KR20240005714A - Sars-cov-2 항원을 표적화하는 펩티드 및 조작된 t 세포 수용체 및 사용 방법 - Google Patents

Sars-cov-2 항원을 표적화하는 펩티드 및 조작된 t 세포 수용체 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 백신접종 및 다른 적용에 유용한 펩티드, 조작된 T 세포 수용체 (TCR), 펩티드 및 TCR을 포함하는 세포, 및 펩티드 및 TCR을 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 막 글리콜-단백질 (MGP), MGP-65: FVLAAVYRI (서열식별번호:22)로부터의 SARS-Cov-2 HLA-A2 제한된 펩티드를 특이적으로 인식하는 TCR에 관한 것이다.

Description

SARS-COV-2 항원을 표적화하는 펩티드 및 조작된 T 세포 수용체 및 사용 방법
I. 관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 3월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/167,433; 2021년 6월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/210,198; 및 2022년 2월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/314,870에 대해 우선권을 주장하며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
II. 발명의 분야
본 발명은 바이러스 감염의 면역요법 및 치료의 분야에 관한 것이다.
III. 배경
2019년 12월에 SARS-CoV-2의 출현 이래로, 세계 보건 기구는 200개가 넘는 국가로의 확산과 전세계적으로 1억7천만 명을 능가하는 감염 및 3백5십만 명을 능가하는 사망을 보고하였다. 이 부담에도 불구하고, 효과적인 백신, 요법, 및 보호적 바이오마커를 확인하기 위한 탐색은 계속되고 있다.
SARS-CoV-2는 인간에서 높은 이환율 및 사망률과 연관된 중증 비정형 폐렴으로서 나타난다. T-세포 림프구감소증과 연관된 조절이상된/과도한 선천 반응은 이 증후군에서 폐 병리현상에 대한 선두적인 기여자이다. 감소된 T 세포의 수는 인간에서 SARS 질환의 급성 상의 중증도 및 바이러스의 지연된 청소와 상관된다. 다른 호흡기 바이러스 감염, 예컨대 인플루엔자 A 및 파라-인플루엔자로부터의 몇 가지 증거는 1차 및 기억 반응 동안 생성된 바이러스-특이적 CD4 및 CD8 T 세포가 바이러스를 청소하고 숙주를 중증 감염으로부터 보호할 수 있음을 확립하였다. 사실, SARS 및 MERS-감염된 환자 및 동물로부터의 연구는 또한 호흡기 코로나 바이러스 감염의 보호 및 청소에서 T 세포-매개 적응성 면역 반응에 대한 중요한 역할을 지적한다. SARS-회복된 환자에서, 중화 항체 역가 및 기억 B 세포 반응은 오래가지 못하고 단지 수 개월 지속되는 반면, SARS-CoV-특이적 기억 T 세포는 감염 후 최대 6년 동안 존속한다.
SARS-CoV 청소 및 숙주 보호에서 바이러스-특이적 CD4 및 CD8 T 세포의 역할에 대한 직접적 증거는 입양 전달 연구로부터 비롯된다. SARS에 대해 감수성인 마우스에서의 입양 주입된 SARS-Cov-특이적 이펙터 CD4 및 CD8 T 세포는 급속한 바이러스 청소 및 동물의 임상적 질환 및 생존의 개선을 발생시켰다. 효과적인 코로나바이러스 치료 및 예방에 대한 필요가 관련 기술분야에 있다.
본 개시내용은 백신접종 및 다른 적용에 유용한 펩티드, 조작된 T 세포 수용체 (TCR), 펩티드 및 TCR을 포함하는 세포, 및 펩티드 및 TCR을 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 코로나바이러스 펩티드, 예컨대 서열식별번호(SEQ ID NO):22 내지 81로 나타내어지는 것들을 특이적으로 인식하는 TCR에 관한 것이다.
