JP4824389B2 - エプスタイン−バールウイルス感染細胞を特異的に攻撃する細胞傷害性t細胞エピトープペプチド及びその用途 - Google Patents
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Description
潜伏感染様式1:バーキットリンパ腫では、EBVの核抗原(EBNA)1だけが発現される。
潜伏感染様式2:ホジキン病や鼻咽頭癌では、潜在膜蛋白1(以後LMP1と標記する)、LMP2、およびEBNA1が発現される。
潜伏感染様式3:移植後リンパ増殖性疾患では、EBVの潜在蛋白即ちEBNA1、2、3A、3B、3C、leader protein、LMP1およびLMP2が全て発現される。
1)ベクターの主要な配列に対する免疫性の完全な欠失
2)in vitroでの転写による再現性の高い収率
3)エレクトロポレーションを利用した遺伝子導入の効率が高いこと
Babcock GJ., et al., Immunity, 13,497-506 (2000) Rickinson AB., et al., In: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology (ed Fourth Edition), Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2575-2628 (2001) Rooney, CM., et al., Lancet, 345, 9-13 (1995) Heslop, HE., et al., Nat Med., 2, 551-555 (1996) Rooney, CM., et al., Blood, 92, 1549-1555 (1998) Khanna, R., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 10391-10396 (1999) Comoli, P., et al., Blood, 99, 2592- 2598 (2002) Bollard, CM., et al., J Exp Med, 200, 1623-1633 (2004) Straathof, KC., et al., Blood 105, 1898-1904 (2005) Khanna, R., et al., Eur J Immunol, 28, 451-458 (1998) Lin, CL., et al., Cancer Res., 62, 6952-6958 (2002) Duraiswamy, J., et al., Blood, 101, 3150-3156 (2003) Duraiswamy, J., et al., Cancer Res., 64, 1483-1489 (2004) Gottschalk, S., et al., Blood, 101, 1905-1912 (2003) Kimura, H., et al., Blood, 98, 280-286 (2001) Nagata, H., et al., Blood, 97, 708-713 (2001) Zhang, Y., et al., Br J Haematol, 121, 805-814 (2003) Demachi, A., et al., Microbiol Immunol., 47, 543-52 (2003) Kieff E., et al., In: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology (ed Fourth Edition) , Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2511-2574 (2001) Khanna R., et al., J Exp Med., 176, 169-176 (1992) Murray RJ., et al., J Exp Med., 176, 157-168 (1992) Steven NM., et al., J Exp Med., 184, 1801-1813 (1996) Callan MF., et al., J Exp Med., 187, 1395-1402 (1998) Levitskaya J., et al., Nature, 375, 685-688 (1995) Blake N., et al., Immunity, 7, 791-802 (1997) Levitskaya J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 12616-12621 (1997) Yin Y., et al., Science, 301, 1371-1374 (2003) Khanna R., et al., Virology, 214, 633-637 (1995) Leen A., et al., J Virol., 75, 8649-8659 (2001) Paludan C., et al., J Immunol., 169, 1593-1603 (2002) Voo KS., et al., Cancer Res., 62, 7195-7199 (2002) Kruger S., et al., J Immunother, 26, 212-221 (2003) Lee SP., et al., J Exp Med., 199, 1409-1420 (2004) Tellam J., et al., J Exp Med., 199, 1421-1431 (2004) Voo KS., et al., J Exp Med., 199, 459-470 (2004) Kuzushima, K., et al., Blood, 94, 3094-3100 (1999) Kagami, Y., et al., Br J Haematol, 103, 669-677 (1998) Akatsuka, Y., et al., Tissue Antigens, 59, 502-511 (2002) Kondo, E., et al., J Immunol., 169, 2164-2171 (2002) Dauer, M., et al., J Immunol., 170, 4069-4076 (2003)
