色流式术分析每次抗原刺激后的CAR+T细胞。
图3A～E描述在胸膜内施用M28z T细胞后根除已建立的MSLN+胸膜肿瘤。(A)原位恶性胸膜间皮瘤的小鼠模型重现人类疾病。在肿瘤接种后5周，用1×105的MSTO MSLN+肿瘤细胞注射小鼠，其宏观病变的磁共振图像和照片(分别为左上和右上图)。所有小鼠具有沿着胸膜和膈膜表面生长的肿瘤，并且包围纵隔结构。下方，代表性的苏木精和伊红(H&E)染色的胸壁切片显示肿瘤的早期胸壁侵袭(左下图)以及持续间皮素表达(右下图)。(B)具有胸膜肿瘤的NOD/SCID/γcnull小鼠(NSG)的连续体内肿瘤生物发光图像(BLI)。MSTO MSLN+肿瘤细胞共表达绿色荧光蛋白/萤火虫荧光素酶融合蛋白(GFP/Luc)以允许成像。在胸膜内肿瘤建模后，静脉内过继转移3×106的M28z T淋巴细胞或胸膜内过继转移3×105的M28z T淋巴细胞(剂量低10倍)治疗小鼠，并胸膜内注射3×105的带有人PSMA靶向的嵌合抗原受体P28z的T细胞作为阴性对照。示出的是来自每组的4个代表性小鼠。在腹侧和背侧对小鼠成像。BLI信号强度以光子/秒来示出。(C)100天的时期内，每种动物每周定量BLI肿瘤信号。每一行对应于一个动物，每个点代表在给定时间点每只动物的腹侧和背侧获取的平均光子计数。(D)Kaplan-Meier存活分析中，与胸膜内施用的M28z+T细胞(n＝7，蓝线)相比，静脉内施用的M28z T细胞(n＝4，蓝色虚线)具有下降的存活(92d vs nd，p＝0.02)。多次重复实验证实结果。(E)肿瘤接种后，对动物的治疗。
图4A～F描述胸膜施用的M28z+T细胞的强烈的、肿瘤抗原依赖性的体内聚集。(A)在用增强的萤火虫荧光素酶(effLuc)(载体显示在顶部)和M28z CAR共转导的1×106的T细胞经胸膜或静脉内施用后第0至10天，在具有MSTO MSLN+肿瘤的NSG小鼠中，比较过继转移的T细胞的体内T细胞BLI。在胸膜内注射1×106MSTO MSLN+肿瘤细胞1周后施用T细胞。示出了每组一个代表性小鼠(n＝3～4)。(B)在T细胞转移后10天期间，来自连续BLI的EffLuc-荧光素酶信号强度。每条线代表3～4只小鼠的平均信号，每个点显示在给定时间点每组中每只动物的腹侧和背侧获取的平均光子计数。值得注意的是，与静脉内施用的effLuc+M28z T细胞相比，胸膜内施用的effLuc+M28z T细胞显示增加的和持续的发光，其说明胸膜腔肿瘤内的初始肺滞留和延迟的信号发射。(C)在胸膜或静脉内施用M28z T细胞后第3天，从代表性动物制备的肿瘤单细胞悬液的多色流式细胞术分析。用抗人CD3抗体对细胞进行染色，通过GFP报告子表达确定CAR阳性，进一步的分析包括CD4/CD8/CD62L/CD45RA。(D)M28z T细胞的免疫组织化学。(E)绝对肿瘤浸润性M28z T细胞数(使用发光计数珠(countbright bead)的总细胞计数)。所示的柱状图表示每组三只小鼠的平均值±标准误差，说明胸膜施用后第7天的M28z T细胞的强烈聚集。以相同剂量用静脉内T细胞治疗的小鼠在胸膜肿瘤内表现出较少的聚集。(F)在胸膜施用后第3天和第7天的脾脏中绝对肿瘤浸润性M28z T细胞数。
图5A～C描述CD28共刺激增强CAR+T细胞体内持久性和功效。(A)CD28共刺激增强如通过中值存活所测量的CAR+T细胞功效，并且促进在单个T细胞剂量后的肿瘤根除。对具有建模的胸膜MSTO MSLN+GFP/Luc+肿瘤的小鼠胸膜内施用1×105CAR+Mz、M28z或P28z(阴性对照)T细胞。每周通过BLI测量肿瘤负荷。左图，Kaplan Meier存活曲线。使用logrank试验测定比较Mz和M28z组(每组至少9只小鼠)的中值存活的统计学显著性。右图，对每只单个小鼠使用每秒光子单位的BLI所定量的肿瘤负荷。(B)CD28共刺激增强CAR+T细胞持久性。在胸膜施用3×106CAR+T细胞后第40和50天，示出每mL外周血的绝对CAR+T细胞。所示的柱状图表示三只小鼠的平均值±标准误差。使用用于多重校正的Bonferroni校正来进行t检验并且确定统计学显著性。*p<0.05。(C)持续的CAR+T细胞主要是CD4+。左图，用Mz或M28z CAR T细胞治疗的小鼠的外周血的代表性多色流式细胞术分析。去除死细胞后，设门策略显示去除死细胞后的淋巴细胞门和CD3+CD45+T细胞门。对于每只小鼠，在为活细胞、CD3+CD45+T细胞和GFP+(CAR+)T细胞设门之后，进行CD4+和CD8+表型分析。右图，描述使用连续流式细胞术，分析在T细胞施用后的连续时间点抽取的外周血，测定CD4：CD8比率的柱状图。对于所有体内实验，预输注CD4：CD8比率约为0.5。在T细胞剂量范围(3×106、1×106和3×105CAR+)上所显示的结果相似。在Mz治疗的小鼠中的T细胞输注后第30天、40天和50天，和M28z治疗的小鼠后第30、40天，比较平均CD4+与CD8+比率的t检验(在每个时间点n＝3)显示统计学显著性(在用于多重校正的Bonferroni校正之后)。
图6A～E描述具有CD28共刺激的CD4+CAR+T细胞表现出延迟但有效的细胞毒性。(A)用于分析CD4+和CD8+T细胞群体的实验，阴性选择珠分选实现>98％的纯度。(B)与CD8+M28zT细胞相比，CD4+M28z T细胞显示延迟但相似的抗肿瘤细胞毒性。将间皮素特异性的CAR+T细胞或对照转导的CAR+T细胞以指定的效应物/靶标比率与转导以过表达间皮素的51Cr负载的MSTO211H靶细胞(MSTO MSLN+)孵育，并测量靶细胞裂解(铬释放)。误差棒表示三次重复的平均值的标准误差。比较CD8 M28z与CD4 M28z CAR+T细胞，*p<0.05。(C)对于最佳的CD4+介导的细胞毒性，CD28共刺激是必需的。在珠粒纯化CD4+和CD8+T细胞亚群之后，将间皮素特异性的CAR+T细胞或对照转导的CAR+T细胞以指定的效应物/靶标比率与转导以过表达间皮素的51Cr负载的MSTO211H靶细胞(MSTO MSLN+)孵育，并测量靶细胞裂解(铬释放)。比较CD4M28z与CD4 Mz CAR+T细胞，*p<0.05。(D)富含细胞因子的上清液不直接引起肿瘤细胞裂解。将CD4+M28z或CD4+P28z(作为阴性对照)与MSTO MSLN+或MSTO Empty靶细胞共孵育18小时后获得的上清液与新铺板的51Cr标记的靶标混合，并在指定的时间点测量靶细胞裂解。CD4+M28z CAR T细胞表现出抗原特异性裂解(阳性对照)。(E)CAR+T细胞分泌的细胞因子增强CAR+介导的细胞毒性。在间皮素特异性刺激CD4+M28z CAR+T细胞后获得的上清液增强了CD8M28z和CD4 M28z与MSTO MSLN+靶细胞的18小时共培养物中的细胞毒性。误差棒表示三次重复的平均值的标准误差。比较添加和不添加上清液的CAR+T细胞，*p<0.05。
图7A～D描述间皮素特异性CAR+T细胞的细胞毒性主要由穿孔素/颗粒酶介导。(A)左侧和中间的图显示在Fas配体阻断时对M28z转导的T细胞的细胞毒性没有影响。在18小时的51Cr释放试验中，在抗-Fas-L单抗(mAb)NOK-1或IgG1同种型对照单抗(每个10μg/ml)和MSTO MSLN+的存在下，将分选的CD4、CD8和未分选的CD4/8M28z+T细胞共培养。右图显示靶细胞对Fas L介导的细胞死亡的敏感性(详见方法部分)。*p<0.05。(B)间皮素特异性CAR转导的T细胞对肿瘤靶标的裂解依赖于细胞毒性颗粒的释放。在96孔组织培养板中，在存在或不存在螯合剂乙二醇四乙酸(EGTA)的条件下，将51Cr释放实验中共培养18小时的分选的CD4+、CD8+亚群和本体未分选的M28z或Mz转导的T细胞群体，与MSTO MSLN+肿瘤细胞共培养18小时。*p<0.05。(C)CD4+CAR T细胞在刺激后表达颗粒酶B，但与CD8+CAR T细胞相比具有延迟的动力学。对静息的PBMC、PHA刺激的母细胞和MSTO MSLN+刺激(效应物与靶标比率2：1)的CAR转导(M28z、Mz，并且P28z作为阴性对照)的T细胞进行颗粒酶A和颗粒酶B的细胞内流式细胞术。将细胞刺激4或18小时，以便与在细胞毒性试验中评估比较两个时间点的铬释放。在为CD3+和GFP+设门的事件之后，使用荧光减去一个染色的细胞测定颗粒酶阳性事件。对于所有染色，抗体同种型对照呈阴性。左图，CD4+和CD8+T细胞亚群的代表性FACS点图。右图，进行总共3个总实验的一个代表性实验的柱状图。(D)M28z CAR T细胞比Mz CAR T细胞表达更大量的颗粒酶B。如(c)中那样对细胞进行染色，并且在用MSTO MSLN+刺激进行刺激18小时后示出代表性直方图。
图8A和8B描述间皮素特异性CAR+T细胞的CD28共刺激效应主要是CD4+介导的。(A)在M28z T细胞中增强的细胞因子分泌主要是CD4+介导的。对用于CD4+、CD8亚群(如前所述)或未分类的群体分选的M28z和Mz T细胞进行细胞因子释放试验。在96孔圆底板中，每孔5×104的CAR+T细胞与5×103靶细胞，三次重复共同培养，每孔终体积为200μl。20小时后，收集共培养上清液，并使用多重人细胞因子检测试验进行细胞因子测定，以检测IL-2、GM-CSF、TNF-α和IFN-γ(Millipore Corp.)。数据表示每个细胞因子三个孔中的细胞因子水平的平均值±标准误差。(B)无外源IL-2的M28z CD4+T细胞的强烈的T细胞扩增能力。每4天与MSLN+或MSLN—肿瘤单层共培养的M28z或Mz转导的CD4+、CD8+亚群或本体未分类的T细胞群体的T细胞扩增。使用通过流式细胞术确定的GFP+百分比校正的手动血细胞计数器计算指定时间间隔的绝对CAR+T细胞数。每个点表示三个孔中计数的平均值±标准误差。
图9A和9B描述当与CD8+M28z CAR T细胞相比时，CD4+M28z CAR T细胞在体内单独施用时有效，并且介导增强的功效。(A)每周进行一次体内生物发光成像，跟踪接种到NSG小鼠胸膜腔中的MSTO MSLN+GFP/Luc+肿瘤的肿瘤负荷(接种时间0天)。在肿瘤输注后第18天，小鼠接受3×105、1×105或3×104的本体M28z(n＝5)、分选的CD4+或CD8+M28z(n＝7)的CAR+T细胞。在对照组(n＝4)中注射相等数目的表达人PSMA靶向CAR P28z的T细胞。BLI信号强度显示为光子/秒，并且表示腹侧和背侧信号的平均值。(B)(a)中描述的T细胞治疗的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。使用logrank统计检验计算显示的P值。在所有剂量下，与CD8+CAR+T细胞相比，CD4+M28z CAR+T细胞是有效的。CD4+CAR+T细胞抗肿瘤功效与未分选的CAR+T细胞相当。
图10A～E描述过继转移的间皮素重导向的T细胞的功能持久性主要是CD4+介导的，并且通过CD28共刺激增强。(A)胸膜内给予T细胞后第202天处死的一个代表性NSG小鼠(n＝3)制备的脾脏单细胞悬液的多色流式细胞术分析。通过输注3×105M28z T细胞，第184天之后，根除已建立的MSTO MSLN+胸膜内肿瘤(数据未显示)。为CAR+(CD3+GFP+)设门事件后的M28z T细胞亚群显示出CD4+T细胞的优势。(B)MSTO MSLN+和MSTO-211H-MSLN-肿瘤再激发的NSG小鼠的体内BLI。在施用1×105M28z或Mz转导的T细胞后，87天后胸膜肿瘤清除；其中1×106MSLN+或MSLN-MSTO肿瘤细胞注射到小鼠的腹膜腔中。在指定的时间点，通过生物发光成像监测luc+肿瘤细胞。每个治疗组对三个NSG小鼠成像。每行代表每组小鼠的平均值±标准误差，每个点显示在整个小鼠腹部和背部测量的平均光子计数。在注射MSTO MSLN+腹膜肿瘤的小鼠中肿瘤再激发后的两周，87天前注射的Mz和M28z CAR+T细胞证实了抗肿瘤功效。与Mz CAR+T细胞相比，M28z CAR+T细胞在减少肿瘤负荷方面更有效。(C和D)肿瘤再激发后，脾脏中聚集的绝对M28z或Mz T细胞数。显示的柱状图表示来自用MSLN+(n＝6)或MSLN-(n＝6)肿瘤再激发并在肿瘤再激发后第16天处死的NSG小鼠的脾脏的转导的T细胞的平均值±标准误差。只有用MSTO-211H-MSLN+再激发的M28z T细胞治疗的小鼠的脾脏中显示出CAR+T细胞的强烈的聚集。T细胞亚群也通过流式细胞术定量(详见方法部分)，并且显示在M28z组中看到的大多数T细胞是CD4+T细胞。(E)肿瘤接种后对动物的治疗。
图11A和11B描述富含FoxP3的肿瘤微环境中的CD4+和CD8+肿瘤/基质浸润与延长的存活相关。(A)甚至在FoxP3的存在下，高CD8+T细胞肿瘤浸润与延长的存活相关。包括的有在1989年至2009年在纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan-Kettering Cancercenter)诊断为具有上皮样MPM的患者。对于162位有可用标本的患者中的每一位，审查所有H&E载玻片(中位数9，范围1～43)。通过从每个患者肿瘤块中取9个代表性核心(0.6mm)并确保至少6个完整的肿瘤核心，选择代表性的块来构建组织微阵列(TMA)。从TMA切下5微米切片，并用特异性抗体(CD8：小鼠单克隆，Dako，1:200稀释，FoxP3：小鼠单克隆，Abcam，1:2000稀释)染色。如下由对于临床数据不知情的病理学家在不同的场合对CD8和FoxP3强度进行分级：对于每个患者，免疫细胞浸润定义为1分(平均值为1至1.67)、2分(平均值为1.67至2.33)或3分(平均值>2.33)。对于统计分析，认为1分低，并且认为2分和3分高。(B)在FoxP3的存在下，高CD4+T细胞基质浸润与延长的存活相关。如a中所述，使用山羊多克隆，R&D系统以1：100稀释以染色CD4+细胞。
图12描述MSLN评分的分布：三阴性乳腺癌(TNBC)与非TNBC。
图13A～F描述存活概况：MSLN+TNBC与NSLN-TNBC。
图14描述I期肺ADC患者血清中术前可溶性MSLN相关肽(SMRP)水平的测量。
图15A～C描述小鼠模型的开发。
图16描述M28z在肺转移小鼠模型中减少肿瘤负荷的有效性。
图17A～D描述与高表达MSLN的靶标相比，M28z T细胞对低表达MSLN的靶标的抗原特异性旁观杀伤。
图18描述表达PD-L1的MSTO-211H(人胸膜间皮瘤)细胞。
图19描述MBBz的结构。
图20A～C描述在肿瘤分泌的免疫抑制蛋白存在下，MSLN靶向的CD28和4-1BB共刺激增强CAR T细胞功能。
图21A～C描述在肿瘤分泌的免疫抑制蛋白存在下，MSLN靶向CD28和4-1BB共刺激增强CAR T细胞功能。
图22描述M28-IL12和M28z对MSLN+癌细胞的细胞毒性。
图23描述IL-12对M28z诱导的细胞因子表达的影响。
图24A～E示出根据本发明公开主题的CAR。(A)显示的是SFG-M28z的结构。(B)显示的是SFG-MBBz的结构。(C)显示的是SFG-M28z-4-1BBL的结构。(D)显示的是SFG-4-1BBL-M28z的结构。(E)显示的是SFG-M28z-IRES-Flexi-IL-12的结构(其中IRES在NFAT或干扰素应答元件的控制下可选地表达)。
图25描述SFG-M28z-EGFRt的结构。
图26描述SFG-iC9-M28z的限制性图谱。
图27A～C描述表达不同水平的M28z的人T细胞。
图28描述表达不同水平的人间皮素的靶细胞系。
图29A和B描述M28z+T细胞针对表达不同水平的人间皮素的靶细胞的细胞因子产生。
图30描述M28z+T细胞对表达不同水平的人间皮素的靶细胞的细胞毒性。
图31A～C描述M28z+T细胞针对表达不同水平的人间皮素(MSLN)的靶细胞的细胞因子产生和细胞毒性。(A)表达不同水平的MSLN的MSTO-211H细胞。(B)对表达不同水平的MSLN的MSTO-211H细胞的CTL分析。(C)对表达不同水平的MSLN的MSTO-211H细胞的细胞因子产生。
图32描述顺铂预治疗促进本公开的表达MSLN特异性CAR的T细胞的功效。
图33描述放射疗法促进本公开的表达MSLN特异性CAR的T细胞的功效。在有胸部肿瘤的小鼠暴露于半侧胸阔放射疗法(HTRT)后第72小时，体外(A)和体内(B)的趋化因子和细胞因子分泌。
图34描述放射疗法促进本公开全部内容的表达MSLN特异性CAR的T细胞中的功效。如通过T细胞BLI所监测的，在施用CAR+T细胞之前的半侧胸阔放射疗法增加T细胞聚集，与仅接受T细胞的小鼠相比，分析收获的脾脏(T细胞第56天)显示更高比例的持续T细胞。
图35A～E描述局部施用MSLN CAR转导的T细胞导致优异的抗肿瘤功效。(A)如通过铬释放试验测量的表达MSLN、但不表达PSMA的靶细胞的裂解所示的，MSLN-CAR转导的T细胞的抗原特异性效应物功能。(B和D)具有胸膜肿瘤的NOD/SCID/γcnull小鼠的肿瘤BLI。用1×105(1×)或3×106(30×)的M28z T细胞静脉内(E:T，分别为1:3000或100)治疗荷瘤小鼠，与1×105(1×)或3×105(3×)M28z T细胞(E:T，分别为1:3000或1000)比较。死亡用星号(*)表示。(C和E)Kaplan-Meier存活分析证明，与静脉内施用(蓝色虚线)相比，胸膜内施用(蓝线实线)具有优异的功效。胸膜内施用M28z未达到中值存活；静脉施用的中值存活期为27天(1×)和86天(30×)。用胸膜P28z(黑线)治疗的对照小鼠的中值存活为27至42天(每组n＝4～10)。使用对数秩检验(Log-rank test)分析存活曲线。**P<0.01；***P<0.001。
图36A～E描述胸膜内施用的M28z+T细胞显示CD4+和CD8+亚群的早期的、强烈的增殖。(A)在荷瘤小鼠中的连续T细胞BLI。静脉内施用的M28z+T细胞在进展性胸膜肿瘤中显示延迟但等效的聚集。(B)来自连续T细胞BLI的平均effLuc-荧光素酶信号强度。胸膜内施用的T细胞(蓝线)显示更早和持续的聚集，在第5天具有最大T细胞信号。静脉内施用的T细胞显示延迟聚集，在第7天具有最大信号。(C)E:T比率反映在6h和第1、3和7天与肿瘤负荷平行的M28z T细胞聚集，证实了T细胞BLI的发现。静脉内施用显示延迟的T细胞聚集、较低的E:T比率和减少的CD8+T细胞浸润。(D)与静脉内施用后肿瘤内CD8+T细胞的聚集减少和脾脏中的CD4+和CD8+T细胞的均匀分布相比，第7天的FACS分析显示胸膜内施用后肿瘤和脾脏内的CD4+和CD8+T细胞亚群的相等聚集。(E)在胸膜内施用后，在CD4+和CD8+T细胞中均观察到CD62L表达的降低。误差棒表示±标准误差。通过Student氏t检验(Student氏test)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图37A～C描述胸膜内施用的M28z+T细胞显示以抗原特异性方式在胸膜外肿瘤中的有效的全身性运输和聚集。(A)具有双荧光素酶成像的连续肿瘤和T细胞BLI，表明全身性运输和胸膜外的肿瘤聚集。具有右侧部和胸膜腔建模的ffluc+MSLN+肿瘤和左侧部MSLN-肿瘤的小鼠，在胸膜内接受Gaussia荧光素酶+M28z T细胞。在T细胞施用之前在侧部和胸膜腔中具有肿瘤的代表性小鼠(左图)。T细胞施用15天后的T细胞BLI(中图)显示胸膜腔中残留的T细胞和MSLN+右侧部肿瘤中的聚集(中图)。一天后，与MSLN-左侧部肿瘤相比，肿瘤BLI显示在MSLN+右侧腹膜肿瘤中出减轻的负荷(右图)。(B和C)与静脉内施用的T细胞相比，胸膜内施用的M28z+T细胞在MSLN+腹膜内肿瘤中显示出早期和强烈的聚集。(C)与静脉内施用(每组n＝3，误差棒表示±SEM)相比，在荷瘤小鼠中腹膜腔的信号强度的倍数增加的定量显示胸膜内施用的增强的T细胞聚集。
图38A和38B描述胸膜内施用的M28z T细胞根除胸膜肿瘤并建立长期CD4+优势持久性。(A)CD28共刺激促进在单剂量的T细胞后的肿瘤根除。将总计1×105的CAR+Mz、M28z或P28z(阴性对照)T细胞胸膜内施用于具有建立的肿瘤的小鼠中。(左图)肿瘤负荷。(右图)Kaplan-Meier存活曲线。Mz和M28z组(每组至少9只小鼠)的中位存活期分别为63天和未达到中值存活。通过对数秩检验分析存活曲线。**P<0.01。(B)CD28共刺激增强CAR+T细胞持久性。胸腔内施用3×106CAR+T细胞后第50天的绝对CAR+T细胞计数(每mL外周血)。误差棒表示±SEM，通过Student氏t检验，*P<0.05。
图39表示用MSLN+和MSLN-肿瘤再激发的小鼠的肿瘤BLI。在施用单剂量的3×105M28z或Mz T细胞根除胸膜肿瘤后第87天，将1×106的MSLN+或MSLN-肿瘤细胞注射到腹膜腔中。肿瘤再激发后，Mz T细胞阻止肿瘤生长，而M28z T细胞促进肿瘤消退。
图40A～F描述CD4+M28z T细胞增强CD8+聚集，所述CD8+聚集是用预活化增强的。(A-C)测定未分选的M28z和Mz或珠粒分选的CD4+和CD8+T细胞。M28z CD4+T细胞显示(A)更高的细胞因子分泌(从4至14倍；通过Student氏t检验，***P<0.001)和(B)无外源IL-2的显著T细胞扩增。(C)CD4+M28z活化在体外重复抗原刺激时促进强烈的CD8+M28z T细胞聚集。(D)抗原活化的CD4+M28z活化促进体内强烈的CD8+M28z T细胞聚集。将分离的CD8+effLuc M28z T细胞胸膜内施用于带有CD4+M28z(n＝6)或CD4+对照转导的T细胞(n＝6)的MSLN+胸膜肿瘤的小鼠并进行连续成像。在CD4+M28z存在下，一个代表性的小鼠(每组n＝6；左图)显示增加的CD8+M28z T细胞聚集。(E)在指定的时间间隔计算CD8+CAR+T细胞的平均聚集(如所示的P值计算从16小时至72小时的增加倍数，每组n＝6)。(F)与同时活化CD4+相比，M28z CD4+的预活化增强CD8+增殖。将珠粒分选的CD8+Mz或M28z T细胞与相应的Mz或M28z CD4+或预活化的CD4+T细胞(在测定前24小时在MSLN+肿瘤细胞上活化)共培养。M28z CD4+的预活化比CD8+和CD4+并发刺激更大程度地增强CD8+的聚集。
图41A～E描述CD4+MSLN CAR+T细胞显示出有效的颗粒酶/穿孔素依赖性的细胞裂解功能。(A)CD4+M28z T细胞显示延迟但类似于CD8+M28z T细胞的细胞毒性。(B)CD28共刺激增强CD4+介导的细胞毒性。(C)从刺激的CD4+M28z CAR+T细胞获得的富含细胞因子的上清液增强CD8M28z和CD4M28z T细胞的细胞毒性。(D)CAR T细胞裂解功能取决于细胞毒性颗粒的释放。在螯合剂乙二醇四乙酸(EGTA)的存在或不存在下，将本体、CD4或CD8 M28z和Mz T细胞共培养18小时。(A～D)珠粒纯化的CD4+或CD8+Mz和M28z T细胞的细胞毒性。(E，左图)CD4+CAR T细胞表达颗粒酶B，但与CD8+CAR T细胞相比具有延迟动力学。对休眠的PBMC、PHA刺激的胚细胞和用MSLN+刺激的M28z、Mz和P28z T细胞进行4或18小时的颗粒酶B的细胞内FACS分析。(E，右图)CD28共刺激增强颗粒酶B表达。直方图显示MSLN+刺激后第18小时的表达。误差棒表示±SEM，通过Student氏检验，*P<0.05。
图42A～C描述胸膜内施用的CD4+M28z CAR T细胞在体内单独施用时有效；与CD8+M28z T细胞相比，介导增强的功效；并建立长期功能持久性。(A)跟踪肿瘤负荷进展的BLI。肿瘤注射后第18天，小鼠接受3×105(3×)、1×105(1×)或3×104(0.3×)的本体M28z(n＝5)、珠粒分选的CD4+、CD8+M28z(n＝7)或P28z(n＝4)的CAR+T细胞。(B)Kaplan-Meier存活曲线。在所有剂量下，与CD8+CAR+T细胞相比，CD4+M28z CAR+T细胞是有效的。CD4+CAR+T细胞的抗肿瘤功效与未分选的CAR+T细胞的抗肿瘤功效相当。通过Student氏检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。原始数据和P值在补充材料中提供。(C)肿瘤再激发的小鼠的肿瘤BLI。在胸膜内施用单剂量的3×105(3×)的未分选(本体)M28z或CD4+分选的M28z T细胞后第196天，将1×106的MSLN+肿瘤细胞注射到腹膜腔中。持续的CD4+M28z T细胞阻止肿瘤生长。
图43A和43B描述靶向间皮素的CAR T细胞证明了抗原特异性效应物功能。(B)用于CAR T细胞效应物功能的体外分析的肿瘤细胞系的FACS分析。(C)M28z CAR T细胞分泌2～5倍量的Th1细胞因子。
图44表示对休眠的PBMC、PHA刺激的母细胞和用MSLN+刺激的M28z CAR T细胞进行的对于颗粒酶A和B的细胞内FACS分析，这里显示的是18小时共培养之后的结果。
图45A和45B描述CAR T细胞裂解细胞功能与靶抗原表达水平成比例。(A)用低(灰色)或高(黑色)水平的间皮素转导的MSTO-211H间皮瘤肿瘤细胞的表面间皮素表达。包括同种型染色用于参照。(B)以指示的效应物与靶标比率，将T细胞和低或高靶标的间皮素共培养18小时后，通过铬释放测量的M28z CAR T细胞的细胞裂解功能。
图46A和46B描述流式细胞术的设门策略。(A)对于使用分选的CD4和CD8CAR T细胞的体外和体内分析，将所有样品分选为>95％纯度。(B)用合适的未转导对照(以确定CAR阳性门)和用同种型对照为CD62L和CD45RA设门进行T细胞表型分析。
图47A～E描述具有CD28或4-1BB共刺激的嵌合抗原受体(CAR)在初始抗原刺激后在体外表现出等效的效应细胞因子分泌和增殖。(A)第一代和第二代CAR。(B)间皮素(MSLN)靶向的CAR包含单独的CD3ζ胞内结构域(Mz，第一代CAR)或CD3ζ胞内结构域与CD28(M28z)或4-1BB(MBBz)共刺激结构域结合(第二代CAR)。在实验中包括具有CD28共刺激的前列腺特异性膜抗原(PSMA)导向的CAR(P28z)以及表达PSMA的靶标(PSMA+)作为阴性对照。CYT，胞质结构域；LS，前导序列；LTR，长末端重复；SA，剪接受体；SD，剪接供体；TM，跨膜。(C～E)CAR转导的T细胞的抗原特异性效应物功能。(C)通过铬释放试验测量的表达MSLN的靶标(MSLN+)而非PSMA+靶标的裂解。(D)如通过Luminex所测定的，在将CAR T细胞与MSLN+细胞共培养后，4-1BB和CD28共刺激增强细胞因子分泌。(E)MSLN+细胞刺激后，M28z和MBBz CAR促进强烈的T细胞聚集。数据表示三次重复的平均值±SEM(C，E)或数据作为单个点绘制(D)。通过Student氏检验，将共刺激的CAR T细胞(M28z或MBBz)与第一代受体(Mz)比较，***P<0.001；使用用于多重校正的Bonferroni校正来确定显著性。
图48A～C描述M28z和MBBz CAR T细胞治疗的小鼠在更高剂量下显示肿瘤根除，而用更低剂量治疗导致M28z治疗后更高的肿瘤复发率。(A)使用体内生物发光成像(BLI)监测NOD/SCID/γcnull小鼠中的肿瘤负荷(萤火虫荧光素酶+MSLN+)。用单剂量的1e5(E:T 1:3,000)、8e4(E:T 1:3,750)或5e4(E:T 1:6,000)的M28z或MBBz CAR T细胞治疗具有建立的胸膜肿瘤的小鼠。符号表示小鼠死亡。将使用相同供体的两个类似实验组合用于说明。(B)用4e4CAR T细胞(E:T 1:7,500)治疗小鼠。包括第一代Mz CAR和阴性对照P28z。(C)比较胸膜内施用4e4Mz(n＝13，红色)、M28z(n＝15，蓝色)、MBBz(n＝8，绿色)和P28z(n＝3，黑色)的CAR T细胞的体内功效的Kaplan-Meier存活分析。施用T细胞后的天数的中值存活。使用对数秩检验分析存活曲线。*P<0.05；**P<0.01。
图49A～C描述M28z和MBBz治疗的小鼠显示出相似的早期和长期CAR T细胞聚集，并且具有进展性肿瘤的M28z治疗的小鼠包含持久的CAR T细胞。(A)CD28和4-1BB共刺激增加肿瘤内CAR T细胞聚集到相等的程度。左图示出在施用单剂量的8e4的CAR T细胞后的肿瘤BLI的结果。6天后，从肿瘤收获T细胞；x表示小鼠，其T细胞计数表示为数据点。右图示出每克肿瘤组织的绝对CAR T细胞(*P<0.05)。进行Student氏t检验，并使用用于多重比较的Bonferroni校正来确定统计学显著性。(B)如在脾脏中测量的，CD28和4-1BB共刺激增加CART细胞持久性至相等的程度。在胸膜内施用CAR T细胞(8e4)后第73天示出每个脾脏中的绝对CAR T细胞。左图示出肿瘤BLI的结果；x表示小鼠，其T细胞计数表示为数据点(*P<0.05)。进行Student氏t检验，并使用用于多重比较的Bonferroni校正来确定统计学显著性。(C)用低剂量的M28z T细胞(4e4)治疗的小鼠显示在脾脏和肿瘤中具有持久的CAR T细胞的肿瘤复发。左图示出肿瘤BLI的结果。收获来自由x表示的小鼠的脾脏和肿瘤，并用于FACS分析(中间图)和T细胞定量(右图)。
图50A～D描述尽管MBBz CAR T细胞优先保留效应细胞因子分泌和细胞毒性，但是在体内抗原暴露后CAR T细胞变得耗尽。(A)胸膜内施用CAR T细胞后6天，从肿瘤和脾脏中分离M28z和MBBz CAR T细胞，并进行离体(ex vivo)抗原刺激。(B)当体外刺激时的铬释放试验显示M28z减少、但持续的MBBz溶解细胞功能(E:T比率1:5)(C)细胞因子分泌测量表明尽管MBBz CAR T细胞能更好地保留分泌性，但是CAR T细胞的效应细胞因子分泌减少。(D)收获的CAR T细胞的GzB、IFN-γ和IL-2表达的RT-PCR测量与图(A)和(B)中的蛋白质水平测量很好地相关。数据表示相对于未刺激的M28z CAR T细胞的体外mRNA表达的倍数变化。数据表示每种条件下三个单独孔的平均值±SEM。进行Student氏t检验，使用用于多重比较的Bonferroni校正确定统计学显著性(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。结果在用于两个实验中的每一个的两个单独的小鼠队列中再现。
图51A～E描述尽管MBBz CAR T细胞优选在体外和在体内肿瘤再激发后保留效应细胞因子分泌和细胞毒性，但是CAR T细胞在体外重复抗原刺激时耗尽。(A)M28z和MBBzCAR T细胞在重复抗原刺激时在体外保持增殖能力。T细胞还通过铬释放试验测定其细胞毒性，通过Luminex试验(B～D)测定其细胞因子分泌。(B)(左)尽管如通过铬释放试验所测量的，MBBz CAR T细胞能够更好地保持细胞裂解功能，但是CAR T细胞在第一次刺激时表现出相等的杀伤，在重复抗原刺激时丧失细胞裂解功能。(C)通过CD107a表达(显示在第三次刺激)所测量的细胞毒性颗粒释放与铬释放试验(B)相关。数据表示相对于未刺激的CAR T细胞的CD107a MFI的倍数变化的平均值±SD(三次重复)。(D)细胞因子分泌测量类似地表明在重复抗原刺激时CAR T细胞效应物功能的丧失；再次，MBBz CAR T细胞能够更好地保留其功能。(E)尽管同样持久，MBBz CAR T细胞显示出优越的功能持久性。在胸膜肿瘤清除(在单剂量的1e5CAR T细胞后)二十八天后，将1e6MSLN+肿瘤细胞注射到胸膜腔(肿瘤再激发)中。MBBz CAR T细胞防止所有小鼠中的肿瘤生长，而在最初用M28z CAR T细胞治疗的4只小鼠中的2只中观察到肿瘤生长和死亡。进行Student氏t检验，并使用Bonferroni校正(*P<0.05；***P<0.001)确定统计学显著性。数据表示三次重复的平均值±SEM或作为单个点绘制。
图52A～F描述PD-1受体及其配体在体内上调。(A)肿瘤浸润M28z和MBBz CAR T细胞在其施用后6天表达抑制性受体，但MBBz CAR T细胞表达更低水平的PD-1。(B)在胸膜内施用后6天，肿瘤浸润性CAR T细胞(TIL)的PD-1受体表达的平均荧光强度(MFI)。(C)在胸膜内施用后6天，肿瘤浸润性CAR T细胞的CD4和CD8亚群中PD-1 mRNA的相对表达。数据以相对于未刺激的M28z T细胞的PD-1 mRNA表达的倍数变化表示。(D)从进展性肿瘤分离的肿瘤浸润性M28z CAR T细胞表达抑制性受体PD-1、Tim-3和Lag-3。(E)从用M28z CAR T细胞治疗的小鼠收获的单细胞肿瘤悬液表达高水平的PD-1结合配体。(F)体外培养的间皮瘤肿瘤细胞表达PD-1受体的配体(PD-L1、PD-L2)，并且在与IFN-γ和TNF-α孵育24小时后表达进一步上调。
图53A～D描述PD-L1抑制CAR T细胞效应物功能。(A)3T3成纤维细胞被转导以单独表达间皮素(MSLN+，左)或共表达MSLN与PD-L1(MSLN+PD-L1+，右)。(B～D)在用3T3 MSLN+或MSLN+PD-L1+靶标刺激后评估M28z和MBBz CAR T细胞效应物功能。PD-L1在重复抗原刺激时抑制M28z和MBBz CAR T细胞聚集(B)，在MSLN+PD-L1+肿瘤细胞两次刺激后的细胞裂解功能(C)和在第一次刺激时Th1效应细胞因子分泌(D)。数据表示三次重复的平均值±SEM或作为单个点绘制。
图54表示有效逆转录病毒转导人T细胞以表达Mz、M28z和MBBz CAR。(顶部)显示的是基因转移后4天的代表性FACS分析。在活/死染色排除非存活细胞后，使用荧光减去一个染色来设置阳性门。所有实验使用具有50％至70％CAR转导效率的T细胞；T细胞组之间的转导百分比彼此在5％以内。(底部)CD4+和CD8+T细胞亚群都被有效转导。示出为CAR T细胞设门后的CD4+和CD8+百分比。
图55表示与M28z CAR T细胞相比，MBBz CAR T细胞表达更少耗尽、更有效的表型。通过重复抗原刺激扩增4-1BB和CD28共刺激的T细胞，并且在第三次刺激后20小时提取mRNA并进行RT-PCR分析。数据以相对于未转导CD4+的T细胞的mRNA表达的倍数变化表示。MBBzCAR T细胞表达更高水平的EOMES(Eomesodermin)和TBX21(T-bet)，和更低水平的PDCD1(PD-1)和FOXP3(Foxp3)。所有比较是显著的，P<0.001。在使用不同供体的3个独立实验中，结果相似。
图56表示M28z和MBBz CAR T细胞共表达PD-1以及其它抑制性受体。对具有胸膜肿瘤小鼠胸膜内施用后6天收获肿瘤浸润性M28z和MBBz CAR T细胞。用针对PD-1和Lag-3(左)或PD-1和Tim-3(右)的抗体将细胞共染色并通过流式细胞术分析。同种型染色对照(顶部)用于建立阳性门。
图57描述在各种癌细胞和正常细胞上的MSLN表达。
图58描述在各种癌细胞和正常细胞上的每个细胞MSLN分子的定量。
图59描述在各种癌细胞和正常细胞上的MSLN的mRNA表达水平。
图60描述M28z CAR T细胞对各种癌细胞和正常细胞的细胞毒性。
图61描述在外源IL-2的存在下，反复抗原刺激后的CAR T-细胞聚集。
图62描述在不存在外源IL-2时，反复抗原刺激后的CAR T-细胞聚集。
图63A～C描述M28z CAR T细胞在肺癌模型中的体内效果。(A)研究设计。(B)通过生物荧光(BLI)的肿瘤生长分析。(C)存活分析。
图64A～D描述M28z CAR T细胞在肺癌模型中的体内聚集。(A)研究设计。(B～D)通过BLI的T-细胞聚集分析。
具体实施方式
本发明公开的主题总体提供靶向间皮素的嵌合抗原受体(CAR)。在一个非限制性实例中，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域以大约1nM至大约25nM的结合亲和力(Kd)特异性结合人间皮素。本发明公开的主题还提供表达靶向间皮素的CAR的免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)，以及使用此类免疫应答细胞治疗瘤形成和其他病理的方法。恶性细胞已经发展了一连续机制来保护自身免于免疫识别和清除。本方法在肿瘤微环境中提供了用于肿瘤根除的免疫原性，并且表现出优于常规的过继性T细胞治疗的显著进步。
一.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第二版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编，1988)；TheGlossary of Genetics，第五版，R.Rieger等(编)，Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另有说明，本文使用的以下术语具有下文给出的含义。
本文使用的术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的惯例，“约”可以指在3个或多于3个标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值的高达20％、优选高达10％、更优选高达5％、再更优选高达1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在数值的一个数量级内、优选在5倍以内、更优选在2倍以内。
本文使用的术语“细胞群体”是指表达相似或不同表型的至少两种细胞的组。在非限制性实例中，细胞群体可以包括至少约10个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个表达相似或不同表型的细胞。
本文使用的术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，而且指保留免疫原结合能力的抗体分子片段。此类片段在本领域中也是众所周知的，并且在体外和体内常规使用。因此，本文使用的术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，而且指众所周知的活性片段F(ab')2和Fab。缺少完整抗体的Fc片段的F(ab')2和Fab片段，更快地从循环中清除，并且可能具有更少的完整抗体的非特异性组织结合(Wahl等，J.Nucl.Med.24：316～325(1983))。本发明的抗体包括完整天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab’、单链V区片段(scFv)、融合多肽和非常规抗体。
本文使用的术语“单链可变片段”或“scFv”是免疫球蛋白(例如小鼠或人)的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其共价连接形成VH::VL异源二聚体。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过肽编码接头(例如，10、15、20、25个氨基酸)连接，其将VH的N末端与VL的C-末端连接或将VH的C末端与VL的N末端连接。接头通常富含用于柔性的甘氨酸，以及用于溶解性的丝氨酸或苏氨酸。接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。在一个非限制性实例中，接头包含具有如下文所提供的SEQ ID NO:17所示序列的氨基酸。
GGGGSGGGGSGGGGS[SEQ ID NO:17]
在一个实施方式中，编码SEQ ID NO:17的氨基酸序列的核苷酸序列在下面提供的SEQ ID NO:18中给出。
GGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCA[SEQ ID NO:18]
在另一个实施方式中，编码SEQ ID NO:17的氨基酸序列的核苷酸序列在下面提供的SEQ ID NO:19中给出。
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCA[SEQ ID NO:19]