따라서, 본 개시내용의 측면은 본 개시내용의 CDR3의 아미노산 서열 또는 본 개시내용의 CDR3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가의 측면은 T-세포 수용체 (TCR)-b 폴리펩티드 및 TCR-a 폴리펩티드를 포함하는 조작된 TCR이며, 여기서 TCR-b 폴리펩티드는 본 개시내용의 CDR3의 아미노산 서열 또는 본 개시내용의 CDR3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, TCR-a 폴리펩티드는 본 개시내용의 CDR3의 아미노산 서열 또는 본 개시내용의 CDR3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR에 관한 것이다. 추가의 측면은 본 개시내용의 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 또는 본 개시내용의 CDR3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드 및/또는 본 개시내용의 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 또는 본 개시내용의 CDR3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 TCR-a 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. CDR3은 서열식별번호:7, 14, 21, 92, 99, 106, 113, 120, 127, 134, 및 141의 CDR3일 수 있다. TCR-a CDR3 측면은 서열식별번호:7, 14, 92, 106, 120, 및 134의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. TCR-b CDR3 측면은 서열식별번호:21, 99, 113, 127, 및 141의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
또한 추가의 측면은 펩티드, 폴리펩티드, 융합 단백질, 및 조작된 TCR을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 1종 이상의 핵산을 포함하는 핵산 벡터, 및 본 개시내용의 펩티드, 융합 단백질, 폴리펩티드, 조작된 TCR, 및/또는 핵산을 포함하는 세포를 기재한다. 또한, 본 개시내용의 펩티드, 폴리펩티드, 세포, 핵산, 또는 조작된 TCR을 포함하는 조성물이 제공된다. 추가의 측면은 본 개시내용의 핵산 또는 벡터를 세포 내로 전달하는 것을 포함하는, 조작된 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 추가의 측면은 폴리펩티드, 조성물, 세포, 핵산, 또는 조작된 TCR을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 코로나바이러스 감염을 치료하거나 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 방법은 만성 코비드를 치료하기 위한 것이며, 방법은 폴리펩티드, 조성물, 세포, 핵산, 또는 조작된 TCR을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또한, 본 개시내용의 조성물 또는 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 방법은 또한 종양 부담을 감소시키는 방법; 암 세포를 용해시키는 방법; 종양/암성 세포를 살해하는 방법; 전체 생존을 증가시키는 방법; 암을 얻거나 또는 종양을 얻을 위험을 감소시키는 방법; 무재발 생존을 증가시키는 방법; 암을 예방하는 방법; 및/또는 암의 확산 또는 전이를 감소시키거나, 제거하거나, 또는 감소시키는 방법을 포함하며, 방법은 폴리펩티드, 조성물, 세포, 핵산, 또는 조작된 TCR을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
추가의 측면은 본 개시내용의 TCR, 또는 그의 항원-결합 단편, 및 CD3 결합 영역을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. CD3 결합 영역은 CD3-특이적 단편 항원 결합 (Fab), 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 단일 도메인 항체, 또는 단일 쇄 항체를 포함할 수 있다. 예시적인 CD3-특이적 단편 항원 결합 (Fab)은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 US20180222981은 본 개시내용의 측면에 사용될 수 있는 CD3에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 개시한다. 항-CD3 항체 및 가변 영역은 또한 참조로 포함되는 US20180117152에 개시되어 있다.
본 개시내용의 측면은 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 펩티드에 관한 것이다. 또한, 서열식별번호:22 내지 38 중 하나의 펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 펩티드가 제공된다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나를 갖거나 또는 그와 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 가질 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 38 중 하나를 갖거나 또는 그와 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 본 개시내용의 펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 추가의 측면은 본 개시내용의 펩티드 또는 폴리펩티드 및 MHC 폴리펩티드를 포함하는 분자 복합체에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 측면은 (a) 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 수득하고; (b) 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 본 개시내용의 펩티드와 접촉시키고, 그에 의해 펩티드/코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포를 생성하는 것을 포함하는, 펩티드/코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 방법에 따라 생산된 펩티드/코로나바이러스-특이적 조작된 T 세포 및 TCR을 기재한다. 추가의 측면은 본 개시내용의 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 또는 발현 벡터를 포함하는 시험관내 단리된 수지상 세포에 관한 것이다.
또한, 환자로부터의 생물학적 샘플을 본 개시내용의 조성물, 펩티드, 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 환자를 진단하거나 또는 환자에서 T 세포 반응을 검출하는 방법이 제공된다. 또한 추가의 측면은 본 개시내용의 펩티드에 결합하는 또는 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 펩티드/코로나바이러스-특이적 결합 분자에 관한 것이다. 예시적인 결합 분자는 항체, TCR 모방 항체, scFv, 나노바디, 카멜리드, 압타머, 및 DARPIN을 포함한다. 관련된 방법은 적어도 1개의 MHC 폴리펩티드 및 본 개시내용의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 T 세포를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 결합된 펩티드 및/또는 MHC 폴리펩티드를 갖는 T 세포를 검출 태그를 검출함으로써 검출하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 추가의 측면은 본 개시내용의 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 발현 벡터, 또는 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 추가의 방법 측면은 (a) 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 수득하고; (b) 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 본 개시내용의 코로나바이러스 펩티드와 접촉시키고, 그에 의해 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포를 생성하고; (c) 코로나바이러스 펩티드에 대해 특이적인 면역 이펙터 세포를 정제하고; (d) 정제된 면역 이펙터 세포로부터 T 세포 수용체 (TCR) 서열을 단리하는 것을 포함하는, 코로나바이러스 TCR을 클로닝하는 방법에 관한 것이다. 추가의 측면은 본 개시내용의 핵산 또는 발현 벡터를 세포 내로 전달하는 것을 포함하는, 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 추가의 측면은 T 세포를 본 개시내용의 펩티드와 공동-배양하는 것을 포함하는, 치료제 T 세포 백신을 제조하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 방법은 SARS를 치료하거나 또는 예방하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 방법은 COVID-19를 치료하거나 또는 예방하기 위한 것이다. 일부 측면에서, COVID-19는 만성 COVID로 추가로 정의된다.