(1) エプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞エピトープペプチド。
(2) エプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞エピトープペプチドが配列番号:1〜3からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含むものである、(1)に記載のペプチド。
(3) 配列番号:1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、エプスタイン-バールウイルス特異的な細胞傷害性T細胞を誘導し得る機能を有することを特徴とする、(1)に記載のペプチド。
(4) HLA-A*0206分子、HLA-Cw*0303分子またはHLA-Cw*0304分子の拘束性抗原ペプチドであって、HLA-A*0206分子、HLA-Cw*0303分子またはHLA-Cw*0304分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうるT細胞レセプターを有する細胞傷害性T細胞を誘導し得る機能を有することを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載のペプチド。
(5) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
(6) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
(7) (5)に記載の核酸を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
(8) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドをHLAに提示した抗原提示細胞を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
(9) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドをHLAに提示した抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるエプスタイン-バールウイルス特異的な細胞傷害性T細胞を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤。
(10) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーに細胞傷害性T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞傷害性T細胞を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤。
(11) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドを用いて細胞傷害性T細胞を誘導することを特徴とする、細胞傷害性T細胞の誘導方法。
(12) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドと末梢血単核球を、血漿を含む培地中で接触させることにより、エプスタイン-バールウイルス特異的細胞傷害性T細胞を誘導する、(11)に記載の誘導方法。
(13) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドをHLAに提示した抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激してエプスタイン-バールウイルス特異的な細胞傷害性T細胞を取得する工程を含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤の製造方法。
(14) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーに細胞傷害性T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞傷害性T細胞を取得する工程を含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤の製造方法。
(15) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドで末梢血を刺激し、該ウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞を取得し、細胞傷害性T細胞が産生するサイトカイン及び/又はケモカイン及び/又は細胞表面分子を測定することを特徴とする、エプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞の定量方法。
(16) (1)〜(4)のいずれかに記載のペプチドから主要組織適合性抗原複合体-テトラマーを調製し、主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血とを反応させることを特徴とする、該末梢血中のエプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞の定量方法。
1.コンピュータを用いた解析