尽管去除了恒定区并引入了接头，scFv蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包含VH和VL编码序列的核酸表达，如Huston等人所述(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879～5883，1988)。还可参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公开号20050196754和20050196754。具有抑制活性的拮抗性scFv已有描述(参见，例如，Zhao等，Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6)：455～51；Peter等，J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012年8月12日；Shieh等，J Imunol 2009 183(4)：2277～85；Giomarelli等，Thromb Haemost 200797(6)：955～63；Fife等，J Clin Invst 2006116(8)：2252～61；Brocks等，Immunotechnology 1997 3(3)：173～84；Moosmayer等，TherImmunol1995 2(10：31～40)。具有刺激活性的激动性scFv已有描述(参见，例如，Peter等，JBioi Chern 2003 25278(38)：36740～7；Xie等，Nat Biotech1997 15(8)：768～71；Ledbetter等，Crit Rev Immunol 1997 17(5-6)：427～55；Ho等，BioChim Biophys Acta2003 1638(3)：257～66)。
本文使用的“F(ab)”是指结合抗原但是是单价的并且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个F(ab)片段和一个Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不结合抗原的Fc区)。
本文使用的“F(ab')2”是指由胃蛋白酶消化完整IgG抗体产生的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab')(二价)区，其中每个(ab')区包含两条分开的氨基酸链，H链的一部分通过S-S键与轻(L)链连接用于结合抗原，其中H链的剩余部分连接在一起。“F(ab')2”片段可以分裂成两个单独的Fab'片段。
本文使用的术语“载体”是指任何遗传元件，比如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，其当关联有适当的控制元件时能够复制，并且其可以将基因序列转移到细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体和质粒载体。
本文使用的术语“表达载体”是指一种重组核酸序列，即重组DNA分子，其含有期望编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的适当的核酸序列。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选的)和核糖体结合位点，通常伴随其它序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止子及聚腺苷酸化信号。
本文使用的术语“亲和力”(affinity)是指结合强度的量度。不受理论的束缚，亲和力取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间的立体化学配合的紧密程度、它们之间接触区域的大小以及带电和疏水基团的分布。亲和力还包括术语“亲合力”(avidity)，其是指形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。用于计算抗体对抗原的亲和力的方法在本领域是已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。功能试验(例如，流式细胞术试验)中的抗体活性也反映抗体亲和力。可以使用功能试验(例如，流式细胞术试验)对抗体进行表型鉴定并比较亲和力。
本发明的方法中有用的核酸分子包括任何编码本发明多肽或其片段的核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％相同，但通常表现出基本同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下，在互补多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其部分之间配对以形成双链分子。(参见，例如，Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol，152：399；Kimmel，A.R.(1987)Methods Enzymol，152：507)。
例如，严格的盐浓度通常小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠、优选小于约500mMNaCl和50mM柠檬酸三钠、更优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格杂交可以在至少约35％甲酰胺、更优选至少约50％甲酰胺的存在下获得。严格温度条件通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、最优选至少约42℃的温度。改变其它参数，例如杂交时间、洗涤剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及载体DNA的包含或排除，对本领域技术人员来说是熟知的。通过根据需要组合这些不同条件来实现各种严格的水平。在优选的实施方式中，杂交将在30℃下在750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，杂交将在37℃下在500mMNaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中发生。在最优选的实施方式中，杂交将在42℃下在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。这些条件的可用变化对于本领域技术人员将是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将在严格性上变化。洗涤严格性条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上文，可以通过降低盐浓度或通过升高温度来提高洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格的盐浓度优选小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠、最优选小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃、更优选至少约42℃、甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方式中，洗涤步骤将在25℃下在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在68℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。这些条件的另外的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员熟知的，并且描述于例如Benton和Davis(Science 196：180，1977)；Grunstein和Rogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 72：3961，1975)；Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，New York，2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular CloningTechniques，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York。
“基本同一性”是指与参照氨基酸序列(例如，本文所述的任何一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任何一种核酸序列)表现出至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列在氨基酸水平或核酸与用于比较的序列至少60％、更优选80％或85％、更优选90％、95％或甚至99％相同。
序列同一性通常使用序列分析软件(例如，Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)衡量。此类软件通过对各种取代、缺失和/或其它修饰指定同源性程度来匹配相同或相似的序列。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，e-3和e-100之间的概率得分表示密切相关的序列。
本文使用的术语“类似物”是指结构相关的多肽或核酸分子，其具有参照多肽或核酸分子的功能。
本文使用的术语“配体”是指结合受体的分子。特别地，配体结合另一个细胞上的受体，允许细胞到细胞的识别和/或相互作用。
本文使用的术语“疾病”是指破坏或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或障碍。疾病的实例包括瘤形成或细胞的病原体感染。
本文使用的术语“有效量”是指足以具有治疗效果的量。在一个实施方式中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制瘤形成的持续增殖、生长或转移(例如，侵袭或迁移)的量。
本文使用的术语“内源的”是指在细胞或组织中正常表达的核酸分子或多肽。
本文使用的术语“外源的”是指并非内源性存在于细胞中或不以足以达到过表达时获得的功能性效果的水平存在的核酸分子或多肽。因此，术语“外源的”将包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。
本文使用的术语“异源核酸分子或多肽”是指并非正常存在于细胞中或由细胞获得的样品中的核酸分子(例如，cDNA、DNA或RNA分子)或多肽。该核酸可以来自另一生物体，或者其可以是例如细胞或样品中并非正常表达的mRNA分子。
本文使用的术语“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞、或其祖细胞、或其子代。
本文使用的术语“调节”是指正或负地改变。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约100％的变化。
本文使用的术语“增加”是指正向地改变至少约5％，包括但不限于正向地改变5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、或约100％。
本文使用的术语“减少”是指负向地改变至少约5％，包括但不限于负向地改变约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或约100％。
本文使用的术语“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的细胞。
本文使用的术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指不同程度地游离于在其天然状态中发现的正常伴随的组分之外的物质。“分离”表示从原始来源或环境分开的程度。“纯化”表示比分离更高的分开程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质与其它物质充分分离，使得任何杂质不会实质上影响蛋白质的生物学性质或引起其他不良后果。也就是说，如果本发明的核酸或肽在通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基，或化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品，则其是纯化的。纯度和均一性通常使用分析化学技术、例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，其可以单独纯化。
本文使用的术语“病原体”是指能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生动物。
示例性病毒包括但不限于逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒，比如HIV-1(也称为HDTV-III、LAVE或HTLV-III/LAV或HIV-III；以及其他分离物，比如HIV-LP)；微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如引起肠胃炎的病毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如Hantaan病毒、Bunga病毒、静脉炎病毒和Naira病毒)；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠弧病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类病毒(例如δ型肝炎(被认为是乙型肝炎病毒的缺损卫星)的因子、非甲非型乙型肝炎(1类＝内部传播；2类＝非肠道传播(即丙型肝炎)的因子；诺瓦克(Norwalk)及相关病毒和星状病毒)。
示例性细菌包括但不限于巴氏杆菌(Pasteurella)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌(Pseudomonas)属和沙门氏菌(Salmonella)物种。感染性细菌的具体实例包括但不限于，幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、Borelia burgdorferi、嗜肺性军团病菌(Legionellapneumophilia)、分枝杆菌(Mycobacteria sps)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟型结核杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、M.kansaii、M.gordonae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌(Group AStreptococcus))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌(Group BStreptococcus))、链球菌(Streptococcus)(草绿色链球菌组(viridans group))、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(Streptococcus)(厌氧菌(anaerobic sps.))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌(Campylobacter sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌(corynebacterium sp.)、[猪]红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、拟杆菌(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)和伊色列氏放线菌(Actinomyces israelli)。
本文使用的术语“受体”是指存在于细胞膜上的选择性结合一种或多种配体的多肽或其部分。
本文使用的术语“识别”是指选择性结合靶标。识别病毒的T细胞通常表达结合病毒所表达的抗原的受体。
本文使用的术语“参照”或“对照”是指比较标准。例如，可以将表达CAR和scFv的细胞的scFv抗原结合水平与表达单独的CAR的相应细胞的scFv抗原结合水平进行比较。
本文使用的术语“分泌的”是指多肽通过内质网、高尔基体的分泌通路从细胞中释放，以及作为在细胞质膜瞬时融合的囊泡将蛋白质释放到细胞外。
本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合到”或“特异性靶向”是指多肽或其片段识别并结合目的生物分子(例如多肽)，但其基本上不识别结合样品中的其他分子，例如天然地包括本发明多肽的生物样品中的其他分子。
本文使用的术语“治疗(treating、treatment)”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病过程的临床干预，并且可以用于预防，或在临床病理过程期间进行。治疗的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理学后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、减轻或缓和疾病状态、和缓解或改善的预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止受侵袭或诊断的受试者或疑似患有病症的受试者中的病症引起的恶化，而且治疗可以预防具有病症风险或疑似患有病症的受试者中病症或病症症状的发作。
本文使用的术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等(例如，其将是特定治疗的受者、或从其中收获细胞)。
二.嵌合抗原受体(CAR)
嵌合抗原受体(CAR)是工程化的受体，其将感兴趣的特异性移植或赋予到免疫效应细胞。CAR可以用于通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。
有三代CAR。“第一代”CAR通常由细胞外抗原结合结构域(例如单链可变片段(scFv))与跨膜结构域融合，再与T细胞受体链的胞质/细胞内结构域融合而组成。“第一代”CAR通常具有来自CD3ζ链的细胞内结构域，其是来自内源性TCR信号传导的主要传递者。“第一代”CAR可以提供重新的抗原识别并且通过在单个融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域激活CD4+和CD8+T细胞，而不依赖HLA介导的抗原递呈。“第二代”CAR将来自各种共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40)的细胞内结构域添加到CAR的胞质尾部，以向T细胞提供额外的信号。“第二代”CAR包括既提供共刺激(例如CD28或4-1BB)又提供激活(CD3ζ)的那些CAR。临床前研究表明，“第二代”CAR可以提高T细胞的抗肿瘤活性。例如，在慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中，靶向CD19分子的临床试验证实了“第二代”CAR修饰的T细胞的强烈功效。“第三代”CAR包括提供多种共刺激(例如CD28和4-1BB)和激活(CD3ζ)的那些CAR。
根据本公开的主题，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域以约1nM～25nM的解离常数(Kd)结合人间皮素。在具体的非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv。在具体的非限制性实施方式中，细胞外抗原结合结构域是任选交联的Fab。在具体的非限制性实施方式中，细胞外结合域是F(ab)2。在具体的非限制性实施方式中，任何前述分子可以包含在具有异源序列的融合蛋白中以形成细胞外抗原结合结构域。
间皮素(MSLN)是高度表达于实体癌症28-33的免疫原性细胞表面抗原27,28。MSLN参与细胞增殖34、粘附35,36、侵袭37-39、细胞信号传导35和转移40。研究已经证明，可以在人32,33,41-47和小鼠中测量由表达MSLN的肿瘤分泌的血清可溶性MSLN相关肽(SMRP)，并且已经显示其与治疗反应和预后相关。在正常组织中，MSLN仅在胸膜、心包膜和腹膜中以低水平表达28,48。抗MSLN重组免疫毒素SS1P在患者中显示出体内特异性和显著的抗肿瘤活性49,50。在胰腺癌疫苗试验中，具有生存优势的患者具有与疫苗诱导的迟发型超敏反应相关的对MSLN的持续CD8+T细胞应答51。衍生自MSLN的特异性T细胞表位显示激活人T细胞以有效地裂解表达MSLN的人肿瘤52。因此，有强有力的证据表明，靶向MSLN的过继性免疫治疗可靶向表达MSLN的肿瘤。
在某些非限制性实施方式中，MSLN是具有NCBI参考编号：AAV87530.1(SEQ ID NO:43)的序列或其片段的人间皮素。
SEQIDNO：43提供如下：
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域对人MSLN具有高的结合特异性以及高的结合亲和力。例如，在这样的实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域(例如以scFv或其类似物实施的)以约25nM或更低的解离常数(Kd)结合人MSLN。在一些实施方式中，Kd为约24nM、约23nM、约22nM、约21nM或约20nM或更小。在其它实施方式中，Kd为约15nM或更小，比如约14nM，约13nM，约12nM或约11nM。在其它实施方式中，Kd为约10nM或更小，比如约9nM、约8nM、约7nM或约6nM。在其它实施方式中，Kd为约5nM或更小，比如约4nM、约3nM、约2.5nM、约2nM或约1nM或更小。在一些实施方式中，Kd为约1至约20nM，比如约2.5至约15nM、或约5至约10nM。在一些实施方式中，Kd为约1nM至约25nM、约1nM至约20nM、约1nM至约15nM、约1nM至约10nM、约5nM至约10nM、约1nM至约5nM、或约1nM至约2nM。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含美国专利号8,357,783中描述的人抗间皮素抗体或其抗原结合部分，该专利的全部内容引入本文以供参考。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域衍生自结合人间皮素的抗体的重链可变区和轻链可变区，例如Feng(2009)中公开的抗体m912，其全部内容引入本文以供参考。抗体m912是通过对重组间皮素进行淘选而从人Fab文库中分离的。在其他实施方式中，细胞外抗原结合结构域衍生自Fab'(例如，来自人或小鼠Fab文库)。
本发明公开的CAR的细胞外抗原结合结构域(例如以scFv或其类似物的实施方式)与人MSLN的结合可以通过例如酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、FACS分析、生物检测法(例如，生长抑制)或Western Blot检测来确认。这些试验中的每一种通常通过使用对目的复合物特异的标记试剂(例如，抗体或scFv)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，scFv可以放射性标记并用于放射免疫法(RIA)(见例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，1986-3，其引入本文以供参考)。放射性同位素可以通过比如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影术的方法检测。在某些实施方式中，用荧光标记物标记MSLN靶向的细胞外抗原结合结构域。荧光标记物的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite和mKalama1)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean和CyPet)和黄色荧光蛋白(例如YFP、Citrine、Venus和YPet)。在一个实施方式中，用GFP标记靶向MSLN的人scFv。
在某些非限制性实施方式中，本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域识别或结合MSLN水平为约1,000或更多个MSLN结合位点/细胞的人MSLN。在某些实施方式中，本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域识别或结合MSLN水平为约1,000至约50,000个MSLN结合位点/细胞的人MSLN。在一些实施方式中，本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域不识别或结合MSLN表达水平小于1,000个MSLN结合位点/细胞的人MSLN，例如表达人MSLN的正常组织，例如正常胸膜、心包膜和腹膜组织。在某些实施方式中，本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域不识别或结合MSLN表达水平超过50,000个MSLN结合位点/细胞的人MSLN。在一个实施方式中，本公开的CAR包含的人scFV识别或结合MSLN表达水平为约1,000至约50,000个MSLN结合位点/细胞的人MSLN。在一个实施方式中，本公开的CAR包含的人scFV不识别或结合MSLN表达水平超过50,000或小于1,000个MSLN结合位点/细胞的人MSLN。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含重链可变区，其包含具有如下文所提供的SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸。
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTSGQAG[SEQ ID NO:1]
编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含轻链可变区，其包含具有如下文所提供的SEQ ID NO:3所示序列的氨基酸。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSGFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ ID NO:3]
编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含轻链可变区，其包含具有如下文所提供的SEQ ID NO:5所示序列的氨基酸。
RHQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSGFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ ID NO:5]
在某些实施方式中，本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。在一个具体实施方式中，本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域包含人scFV。在一个实施方式中，人scFV包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸1～119的重链可变区。在另一个实施方式中，人scFV包含重链可变区，其包含具有如下文所提供的SEQ ID NO:6所示序列的氨基酸。
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSSS[SEQ ID NO:6]
在一个实施方式中，人scFV包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸1～107的轻链可变区。在一个实施方式中，人scFV包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸1～107的轻链可变区。
在某些实施方式中，人scFV包含具有如下文所提供的SEQ ID NO:7所示序列的氨基酸。
在一个实施方式中，编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:8所示。
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtgcagctgcaggagtccggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccgtcagcagtggtagttactactggagctggatccggcagcccccagggaagggactggagtggattgggtatatctattacagtgggagcaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgctgcggacacggccgtgtattactgtgcgagagaggggaagaatggggcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcacgacatcagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtaccccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggactgcggccgca[SEQ ID NO:8]
在另一个实施方式中，编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:9所示。如SEQ ID NO:9所示的核酸序列以合成方式优化用于密码子使用，其可以增加CAR的表达。
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGCAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCGTGAGCAGCGGCAGCTATTATTGGAGCTGGATTCGCCAGCCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTTATTATAGCGGCAGCACCAACTATAACCCGAGCCTGAAAAGCCGCGTGACCATTAGCGTGGATACCAGCAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACCGCGGCGGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAAGGCAAAAACGGCGCGTTTGATATTTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCGCCATCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTAGCAGCTATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGCGGCGAGCAGCCTGCAGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGAGCTATAGCACCCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGCACCGCGGCGGCG[SEQ ID NO:9]
在另一个实施方式中，编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:10所示。如SEQ ID NO:10所示的核酸序列以合成方式优化用于密码子使用，其可以增加CAR的表达。
atggccCTCCCGGTAACGGCTCTGCTGCTTCCACTCGCACTGCTCTTGCATGCTGCCAGACCACAGGTCCAGCTGCAGGAGAGTGGGCCTGGACTGGTTAAGCCGAGTGAGACACTTTCCTTGACGTGCACTGTGAGCGGGGGAAGTGTGTCCTCAGGTAGTTATTACTGGTCCTGGATTCGCCAGCCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGATAGGTTATATCTATTATTCTGGCAGCACTAATTACAATCCTTCTCTCAAAAGTAGGGTGACAATTTCAGTGGATACTTCCAAAAATCAGTTTAGTCTGAAGCTCAGCTCTGTGACAGCTGCTGATACTGCAGTTTACTACTGCGCCAGGGAGGGGAAGAATGGCGCCTTCGATATTTGGGGACAGGGCACTATGGTGACTGTATCAAGCGGAGGCGGTGGCAGCGGCGGGGGAGGGAGTGGAGGCGGCGGGTCTCGACATCAGATGACACAGAGCCCATCATCACTTAGCGCCAGCGTTGGCGACCGGGTTACGATAACATGCAGGGCTTCCCAATCTATCAGTTCTTATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAGGCCCCCAAGCTGCTCATCTACGCAGCCTCATCCCTGCAGAGCGGCGTCCCTAGTCGATTTTCCGGTAGTGGGTCAGGGACAGATTTTACCCTGACTATCAGTTCACTGCAGCCCGAGGACTTCGCGACATACTATTGCCAACAGTCCTATAGTACACCCTTGACATTTGGCGGCGGGACTAAAGTAGAAATTAAACGCACCgcggccgca[SEQ ID NO:10]
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包含具有SEQ ID NO:11所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:12所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR2、和包含具有SEQ ID NO:13所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR3。在一些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包含具有SEQ ID NO:14所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:15所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR2、和包含具有SEQ ID NO:16所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR3。在一个非限制性的示例性实施方式中，细胞外抗原结合结构域是衍生自在Feng等人，Mol.Cancer Therapy(2009)；8(5)：1113～1118所公开的全人抗MSLN抗体m912的人scFv，其引入本文以供参考。
SEQ ID NO:11～16提供如下：
GGSVSSGSYY[SEQ ID NO:11]
IYYSGST[SEQ ID NO:12]
AREGKNGAFDIW[SEQ ID NO:13]
QSISSY[SEQ ID NO:14]
AASS[SEQ ID NO:15]
QQSYSTPLTF[SEQ ID NO:16]
本文使用的术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的本公开的CAR(例如，细胞外抗原结合结构域)的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，比如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本发明公开主题的人scFv中。可以根据其物理化学性质如电荷和极性将氨基酸分组。保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基被相同组内的氨基酸替代的取代。例如，氨基酸可以通过电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。此外，氨基酸可以通过极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同组的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能试验检测改变的抗体的保留功能(即，以上(c)至(l)中所述的功能)。在某些实施方式中，在特定序列或CDR区内改变不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基。
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域能够包含连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区的接头。本文使用的术语“接头”是指共价连接两个或多个多肽或核酸使得它们彼此连接的官能团(例如，化学的或多肽)。本文使用的“肽接头”是指用于将两种蛋白质偶联在一起(例如，偶联VH和VL结构域)的一个或多个氨基酸。在一个非限制性实例中，接头包含具有如下文所提供的SEQ ID NO:17所示序列的氨基酸。
GGGGSGGGGSGGGGS[SEQ ID NO:17]
在一个实施方式中，编码SEQ ID NO:17的氨基酸序列的核苷酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:18所示：
GGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCA[SEQ ID NO:18]
在另一个实施方式中，编码氨基酸序列SEQ ID NO:17的核苷酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:19所示。
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCA[SEQ ID NO:19]
此外，细胞外抗原结合结构域能够包含将新生蛋白质导入内质网的前导序列或信号肽。如果CAR将被糖基化并锚定在细胞膜中，信号肽或前导序列可能是必需的。信号序列或前导序列可以是存在于新合成的蛋白质的N-末端的肽序列(约5、约10、约15、约20、约25或约30个氨基酸长度)，其指导蛋白质进入分泌通路。在非限制性实例中，前导序列共价连接到细胞外抗原结合结构域的5’末端。在一个实施方式中，前导序列包含CD8多肽，其包含具有如下文所提供的SEQ ID NO:20所示序列的氨基酸。
MALPVTALLLPLALLLHAARP[SEQ ID NO:20]
编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的核苷酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:21所示：
ATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCC[SEQ IDNO:21]
在某些非限制性实施方式中，CAR的跨膜结构域包含跨越膜的至少一部分的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域产生不同的受体稳定性。在抗原识别之后，受体簇和信号被传递到细胞。根据本发明公开的主题，CAR的跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)，或其组合。
在一个实施方式中，跨膜结构域包含CD8多肽。该CD8多肽可具有与如下提供的NCBI参考编号为NP_001139345.1(SEQ ID NO:22)的序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的氨基酸序列(本文中的同源性可使用标准软件如BLAST或FASTA确定)，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性实施方式中，CD8多肽能够具有SEQ ID NO:22的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多235个氨基酸。或者，或另外，在非限制性的各种实施方式中，CD8多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:22的氨基酸1～235、1～50、50～100、100～150、150～200或200～235。在一个实施方式中，本发明公开的主题的CAR是Mz，其跨膜结构域包含CD8多肽。在另一个实施方式中，本发明公开的主题的CAR是MBBz，其跨膜结构域包含CD8多肽。在一个非限制性实施方式中，本公开的CAR包含跨膜结构域，其包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸137～209的CD8多肽。