본 개시내용의 핵산은 본원에 기재된 CDR 영역, 가변 영역, 조작된 TCR, 폴리펩티드, TCR-a 폴리펩티드, TCR-b 폴리펩티드, 펩티드, 폴리펩티드, 및 융합 단백질을 코딩하는 것들을 포함한다. 핵산은 RNA일 수 있다. 핵산은 또한 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 상보체를 코딩하는 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 핵산은 서열식별번호:1, 8, 15, 86, 93, 100, 107, 114, 121, 128, 또는 135, 또는 그의 단편 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산은 서열식별번호:1, 8, 15, 86, 93, 100, 107, 114, 121, 128, 또는 135, 또는 그의 단편 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:7을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다. 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:14를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다. 폴리펩티드는 서열식별번호:7, 14, 또는 21 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:21을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 (i) 서열식별번호:7의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:7과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3; 또는 (ii) 서열식별번호:14의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드; 및 서열식별번호:21의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:21과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 (i) 서열식별번호:7의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:7을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3; 또는 (ii) 서열식별번호:14의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:14를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드; 및 서열식별번호:21의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:21을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR은 TCR-a 폴리펩티드 및/또는 TCR-b 폴리펩티드로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:5, 12, 또는 19 중 하나의, 또는 서열식별번호:5, 12, 또는 19 중 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:5, 12, 또는 19 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:5 및 12 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:5 및 12 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:19를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:5 및 12 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:19를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:5 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:19의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR-a 또는 TCR-b는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:6, 13, 및 20 중 하나의, 또는 서열식별번호:6, 13, 및 20 중 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:6, 13, 및 20 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:6 및 13 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:6 및 13 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:20을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:6 및 13 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:20을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:6 및 13 중 하나의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:20의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
가변 영역은 서열식별번호:3, 10, 및 17 중 하나와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:3, 10, 및 17 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:3, 10, 및 17 중 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:3 및 10 중 하나와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:3 및 10 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:3 및 10 중 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:17과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:17을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:17의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 신호 펩티드는 서열식별번호:4, 11, 및 18 중 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:4, 11, 및 18 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:4, 11, 및 18 중 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 TCR 측면은 TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 (i) 각각 서열식별번호:5, 6, 및 7의 아미노산 서열; 또는 (ii) 각각 서열식별번호:12, 13, 및 14의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:19, 20, 및 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR에 관한 것이다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:2를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:16의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:16을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:9의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:9를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:16의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:16을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:1의 핵산 서열 또는 서열식별번호:1을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:15의 핵산 서열 또는 서열식별번호:15를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:8의 핵산 서열 또는 서열식별번호:8을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:15의 핵산 서열 또는 서열식별번호:15를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:92를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:92의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:99를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:92의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:92와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:99의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:99와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:92의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:92를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:99의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:99를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR은 TCR-a 폴리펩티드 및/또는 TCR-b 폴리펩티드로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:90 또는 97의, 또는 서열식별번호:90 또는 97과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:90 또는 97 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:90을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:97을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:90을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:97을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:90의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:97의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR-a 또는 TCR-b는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:91 또는 98 중 하나의, 또는 서열식별번호:91 또는 98 중 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:91 또는 98 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:91을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:98을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:91을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:98을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:91의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:98의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
가변 영역은 서열식별번호:88 또는 95와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:88 또는 95를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:88 또는 95의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:88과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:88을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:88의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:95와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:95를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:95의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 신호 펩티드는 서열식별번호:89 및 96 중 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:89 및 96 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:89 및 96 중 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 TCR 측면은 TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:90, 91, 및 92의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:97, 98, 및 99의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR에 관한 것이다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:87의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:87을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:94의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:94를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:86의 핵산 서열 또는 서열식별번호:86을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:93의 핵산 서열 또는 서열식별번호:93을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:106을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:106의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:113을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:106의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:106과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:113의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:113과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:106의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:106을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:113의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:113을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR은 TCR-a 폴리펩티드 및/또는 TCR-b 폴리펩티드로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:104 또는 111의, 또는 서열식별번호:104 또는 111과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:104 또는 111을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:104를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:111을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:104를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:111을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:104의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:111의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR-a 또는 TCR-b는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:105 또는 112의, 또는 서열식별번호:105 또는 112와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:105 또는 112를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:105를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:112를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:105를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:112를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:105의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:112의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
가변 영역은 서열식별번호:102 또는 109와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:102 또는 109를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:102 또는 109의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:102와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:102를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:102의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:109와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:109를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:109의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 신호 펩티드는 서열식별번호:103 및 110 중 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:103 및 110 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:103 및 110 중 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 TCR 측면은 TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:104, 105, 및 106의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:111, 112, 및 113의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR에 관한 것이다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:101의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:101을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:108의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:108을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:100의 핵산 서열 또는 서열식별번호:100을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:107의 핵산 서열 또는 서열식별번호:107을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:120을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:120의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:127을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:127의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:120의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:120과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:127의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:127과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:120의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:120을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:127의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:127을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR은 TCR-a 폴리펩티드 및/또는 TCR-b 폴리펩티드로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:118 또는 125의, 또는 서열식별번호:118 또는 125와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:118 또는 125를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:118을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:125를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:118을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:125를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:118의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:125의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR-a 또는 TCR-b는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:119 또는 126의, 또는 서열식별번호:119 또는 126과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:119 또는 126을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:119를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:126을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:119를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:126을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:119의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:126의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
가변 영역은 서열식별번호:116 또는 123과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:116 또는 123을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:116 또는 123의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:116과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:116을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:116의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:123과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:123을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:123의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 신호 펩티드는 서열식별번호:117 및 124 중 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:117 및 124 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:117 및 124 중 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 TCR 측면은 TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:118, 119, 및 120의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:125, 126, 및 127의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR에 관한 것이다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:115의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:115를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:122의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:122를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:114의 핵산 서열 또는 서열식별번호:114를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:121의 핵산 서열 또는 서열식별번호:121을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:134를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:134의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:141을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:141의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:134의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:134와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:141의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:141과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:134의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:134를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:141의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:141을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR은 TCR-a 폴리펩티드 및/또는 TCR-b 폴리펩티드로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:132 또는 139의, 또는 서열식별번호:132 또는 139와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:132 또는 139를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:132를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:132의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:139를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다. 폴리펩티드, TCR, 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:139의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:132를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:139를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:132의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드 및 서열식별번호:139의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드, TCR-a 또는 TCR-b는 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:133 또는 140의, 또는 서열식별번호:133 또는 140과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:133 또는 140을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 CDR2를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:133을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:133의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:140을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:140의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함할 수 있다.