本発明のエプスタイン-バールウイルスに特異的なCTLエピトープペプチドは、エプスタイン-バールウイルス関連タンパク質のアミノ酸配列について、目的とするHLA分子の各結合モチーフを有する8〜11個のアミノ酸よりなるエピトープペプチドを検索し得る、インターネット上に公開されている複数のソフトウェア(Pingping G., et al., Nucleic Acids Res., 31, 3621-3624(2003))に照合してCTLエピトープの候補ペプチドを選択する事ができる。本発明において、エプスタイン-バールウイルス関連タンパク質としては、EBNA1、2、3A、3B、3C、LMP1、LMP2、またはleader protein等を挙げることができ、より好ましくは、EBNA1またはLMP1を挙げることが出来る。EBNA1のアミノ酸配列およびDNA配列を配列番号:36および37に、N末端が欠損したLMP1のアミノ酸配列およびDNA配列を配列番号:34および35に示す。
HLAクラスI分子は、主としてHLA-A、HLA-B、HLA-Cがあり、これらに結合して提示されるエピトープペプチドは、8〜11個のアミノ酸からなる。エピトープペプチドのN末端側から2番目と、9あるいは10番目のアミノ酸はHLA分子との結合に対して最も重要なアミノ酸であり、アンカーモチーフと呼ばれている。このアンカーモチーフは、各々のHLA分子の種類によって異なることが報告されている。例えば、HLA-A2分子に結合するペプチドとしては、N末端より2番目の位置にLeuが配置され、9あるいは10番目の位置にLeu又はValが配置されたペプチドであって、9〜10個のアミノ酸残基からなるペプチドが最も良く知られている(Sudo T., et al., J. Immunol., 155, 4749-4756 (1995))。また、日本人を含むアジアの人種に多いHLA-A24に結合するペプチドとしては、N末端より2番目の位置にTyr、Phe、Met又はTrpのいずれかが配置され、9あるいは10番目の位置にLeu、Ile、Trp又はPheのいずれかが配置されたペプチドであって、9〜10個のアミノ酸からなるペプチドが最もよく知られている(Kondo A., J. Immunol., 155, 4307-4312 (1995))。蛋白質のアミノ酸配列中からこのアンカーモチーフを有する配列を検索し、CTLエピトープの候補ペプチドを選択する事ができる。
エプスタイン-バールウイルス関連タンパク質の蛋白質全体を網羅する20個前後のアミノ酸よりなるペプチドライブラリーを合成する。20個前後のアミノ酸のうち、前後10個程度(例えば、7,8,9,10,11,12,13個)のアミノ酸は、前後のペプチド配列と重複するようにライブラリーを作製する。これによって、蛋白質全体を網羅的に検索する事ができる。
エプスタイン-バールウイルス感染歴がある人から分離した末梢血単核球(peripheral blood mononuclear cells;PBMC)、あるいはPBMCから分離したT細胞を適切な培地に0.1〜2×106/mLの細胞濃度で浮遊させる。これに同じ人からあらかじめ分離培養しておいたエプスタイン-バールウイルス感染細胞1×105/mLを加え、5%炭酸ガス(CO2)恒温槽にて37℃で7日間培養する。培養7日後にエプスタイン-バールウイルス感染細胞とインターロイキン2(IL-2)を添加し、以後、エプスタイン-バールウイルス感染細胞とIL-2による刺激を毎週繰返すことによりCTLを誘導する。このようにして誘導したCTLがエピトープ候補ペプチドに対して特異性があるかどうかの検討は、MHC−テトラマー法、エリスポットアッセイ、クロムリリースアッセイ、細胞内サイトカイン染色法等で判定する(Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, 6.19 ELISPOT Assay to Detect Cytokine-Secreting Murine and Human Cells, 6.24 Detection of Intracellular Cytokines by Flow Cytometry, published by John Wiley & Sons, Inc.)。
エプスタイン-バールウイルス感染歴がある人から分離したPBMCを適切な培地に0.1〜2×106/mLの細胞濃度で浮遊させ、これにエピトープ候補ペプチドの任意の1種を0.01〜100μg/mLの濃度で加える。5%CO2恒温槽にて37℃で培養し、2日後にIL-2を添加する。以後、前記ペプチドとIL-2による刺激を週に1度あるいは2週間に1度繰返すことによりCTLを誘導する。このようにして誘導したCTLがエピトープ候補ペプチドに対して特異性があるかどうかの検討は、MHC−テトラマー法、エリスポットアッセイ、クロムリリースアッセイ、細胞内サイトカイン染色法等で判定する。
エプスタイン-バールウイルス感染歴がある人から分離したPBMCを適切な培地に0.1〜2×106/mLの細胞濃度で浮遊させ、これに合成したペプチドライブラリーを適当な数(例えば10種類ずつ)にプールした物を加える。5%CO2恒温槽にて37℃で培養し、2日後にIL-2を添加する。以後、プールペプチドとIL-2による刺激を週に1度あるいは2週間に1度繰返すことにより、CTLを誘導する。このようにして誘導したCTLがエピトープ候補ペプチドに対して特異性があるかどうかの検討は、エリスポットアッセイ、クロムリリースアッセイ、細胞内サイトカイン染色法等で判定する。良好な結果を示したプールペプチドに対しては、1種類ずつペプチドを加えて上記実験を繰返せば、CTL誘導能を有するペプチドを選択する事が可能である。反応したペプチドについて順次短くし、基幹のペプチドを得て本発明のエピトープペプチドとする。一般的に、エピトープペプチドは最終的に8〜11個のアミノ酸までに短くすることができる。
1.HLAとの親和性を高める為の変更(Rosenberg SA., et al., Nat Med., 4, 321-327 (1998)、Berzofsky JA., et al., Nat Rev Immunol., 1, 209-219 (2001))、
2.TCRの認識性を向上させるための変更(Fong L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 98, 8809-8814 (2001), Rivoltini L., et al., Cancer Res., 59, 301-306 (1999))、