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV[SEQ ID NO:22]
根据本发明公开的主题，“CD8核酸分子”是指编码CD8多肽的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明公开的CAR的跨膜结构域包含CD28多肽。CD28多肽具有与NCBI参考编号为P10747或NP_006130(SEQ ID NO:23)的序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性实施方式中，CD28多肽可以具有SEQ ID NO:23的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多220个氨基酸。或者，或另外，在非限制性的各种实施方式中，CD28多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:23的氨基酸1～220、1～50、50～100、100～150、150～200或200～220。在一个实施方式中，本发明公开的主题的CAR是M28z，其包含含有CD28多肽的跨膜结构域和包含含有含CD28多肽的共刺激信号传导区的细胞内结构域。在一个实施方式中，M28z的跨膜结构域和胞内结构域中包含的CD28多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:23的氨基酸117～220。
SEQ ID NO:23提供如下：
根据本发明公开的主题，“CD28核酸分子”是指编码CD28多肽的多核苷酸。在一个实施方式中，编码M28z的跨膜结构域和细胞内结构域(例如共刺激信号传导区)中包含的CD28多肽的CD28核酸分子包含如下文所提供的SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC[SEQ ID NO:24]
在某些非限制性实施方式中，CAR还可包含将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区(spacer)。间隔区可以是足够柔性的，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，以利于抗原识别。间隔区可以是来自IgG1的铰链区、或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞内结构域可包含可激活或刺激细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)的CD3ζ多肽。CD3ζ包含3个ITAM，并且在结合抗原后将激活信号传递到细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)。该CD3ζ多肽可具有与NCBI参考编号为NP_932170(SEQ ID NO:25)的序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性实施方式中，CD3ζ多肽可具有SEQ ID NO:25的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多164个氨基酸。或者，或另外，在非限制性的各种实施方式中，CD3ζ多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:25的氨基酸1～164、1～50、50～100、100～150或150～164。在一个实施方式中，CD3ζ多肽具有SEQ ID NO:25的氨基酸52～164的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明公开的主题的CAR是Mz，其细胞内结构域包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸52～164的氨基酸序列的CD3ζ多肽。在一个实施方式中，本发明公开的主题的CAR是M28z，其细胞内结构域包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸52～164的氨基酸序列的CD3ζ多肽。在一个实施方式中，本发明公开的主题的CAR是MBBz，其细胞内结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:25的氨基酸52～164的CD3ζ多肽。
SEQ ID NO:25提供如下：
根据本发明公开的主题，“CD3ζ核酸分子”是指编码CD3ζ多肽的多核苷酸。在一个实施方式中，编码本发明公开的CAR(例如Mz、M28z或MBBz)的细胞内结构域中包含的CD3ζ多肽的CD3ζ核酸分子包含如下文所提供的SEQ ID NO:26中所示的核苷酸序列。
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA[SEQ ID NO:26]
在某些非限制性的实施方式中，CAR的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区，其包含至少一个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激分子。本文使用的“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。至少一个共刺激信号传导区可包含CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、PD-1多肽、CTLA-4多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)，或其组合。共刺激分子可以结合共刺激配体，共刺激配体是在细胞表面上表达的蛋白质，其在结合其受体时产生共刺激应答，即实现当抗原结合其CAR分子时所提供的刺激的细胞内应答。共刺激配体包括但不限于CD80、CD86、CD70、OX40L、4-1BBL、CD48、TNFRSF14和PD-L1。作为一个实例，4-1BB配体(即4-1BBL)可结合4-1BB(也称为“CD137”)以提供细胞内信号，其与CAR信号联合诱导CAR+T细胞的效应细胞功能。U.S.7,446,190中公开了包含细胞内结构域的CAR，其细胞内结构域包含含有4-1BB、ICOS或DAP-10的共刺激信号传导区(例如，在US7,446,190中，编码4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，编码ICOS的核苷酸序列如SEQID NO:16所示，编码DAP-10的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示)，其全部内容通过引入本文以供参考。在一些实施方式中，CAR的细胞内结构域包含共刺激信号传导区，其包含两种共刺激分子：CD28和4-1BB(参见Sadelain等人，Cancer Discovery，OF1-11，(2013))、或CD28和OX40。
4-1BB可以作为肿瘤坏死因子(TNF)配体并具有刺激活性。4-1BB多肽具有与NCBI参考编号为P41273或NP_001552(SEQ ID NO:27)的序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的实施方式中，4-1BB多肽具有SEQ ID NO:27的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多255个氨基酸。或者或另外，在非限制性的各种实施方式中，4-1BB多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:27的氨基酸1～255、1～50、50～100、100～150、150～200或200～255。在一个实施方式中，本发明公开的主题的CAR是MBBz，其细胞内结构域包含4-1BB多肽。
SEQ ID NO:27提供如下：
根据本发明公开的主题，“4-1BB核酸分子”是指编码4-1BB多肽的多核苷酸。
OX40多肽可具有与NCBI参考编号为P43489或NP_003318(SEQ ID NO:28)的序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
SEQ ID NO:28提供如下：
根据本发明公开的主题，“OX40核酸分子”是指编码OX40多肽的多核苷酸。
ICOS多肽具有与NCBI参考编号为NP_036224(SEQ ID NO:29)的序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
SEQ ID NO:29提供如下：
根据本发明公开的主题，“ICOS核酸分子”是指编码ICOS多肽的多核苷酸。
CTLA-4是由活化的T细胞表达的抑制性受体，其在被相应的配体(分别为CD80和CD86；B7-1和B7-2)接合时介导活化的T细胞抑制或无反应性(anergy)。在临床前和临床研究中，通过系统性抗体输注引起的CTLA-4阻断尽管增强了内源性抗肿瘤应答，但在临床环境中具有显著的未预见的毒性。
CTLA-4包含细胞外V结构域、跨膜结构域和胞质尾区。已经表征了编码不同亚型的替代剪接变体。膜结合亚型作为通过二硫键互连的同源二聚体起作用，而可溶性亚型则作为单体起作用。细胞内结构域类似于CD28的结构域，因为其没有内在的催化活性并且包含能够结合PI3K、PP2A和SHP-2的一个YVKM基序和一个能够结合包含SH3的蛋白质的富含脯氨酸的基序。CTLA-4在抑制T细胞应答中的一种作用似乎直接通过TCR-近端信号传导蛋白比如CD3和LAT的SHP-2和PP2A去磷酸化。CTLA-4也可通过与CD28竞争CD80/86结合而间接影响信号传导。CTLA-4也已显示与PI3K、CD80、AP2M1和PPP2R5A结合和/或相互作用。
根据本发明公开的主题，CTLA-4多肽可具有与SEQ ID NO:30或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的(本文中的同源性可使用标准软件如BLAST或FASTA确定)氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的实施方式中，CTLA-4多肽可具有SEQ ID NO:30的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多223个氨基酸。或者或另外，在非限制性的各种实施方式中，CTLA-4多肽的氨基酸序列为SEQID NO:30的氨基酸1～223、1～50、50～100、100～140、141～161、162～182、183～223、141～223、162～223、或183～223。在一个实施方式中，CTLA-4多肽具有SEQ ID NO:30的氨基酸183～223的氨基酸序列。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域包含含有CTLA-4多肽的共刺激信号传导区，其氨基酸序列为SEQ ID NO:30的氨基酸183～223。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含CTLA-4多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:30的氨基酸162～182。
SEQ ID NO:30提供如下：
根据本发明公开的主题，“CTLA-4核酸分子”是指编码CTLA-4多肽的多核苷酸。
PD-1是与在内源性巨噬细胞和树突细胞上表达的其相应配体PD-L1和PD-L2接合时活化T细胞的负免疫调节剂。PD-1是268个氨基酸的I型膜蛋白。PD-1具有两种配体PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员。该蛋白质的结构包含细胞外IgV结构域，其后是跨膜区和细胞内尾区。细胞内尾区包含位于免疫受体基于酪氨酸的抑制基序和免疫受体基于酪氨酸的开关基序的两个磷酸化位点，PD-1负调节TCR信号。SHP-1和SHP-2磷酸酶在配体结合时结合PD-1的细胞质尾部。PD-L1的上调是肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的一种机制。在临床前和临床试验中，通过拮抗性抗体引起的PD-1阻断诱导通过宿主内源性免疫系统介导的抗肿瘤反应。
根据本发明公开的主题，PD-1多肽可具有与SEQ ID NO:31或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的实施方式中，PD-1多肽可具有SEQ ID NO:31的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多288个氨基酸。或者或另外，在非限制性的各种实施方式中，PD-1多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:31的氨基酸1～288、1～50、50～100、100～144、145～170、171～191、192～288、145～288、171～288或192～288。在一个实施方式中，PD-1多肽具有SEQ ID NO:31的氨基酸192～288的氨基酸序列。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域包含含有PD-1多肽的共刺激信号传导区，其氨基酸序列为SEQ ID NO:31的氨基酸192～288。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:31的氨基酸171～191的PD-1多肽。
SEQ ID NO:31提供如下：
根据本发明公开的主题，“PD-1核酸分子”是指编码PD-1多肽的多核苷酸。
淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)是免疫细胞的负免疫调节剂。LAG-3属于免疫球蛋白(Ig)超家族，并且含有4个胞外Ig样结构域。LAG3基因含有8个外显子。序列数据、外显子/内含子组成和染色体定位都表明LAG3与CD4的密切关系。LAG3也被称为CD223(分化簇223)。
根据本发明公开的主题，LAG-3多肽可具有与SEQ ID NO:32或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的实施方式中，LAG-3多肽可具有SEQ ID NO:32的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多525个氨基酸。或者或另外，在非限制性的各种实施方式中，LAG-3多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:32的氨基酸1～525、1～50、50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～420、421～450、451～471、472～525、421～525、451～525或472～525。在一个实施方式中，LAG-3多肽的氨基酸序列为SEQID NO:32的氨基酸472～525。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域包含含有LAG-3多肽的共刺激区，其氨基酸序列为SEQ ID NO:32的氨基酸472～525。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:32的氨基酸451～471的LAG-3多肽。
SEQ ID NO:32提供如下：
根据本发明公开的主题，“LAG-3核酸分子”是指编码LAG-3多肽的多核苷酸。
自然杀伤细胞受体2B4(2B4)介导NK细胞和T细胞亚群上的非MHC限制性细胞杀伤。到目前为止，2B4的功能仍在研究中，其中2B4-S亚型被认为是激活受体，2B4-L亚型被认为是免疫细胞的负免疫调节剂。2B4在结合其高亲和力配体CD48时变得契合。2B4含有基于酪氨酸的开关基序，一种允许蛋白质与各种磷酸酶结合的分子开关。2B4也被称为CD244(分化簇244)。
根据本发明公开的主题，2B4多肽可具有与SEQ ID NO:33或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％约100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的实施方式中，2B4多肽可具有SEQ ID NO:33的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多370个氨基酸。或者或另外，在非限制性的各种实施方式中，2B4多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:33的氨基酸1～370、1～50、50～100、100～150、150～215、216～229、230～250、251～370、216～370、230～370或251～370。在一个实施方式中，2B4多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:33的氨基酸251～370。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域包含含有2B4多肽的共刺激信号传导区，其氨基酸序列为SEQ ID NO:33的氨基酸251～370。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:33的氨基酸230～250的2B4多肽。
SEQ ID NO:33提供如下：
根据本发明公开的主题，“2B4核酸分子”是指编码2B4多肽的多核苷酸。
在T细胞激活期间诱导B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)表达，并且BTLA保持在Th1细胞上表达而不在Th2细胞上表达。与PD1和CTLA4一样，BTLA与B7同源物B7H4相互作用。然而，与PD-1和CTLA-4不同的是，BTLA通过与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)的相互作用表现T细胞抑制，而不仅仅是细胞表面受体的B7家族。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14)的配体，也称为疱疹病毒侵入介体(HVEM)。BTLA-HVEM复合物负调节T细胞免疫应答。已显示BTLA活化抑制人CD8+癌症特异性T细胞的功能。BTLA也称为CD272(分化簇272)。
根据本发明公开的主题，BTLA多肽可具有与SEQ ID NO:34或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性实施方式中，BTLA多肽可具有作为SEQ ID NO:34的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多289个氨基酸。或者或另外，在非限制性的各种实施方式中，BTLA多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:34的氨基酸1～289、1～50、50～100、100～134、135～157、158～178、179～289、135～289、158～289或179～289。在一个实施方式中，BTLA多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:34的氨基酸179～289。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域包含含有BTLA多肽的共刺激信号传导区，其氨基酸序列为SEQ ID NO:34的氨基酸179～289。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:34的氨基酸158～178的BTLA多肽。
SEQ ID NO:34提供如下：
根据本发明公开的主题，“BTLA核酸分子”是指编码BTLA多肽的多核苷酸。
在一个实施方式中，CAR是Mz，其包含含有特异性结合人间皮素的细胞外抗原结合结构域的细胞外抗原结合区、含有CD8多肽的跨膜结构域和含有CD3ζ多肽的细胞内结构域(参见例如，图2)。Mz还包含共价连接到细胞外抗原结合结构域的5’末端的前导序列。前导序列包含含有SEQ ID NO:20所示序列的氨基酸的CD8多肽。
在一个实施方式中，CAR是M28z，其包含特异性结合人间皮素的细胞外抗原结合区、含有CD28多肽的跨膜结构域和含有CD3ζ多肽的细胞内结构域和含有CD28多肽的共刺激信号传导区(参见，例如，图2)。M28z还包含共价连接到细胞外抗原结合结构域的5’末端的前导序列。前导序列包含含有SEQ ID NO:20所示序列的氨基酸的CD8多肽。在一些实施方式中，CAR包含M28z和共刺激配体IL-12，例如如图24E所示的M28z+IL-12。IL-12可以共价连接到M28z的细胞内结构域的3’末端。在一些实施方式中，CAR包含M28z和共刺激配体4-1BBL，例如如图24C和24D所示的M28z+4-1BBL。如图24D所示，4-1BBL可以共价连接到M28z的细胞外抗原结合结构域的5’末端。或者，如图24C所示，4-1BBL可以共价连接到M28z的细胞内结构域的3’末端。
在一个实施方式中，CAR是MBBz，其包含特异性结合人间皮素的细胞外抗原结合区、含有CD8多肽的跨膜结构域和含有CD3ζ多肽的细胞内结构域和含有4-1BB多肽的共刺激信号传导区(参见，例如，图19和24B)。MBBz还包含共价连接到细胞外抗原结合结构域的5’末端的前导序列。前导序列包含含有SEQ ID NO:20所示序列的氨基酸的CD8多肽。
在一些实施方式中，本发明公开的主题的CAR可进一步包含用于在人细胞中表达核酸序列的诱导型启动子。用于表达CAR基因的启动子是组成型启动子，例如泛素C(UbiC)启动子。
MSLN特异性CAR在体外和体内环境中针对卵巢癌、恶性胸膜间皮瘤(MPM)和三阴性乳腺癌(TNBC)显示出效力54-58。两个I期临床试验已经使用抗MSLN的CAR转导的T细胞。NCI I期临床试验(NCT01583686)用CAR T细胞治疗转移性或不可切除的表达MSLN的癌症，联合清髓性化疗和/或阿地白介素(aldesleukin)(IL-2类似物)以增强CAR T细胞持久性。宾夕法尼亚大学I期临床试验(NCT01355965)给予间皮瘤患者1至3个剂量的RNA转染的MSLN靶向的CAR T细胞。在后期研究中，在第三治疗的患者中观察到人抗小鼠抗体(HAMA)应答(CancerImmunol Res 2013年4月7日)。与NCI和U Penn临床试验中的MSLN CAR不同，在一个实施方式中，与来自鼠抗体的CAR相比，本公开的MSLN靶向CAR源自人Fab53，因此提供了大大降低的免疫原性风险(参见(参见Maus等人，Cancer Immunol Res(2003)；1(1)：26～31)，其报道了源自鼠抗体的CAR的潜在免疫原性可能是mRNA CAR的安全问题)。本公开的MSLN靶向的CAR可以转导CD4+和CD8+T细胞，因此，用CAR转导患者的T细胞产生辅助性和CTL应答，导致持续的抗肿瘤反应。
三.免疫应答细胞
本发明提供了表达包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的CAR的免疫应答细胞，如上所述，其中细胞外抗原结合结构域特异性结合人间皮素。本发明公开的主题还提供了使用此类细胞治疗例如需要增强的免疫应答的疾病的方法。本发明的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。淋巴谱系的细胞包含B、T和天然杀伤(NK)细胞，提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物质的检测、对宿主外源细胞的检测等。淋巴谱系的细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)。T细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，并且主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与获得性免疫系统。本发明公开主题的T细胞可以是任何类型的T细胞，包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中心记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(例如，TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关恒定T细胞、和γδT细胞。在一些实施方式中，表达CAR的T细胞表达Foxp3以实现和维持T调节表型。自然杀伤(NK)细胞可以是作为细胞介导的免疫的一部分并且在先天免疫应答期间起作用的淋巴细胞。NK细胞不需要预先活化以便对靶细胞发挥其细胞毒性作用。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞的子集。
本发明公开主题的免疫应答细胞可以表达特异性结合人间皮素的细胞外抗原结合结构域(例如人scFV、任选交联的Fab或F(ab)2)，用于治疗或预防瘤形成。此类免疫应答细胞可以施用于有此需要的受试者(例如人受试者)，用于治疗或预防实体瘤(例如间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜瘤、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastriccancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)和/或胆管癌)。在一个实施方式中，免疫应答细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一个实施方式中，T细胞是CD4+T细胞。
本公开的免疫应答细胞可以进一步包含至少一种外源性共刺激性配体，使得免疫应答细胞外源性地共表达或被诱导为外源性地共表达间皮素特异性CAR和至少一种外源性共刺激性配体。间皮素特异性CAR和至少一种共刺激配体之间的相互作用提供了对于免疫应答细胞(例如，T细胞)的完全激活而言重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员和免疫球蛋白(Ig)超家族配体。TNF是参与全身炎症并刺激急性期反应的细胞因子。它的主要作用是调节免疫细胞。TNF超家族的成员具有许多共同的特征。大多数TNF超家族成员被合成作为包含短胞质区段和相对长的细胞外区的II型跨膜蛋白(细胞外C末端)。TNF超家族成员包括但不限于神经生长因子(NGF)、CD40L(CD40L)/CD154、CD137L/4-1BBL、TNF-α、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、CD30L/CD153、肿瘤坏死因子β(TNFβ)/淋巴毒素-α(LTα)、淋巴毒素-β(LTβ)、CD257/B细胞激活因子(BAFF)/Blys/THANK/Tall-1、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)和TNF相关性细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)。免疫球蛋白(Ig)超家族是参与细胞识别、结合或粘附过程的大量细胞表面的可溶性蛋白质。这些蛋白质与免疫球蛋白共享结构特征——它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于CD80和CD86、CD28的配体、PD-1的配体PD-L1/(B7-H1)。
在一些实施方式中，至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14、PD-L1，及其组合。在一个实施方式中，共刺激性配体是4-1BBL。在一个非限制性实施方式中，如图24C和24D所示，免疫应答细胞共表达M28z和4-1BBL，例如M28z+4-1BBL。如图24D所示，4-1BBL可以共价连接到M28z的细胞外抗原结合结构域的5’末端。或者，如图24C所示，4-1BBL可以共价连接到M28z的细胞内结构域的3’末端。
OX40L多肽可具有与NCBI参考编号：BAB18304或NP_003317(SEQ ID NO:35)或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
SEQ ID NO:35提供如下：
根据本发明公开的主题，“OX40L核酸分子”是指编码OX40L多肽的多核苷酸。
此外，本公开的免疫应答细胞可以进一步包含至少一种外源性细胞因子，使得免疫应答细胞外源性地共表达或被诱导为外源性地共表达间皮素特异性CAR和至少一种细胞因子。在一些实施方式中，所述至少一种细胞因子选自IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17和IL-21。在一个实施方式中，细胞因子是IL-12。在一个非限制性实施方式中，如图24E所示，免疫应答细胞共表达M28z和IL-12，例如M28z+IL-12。IL-12可以共价连接到M28z的细胞内结构域的3’末端。
另外，免疫应答细胞可以表达结合不同于人间皮素的抗原的第二CAR。可以用作与本发明公开主题中的间皮素特异性CAR联合的第二CAR的CAR包括在Sadelain等人，“TheBasic Principles of Chimeric Antigen Receptor Design”Cancer Discovery，OF1-11，(2013)、Chicaybam等人，(2011)、Brentjens等人Nature Medicine 9：279～286(2003)和U.S.7,446,190中描述的那些CAR，上述全部内容引入本文以供参考，例如CD19靶向的CAR(参见US 7,446,190；US 2013/0071414)、HER2靶向的CAR(参见Ahmed等人，Clin CancerRes.，2010)、MUC16靶向的CAR(参见Chekmasova等人，2011)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)靶向的CAR(例如，Zhong等人，Molecular Therapy，18(2)：413～420(2010)，上述所有的全部内容引入本文以供参考。在WO 2014/055668中描述表达两种或更多种抗原识别受体(例如，CAR)的免疫应答细胞，其全部内容引入本文以供参考。
抗原可以是肿瘤或病原体抗原。任何合适的肿瘤抗原(抗原肽)适用于本文所述的肿瘤相关实施方式。肿瘤抗原的来源包括但不限于癌蛋白。抗原可以表达为肽或完整蛋白或其部分。完整蛋白或其部分可以是天然的或诱变的。合适的抗原包括但不限于前列腺特异性膜抗原(PSMA)和前列腺干细胞抗原(PCSA)。在一些实施方式中，肿瘤抗原可以是碳酸酐酶IX(CAlX)、癌胚抗原(CEA)、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(LlCAM)、黑色素瘤抗原家族A,1(MAGE-A1)、粘蛋白16(Muc-16)、粘蛋白1(Muc-1)、NKG2D配体、癌-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、Wilms肿瘤蛋白(WT-1)、1型酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1)，或其组合。
用于治疗病原体感染或其它感染性疾病(例如免疫受损受试者)的合适的致病性抗原包括但不限于存在于巨细胞病毒(CMV)、Epstein Barr病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒的病毒抗原。包含靶向病毒抗原的第二CAR的免疫应答细胞可用于治疗病毒性疾病。在一个非限制性实施方式中，本公开的靶向间皮素的CAR和结合CMV抗原的第二CAR在免疫应答细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)中共表达可用于治疗CMV。
可以用于本发明公开的主题的方法中的间皮素特异性或靶向间皮素的人淋巴细胞包括但不限于外周供体淋巴细胞，例如在Sadelain,M.等，2003Nat Rev Cancer 3：35～45(公开了经基因修饰以表达CAR的外周供体淋巴细胞)；Morgan,R.A.等2006Science 314：126～129(公开了经基因修饰以表达包含α和β异源二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞)；Panelli,M.C.等2000J Immunol 164：495～504；Panelli,M.C.等2000J Immunol 164：4382～4392(公开了肿瘤活检中源自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物)；和Dupont,J.等2005Cancer Res 65：5417～5427；Papanicolaou,G.A.等2003Blood 102：2498～2505(公开了使用人工抗原递呈细胞(AAPC)或脉冲树突状细胞选择性体外扩增的抗原特异性外周血白细胞)。免疫应答细胞(例如T细胞)可以是自体的、非自体的(例如同种异体的)、或在体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。
可用试验比较共刺激信号对增强MSLN CAR转导的T细胞增殖、效应物功能和在重复(每周)抗原刺激时的聚集的影响。外周血淋巴细胞(PBL)可以在IRB批准的方案下从健康志愿者收获并转导。可通过FACS分析以定量GFP+(转导的)T细胞的分数和/或通过定量PCR监测基因转移效率。使用公认的共培养系统16,25,98，可以确定表达MSLN(相对于MSLN-对照)的成纤维细胞AAPC是否指导细胞因子从转导的T细胞释放(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的细胞上清液LUMINEX试验)、T细胞增殖(通过CFSE标记)和T细胞存活(通过Annexin V染色)。可评估CD80和/或4-1BBL对T细胞存活、增殖和功效的影响。T细胞可暴露于MSLN+靶细胞的重复刺激，并且确定通过重复刺激T细胞增殖和细胞因子应答是否保持相似或减少。可在严格等同的条件下并行比较Mz、M28z、MBBz、M28z+4-1BBL和M28z-IL-12 CAR构建体。可使用铬释放法进行具有多个E：T比率的细胞毒性试验。可任选地使用2因子ANNOVA，随后用成对多重比较程序进行统计分析，其中数据可以表示为平均值±SEM。可鉴定CD4和CD8 T细胞亚型(活化效应性、中枢记忆性、效应记忆性)以确定什么条件有利于中枢记忆表型的维持或扩增。
在一个非限制性实例中，在每个带有和不带有来自相同细胞系的表达MSLN的TNBC肿瘤的两个或多个小鼠中，可通过尾静脉注射以全身注射转导的(Mz/M28z/MBBz/M28z+4-1BBL)和未转导的T细胞。在施用前，T细胞可以用CFSE标记，用Gaussia荧光素酶转导，并且对它们的发射光谱进行定量。在24小时和7、40和70天，可通过T细胞的BLI以及从安乐死小鼠(每个时间点4只小鼠)收获的肿瘤的流式细胞术对TME中T细胞运输和持续性进行评估，并且可进一步通过IHC分析确认。为了确定MSLN表达对T细胞运输的特异性影响，可在右乳房垫中用表达MSLN的肿瘤细胞和在左乳房垫中用等量的MSLN阴性肿瘤细胞注射小鼠，并且全身施用T细胞。具有成像阳性TNBC的小鼠可全身注射未转导和靶向T细胞的1：1混合物。未转导的T细胞可被Click Beetle荧光素酶标记，靶向的T细胞可被Gaussia荧光素酶标记，然后用BLI来表征其与MSLN+TNBC细胞相关的药效学。T细胞持久性和增殖可通过对小鼠实施安乐死后通过流式细胞术确定的T细胞的CFSE标记来区分。
在一个非限制性实例中，为了研究靶向T细胞的特异性和功效，具有转移性TNBC(胸膜转移性疾病或全身性转移性疾病)的SMRP和成像阳性小鼠被分为4组，每组36只小鼠。小鼠用全身(组1)或胸膜内(组2)递送的对照T细胞或用全身(组3)或胸膜内(组4)递送的MSLN靶向的T细胞治疗。对照T细胞可用hrGFP载体转导。可递送100万个细胞至500万个细胞的剂量的T细胞。除了监测体重减轻和恶病质之外，通过连续BLI和通过测量SMRP来监测肿瘤负荷。可在T细胞施用后7、21、40和70天处死来自每组的三只小鼠用于组织学检查和IHC分析。通过流式细胞术分析收获的组织的靶向T细胞的持续性和表型。T细胞治疗功效评价参数是肿瘤负荷，其可以通过肿瘤结节的数量和分布(在胸膜腔中＝疾病/治疗小鼠的平均胸壁重量-对照小鼠的平均胸壁重量)、淋巴结转移的数量和负荷、血清SMRP水平、通过流式细胞术检测的实体器官中的微转移肿瘤负荷、以及小鼠的长期存活来评估。在每组12只小鼠的平行实验中监测和测量每组小鼠的中值存活和存活曲线。
在某些实施方式中，本公开的免疫应答细胞(例如T细胞)表达约1至约4、约2至约4、约3至约4、约1至约2、约1至约3、或约2至约3个载体拷贝数/细胞的本公开的间皮素特异性CAR。例如，本公开的免疫应答细胞(例如，T细胞)表达约1、约2、约3或约4个载体拷贝数/细胞的间皮素特异性CAR。在一个非限制性实施方式中，本公开的免疫应答细胞(例如T细胞)表达约3至约4个载体拷贝数/细胞的本公开的间皮素特异性CAR。在某些实施方式中，免疫应答细胞(例如T细胞)的细胞毒性和细胞因子产生与细胞中的间皮素特异性CAR的表达水平成比例。例如，免疫应答细胞中的CAR表达水平越高，免疫应答细胞表现出细胞毒性和细胞因子产生越大。具有高间皮素-CAR表达水平的免疫应答细胞(例如，T细胞)可以对具有低水平的间皮素表达例如约2000或更少、约1000或更少、约900或更少、约800或更少、约700或更少、约600或更少、约500或更少、约400或更少、约300或更少、约200或更少、约100或更少的间皮素结合位点/细胞的组织或细胞诱导抗原特异性细胞因子产生或分泌和/或表现出细胞毒性。参见例如实施例4和5。另外或或者，本公开的免疫应答细胞(例如T细胞)的细胞毒性和细胞因子产生与靶组织或靶细胞中人间皮素的表达水平成比例。例如，靶标中人间皮素的表达水平越高，免疫应答细胞显示出越大的细胞毒性和细胞因子产生。参见例如实施例5。
在某些实施方式中，靶细胞是异种MSLN表达细胞，其是包含MSLN低表达的细胞和MSLN高表达的细胞的细胞群体。在MSLN高表达的细胞存在下，本公开的免疫应答细胞可以对MSLN低表达(例如，约2,000或更少、约1,000或更少、约900或更少、约800或更少、约700或更少、约600或更少、约500或更少、约400或更少、约300或更少、约200或更少、或约100或更少的MSLN结合位点/细胞)的细胞表现出增加的细胞毒性和抗肿瘤活性。参见例如实施例2。在某些实施方式中，即使在MSLN高表达的细胞的存在下，免疫应答细胞不表现出对MSLN阴性细胞增加的细胞毒性或非特异性杀伤。因此，免疫应答细胞可以在MSLN高表达的细胞存在下对MSLN低表达的细胞表现出增加的细胞毒性和抗肿瘤活性，同时保持对MSLN阴性细胞的安全性。