조작된 TCR은 서열식별번호:133을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:140을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조작된 TCR은 서열식별번호:133의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-a 폴리펩티드, 및 서열식별번호:140의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 TCR-b 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
가변 영역은 서열식별번호:130 또는 137과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:130 또는 137을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가변 영역은 서열식별번호:130 또는 137의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:130과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:130을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-a 가변 영역은 서열식별번호:130의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:137과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:137을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR-b 가변 영역은 서열식별번호:137의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역은 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 신호 펩티드는 서열식별번호:131 및 138 중 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:131 및 138 중 하나를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 서열식별번호:131 및 138 중 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 TCR 측면은 TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:132, 133, 및 134의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3은 각각 서열식별번호:1139, 140, 및 141의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR에 관한 것이다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:129의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:129를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:136의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:136을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:128의 핵산 서열 또는 서열식별번호:128을 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:135의 핵산 서열 또는 서열식별번호:135를 갖는 또는 그와 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
TCR은 변형을 포함할 수 있거나 또는 키메라일 수 있다. TCR의 가변 영역은 본 개시내용의 펩티드에 특이적으로 결합하는 클로닝된 TCR의 불변 영역과는 상이한 TCR 불변 영역에 융합될 수 있다.
TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드는 작동가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 공유 연결, 예컨대 펩티드 결합 (예를 들어, 2개의 요소가 폴리펩티드이고, 동일한 폴리펩티드 상에 있음), 또는 비-공유 연결, 예컨대 반 데르 발스 힘 (예를 들어 서로에 대해 특정 정도의 특이적 결합 친화도를 갖는 2개의 폴리펩티드)을 지칭할 수 있다. TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 작동가능하게 연결될 수 있다. TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드 상에 있을 수 있고, 여기서 TCR-b는 TCR-a에 대해 아미노-근위이다. TCR-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드 상에 있을 수 있고, 여기서 TCR-a는 TCR-b에 대해 아미노-근위이다. 따라서, TCR은 단일 쇄 TCR일 수 있다. 단일 쇄 TCR은 TCR-a 및 TCR-b 폴리펩티드 사이에 링커를 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 링커는 본원에 기재된 또는 관련 기술분야에 공지된 링커일 수 있다. 링커는 또한 글리신 및 세린 잔기를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 링커는 단지 글리신 및 세린 잔기로 구성된다 (글리신-세린 링커). 링커는 유연성 링커일 수 있다. 예시적인 유연성 링커는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체 (예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (G4S)n 및 (GGGS)n (여기서 n은 적어도 1의 정수임)을 포함한다. 일부 측면에서, n은 적어도, 많아야, 또는 정확하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위)이다. 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 유연성 링커는 본 개시내용의 폴리펩티드에서 링커로서 사용될 수 있다. 예시적인 링커는 GGSG, GGSGG, GSGSG, GSGGG, GGGSG, GSSSG 등을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 제1 영역이 제2 영역의 카르복시 말단에 부착되는 경우 제1 영역은 제2 영역에 대해 카르복시-근위이다. 제1 및 제2 영역 사이에 추가의 개재 아미노산 잔기가 있을 수 있다. 따라서, 영역은 개재 아미노산 잔기를 갖는 것으로 구체적으로 특정되지 않는 한, 바로 인접할 필요는 없다. 용어 "아미노-근위"는 제1 영역이 제2 영역의 아미노 말단에 부착되는 경우 제1 영역이 제2 영역에 대해 아미노-근위라는 점에서 유사하게 정의된다. 유사하게, 달리 진술되지 않는 한, 제1 및 제2 영역 사이에 추가의 개재 아미노산 잔기가 있을 수 있다.
CDR은 또한 TCR-a 또는 TCR-b 폴리펩티드의 가변 영역의 맥락에서 특정한 CDR 서열의 하나 또는 둘 다의 측에 플랭킹된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23개, 또는 그 초과의 인접한 아미노산 잔기 (또는 그 안의 추론가능한 임의의 범위)를 포함할 수 있고; 따라서, 특정한 CDR 서열, 예컨대 서열식별번호:3, 10, 및 17의 가변 영역에서 제시된 것들의 N-말단 또는 C-말단 단부에 1개 이상의 추가의 아미노산이 있을 수 있다. 대안적으로, 또는 조합으로, CDR은 또한 본원에 기재된 CDR의 단편일 수 있고, 특정한 CDR 서열의 C-말단 또는 N-말단 단부로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산을 결여할 수 있다.