3.血清中のペプチド分解酵素等による代謝を回避する為の変更(Berzofsky JA., et al., Nat Rev Immunol., 1, 209-219 (2001), Parmiani G., et al., J Natl Cancer Inst., 94, 805-818 (2002), Brinckerhoff LH., et al., Int J Cancer., 83, 326-334 (1999))等が挙げられる。
1. 適当な培養液中で、抗原提示細胞とCTLエピトープペプチドを30分から1時間混合したエピトープペプチドパルス抗原提示細胞、
2. CTLエピトープペプチドをコードする核酸を用い、遺伝子導入等で抗原提示細胞にCTLエピトープペプチドを提示された細胞、
3. 人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞、等を意味する。
従って本発明の好ましい態様としては、本発明のペプチドをHLAに提示した抗原提示細胞を有効成分とするワクチンを提供する。
以下にCTLの調製方法の具体例を記載するが、必ずしもこれらの方法に制限されない。
PBMCと、適当な濃度のエプスタイン-バールウイルス特異的エピトープペプチド−テトラマー試薬を反応させる。エピトープペプチド−テトラマー試薬と結合したエプスタイン-バールウイルス特異的CTLは標識色素により染色されるので、セルソーター、顕微鏡などを用いて染色されたCTLのみを単離する。このようにして単離されたエプスタイン-バールウイルスに特異的なCTLは、抗CD3抗体、PHA、IL-2等のT細胞刺激薬剤や、X照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
エプスタイン-バールウイルス特異的エピトープペプチド−モノマー及び/又はエピトープペプチド−テトラマー試薬を無菌プレートなどに固相化し、PBMCを固相化プレートで培養する。プレートに固相化されたエピトープペプチド−モノマー及び/又はエピトープペプチド−テトラマーに結合したエプスタイン-バールウイルス特異的CTLを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残った抗原特異的CTLだけを新しい培地に懸濁する。このようにして単離されたエプスタイン-バールウイルス特異的CTLは、抗CD3抗体、PHA、IL-2等のT細胞刺激薬剤や、X照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
エプスタイン-バールウイルス特異的エピトープペプチド−モノマー及び/又はエピトープペプチド−テトラマー試薬と、CD80、CD83、CD86等の共刺激分子か、もしくは、共刺激分子と結合するT細胞側のリガンドであるCD28に対してアゴニスティックに作用する抗体等を無菌プレートなどに固相化し、PBMCを固相化プレートで培養する。2日後にIL-2を培地に添加し5%CO2恒温槽にて37℃で7〜10日培養する。培養した細胞を回収し新たな固相化プレート上で培養を続ける。この操作を繰り返す事で受動免疫療法に必要な細胞数のCTLを確保する。
PBMCあるいはT細胞を本発明のCTLエピトープペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、又は人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激する。刺激によって誘導されたCTLを5%CO2恒温槽にて37℃で7〜10日培養する。CTLエピトープペプチドとIL-2、又は抗原提示細胞とIL-2による刺激を週に1度繰り返す事で受動免疫療法に必要な細胞数のCTLを確保する。
エプスタイン-バールウイルス特異的エピトープペプチド−テトラマー試薬と、CTL調製方法にて誘導されたCTLを反応させ、エピトープペプチド−テトラマーを標識している標識色素に対する抗体等を磁気標識した2次抗体を用いて分離する事が可能である。このような磁気標識した2次抗体と、磁気細胞分離装置は例えば、Dynal社やMiltenyi Biotec GmbH社から入手可能である。このようにして単離されたエプスタイン-バールウイルス特異的CTLは、抗CD3抗体、PHA、IL-2等のT細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
エプスタイン-バールウイルス特異的CTLが、放出するサイトカイン等を利用して、エプスタイン-バールウイルスに特異的なCTLを精製する事ができる。例えば、Miltenyi Biotec GmbH社から入手可能なキットを用いる事で、CTLから放出されるサイトカインを細胞表面で特異抗体により補足し、サイトカイン特異的な標識抗体で染色し、続いて磁気標識した標識物質特異的な抗体で染色後、磁気標識細胞分離装置を用いて精製する事も可能である。このようにして単離されたエプスタイン-バールウイルス特異的CTLは、抗CD3抗体、PHA、IL-2等のT細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
特異的CTLの細胞表面では、特異的なペプチドの刺激により発現が増強する細胞表面蛋白質(例えばCD107a、CD107b、CD63、CD69など)が報告されている(Betts MR., et al., J Immunol Methods., 281, 65-78 (2003), Trimble LA., et al., J Virol., 74, 7320-7330 (2000))。このような蛋白質の特異抗体を磁気標識する事で、磁気分離装置等を用いてCTLを精製する事が可能である。また、このような特異抗体に対する抗IgG抗体等を磁気標識する事でも同様にCTLの精製が可能である。あるいは、これら抗体を培養用のプラスティックプレートにコートし、このプレートを用いて刺激を加えたPBMCを培養し、プレートに結合しなかった細胞集団を洗い流す事で特異的なCTLを精製することも可能である。このようにして単離されたエプスタイン-バールウイルス特異的CTLは、抗CD3抗体、PHA、IL-2等のT細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