在某些实施方式中，免疫应答细胞可以表达一种或多种粘附分子，其可以增加MSLN特异性CAR的亲合力，特别是当CAR是低亲和性CAR时。粘附分子的非限制性实例包括CD2和VLA-4。在免疫应答细胞上表达的CD2可以结合靶细胞(例如癌细胞)上表达的CD58。在免疫应答细胞上表达的VLA-4可以结合靶细胞(例如癌细胞)上的VCAM-1。
未纯化的CTL的来源可以是任何本领域已知的，例如骨髓、胎儿、新生儿或成人或其他造血细胞来源，例如胎肝、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如，阴性选择方法可以初步除去非CTL。mAb特别用于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标记用于阳性和阴性选择。
大部分终末分化的细胞可以通过相对粗糙的分离在初始除去。例如，磁珠分离可以用于初始除去大量不相关的细胞。优选地，在细胞分离之前，至少约80％、通常至少70％的总造血细胞将被除去。
分离步骤包括但不限于密度梯度离心；重调(resetting)；偶联至改变细胞密度的颗粒；用抗体包被的磁珠进行磁性分离；亲和层析；与mAb结合或联合使用的细胞毒试剂，包括但不限于补体和细胞毒素；和用附着于例如板、芯片的固体基质的抗体淘选、淘洗或任何其他方便的技术。
用于分离和分析的技术包括但不限于流式细胞术，其可具有不同程度的复杂性，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。
通过使用与死细胞相关的染料比如碘化丙啶(PI)，可以相对于死细胞来选择细胞。优选地，将细胞收集在包含2％胎牛血清(FCS)或0.2％牛血清白蛋白(BSA)或任何其它合适的，优选无菌的、等渗培养基的培养基中。
四.载体
免疫应答细胞(例如，T细胞、CTL细胞、NK细胞)的基因修饰可以通过用重组DNA或RNA构建体转导基本上同源的细胞组合物来实现。在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒或慢病毒)，其用于将DNA或RNA构建体导入宿主细胞基因组。例如，编码间皮素特异性CAR的多核苷酸可以克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或从替代的内部启动子驱动表达。
也可使用非病毒载体或RNA。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如使用核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和/或规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)或转基因表达(例如使用天然或化学修饰的RNA)。
对于细胞的初始基因修饰以提供间皮素特异性细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续基因修饰以提供包含含有至少两种共刺激配体的抗原递呈复合物的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样证明是有效的。逆转录病毒载体和合适的组装线的联合也是合适的，其中衣壳蛋白对于感染人细胞是有功能的。已知各种产生双嗜性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等人(1985)Mol.Cell.Biol.5：431～437)；PA317(Miller等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：2895～2902)；和CRIP(Danos等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460～6464)。非嗜性颗粒也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包衣假型包装的颗粒和本领域已知的任何其它颗粒。
可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞的直接共培养，例如通过Bregni等人(1992)Blood 80：1418～1422的方法，或者用单独的病毒上清或具有或没有合适的生长因子和聚阳离子的浓缩载体储备液培养，例如通过Xu等人(1994)Exp.Hemat.22：223～230；和Hughes等人(1992)J.Clin.Invest.89：1817的方法。
转导病毒载体可用于在免疫应答细胞中表达共刺激配体(例如4-1BBL和IL-12)。优选地，选择的载体表现出高的感染效率和稳定的整合和表达(参见例如Cayouette等人，Human Gene Therapy 8：423～430，1997；Kido等人，Current Eye Research 15：833～844，1996；Bloomer等人，Journal of Virology 71：6641～6649，1997；Naldini等人，Science272：263～267，1996；和Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：10319，1997)。可以使用的其他病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，比如Epstein-Barr病毒(也参见例如，Miller，Human Gene Therapy 15-14，1990；Friedman，Science 244：1275～1281，1989；Eglitis等人，BioTechniques 6：608～614，1988；Tolstoshev等人，Current Opinion in Biotechnology 1：55～61，1990；Sharp，TheLancet 337：1277～1278,1991；Cornetta等人，Nucleic Acid Research and MolecularBiology 36：311～322，1987；Anderson，Science 226：401～409，1984；Moen，Blood Cells17：407～416，1991；Miller等，Biotechnology 7：980～990，1989；Le Gal La Salle等，Science 259：988～990，1993；和Johnson，Chest 107：77S～83S，1995的载体)。逆转录病毒载体已充分开发，并已用于临床环境中(Rosenberg等人，N.Engl.J.Med 323：370，1990；Anderson等人，美国专利号5,399,346)。
在一个非限制性实例中，编码本公开的靶向MSLN的CAR的载体是逆转录病毒载体，例如基于莫洛尼鼠(Moloney murine)白血病的逆转录病毒载体SGFγ-逆转录病毒载体，比如编码M28z的SGFγ-逆转录病毒载体，如图24A和26所示。SFG-ICAS9-P2A-M28z质粒DNA的核苷酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:36所示：
CATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAGACTATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCGGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTccggaaaaaacttttctttaaaacatcaGGATCTGGAGCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCAATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCCTCAGGTTCAGCTTCAGGAGAGTGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGTGAGACTCTCAGCTTGACTTGCACAGTTTCTGGAGGCAGTGTCTCCTCAGGCAGCTATTATTGGTCCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGGAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATATATTACAGTGGCAGCACAAATTACAATCCATCCCTGAAGTCTCGAGTAACTATCAGTGTGGACACAAGCAAGAATCAGTTTTCACTCAAACTGTCTTCTGTGACTGCTGCTGACACTGCTGTTTATTATTGTGCCAGGGAGGGGAAAAATGGGGCATTTGATATTTGGGGTCAGGGCACAATGGTGACAGTCAGCTCTGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCACGCCATCAGATGACTCAGTCCCCcTCCAGTCTTTCTGCCTCAGTTGGGGATAGAGTGACCATCACATGCAGAGCAAGTCAGAGCATATCATCCTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAAATTGCTGATTTATGCAGCCTCAAGTCTCCAGAGTGGGGTGCCAAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCAGTGGGACAGATTTCACATTGACAATCAGCTCCCTCCAACCTGAAGATTTTGCCACCTACTATTGCCAGCAATCCTACAGCACGCCCCTGACTTTTGGAGGTGGCACAAAGGTAGAGATCAAGAGGACTGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAACAGCCACTCGAGGATCCGGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCACATGCAGCATGTATCAAAATTAATTTGGTTTTTTTtCTTAAGTATTTACATTAAATGGCCATAGTACTTAAAGTTACATTGGCTTCCTTGAAATAAACATGGAGTATTCAGAATGTGTCATAAATATTTCTAATTTTAAGATAGTATCTCCATTGGCTTTCTACTTTTTCTTTTATTTTTTTTGTCCTCTGTCTTCCATTTGTTGTTGTTGTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTGGTTGGTTGGTTAAtTTTTTTTTAAAGATCCTACACTATAGTTCAAGCTAGACTATTAGCTACTCTGTAACCCAGGGTGACCTTGAAGTCATGGGTAGCCTGCTGTTTTAGCCTTCCCACATCTAAGATTACAGGTATGAGCTATCATTTTTGGTATATTGATTGATTGATTGATTGATGTGTGTGTGTGTGATTGTGTTTGTGTGTGTGATTGTGTATATGTGTGTATGGTTGTGTGTGATTGTGTGTATGTATGTTTGTGTGTGATTGTGTGTGTGTGATTGTGCATGTGTGTGTGTGTGATTGTGTTTATGTGTATGATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTGTGTATATATATTTATGGTAGTGAGAGGCAACGCTCCGGCTCAGGTGTCAGGTTGGTTTTTGAGACAGAGTCTTTCACTTAGCTTGGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTTGCTCTTAGGAGTTTCCTAATACATCCCAAACTCAAATATATAAAGCATTTGACTTGTTCTATGCCCTAGGGGGCGGGGGGAAGCTAAGCCAGCTTTTTTtAACATTTAAAATGTTAATTCCATTTTAAATGCACAGATGTTTTTATTTCATAAGGGTTTCAATGTGCATGAATGCTGCAATATTCCTGTTACCAAAGCTAGTATAAATAAAAATAGATAAACGTGGAAATTACTTAGAGTTTCTGTCATTAACGTTTCCTTCCTCAGTTGACAACATAAATGCGCTGCTGAGAAGCCAGTTTGCATCTGTCAGGATCAATTTCCCATTATGCCAGTCATATTAATTACTAGTCAATTAGTTGATTTTTATTTTTGACATATACATGTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAAAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGATTGTCTAGTGTCTATGACTGATTTTATGCGCCTGCGTCGGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCGGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTCGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGTCCTAAAATCCCGATCGTTTAGGACTCTTTGGTGCACCCCCCTTAGAGGAGGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATATGGGCCCGGGCTAGCCTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCCCCATATGGCCATATGAGATCTTATATGGGGCACCCCCGCCCCTTGTAAACTTCCCTGACCCTGACATGACAAGAGTTACTAACAGCCCCTCTCTCCAAGCTCACTTACAGGCTCTCTACTTAGTCCAGCACGAAGTCTGGAGACCTCTGGCGGCAGCCTACCAAGAACAACTGGACCGACCGGTGGTACCTCACCCTTACCGAGTCGGCGACACAGTGTGGGTCCGCCGACACCAGACTAAGAACCTAGAACCTCGCTGGAAAGGACCTTACACAGTCCTGCTGACCACCCCCACCGCCCTCAAAGTAGACGGCATCGCAGCTTGGATACACGCCGCCCACGTGAAGGCTGCCGACCCCGGGGGTGGACCATCCTCTAGACTGC[SEQ ID NO:36]
编码M28z的SFGγ-逆转录病毒载体可以通过将两个DNA片段插入SFG骨架的6.7kbNotI/BglII中来构建。骨架编码以下：(1)除了包含Mo-MLV env编码mRNA的SA和5’UTR区之外的整个SFGγ-逆转录病毒载体；(2)与人CD3ζ信号传导结构域融合的人CD28信号传导结构域的CDS。
DNA片段1可以是来自质粒构建体SFG-iCAS9-41BBL-NY28z的1.5kb BglII/BspEI片段。该片段编码包含与iCASP9的缺少C末端八个氨基酸和终止密码子的CDS融合的Mo-MLVenv编码mRNA的SA和5’UTR的区域。iCASP9 CDS可以由Blue Heron Bio通过重新合成得到。
DNA片段2可以是来自0.979kb PCR产物的0.89kb BspEI/NotI片段。该片段编码与GSG-P2A-CD8a前导序列_m912 scFv融合的iCASP9的C-末端CDS(没有终止密码子)。可以使用以下引物由SFG-TK-2A-M28z作为模板合成该PCR产物：
(1)iCASP9-2A左侧引物：gcgctccggaaaaaacttttctttaaaacatcaggatctggagcaacaaacttc[SEQ ID NO:37]
(2)CD28右侧引物：ggtgtttccctttcacatgg[SEQ ID NO:38]。
P2A的氨基酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:39所示：
ATNFSLLKQAGDVEENPGP[SEQ ID NO:39]
编码SEQ ID NO:39的氨基酸序列的核苷酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:40所示：
GCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCC[SEQ ID NO:40]
SFG-TK_2A_M28z模板可以使用SFG-Hsvtk_P2A_P28z骨架和SFG-M28z_ires_hrGFP中的CD8a前导序列_m912 scFv序列通过重叠延伸PCR得到。SFG-M28z_ires_hrGFP中的CD8a前导_m912 scFv序列可以使用表达优化的密码子表由Blue Heron Bio通过重新合成得到。
SFG/TK_2A_P28z可以来自SFG/TP28z.3使用3个片段连接-
(1)来自SFG-TP28z.3的1462bp BglII/BssHII片段，其编码包含与HSV-TK基因融合的剪接受体位点的Mo-MLV载体的区域；
(2)来自PCR产物的880bp BssHII/NotI片段，其编码不含终止密码子_GSG_2A_CD8a信号肽_J591 ScFv的HSV-TK基因的3’末端；和
(3)来自SFG-TP28z.3的6652bp NotI/BssHII片段，其编码嵌合抗原受体的跨膜_CD28_zeta链的剩余部分加上逆转录病毒载体骨架的剩余部分。
可以使用先前构建的编码GSG_P2A_CD28z的质粒DNA作为模板扩增PCR产物。可以使用以下引物：
(1)正向HSVTK_接头_GSG_P2A：
GCGCGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACGGATCTGGAGCAACAAACTTC[SEQ IDNO:41]；和
(2)逆向-P28z R：ggtgtttccctttcacatgg[SEQ ID NO:42]
SFG-iC9-41BBL-NY28z可以通过将两个片段插入来自SFG-Hsvtk_2A_P28z的6.8kbAgeI/NotI骨架中产生：(1)来自pUC(-mcs)-CBNI的1.7kb AgeI/SacII片段，其编码与iCASP9的整个CDS融合的env mRNA的Mo-MLV SD和5’UTR以及在gsg_P2A剪切肽读码框内融合的N末端4-1BBL；和(2)来自pUC(-mcs)-CBNII的1.5kb SacII/AgeI片段，其编码通过另一个GSG_P2A剪切肽与靶向NYESO-1抗原的scFv融合的剩余的C-末端4-1BBL CDS。
pUC(-mcs)-CBNI和pUC(-mcs)-CBNII都可以从Blue Heron Bio获得，并且通过重新基因合成产生插入片段。
非病毒方法也可以用于在细胞中表达蛋白质。例如，可以通过在脂质转染(Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413，1987；Ono等人，Neuroscience Letters17：259，1990；Brigham等人，Am.J.Med.Sci.298：278，1989；Staubinger等人，Methods inEnzymology 101：512，1983)、去唾液酸血清类粘蛋白-多聚赖氨酸缀合物(Wu等人，Journalof Biological Chemistry 263：14621，1988；Wu等人，Journal of Biological Chemistry264：16985，1989)的存在下施用核酸、或通过在外科条件下的微注射(Wolff等人，Science247：1465，1990)将核酸分子引入细胞中。用于基因转移的其它非病毒方法包括体外使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的转染。脂质体对于将DNA递送到细胞中也可以是潜在有益的。正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过将正常核酸离体转移到可培养细胞类型(例如，自体的或异源的原代细胞或其子代)中来实现，之后将细胞(或其子代)注射到靶组织中或全身注射。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、(兆碱基)大范围核酸酶或TALE核酸酶)获得或得到。瞬时表达可以通过RNA电穿孔获得。
用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可以由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)引导，并且受任何合适的哺乳动物调节元件或内含子(例如，延伸因子1α增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要，可以使用已知优先引导特定细胞类型中的基因表达的增强子来引导核酸的表达。所使用的增强子可以包括但不限于特征为组织或细胞特异性增强子的那些增强子。或者，如果使用基因组克隆作为治疗性构建体，则调节可以通过同源调节序列介导，或如果需要，通过来自包括上述任何启动子或调节元件的异源来源的调节序列介导。
所得细胞可以在类似于未修饰细胞的条件下生长，由此可以扩增修饰的细胞并用于多种目的。
五.多肽及类似物和多核苷酸
本发明公开的主题中还包括特异性结合人间皮素的细胞外抗原结合结构域(例如scFv，比如衍生自抗体m912的scFv，Fab或(Fab)2)、CD3ζ、CD8、CD28、4-1BB、4-1BBL、IL-12、Mz、M28z、MBBz多肽或其片段、以及其编码多核苷酸，它们以当在免疫应答细胞中表达时增强其抗肿瘤活性的方式被修饰。本发明公开的主题提供了通过产生序列中的改变来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。此类改变包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。本发明公开的主题还包括本发明公开主题的任何天然存在的多肽的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异、通过翻译后修饰或通过两者而不同于本发明公开主题的天然存在的多肽。本发明公开主题的类似物通常可以表现出与本发明公开主题的天然存在的氨基酸序列的全部或部分至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高同一性。序列比较的长度为至少5、10、15、20、25、50、75、100或更多个氨基酸残基。同样，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，e-3和e-100之间的概率得分表示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生化，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；此类修饰可以在多肽合成或加工期间或在用分离的修饰酶处理之后发生。类似物还可以通过一级序列的改变而不同于本发明公开主题的天然存在的多肽。这些改变包括天然和诱导的遗传变异体(例如，产生自通过照射或暴露于甲磺酸乙酯的随机诱变或通过如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版)CSH Press，1989，或同上Ausubel等人所述的位点特异性诱变)。还包括环化肽、分子和类似物，其包含除L-氨基酸外的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，例如β或γ氨基酸。
除了全长多肽之外，本发明公开的主题还提供本发明公开的主题的多肽或肽结构域中任一者的片段。片段可以是至少5、10、13或15个氨基酸。在一些实施方案中，片段是至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或至少50个连续氨基酸。在一些实施方案中，片段是至少60至80、100、200、300或更多个连续氨基酸。本发明公开的主题的片段可以通过本领域普通技术人员已知的方法产生，或者可以由正常的蛋白质加工产生(例如从新生多肽中除去生物活性不需要的氨基酸或通过备选mRNA剪接或备选蛋白质加工事件除去氨基酸)。
非蛋白质类似物可具有设计为模拟本发明蛋白质的功能活性的化学结构。此类类似物根据本发明公开的主题的方法施用。此类类似物可能超过原始多肽的生理活性。模拟设计的方法是本领域公知的，并且可以根据这样的方法通过修饰化学结构来进行类似物的合成，使得当在免疫应答细胞中表达时，所得的类似物增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括但不限于取代替代的R基团和改变参考多肽的特定碳原子的饱和度。蛋白质类似物可以对体内降解相对耐受，导致施用时更长的治疗效果。用于测量功能活性的试验包括但不限于下文实施例中描述的那些。
根据本发明公开的主题，编码特异性结合人间皮素的细胞外抗原结合结构域(例如scFV(例如衍生自抗体m912的scFv)、Fab或(Fab)2)、CD3ζ、CD8、CD28、4-1BB、4-1BBL、IL-12、Mz、M28z和MBBz的多核苷酸可以通过密码子优化进行修饰。密码子优化可以改变天然存在的和重组的基因序列，以在任何给定的表达系统中实现最高可能水平的生产力。涉及蛋白质表达的不同阶段的因子包括密码子适应性、mRNA结构以及转录和翻译中的各种顺式元件。本领域技术人员已知的任何合适的密码子优化方法或技术可用于修饰本发明公开主题的多核苷酸，包括但不限于OptimumGeneTM、Encor优化和Blue Heron。
在某些实施方案中，本公开的CAR的细胞外抗原结合结构域是衍生自m912抗体的scFv。基于四种不同的算法(例如，Blue Heron和Encore算法)进行m912抗体的密码子优化。将从所有四种算法获得的密码子优化序列进行混合，并且为最佳克隆除去所有CPG和BAM-H1。密码子优化的核苷酸序列与原始m912 scFv约70％同源。为了在免疫应答细胞(例如人原代T细胞)中获得有效表达，将密码子优化的核苷酸序列连接到人CD8前导序列，例如编码SEQ ID NO:20的多核苷酸。CD8前导序列在ScFv重链(QVQL)之前提供最佳信号剪切。密码子优化使免疫应答细胞(例如多个人供体原代T细胞)中的间皮素CAR表达优化，具有良好的转导效率。测试在多个供体T细胞中的多个CAR载体拷贝数的功能效率、特异性和针对具有不同间皮素表达的多种血液和实体癌细胞的敏感性。具有1～4个的载体拷贝数(更具体地，约3～4个)的密码子优化的基于m912的间皮素CAR提供针对高间皮素表达靶标的高效细胞毒性、而对低间皮素表达靶标即正常组织有最小反应性，这是实现载体安全而不影响效率的一个关键特性。上述用于产生对表达高间皮素的癌细胞有活性、同时不作用于表达低间皮素的正常组织的特异性间皮素CAR的创新性基因工程，在确保安全性的同时用作癌症治疗的临床载体是最佳的。
六.施用
可以全身或直接向受试者提供本发明公开的主题的间皮素特异性CAR和表达它的免疫应答细胞，用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、传染病、炎性疾病或移植排斥。在一个实施方案中，将MSLN特异性CAR和表达它的免疫应答细胞直接注射到目标器官(例如，受瘤形成影响的器官)中。或者，将MSLN特异性CAR和表达它的免疫应答细胞通过例如施用到循环系统中(例如，肿瘤血管系统)间接提供给目标器官。可以在施用细胞和组合物之前、期间或之后提供扩增和分化剂，以增加体外或体内T细胞的产生。
本发明公开主题的MSLN特异性CAR和表达它的免疫应答细胞可以以任何生理学可接受的手段施用，通常是血管内施用，尽管它们也可以被引入骨或其他方便的位点，其中细胞可以找到合适的再生和分化位点(例如，胸腺)。通常，施用至少1×105个细胞，最终达到1×1010个或更多。包含表达MSLN特异性CAR的免疫应答细胞的细胞群体可以包含纯化的细胞群体。本领域技术人员可以使用各种公知的方法，比如荧光激活细胞分选(FACS)，容易地确定细胞群体中免疫应答细胞的百分比。包含经遗传修饰的表达MSLN特异性CAR的免疫应答细胞的细胞群体中的纯度范围可以是约50％至约55％、约55％至约60％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95至约100％。本领域技术人员可以容易地调整剂量(例如，纯度的降低可能需要增加剂量)。免疫应答细胞可通过注射、导管等引入。如果需要，还可以包含因子，包括但不限于白细胞介素，例如IL-2、IL-3、IL 6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21以及其它白细胞介素，集落刺激因子，比如G-、M-和GM-CSF，干扰素，例如γ-干扰素。
本发明公开主题的组合物包含药物组合物，其包含表达MSLN特异性CAR的免疫应答细胞和药学上可接受的载体。施用可以是自体的或非自体的。例如，表达MSLN特异性CAR的免疫应答细胞和包含它的组合物可以从一个受试者获得，并施用于相同受试者或不同的相容受试者。可以通过局部注射，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或胃肠外给药来施用本发明公开主题的外周血来源的T细胞或其子代(例如，体内、离体或体外衍生的)。当施用本发明公开主题的药物组合物(例如包含表达MSLN特异性CAR的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浊液、乳浊液)。
七.制剂
本发明公开主题的表达MSLN特异性CAR的免疫应答细胞和包含其的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浊液、乳浊液、分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)和合适的其混合物的溶剂或分散介质。
无菌可注射溶液可以通过将包含表达本发明公开主题的MSLN特异性CAR的免疫应答细胞的组合物掺入所需量的合适溶剂与如果需要的各种量的其它成分来制备。此类组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以是冻干的。根据给药途径和所需制剂，组合物可以包含辅助物质，比如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、凝胶或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等。可以参考标准教科书，比如引入本文以供参考的“REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCE”，第17版，1985，来制备合适的制剂，而无需过多的实验。
可以加入增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可注射药物形式的延长吸收可以通过使用延迟吸收的试剂，例如明矾单硬脂酸盐和明胶来实现。然而，根据本发明，使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与表达本发明公开主题的MSLN特异性CAR的免疫应答细胞相容。
组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本发明公开主题的组合物的所需等渗性可使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂比如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来完成。特别优选氯化钠用于含有钠离子的缓冲液。
如果需要，组合物的粘度可以使用药学上可接受的增稠剂保持在选定的水平。可以使用甲基纤维素，因为它容易购得且经济可行并且易于操作。其它合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可以取决于所选择的试剂。重要的是使用将实现所选定的粘度的量。显然，合适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液、悬浊液、凝胶或另一液体形式，比如时间释放形式或液体填充形式)。
本领域技术人员将认识到，组合物的组分应当选择为化学惰性的，并且不会影响如本发明公开主题中所述的免疫应答细胞的存活力或功效。对化学和药学原理的技术人员将不存在问题，或者可以从本公开和本文引用的文献通过参考标准教科书或通过简单实验(不涉及过多实验)，容易地避免问题。
关于本发明公开主题的免疫应答细胞的治疗用途的一个考虑是获得最佳效果所必需的细胞的量。待施用的细胞的量将根据所治疗的受试者而变化。在某些实施方案中，将约104至约1010，例如约104至约105、约104至约106、约105至约106、约106至约107、约107至约108、约108至约109、约109至约1010、约105至约109或约106至约108个本公开的免疫应答细胞施用于受试者。更有效的细胞可以以甚至更小的数量施用。在某些实施方案中，将至少约1x104、至少约1x105、约1x104至约1x105(例如，约1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104或1x105)、约1x105至约1x106(例如，1x105、2x105、3x105、4x105、6x105、7x105、8x105、9x105或1x106)、或约1x106至约1x107(例如，1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、7x106、8x106、9x106或1x107)个本公开的免疫应答细胞施用于受试者。
在某些实施方案中，将至少约1x108、约2x108、约3x108、约4x108和约5x108个本发明公开主题的免疫应答细胞施用于人受试者。将被认为是有效剂量的精确确定基于每个受试者个体的因素，包括其大小、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。剂量可以由本领域技术人员从本公开和本领域的知识中容易地确定。
本领域技术人员可容易地确定组合物中细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量，并且确定哪些在本发明公开的主题的方法中施用。通常，任何添加剂(除了活性细胞和/或物质之外)在磷酸盐缓冲盐水中以约0.001wt％至约50wt％的溶液的量存在，并且活性成分是以微克至毫克的数量级，比如约0.0001wt％至约5wt％、约0.0001wt％至约1wt％、约0.0001wt％至约0.05wt％、约0.001wt％至约20wt％、约0.01wt％至约10wt％、或约0.05wt％至约5wt％存在。对于要施用于动物或人的任何组合物，以及对于任何特定的施用方法，应当确定毒性，比如通过在合适的动物模型例如啮齿动物比如小鼠中测定致死剂量(LD)和LD 50；和引起合适的应答的组合物的剂量、其中组分的浓度和施用组合物的时间。此类确定根据本领域技术人员的知识、本公开和本文引用的文献并不需要过度实验。并且，可以在没有过度实验的情况下确定顺序施用的时间。
八.治疗方法
肿瘤微环境。
肿瘤具有敌对于宿主免疫应答的微环境，其涉及恶性细胞的一连续机制以保护自身免于免疫识别和清除。这种“不利的肿瘤微环境”包括多种免疫抑制因子，包括浸润性调节性CD4+T细胞(Treg)、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、包括IL-10和TGF-β的免疫抑制性细胞因子，以及靶向由活化T细胞(CTLA-4和PD-1)表达的免疫抑制性受体的配体的表达。这些免疫抑制机制在维持耐受性和抑制不适当的免疫应答中起作用，然而在肿瘤微环境内，这些机制阻止有效的抗肿瘤免疫应答。总之，这些免疫抑制因子可以诱导过继转移的CAR修饰的T细胞在遇到靶向的肿瘤细胞时显著的无反应性或凋亡。
肿瘤免疫学的挑战。
有效的肿瘤免疫需要肿瘤抗原识别和免疫效应细胞的无对抗的肿瘤清除。肿瘤抗原必须包含由肿瘤递呈并且可以被特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的肽表位。引发的CTL必须扩增到足够数量并迁移到肿瘤位点，在其中它们成熟为效应物以实现其功能，这种功能通过辅助性T细胞增强并被Treg和抑制性巨噬细胞抑制。
使用工程化T淋巴细胞的靶向T细胞治疗。
T细胞工程是一个开创性的战略，以潜在解决许多以前观察到的早期免疫治疗方法的缺点。在过去一年中，研究人员报道了复发的10,11、耐药(chemorefractory)白血病和转移性黑色素瘤12-14中的显著的完全缓解，其是靶向特定抗原(分别为CD19和NY-ESO-1)的自体外周血T细胞获得的。
遗传方法的原理：细胞工程可以用于将T细胞重定向至肿瘤抗原并增强T细胞功能。遗传性T细胞修饰的一个动力是增强T细胞存活和扩增并抵消T细胞死亡、无反应性和免疫抑制的潜力。还可以改进T细胞的遗传靶向以防止正常组织的不期望的破坏。
嵌合抗原受体(CAR)：可以通过转移编码CAR的基因产生肿瘤特异性T细胞15-20。第二代CAR包含肿瘤抗原结合结构域，其融合到能够激活T细胞的细胞内信号传导结构域，以及设计为增强T细胞效能和持续性的共刺激结构域21(参见图1)。因此CAR设计可以协调抗原识别与信号传导，生理上由两个单独的复合物TCR异二聚体和CD3复合物承担的两种功能。CAR的细胞外抗原结合结构域通常来源于鼠单克隆抗体(mAb)或来自受体或其配体。因此，抗原识别是非MHC限制的22,23，因此使用相同的CAR适用于表达靶抗原的任何患者。通过CAR的抗原结合触发细胞内结构域中基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的磷酸化，启动细胞裂解诱导、细胞因子分泌和增殖所需的信号传导级联。由于抗原识别的MHC限制被绕过，CAR靶向T细胞的功能不受HLA下调或抗原加工装置中的缺陷的影响。
T细胞对于扩增和存活的要求：肿瘤特异性T细胞的增殖在离体是需要的，并且在体内可以说是期望的。T细胞增殖必须伴随T细胞存活以允许绝对T细胞扩增和持续。为了响应抗原而增殖，T细胞必须接收两种信号。一种是由抗原递呈细胞(APC)的表面上展示的抗原肽/MHC复合物的TCR识别所提供19。另一种由T细胞共刺激受体，比如CD28或4-1BB受体所提供。虽然T细胞的细胞裂解活性不需要伴随的共刺激，但是如先前所证明的，提供共刺激信号以维持过继转移T细胞的抗肿瘤功能，存在关键需求17,21,24-26。
免疫监测：淋巴细胞是多功能“药物”，其在输注后表现出动态演变效应。在遇到抗原时，肿瘤特异性T细胞活化和/或释放多种可以触发肿瘤杀伤、T细胞增殖和其它免疫细胞的募集或免疫调节的蛋白质。因此，测量哪些蛋白质从哪些细胞分泌、以什么数量和在什么时间点，产生了针对特定患者为什么反应或不反应的深刻见解，并且为设计更有效的试验提供关键反馈。这些试验系统将允许直接和有意义的临床方法比较，从而有助于设计合理的下一代治疗策略。
对于治疗，施用的量是有效产生所需效果的量。可以在一次或系列施用中提供有效量。可以在推注或通过连续灌注提供有效量。
“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗后影响有益或期望的临床结果的量。可以以一个或多个剂量将有效量施用于受试者。在治疗方面，有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病的进展或以其它方式减少疾病的病理学后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的技能范围内。当确定合适剂量以达到有效量时，通常考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的病症、病症的严重程度以及施用的免疫应答细胞的剂型和有效浓度。
