JPWO2018110374A1 - 殺細胞効果を有するキメラ抗原受容体遺伝子改変リンパ球 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]EphrinB2細胞外ドメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナルドメインを含む、EPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
[2]EphrinB2細胞外ドメインが配列番号1のアミノ酸配列を含む、[1]に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
[3]前記細胞内シグナルドメインが共刺激分子の細胞内ドメインとCD3ζとを含む、[1]又は[2]に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
[4]前記共刺激分子がCD28である、[3]に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
[5]前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインの間にスペーサードメインを含む、[1]〜[4]のいずれか一項に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
[6][1]〜[5]のいずれか一項に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体をコードする遺伝子。
[7][6]に記載の遺伝子を標的細胞に導入するステップ、を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製方法。
[8]前記遺伝子の導入が、トランスポゾン法によって行われる、[7]に記載の調製方法。
[9]トランスポゾン法がpiggyBacトランスポゾン法である、[8]に記載の調製方法。
[10]標的細胞がT細胞である、[7]〜[9]のいずれか一項に記載の調製方法。
[11][1]〜[5]のいずれか一項に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体を発現した遺伝子改変リンパ球。
[12]リンパ球がT細胞である、[11]に記載の遺伝子改変リンパ球。
[13][11]又は[12]に記載の遺伝子改変リンパ球を治療上有効量含む、細胞製剤。
[14]横紋筋肉腫、肺がん、大腸がん、悪性中皮腫、食道がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫及び頭頸部がんからなる群より選択される腫瘍ないしがんの治療用である、[13]に記載の細胞製剤。
[15]横紋筋肉腫、肺がん、大腸がん、悪性中皮腫、食道がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫及び頭頸部がん及び頭頸部がんからなる群より選択される腫瘍ないしがんの患者に対して、[11]又は[12]に記載の遺伝子改変リンパ球を治療上有効量、投与するステップを含む、治療法。
[16]プロモーターと、該プロモーターの制御下にある、[6]に記載の遺伝子と、を含む発現カセット。
[17][16]に記載の発現カセットを保持するベクター。
[18]前記発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備える、[17]に記載のベクター。
[19][18]に記載のベクターと、トランスポザーゼ発現ベクターを含む、EPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製キット。
[20]トランスポザーゼがpiggyBacトランスポザーゼである、[19]に記載の調製キット。
本発明の第1の局面はEPHB4(Ephrin type-B receptor 4)受容体特異的なキメラ抗原受容体(慣例に従い、キメラ抗原受容体を「CAR」と呼称することがある)に関する。本発明のCARはEPHB4を標的としたものであり、EPHB4受容体に対して特異性の高い結合力(結合特異性)を有する。その特有の機能を発揮すべく、本発明のCARは特徴的な構造を備える。具体的には、EphrinB2細胞外ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナルドメインを備える。
一般的なCARは、標的を特異的に認識する一本鎖抗体(scFv)を利用し、抗原に対する特異性を得る。対照的に本発明のCARでは、標的であるEPHB4受容体の自然リガンドであるEphrinB2タンパク質の細胞外ドメインを抗原認識に利用する。EphrinB2タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号1に示す。典型的には、本発明のCARの細胞外ドメインは当該アミノ酸配列からなるポリペプチド鎖によって構成される。但し、その機能、即ち、EPHB4に対する特異性を示す限り、本発明のCARの細胞外ドメインが、EphrinB2タンパク質の細胞外ドメイン以外の部分を含んでいても、或いは、EphrinB2タンパク質の細胞外ドメインの一部から構成されていてもよい。また、EPHB4に対する特異性が損なわれない限り、上記アミノ酸配列の一部が改変されていてもよい。ここでの改変は、アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基の欠失、置換、付加等によって生じ得る。改変対象となるアミノ酸の数は例えば50個以下、好ましくは25個以下、更に好ましくは15個以下、更に更に好ましくは10個以下、最も好ましくは5個以下である。
膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインの間に介在する。膜貫通ドメインとしては、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通ドメインを用いることができる。人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通ドメインを用いることにしてもよい。
細胞内シグナルドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。即ち、細胞外ドメインが標的の抗原と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナルを伝達することが可能な細胞内シグナルドメインが用いられる。細胞内シグナルドメインには、TCR複合体を介したシグナルを伝達するためのドメイン(便宜上、「第1ドメイン」と呼ぶ)と、共刺激シグナルを伝達するためのドメイン(便宜上、「第2ドメイン」と呼ぶ)が含まれる。第1ドメインとして、CD3ζの他、FcεRIγ等の細胞内ドメインを用いることができる。好ましくは、CD3ζが用いられる。また、第2ドメインとしては共刺激分子の細胞内ドメインが用いられる。共刺激分子としてCD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD4、CD5、CD134、OX-40又はICOSを例示することができる。好ましくは、CD28又は4-1BBの細胞内ドメインを採用する。
CARの分泌を促すためにリーダー配列(シグナルペプチド)が用いられる。例えば、GM-CSFレセプターのリーダー配列を用いることができる。また、細胞外ドメインと膜貫通ドメインがスペーサードメインを介して連結した構造にするとよい。即ち、好ましい態様のCARは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサードメインを含む。スペーサードメインは、CARと標的抗原との結合を促進させるために用いられる。例えば、ヒトIgG(例えばヒトIgG1、ヒトIgG4)のFc断片をスペーサードメインとして用いることがきる。その他、CD28の細胞外ドメインの一部やCD8αの細胞外ドメインの一部等をスペーサードメインとして用いることもできる。尚、スペーサードメインを、膜貫通ドメインと細胞内シグナルドメインの間にも設けることにしてもよい。
本発明の第2の局面はCARをコードする遺伝子(以下、「CAR遺伝子」と呼称することがある)及びその利用(発現カセット、ベクター、CARを発現する遺伝子改変リンパ球の調製方法、CARを発現する遺伝子改変リンパ球及びその用途など)に関する。本発明のCAR遺伝子は上記構造のCARをコードする。従って、それを標的細胞に導入し、発現させることにより、本発明のCARを細胞表面に発現する遺伝子改変リンパ球(CAR遺伝子導入リンパ球)が得られる。CAR遺伝子導入リンパ球はCAR療法に利用することができる。CAR遺伝子の配列の具体例を配列番号3に示す。当該CAR遺伝子は、5'末端側から3'末端側に向かって、EphrinB2細胞外ドメイン(配列番号1)をコードする領域(配列番号5)、リンカー配列(配列番号6)、CD28(膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含む)をコードする領域(配列番号7)及びCD3ζ細胞内ドメインをコードする領域(配列番号8)が直列的に並ぶ構造を備える。
(i)T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、ウイルスペプチド抗原存在下での培養及び増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる、ウイルスペプチド抗原を保持した非増殖性細胞を用意するステップ
(ii)EPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体遺伝子を標的細胞に導入し、遺伝子改変T細胞を得るステップ
(iii)ステップ(i)で用意した非増殖性細胞とステップ(ii)で得た遺伝子改変T細胞を混合し、共培養するステップ
(iv)培養後の細胞を回収するステップ
本発明の更なる局面は、本発明の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球(以下、「本発明のCAR遺伝子導入リンパ球」と呼ぶ)及びその用途に関する。本発明のCAR遺伝子導入リンパ球はEPHB4 受容体を高発現する腫瘍/がん(以下、「標的疾患」と呼ぶ)の治療、予防又は改善に広く利用され得る。標的疾患の例を挙げると、横紋筋肉腫、肺がん、大腸がん、悪性中皮腫、食道がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫及び頭頸部がんである。「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること(軽症化)、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病(障害)又はその症状の発症/発現を防止又は遅延すること、或いは発症/発現の危険性を低下させることをいう。一方、「改善」とは、疾病(障害)又はその症状が緩和(軽症化)、好転、寛解、又は治癒(部分的な治癒を含む)することをいう。
本発明の更なる局面は本発明の調製方法に利用可能なベクター(CAR遺伝子導入リンパ球調製ベクター)及びキット(CAR遺伝子導入リンパ球調製キット)に関する。本発明のCAR遺伝子導入リンパ球調製ベクターは、CAR発現カセットを搭載したものであり、当該発現カセットの標的細胞への導入を可能にする。CAR発現カセットにはCAR遺伝子の他、CAR遺伝子の発現に必要なプロモーター(CMV-IE、SV40ori、レトロウイルスLTP、SRα、EF1α、βアクチンプロモーター等)が含まれる。本発明のベクターに、検出用遺伝子(レポーター遺伝子、細胞又は組織特異的な遺伝子、選択マーカー遺伝子など)、エンハンサー配列、WRPE配列等を含めることができる。