なお、本発明の「受動免疫療法剤」は、「免疫治療剤」、「エプスタイン-バールウイルス関連疾患治療剤」、又は「CTL誘導剤」と表現することも可能である。
本発明の受動免疫療法剤の好ましい態様としては、本発明のペプチド、もしくは該ペプチドをHLAに提示した抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるエプスタイン-バールウイルス特異的な細胞傷害性T細胞を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤である。
本発明はさらに、本発明のペプチドを利用したエプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞の定量(検出・測定)方法を提供する。
本発明のCTLエピトープペプチドを使用して作製したMHC−テトラマー試薬を用いて、末梢血中のエプスタイン-バールウイルスに特異的なCTLを定量することができる。定量は、例えば、以下のようにして実施することができる。末梢血あるいはPBMCを、適当な濃度のエピトープペプチド−テトラマー試薬と反応させる。該エピトープペプチド−テトラマー試薬と結合したCTLは標識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。エピトープペプチド−テトラマー試薬と反応させる時に、エピトープペプチド−テトラマー試薬と異なる色素で標識された抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体等を反応させる事で、エプスタイン-バールウイルスに特異的なCTLのT細胞サブセットも同時に判定できる。
PBMCを本発明のCTLエピトープペプチドで刺激することによってCTLが産生するIFNIY(interferon gamma)、TNF(tumor necrosis factor)、インターロイキン等のサイトカイン及び/又はケモカインを定量する方法である。以下にIFNYを例にとり具体的に方法を示す。
PBMCを適当な培地におよそ2×106/mLの細胞濃度で浮遊させ、本発明のCTLエピトープペプチドを加える。さらに細胞内蛋白輸送阻止剤(例えば、Brefeldin AやMonensin等)を加え、5%CO2恒温槽にて37℃で5〜16時間培養する。培養後、T細胞マーカー抗体(抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体)あるいは/または、エピトープペプチド−テトラマー試薬と反応させ、細胞を固定後、膜透過処理を行い、色素標識抗IFNY抗体を反応させる。フローサイトメーター等を用いて解析し、全細胞中、T細胞中あるいはエピトープペプチド−テトラマー陽性細胞中のIFNY陽性細胞率を定量する。
抗IFNY抗体を固相化した96穴MultiScreen-HAプレート(Millipore社)にPBMCをまく。エピトープペプチドを各穴に入れ37℃の5%CO2恒温槽培養器にて20時間培養する。翌日、プレートを洗浄し、抗IFNY抗体、ペルオキシダーゼ標識抗IgG抗体の順で反応させる。さらにペルオキシダーゼの基質を加え、発色によりIFNYスポットを可視化し、実体顕微鏡でカウントする。
PBMCを適当な培地におよそ2×106/mLの細胞濃度で浮遊させ、本発明のCTLエピトープペプチドを加える。5%CO2恒温槽にて37℃で24〜48時間培養する。培養後、上清を回収し、その中に含まれるIFNY濃度を市販のELISAキット(例えばMBL社のHUMAN IFN gamma ELISA)を使用して定量する。
細胞表面蛋白質特異的抗体を用いて定量を行う。特異的CTLは、特異的なペプチドの刺激により細胞表面に発現が増強する細胞表面蛋白質(例えばCD107a、CD107b、CD63、CD69など)が報告されている。このような蛋白質を特異的に認識する標識抗体と、ペプチド刺激したPBMC等を混合する事で、標識抗体と結合したCTLは標識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。標識抗体と反応させる時に、同時にあるいは、順番に、標識抗体と異なる色素で標識された抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体等を反応させる事で、エプスタイン-バールウイルスに特異的なCTLのT細胞サブセットも同時に判定できる。
従って本発明の定量方法の好ましい態様は、本発明のペプチドで末梢血を刺激し、該ウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞を取得し、細胞傷害性T細胞が産生するサイトカイン及び/又はケモカイン及び/又は細胞表面分子を測定することを特徴とする、エプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞の定量方法に関する。
上記方法においては、被検者から予め取得・単離された末梢血試料を用いることができる。
本発明者らは、まずEBV関連タンパク質のうち、LMP1に特異的なCTLクローンの誘導を行い、LMP1由来のエピトープの同定を行った。
LMP1由来のエピトープの同定に関連する実験(実施例1〜8)に用いられた、細胞株および樹状細胞の調製方法について以下に示す。
欠失変異体△LMP1を発現している抗原提示細胞を作製するために、本発明者らは、pcDNA/ΔLMP1プラスミドからインビトロ転写システムを用いて、欠失変異体ΔLMP1 mRNAを産生した。
T7プロモータ領域とΔLMP1をコードする領域を含む断片を、pcDNA/ΔLMP1をテンプレートとしてPCRで作製した。増幅されたDNAは、5’-capped mRNAのインビトロ転写の際のテンプレートとして利用された。5’-capped mRNAのインビトロ転写を、mMESSAGE mMACHINEキット(Ambion,米国 Austin, TX)を用いて行った。