TCR 또는 융합 단백질은 검출 또는 치료 작용제에 접합될 수 있다. 작용제는 형광 분자, 방사성 분자, 또는 독소를 포함할 수 있다. TCR 또는 융합 단백질은 본원에 기재된 작용제에 접합될 수 있다.
펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드의 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 38 중 하나를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 펩티드는 13개의 아미노산의 길이 또는 그보다 짧을 수 있다. 펩티드는 적어도, 많아야, 정확하게 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산 (또는 그 안의 추론가능한 임의의 범위)을 갖거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 구체적인 측면에서, 펩티드는 9개의 아미노산으로 이루어진다. 펩티드는 10개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 펩티드는 11개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 펩티드는 12개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 펩티드는 13개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 펩티드는 면역원성이다. 용어 면역원성은 면역 반응, 예컨대 보호적 면역 반응의 생성을 지칭할 수 있다. 펩티드는 변형될 수 있다. 변형은 분자에의 접합을 포함할 수 있다. 분자는 항체, 지질, 아주반트, 또는 검출 모이어티 (태그)일 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 100% 서열 동일성을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 펩티드는 또한 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드를 갖는 또는 그와 적어도 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것들을 포함한다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 63% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 66% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 70% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 72% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 77% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 80% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 80% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 81% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 88% 동일성을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 90% 동일성을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 펩티드는 서열식별번호:18 내지 21 중 하나의 펩티드에 비해 1, 2, 또는 3개의 치환을 가질 수 있다. 펩티드는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드에 비해 적어도 또는 많아야 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 치환을 가질 수 있다.
제약 조성물은 비경구 투여, 정맥내 주사, 근육내 주사, 흡입, 또는 피하 주사를 위해 제제화될 수 있다. 펩티드는 리포솜, 지질-함유 나노입자, 또는 지질-기반 담체에 포함될 수 있다. 제약 제제는 주사 또는 비강 스프레이로서 흡입을 위해 제제화될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 조성물은 백신으로서 제제화된다. 조성물은 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 수지상 세포에 관한 일부 측면에서, 수지상 세포는 성숙한 수지상 세포를 포함한다. 세포는 HLA-A 유형을 갖는 세포일 수 있다. HLA는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C일 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 HLA-A24 유형이다. 일부 측면에서, 세포는 HLA-A11 유형이다. 일부 측면에서, 세포는 HLA-A01, HLA-A02, HLA-A11, HLA-A24, HLA-B07, HLA-B08, HLA-B15, 또는 HLA-B40이다.
방법은 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, T 세포는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 측면에서, T 세포는 CD4+ T 세포, Th1, Th2, Th17, Th9, 또는 Tfh T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 이펙터 기억 T 세포이다.
본 개시내용의 방법 측면에서, 접촉은 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 항원 제시 세포 (APC), 인공 항원 제시 세포 (aAPC), 또는 인공 항원 제시 표면 (aAPS)과 공동-배양하는 것으로 추가로 정의되고; 여기서 APC, aAPC, 또는 aAPS는 그들의 표면 상에 펩티드를 제시한다. 일부 측면에서, APC는 수지상 세포이다.
본 개시내용의 측면에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포, 말초 혈액 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 불변 NK 세포, 또는 NKT 세포이다. 면역 이펙터 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 유도 다능성 줄기 (iPS) 세포로부터 분화된 것일 수 있다. T 세포 측면은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 γδ T 세포로 추가로 정의되는 T 세포를 포함한다. 특정 측면에서, T 세포는 세포독성 T 림프구 (CTL)이다. 일부 측면에서, 수득은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 단리하는 것을 포함한다.
핵산은 TCR-a (TRA) 및 TCR-b (TRB) 유전자를 포함할 수 있다. 핵산은 폴리시스트론성일 수 있다. 핵산은 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 또는 2A 절단가능한 링커, 예컨대 P2A 링커를 포함할 수 있다. 핵산은 TCR-a 및/또는 TCR-b 유전자를 코딩하는 cDNA를 포함할 수 있다. 핵산은 CD3 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 코딩할 수 있다. CD3 결합 영역은 CD3-특이적 단편 항원 결합 (Fab), 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 단일 도메인 항체, 또는 단일 쇄 항체를 포함할 수 있다.