1.材料及び方法
(1)pIRII-EPHB4-CARベクターの作製
(I)既報のCD19.CAR発現piggyBacトランスポゾンベクター(pIRII-CAR.CD19)(Saito S, Nakazawa Y, Sueki A, Matsuda K, Tanaka M, Yanagisawa R, Maeda Y, Sato Y, Okabe S, Inukai T, Sugita K, Wilson MH, Rooney CM, Koike K. Anti-leukemic potency of piggyBac-mediated CD19-specific T cells against refractory Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Cytotherapy. 2014;16;1257-69)を制限酵素XhoIとBbvCI(New England Biolab, Ipswich, MA, USA)の両者で切断した。
(II)EFNB2遺伝子を高発現していることが知られている、ヒト神経芽腫細胞株SH-SY5YからmRNAを抽出し、cDNAを合成した。EFNB2は333個のアミノ酸配列(配列番号2)を持つ膜結合型蛋白であるが、その細胞外ドメイン(配列番号1)は、N末端から227番目のアミノ酸までであることが知られている。この部位を特異的に増幅可能なPCRプライマー(XhoI-EFNB2 forwardプライマー:ATCTCGAGATGGCTGTGAGAAGGG(配列番号9)とEFNB2 ECD-BbvCI reverseプライマー:ATCCTCAGC ATAAGGCCACTTCGGAAC(配列番号10))を作製し、先に得られたcDNAを鋳型としてPCR反応を行った。このPCRプライマー配列にはあらかじめForwardプライマーにXhoI制限酵素認識部位を、ReverseプライマーにBbvCI認識部位をそれぞれ挿入しておいた。
(III)(II)で得られた699bpのDNA断片を、ZeroBlunt PCR Cloning Kit(Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)を用いてpCR-Bluntプラスミドにクローニングした。このプラスミドを用いて大腸菌をトランスフォームし、大量増幅、抽出した。抽出したEFNB2細胞外ドメイン塩基配列が挿入されたpCR-Bluntプラスミドを、制限酵素XhoIとBbvCIの両者で切断した。
(IV)(I)で得られた4971bpのDNA断片と、(III)で得られた689bpのDNA断片をDNA Ligation kit(Takarabio, Otsu, Shiga, Japan)を用いてライゲーションした。
(V)コンピテントセルを用いて、(IV)で得られた5660bp環状DNAプラスミド(配列番号4)を大量増幅した。
(VI)Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)を用いて全塩基配列を確認した(配列表を参照)。
(I)末梢血約10 mlより比重遠心分離法を用いて単核球(PBMC)を分離した。
(II)4D-NucleofectorTM装置とP3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMXキット(Lonza, Basel, Switzerland)の組み合わせによるエレクトロポレーション法(Program EO-115)を用いて、pIRII-EPHB4-CARベクター(5μg)とpCMV-piggyBacベクター(5μg)を1x107個のPBMCに遺伝子導入した。
(III)(II)で得られた遺伝子導入細胞と、4種類のウイルス抗原ペプチド(MACS GMP PepTivator; AdV5 Hexon, CMV pp65, EBV EBNA-1, EBV BZLF1, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)でパルスした1x106個の照射済みPBMCを混合し、インターロイキン(IL)-7(10 ng/ml, Miltenyi)およびIL-15(5 ng/ml, Miltenyi)添加TexMACS培地(Miltenyi)2 mlで満たされた、抗CD28抗体(Miltenyi)で固相化した24ウェル培養プレートの1ウェルに静置した。遺伝子導入3日後、非固相化24ウェル培養プレートの1ウェルに遺伝子導入細胞を移入した。その際、IL-7/IL-15添加TexMACS培地を1 ml交換した。遺伝子導入7日後、遺伝子導入細胞をIL-7/IL-15(5 ng/ml)添加TexMACS培地30 mlで満たされたG-Rex10培養器(Wilson Wolf Manufacturing Inc, New Brighton, MN)に移入した。遺伝子導入14日目に細胞を回収した。一部の細胞を用いてCAR蛋白の発現をフローサイトメトリー法で確認した。このようにして作製されたCAR-T細胞をEPHB4-CAR-T細胞とする。尚、対照群として、既報のpIRII-CAR.CD19ベクターを遺伝子導入したCD19-CAR-T細胞も同様の方法で増幅培養した。
EPHB4高発現腫瘍として、代表的な小児がんの一つである横紋筋肉腫の腫瘍細胞株Rh30(EPHB4高発現、CD19低発現)を用いた。対照となるEPHB4低発現腫瘍として、ヒトB細胞性リンパ腫Raji細胞(EPHB4低発現、CD19高発現)を用いた。24ウェル培養プレートの1ウェルに2x105個のCAR-T細胞(CD19-CAR-T細胞又はEPHB4-CAR-T細胞)と1x105個の腫瘍細胞(Rh30細胞又はRaji細胞)を入れ(CAR-T細胞と腫瘍細胞の細胞比2:1)、1 mlの10%ウシ胎仔血清含DMEM培地下で3日間共培養した。尚、各組合せについて3ウェルを用意した。