これらの細胞を、抗原提示細胞として、血清反応陽性献血者5人からLMP1特異的なT細胞の誘導を試みた。
次に、ΔLMP1特異的CTLクローンの誘導を以下の工程により行った。
ELISPOTアッセイは、公知の方法によって実施した(Kuzushima, K., et al., Blood, 94, 3094-3100 (1999), Kondo, E., et al., J Immunol., 169, 2164-2171 (2002), Kuzushima, K., et al., Blood, 98, 1872-1881(2001))。CD8+T細胞を、抗ヒトインターフェロンγ(IFNγ)モノクローン抗体(Pierce Biotechnology、フィラデルフィア(PA))でコーティングされたMultiscreen-HAプレート(MAHA S4510; Millipore、米国ビルリカ(MA州))のウェルの中で、様々な刺激因子と共に培養した。
HLA-A2スーパータイプに存在するペプチドYLLEMLWRL(配列番号:25)を除き、HLA-A*0206拘束性のLMP1由来エピトープはこれまでに報告されていない。H7はペプチドYLLEMLWRL(配列番号:25)でIFN-γスポットを作らなかった(データは示さない)ことから、H7が認識するエピトープの同定を行った。
C末端側を削ったいくつかのΔLMP1-mRNAをエレクトロポレーションで自己のCD40-B細胞に導入し、H7に認識されるかどうかをELISPOTアッセイで検討した。
図2Aに示されるように、抗原性はアミノ酸残基70と77の間のC-末端トランケーションで失われたことから、エピトープのC-末端はアミノ酸残基71と77の間に位置することが明らかとなった。
LMP1導入細胞の抗原処理に関して、ELISPOTアッセイで2つの不一致が観察された。
(1)H7は全長ΔLMP1-mRNAを導入したCD40-Bを認識した(図2A)が、同じ配列を発現しているプラスミドを導入したA0206-293T細胞を認識しなかった。
(2)H7はアミノ酸残基44−77をコードするトランケートされたΔLMP1-mRNAを導入したCD40-Bを認識した(図2A)が、同じ配列を発現しているプラスミドを導入したA0206-293T細胞を認識しなかった。
shRNA構造物は、その後に5T終止シグナルが続く、センスとアンチセンス配列を分かつTTCAAGAGA-ループを含んでいる。これらの構造物は、2つの相補的DNAオリゴヌクレオチドとして合成され、アニールされ、ベクターのBamHIとEcoRI制限酵素認識部位の間に挿入された。更に、ネガティブコントロールsiRNA(BD Biosciences Clontech)が同じベクターに挿入され、コントロールとして使われた。クローン化された遺伝子は配列を解析してその同一性を確認した。
ip-LMP2とip-LMP7の発現を、公知の方法(Schwarz, K., et al., J Immunol., 165, 768-778(2000), Tajima, K., et al., Int J Cancer, 110, 403-412 (2004))、すなわちウェスターンブロッティング法により評価を行った。
上記の結果より、LMP1エピトープの処理と提示には、ip-LMP7が不可欠であることが明らかとなった。
次に、H7のLCLに対する傷害活性を調べた。CTLアッセイは以下の工程により行った。標的細胞を37℃で1.5時間50μCiクロム(51Cr)でラベルし洗浄して、指示されたエフェクターと目的の割合になるように96穴プレート中でCTLと混合した。37℃で4時間または16時間培養した後に、上清の放射活性をγ計測器で数えた。特異的51Cr放出の割合は次のように計算した。:100x(実験的な放出-自然発生的な放出)/(最大放出-最小放出)
そこで、図4Bに示すように、標的細胞としてΔLMP1を強制発現させたLCLで実験を行ったところ、H7は4時間CTLアッセイでΔLMP1を発現させたLCLを特異的に溶解したが、EGFPを発現させたLCLは溶解しなかった。
EBV LMP1は他の蛋白と共に潜伏感染様式IIIとしてLCL細胞に発現され、潜伏感染様式IIとしてNK/T細胞に発現される(Zhang, Y., et al., Br J Haematol, 121, 805-814 (2003))。そこで、EBV潜伏感染様式II型の悪性腫瘍の代表として、EBV陽性NK細胞株(Nagata, H., et al., Blood 2001; 97: 708-713, Zhang, Y., et al., Br J Haematol, 121, 805-814 (2003), Kagami, Y., et al., Br J Haematol, 103, 669-677 (1998))に対するH7細胞の傷害活性を検討した。検討したLMP1を発現している3つのNK細胞株の内、2つはHLA-A*0206陽性であった。図5Aに示したように、H7細胞は一つのHLA-A*0206陽性株(SNK-10)を溶解したが、他の細胞(SNK-6)、あるいはHLA-A*0206陰性株(HANK-1)は溶解しなかった。HLA-A*0206を導入したHANK-1細胞はH7細胞によって特異的に溶解された(図5B)。エピトープペプチドでパルスされたSNK-6細胞はH7によって特異的に溶解された(図5A)ため、SNK-6細胞はLMP1エピトープによって突然変異を生じた可能性が考えられる。さらに、本発明者らはLMP1エピトープに結合するゲノムDNAをシークエンスした。その結果、3つのEBV陽性NK細胞株のすべてがアミノ酸残基55-80に影響を与えない同一の突然変異を保有していることが明らかとなった(データは示さない)。
本発明者らは、次にEBV関連タンパク質のうち、EBNA1に特異的なCTLクローンの誘導を行い、EBNA1由来のエピトープの同定を行った。
EBNA1由来のエピトープの同定に関連する実験(実施例9〜16)において用いられた、細胞株および樹状細胞の調製方法について以下に示す。