对于使用抗原特异性T细胞的过继免疫治疗，通常输注约106至约1010(例如约109)范围内的细胞剂量。当将免疫应答细胞施用于受试者并随后分化时，免疫应答细胞诱导为特异性针对一种特定抗原(例如，人间皮素)。T细胞的“诱导”可以包括比如通过缺失或无反应性实现的抗原特异性T细胞的失活。失活对于建立或重建比如在自身免疫性疾病中的耐受性特别有用。本发明公开主题的免疫应答细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于胸膜施用、静脉内施用、皮下施用、结内施用、肿瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用、腹膜内施用和直接施用于胸腺。在一个实施方案中，免疫应答细胞和包含它的组合物经胸膜施用于需要的受试者。
本发明公开的主题提供使用表达间皮素特异性CAR的免疫应答细胞(例如，T细胞)的各种方法。例如，本发明公开的主题提供减少受试者的肿瘤负荷的方法。在一个非限制性实例中，减少肿瘤负荷的方法包括将有效量的本公开的免疫应答细胞施用于受试者，从而在受试者中诱导肿瘤细胞死亡。本公开的免疫应答细胞可以减少受试者中肿瘤细胞的数量、减小肿瘤尺寸和/或根除肿瘤。肿瘤可以是实体瘤。实体瘤的非限制性实例包括间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜瘤、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastriccancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)和胆管癌。
本发明公开的主题还提供增加或延长患有瘤形成的受试者的存活的方法。在一个非限制性实例中，增加或延长患有瘤形成的受试者的存活的方法包括将有效量的本公开的免疫应答细胞施用于受试者，从而增加或延长受试者的存活。该方法可以减少或根除受试者中的肿瘤负荷。另外，本发明公开的主题提供用于增加受试者中的免疫应答的方法，包括将本公开的免疫应答细胞施用于受试者。本发明公开的主题还提供用于治疗或预防受试者中的瘤形成的方法，包括将本公开的免疫应答细胞施用于受试者。
本文使用的术语“瘤形成”是指以细胞或组织的病理增殖及其随后向其它组织或器官的迁移或侵袭为特征的疾病。瘤形成生长通常是不受控制的和进行性的，并且在不会引起或将导致正常细胞增殖停止的条件下发生。瘤形成可以影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、结肠、骨、脑、乳腺、软骨、神经胶质、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胸膜、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫、和阴道的器官，或其组织或细胞类型。瘤形成包括癌症，例如肉瘤(sarcomas)、癌(carcinoma)或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。在一个实施方案中，瘤形成是实体瘤。瘤形成可以是原发性肿瘤或原发性癌症。此外，瘤形成可以是转移性状态。
可使用本发明公开主题的免疫应答细胞抑制其生长的癌症包括通常对免疫治疗应答的癌症。治疗的癌症的非限制性实例包括间皮瘤、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌(例如转移性乳腺癌、转移性三阴性乳腺癌)、结肠癌、胸膜瘤、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastric cancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomachcancer)和胆管癌。另外，本发明公开的主题包括其生长可使用本发明公开的主题的免疫应答细胞来抑制的难治性或复发性恶性肿瘤。
可以使用本发明公开的主题的方法治疗的其它瘤形成或癌症的实例包括骨癌、肠癌、肝癌、皮肤癌、头或颈癌、黑素瘤(皮肤或眼内恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、喉癌、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、血癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、子宫癌、直肠癌、肛区癌、膀胱癌、脑癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、白血病(例如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括由石棉诱导的癌症、包括瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病和实体瘤比如肉瘤和癌(carcinoma)(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、许旺氏细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
另外，本发明公开的主题提供响应受试者中的癌细胞或病原体而增加免疫激活细胞因子产生的方法。在一个非限制性实例中，该方法包括将本公开的免疫应答细胞施用于受试者。免疫激活细胞因子可以是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、干扰素调节因子7(IRF7)，及其组合。在某些实施方案中，本发明公开主题的包含间皮素特异性CAR的免疫应答细胞增加GM-CSF、IFN-γ和/或TNF-α的产生。
本发明公开的主题提供特别可用于治疗实体瘤(例如间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜癌、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastric cancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)和胆管癌)的疗法。实体瘤可以是原发性肿瘤或转移状态的肿瘤。某些实体瘤是表达异质MSLN的肿瘤，例如乳腺癌(例如TNBC)、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌、结肠癌、胃癌(gastric cancer)和恶性胸膜间皮瘤(MPM)。异质MSLN表达细胞(例如肿瘤细胞)是包含低表达MSLN的细胞和高表达MSLN的细胞的细胞群体。在高表达MSLN的细胞的存在下，本公开的免疫应答细胞可以对低表达MSLN(例如，约2,000或更少、约1,000或更少、约900或更少、约800或更少、约700或更少、约600或更少、约500或更少、约400或更少、约300或更少、约200或更少、或约100或更少的MSLN结合位点/细胞)的细胞表现出增加的细胞毒性和抗肿瘤活性。参见例如实施例2。在某些实施方案中，即使在高表达MSLN的细胞存在下，免疫应答细胞不表现出对MSLN阴性细胞的增加的细胞毒性或非特异性杀伤。因此，免疫应答细胞可以在高表达MSLN的细胞的存在下表现出对低表达MSLN的细胞增加的细胞毒性和抗肿瘤活性，同时保持对MSLN阴性细胞的安全性。
进行治疗的合适的人受试者通常包括可以通过临床标准区分的两个治疗组。具有“晚期疾病”或“高肿瘤负荷”的受试者是具有临床可测量的肿瘤的受试者。临床可测量的肿瘤是可以基于肿瘤块检测的(例如通过触诊、CAT扫描、声波图、乳房X线照片或X射线；阳性生物化学或组织病理学标记本身不足以鉴定该群体)的肿瘤。将本发明公开主题所包含的药物组合物施用于这些受试者以引起抗肿瘤反应，目的是减轻他们的病症。理想地，结果是发生肿瘤块的减少，但是任何临床改善均构成益处。临床改善包括降低的肿瘤的风险或进展速率或病理学后果的减少。
第二组合适的受试者在本领域中称为“辅助组”。他们是具有瘤形成史但已对另一种治疗方式应答的个体。先前的治疗可以包括但不限于手术切除、放射治疗和传统化疗。结果，这些个体没有临床可测量的肿瘤。然而，他们被怀疑在原始肿瘤位点附近或通过转移而处于疾病进展的风险中。该组可以进一步细分为高风险和低风险个体。根据在初始治疗之前或之后观察到的特征进行细分。这些特征在临床领域中是已知的，并且针对每种不同的瘤形成被适当地定义。通常的高风险亚组的特征是其中肿瘤侵入邻近组织或显示淋巴结参与的那些。
另一组具有瘤形成的遗传易感性，但尚未证实瘤形成的临床表现。例如，对于仍然处于育龄期但在与乳腺癌相关的遗传突变的测试为阳性的妇女，希望预防性地接受本文所述的一种或多种抗原结合片段以预防性地防止瘤形成的发生，直到适合于进行预防性手术。
受试者可以具有晚期形式的疾病，在这种情况下，治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展和/或减轻副作用。受试者可以具有病史，例如他们已经经过治疗，在这种情况下，治疗目标通常包括复发风险的降低或延迟。
此外，本发明公开的主题提供用于治疗患有病原体感染(例如，病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或原生动物感染)的受试者的方法。本发明公开的主题对于增强免疫受损个体的免疫应答特别有用。对使用本发明的方法治疗敏感的示例性病毒感染包括但不限于巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒感染。因此，本发明公开的主题提供治疗或预防受试者的病原体感染的方法，该方法包括施用有效量的本发明公开主题的表达间皮素特异性CAR的免疫应答细胞。
根据本发明公开的主题，上述各种方法可以包括施用至少一种免疫调节剂。免疫调节剂的非限制性实例包括免疫刺激剂、检验点免疫阻断剂、放射治疗剂和化疗剂。在某些实施方案中，免疫调节剂是免疫刺激剂。免疫刺激剂的非限制性实例包括IL-12和激动性共刺激单克隆抗体(agonist costimulatory monoclonal antibodies)。在一个实施方案中，免疫刺激剂是IL-12。在某些实施方案中，本发明公开主题的免疫应答细胞与抗IL-12抗体组合可用于治疗乳腺癌(BC)，例如转移性三阴性乳腺癌(TNBC)。激动性共刺激单克隆抗体的非限制性实例包括抗4-1BB抗体、抗OX40抗体和抗-ICOS抗体。在一个实施方案中，激动性共刺激单克隆抗体是抗4-1BB抗体。
本发明公开主题的一个重要方面是不仅产生用于过继疗法的肿瘤靶向的(例如间皮素特异性的)T细胞，而且通过设计改善的抗原受体和通过使用IL-12进行免疫调节干预宿主微环境来增强T细胞功能。在所有免疫治疗方法中，IL-12作为多功能细胞因子，已被认为是治疗BC59-61的最有希望的方法之一。IL-12被认为是适应性1型细胞介导的免疫的主要调节剂，该免疫是参与抗肿瘤应答的关键途径62。IL-12调节各种水平的抗肿瘤应答，包括CD4 T细胞向Th1表型的极化63、T细胞和NK效应物功能的增强64、重塑先天免疫应答65和调节肿瘤血管生成66。IL-12的免疫调节和抗血管生成功能已经提供使用该细胞因子与本发明公开的主题的免疫应答细胞联合治疗癌症(例如BC(例如TNBC))的基本原理。在148个临床试验中，包括将IL-12施用于癌症患者(最近报道了36个)，成功的II期腹腔内67,68或皮下69, 70IL-12研究显示，通过基因转移产生的IL-12的旁分泌，可以在局部和远处诱导针对肿瘤的免疫。虽然几项研究已经证明IL-12在乳腺癌(BC)59,61,71的临床前模型中的抗癌效果，但是在晚期癌症的一些临床试验中观察到的施用重组人IL-12导致的显著毒性排除了其临床使用。为了克服这个限制，许多组已经证明使用腺病毒载体的肿瘤内递送IL-12在BC72,73的临床前模型中诱导肿瘤消退和T细胞活化。最近，Sabel等人使用聚乳酸微球释放IL-12进入肿瘤，发现抗肿瘤反应主要由NK细胞介导74。其他人曾使用间充质基质细胞局部递送IL-12到小鼠BC75。紫杉醇和曲妥珠单抗与IL-12联合在表达HER2/neu的恶性肿瘤患者中的I期试验显示，在刺激NK细胞细胞因子分泌方面，IL-12和曲妥珠单抗之间的令人印象深刻的协同作用76。因此，IL-12作为抗癌剂可以具有相当大的前景，并且其在过继T细胞治疗方法中作为共刺激剂的用途是充分证明的。
在某些实施方案中，免疫调节剂是检查点免疫阻断剂。检验点免疫阻断剂的非限制性实例包括抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体和抗TIM3抗体。在一个实施方案中，检查点免疫阻断剂是抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，本发明公开主题的免疫应答细胞与抗PD-L1抗体联合可用于治疗乳腺癌(BC)，例如TNBC。
程序性细胞死亡配体1(PD-L1/B7-H4/CD274)是通常在活化的发炎的组织中表达的抑制性信号，作为负反馈回路以限制T细胞活化。PD-L1表达通常在无炎症的正常组织(包括乳腺77)中不存在，并且相反，在癌组织中最普遍，特别是在具有炎性浸润的那些组织中78。这种与炎症的关联可能是由于在肿瘤细胞暴露于T细胞激活时产生的T细胞分泌的细胞因子时的PD-L1上调。这种表达模式通过BC表现，其中50％～75％的BC样本对PD-L1染色阳性79-81，并且具有与严重淋巴细胞浸润强烈相关的表达80。在54％的患者中BC浸润性T细胞也表达PD-L181。BC也固有表达继发于致癌信号传导的PD-L1。PI(3)K通路的激活导致BC细胞中PD-L1蛋白上调，并且患者肿瘤中的PI(3)K激活与PD-L1表达显著相关82。通过活化T细胞的PD-1表达在空间和时间上将配体与免疫抑制性TME内的受体表达相连接。PD-L1在BC组织中的表达表明其作为这些患者的免疫治疗靶标。PD-L1/PD-1阻断在多种临床前癌症模型(包括乳腺癌83)中的功效为使用PD-L1或PD-1靶向抗体用于晚期癌症患者的I期试验铺平了道路。I期研究(使用PD-1抗体)仅在PD-L1+患者中显示功效84。基因工程改造的T细胞为克服共抑制检查点和通常在TME内发现的共刺激的缺乏提供独特的优势。表达CAR的T细胞是真正工程化的，以优化其共刺激需要，以支持T细胞扩增、存活和功能。
在一些实施方案中，免疫调节剂是放射治疗剂。局部的、辐射诱导的免疫学环境不仅可以提供增强肿瘤中靶向T细胞的植入的前提条件(从而消除对全身性淋巴细胞清除方案的需求)，而且由放射疗法和过继T细胞疗法联合产生的免疫应答还增强了远位抗肿瘤功效。在耐辐射的肿瘤中，CAR T细胞中的4-1BB共刺激信号传导可以克服免疫抑制。在一些实施方案中，免疫调节剂是化疗剂，包括但不限于顺铂。顺铂诱导的趋化因子和细胞因子的分泌可以促进MSLN靶向的和内源性T细胞应答。
研究表明，存在高水平的细胞毒性肿瘤浸润淋巴细胞(cTIL)和低水平的调节性T细胞(Treg)的肺腺癌(LAC)和恶性胸膜间皮瘤(MPM)患者具有更好的预后和更长的无进展存活(Servais等人，Clin Cancer Res(2012年5月1日)，18：2478～2489；Kachala等人，ClinCancer Res(2013)，20(4)：1020～8)。使用MSLN靶向的CAR的过继T细胞治疗可用于促进LAC和MPM中的cTIL。Servais(2012)和Kachala(2013)报道，MSLN过表达，促进LAC和MPM中的攻击性——证明选择MSLN作为CAR T细胞治疗的靶标。顺铂和放射治疗后更高比例的TIL与小鼠模型和患者中改善的结局相关(图32、33和34)。
肿瘤放射和顺铂治疗诱导的肿瘤和远位免疫调节可以提供更好地植入过继转移的T细胞所需的前提条件；针对肿瘤和基质免疫调节的T细胞共刺激策略可以加强内源性和过继转移的T细胞的抗肿瘤功效。
另外，使用表达间皮素特异性CAR的免疫应答细胞(例如，T细胞)的上述各种方法，例如用于治疗受试者中的癌症或用于降低受试者中的肿瘤负荷，可以与癌细胞抗原调节联合。表达间皮素特异性CAR的免疫应答细胞(例如，T细胞)可以靶向和杀灭在肿瘤或癌细胞的膜上表达的MSLN(称为“细胞膜MSLN”)而不是细胞质MSLN。某些肿瘤或癌症(例如，肺癌和间皮瘤)具有低细胞膜MSLN，但是具有高细胞质MSLN。癌细胞抗原调节可以增加细胞膜MSLN在肿瘤或癌细胞中的表达，这可以使肿瘤或癌细胞更可能被表达CAR的免疫应答细胞靶向，因此更易于被免疫应答细胞杀伤。在一个实施方案中，癌细胞抗原调节是放射。
可以对表达间皮素特异性CAR的免疫应答细胞(例如，T细胞)引入进一步修饰以避免或最小化免疫并发症(称为“恶性T细胞转化”)的风险，例如移植物抗宿主病(GvHD)，或当健康组织表达与肿瘤细胞相同的靶抗原时，导致与GvHD相似的结果。这个问题的潜在解决方案是将自杀基因工程化到表达CAR的T细胞中。合适的自杀基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型半胱天冬酶9自杀基因(iCasp-9)和截短的人表皮生长因子受体(EGFRt)多肽。在一个实施方案中，自杀基因是EGFRt多肽。EGFRt多肽可以通过施用抗EGFR单克隆抗体(例如西妥昔单抗(cetuximab))来使T细胞能够清除。如图25所示，EGFRt可以共价连接到MSLN特异性CAR(例如，Mz、M28z、MBBz)的细胞内结构域的3’末端。自杀基因可以包括在包含编码本公开的间皮素特异性CAR的核酸的载体中。以这种方式，施用一种设计为在恶性T细胞转化期间(例如GvHD)活化自杀基因的前药(例如，可以活化iCasp-9的前药如AP1903)引发自杀基因活化的表达CAR的T细胞的凋亡。
此外，本发明公开的主题提供预防或治疗受试者中的炎性疾病的方法。在一个非限制性实例中，该方法包括将本公开的免疫应答细胞施用于受试者。在一个实施方案中，免疫应答细胞是免疫抑制性细胞。在一个非限制性实例中，免疫抑制性细胞是调节性T细胞。在一个实施方案中，炎性疾病是胰腺炎。在一个实施方案中，受试者是人。在一个具体实施方案中，受试者是器官移植的受者，例如胰腺移植的受者。
此外，本发明公开的主题提供在作为器官移植受者的受试者中预防移植排斥的方法。在一个非限制性实例中，该方法包括将本公开的免疫应答细胞施用于受试者。在一个实施方案中，免疫应答细胞是免疫抑制性细胞。在一个非限制性实例中，免疫抑制性细胞是调节性T细胞。在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是胰腺移植的受者。
本公开的间皮素特异性CAR可以转导入免疫抑制性细胞，例如调节性T细胞。可以将转导的免疫抑制性细胞施用于患有炎性病症或炎性疾病的受试者(例如人)。在一些实施方案中，炎症部位或炎性疾病部位具有高表达水平的间皮素，其被本公开的MSLN-CAR识别。炎性病症可以是极端的，例如严重的胰腺炎。此外，转导的免疫抑制性细胞可以施用于作为器官移植受者的受试者。
另外，本公开的MSLN特异性CAR以及靶向MHC抗原的第二CAR可以共转导入免疫抑制性细胞(例如，调节性T细胞)，使得免疫抑制性细胞可以特异性地在移植胰腺的位点聚集。在一个实例中，MHC I类受试者从MHC II类供者接受胰腺移植；受者的调节性T细胞用本公开的MSLN特异性CAR和靶向MHC II类抗原的第二CAR转导，因此受者的转导的调节性T细胞在移植的胰腺的部位聚集/汇集，避免移植或器官排斥。
九.试剂盒
本发明公开的主题提供用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫病症或同种异体移植的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含治疗或预防组合物，其包含有效量的包含单位剂型的间皮素特异性CAR的免疫应答细胞。在具体实施方案中，细胞还包含共刺激配体。在一些实施方案中，试剂盒包含含有治疗性或预防性疫苗的无菌容器；此类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。此类容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合于保存药物的其它材料制成。
如果需要，免疫应答细胞与将细胞施用于具有或有风险发生瘤形成、病原体感染、免疫病症或同种异体移植的受试者的说明书一起提供。说明书通常包括关于组合物用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植的用途的信息。在其它实施方案中，说明书包括以下中的至少一个：治疗剂的说明；用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植或其症状的剂量方案和施用方法；注意事项；禁忌；适应症；非适应症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接印在容器上(当存在时)、或作为标签贴到容器上、或作为单独的页、小册子、卡片或折叠式印刷品，在容器中或与容器一起提供。
实施例
除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其完全在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有充分解释，比如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait，1984)；“Animal Cell Culture”(Freshney，1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir，1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller和Calos，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel，1987)；“PCR:The PolymeraseChain Reaction”，(Mullis，1994)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan，1991)。这些技术适用于生产本发明的多核苷酸和多肽，并且因此可以在制备和实施本发明时考虑。在下面的部分中将讨论用于具体实施方式的特别有用的技术。
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何进行和利用本发明的试验、筛选和治疗方法的完全公开和描述，并且不意在限制发明人认定作为他们的发明的范围。
实施例1.工作实施例
1.引言
使用嵌合抗原受体(CAR)的癌抗原靶向T细胞疗法最近在治疗血液恶性肿瘤方面获得了临床成功。将CAR T细胞疗法用于实体瘤存在必须克服以实现临床益处的若干障碍。实体瘤限制在解剖层次内，阻碍有效的T细胞运输，通常缺乏共刺激配体的表达，并表达T细胞功能的负调节剂。因此，清除实体瘤依赖于能够克服肿瘤介导的免疫抑制的T细胞的成功浸润。
基因工程激活共刺激信号到抗原特异性嵌合受体中可以抵消免疫抑制肿瘤微环境，以确保T细胞增殖和存活。共刺激信号增强抗肿瘤功效的能力归因于CD4+和CD8+T细胞亚群的协同作用。通常，认为CD8+T细胞在清除癌细胞中起主要作用，而CD4+T细胞提供CD8+效应物形成和防止CD8+T细胞耗尽所必需的辅助细胞因子。最近，理解CD4+T细胞本身可以介导有效的抗肿瘤效力这点突出了该亚群在肿瘤免疫治疗中演变的作用。嵌合抗原受体特别适合于将CD4+T细胞有效募集到抗肿瘤应答的所有方面。CAR T细胞识别细胞表面肿瘤抗原，绕过了在大多数肿瘤中缺乏的MHC II类表达的需要。此外，它们的抗体来源的抗原识别结构域为CD4+T细胞介导的裂解提供所必需的高结合性亲和力。
在胸膜间皮瘤原位模型中，为了促进向肿瘤的有效T细胞递送，T细胞被直接施用到胸膜腔中。据推测，胸膜内施用的CD4+CAR T细胞将能够直接裂解肿瘤，并且与由CD28共刺激所赋予的增强的增殖能力一致，其本身应当介导体内肿瘤清除所需的所有功能。本实施例证实了量级等同于CD8+CAR T细胞的有效的CD4+介导的肿瘤细胞裂解，和CD4+CAR T细胞分泌IL-2并在反复体外抗原刺激后扩增的独特能力。胸膜内施用的基因靶向间皮素的CD4+T细胞，经历强大的增殖和这些细胞的单独转移，导致大规模定植的胸膜肿瘤的排斥。此外，CD4+CAR T细胞迁移出胸膜腔并建立长期的肿瘤免疫，这由通过它们的能力产生对胸膜外肿瘤再激发的应答来证明。总之，体外和体内研究支持区域性施用CAR T细胞以克服实体瘤所造成的障碍这一应用。本实施例表明，能够产生T细胞辅助和细胞毒性的多功能CD4+T细胞的产生为使用CAR+T细胞疗法来治疗实体瘤提供了特别的优势。
2.材料和方法
细胞系
MSTO-211H(人胸膜间皮瘤)和EL4(鼠胸腺瘤)均获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC。MSTO-211H细胞经逆转录病毒转导以表达绿色荧光蛋白/萤火虫荧光素酶融合蛋白(MSTO GFP-ffLuc+)，以促进非侵入性体内生物发光成像。然后用亚克隆到SFG逆转录病毒载体中的人MSLN-变体1(由人卵巢癌细胞系(OVCAR-3)分离)转导这些细胞，以产生MSTO MSLN+GFP-ffLuc+。
γ逆转录病毒载体构建和病毒的生产
为了产生间皮素特异性嵌合抗原受体，构建一种融合蛋白，其编码全人scFv m912连接到人CD8前导肽的N末端。使用γ逆转录病毒载体作为骨架构建体，通过使用位于scFv的5’端的NcoI位点和位于3’端的NotI位点的定向克隆，交换该scFv以产生第一代(SFG-Mz)和第二代(SFG-M28z)间皮素特异性构建体。插入内部核糖体进入位点以促进CAR与人源化重组绿色荧光蛋白(hrGFP)报告基因的双顺反子表达。然后将SFG-Mz、SFG-M28z和SFG-P28z转染到293T H29包装细胞系中，并将该病毒上清液用于转导并产生稳定的293T RD114细胞系。
T细胞分离、基因转移和CD4/CD8分离
根据机构审查委员会批准的方案从健康志愿者供者的血液中分离外周血白细胞。通过在Lymphoprep(Accurate Chemical&Scientific Corporation，NY)上的低密度离心来分离PHA活化的外周血单核细胞(PBMC)。分离后两天，在涂有15μg/ml纤维连接蛋白(retronectin，Takara Biomedical，Otsu，Japan)的平板上，每天将PBMC用293T产生的含有Mz、M28z或P28z载体的上清液转导1小时，持续2天。在允许3天的载体表达后，将转导的PBMC保持在20单位/ml IL-2中。通过流式细胞术测定转导效率。
根据制造商的说明书(Invitrogen，CA)，使用 UntouchedTM人CD4和CD8 T细胞分离试剂盒，通过阴性选择方案获得CD4和CD8 T细胞的纯群体。分离的细胞立即用于实验或在补充有10％FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI 1640中培养。对于体内实验，培养基还补充有20单位/mL的IL-2。
细胞毒性测定
通过标准51Cr释放试验测定用嵌合抗原受体或载体对照转导的T细胞的细胞毒性。在96孔圆底板中，在含有10％FCS、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的200μl RPMI中的1×106个总T细胞，以100μl培养基以1：2连续稀释。将靶细胞与100μCi 51Cr/1×106个细胞温育2小时，并以5×103个细胞/100μl的终浓度重悬。用培养基洗涤三次后，将100μl靶细胞加入到T细胞中，并在37℃下在5％CO2湿润的培养箱中孵育4至24小时。对于使用MSLN刺激的CD4细胞的实验，将CD4效应物和靶标在100μl的总体积中孵育4小时，并加入细胞毒性试验中，其中效应物和靶标悬浮于100μl中，上述总体积为200μl。在添加外源IL-2的实验中，将细胞在终浓度为10～40单位/mL的最终培养基中孵育。收集上清液，接种在96孔Lumina平板(PerkinElmer，CA)上并在PerkinElmer TopCount(PerkinElmer，CA)上测量。在用单独培养基孵育的靶细胞中评价自发51Cr释放，并且用孵育在100μl 0.2％Triton-X 100中的靶细胞测定最大51Cr释放。如下计算特异性裂解百分比：[(cpm实验释放-cpm自发释放)/(cpm最大释放-cpm自发释放)]×100。数据报告以三份测量的平均值+/-SEM，并用MicrosoftExcel(Microsoft Corp.，WA)或GraphPad Prism(GraphPad Software，CA)分析。
T细胞分离、基因转移和CD4/CD8分离
根据机构审查委员会批准的方案从健康志愿者供者的血液中分离人原代T淋巴细胞。通过在Lymphoprep(Accurate Chemical&Scientific Corporation，NY)上的低密度离心来分离PHA活化的外周血单核细胞(PBMC)。分离后两天，根据制造商的说明书，在涂有15μg/ml纤维连接蛋白(retronectin，Takara Biomedical，Otsu，Japan)的6孔非组织培养平板(Falcon，Becton Dickinson，NJ)上，通过在24℃下以3000rpm离心(spinoculation)1小时，每天将PBMC用编码M28zG、M2zG或人重组绿色荧光蛋白(hrGFP)的逆转录病毒载体以病毒上清液转导，持续2天。将转导的PBMC保持在补充有10％FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和20单位/ml IL-2的RPMI 1640中。根据制造商的说明书(Invitrogen，CA)，使用 UntouchedTM人CD4和CD8 T细胞分离试剂盒，通过阴性选择方案获得CD4和CD8T细胞的纯群体。分离的细胞立即用于实验或在补充有10％FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI 1640中培养。对于体内实验，培养基还补充有20单位/mL的IL-2。
原位胸膜间皮瘤动物模型和过继T细胞疗法
为了开发胸膜间皮瘤的原位小鼠模型，使用6～10周龄的雌性NOD/SCIDγ(Taconic，NY)。所有步骤在机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。使用吸入的异氟烷和氧将小鼠麻醉，并施用布比卡因用于镇痛。通过右胸部切口，进行200μL无血清培养基中的1×105～1×106的肿瘤细胞的直接胸膜内注射，以建立如先前所述的原位MPM肿瘤35,37,39,40。通过直接胸膜内注射至小鼠的胸腔或通过尾静脉全身注射，用200μL无血清培养基注射，将总计3×104～3×106的转导的T细胞过继转移到荷瘤小鼠中。对于施用外源IL-2的实验，在施用过继转移的T细胞后的第二天开始，每天施用三次腹膜内剂量为100,000单位的IL-2处理小鼠。
细胞因子检测试验
在96孔圆底板中，每孔200μL培养基中含5×103的靶细胞，设三个复孔，将用M28zG、M2zG或对照载体转导的5×105～5×103T细胞与之共培养，进行细胞因子释放试验。在共培养6～24小时后，收集上清液。在Luminex IS100系统上使用多重珠人细胞因子检测试剂盒(EMD Millipore Corp.，MA)测定细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、MIP-1、MCP-1、RANTES、GM-CSF、TNF-α和IFN-γ的水平。该值表示三个复孔的平均值，误差棒表示测量的标准误差(SEM)。使用IS 2.3软件(Luminex Corp，TX)、Microsoft Excel(MicrosoftCorp.，WA)和GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.，CA)分析所得数据。
T细胞增殖试验
用具有或不具有MSLN表达的经辐照的MSTO-211H细胞刺激经M28zG、M2zG或hrGFP转导的1×106～3×106个T细胞，以1×105～3×105个细胞/3mL/孔的密度种入6孔组织培养板。新鲜RPMI-1640培养基补充有10％FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和20～40单位/ml IL-2。每7天计数细胞，然后覆盖在具有或不具有MSLN表达的经辐照的MSTO-211H细胞上。对每个T细胞组绘制细胞数对时间的曲线，并通过流式细胞术测定表型。
组织学和免疫染色
在石蜡包埋的4％多聚甲醛固定的组织样品经苏木精和伊红染色后，进行肿瘤的组织病理学评价。对于血管生成，将CD34大鼠单克隆抗体(5μg/ml，eBioscience)孵育7小时，然后用(1：200)生物素化的兔抗大鼠IgG(Vector Labs，Cat.#BA-4000)孵育16分钟。大鼠IgG2a(5μg/ml)用作合适的同型阴性对照。对于淋巴管生成，将山羊多克隆LYVE-1抗体(1μg/ml；R&D Systems)孵育3小时，然后与生物素化的兔抗山羊IgG(来自Vector labs的ABC试剂盒)孵育60分钟。建立了使用Tyramide-Alexa Fluor 488(Invitrogen)或Tyramide-Alexa Fluor 568(Invitrogen)分别用于CD34和LYVE-1的免疫荧光检测方案，并使用Discovery XT自动处理器(Ventana Medical Systems)在MSKCC Molecular CytologyCore Facility进行。使用Ventana平台，用小鼠抗人MSLN IgG(1：100，Vector Labs，CA)进行人MSLN的免疫组织化学。
定量和T细胞生物发光成像
在荷瘤小鼠中的体内BLI使用单次腹膜内剂量为150mg/kg的D-荧光素(D-Luciferin)进行。在D-荧光素注射20分钟后，用Xenogen IVIS 100Imaging System(Caliper Life Sciences，MA)对小鼠成像。根据信号强度获取5～30秒的图像。使用LivingImage 2.60软件分析BLI数据，并且BLI信号报告为总通量(光子/s)。然后使用MicrosoftExcel(Microsoft Corp.，WA)将BLI通量(光子/s)确定为腹侧和背侧图像的平均值，并用GraphPad Prism(GraphPad Software，Inc.，CA)分析。
通过单次胸膜内注射将用M28zG转导的T细胞和增强的萤火虫荧光素酶报告基因过继转移到小鼠中。转移后，用单次静脉内的单次腹膜内剂量为150mg/kg的D-荧光素对T细胞成像，并且在注射20分钟后，用Xenogen IVIS 100Imaging System成像120秒。
3.结果
靶向间皮素的CD28共刺激增强CAR T细胞功能
为了产生间皮瘤反应性T细胞，人外周血T细胞用逆转录病毒转导间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)。间皮素特异性的抗原识别由融合到下游T细胞信号传导结构域的m912scFv提供，所述T细胞信号传导结构域提供单独的CD3z信号传导(Mz)或CD3z信号传导与CD28共刺激信号传导串联(M28z)(图2A)。Mz和M28z的转导效率通过GFP报告子转基因来监测，所述GFP报告子转基因通过IRES元件关联至CAR表达。GFP信号与结合至CAR的人scFv的蛋白质-L高度相关，证明其作为报告子的可靠性。在所有实验中包括对不相关抗原赋予特异性的阴性对照。原代人T细胞的CD4+和CD8+亚群都用嵌合受体有效地转导至60～70％的等效频率用于实验(图2B)。
为了评估Mz和M28z CAR转导的T细胞的间皮素特异性效应物功能，研究了三种标准试验中的体外T细胞应答。作为靶细胞系，使用转导以过表达间皮素(MSTO MSLN+)的MSTO-211H间皮瘤癌细胞系(其缺乏内源CD80/86共刺激配体的表达)。在测量细胞毒性的铬释放试验中，在与MSTO MSLN+肿瘤细胞共培养18小时时，Mz和M28z CAR T细胞显示出等同的间皮素特异性裂解(图2C)。当比较第一代和第二代受体时观察到等同的裂解再现了可用于其它嵌合受体的数据。
在测量细胞因子分泌和增殖时通常观察到共刺激的有益效果，该发现在模型系统中证实。与Mz T细胞相比，M28z CAR T细胞分泌的GM-CSF、IFN-γ和TNF-α的量大约是其两倍。IL-2是对T细胞存活和增殖至关重要的细胞因子，只有M28z受体提供IL-2的分泌(图2D)。用阴性对照受体转导的T细胞和由间皮素阴性肿瘤细胞刺激的间皮素特异性细胞不显示细胞毒性，也不分泌细胞因子，这表明对于所有抗肿瘤效应物功能，需要具有抗原特异性。
为了评估在不存在肿瘤细胞共刺激配体表达的情况下，顺式提供用于抗原识别的CD28共刺激是否可提供T细胞聚集，在用MSTO MSLN+肿瘤细胞进行重复抗原刺激时，定量Mz和M28z CAR T细胞的扩增。在外源IL-2的存在下，间皮素特异性受体转导的T细胞扩增，在每周抗原刺激培养四周后，经CD28共刺激的细胞达到180倍的扩增。这种强烈的增殖应答比Mz CAR T细胞所达到的增强3倍(图2E，左)。此外，在不存在外源IL-2时，在这种提供T细胞存活和增殖能力的更有力测试的模型系统中，只有M28z CAR T细胞能够聚集。共刺激的T细胞能够在两次连续抗原刺激后存活和增殖，然后在第三次刺激后观察到细胞死亡诱导的T细胞数目的下降(图2E，右)。Mz和M28z CAR T细胞在连续刺激时富集GFP阳性，并且在连续刺激时获得效应物/分化的L-选择素阴性T细胞表型(图2F)。
胸膜施用的M28z转导的T细胞根除胸膜肿瘤
为了研究M28z T细胞在体内的效力，开发了使用如前所述的MSTO-211H肿瘤细胞的恶性胸膜间皮瘤的原位模型。将肿瘤细胞直接接种到胸膜腔中，并给予足够的时间(>10天)，以在开始治疗之前建立大的肿瘤负荷。肿瘤沿着胸膜表面(MRI，图3A左上)、扁长形的纵膈结构(图3A，右上)局部扩散，并侵入胸壁(图3A，底部)。这种模式重现人类疾病。在开始过继T细胞治疗之前，连续BLI用于确认肿瘤建立，随后用于测量对治疗的应答。在该实验中，在肿瘤接种后12天，用单次静脉内输注3×106的或单次胸膜施用3×105的靶向间皮素的T细胞来治疗动物。在用3×105的PSMA靶向T细胞(其在体外不裂解MSLN+肿瘤靶标(图2B))治疗的对照小鼠中，肿瘤负荷稳定地进展直到小鼠死亡(图3B和3C)。静脉内M28z T细胞治疗导致肿瘤负荷延迟的、短暂的减少，随后是晚期肿瘤进展(图3B)，产生适度的44天的存活优势(P＝0.0051，图3D)。胸膜施用的M28z T细胞诱导主要的应答。在第7天和在T细胞第11天的基线时，肿瘤负荷显著降低(图3B)。在该组中未达到中值存活(与IV相比p＝0.0013)。在胸膜施用M28z T细胞后200天，7只治疗的动物中有两只无肿瘤，但在任何其他治疗组或对照组中没有动物实现完全的肿瘤清除(图3C)。在T细胞治疗后100天，起始治疗的其它四只小鼠在抗原阴性肿瘤细胞复发前显示出明显的肿瘤消退(图3B)。
胸膜施用的T细胞扩增是强烈的和抗原特异性的
这些观察结果导向对T细胞扩增和肿瘤定位在胸膜内和静脉内施用之间是否存在差异的研究。为此，使用先前描述的动物模型，其中肿瘤局限于胸膜间隙。所有小鼠用T细胞治疗，所述T细胞被转导以共表达M28z+和增强的萤火虫荧光素酶(effLuc)，以允许CAR转导的T细胞的体内成像(图4A)。在两个治疗组中，在过继转移1×106M28z+effLuc+T细胞后4小时观察到M28z effLuc+淋巴细胞的组织分布和生物发光信号的巨大差异(图4B)。比较两组的四小时生物发光信号显示，当与静脉内相比时，胸膜局部施用的胸膜T聚集显著增加10倍。静脉内施用的T细胞在施用后8～10天显示出最初的肺滞留和适度的T细胞聚集。相反，当与单独的effLuc转导的T细胞相比时，胸膜内施用的T细胞显示显著和持续的抗原特异性聚集长达2周(数据未显示)。流式细胞术分析、T细胞计数和免疫组织化学确定T细胞数目与生物发光信号强度高度一致(图4C至4E)。此外，在输注后第7天胸膜施用的T细胞从胸膜腔运出，并循环到包括脾脏(图4F)和肺(数据未显示)的胸膜外部位。
M28z共刺激的CAR T细胞表现出有效的抗肿瘤功效和T细胞持久性