벡터는 TCR-a 및 TCR-b 유전자 둘 다를 포함할 수 있다. 벡터는 핵산의 발현을 지정하는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터를 포함할 수 있다. 세포는 줄기 세포, 전구 세포, 면역 세포, 또는 자연 킬러 (NK) 세포를 포함할 수 있다. 세포는 조혈 줄기 또는 전구 세포, T 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 분화된 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 포함할 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리되거나 또는 유래될 수 있다. T 세포는 세포독성 T 림프구 (CTL), CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 불변 NK T (iNKT) 세포, 감마-델타 T 세포, NKT 세포, 또는 조절 T 세포를 포함할 수 있다. 세포는 현재 또는 이전의 코로나바이러스 감염을 갖는 환자로부터 단리될 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 현재 또는 과거의 코로나바이러스 감염을 갖지 않는 건강한 대상체로부터 단리된다. 일부 측면에서, 세포는 건강한 환자로부터 단리된다. 세포는 동결될 수 있거나, 또는 결코 동결되지 않았을 수 있다. 세포는 세포 배양 중인 세포일 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 TCR 유전자의 내인성 발현을 결여한다. 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 혈청-무함유, 미코플라스마-무함유, 내독소-무함유, 및/또는 무균인 것으로 결정되었던 것일 수 있다. 방법은 세포를 배지에서 배양하고/거나, 세포를 세포의 분열을 허용하는 조건에서 인큐베이션하고/거나, 세포를 스크리닝하고/거나, 세포를 동결시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 측면에서, 코로나바이러스는 박쥐로부터 단리된 코로나바이러스를 지칭할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 코로나바이러스는 인간에서 SARS를 유발하는 바이러스인 SARS-CoV이다. 일부 측면에서, 코로나바이러스는 인간에서 COVID-19를 유발하는 바이러스인 SARS-CoV-2이다. 일부 측면에서, 방법은 SARS를 치료하거나 또는 예방하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 방법은 COVID-19를 치료하거나 또는 예방하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 코로나바이러스는 서열식별번호:22 내지 81 중 하나를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 코로나바이러스이다. 대상체는 실험실 시험 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 말, 또는 돼지를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 코로나바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 갖는 것일 수 있다. 일부 측면에서, 대상체는 코로나바이러스 감염의 임의의 증상을 갖지 않는다. 대상체는 코로나바이러스 감염을 갖고/거나 이로 진단되었던 것일 수 있다. 일부 측면에서, 대상체는 코로나바이러스 감염을 갖지 않고/거나 이로 진단되지 않았다. 일부 측면에서, 대상체는 코로나바이러스 감염에 대해 이전에 치료되었다. 대상체는 이전의 치료에 대해 저항성 또는 비-반응성인 것으로 결정되었던 것일 수 있다. 일부 측면에서, 대상체는 추가의 치료제가 투여된다. 일부 측면에서, 추가의 치료제는 스테로이드 또는 항-바이러스 치료제를 포함한다. 일부 측면에서, 추가의 치료제는 덱사메타손, 모노클로날 항체, 렘데시비르, 팍스로비드(Paxlovid), 몰누피라비르(Molnupiravir), 회복기 혈장, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 대상체는 SARS를 갖고/거나 이로 진단되었다. 일부 측면에서, 대상체는 코로나바이러스 감염과 관련된 합병증으로 진단되었다. 일부 측면에서, 대상체는 COVID-19 또는 SARS와 관련된 합병증으로 진단되었다. 합병증은 폐렴, 호흡 곤란 또는 숨참, 흉통 또는 가슴 압박, 급성 호흡 부전, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 심장 손상, 2차 감염, 급성 신장 손상, 패혈성 쇼크, 혈전, 다중계 염증 증후군, 만성 피로, 횡문근융해, 파종성 혈관내 응고, 또는 급성 간 손상을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 대상체는 코로나바이러스에 대해 백신접종된다. 일부 측면에서, 대상체는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV에 대해 백신접종된다. 대상체는 또한 코로나바이러스에 대해 백신접종되지 않는 것일 수 있다. 일부 측면에서, 대상체는 만성 코비드로 진단되었다. 일부 측면에서, 환자는 면역손상되거나 또는 면역억제된다.
본 개시내용의 조성물은 백신으로서 제제화될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 COVID-19 또는 SARS-Cov-2 감염을 예방하기 위한 예방적 요법을 제공한다. 조성물은 아주반트를 추가로 포함할 수 있다. 아주반트는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, TLR 효능제 및 알루미늄 염을 포함한다.
본 개시내용의 방법은 세포를 하나 이상의 세포 특성에 대해, 예컨대 TCR 발현, TCR 유전자를 코딩하는 핵산의 혼입에 대해, 또는 면역원성 특성, 예컨대 항원에의 TCR의 결합에 대해 스크리닝하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
방법은 세포 또는 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 세포는 자가 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 세포는 비-자가 세포를 포함한다. 세포는 또한 동종이형 또는 이종 세포로 정의될 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 그의 분획을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 생물학적 샘플은 림프구를 포함한다. 일부 측면에서, 생물학적 샘플은 림프구를 포함하는 분획화된 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 또한 본원에 기재된 것일 수 있다.