CD40で活性化されたB細胞(CD40-B)は公知の方法に基づいて、献血者のPBMCから産生された(Schultze JL, et al., J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997), Kondo E, et al., J Immunol., 169, 2164-2171 (2002))。簡単に述べると、PBMCを、放射線照射されCD40Lで形質転換したNIH3T3細胞 (以下t-CD40Lと記載する。BostonにあるDana-Farber Cancer InstituteのDr. Gordon Freemanから提供されたものである)と、リコンビナントIL-4(Genzyme, Cambridge, MA)、およびシクロスポリンA (Sandoz, Basel, Switzerland)と共に培養液中で培養した。増殖したCD40-Bに、週に2回刺激を加えた。
EBVを保持したLCLは、公知の方法(Kuzushima K, et al., Blood, 94, 3094-3100 (1999))に基づき、B95-8細胞培養上清を用いて、PBMCを分化させることによって調製した。そして、10%ウシ胎仔血清、2mM L-グルタミン、50U/mLのペニシリン、50μg/mLストレプトマイシンと50μg/mLのカナマイシンを含むRPMI1640培地(シグマケミカル社、セントルイス、MO)中で培養した。
EBNA1を発現している抗原提示細胞を作製するために、本発明者らは、pcDNA/EBNA1プラスミドからインビトロ転写システムを用いて、ポリA鎖を持つ全長EBNA1 mRNAを産生した。
インビトロで転写されたEBNA1 mRNAを作製するために、まずpcDNA/EBNA1ベクターを構築した。RNeasy Kit(Qiagen、Hilden (ドイツ))を用いて、上記のB95.8で形質転換したLCLから全てのRNAの抽出し、EBNA1をコードする配列を得た。EBNA1のアミノ酸配列およびDNA配列を配列番号:36および37に示す。そして、逆転写の後に、以下の特異的プライマーを用いたPCR法によってEBNA1 cDNAを増幅した。
フォワードプライマー
5'-AAGCTTGCCACCATGTCTGACGAGGGGCCAGGTACAG (配列番号:28)
リバースプライマー
5'-GAATTCTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTC (配列番号:29)
次に、樹状細胞とCD40-B細胞に、エレクトロポレーションによって全長EBNA1mRNAを導入した。まず、無血清のRPMI1640を用いて二度洗浄し、最終濃度が2.5×107細胞/mLとなるように懸濁した。40μLのRPMI1640培地中で20μgのmRNAと混合した後に、2mmのセルの中に入れElectro Square Porator ECM830(ハーバードApparatus、ホリストン(MA))を用いてエレクトロポレーションを行った。条件設定は樹状細胞に対しては450V、500μS、CD40-B細胞に対しては350V、350μSに設定した。
健康なドナーの単核球由来の樹状細胞に、全長EBNA1 mRNAをエレクトロポレーションによって導入し、炎症性サイトカインの混合物の添加することにより、樹状細胞の成熟化を誘導した。
EBNA1特異的CTLクローンの誘導は以下の工程により行った。
保存されていたCD8+T細胞を解凍し、10%ヒト血清、2mM L-グルタミン、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、および50μg/mLカナマイシン(CTL培地という)を含み、さらに5ng/mL IL-7(R&D Systems, Minneapolis, MN) と5ng/mL IL-12 (R&D systems) 5ng/mLを加えた200μL のRPMI1640倍地中で、5%CO2濃度の下、湿潤インキュベーターで培養した。8、16、および23日目に、EBNA1-mRNAを導入し、γ線を照射した樹状細胞によって、T細胞を刺激した。各再刺激の1日後に、最終的に20U/mLの濃度になるように、IL-2(塩野義、大阪、日本)を加えた。T細胞クローンを確立するため、ポリクローナルなCTLの限界希釈法を実施した(Kuzushima K, et al., Blood. 2001;98:1872-1881)。
ELISPOTアッセイは、公知の方法で行った(Kuzushima K, et al., Blood, 101, 1460-1468 (2003))。CD8+T細胞を、抗ヒトインターフェロンγ(IFNγ)モノクローナル抗体(ピアスBiotechnology、フィラデルフィア(PA))でコーティングされたMultiscreen-HAプレート(Millipore、ビルリカ(MA))のウェル中で各種刺激因子と共に培養した。刺激因子として、(A)自己のEBNA1 mRNAを導入したCD40-B細胞若しくは導入しなかったCD40のB細胞と、(B)自己若しくは同種のLCL(1×105の細胞/ウィル)を各ウェルに蒔いた。(以下に説明するペプチドタイトレーションとオバーラッピングアッセイにおいては、濃度をふった合成ペプチドを室温で1時間、自己のCD40-B細胞に加えた。)
これらのクローンは、EBNA1-mRNAを導入した自己のCD40-B細胞とLCLを認識するが、EBNA1-mRNAを導入しなかった自己CD40B細胞やHLAが不一致の同種LCLは認識しなかった(図7)。
献血者はHLA-A*2402、A*3101、B*1507、B*3501、およびCw*0303として遺伝学的に分類された。抗原を提示しているHLA分子を同定するため、HLAが部分的に一致しているLCLのパネルを、クローンB5若しくはC6を刺激してIFNγを生産するために用いた。自己のLCLに加えて、HLA-B*3501を発現している同種LCLが、CTLクローンC6によって認識された(図8A)。そして、HLA-Cw*0304または、HLA-Cw*0303を持つLCLが、クローンB5(図8B)によって認識された。このことは、HLA-B*3501がクローンC6認識のための推定上の制限因子であり、一方、HLA-Cw*0303とHLA-Cw*0304はクローンB5の制限因子として働いていることを示している。