为了研究由体内CD28共刺激提供的增殖能力，用Mz、M28z或对照转导的T细胞以低剂量的3×105CAR+T细胞治疗具有胸膜肿瘤的小鼠。如前所述，在肿瘤生长18天后将T细胞直接注射到胸膜腔中。在用3×104PSMA靶向的T细胞治疗的对照小鼠中，肿瘤负荷稳定地进行直到死亡(中值存活36天)。用等剂量的Mz CAR+T细胞治疗使存活延长63天(图4a)，并在20％的小鼠中根除肿瘤。肿瘤生物发光表明在肿瘤负荷中的混合应答。用M28z受体转导的T细胞的治疗诱导肿瘤生物发光至背景发射的几乎均匀的减少，表明在M28z治疗的小鼠中大多数的根除。在该组中未达到中值存活(与Mz相比，p＝0.01)。如在大体检查中证实的，在T细胞输注后超过200天，用M28z T细胞治疗的小鼠的60％是无肿瘤的。其他小鼠在复发前最初显示明显的肿瘤消退，并存活平均125天。在更高T细胞剂量下，在两个组中观察到完全肿瘤清除，反映了两种受体的相等的细胞裂解效力，并表明在初始T细胞效应物与肿瘤细胞比例低时，CD28共刺激诱导的T细胞增殖的重要性。
在治疗小鼠的外周血中的CAR+T细胞计数的连续评价显示抗肿瘤功效和增强的T细胞存活之间的相关性强。在所有的每周测量中，M28z治疗的小鼠显示增强的T细胞持久性，包括在T细胞输注后第40天和50天的晚期时间点(图6B)。在三种单独的T细胞剂量(3×106、1×106和3×105)施用的CAR+T细胞和在T细胞输注后第14和55天在脾脏中的绝对CAR+T细胞定量时获得相似的结果。
持续T细胞的表型评估显示，在Mz和M28z治疗的小鼠中，在T细胞输注后30天CD4+T细胞的进行性富集是统计学显著的。无论T细胞剂量或分析的组织(脾脏或血液)如何，均一致地观察到该发现。这种富集对于Mz治疗的小鼠更显著，表明在CAR功效中CD4+和CD8+T细胞亚群的差异作用的两种可选解释。或者主要的CD4+T细胞的更大绝对量导致增强的M28z功效，或者是CD28共刺激的能力来维持最终导致抗肿瘤功效的CD8+T细胞的显著比例。为了解决这两种可能性，对CD4+和CD8+CAR转导的T细胞就其在体外和体内的抗肿瘤功效进行正面直接(head-to-head)比较。
CD4+CAR T细胞表现出强的细胞毒性，其依赖于CD28共刺激信号
为了比较CD4+和CD8+CAR T细胞的效应物功能，将两种T细胞亚群纯化至>98％的纯度(图6A)。在共培养4小时后，CD8+T细胞是显示细胞毒性的唯一亚群(图6B，左)；然而，在18小时共培养后，当与CD8+M28z T细胞相比时，CD4+M28z T细胞介导等同的细胞毒性。
由于CD28共刺激可以通过IL-2诱导的T细胞细胞毒性或TNF-α(能够直接诱导肿瘤细胞凋亡的细胞因子)分泌的增强来增强细胞裂解，因此评估CD28共刺激在CAR介导的细胞毒性中的作用。在多个效应物与靶标比下，CD28共刺激信号通过CD4+M28z CAR T细胞增强裂解13～16％(p<0.0001)，但通过CD8+CAR T细胞没有一致地增强的裂解(p＝0.07)。
为了确定CD28信号增强CAR T细胞细胞毒性的机制，刺激带有间皮素表达的肿瘤细胞的CD4+M28z CAR T细胞，并进行上清液转移细胞毒性试验。仅转移上清液或转移上清液加上对照转导的T细胞，不会导致可检测的裂解(图6D)。作为阳性对照，CD4+M28z裂解间皮素阳性靶标。相反，从刺激的CD4+M28z T细胞获得的富含细胞因子的上清液(通过Luminex试验确认的细胞因子浓度)的转移增强CD4+M28z(增强5～23％，p<0.0001)和CD8+M28z CAR T细胞(5～30％增强，p<0.001)的细胞毒性。对比观察到共刺激增强具有延迟动力学的CD4+CAR T细胞裂解，上清液在短期4小时共培养后增加了较小程度的裂解(对于CD4+为2.5～4％，对于CD8+为1.0～4.4％，数据未显示)。
因此，顺式提供用于抗原识别的CD28共刺激信号促进具有延迟动力学的细胞毒性CAR T细胞效应物的产生，并且在CD4+T细胞亚群中最显著。
CAR+T细胞介导的细胞毒性是颗粒酶/穿孔素通路依赖性的
已经排除通过富含细胞因子的上清液直接裂解肿瘤靶标，研究两种细胞接触依赖性(Fas/FasL或颗粒酶/穿孔素通路)裂解机制中的哪一种负责CAR T细胞的细胞毒性。抗体阻断Fas配体/Fas受体相互作用不减少通过Mz或M28z CAR T细胞的靶细胞裂解(p>0.05，图7A，底部)。流式细胞术确认了CAR T细胞表达Fas配体并且在MSTO MSLN+肿瘤上表达Fas受体(图7A，上图)。MSTO MSLN+细胞对FasL介导的细胞毒性敏感，并且实验中使用的αFasL Ab阻断这种效果(图7A，右下图)。
通过向T细胞/肿瘤细胞共培养物中添加钙螯合剂EGTA而阻断颗粒酶释放减少了所有测试组中CAR介导的裂解(p<0.0001，图7B)，证明CAR T细胞细胞毒性是穿孔素/颗粒酶通路依赖性的。使用等浓度的EGTA(4mM)观察到的细胞毒性降低在各组之间不同。在Mz(平均降低27.6％，相比对于M28z降低17.6％)和CD8+(CD8+Mz降低29.4％相比CD4+Mz降低15.3％；对于CD8+M28z降低24.2％，相比对于CD4+M28z降低11.1％)T细胞组中观察到最显著的裂解减少。
进行细胞内流式细胞术以将细胞毒性试验的结果与穿孔素颗粒酶诱导的裂解的两种主要介质——颗粒酶A和B的表达相关联。在静息PBMC中颗粒酶A和B的表达主要限于CD8+T细胞，与先前的研究一致(图7C)。在CAR转导的T细胞的PHA刺激和间皮素特异性刺激后，颗粒酶A表达没有显著改变。相反，颗粒酶B的特征在于通过诱导表达。在PHA刺激之后，大约75％的CD4+和CD8+T细胞染色呈阳性，并且在用表达间皮素的肿瘤细胞刺激后18小时，颗粒酶B在大于95％的CD4+和CD8+M28z CAR T细胞中表达。为了相对于颗粒酶B表达的动力学比较CD4+和CD8+T细胞，刺激细胞4或18小时，并且定量颗粒酶B的MFI。CD8+M28z T细胞在4小时共培养后表现出1.8倍的MFI增加，并且在最后12小时进一步上调额外0.8倍的颗粒酶B表达。然而，CD4+M28z T细胞在培养的最后12小时上调颗粒酶B表达至更大程度(在4小时内增加1.5倍，在最后12小时增加额外的2.2倍，在另外两个独立实验中获得类似的结果)。这些发现可以反映如图6B所示的CD4+CAR T细胞观察到的细胞毒性的延迟动力学。此外，CD28共刺激信号增强在CD4+和CD8+T细胞亚群中的颗粒酶B表达(图7D，18小时共培养后的表达)，可能反映了CD4+M28z T细胞所观察到的增强的细胞毒性(当与CD4+Mz T细胞相比时，图6C)和M28z T细胞对颗粒酶释放阻断的相对抗性(图7B)。
CD28共刺激在CD4+T细胞中提供优异的细胞因子分泌和增殖
为了评估CD28共刺激对体外T细胞细胞因子的相对贡献和对T细胞亚群上的抗原活化的增殖应答，将带有表达间皮素的肿瘤细胞的用Mz或M28z转导的CD4+、CD8+和本体T细胞活化，定量Th1细胞因子的分泌以及抗原特异性增殖。与CD8+T细胞相比，用Mz转导的CD4+T细胞显示增加的Th1细胞因子分泌水平，在M28z T细胞中观察到的CD28共刺激增强这种差异(图2A)。如预期的，在不存在共刺激配体的情况下，重复发生的刺激在CD4+或CD8+Mz T细胞群体中不诱导T细胞扩增，并且在不存在外源IL-2时在第一次刺激后快速诱导T细胞数量的下降(图2B)。相反，与CD8+M28z T细胞的2倍增加相比，共刺激赋予的CD4+M28z T细胞通过第3次刺激触发了20倍更高的平均增殖。
CD4 M28z CAR T细胞在体内单独有效，并且当与CD8 M28z CAR T细胞相比时介导 增强的功效
观察到的CD4+M28z T细胞的有效体外效应物功能导致一种假说，其为CD4+M28z T细胞即使在当施用时不存在CD8+T细胞，也表现出体内的功效。在肿瘤生长18天后，以三种不同剂量施用到胸膜腔中的CD4+M28z、CD8+M28z或本体未分选的M28z T细胞治疗荷瘤小鼠。在用最高剂量的3×105CAR+T细胞治疗的对照小鼠中，肿瘤负荷稳定地进行直到小鼠被处死(中值存活28天)。用CD4+M28z和本体M28z CAR T细胞治疗导致小鼠中100％的肿瘤根除，小鼠保持无肿瘤的随访至200天。CD8+M28z T细胞比对照转导的细胞延长存活83天(111天，相比28天，p＝0.003)，但是仅在3/7小鼠中导致肿瘤根除。当与CD8+M28z治疗的小鼠相比时，用CD4+M28z CAR T细胞的治疗显著延长存活(未达到ms，相比111天，p＝0.02)。在较低剂量下，当比较CD4+与CD8+M28z CAR治疗的效力(剂量为1×105，112相比67天，p＝0.04，剂量为3×104 160相比37，p＝0.001)时，结果相似。这些结果说明，CD4+CAR T细胞除了它们更常规的细胞因子产生和增殖功能之外，还能够介导裂解，优于CD8+CAR T细胞治疗。此外，即使在初始E:T比为1:10,000的剂量下，CD4+M28z T细胞的增殖潜力赋予了达到有效E:T比的能力。
过继转移的功能持久性主要是CD4+介导的，并且通过CD28共刺激增强
通过进行肿瘤再激发实验评估在持续肿瘤控制中维持T细胞的重要性。最初用胸膜MSTO MSLN+接种小鼠，并施用在两种组中几乎均匀地消灭肿瘤的剂量——1×105Mz或M28z胸膜T细胞(图4)。在初始T细胞注射后87天，将1×106MSLN+或MSLN-MSTO肿瘤细胞施用到腹膜腔中，并且通过BLI跟踪肿瘤负荷。在所有小鼠中肿瘤负荷初始增加之后，在Mz和M28z T细胞治疗的小鼠中都观察到肿瘤负荷的抗原特异性控制，在M28z小鼠中观察到更大的降低(图10)。检查小鼠中的T细胞增殖应答。在再激发后第16天处死来自所有组的小鼠，并如前所述收获脾脏。与抗原阴性肿瘤再激发相比，抗原再激发的M28z T细胞显示T细胞数量的4倍扩增(图10C)。这种脾脏中T细胞聚集的显著差异主要是由于CD4+亚群(图10D)。
4.讨论
癌症免疫治疗的主要目标是产生有效的初级免疫应答并建立T细胞持久性。实体瘤对这些目标提出了重大挑战，因为它们位于阻碍T细胞运输的解剖层次内，并且通常缺乏共刺激配体的表达。使用建立的胸膜间皮瘤的鼠模型，该实施例显示，在大多数小鼠中，基因工程化以靶向癌症抗原并提供共刺激信号传导的T细胞根除已建立的胸膜间皮瘤(图5)。本实施例证明，如通过其与CD8+T细胞相比时优异的细胞因子分泌和增殖所证明的，CD4亚群特异性地扩大共刺激信号传导的增强特性(图8)。此外，用共刺激的嵌合抗原受体转导CD4+T细胞将该亚群募集到初级细胞毒性应答中(图6)。细胞毒性潜力的获得与保留Th1辅助细胞因子分泌能力的结合形成能够独立清除胸膜间皮瘤异种移植物的强大的CD4+免疫效应物(图10)。当将T细胞直接施用到胸膜腔中时，这种抗肿瘤功效特别突出，导致当与静脉内施用相比时在显著较低的T细胞剂量下完全的肿瘤控制。肺隔离被确定为通过静脉内施用的T细胞有效肿瘤浸润的关键阻碍(图4)。相反，施用胸膜T细胞导致早期肿瘤浸润和遇到抗原后的强烈增殖。引人注目的是，局部施用的T细胞从胸膜腔迁移到体循环中(图4)，并且与共刺激信号结合，在初始T细胞输注后100天在肿瘤再激发后显示出长期功能持久性(图10)。这些发现表明通过成功招募CD4+T细胞作为抗肿瘤功效的主要介质并且通过使用局部施用以实现有效的初级和次级免疫，CAR治疗可能对克服实体瘤带来的障碍特别有用。
在本实施例中，肺隔离被确定为限制有效T细胞向实体瘤运输的关键阻碍。荧光素酶标记的T细胞的生物发光成像表明静脉内施用的T细胞的延长的肺隔离导致其在胸膜肿瘤中聚集的延迟(图4)。通过IV的T细胞的肿瘤浸润的延迟与肿瘤负荷的延迟消退一致(图3)。这些结果证实了先前的表明有效的运输和外周肿瘤的浸润与实体癌中的抗肿瘤功效相关的研究，并且表明肺隔离作为静脉内施用的T细胞的较差肿瘤聚集的主要原因。肺隔离可能部分是由于CAR+转导的T细胞的活化状态，其需要活化用于有效的逆转录病毒转导。活化的功能结果是粘附整联蛋白的亲和力的增加，所述整联蛋白结合由肺血管系统组成型表达的配体。除了用IV施用观察到的运输延迟之外，还观察到与胸膜施用相比，胸膜内肿瘤中T细胞聚集的绝对减少(图4)。肿瘤聚集的低水平可能是由于CAR T细胞向外周组织的低效运输，其通常需要另外的信号，比如L-选择素的下调和趋化因子受体和粘附分子的上调。与这些研究一致，大多数CAR转导的T细胞在施用时是L-选择素阳性的，并且可能不能有效地运输到胸膜肿瘤，这是需要在未来研究中解决的问题。旨在优化T细胞递送至实体瘤的其它策略具有过表达的趋化因子受体以增强肿瘤聚集。可以通过将T细胞局部直接施用到具有肿瘤的胸膜中的临床相关方法来规避运输需要。胸膜施用绕过肺隔离以及T细胞表型固有的任何运输偏好。所得的T细胞活化和有效的增殖应答导致抗肿瘤功效增加。重要的是，胸膜内施用的T细胞能够从胸膜腔迁移并在整个周围循环，在长达200天的长期时间点持续，并在其初始输注后大于100天建立全身性肿瘤监测(图10)。
在不存在外源IL-2时重复抗原暴露后，CD28共刺激的T细胞表现出优异的细胞因子分泌和增殖(图1)，该发现与其它嵌合受体-癌抗原模型一致。M28z CAR T细胞即使在低T细胞剂量下清除胸膜肿瘤，说明共刺激在提供体内实现有效的T细胞与肿瘤比例所需的增殖能力中的重要性。此外，CD28共刺激增强T细胞持久性(图5)，并在初次施用后大于100天的二次再激发时提供优异的肿瘤控制。引人注目的是，M28z T细胞在抗原重激发后经历了强烈的增殖，表明共刺激信号传导的持久功能性(图10)。这强调了共刺激对大肿瘤负荷的完全控制的重要性，并且表明共刺激的T细胞在存在慢性抗原刺激时更不容易耗尽。包含共刺激信号以增强CAR T细胞体内增殖和持久性最近已经转变为造血恶性肿瘤试验的长期癌症缓解。在初始肿瘤消退后，在一些小鼠中观察到的抗原阳性肿瘤的晚期复发表明，以低T细胞剂量施用的CAR T细胞可能被肿瘤介导的免疫抑制负调节。正在进行的临床前研究将解决的问题是，如果将共刺激性CAR转移和靶向逆转这些抑制通路到相同的细胞相结合，将进一步提高抗肿瘤功效。
以前的研究已经强化了对CD4+和CD8+T细胞的最佳抗肿瘤免疫的要求。常规认为CD8+T细胞在清除癌细胞中起主要作用，而CD4+T细胞为CD8+T细胞提供最佳功能所必需的生长因子如IL-2。尽管本实施例中显示的结果与支持CD4+T细胞辅助在引发最佳CD8+效应物形成和维持CD8+T细胞对持续病毒或肿瘤的应答的重要性的大量工作一致，但它们还突出了一种正在增加的理解，即CD4+T细胞可以充当抗肿瘤功效的主要介质。在体外，CD28共刺激的CD4+CAR T细胞分泌更大量的细胞因子(图8)，在没有外源IL-2补充的情况下在重复抗原刺激时能够独特地增殖(图8)，并且当与CD8+T细胞比较时表现相当的细胞毒性(图6)。细胞毒性潜力的获得与保留Th1辅助细胞因子分泌的能力相结合形成强大的CD4+免疫效应物，其能够在局部施用后清除胸膜间皮瘤异种移植物。这一观察与使用CAR T细胞的先前研究相反。在这些研究中缺乏CD4+CAR T细胞功效可以通过低水平的CAR表达和使用缺乏共刺激信号传导的第一代受体来解释。由于当与CD8+T细胞相比时，CD4+T细胞需要更高的亲合力相互作用来介导效应物功能，并且由于功能性亲合力部分地由受体表达水平决定，在该实施例中获得的高水平的受体表达可以解释CD4+效力。此外，因为嵌合抗原受体使用用于抗原识别的高亲和性scFv，进一步增加亲合力，所以CAR治疗独特地适合于产生能够T细胞辅助和细胞毒性的多功能CD4+T细胞。在抗肿瘤TCR转基因治疗中，提高T细胞亲合力的其它策略已经成功地用于产生细胞毒性CD4+T细胞。本实施例中显示的研究有助于理解，除了调节T细胞应答的环境因素外，控制功能性亲合力的因子决定了CD4+与CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中的相对作用。
通过CAR转导的CD4+T细胞获得细胞毒性活性是特别引人注目的。最近发表的使用抗肿瘤免疫的TCR转基因模型进行的研究也证明了CD4+T细胞分化成细胞毒性效应物的能力。在这些报告中，CD4+T细胞独立清除肿瘤的能力依赖于在受体小鼠中实现淋巴细胞减少。淋巴减少方案用于提高转基因T细胞疗法的功效，部分通过增加能够刺激T细胞扩增和程序性细胞毒性分化的γ链细胞因子的可用性来起作用。增加细胞因子可用性的其他临床策略包括全身性IL-2施用，尽管使用IV施用的功效由于无效递送至肿瘤而受到限制。T细胞的基因修饰具有实现肿瘤反应性CAR+T细胞的完全活化的希望，而无需以将IL-2有效递送至肿瘤微环境内的T细胞活化位点的方式使用淋巴细胞减少。在该实施例中，抗原识别下游包含的CD28共刺激信号通过穿孔素/颗粒酶依赖性通路(图7)增强CD4+T细胞毒性(图6)，与共刺激的CD4+CAR T细胞在抗原刺激时表达高水平的颗粒酶B的能力相关联。这种效应通过CD28信号传导越来越多地获得的分泌的细胞因子而加强；而细胞因子不能介导直接的肿瘤裂解，向CD4+T细胞中加入富含细胞因子的上清液导致增强的细胞毒性(图6)。这些发现得到其他研究的支持，表明共刺激产生细胞毒性CD4+细胞的能力中IL-2的依赖性作用。鉴于它们强烈的IL-2产生，共刺激的CD4+T细胞处于独特的位置以用作强大的免疫效应物，特别是当配备有提供与肿瘤抗原的高亲合力相互作用的CAR受体时。
总之，本实施例提供证据支持使用局部CAR T细胞施用以克服实体瘤所造成的障碍。将CD4+T细胞成功地募集到抗肿瘤免疫的所有方面为使用CAR+T细胞治疗实体瘤提供了特别的优势。
实施例2.用于转移性乳腺癌的靶向T细胞疗法
1.在TNBC中的MSLN表达与侵袭性相关联：评估了226个TNBC和88个非TNBC的组织微阵列中MSLN的表达。分析显示，在TNBC中MSLN过表达比在非TNBC中显著更频繁(分别为36％和16％；p＝0.0006；图12)。MSLN阳性TNBC患者发生更远的转移，间隔更短(见表1)，并且与MSLN阴性TNBC的患者相比具有显著更低的总体和无病存活，表明MSLN表达是侵袭性的标志物。结果显示，MSLN+TNBC患者是MSLN靶向疗法试验的潜在人群。中值随访时间为5.3年(范围为0.7～8.2)，5年Kaplan-Meier存活估计显示，与非TNBC的0.959(95％CI：0.895～0.984)相比，TNBC的总存活概率显著更低，为0.82(95％CI：0.75～0.87)(图13A)。在TNBC患者中，MSLN阳性与显著更短的总存活期(OS)(0.659[95％CI：0.515～0.770]相比0.913[95％CI：0.838～0.954])(图13B)以及与显著更短的无疾病存活(DFS)(0.665[95％CI：0.536～0.766]相比0.865[95％CI：0.785～0.916])(图13C)相关联。MSLN的阴性存活影响与淋巴结状态无关(对数秩检验，p＝0.0003)。与淋巴结阳性/MSLN-TNBC病例(0.865[95％CI：0.699～0.943])相比，淋巴结阳性/MSLN+TNBC病例最差(5年OS概率，0.564[95％CI：0.348～0.733])(图13D)。在TNBC患者中，间皮素阳性患者具有降低的总存活期(p＝0.001)；降低的疾病特异性存活(p＝0.08)；增加的远处转移的频率(OR 2.9，p＝0.011)；减少的至远处转移的平均间隔(19个月相比35个月，p＝0.006)；减少的平均存活(24个月相比53个月，p＝0.001)，如图13E和14F所示。
表1
血清SMRP作为肿瘤负荷进展的标志物：已发表的数据已建立了作为肿瘤负荷进展的标志物，例如作为食管和肺腺癌患者进展的标志物的血清SMRP(间皮瘤患者的标准临床检测)的连续测量的作用(图14)。因此，血清SMRP测量是可以容易地应用于TNBC患者群体的标准临床实验室检测。
MSLN特异性CAR：如实施例1所述，产生由人MSLN抗体(scFv)衍生的MSLN靶向的CAR和eGFP报告基因，由IRES接头分开(Mz)。如实施例1所述，引入CD28受体的胞质结构域以构建第二代M28z CAR，以增强T细胞增殖、细胞因子分泌和存活。如通过eGFP报告基因所检测的，将载体构建体成功转导入人T细胞的CD4和CD8亚型。使用标准铬释放试验(其中MSLN靶向的或对照T细胞与MSLN+癌细胞一起孵育)的体外细胞毒性显示Mz-和M28z-转导的T细胞对MSLN+细胞的有效和特异性杀伤。与Mz T细胞相比，M28z CAR T细胞分泌的GM-CSF、IFN-γ和TNF-α多大约2倍的量。分泌IL-2，一种对T细胞存活和增殖至关重要的细胞因子，由M28z独特地提供。在外源IL-2的存在下，用MSLN特异性受体转导的T细胞扩增，其中CD28共刺激的细胞达到的增殖应答比Mz CAR T细胞的大3倍。此外，在不存在外源IL-2时，只有M28z CAR T细胞能够在重复抗原刺激时聚集。
CAR+T细胞介导的细胞毒性是颗粒酶/穿孔素通路依赖性的：如实施例1所述，测定两种细胞接触依赖性(Fas/FasL或颗粒酶/穿孔素通路)溶解机制中的哪种负责CAR T细胞细胞毒性。Fas配体/Fas受体相互作用的抗体阻断不减少Mz或M28z CAR T细胞的靶细胞裂解(p>0.05)。流式细胞术确认CAR T细胞表达Fas配体并且MSLN+肿瘤上表达Fas受体。MSLN+细胞对FasL介导的细胞毒性敏感，实验中使用的FasL抗体阻断这种效应。相反，通过向T细胞/肿瘤细胞共培养物中添加钙螯合剂乙二醇四乙酸(EGTA)阻断颗粒酶释放减少了在Mz和M28z以及CD4和CD8亚群中CAR介导的裂解(p<0.0001)，证明CAR T细胞细胞毒性是穿孔素/颗粒酶依赖性的。
小鼠模型的开发：为了便于研究表达MSLN的TNBC的胸膜和全身靶向治疗，发明人开发了三种不同的动物模型，并进行验证85-90。所得肿瘤在解剖层次上类似于原位或转移性胸膜肺损伤的人类疾病(分别为图15A，B和C)。这些动物模型验证了非侵入性生物发光成像(BLI)的用途85-89,91-93，以通过使用eGFP+、MSLN+和萤火虫荧光素酶+细胞系来追踪肿瘤的进展。这些肿瘤甚至在疾病的晚期保留了MSLN的表达(数据未显示)。重要的是，将小鼠用肿瘤接种并每周用BLI的优化方案对分泌的血清SMRP成像，所述血清SMRP是可靠的血清生物标志物，并与肿瘤负荷测量和进展相关联(图15A，B和C，下)。在插图中显示的是具有由BLI或MRI证明的转移的小鼠。
单次低剂量的M28z CAR+T细胞在表达MSLN的肺转移小鼠模型中的抗肿瘤功效：在22天的转移性肿瘤生长后，如通过中值存活中的增加所观察到的，单剂量的静脉内M28z转导的T细胞与对照小鼠相比有效地降低肿瘤负荷(p<0.05，相对于对照)(图16)，因此，表现出全身施用的M28z T细胞在肺转移模型中根除多重肿瘤损伤的能力。
局部施用的M28z转导的T细胞根除胸膜肿瘤：如实施例1所述，在建立大的转移性胸膜肿瘤负荷后，在肿瘤接种后18天(图3E)用单次静脉内输注或单次胸膜内施用MSLN靶向T细胞治疗动物。在用胸膜施用对照转导的T细胞治疗的小鼠中，肿瘤负荷稳定地进行(图17B)，直到小鼠死亡(图3C)。用更低剂量的静脉内M28z T细胞治疗导致肿瘤负荷的延迟减少(图3B和C)，产生存活优势(p＝0.005；图3D)。胸膜施用的M28z T细胞诱导主要应答。肿瘤负荷在第7天显著降低，在第11天显著降低在基线(图3B)。大多数实现肿瘤根除的小鼠未达到中值存活(图17D)。
M28z CAR T细胞表现出有效的抗肿瘤功效，并且通过CD28共刺激增强T细胞功能持久性：如实施例1所述，在施用Mz或M28z胸膜T细胞的建立的胸膜MSLN+肿瘤小鼠中，在肿瘤根除后，两组显示CD4和CD8亚群的CAR T细胞持久性(图10A)。在初始T细胞注射后的第87天，将MSLN+或MSLN—肿瘤细胞施用到腹膜腔中，并且用BLI跟踪肿瘤负荷(图10E，上图)。在Mz和M28z T细胞治疗的小鼠中都观察到肿瘤负荷的抗原特异性控制，在M28z治疗的小鼠中观察到更大的降低(图10C和10E)。在再激发后第16天处死小鼠，收获它们的脾脏。与抗原阴性肿瘤相比，用抗原阳性肿瘤再激发的M28z T细胞显示出T细胞的4倍扩增(图10D)。这表明CAR T细胞能够在外周中持续存在，并且当用肿瘤再激发时显示增殖，这种效果通过CD28共刺激增强。
M28z T细胞介导MSLN低表达靶标的抗原特异性旁观者杀伤效应(bystanderkilling)：鉴于某些实体癌(包括TNBC)中MSLN表达的异质性，评价M28z T细胞对表达异质MSLN的靶标的细胞毒性。与MRC-5肺成纤维细胞(MSLN-)共培养16小时后，M28z T细胞显示无裂解(图17A)。评价M28z T细胞对表达MSLN靶标的细胞毒性，该靶标由天然表达低水平MSLN的细胞系(低MSLN)和转导以表达高水平MSLN的细胞系(高MSLN)的1：1混合物组成。为了检查特异性裂解，仅将低MSLN细胞系用51铬标记，并与未标记的高MSLN细胞混合，随后与M28z或对照T细胞共培养。在共培养16小时后，观察到在高MSLN靶标的存在下，M28z T细胞对低MSLN细胞的特异性细胞裂解(图17B)，超过对单独的低MSLN细胞系的裂解，在每个效应物与靶标比下超过约5％～15％(p<0.05)。重要的是，与未活化的M28z T细胞相比，抗原预活化的M28z T细胞不显示出对低MSLN细胞或MSLN阴性肿瘤的任何增加的细胞毒性或非特异性杀伤(图17C和17D)。因此，M28z T细胞在高MSLN肿瘤存在下表现出针对低MSLN细胞的增强的抗原特异性细胞裂解。
由T细胞BLI证明的靶向MSLN的CAR T细胞体内运输：如实施例1所述，为了测定T细胞体内运输和增殖，优化了用M28z CAR和增强的萤火虫荧光素酶(effLuc)双重转导人T细胞。与非荷瘤小鼠相比，胸膜施用的T细胞仅在荷瘤小鼠中显示增加的强度，表示MSLN特异性T细胞增殖(图4A，背侧和腹侧)。相反，全身施用的M28zG-effluc+T细胞在施用后立即显示肺滞留，几天后胸膜信号发射增加(图4B)。优化通过使用非侵入性成像来监测T细胞应答，这允许观察到运输以及响应于抗原的T细胞增殖的定量。
具有4-1BB共刺激结构域的MSLN特异性CAR以研究对表达T细胞功能抑制子的癌细胞的功效：为了研究通常表达抑制性蛋白以逃避免疫系统的癌症的影响，表达PD-L1(图18中的黑色，与红色的同种型对照相比)和分泌抑制性细胞因子比如TGF-β的细胞通过ELISA表征和确认。因此，这些细胞允许在抑制性TME内模拟CAR T细胞的体内抗肿瘤功效。为了研究CAR T细胞克服肿瘤介导的抑制的能力，提供了在抗原识别时提供4-1BB共刺激信号传导的受体(MBBz；图19)。原代人T细胞用MSLN特异性CAR有效转导至效率为60％～70％。
在肿瘤分泌的免疫抑制蛋白存在下靶向MSLN的CD28和4-1BB共刺激增强CAR T细胞功能：设计出表达MSLN(3T3 MSLN+；图20A，上)或MSLN和PD-L1(3T3 MSLN+PD-L1+；图20A，下)的3T3小鼠成纤维细胞，并将外源TGF-β加入到T细胞/3T3 MSLN+共培养物中(图21A)作为有害的TME的替代物。与用3T3 MSLN+刺激相比，用3T3 MSLN+PD-L1+(未填充形状；3T3MSLN+，填充形状)刺激时，共刺激的CAR+T细胞分泌更低量的细胞因子。然而，即使在PD-L1存在下，共刺激的T细胞继续分泌比Mz T细胞更大量的细胞因子(p<0.005)。此外，用10μg/mLPD-L1阻断抗体阻断PD-L1/PD-1连接解救所有T细胞组的细胞因子分泌(用蓝色填充形状显示解救；p<0.02，将Mz用PD-L1阻断与Mz无阻断相比较；对于MBBz的IFN-γ，p＝0.02，对于M28z，p<0.02，非配对t检验)，进一步证明PD-L1介导的抑制的特异性并提示PD-L1/PD-1轴阻断在增强CAR T细胞治疗中的作用。关于增殖，在PD-L1过表达的存在下，仅M28z和MBBzCAR T细胞能够扩增(在第7天和第14天，p<0.05)。与PD-L1介导的抑制相似，TGF-β的加入也降低了所有CAR T细胞组的细胞因子分泌，但与Mz CAR+T细胞相比，共刺激的CAR+T细胞又继续分泌更大量的细胞因子(p<0.003；图21B)。在TGF-β存在下响应于MSLN特异性刺激，MBBzCAR T细胞仍然能够在两次连续刺激后扩增(p<0.002；图21C)。证明了甚至在显著的肿瘤表达的抑制蛋白的存在下,共刺激信号传导增强CAR T细胞功能。
IL-12作为过继T细胞疗法中的共刺激物：表征确定M28z IL12CAR构建体在转导入T细胞时分泌IL-12。M28z和M28z IL12细胞，但不是未转导的细胞，都以大致相同的效果介导MSLN+癌细胞的特异性裂解(图22)。使用ELISA/LUMINEX试验，显示在与表达抗原的肿瘤细胞共培养时，IL-12 CAR T细胞增强Th1细胞因子(IFN-γ、TNFα和GM-CSF)的分泌(图23)，并且与M28z CAR T细胞相比，抑制Th2细胞因子(IL-13、IL-4和IL-5)的产生。
实施例3.逆转录病毒载体SFG-iCASP9-2A-M28z的产生
SFG载体采用Mo-MuLV的5'和3'长末端重复序列(LTR)用于表达iCASP9-2A-M28zCAR。iCASP9-2A-M28z CAR的转录处于存在于5'LTR的U3区域中的增强子和启动子序列以及存在于3'LTR的R区域中的多聚腺苷酸化位点的控制下。此外，载体保留了将重组逆转录病毒基因组有效包封入病毒颗粒所需的ψ+序列，以及用于产生编码Mo-MLV中env蛋白的亚基因组逆转录病毒RNA的逆转录病毒剪接供体和受体序列。插入iCASP9-2A-M28z序列，使得其起始密码子处于亚基因组病毒转录物中病毒env ATG正常占据的位置。通过Northern印迹分析显示，该克隆策略相对于常规γ逆转录病毒载体，每个载体拷贝的剪接与未剪接载体RNA的比例增加四倍(Krall和Kohn，1996，Expression levels by retroviral vectorsbased upon the N2 and the MFG backbones.Gene Ther 3,365)。
通过将两个DNA片段插入SFG骨架的6.7kb NotI/BglII中构建SFG-iCASP9-2A-M28z(如图31和32所示)。骨架编码以下：(1)除了包含Mo-MLV env编码mRNA的SA和5’UTR区之外的整个SFGγ-逆转录病毒载体；和(2)与人CD3ζ信号传导结构域融合的人CD28信号传导结构域的CDS。
DNA片段1是来自质粒构建体SFG-iC9-41BBL-NY28z的1.5kb BglII/BspEI片段。该片段编码包含与缺少C末端的八个氨基酸和终止密码子的iCASP9的CDS融合的Mo-MLV env编码mRNA的SA和5'UTR的区域。iCASP9CDS由Blue Heron Bio通过重新合成得到。
DNA片段2是来自0.979kb PCR产物的0.89kb BspEI/NotI片段。该片段编码与GSG-P2A-CD8a前导序列_m912 scFv融合的iCASP9的C-末端CDS(无终止密码子)。使用以下引物由SFG-TK-2A-M28z作为模板合成该PCR产物：
(1)iCASP9-2A左侧引物：gcgctccggaaaaaacttttctttaaaacatcaggatctggagcaacaaacttc[SEQ ID NO:37]
(2)CD28右侧引物：ggtgtttccctttcacatgg[SEQ ID NO:38].
P2A的氨基酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:39所示：
ATNFSLLKQAGDVEENPGP[SEQ ID NO:39]
编码SEQ ID NO:39的氨基酸序列的核苷酸序列如下文所提供的SEQ ID NO:40所示：
GCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCC[SEQ ID NO:40]
使用SFG-Hsvtk_P2A_P28z骨架和SFG-M28z_ires_hrGFP中的CD8a前导序列_m912scFv序列通过重叠延伸PCR获得SFG-TK_2A_M28z模板。SFG-M28z_ires_hrGFP中的CD8a前导序列_m912 scFv序列使用表达优化的密码子表1由Blue Heron Bio通过重新合成得到。SFG-Hsvtk_P2A_P28z逆转录病毒载体SFG/TK_2A_P28z的产生来自SFG/TP28z.3使用3片连接-(1)来自SFG-TP28z.3的1462bp BglII/BssHII片段，其编码包含与HSV-TK基因融合的剪接受体位点的Mo-MLV载体的区域；(2)来自PCR产物的880bp BssHII/NotI片段，其编码不含终止密码子_GSG_2A_CD8a信号肽_J591 ScFv的HSV-TK基因的3’末端；和(3)来自SFG-TP28z.3的6652bp NotI/BssHII片段，其编码嵌合抗原受体的跨膜_CD28_ζ链的剩余部分加上逆转录病毒载体骨架的剩余部分。使用先前构建的编码GSG_P2A_CD28z的质粒DNA作为模板扩增PCR产物。使用以下引物：(1)正向HSVTK_接头_GSG_P2A：GCGCGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACGGATCTGGAGCAACAAACTTC[SEQ ID NO:41](2)逆向-P28z R：ggtgtttccctttcacatgg[SEQ ID NO:42]
逆转录病毒载体SFG-iC9-41BBL-NY28zSFG-iC9-41BBL-NY28z的产生通过将两个片段插入来自SFG-Hsvtk_2A_P28z的6.8kb AgeI/NotI骨架中产生：(1)来自pUC(-mcs)-CBNI的1.7kb AgeI/SacII片段，其编码与iCASP9的整个CDS融合的env mRNA的Mo-MLV SD和5’UTR以及在gsg_P2A剪切肽读码框内融合的N末端4-1BBL；和(2)来自pUC(-mcs)-CBNII的1.5kb SacII/AgeI片段，其编码通过另一个GSG_P2A剪切肽与靶向NYESO-1抗原的scFv融合的剩余的C-末端4-1BBL CDS。
从Blue Heron Bio获得pUC(-mcs)-CBNI和pUC(-mcs)-CBNII，并且通过重新基因合成产生插入片段。
实施例4.CAR表达水平与表达CAR的T细胞的功效相关
使用293T包装细胞系的亚克隆，产生具有不同表达水平的M28z CAR的T细胞群体。靶向CD标志物的第二代CAR用作阴性对照(对照CAR)。编码M28z的逆转录病毒构建体显示于图27A中。如图27A所示，构建体包含报告子GFP。用M28z和对照CAR转导CD3+人T细胞。如图27B所示，T细胞表达不同水平的M28z。将具有约4个或更多个载体拷贝数/细胞的M28z表达水平的T细胞分类为“高M28z”。将具有约1至约4个载体拷贝数/细胞的M28z表达水平的T细胞分类为“中M28zT”，将具有小于约1个载体拷贝数/细胞的M28z表达水平的细胞分类为“低M28z”。如图27C所示，通过定量PCR测量未转导和转导的T细胞的载体拷贝数。产生四种表达不同水平的表面间皮素的靶细胞系：Met5a、EKVX、MSTO M和OVCAR-3。Met5a是用SV40大T抗原永生化的人间皮细胞系。EKVX是天然表达间皮素的肺癌细胞系。MSTO M是经转导以过表达人间皮素的MSTO-211H细胞系。OVCAR-3是天然表达间皮素的卵巢癌细胞系。如图28所示，在这四种靶细胞系中，MSTO M具有最高表达水平的人间皮素，Met5a具有最低表达水平的人间皮素。将四种靶细胞系与M28z+T细胞或对照CAR+T细胞共培养。评估四种靶细胞系中M28z+T细胞的细胞因子产生或分泌。如图29A和29B所示，只有具有最高M28z表达水平的T细胞显示向Met5a靶细胞的抗原特异性细胞因子分泌，所述Met5a靶细胞在四个测试的细胞系中具有最低的人间皮素表达水平。M28z CAR的表达水平增加导致向MSTO靶细胞的剂量依赖性细胞因子分泌，所述MSTO靶细胞在四种测试的细胞系中具有最高的人间皮素表达水平。在使用Bonferroni校正的成对比较中，细胞因子分泌在(1)与仅T细胞和Met5a靶标的所有其他三种效应物相比，高表达水平的M28z中；和(2)MSTO M靶细胞的情况下的所有组比较之间，显著更高(p<0.05)。
此外，通过标准51Cr-释放试验评估M28z+T细胞对四种靶细胞系的细胞毒性。将表达各种密度M28z CAR的T细胞、Met5a靶细胞、MSTO MSLN+靶细胞和EL4PSMA+MSLN-靶细胞以不同的E:T比率孵育18小时。将EL4PSMA+MSLN-靶细胞用作阴性对照。如图30所示，只有具有高表达水平的M28z的T细胞显示针对Met5a靶细胞的细胞毒性，所述Met5a靶细胞在四种测试的细胞系中具有最低的人间皮素表达水平。此外，如图30所示，CAR的表达水平决定对于MSTO靶细胞的细胞毒性程度，所述MSTO靶细胞在四种测试的细胞系中具有最高的人间皮素表达水平。
实施例5.间皮素表达水平与表达CAR的T细胞的功效相关
如图31A所示，使用单间皮瘤细胞系(MSTO 211-H)，并用低或高水平的人MSLN转导。通过如上所述的标准51Cr释放试验测定M28z+T细胞的细胞毒性，结果示于图31B中。通过细胞因子分泌试验测定细胞因子产生，结果示于图31C中。如图31B和31C所示，M28z+T细胞的细胞毒性和细胞因子产生与人MSLN的表达水平成比例。例如，人MSLN的表达水平越高，T细胞的细胞毒性和细胞因子产生越大。
实施例6.具有任选表达水平的MSLN特异性CAR的产生
获得来源于m912抗体的scFv。基于四种不同的算法(例如，Blue Heron和Encore算法)进行m912抗体的密码子优化。将从所有四种算法获得的密码子优化序列混合，并且为了最佳克隆除去所有CPG和BAM-H1。密码子优化的核苷酸序列与原始m912 scFv约70％同源。为了在免疫应答细胞(例如人原代T细胞)中获得有效表达，将密码子优化的核苷酸序列连接到人CD8前导序列例如编码SEQ ID NO:20的多核苷酸。CD8前导序列在ScFv重链(QVQL)之前提供最佳信号剪切。密码子优化使间皮素CAR在具有良好的转导效率的免疫应答细胞(例如人多供体原代T细胞)中的表达得到优化。针对具有不同间皮素表达的多种血液和实体癌细胞，测试在多供体T细胞中的多个CAR载体拷贝数的功能效率、特异性和敏感性。具有载体拷贝数为1～4的密码子优化的基于m912的间皮素CAR提供针对高间皮素表达靶标的高效细胞毒性，而对于低间皮素表达靶标即正常组织的最小反应性，这是为载体安全而不影响效率所达到的关键特征。上述的创造性基因工程产生特异性间皮素CAR，其对表达高间皮素的癌细胞有反应而同时保留表达低间皮素的正常组织，该基因工程在确保安全性的同时最适合用作癌症治疗的临床载体。
实施例7.靶向间皮素的CAR T细胞治疗的局部递送产生有效的和持久的CD4依赖性肿瘤免疫——实施例1的更新
1.摘要
将最近的血液恶性肿瘤的CAR T细胞治疗的成功转化到实体瘤将需要克服几个障碍，包括低效的T细胞肿瘤浸润和不足的功能持久性。利用如实模仿人胸膜恶性肿瘤的原位模型，评估使用M28z CAR的间皮素靶向T细胞的两种施用途径。发现胸膜内施用的CAR T细胞大大优于全身输注的T细胞，需要30倍更少的M28z T细胞诱导长期的完全缓解。胸膜内施用T细胞后，迅速的体内抗原诱导T细胞活化允许强烈的CAR T细胞扩增和效应物分化，导致增强的抗肿瘤功效和功能性T细胞持续200天。局部施用T细胞也促进了胸外肿瘤部位的有效清除。这种治疗功效取决于与更高的肿瘤内CD4/CD8细胞比率相关的早期CD4+T细胞活化和CD28依赖性的CD4+T细胞介导的细胞毒性。相反，静脉内递送的CAR T细胞即使在胸膜肿瘤中以相同数目聚集，也无法实现相当的活化、肿瘤根除或持续。胸膜内施用的T细胞循环和持续的能力支持通过“局部分配中心”递送最佳CAR T细胞疗法的观点。基于这些结果，正在进行1期临床试验，以评价胸膜内施用间皮素靶向CAR T细胞在原发性或继发性胸膜恶性肿瘤患者中的安全性。
2.引言
原发性(恶性胸膜间皮瘤，MPM)和转移性(来自肺癌和乳腺癌)的胸膜恶性肿瘤，每年只在美国就影响超过15万患者108。MPM是一种区域性侵入性疾病，治疗选择有限109。研究报道了在MPM中具有更高水平的肿瘤浸润淋巴细胞的更好的预后110-113，表明基于T细胞的免疫疗法可能对MPM的患者有益114。
最近，利用CAR重定向和重编程患者T细胞的靶向免疫治疗在一些B细胞恶性肿瘤，特别是急性成淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤中显示令人鼓舞的结果11,115,116,117。CAR是将T细胞重新靶向肿瘤表面抗原的合成受体21,118。将活化和共刺激信号传导结构域结合的第二代CAR的出现使得能够设计在患有化药难治疗的CD19+恶性肿瘤的患者中介导完全应答的有效T细胞11,115,116,117。CAR疗法对实体癌的治疗潜力仍然未知。划分CAR疗法用于何种实体瘤的一个关键方面是鉴定有效的靶抗原。间皮素(MSLN)是与区域侵入相关的细胞表面分子，是MPM的特征，其在超过90％的上皮样MPM中过表达37。在发明人的临床病理学研究中，系统评价了MSLN表达和强度，在69％的肺腺癌(n＝1209)119、36％的三阴性乳腺癌(n＝355)和46％的食管腺癌(n＝125)47中，发现有强至中度的MSLN表达。MSLN表达与肿瘤侵袭性和降低的生存率一致相关37,47,119。总的来说，这些观察支持在MPM和其他实体癌中靶向MSLN114 ,120-122。