조성물은 MHC 폴리펩티드 및 본 개시내용의 펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 MHC 폴리펩티드 및/또는 펩티드는 검출 태그에 접합된다. 따라서, 적합한 검출 태그는 방사성동위원소, 형광색소, 화학발광 화합물, 염료, 및 효소를 포함하는 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 태그는 간단하게 검출될 수 있거나 또는 이는 정량화될 수 있다. 간단하게 검출되는 반응은 일반적으로 그의 존재만을 확인하는 반응을 포함하는 반면, 정량화되는 반응은 일반적으로 정량화가능한 (예를 들어, 수치적으로 보고가능한) 값, 예컨대 강도, 극성, 및/또는 다른 특성을 갖는 반응을 포함한다. 발광 또는 형광 검정에서, 검출가능한 반응은 결합에 실제로 관여하는 검정 성분과 회합된 발광단 또는 형광단을 사용하여 직접적으로, 또는 또 다른 (예를 들어, 리포터 또는 인디케이터) 성분과 회합된 발광단 또는 형광단을 사용하여 간접적으로 생성될 수 있다. 신호를 생성하는 발광 태그의 예는 생체발광 및 화학발광을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 형광 태그의 예는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라사이트 그린(Malacite green), 스틸벤, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 캐스케이드 블루(Cascade Blue).TM., 및 텍사스 레드(Texas Red)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 광학 염료는 문헌 [Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th)]에 기재되어 있다. 검출 태그는 또한 스트렙타비딘 또는 그의 결합 상대, 비오틴을 포함한다.
MHC 폴리펩티드 및 펩티드는 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된"은 2개의 성분이 조합되거나 또는 조합되어 복합체를 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. 예를 들어, 성분은 공유 부착되고/거나 동일한 폴리펩티드 상에, 예컨대 융합 단백질에 있을 수 있거나, 또는 성분은 서로에 대해 특정 정도의 결합 친화도, 예컨대 반 데르 발스 힘을 통해 발생하는 결합 친화도를 가질 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 MHC 폴리펩티드 및 펩티드가 펩티드 결합을 통해 작동적으로 연결된 것에 관한 것이다. 추가의 측면은 MHC 폴리펩티드 및 펩티드가 반 데르 발스 힘을 통해 작동적으로 연결된 것에 관한 것이다. 펩티드-MHC는 작동적으로 연결되어 pMHC 복합체를 형성할 수 있다. 일부 측면에서, 적어도 2개의 pMHC 복합체는 함께 작동적으로 연결된다. 다른 측면은 서로에 작동적으로 연결된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 pMHC 복합체를 포함하거나, 적어도 이들을 포함하거나, 또는 많아야 이들을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 2개의 MHC 폴리펩티드는 1개의 펩티드에 연결된다. 다른 측면에서, MHC 폴리펩티드 대 펩티드의 평균 비는 1:1 내지 4:1이다. 일부 측면에서, 비 또는 평균 비는 적어도, 많아야, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 대 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위)이다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 펩티드는 MHC와 복합체화된다. 일부 측면에서, MHC는 HLA-A 유형을 포함한다. MHC는 HLA-A3 또는 HLA-A11 유형으로 추가로 정의될 수 있다. 펩티드는 수지상 세포, 림프모구성 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 또는 인공 항원 제시 표면 상으로 로딩될 수 있다. 일부 측면에서, 인공 항원 제시 표면은 표면에 접합된 또는 연결된 MHC 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 표면은 비드, 마이크로플레이트, 유리 슬라이드, 또는 세포 배양 플레이트를 포함한다.
본 개시내용의 방법은 펩티드 및/또는 MHC와 결합된 T 세포의 수를 카운팅하는 것을 추가로 포함할 수 있다. T 세포를 포함하는 조성물은 대상체로부터 단리될 수 있다. 대상체는 본원에서 정의된 바와 같은 것, 예컨대 인간 대상체일 수 있다. 방법은 펩티드 및/또는 MHC와 결합된 T 세포의 수를 분류하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법은 또한 펩티드 및/또는 MHC와 결합된 T 세포로부터 1개 이상의 TCR 유전자를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 TCR, 예컨대 본 개시내용의 펩티드에 결합하는 TCR로부터 TCR 알파 및/또는 베타 유전자(들)를 시퀀싱하는 것을 포함하거나 또는 추가로 포함한다. 방법은 또한 파라토프 핫스팟에 의한 림프구 상호작용의 그룹핑 (GLIPH) 분석을 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 이는 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Glanville et al., Nature. 2017 Jul 6; 547(7661): 94-98]에 추가로 기재되어 있다.
본 개시내용의 조성물은 혈청-무함유, 미코플라스마-무함유, 내독소-무함유, 및/또는 무균일 수 있다. 방법은 본 개시내용의 세포를 배지에서 배양하고/거나, 세포를 세포의 분열을 허용하는 조건에서 인큐베이션하고/거나, 세포를 스크리닝하고/거나, 세포를 동결시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 또한 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 본 개시내용의 세포로부터 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법은 수지상 세포를 하나 이상의 세포 특성에 대해 스크리닝하는 것을 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 세포를 1종 이상의 시토카인 또는 성장 인자와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 1종 이상의 시토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 세포 특성은 CD86, HLA, 및 CD14 중 1종 이상의 세포 표면 발현을 포함한다. 수지상 세포는 CD34+ 조혈 줄기 또는 전구 세포로부터 유래될 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 접촉은 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 항원 제시 세포 (APC)와 공동-배양하는 것으로 추가로 정의될 수 있고, 여기서 APC는 그들의 표면 상에 펩티드를 제시한다. 특정한 측면에서, APC는 수지상 세포이다. 일부 측면에서, 수지상 세포는 말초 혈액 단핵구 (PBMC)로부터 유래된다. 일부 측면에서, 수지상 세포는 PBMC로부터 단리된다. 수지상 세포 또는 DC가 유래되는 세포는 백혈구성분채집술에 의해 단리된다.