エピトープ領域を特定するために、クローンB5およびC6を、20個のアミノ酸を持つペプチドのセットと共に自己のCD40-B細胞において刺激した。本発明に使用されたペプチドは、Bio-Synthesis, Inc. Lewisville, TX.から購入した。GArの一次構造はMHCクラスIエピトープを含みそうにないことから、本発明者らはエピトープソースとしてこの部分を除いた。アミノ酸セット(合計56のペプチド)は13残基のオーバーラップによって、GArドメイン除く完全なEBNA1タンパク質配列をカバーしている。
HLA-Cw*0303とCw*0304のcDNAクローンは、プライマーであるC03F(5'-AACCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTACACCGCTGTGTCCCGGCC-3'、配列番号:32)及びC03R(5'-AAGGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGG-3'、配列番号:33)プライマーを用いて、HLA-Cw*0303とCw*0304の重鎖の細胞外ドメインをコードする配列をPCRで増やすためのテンプレート(鋳型)として使用された。
クローンのB5とC6は、クロムリリースアッセイにおいては、自己のLCLを溶解しなかった(データは示さない)。ここで、これらのEBNA1特異的CTLが、EBNA1を発現しているLCLの長期的成長と生存に影響を及ぼすか否かを検討した。
最終的にLCLがどれだけ増えたかを、顕微鏡観察によって評価し、フローサイトメトリーによるCD19の発現で確認した。
Claims (13)
- 配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなる、エプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞エピトープペプチド。
- HLA-A*0206分子、HLA-Cw*0303分子またはHLA-Cw*0304分子の拘束性抗原ペプチドであって、HLA-A*0206分子、HLA-Cw*0303分子またはHLA-Cw*0304分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうるT細胞レセプターを有する細胞傷害性T細胞を誘導し得る機能を有することを特徴とする、請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1又は2に記載のペプチドをコードする核酸。
- 請求項1又は2に記載のペプチドを有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
- 請求項3に記載の核酸を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
- 請求項1又は2に記載のペプチドをHLAに提示した抗原提示細胞を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
- 請求項1又は2に記載のペプチドもしくは該ペプチドをHLAに提示した抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるエプスタイン-バールウイルス特異的な細胞傷害性T細胞を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤。
- 請求項1又は2に記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーに細胞傷害性T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞傷害性T細胞を有効成分として含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤。
- 請求項1又は2に記載のペプチドと末梢血単核球を、血漿を含む培地中で接触させることにより、エプスタイン-バールウイルス特異的細胞傷害性T細胞を誘導することを特徴とする、細胞傷害性T細胞の誘導方法。
- 請求項1又は2に記載のペプチドもしくは該ペプチドをHLAに提示した抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激してエプスタイン-バールウイルス特異的な細胞傷害性T細胞を取得する工程を含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤の製造方法。
- 請求項1又は2に記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーに細胞傷害性T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞傷害性T細胞を取得する工程を含む、エプスタイン-バールウイルスに対する受動免疫療法剤の製造方法。
- 請求項1又は2に記載のペプチドで末梢血を刺激し、該ウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞を取得し、細胞傷害性T細胞が産生するサイトカイン及び/又はケモカイン及び/又は細胞表面分子を測定することを特徴とする、エプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞の定量方法。
- 請求項1又は2に記載のペプチドから主要組織適合性抗原複合体-テトラマーを調製し、主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血とを反応させることを特徴とする、該末梢血中のエプスタイン-バールウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞の定量方法。
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