靶向间皮素的CAR先前已在间皮瘤的皮下模型中显示活性55,56,123。然而，靶向的T细胞疗法没有在原位模型中进行研究。为此，建立了重现人类疾病的独特性特征的临床相关的MPM小鼠模型37,85,86。已建立的胸膜肿瘤通过区域入侵而包围肺和纵隔结构，显示广泛的淋巴管生成并形成纵膈淋巴结转移。这种模型不仅解决CAR T细胞是否可以根除肿瘤，而且研究了T细胞施用的两种可能途径：常规全身静脉内和局部胸膜内施用。据推测，对于我们可以模拟的扩散性胸膜疾病、纵隔淋巴结和偶发性转移部位，由于全身递送更好浸润，其可能更好。令人惊奇的是，发现局部的即胸膜内T细胞施用，不仅针对胸膜疾病，而且针对弥散性肿瘤位点都非常优越。该观察促使对这种治疗功效的基础的研究。
在该实施例中，报道了局部CAR T细胞疗法对实体瘤的治疗潜力，并强调了CD4+CAR T细胞的早期抗原活化对实现增强的抗肿瘤功效的重要性。此外，这些结果表明局部治疗在临床相关的疾病模型中的明显益处，可立即转化用于MPM和转移性胸膜肿瘤的治疗。
3.材料和方法
研究设计
这项研究的目的是创建一个最佳的T细胞免疫疗法用于实体恶性肿瘤。设计了靶向间皮素的嵌合抗原受体，当其转导入人T细胞时提供肿瘤抗原识别和抗原特异性效应物功能。在体外，分析(i)细胞毒性，(ii)细胞因子分泌和(iii)T细胞增殖。体内实验使用T细胞和肿瘤的实时成像分析了优化T细胞疗法的策略。使用具有人癌细胞和人T细胞的免疫缺陷小鼠，以验证和促进我们的M28z CAR转化到临床，如先前对于CD19(Brentjens，NM，2003)和PSMA(Gade，CR，2005)所做的那样。CAR T细胞和内源性免疫系统之间的机械相互作用的研究将在免疫活性小鼠模型中被最好地研究，然而其必须利用不同于其临床相关对应物的鼠CAR。实验程序得到纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MSKCC)的机构动物护理和使用委员会批准。每个实验使用不同的供体T细胞(T细胞从未聚集)进行多次。所提供的数据使用代表性实验(具有多于三个的样品重复)以避免混杂变量比如由于转导效率、供体相关变量和E:T比率的差异。
细胞系
将MSTO-211H(人胸膜间皮瘤)和EL4(鼠胸腺瘤)细胞进行逆转录病毒转导，以表达GFP/萤火虫荧光素酶融合蛋白(MSTO GFP-ffLuc+)。然后将这些细胞用亚克隆到SFG逆转录病毒载体中的人MSLN-变体1转导以产生MSTO MSLN+GFP-ffLuc+。
γ逆转录病毒载体构建和病毒生产
为了产生MSLN特异性CAR，如前所述17，工程化一种融合蛋白，其编码与人CD8前导肽和CD8/CD3ζ或CD28/CD3ζ序列连接的全人scFv m912(由D.Dimitrov友情提供，NCI-Frederick)53。在SFGγ-逆转录病毒载体骨架(由I Riviere友情提供，MSKCC)内，插入内部核糖体进入位点，以促进CAR与人源化重组GFP报告基因的双顺反子表达。然后，如前所述，将编码Mz、M28z和P28z的质粒转染到293T H29包装细胞系中20。
T细胞分离、基因转移和CD4/CD8分离
根据机构审查委员会批准的方案，从健康志愿者供者的血液中分离外周血白细胞。通过在Lymphoprep上的低密度离心来分离PHA活化的PBMC。分离后两天，在涂有15μg/mLretronection的平板上，每天将PBMC用293T RD114产生的含有Mz、M28z或P28z载体的上清液转导1小时，持续2天。在允许3天的载体表达后，将转导的PBMC维持在20单位/mL IL-2中。通过流式细胞术分析测定转导效率。通过阴性选择方案，使用Dynabeads Untouched人CD4和CD8 T细胞分离试剂盒获得CD4+和CD8+T细胞的纯群体。
细胞毒性测定
用CAR或载体对照转导的T细胞的细胞毒性通过如前所述的标准51Cr释放试验测定153。
原位胸膜间皮瘤动物模型和体内评估
为了开发胸膜间皮瘤的原位小鼠模型，使用6至10周龄的雌性NOD/SCIDγ小鼠。所有程序在机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。使用吸入的异氟烷和氧来麻醉小鼠，并施用布比卡因用于镇痛。通过右胸部切口，进行200μL无血清培养基中的1×105～1×106的肿瘤细胞的直接胸膜内注射，以建立如先前所述的原位MPM肿瘤85,86,92,154。通过直接胸膜内注射至小鼠的胸腔或通过尾静脉全身注射，用200μL无血清培养基注射，将总计3×104～3×106的转导的T细胞过继转移到荷瘤小鼠中。通过眼眶后出血获得外周血。
细胞因子检测试验
在96孔圆底板中，每孔200μL培养基中含5×103的靶细胞，设三个复孔，将用M28z、Mz或对照载体转导的5×105～5×103T细胞与之共培养，进行细胞因子释放试验。在共培养6～24小时后，收集上清液。使用多重珠人细胞因子检测试剂盒测定细胞因子水平。
T细胞增殖试验
用具有或不具有MSLN表达的经辐照的MSTO-211H细胞刺激经M28z、Mz或P28z转导的总计1×106～3×106T细胞，并以1×105～3×105细胞/孔的密度接种6或24孔组织培养板。如上所述，在不存在或存在20U/mL外源IL-2的情况下进行增殖试验。每4或7天对细胞计数，然后覆盖在具有或不具有MSLN表达的经辐照的MSTO-211H细胞上。对每个T细胞组绘制细胞数对时间的曲线，并通过流式细胞术分析测定表型。
组织学分析和免疫染色
在对石蜡包埋的、4％多聚甲醛固定的组织样品进行苏木精和伊红染色后，进行肿瘤的组织病理学评价。用小鼠抗人MSLN IgG进行人MSLN的免疫组织化学分析。用小鼠抗人CD3IgG进行人抗CD3染色。
流式细胞术
使用PE-缀合的或APC-缀合的抗人MSLN大鼠IgG2a检测人MSLN表达。用针对CD3、CD4、CD8、CD62L、CD25、CD27和CD45RA的单克隆抗体测定T细胞表型。随后在LSRII细胞仪上进行GFP、MSLN表达的流式细胞术以及T细胞表型分析，并且使用FlowJo分析软件分析。小鼠组织如下处理：称重组织并收获到冰冷的RPMI-1640中。用手术刀手动将组织分离，然后通过40～100μm过滤器机械解聚。将样品重悬，并在FACS上记录2×106的事件。
体内定量和T细胞BLI
使用单次腹膜内剂量为150mg/kg的用于萤火虫或effLuc报告基因的d-荧光素(d-Luciferin)(由Dr Patrick Hwu，Texas友情提供)86,155进行小鼠中BLI。用M28z和Gaussia萤光素酶报告基因转导的细胞用重悬于150μl的丙二醇：PBS(1：1)中的单次静脉内剂量为15μg的天然腔肠素(coelentereazine)成像156。使用Living Image 2.60软件分析BLI数据，并报告作为总通量(光子/s)的BLI信号。然后使用Microsoft Excel(Microsoft Corp.，WA)将BLI通量(光子/s)确定为腹侧和背侧图像的平均值，并用GraphPad Prism(GraphPadSoftware，Inc.，CA)分析。
统计方法
如图例所示，数据表示为平均值+/-SD或SEM。在适用的情况下，通过非配对Student't t检验(双尾)用多重比较的Bonferroni校正来分析结果。使用对数秩检验分析存活曲线。统计学显著性定义为P<0.05。所有统计学分析用Prism软件6.0版本(GraphPad)进行。
4.结果
Mz-和M28z-转导的T细胞特异性地对MSLN+靶细胞应答
构建引入了人MSLN特异性scFv53和CD3ζ或CD28/CD3ζ信号传导结构域(Mz和M28z，图2A)的两种CAR。前列腺特异性膜抗原(PSMA)17特异性的P28z CAR用作同种异体反应性和异种反应性的阴性对照。使用SFGγ-逆转录病毒载体有效转导CD4+和CD8+人外周血T淋巴细胞(60～75％转导，图2B)。MSLN-转导的MSTO-211H(MSLN+)细胞和PSMA-转导的EL-4小鼠淋巴瘤细胞(MSLN-)提供用于体外实验的MSLN阳性和阴性靶标(图43A)。Mz-和M28z-转导的T细胞在体外表现出相似的MSLN-特异性裂解(图35A)。P28z CAR T细胞不裂解MSTO MSLN+，且靶向间皮素的CAR不裂解EL4PSMA+。如对于第二代CAR15所预期的，M28z CAR T细胞分泌2至5倍更大量的Th1细胞因子(图43B)，并且在不存在或存在外源IL-2的情况下重复暴露于MSLN+细胞时，提供更大的T细胞聚集(图2E)。基于这些发现，我们继续进行以评价M28z在具有建立的胸膜肿瘤的小鼠中的治疗潜力。
M28z T细胞的局部递送比全身途径更有效
在先前由本发明人的实验室建立的MPM的原位模型中37,85,86,93，使用萤火虫荧光素酶(fLuc)转导的MSTO-211H的连续生物发光成像(BLI)来确认肿瘤的建立，在T细胞治疗开始前使干预组的肿瘤负荷相等，并测量对治疗的应答。在肿瘤接种后12天，用单次静脉内或胸膜内施用1×105M28z CAR T细胞(根据如前所述的肿瘤负荷定量估计，效应物对靶标[E：T]比例为1：3000)治疗具有建立的胸膜肿瘤的小鼠85,86。P28z CAR或未转导的T细胞以相同的剂量施用以证明抗原特异性和同种异体反应性和异种反应性的对照。用该剂量的静脉内M28z T细胞治疗导致边缘抗肿瘤功效(图35B)，几乎不超过P28z对照T细胞(图35C，蓝色虚线对比黑色实线，MS分别为27对比25天)。相比之下，胸膜内施用的M28z T细胞诱导主要应答。肿瘤负荷在第7天显著降低，在第11天变得不可检测(图35B)。在第100天没有达到中值存活(图35C)。用更高剂量的静脉内M28z T细胞(3×106，增加30倍，E:T 1:100)的治疗降低肿瘤负荷，但不能避免最终肿瘤进展(图2B和35D)，产生适度的44天生存优势(图35E，蓝色虚线)。相比之下，胸膜内施用的10倍更低剂量的M28z CAR T细胞(3×105，E:T 1:1000)在施用后10天内快速降低肿瘤负荷(图2B和35D)，并且到第200天没有达到中值存活(蓝色实线，图35E)。来自3个不同供体的T细胞的实验结果相似，反驳了同种异体反应性的显著影响(如果有的话)。
与全身递送不同，胸膜内T细胞施用促进迅速的M28z T细胞扩增和分化
即使在比静脉内使用的剂量低30倍的剂量下，用局部CAR T细胞疗法，观察到长期无肿瘤存活，促使我们研究胸膜内与静脉内施用后的T细胞肿瘤浸润、扩增和持续性。为此，本发明人首先进行了肿瘤和T细胞非侵入性定量BLI。所有小鼠用单剂量的共表达M28z和增强的萤火虫荧光素酶(effLuc)的T细胞(1×106)治疗。在施用的24小时内，胸膜内递送导致胸膜M28z T细胞聚集的快速增加，比通过静脉内递送大10倍(图36A)。这种快速和持续的聚集发生在用M28z(图36B，蓝线)，但用P28z T细胞并不如此。静脉内施用的M28z T细胞在5至7天后产生与胸膜内递送的T细胞相当的信号。上升的T细胞BLI信号与由伴随的肿瘤BLI减少来记录的肿瘤负荷消退并行。连续免疫组织化学分析证实了T细胞聚集动力学(图4D)。T细胞与肿瘤细胞比率的进一步流式细胞术分析显示，当比较两种施用途径时，在初始时间点(第3～5天)CAR T细胞的聚集类似，然而之后这两种施用途径发生分歧，在胸膜内递送的T细胞的案例中稳定增加，但在全身治疗的小鼠中减少(图36C)。与效应物功能的差异获取一致，我们观察到在胸膜CD4/CD8比率和CD62L表达(L选择素)模式中的显著差异，所述L选择素是在T细胞活化和效应记忆形成时下调的标志物124。虽然胸膜内施用维持平衡的CD4/CD8比率，但是静脉内施用导致显著更小的CD8+聚集(图36C和36D)。在这些小鼠的脾脏中看到的CD4+和CD8+T细胞的平等分布表明，减少的肿瘤内CD8+聚集不是由于全身不存在CD8+T细胞。此外，大多数静脉内施用的CD4+T细胞在施用后1周表现出非活化(CD62L+)T细胞表型。相反，大部分胸膜内施用的CD4+T细胞显示活化的CD62L-表型(图36F)。CD8+M28z T细胞在任一情况下显示CD62L表达的类似减少(图36F)证实，差别活化主要影响CD4+T细胞的活化和CD8+T细胞的伴随聚集。
局部致敏的M28z T细胞支持有效的、全身的、肿瘤特异性应答
为了评估胸膜内施用的T细胞是否提供全身性肿瘤保护，本发明人用胸膜内的表达Gaussia荧光素酶的M28z T细胞治疗携带表达萤火虫荧光素酶以及MSLN+和MSLN-侧部肿瘤(右MSLN+和左MSLN-，图37A，左图)的MSLN+胸膜肿瘤的小鼠。在施用T细胞后15天，使用腔肠素的BLI显示胸膜腔中的残余T细胞和在MSLN+右侧肿瘤中的T细胞聚集(图37A，中图)，但在MSLN-左侧肿瘤未显示。在次日用D-荧光素进行的肿瘤显像显示胸膜肿瘤的根除、MSLN+右侧肿瘤消退和MSLN-左侧肿瘤的进展(图37A，右图)。此外，研究了胸膜内施用的CAR T细胞是否能够运输到腹膜腔——间皮瘤散布的潜在位点。在该双胸膜/腹膜疾病模型中，胸膜内施用的M28z T细胞快速聚集(1～2天)并且高于静脉内施用的T细胞(图37B和37C)。
胸膜内施用的M28z T细胞保持功能至少100天
已经证明局部分配的M28z T细胞的快速活化及其有效的胸外再分布，进一步检测它们的持久性和功能。在建立大的胸膜肿瘤负荷超过18天后，以3×105CAR+T细胞(E:T，1:1000)的低剂量将Mz、M28z或P28z T细胞施用到胸膜腔。M28z T细胞的治疗诱导肿瘤生物发光的均匀降低至背景发射水平，以及长期无肿瘤的存活(中值存活未达到，相比在Mz中63天，相比在P28z中36天，P＝0.01，图38)。在经治疗的小鼠的外周血中的CAR+T细胞计数的连续评估显示，与Mz治疗的小鼠相比在M28z治疗的小鼠中有增加的T细胞持久性(T细胞输注后50天；图38B)。使用3个单独的T细胞剂量(3×106、1×106和3×105施用的CAR+T细胞)获得了T细胞持久性的类似结果。在Mz和M28z治疗的小鼠中，T细胞输注后30天，持续T细胞的表型评估显示CD4+T细胞的进行性和主导的富集(图5C)。在脾脏和血液中的所有3个T细胞剂量下都观察到这种逐渐的CD4+富集。
接下来，通过进行肿瘤再激发实验来评价持续T细胞的功能状态。对具有建立的MSLN+胸膜肿瘤的小鼠胸膜内施用3×105Mz或M28z T细胞以根除胸膜肿瘤并促进长期存活。在初始T细胞注射后的87天，将MSLN+或MSLN-肿瘤细胞(1×106)施用到腹膜腔中以长期存活，并使用BLI监测肿瘤负荷。在再激发时，如通过代表性小鼠中的FACS分析所证实的，持续T细胞主要是效应记忆(CD45RA-CD62L-)细胞(图10A)。在所有小鼠中肿瘤负荷初始增加之后，在Mz和M28z T细胞治疗的小鼠中都观察到肿瘤负荷的抗原特异性控制，在M28z治疗的小鼠中最显著(图39)。然后，检测对肿瘤激发的T细胞增殖应答。在再激发后16天处死所有组的小鼠，收集脾脏用于FACS分析。最初用M28z T细胞治疗并用MSLN+肿瘤再激发的小鼠显示比用MSLN-肿瘤再激发的小鼠高4倍的T细胞扩增(图10C)。更大的T细胞聚集主要归因于M28z组中的CD4+亚群(图10D)。
CD4+M28z T细胞的早期抗原激活对于增强CAR T细胞功效是必需的
为了评估CD28共刺激对CD4+和CD8+细胞因子和增殖反应的相对贡献，用MSLN+肿瘤细胞刺激用Mz或M28z转导的CD4+、CD8+和本体T细胞(bulk T cell)，并定量Th1细胞因子的分泌和增殖。与CD8+T细胞相比，用Mz转导的CD4+T细胞具有增加的Th1细胞因子分泌水平(图40A)。CD28-共刺激的CD4+T细胞分泌比CD8+T细胞高11至50倍的细胞因子，显示在CD28共刺激的T细胞特别是CD4+T细胞中细胞因子分泌强烈增强。如所预期的，用MSLN+靶标重复刺激，在CD4+或CD8+Mz T细胞群中不诱导T细胞扩增，并且在不存在外源IL-2时，在抗原刺激后相当快速地诱导T细胞数量的下降(图40B)。相比之下，与CD8+M28z T细胞的2倍增加相比，CD4+M28z T细胞通过第三次刺激扩增20倍更大的平均增殖(P<0.001)。当与CD4+M28z T细胞共培养并通过MSLN+靶标刺激时，CD4+CAR T细胞支持M28z CAR T细胞功能的重要性进一步通过CD8+M28z T细胞的强烈聚集证明(3倍更高的聚集；P<0.001；图40C)。为了进一步证实CD4+M28z CAR T细胞在体内的增强功能，用effLuc转导CD8+M28z CAR T细胞(以监测携带胸膜肿瘤的小鼠中的T细胞聚集)。如通过BLI追踪T细胞信号发射所测定的(增加2.3倍，相比72h时T细胞生物发光信号增加1.2倍；图40D～E)，当与CD4+M28z T细胞施用时，CD8+M28z CAR T细胞具有显著增强的体内聚集。
胸膜施用的M28z T细胞的增强的抗肿瘤功效可以通过CD4+M28z T细胞的早期抗原活化来解释，这可以导致最佳的细胞因子分泌，以维持CD4+和CD8+CAR T细胞亚群的扩增。为了证明早期抗原活化的影响，我们使用预活化的CD4+M28z T细胞(在24小时前在MSLN+肿瘤细胞上预活化一次)进行上述体外聚集实验。与CD4+T细胞与CD8+T细胞同时抗原暴露的实验条件相比，CD4+CAR T细胞预活化导致体外CD4+和CD8+聚集的增强(图40F)。
CD4+CAR T细胞表明CD28依赖性颗粒酶/穿孔素介导的细胞毒性
研究M28z CAR T细胞的细胞毒性潜力。纯化的CD8+T细胞在4小时内显示出快速的细胞毒性(图41A，左)。CD4+M28z+T细胞具有较低的快速细胞毒性潜力，但是在18小时达到与CD8+M28z+T细胞相当的水平。在多个E：T比率下，CD28共刺激信号传导增强CD4+M28z CAR T细胞的裂解13～16％(P<0.001；图41B)，但并不一致地增强CD8+T细胞介导的细胞裂解(P＝0.07)。在51Cr释放试验时添加的从刺激的CD4+M28z T细胞获得的富含细胞因子的上清液的转移增强了CD4+M28z T细胞(5％～23％增强；P<0.0001；图41C)和CD8+M28z CAR T细胞(5％～30％增强；P<0.001)两者的细胞毒性。单独转移上清液或向P28z对照T细胞中加入上清液不会导致裂解(图41C)。因此，得出结论，M28z CAR有利于细胞毒性CD4+T细胞效应物的形成，并且以CD4依赖性方式帮助CD8+T细胞的细胞毒性。
排除了通过富含细胞因子的上清液直接裂解肿瘤靶标，测定两种细胞接触依赖性裂解机制(Fas受体/Fas配体或颗粒酶/穿孔素途径)中的哪一种负责CAR T细胞的细胞毒性。Fas配体/Fas受体(FasL/FasR)相互作用的抗体阻断不减少Mz或M28z CAR T细胞的靶细胞裂解(P>0.05；图7A，左和中)。流式细胞术分析证实CAR T细胞表达FasL并且MSLN+肿瘤上表达FasR(图7A)。MSLN+细胞的确对FasL介导的细胞毒性敏感，并且在这些实验中使用的αFasL抗体阻断了这种作用(图45A，右)。通过向T细胞/肿瘤细胞共培养物中加入钙螯合剂EGTA来阻断颗粒酶释放，减少了所有测试组中的CAR介导的裂解(图41D)，表明CAR T细胞的细胞毒性依赖于穿孔素/颗粒酶途径。在Mz(平均减少27.6％，相比M28z为17.6％)和CD8+(对于CD8+Mz为29.4％，相比对于CD4+Mz为15.3％，对于CD8+M28z为24.2％，相比对于CD4+M28z为11.1％)T细胞组中观察到最显著的裂解减少。颗粒酶A和B在静息外周血单核细胞(PBMC)中的表达主要限于CD8+T细胞，与先前研究的结果一致(图41E和44C)。在CAR转导的T细胞的PHA刺激和MSLN特异性刺激后，颗粒酶A表达没有显著改变(图44)。在用表达MSLN的肿瘤细胞刺激后18小时内，颗粒酶B在大于95％的CD4+和CD8+M28z CAR T细胞中表达。CD8+M28z T细胞在4小时共培养后MFI增加1.8倍，并且颗粒酶B表达在最后12小时进一步上调至2.6倍。然而，对于CD4+M28z T细胞，在最后12小时的培养期间，颗粒酶B的表达上调程度大得多(在最初的4小时期间为1.5倍，在最后12小时期间为3.7倍)。这些发现可以解释CD4+CAR T细胞显示的延迟的裂解动力学。此外，M28z增强了在CD4+和CD8+T细胞亚群中的颗粒酶B表达(图41E，共培养18小时后的表达)，可能解释了与CD4+Mz T细胞相比，CD4+M28z T细胞所观察到的增强的细胞毒性(图41B)。
局部施用的CD4+CAR T细胞单独是有效的，并介导功能性持久
对有效的CD4+M28z体外效应物功能和CD4+主要长期免疫的观察，导致了一种设想，即CD4+M28z T细胞将在不存在CD8+T细胞时表现出体内功效。在肿瘤生长18天后，用以3种不同剂量施用到胸膜腔中的CD4+M28z、CD8+M28z或本体未分选的M28z T细胞治疗荷瘤小鼠(图42A和42B)。在P28z治疗的小鼠中，肿瘤负荷稳定地进行直到小鼠被处死(中值存活，28天)。用CD4+M28z和本体M28z CAR T细胞(3×105；E:T，1:1000)治疗导致小鼠中100％的肿瘤根除，通过200天的随访小鼠保持无肿瘤。用CD8+M28z T细胞治疗仅延长存活83天(111天相比28天；P＝0.003；图42B)，并且在7只小鼠中仅3只实现了肿瘤根除。即使在较低剂量下，CD4+M28z CAR T细胞比CD8+CAR T细胞具有更高的功效(1×105：E:T，1:3000，112天相比67天[P＝0.04]；3×104：E:T，1:10000，160天相比37天[P＝0.001])。这些结果说明单独的CD4+CART细胞优于单独的CD8+CAR T细胞，尽管它们不如组合的CD4+和CD8+T细胞有效。
最后，为了解决在没有CD8+T细胞施用时，CD4+T细胞是否可以建立长期功能持久性，我们在初始胸膜内施用CD4+分选的或本体M28z T细胞后196天，在小鼠中进行腹膜肿瘤再激发。尽管与含有CD4+和CD8+的本体群体相比，持续的CD4+M28z T细胞的肿瘤负荷初始增加，然后肿瘤消退，并且随后的肿瘤生长被控制超过4周(图42C)。
5.讨论
如实地模仿人类疾病的原位MPM模型37,85,86,93用于评估用MSLN靶向的T细胞治疗恶性胸膜疾病的两种施用途径。发现胸膜内施用的CAR T细胞大大超出全身输注的T细胞，用低于30倍更少的M28z CAR T细胞诱导长期的完全缓解。局部施用的CAR T细胞显示出快速和稳健的T细胞扩增，导致有效的T细胞分化和全身肿瘤免疫。这种优越的功效依赖于早期CD4+T细胞活化，并与更高的肿瘤内CD4/CD8细胞比率和长期记忆相关。相反，静脉内递送的CAR T细胞即使在胸膜肿瘤中以相同数目聚集，也不能达到相当的活化、肿瘤根除或持续性。这些发现的平移相关性通过人T细胞和CAR的使用进一步增加，因为这些将基于本文报道的结果用于临床研究。
在本研究中，将MSLN靶向的CAR T细胞胸膜内施用于具有建立的胸膜肿瘤的小鼠(接种后12～18天，对照小鼠在第25～36天死亡)。使用肿瘤和T细胞非侵袭性成像，我们证明胸膜内施用的CAR T细胞(1)有效浸润整个胸部肿瘤，(2)成为有效的效应细胞，其以30倍低于静脉内治疗中使用剂量的剂量根除胸膜肿瘤，和(3)迁移出胸膜腔，循环并聚集在胸外肿瘤部位。而局部施用的细胞的即时位置显然避开了静脉内施用T细胞的专性循环和瞬时肺隔离，胸膜内施用的T细胞不同于全身募集的T细胞在于：1)CD8 T细胞聚集的水平和2)如CD62L下调所反映的效应物分化的动力学的快速性。最初缺乏胸膜CD8+T细胞聚集不是通过CD8+T细胞总体消失引起的，因为静脉内施用后7天内CD8+T细胞在小鼠的脾脏中持续存在。它们的较差的募集可能部分是由于它们运输所需的趋化因子受体或粘附分子的次优表达。然而，尽管通过在CAR T细胞中强制表达转导的CCR-2可以增强胸膜聚集55，但是用CAR T细胞的局部治疗绕过了运输限制(如果有的话)，并且能够在没有另外的T细胞工程化的情况下，高效地再分布到其他肿瘤位置，具有比静脉内施用的T细胞更大的功效。此外，单剂量的局部CAR T细胞治疗建立了长期的肿瘤免疫(在T细胞施用后高达200天)，提供了抗肿瘤再激发的有效保护。
这种局部CAR T细胞治疗的全身益处使人想起局部放射治疗125,126和肿瘤内溶瘤病毒治疗127对实体恶性肿瘤的远端效应，其中局部炎症应答可产生特异性免疫并有效影响远处肿瘤位点。胸膜内施用的CAR T细胞迁移出胸膜腔，并且早在施用后24～72小时在胸膜外肿瘤部位直接可视。因此，早期T细胞活化对CAR T细胞生物分布起到有益的作用。CD62L—表型的快速获得可以解释它们随后有效地转运至转移部位124。在我们的原位模型中胸膜间皮瘤86的大量的淋巴血管形成可能有助于这种有效的T细胞活化和再分布，与侧部肿瘤中形成对比，后者通常在生长时经历中心坏死。
胸膜内施用的T细胞在外周循环和持续的显著能力为具有可接近肿瘤部位的转移性癌症开辟了治疗的新途径，其可以用作CAR T细胞疗法的“局部充电和分配中心”。这些包括转移到胸膜腔的癌症，比如肺癌和乳腺癌，以及转移到腹膜腔的癌症，比如胰腺癌和卵巢癌。除了胸膜内或腹膜内施用，我们的研究结果提出，其他局部过继T细胞治疗方法，比如肝动脉输注、局部肢体灌注或颅内施用128-130，可以提供优越的疗效的前景。更保守地，这些局部和/或肿瘤内递送方法高度适用于其他表达MSLN的癌症，包括卵巢癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、三阴性乳腺癌、食管癌、胃癌、胆管癌和胸腺癌37,47,119,58,131-135。这种方法至少可以降低T细胞剂量需求，当不能获得大量的CAR T细胞时(由于低产率分离术、差的离体扩增或低转导)提供优势，并且甚至可以消除对全身血液成分置换的需要。
CD4+T细胞亚群的早期浸润和活化对于观察到的局部施用的益处是必要的。M28zCAR T细胞是多功能的，显示出有效的CD4+T细胞细胞毒性以及支持T细胞效应物形成、存活和增殖的辅助功能。CD4+T细胞的双重功能性通过CD4+效应物在局部施用后独立清除胸膜间皮瘤异种移植物的能力而最清楚地证明。它们在辅助功能中的关键作用进一步由与静脉内施用相比胸膜施用后观察到的增强的CD8+T细胞亚群和早期抗原活化的CD4+T细胞实现CD8+T细胞增殖突发的重要性来支持。静脉内施用的T细胞实现CD4+和CD8+亚群的有效聚集的更少能力表明，M28z CAR T细胞受到它们延迟到达肿瘤部位的负面影响。
通过CAR提供的CD28共刺激的关键作用以几种方式揭示。即使在低T细胞剂量下，M28z T细胞清除大的胸膜肿瘤。我们使用的胸膜内T细胞剂量(在大多数实验中为3×105M28z T细胞)是比其他间皮瘤异种移植物研究中使用的剂量显著更低的剂量55,56,123，并且与目前用于血液恶性肿瘤11,116和实体瘤136,137的临床试验中的剂量相当(参见表2)。
表2.临床前和临床研究中的CAR T细胞剂量*
*该临床试验使用mRNA的电穿孔来表达CAR。其他临床和临床前研究使用逆转录病毒(当前研究11,136)或慢病毒55,123载体转导CAR。
**与临床试验中使用的人剂量相当的小鼠剂量，使用得自National CancerInstitute的公式计算(http://dtp.nci.nih.gov)。
在胸膜内施用大于100天的肿瘤再激发后，与Mz T细胞相比，M28z T细胞提供了更好的肿瘤控制和强烈的增殖。相对于CD8+T细胞，CD28信号传导的增强特性在CD4+亚群中特别显著，如它们优良的细胞因子分泌和增殖所证实。有趣的是，CD28/CD3ζCAR对于通过穿孔素/颗粒酶依赖性途径诱导有效的CD4+T细胞介导的细胞毒性是必需的。已确定与CD8+T细胞相比，CD4+T细胞需要更高亲合力相互作用，以介导效应物功能138,139。因此CD28/CD3ζCAR工程化可能特别适合于产生能够T细胞辅助和细胞毒性的多功能CD4+T细胞140。
在表达低水平间皮素的正常组织附近，间皮素靶向CAR T细胞的增强的定位和活化可能增加“在脱靶肿瘤上的”毒性比如胸膜炎和心包炎的假设风险。然而，如先前报道的47,91,119，与正常组织相比，间皮素表达在肿瘤组织中显著更高。由于CAR T细胞活化在较高抗原密度的存在下更强，所以预期CAR T细胞对肿瘤的应答比对正常组织强。这得到本发明人使用等基因靶(图46A和46B)的体外研究和其他54,140的支持。还值得注意的是，在用靶向间皮素的CAR T细胞治疗的小鼠中的组织病理学研究没有显示胸膜或心包中的炎症性改变。此外，针对间皮素与免疫毒素的临床研究在超过100例患者中没有显示对正常组织的毒性122,141,142。报道的在用靶向间皮素的CAR T细胞治疗的患者中观察到的毒性(过敏性休克)是由于对包含鼠scFv的CAR的抗体应答143。M28z CAR仅由人序列组成53。然而，据信，需要另外的策略来限制或防止对正常组织的反应性。虽然淋巴毒性皮质类固醇有时可以清除CART细胞117，但是本发明人将利用自杀基因94推进到临床。在施用前药或抗体后，比如iCaspase-994、EGFR突变144和单纯疱疹病毒胸苷激酶145的自杀基因介导快速T细胞清除。如果必要，发明人还可以寻求设计为使用组合抗原识别或抑制性受体146-148来防止对正常组织的反应性的替代策略。限制CAR T细胞毒性的另一种策略是使用mRNA电穿孔56,149瞬时表达CAR，尽管以CAR T细胞持久性为代价并且需要多次T细胞施用以获得功效。
在这项研究中，如以前对CD19和PSMA靶向的CAR T细胞治疗所做的那样15,16,117，使用具有人类癌细胞和人类T细胞的免疫缺陷小鼠，以便促进我们的发现以及基于人的CAR载体向临床试验的直接临床转化。在免疫活性小鼠模型中研究过继转移的细胞和内源性免疫系统之间的相互作用将扩展我们的观察的意义。
基于本文提供的数据，设计I期临床试验以评价MSLN靶向CAR T细胞的胸膜内施用的安全性。本发明人已经证明具有更具侵袭性的疾病91,119，即原发性胸膜恶性肿瘤或来自过度表达MSLN的肺癌和乳腺癌的继发性胸膜恶性肿瘤，其患者将参与该试验。MSLN靶向的CAR T细胞将通过胸膜内导管递送，该方法被开发成为管理恶性胸腔积液患者的护理标准150。先前，生物制剂比如细胞因子151和溶瘤病毒152的局部施用已经成功地转化到临床。这项研究有力支持了，部分由于早期CD4+T细胞活化和随后发生的全身性益处，局部CAR T细胞施用于具有MPM的受试者结果将以减少的T细胞剂量引起更大的T细胞抗肿瘤功效。
实施例8.CAR T细胞抵抗肿瘤介导的抑制
1.摘要
使用临床相关的胸膜间皮瘤的原位小鼠模型，本发明人证明表达基于CD28或4-1BB的第二代CAR的T细胞虽然是持续的，但在肿瘤微环境内被功能性抑制。虽然CD28和4-1BB CAR赋予CAR T细胞类似的增殖和持久性；后者更持久地保持它们的细胞毒性和细胞因子分泌功能，导致在给予低T细胞剂量的小鼠中改善的存活。
2.引言
嵌合抗原受体(CAR)是将T细胞重新靶向肿瘤表面抗原的合成受体157,158。第一代受体将负责抗原识别的抗体衍生的肿瘤结合元件与触发T细胞活化的CD3ζ或Fc受体信号传导结构域相连接。第二代CAR的出现，其结合活化和共刺激信号传导结构域，导致在化药难治性B细胞恶性肿瘤患者中的令人鼓舞的结果159-163。将这种临床成功转化到实体瘤尚未完成，将需要克服额外的障碍，包括实现足够的T细胞浸润到肿瘤中并抵抗肿瘤免疫逃逸。最近，为了克服全身性T细胞施用时观察到的肿瘤浸润和延迟活化的限制，本发明人证明了在临床相关的胸膜间皮瘤模型中局部施用间皮素特异性CAR T细胞的优点164。间皮素(MSLN)是肿瘤相关的细胞表面抗原，选择它是基于其在几种癌症中的过表达以及我们观察到的其与肿瘤侵袭性(tumor aggressiveness)和在间皮瘤、肺和乳腺癌患者中减少的存活的关系165-172。靶向MSLN的CAR T细胞的局部施用以比静脉内施用低30倍的剂量根除原发性肿瘤并建立长期全身性免疫监视164。这些结果对于治疗实体恶性肿瘤是令人鼓舞的，并且促使本发明人开始胸膜内施用靶向间皮素的CAR T细胞的I期临床试验(NCT02414269)。当发明人模拟低水平肿瘤浸润时，他们发现并在此报告了CAR T细胞对肿瘤细胞介导的免疫抑制易感，导致受损的T细胞功能和减少的肿瘤排斥。
在该报告中，发明人已经确定了CAR T细胞的肿瘤介导的抑制的存在和动力学。通过进行T细胞效应物功能的全面连续分析，发明人已经确定，甚至是目前临床试验中的共刺激的CAR T细胞在体内重复抗原相遇时，它们的细胞溶解和细胞因子分泌功能也受到抑制。进一步强调了替代共刺激策略(4-1BB相比CD28)承受免疫抑制的不同能力。
3.材料和方法
一般目的
本研究的目的是表征肿瘤介导的T细胞抑制的机制，以增强T细胞免疫治疗实体恶性肿瘤的功效。本发明人设计了靶向MSLN的CAR，当转导入人T细胞时，其提供肿瘤抗原识别和抗原特异性效应物功能活化。本发明人还设计了提供共刺激信号传导和/或共抑制阻断的信号传导结构域。在体外，分析了细胞毒性、细胞因子分泌和T细胞增殖。通过使用临床相关的原位MPM和转移性肺癌的小鼠模型，体内实验分析了优化T细胞治疗的策略。如先前CD19214和PSMA215CAR T细胞所证明的，人癌细胞和人T细胞用于验证并促进我们的M28z CAR到临床的转化。实验程序由纪念斯隆凯特琳癌症中心(MSKCC)的机构动物护理和使用委员会批准。使用不同的供体T细胞，每个实验进行多次。为了避免混杂变量——例如由于转导效率、供体相关变量和E:T比率而引起的差异——本文使用代表性实验提供的数据，样品重复数大于3。
细胞系
MSTO-211H人胸膜间皮瘤细胞(ATCC，Manassas，VA)经逆转录病毒转导以表达GFP和萤火虫荧光素酶融合蛋白(MSTO GFP-ffLuc+)。然后将这些细胞用亚克隆到SFG逆转录病毒载体中的人MSLN变体1转导以产生MSTO MSLN+GFP-ffLuc+。类似地，用人MSLN变体1单独转导A549细胞和3T3鼠成纤维细胞以产生A549MSLN+和3T3 MSLN+细胞系。3T3细胞也用PD-L1(亚克隆到SFG载体中的Origene cDNA)共转导以产生3T3 MSLN+PDL1+细胞。
γ-逆转录病毒载体构建和病毒制备
为了产生MSLN特异性CAR，本发明人设计了编码特异性针对MSLN的全人scFv m912的cDNA(由D.Dimitrov，National Cancer Institute，Frederick提供)186，如先前所描述216，将其连接到人CD8前导结构域和CD8/CD3ζ、CD28/CD3ζ或CD8/4-1BB/CD3ζ结构域。类似地，使用先前表征的靶向PSMA的scFv215产生对照PSMA特异性CAR。将CAR序列插入到SFGγ-逆转录病毒载体(由I.Reliere，MSKCC提供)中，并将其与P2A序列连接，以诱导LNGFR报告子(截短的低亲和力神经生长因子受体)的共表达。然后，如先前所述219，将编码CAR的质粒转染到293T H29包装细胞系中，以制备逆转录病毒。
T细胞分离、基因转移和CD4/CD8分离
根据机构审查委员会批准的方案从健康志愿者供者的血液中分离外周血白细胞。通过在Lymphoprep(Stem Cell Technology，Vancouver，Canada)上的低密度离心来分离外周血单核细胞(PBMC)，并用植物凝集素(2μg/mL；Remel，Lenexa，KS)活化。分离后两天，用293T RD114产生的编码CAR的逆转录病毒颗粒转导PBMC，并在用纤维连接蛋白(15μg/mL；r-纤连蛋白，Takara，Tokyo，Japan)包被的平板上，以3000rpm旋转孵育1小时。1天后，将转导的PBMC保持在IL-2(20UI/mL；Novartis，Basel，Switzerland)中。通过流式细胞术分析测定转导效率。通过基于流式细胞术的分选(BD Aria Sorter)，获得纯的CD4+和CD8+CAR+T细胞群。
流式细胞术
使用藻红蛋白或别藻蓝蛋白缀合的抗人MSLN大鼠IgG2a(R&D Systems，Minneapolis，MN)检测人MSLN表达。使用以下抗体分析肿瘤细胞上共刺激或抑制蛋白的表达：4-1BBL(PE，克隆5F4；BioLegend，San Diego，CA)、MHC HLA-DR(PE，克隆L203；R&DSystems)、PD-L1(APC，克隆MIH1；eBioscience，San Diego，CA)、PD-L2(APC，克隆MIH18；eBioscience)和半乳凝素-9(APC，克隆9M13；BioLegend)。用针对CD3、CD4、CD8和CD69mLNGFR的单克隆抗体测定T细胞表型和转导效率。使用PD1(APC，eBioJIU5；eBioscience)、TIM-3(PE，克隆344823；R&D Systems)和Lag-3(PE，克隆C9B7W；BioLegend)分析T细胞抑制性受体的表达。使用BD LSRII流式细胞仪(BD，Franklin Lakes，NJ)和FlowJo分析软件分析细胞染色。
T细胞功能试验
如先前所述220，用CAR或载体对照转导的T细胞的细胞毒性通过标准51Cr释放试验测定。为了进行荧光素酶活性测定，将表达MSLN和萤火虫荧光素酶的CAR+T细胞和MSTO-211H细胞以不同的E:T比率孵育18小时。在每孔加入100μL D-荧光素(15mg/mL)后，使用IVIS 100/lumina II通过BLI测定肿瘤细胞数量，并与单独的肿瘤细胞发射的信号进行比较。将效应细胞和经辐照的MSTO-211H MSLN肿瘤细胞以5：1的比例在24孔板中孵育18小时后，进行CD107a和细胞内染色。对于CD107a试验，在刺激时加入5μL CD107a-PeCy7抗体(BDBiosciences，SanJose，CA)和Golgi STOP(4μL/6mL；BD Biosciences)。对于细胞内染色，在刺激时加入Golgi Plug(1μL/1mL；BD Biosciences)。孵育后，对效应细胞进行CD4、CD8、LNGFR和CD3标志物的染色，然后根据制造商的说明书(Cytofix/Cytoperm试剂盒；BDBiosciences)固定和透化。使用颗粒酶B-APC、穿孔素-PE和IFN-γ-FITC抗体(BDBiosciences)进行细胞内细胞因子的染色。
在200μL培养基中，3×104至5×103T细胞与靶细胞以1:1至5:1的比率，在96孔圆底板中共培养，设三个复孔，进行细胞因子释放试验。共培养6～24小时后，收集上清液。根据制造商的说明书(Millipore，Darmstadt，Germany)，使用多重珠人细胞因子检测试剂盒测定细胞因子水平。
为了分析T细胞的增殖能力，用具有或不具有MSLN(以及在3T3的情况下，具有或不具有PD-L1)表达的经辐照的MSTO-211H或3T3细胞刺激1×106CAR+T细胞。在不存在外源IL-2的情况下，进行增殖试验。每7天对细胞计数，然后将其覆盖在经辐照的靶细胞上进行重复刺激。对每个T细胞组绘制CAR+T细胞数对时间的曲线。
原位胸膜间皮瘤动物模型和离体实验
为了开发胸膜间皮瘤的原位小鼠模型，使用4至6周的雌性NOD/SCIDγ小鼠(TheJackson Laboratory,Bar Harbor,Maine)。所有程序在机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。使用吸入的异氟烷和氧麻醉小鼠，施用布比卡因镇痛。如先前所述164,171,188，通过右胸部切口，进行200μL无血清培养基中的1×105～1×106肿瘤细胞的直接胸膜内注射，以建立原位MPM肿瘤。通过直接胸膜内注射至小鼠的胸腔或通过尾静脉全身注射，将总计3×104～1×105的转导的T细胞(在200μL无血清培养基中)过继转移到荷瘤小鼠中。在单次腹膜内剂量的D-荧光素(150mg/kg；Perkin Elmer，Waltham，MA)后20分钟，通过BLI在体内监测和定量肿瘤生长。使用Living Image软件(版本2.60)分析BLI数据；BLI信号报告为总通量(每秒光子数)，其表示腹侧和背侧通量的平均值。为了分析离体的CAR T细胞的功能性能力，如下处理肿瘤组织和小鼠脾脏：称重组织并收获至冰冷的RPMI 1640中。用手术刀手动将组织分离，然后通过40～100μm过滤器机械解聚。接下来，通过FACS分析样品以分型，或使用FACS Aria分选仪分选CAR+CD4+或CD8+T细胞，然后在具有IL-2(60UI/mL)的RPMI中静息24小时，并且如上所述，进行51Cr-释放和细胞因子释放试验。
组织学分析和免疫染色
在石蜡包埋的4％多聚甲醛固定的组织样品经H&E染色后，进行肿瘤的组织病理学评价。如先前所述168,170,172，用小鼠抗人MSLN免疫球蛋白G进行人MSLN的免疫组织化学分析。