CD19-CAR-T細胞又はEPHB4-CAR-T細胞とRh30細胞を細胞比2:1で共培養し、共培養0日目及び3日目に、培養上清中に放出されたIFNγをELISA法で定量した。
EFNB2細胞外ドメインを抗原認識部位として挿入したEPHB4-CAR発現ベクター(pIRII-EPHB4-CAR)の構成を図1に示す。また、EPHB4-CAR発現ベクターの塩基配列(配列番号4)を配列表に示した。配列番号4の配列は、EphrinB2細胞外ドメインをコードする領域(6bp〜687bp。配列番号5)、リンカー配列(配列番号6)CD28(膜貫通ドメインと細胞内ドメイン含む)をコードする領域(702bp〜1022bp。配列番号7)、CD3ζ細胞内ドメイン鎖をコードする領域(1023bp〜1361bp。配列番号8)を含む。
EPHB4-CAR-T細胞は、EPHB4を高発現する横紋筋肉腫細胞に対して選択的かつ強力に細胞死を誘導した。即ち、今回開発したEPHB4-CAR-T細胞によれば、EPHB4を高発現する腫瘍を特異的に殺傷できることが証明された。従って、EPHB4-CAR-T細胞を用いた治療(CAR-T療法)は横紋筋肉腫に対する新規治療法として有望である。また、EPHB4-CAR-T細胞には、肺がん、大腸がん、悪性中皮腫、食道がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫及び頭頸部がん等、EPHB4を高発現する各種腫瘍/がんの治療への適用も多いに期待される。
EPHB4-CAR-T細胞の殺細胞効果をマウスモデルで検証した。ホタルルシフェラーゼ(Firefly luciferase)で標識した横紋筋肉腫細胞株Rh30 2×106個を免疫不全マウス(SCID Beigeマウス)の皮下に接種し、担癌マウスを作成した。
配列番号4:人工配列の説明:pIRII-EFNB2-CARベクター
配列番号6:人工配列の説明:リンカー
配列番号9:人工配列の説明:XhoI-EFNB2 forwardプライマー
配列番号10:人工配列の説明:EFNB2 ECD-BbvCI reverseプライマー
Claims (20)
- EphrinB2細胞外ドメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナルドメインを含む、EPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
- EphrinB2細胞外ドメインが配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
- 前記細胞内シグナルドメインが共刺激分子の細胞内ドメインとCD3ζとを含む、請求項1又は2に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
- 前記共刺激分子がCD28である、請求項3に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
- 前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインの間にスペーサードメインを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体をコードする遺伝子。
- 請求項6に記載の遺伝子を標的細胞に導入するステップ、を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製方法。
- 前記遺伝子の導入が、トランスポゾン法によって行われる、請求項7に記載の調製方法。
- トランスポゾン法がpiggyBacトランスポゾン法である、請求項8に記載の調製方法。
- 標的細胞がT細胞である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の調製方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のEPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体を発現した遺伝子改変リンパ球。
- リンパ球がT細胞である、請求項11に記載の遺伝子改変リンパ球。
- 請求項11又は12に記載の遺伝子改変リンパ球を治療上有効量含む、細胞製剤。
- 横紋筋肉腫、肺がん、大腸がん、悪性中皮腫、食道がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫及び頭頸部がんからなる群より選択される腫瘍ないしがんの治療用である、請求項13に記載の細胞製剤。
- 横紋筋肉腫、肺がん、大腸がん、悪性中皮腫、食道がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫及び頭頸部がんからなる群より選択される腫瘍ないしがんの患者に対して、請求項11又は12に記載の遺伝子改変リンパ球を治療上有効量、投与するステップを含む、治療法。
- プロモーターと、該プロモーターの制御下にある、請求項6に記載の遺伝子と、を含む発現カセット。
- 請求項16に記載の発現カセットを保持するベクター。
- 前記発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備える、請求項17に記載のベクター。
- 請求項18に記載のベクターと、トランスポザーゼ発現ベクターを含む、EPHB4受容体特異的キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製キット。
- トランスポザーゼがpiggyBacトランスポザーゼである、請求項19に記載の調製キット。
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