定量实时PCR
提取来自CD4+LNGFR+或CD8+LNGFR+分选的T细胞的mRNA，并使用μMACS One-StepcDNA试剂盒(MACS molecular，Miltenyi Biotech Inc，Auburn，USA)将其逆转录成cDNA。用方法，使用Applied 7500系统(Foster，CA，USA)、Universal PCR Mastermix和具有6-羧基荧光素(FAM-MBG)标记并通过生物技术设计的探针：Tbet(Hs00203436_m1)、Eomes(Hs00172872_m1)、颗粒酶B(Hs01554355_m1)、IFNγ(Hs00989291_m1)、IL-2(Hs00174114_m1)、PD-1(Hs01550088_m1)进行定量实时PCR(RT-PCR)。使用目的基因的比较阈值周期(CT)，并使用如下公式ΔCt(样品)＝Ct(目的基因)–Ct(β2m)，将其归一化到β2m管家基因。然后，使用2-ΔΔCt方法来分析与对照条件相比的相对倍数变化表达，并按如下公式计算：2-ΔΔCt＝2^-(ΔCt(样品)-ΔCt(对照))。
统计方法
使用Prism(6.0版本；GraphPad Software，La Jolla，CA)软件分析数据，并如图例所示，以平均值±SEM表示。使用非配对Student's t检验(双尾)分析结果，当适用时，用Bonferroni校正来进行多重比较。使用对数秩检验分析存活曲线。统计学显著性定义为P<0.05。所有统计分析用Prism软件进行。
4.结果
具有CD28或4-1BB共刺激的CAR在初始抗原刺激后在体外表现出等效的效应物细胞因子分泌和增殖
构建包含人MSLN特异性scFv186和CD3ξ、CD28/CD3ξ或4-1BB/CD3ξ信号传导结构域的三种CAR(Mz、M28z、MBBz)(图47A和47B)。对前列腺特异性膜抗原(PSMA)特异的P28z CAR作为阴性效应物来控制同种异体反应性和异种反应性。使用SFG-逆转录病毒载体有效转导CD4+和CD8+人外周血T淋巴细胞(50％～70％转导)(图54)。MSLN转导的MSTO-211H细胞(MSLN+)和PSMA转导的EL-4小鼠淋巴瘤细胞(MSLN-)在体外实验中用作MSLN阳性和阴性靶标。Mz、M28z和MBBz转导的T细胞在体外表现出相似的MSLN特异性裂解(图47C)。P28z CAR T细胞不裂解MSTO MSLN+细胞，并且MSLN靶向的CAR不裂解EL4PSMA+细胞——表明裂解是抗原特异性的。在不存在外源IL-2时，当与Mz相比，M28z和MBBz CAR T细胞分泌2至15倍更高水平的Th1细胞因子(图47D)，并且重复暴露于MSLN+细胞时达到14倍更大的T细胞聚集(图47E)，验证了共刺激信号传导的功能性187。已确定了抗原特异性并验证了共刺激信号传导结构域的功能，我们继续评估MSLN靶向的CAR T细胞在小鼠携带建立的胸膜肿瘤中的治疗潜力。
M28z比MBBz更容易允许肿瘤复发
在以前由我们的实验室建立的恶性胸膜间皮瘤(MPM)的原位模型171,188-190中，使用具有萤火虫荧光素酶(ffLuc)转导的MSTO-211H细胞的连续生物发光成像(BLI)来确认肿瘤的建立，在开始T细胞治疗之前平衡干预组的肿瘤负荷，并测量对治疗的应答。以单次剂量1×105(根据肿瘤负荷定量估计的效应物与靶标[E:T]比率为1:3000)189胸膜内施用的M28z和MBBz CAR T细胞，能够在大多数小鼠中根除已建立的胸膜肿瘤(图48A，上)。由于本研究的目的是研究肿瘤诱导的免疫抑制对T细胞耗尽的影响，将CAR T细胞以连续较低的剂量施用于患有建立的胸膜肿瘤的小鼠。据推测，在这些较低剂量下，T细胞将尤其易于耗尽，因为它们必须在抑制环境内遭遇重复抗原时保持功能以清除肿瘤。正是在这些较低剂量下，发明人开始看到肿瘤复发，特别是在M28z群体中(图48A，中间和底部)。在测试的最低剂量4×104(E:T，1:7,500)下，用胸膜内Mz(第一代CAR，不包含共刺激信号传导)CAR T细胞治疗的小鼠在肿瘤负荷方面显示出不可持续的应答(图48B)，中值存活比P28z治疗的对照(中值存活，45相比16天，P28z表示靶向PSMA抗原的异种反应性和同种异体反应性对照)长29天(图48B)。用M28z CAR T细胞治疗的小鼠比用第一代CAR T细胞治疗的小鼠具有更均匀的肿瘤负荷减少并存活更长(中值存活，64天)；然而，用M28z CAR T细胞治疗的所有小鼠最终死于进展性肿瘤。证实肿瘤生长不是由肿瘤抗原逃逸引起的(通过流式细胞术和组织学分析发现所有测试小鼠中的复发性肿瘤是MSLN+；数据未显示)。相比之下，胸腔内施用的MBBz CART细胞在治疗20天内诱导肿瘤根除，并且绝大多数小鼠(8中的7只)保持无肿瘤大于100天(第100天没有达到中值存活)。
MBBz在低T细胞剂量下优于M28z CAR T细胞
通过共刺激信号传导提供的CAR T细胞功效的改善通常归因于CAR T细胞增殖和/或持久性的改善158。如预期的，与Mz CAR T细胞相比，M28z和MBBz CAR T细胞实现了增强的肿瘤内T细胞聚集(对于M28z是9倍，对于MBBz是12倍)(图49A)。令人惊讶的是，尽管M28z和MBBz CAR T细胞之间的功效差异，在两组之间观察到相似数目的肿瘤浸润性T细胞(图49A)。此外，M28z和MBBz CAR T细胞在长期时间点上具有相同的持久性(图49B)。最初具有治疗应答但随后死于进展性肿瘤的M28z治疗的小鼠的肿瘤组织和脾脏，包含循环T细胞以及包括CAR阳性细胞的肿瘤浸润性T细胞(图49C)。这个发现表明，仅仅可以有效运输到肿瘤的T细胞的持续性不足以清除肿瘤，并且肿瘤微环境中的T细胞功能状态可能是临床结果的更关键决定因素。因此假设，甚至共刺激的T细胞可能在肿瘤内耗尽，特别是在对应于低效应物：靶标比率的低T细胞剂量下。此外，与M28z CAR T细胞一样持久的MBBz CAR T细胞可以更好地抵抗耗尽并保留T细胞效应物功能，以清除大的肿瘤负荷。
间皮素CAR T细胞在体内抗原暴露后变得耗尽
为了评估是否存在CAR T细胞的持续免疫抑制并比较M28z和MBBz CAR T细胞克服肿瘤介导的免疫抑制的相对能力，将1×106CAR T细胞注射到MSTO MSLN+肿瘤携带小鼠的胸膜腔，允许足够的时间用于重复的抗原相遇和T细胞活化(通过活化标记CD69的向前和侧向散射以及上调确认)，然后用MSLN+靶标对收获的CD4或CD8CAR肿瘤浸润性或脾T细胞进行离体刺激(示意图如图50A所示)。使用未注射的体外静息T细胞(“输注前细胞”)建立基线功能水平(抗原暴露前)。与静息M28z CD8+CAR T细胞相比，暴露于MSLN抗原的T细胞在体内具有较低水平的细胞裂解功能(图50A)(输注前细胞裂解，20.5％；肿瘤浸润性T细胞裂解，13.1％；脾T细胞裂解，8.7％)。相比之下，MBBz CAR T细胞保留细胞裂解功能(输注前细胞裂解，18.3％；肿瘤浸润性T细胞裂解，37.2％；脾T细胞裂解，22.2％)。分选的CD4+CAR T细胞表现出类似的结果模式。还测量了肿瘤浸润和脾CAR T细胞的离体刺激后的细胞因子水平，并且还观察到在体内暴露于MSLN+抗原的CD4+M28z CAR T细胞的Th1细胞因子分泌的减少。CD4+MBBz CAR T细胞也表现出Th1细胞因子分泌的减少，尽管当与M28z CAR T细胞相比时这些细胞能更好地保留细胞因子分泌(图50B)。与CD4+T细胞上清液相比，CD8+T细胞上清液含有显著更低水平的细胞因子(先前在我们的模型中观察到的发现164)。CD8+T细胞在体内抗原暴露时也具有降低的分泌细胞因子的能力；CD8+MBBz CAR T细胞优先保留它们分泌IFN-γ的能力。接下来，评估在施用后第3天从肿瘤和脾脏收获的T细胞的mRNA水平，并且发现GzB、IL-2和IFN-γ的体内表达水平对于CD4+和CD8+MBBz CAR T细胞大多比对M28z CAR T细胞更大，CD8+亚群中的IL-2表达除外(图50C)。
MBBz CAR T细胞在体内显示延迟耗尽
已经证明在体内暴露于抗原的共刺激CAR T细胞中的细胞裂解功能和效应物细胞因子分泌的抑制，本发明人推测重复抗原刺激可能类似于慢性感染模型，在T细胞抑制中起作用，在重复抗原相遇时保持功能的不同能力可能解释MBBz CAR T细胞的增强的功效。因此，在体外模型系统中，检测Mz、M28z和MBBz CAR T细胞抵抗重复抗原相遇的能力，其中每7天在MSLN+抗原刺激下评估细胞的增殖、细胞溶解功能和细胞因子分泌。M28z和MBBz CAR T细胞具有类似的在连续MSLN+刺激时扩增的能力，扩增至比Mz CAR T细胞高14倍的水平；他们在第三次刺激后失去扩增的能力(图51)。尽管MBBz CAR T细胞能够更好地保留溶解功能，MBBz和M28z CAR T细胞在重复抗原刺激下丧失细胞溶解功能。其中在第一次刺激时，在三个T细胞组中裂解相等，到第三次刺激，M28z裂解功能被抑制到更显著的水平，使得MBBzCAR T细胞在多个E:T比率下具有更强的肿瘤裂解(图51B，右)。第三次刺激下的溶解功能(通过测量CD107a表达的脱颗粒试验所评估)与铬释放试验的结果相关(图51C)。接下来，测量Th1细胞因子分泌，并再次观察到，在第一次刺激时M28z和MBBz CAR T细胞之间的相似水平以及每次刺激的连续降低。与细胞毒性一样，MBBz CAR T细胞优先保留细胞因子分泌；并且当比较第一和第二刺激的水平时，对于M28z，细胞因子浓度减少大于30倍，而对于MBBzCAR T细胞仅降低约2倍(图51D)。然后通过在第二次刺激下测量细胞因子的细胞内水平来确认细胞因子产生的差异(数据未显示)。在抗原刺激时，对CAR T细胞的逆转录酶PCR分析揭示，与M28z CAR T细胞相比，MBBz CAR T细胞表达与更低水平的耗尽和抑制相关的标志物：MBBz CAR T细胞表达更高水平的Tbet和脱中胚蛋白(Eomesodermin)以及更低水平的PD1和FoxP3(图55)。然后，本发明人试图测试已经暴露于肿瘤抗原的持久性CAR T细胞的体内功能，假设虽然M28z和MBBz CAR T细胞之间的定量持续性相等，但是MBBz CAR T细胞将在肿瘤再激发时显示增强的功能。对具有建立的MSLN+胸膜肿瘤的小鼠施用胸膜内M28z或MBBz CAR T细胞(剂量为1×105，E:T比例1:3000)以根除胸膜肿瘤(图51E)。在初始T细胞注射后20天，通过将MSLN+肿瘤细胞(1×106)注射到存活者的胸膜腔中来进行肿瘤再激发；使用BLI监测肿瘤负荷。持续的MBBz CAR T细胞能够更好地控制肿瘤负荷(4只MBBz治疗的小鼠中的4只具有基线水平的BLI信号，相比4只M28z治疗的小鼠的2只)(图51E)。
肿瘤细胞PD-L1抑制间皮素CAR T细胞效应物功能
已经确定CAR T细胞被体内肿瘤环境抑制，并且MBBz CAR T细胞能够更好地克服这种抑制——至少部分是因为它们在重复抗原相遇时保持功能的能力——本发明人接下来试图评估抑制性受体和配体通路在模型中发挥的作用。本发明人开始于在具有肿瘤进展的M28z治疗的小鼠中将肿瘤浸润性T细胞染色，用于表现已知通路的抑制。我们发现PD-1、Tim-3和LAG-3的高水平表达(图52A)。在施用后6天收获的肿瘤浸润的MBBz CAR T细胞也表明抑制性受体的上调，尽管它们在蛋白质和mRNA水平上表达显著更低水平的PD-1受体(图52B～52D)。与CD8+T细胞相比，CD4+T细胞表达更高水平的PD-1。观察到显著部分的M28z和MBBz CAR T细胞共表达PD-1和LAG-3或PD-1和Tim-3，这表明多个抑制通路可以同时发挥作用(图56)。接下来，评估肿瘤表达的配体：PD-L1和PD-L2(PD-1的配体)、半乳凝素-9(Tim-3的配体)和MHC II类(LAG-3的配体)。在胸膜内施用M28z CAR T细胞后收获的胸膜肿瘤细胞上仅表达PD-1配体(图52E)。如别处报道的173,174，肿瘤细胞与IFN-γ和TNF-α(在与图47和51中T细胞分泌的浓度相近的浓度下)的共培养导致肿瘤细胞上PD-L1和PD-L2表达的相似水平的上调(图52F)，反映肿瘤细胞抵抗免疫攻击(“获得性免疫抗性”)的获得性。PD-1受体和配体在体内表达的独特存在表明该通路可能发挥显著的抑制作用。由于一些研究表明共刺激通过PD-1191-193可能足以克服抑制，因此发明人接下来评估了在PD-L1介导的免疫抑制的体外模型(使用单独用MSLN[MSLN+]或用MSLN和PD-L1[MSLN+PD-L1+]转导的3T3小鼠成纤维细胞)中，过表达的PD-L1是否可以抑制CAR T细胞功能(图53A)。在M28z和MBBz CAR T细胞中，PD-L1过表达导致在连续刺激时聚集减少(图53B)和Th1效应细胞因子分泌减少(图53D)。虽然肿瘤细胞裂解在初始刺激时没有被抑制(数据未显示)，但是在针对MSTO MSLN+肿瘤细胞的两次刺激之后，以3T3作为靶进行的铬释放试验显示，在M28z和MBBz CAR T细胞中裂解功能降低，在M28z CAR T细胞中降低更高程度(图53C)。该结果可能是由于暴露于MSTO MSLN+肿瘤细胞后PD-1在M28z和MBBz CAR T细胞上的差异上调。
5.讨论
本文提供的研究表明，甚至在表达第二代CAR的T细胞在肿瘤微环境中的体内抗原暴露时也被抑制。其他几项研究报道，单独的共刺激可以克服肿瘤表达的抑制性信号传导，可能解释为它们依赖于体外研究、它们使用免疫敏感的体内模型以及它们施用高剂量T细胞，这些不反映在患者中观察到的已建立的实体瘤的负担191-193。在实验中，不管是CD28或4-1BB共刺激结构域，更高的T细胞剂量导致肿瘤根除。是更低的T细胞剂量(导致较低的效应物：靶标比率)，使耗尽的效果变得明显。这些发现说明，使用临床相关的体内模型和与患者试验中使用的T细胞剂量类似的T细胞剂量的重要性。使用的胸膜内T细胞剂量(每只小鼠4×104～1×105相当于人的1.2×105～3×106/Kg)明显低于在其它间皮瘤异种移植研究194,195中使用的那些剂量，与用于目前的血液恶性肿瘤159,162和实体瘤196,197的临床试验中使用的剂量相当。因此，本文提出的实验策略特别适合于表征耗尽在CAR T细胞治疗中的作用。
在本报告中，虽然4-1BB和CD28共刺激信号传导使T细胞持久性增强相似的程度——在较低的E:T比率下，但只有4-1BB共刺激的T细胞治疗根除肿瘤。4-1BB共刺激的T细胞虽然仍然对肿瘤介导的抑制敏感，对体内抗原暴露和体外重复抗原刺激后的T细胞裂解功能和细胞因子分泌下降相对抵抗。4-1BB信号传导对免疫抑制的抗性与更有效的表型(PD-1loTbethi,Eomesoderminhi)198-202相关，其在其他肿瘤模型和慢性病毒感染的类似模型中，已经与更少的耗尽和更强烈的细胞毒效应物应答相关联。这表明，在可用选项(即4-1BB、CD28、OX40L、4-1BBL、CD27等)中选择特定共刺激信号传导策略的标准应该延伸到超出T细胞持久性至“功能持久性”，其定义为T细胞在重复抗原刺激时起作用的能力，这可以是最初在肿瘤微环境内或可在原发性肿瘤负荷控制之后在抗原再激发下发生。如同发明人已经公开的支持局部CAR T细胞治疗的工作164一样，施用具有高功能持久性的T细胞使得可单次施用低T细胞剂量，这起到限制细胞因子释放综合征但仍然能够根除原发性肿瘤的作用。重要的是要注意，不应该从这些实验得出4-1BB是用于患者治疗的事实上(de facto)的共刺激剂的结论——优异的信号传导通路将取决于肿瘤的共刺激和共抑制配体表达的独特模式、抗原表达水平或密度、scFv对肿瘤抗原的亲和力、肿瘤表位与膜的距离、以及构建体设计(例如间隔区和跨膜结构域)的变量158,203-207。这些变量——而不是信号传导中的定性差异——可能最终解释临床前试验中观察到的变化性，其替代地得出结论，4-1BB或CD28是优异的，这取决于环境。实际上，本报告中使用的4-1BB和CD28构建体在其跨膜结构域中是完全不同的，因此不应该从该研究中得出结论确定最佳共刺激结构域。
实施例9.M28z CAT T细胞对具有可变MSLN表达的细胞的功效
通过FACS评估癌细胞(例如，A549、H1299和EKVX肺癌细胞、MSTO间皮瘤细胞和Hela细胞)与正常细胞(例如MRC5细胞)上的MSLN表达。结果示于图57中。通过量子标记珠(quantibrite beads)FACS分析来定量每个细胞的MSLN分子的数量。结果示于图58中。如图57和58所示，MSLN转导的A549Mmc和H1299Mmc细胞具有最高的MSLN表达，然后是MSLN转导的EKVXM和MSTOGM(或“MGM”)细胞。接下来，在这些肺和间皮瘤细胞上进行MSLN mRNA表达分析。从培养的肿瘤细胞提取mRNA并合成cDNA。对MSLN进行Taqman试验，使用B2-微球蛋白(microglobulin)作为内部对照。如图59所示，结果以相对于MRC-5细胞中的MSLN mRNA表达的倍数变化表示。与图57和58所示的MSLN表达水平一致，MSLN转导的A549Mmc和H1299Mmc细胞具有最高的MSLN mRNA水平，然后是MSLN转导的EKVXM和MGM细胞。
如先前所述220，M28z CAR转导的T细胞的细胞毒性通过标准51Cr释放试验测定。M28z CAR转导的T细胞和具有不同MSLN表达水平的细胞以不同的E:T比率孵育18小时。将靶向PSMA抗原的P28z用作阴性对照。结果示于图60。如图60所示，M28z CAR T细胞的细胞毒性是MLSN抗原依赖性的，并且与MSLN表达水平成比例。例如，M28z CAR T细胞对具有最高MSLN表达水平的A549Mmc细胞的细胞毒性在所有检测细胞中是最高的。还注意到，M28z CAR T细胞的细胞毒性与细胞表面上的MSLN抗原强度不完全成比例，因为细胞毒性可能受几种其它因素的影响，例如细胞内MSLN的量、在癌细胞上的共刺激或共抑制配体的表达、细胞大小、培养中癌细胞/T细胞孵育的持续时间(其进而影响共抑制配体表达)和接种的癌细胞的融合(confluence)。
实施例10.M28z CAR T细胞的增殖能力
在存在外源IL-2以及不存在IL-2的情况下，测定重复抗原刺激后的CAR T细胞聚集。在IL-2存在下，用表达不同水平的MSLN的不同细胞系(MRC5、EKVX、A549G和A549GM)多次刺激M28z CAR T细胞。使用10:1的比例，刺激后7天对T细胞计数。结果示于图61和62中。如图61A和61B所示，CAR T细胞聚集与肿瘤细胞上的MSLN水平成比例。
实施例11.M28z CAR T细胞在肺癌模型中的体内功效
为了评估在原位肺癌模型中，M28z CAR转导的T细胞对于表达低或高MSLN抗原表达的肺癌细胞的功效，将免疫缺陷的NSG小鼠静脉内注射表达GFP-萤火虫萤光素酶和低或高MSLN表达的1e6A549细胞(分别为A549G或A549GM)。肿瘤建立后22天，用静脉内单次剂量的5e4或5e5M28z CAR T细胞治疗小鼠(图63A)。通过肿瘤生物发光成像(BLI)(图63B)和Kaplan-Meier存活分析(图63C)通过连续评估肿瘤负荷来监测抗肿瘤功效。M28z CAR T细胞在两个剂量下对高表达MSLN的癌细胞(A549GM)均有效。M28z T细胞仅在所检测的两种剂量的较高剂量下针对低表达MSLN的A549G细胞有效延迟肿瘤负荷进展并延长存活。与公开的常规CAR T细胞实验相比，使用的两种剂量都是低得多的剂量。结论是，M28z T细胞在控制具有低MSLN表达细胞(A549G)的小鼠中的肿瘤负荷是有效的，并根除具有高抗原表达细胞(A549GM)的小鼠中的肿瘤。
用1e6A549E或A549M细胞(分别为低和高MSLN表达，无GFP荧光素酶)静脉内注射免疫缺陷NSG小鼠以建立肺癌(图64A)。肿瘤建立22天后，用与增强的萤火虫荧光素酶(Effluc)共转导的M28z CAR T细胞，静脉内以单次剂量2e6治疗小鼠，以监测体内T细胞聚集。在T细胞注射后的第1、3、5、7和12天进行T细胞BLI(图64A)。如图64B～64D所示，在具有高MSLN表达(A549M)的小鼠中，CAR T细胞以快速方式聚集，在第5天达到其峰值(在此时肿瘤被清除)，然后显示降低的聚集。CAR T细胞聚集在具有低表达MSLN的肿瘤(A549E)的小鼠中以相对低的速度进展，在第7天达到其峰值。因此，M28z CAR T细胞聚集取决于肺癌肿瘤中的抗原表达水平。
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从前面的描述中，显然可以对本文所述的本发明进行变化和修改，以使它适用于各种用途和条件。这些实施方式也在所附权利要求的范围内。
本说明书中提到的所有专利和出版物以及通过登录号或参考号提到的序列均并入本文以供参考，其程度如同每个独立的专利和出版物以及序列被具体地和单独地指明并入本文以供参考。

Claims (97)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域以约1nM至约25nM的结合亲和力(Kd)特异性结合人间皮素。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单链可变区片段(scFv)。
3.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含人scFv。
4.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含任选交联的Fab。
5.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含F(ab)2。
6.如权利要求2～5中任一项所述的CAR，所述scFV、Fab和F(ab)2的一个或多个包含在具有异源序列的融合蛋白中以形成所述细胞外抗原结合结构域。
7.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR的细胞外抗原结合结构域识别间皮素表达水平为约1,000或更多个间皮素结合位点/细胞的人间皮素。
8.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸1～119的重链可变区。
9.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸1～107的轻链可变区。
10.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸1～107的轻链可变区。
11.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸1～119的重链可变区；和含有SEQ ID NO:5的氨基酸1～107的轻链可变区。
12.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸1～119的重链可变区；和含有SEQ ID NO:3的氨基酸1～107的轻链可变区。
13.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包括：包含具有SEQ IDNO:11所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:12所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR2、和包含具有SEQ ID NO:13所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR3。
14.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包括：包含具有SEQ IDNO:14所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:15所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR2、和包含具有SEQ ID NO:16所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR3。
15.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包括：包含具有SEQ IDNO:11所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:12所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR2、包含具有SEQ ID NO:13所示序列或其保守修饰的氨基酸的重链可变区CDR3、包含具有SEQ ID NO:14所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR1、包含具有SEQ ID NO:15所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR2、和包含具有SEQ ID NO:16所示序列或其保守修饰的氨基酸的轻链可变区CDR3。
16.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含在所述细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区之间的接头。
17.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含共价连接到所述细胞外抗原结合结构域的5’末端的前导序列。
18.如权利要求17所述的CAR，其中所述前导序列包含CD8多肽。
19.如权利要求1所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合。
20.如权利要求19所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8多肽。
21.如权利要求19所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD28多肽。
22.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞内结构域包含CD3ζ多肽。
23.如权利要求1所述的CAR，其中所述细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区。
24.如权利要求23所述的CAR，其中所述至少一个共刺激信号传导区包含CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、PD-1多肽、CTLA-4多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合。
25.如权利要求1所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8多肽，并且所述细胞内结构域包含CD3ζ多肽。
26.如权利要求1所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD28多肽，所述细胞内结构域包含CD3ζ多肽，并且所述共刺激信号传导结构域包含CD28多肽。
27.如权利要求1所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8多肽，所述细胞内结构域包含CD3ζ多肽，并且所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB多肽。
28.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR是Mz。
29.如权利要求28所述的CAR，其中所述Mz的跨膜结构域包含CD8多肽，并且所述Mz的细胞内结构域包含CD3ζ多肽。
30.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR是M28z。
31.如权利要求30所述的CAR，其中所述M28z的跨膜结构域包含CD28多肽，所述M28z的细胞内结构域包含CD3ζ多肽，并且所述共刺激信号传导区包含CD28多肽。
32.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR是MBBz。
33.如权利要求32所述的CAR，其中所述MBBz的跨膜结构域包含CD8多肽，所述MBBz的细胞内结构域包含CD3ζ多肽，并且所述共刺激信号传导区包含4-1BB多肽。
34.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR是重组表达的。
35.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR由载体表达。
36.如权利要求35所述的CAR，其中所述载体是γ-逆转录病毒载体。
37.一种分离的免疫应答细胞，其包含前述权利要求中任一项所述的CAR。
38.如权利要求37所述的分离的免疫应答细胞，还包含至少一种外源的共刺激配体。
39.如权利要求38所述的分离的免疫应答细胞，其中所述至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14及其组合。
40.如权利要求39所述的分离的免疫应答细胞，其中所述共刺激配体是4-1BBL。
41.如权利要求37所述的分离的免疫应答细胞，还包含至少一种外源的细胞因子。
42.如权利要求41所述的分离的免疫应答细胞，其中所述至少一种细胞因子选自IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21及其组合。
43.如权利要求42所述的分离的免疫应答细胞，其中所述至少一种细胞因子是IL-12。
44.如权利要求37～43中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞。
45.如权利要求37所述的分离的免疫应答细胞，其中所述细胞是T细胞。
46.如权利要求37～45中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述分离的免疫应答细胞表达约1至约4个载体拷贝数/细胞的CAR。
47.如权利要求37～46中任一项所述的分离的免疫应答细胞，还包含与不同于人间皮素的抗原结合的抗原识别受体。
48.如权利要求47所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抗原是肿瘤或病原体抗原。
49.如权利要求48所述的分离的免疫应答细胞，其中所述肿瘤抗原选自碳酸酐酶IX(CAlX)、癌胚抗原(CEA)、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(LlCAM)、黑色素瘤抗原家族A,1(MAGE-A1)、粘蛋白16(Muc-16)、粘蛋白1(Muc-1)、NKG2D配体、癌-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、Wilms肿瘤蛋白(WT-1)、1型酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1)及其组合。
50.如权利要求37～49中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述分离的免疫应答细胞表达一种或多种粘附分子。
51.如权利要求50所述的分离的免疫应答细胞，其中所述粘附分子增加CAR的亲合力。
52.如权利要求50或51所述的分离的免疫应答细胞，其中所述粘附分子选自CD2、VLA-4及其组合。
53.一种减少受试者中肿瘤负荷的方法，其包括将有效量的如权利要求37～52中任一项所述的免疫应答细胞施用于所述受试者，从而诱导所述受试者中的肿瘤细胞死亡。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数量。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述方法减少肿瘤大小。
56.如权利要求53所述的方法，其中所述方法根除所述受试者中的肿瘤。
57.如权利要求53所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述实体瘤选自间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜瘤、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastric cancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)、胆管癌及其组合。
59.一种增加或延长患有瘤形成的受试者的存活的方法，其包括将有效量的如权利要求37～52中任一项所述的免疫应答细胞施用于所述受试者，从而增加或延长所述受试者的存活。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述瘤形成选自间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜癌、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastric cancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)、胆管癌及其组合。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述方法减少或根除所述受试者的肿瘤负荷。
62.一种响应受试者的癌细胞或病原体而增加免疫激活细胞因子产生的方法，其包括将如权利要求37～52中任一项所述的免疫应答细胞施用于所述受试者。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述免疫激活细胞因子选自GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、干扰素调节因子7(IRF7)及其组合。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述免疫激活细胞因子选自GM-CSF、IFN-γ、TNF-α及其组合。
65.如权利要求53～64中任一项所述的方法，还包括施用至少一种免疫调节剂。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述至少一种免疫调节剂选自免疫刺激剂、检查点免疫阻断剂、放射治疗剂、化疗剂及其组合。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述免疫刺激剂选自IL-12、激动性共刺激单克隆抗体及其组合。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述免疫刺激剂是IL-12。
69.如权利要求66所述的方法，其中所述激动性共刺激单克隆抗体选自抗4-1BB抗体、抗OX40抗体、抗ICOS抗体及其组合。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述激动性共刺激单克隆抗体是抗4-1BB抗体。
71.如权利要求66所述的方法，其中所述检查点免疫阻断剂选自抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗LAG3抗体、抗B7-H3抗体、抗TIM3抗体及其组合。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述检查点免疫阻断剂是抗PD-L1抗体。
73.如权利要求53～72中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
74.如权利要求53～73中任一项所述的方法，其中所述免疫应答细胞经胸膜施用于受试者。
75.一种用于产生结合人间皮素的免疫应答细胞的方法，其包括将核酸序列引入到免疫应答细胞中，
所述核酸序列编码包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述细胞外抗原结合结构域以约1nM至约25nM的结合亲和力(Kd)特异性结合人间皮素。
76.一种核酸，其编码如权利要求1～36中任一项所述的CAR。
77.一种载体，其包含如权利要求76所述的核酸。
78.如权利要求77所述的载体，其中所述载体是γ-逆转录病毒载体。
79.一种药物组合物，其包含有效量的如权利要求37～52中任一项所述的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。
80.一种用于治疗瘤形成的药物组合物，其包含有效量的如权利要求37～52中任一项所述的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。
81.如权利要求80所述的药物组合物，其中所述瘤形成选自间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜癌、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastric cancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)、胆管癌及其组合。
82.一种用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、或移植排斥的试剂盒，其包含如权利要求37～52中任一项所述的免疫应答细胞。
83.一种用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、或移植排斥的试剂盒，其包含如权利要求76所述的核酸。
84.如权利要求82或83所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含使用免疫应答细胞治疗患有瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、或移植排斥的受试者的书面说明书。
85.如权利要求82～84中任一项所述的试剂盒，其中所述瘤形成选自间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜癌、成胶质细胞瘤、食管癌、胃癌(gastric cancer)、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃癌(stomach cancer)、胆管癌，及其组合。
86.一种预防或治疗受试者的炎性疾病的方法，其包括将如权利要求37～52中任一项所述的免疫应答细胞施用于受试者。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述免疫应答细胞是免疫抑制性细胞。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述免疫抑制性细胞是调节性T细胞。
89.如权利要求86～88中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是胰腺炎。
90.如权利要求86～89中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
91.如权利要求86～90中任一项所述的方法，其中所述受试者是器官移植的受者。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述受试者是胰腺移植的受者。
93.一种预防作为器官移植受者的受试者中的移植排斥的方法，其包括将如权利要求37～52中任一项所述的免疫应答细胞施用于所述受试者。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述免疫应答细胞是免疫抑制性细胞。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述免疫抑制性细胞是调节性T细胞。
96.如权利要求93～95中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
97.如权利要求93～96中任一项所述的方法，其中所述受试者是胰腺移植的受者。
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