본 개시내용의 측면에서 펩티드-MHC (pMHC) 복합체는 본 개시내용의 펩티드를 MHC 복합체와 접촉시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 측면에서, 펩티드는 세포에서 발현되고, 내인성 MHC 복합체에 결합하여 pMHC를 형성한다. 일부 측면에서, 펩티드 교환을 사용하여 pMHC 복합체를 제조한다. 예를 들어, MHC에 결합하고 이를 안정화시키는 절단가능한 펩티드, 예컨대 광절단가능한 펩티드가 디자인될 수 있다. 펩티드의 절단 (예를 들어 광절단가능한 펩티드에 대한 조사에 의해)은 펩티드를 HLA 복합체로부터 해리시키고, 비어 있는 HLA 복합체를 발생시키며, 이는 UV 노출이 "구제 펩티드"의 존재 하에서 수행되지 않는 한, 급속하게 분해된다. 따라서, 본 개시내용의 펩티드는 펩티드 교환 절차에서 "구제 펩티드"로서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 추가의 측면은 본 개시내용의 펩티드를 포함하는 pMHC 복합체에 관한 것이다. pMHC 복합체는 고체 지지체에 작동적으로 연결될 수 있거나 또는 검출가능한 모이어티, 예컨대 형광 분자, 방사성동위원소, 또는 항체에 부착될 수 있다. 본 개시내용의 추가의 측면은 함께 작동적으로 연결된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 펩티드-MHC 분자를 포함하거나, 적어도 이들을 포함하거나, 또는 많아야 이들을 포함하는 펩티드-MHC 다량체성 복합체에 관한 것이다. 연결은 공유적, 예컨대 펩티드 결합을 통해, 또는 비-공유적일 수 있다. 일부 측면에서, pMHC 분자는 비오틴 분자에 결합될 수 있다. 이러한 pMHC 분자는 스트렙타비딘 분자에의 결합을 통해 다량체화될 수 있다. pMHC 다량체는 조성물에 또는 조직에 있는 항원-특이적 T 세포 또는 TCR 분자를 검출하는데 사용될 수 있다. 다량체는 계내에서 또는 생검 샘플에서 펩티드- 또는 코로나바이러스-특이적 T 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 다량체는 고체 지지체에 결합되거나 또는 고체 지지체, 예컨대 어레이 또는 슬라이드 상에 침착될 수 있다. 이어서 세포는 슬라이드에 첨가될 수 있고, pMHC 다량체 및 세포 사이의 결합의 검출이 수행될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 pMHC 분자 및 다량체는 대상체에서 SARS-Cov-2 감염을 검출하고 진단하는데 또는 COVID-19를 갖는 개체에서 면역 반응을 결정하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서 정의된 바와 같은 수득은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 단리하는 것을 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 면역 이펙터 세포의 출발 집단은 대상체로부터 수득된다. 본 개시내용의 방법은 공동-배양 전에 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 수지상 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 펩티드의 도입은 수지상 세포를 펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염시키거나 또는 감염시킴으로써 또는 펩티드를 수지상 세포와 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산은 전기천공에 의해 도입될 수 있다. 다른 핵산 전달 방법, 예컨대 리포펙션, 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란으로의 형질감염, 미세주사, 및 바이러스-매개 형질도입은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본 개시내용의 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 본 개시내용의 방법에서 유용하다. 일부 측면에서, 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산은 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 수지상 세포 배양 배지에 첨가함으로써 도입된다. 일부 측면에서, 면역 이펙터 세포는 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산이 도입된 수지상 세포의 제2 집단과 공동-배양된다. 일부 측면에서, CD4-양성 또는 CD8-양성 및 펩티드 MHC 사량체-양성 T 세포의 집단은 공동-배양 후 면역 이펙터 세포로부터 정제된다. 일부 측면에서, CD4-양성 또는 CD8-양성 및 펩티드 MHC 사량체-양성 T 세포의 집단은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 정제된다. 일부 측면에서, 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포의 클론 집단은 제한 또는 계열 희석, 이어서 급속 확장 프로토콜에 의한 개별적 클론의 확장에 의해 생성된다.
일부 측면에서, 정제는 분류된 세포의 제한 또는 계열 희석, 이어서 급속 확장 프로토콜에 의한 개별적 클론의 확장에 의한 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포의 클론 집단의 생성을 추가로 포함한다. 본 개시내용의 방법은 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포의 클론 집단으로부터의 T 세포 수용체 (TCR)의 클로닝을 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 본 개시내용의 방법에서 용어 단리는 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포의 클론 집단으로부터의 T 세포 수용체 (TCR)의 클로닝으로 정의되거나 또는 추가로 정의될 수 있다. 일부 측면에서, TCR의 클로닝은 TCR 알파 및 베타 쇄의 클로닝이다. 일부 측면에서, TCR은 cDNA 단부의 5'-급속 증폭 (RACE) 방법을 사용하여 클로닝된다. 일부 측면에서, TCR 알파 및 베타 쇄는 cDNA 단부의 5'-급속 증폭 (RACE) 방법을 사용하여 클로닝된다. 일부 측면에서, 클로닝된 TCR은 발현 벡터 내로 서브클로닝된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 TCR 알파 서열 및 TCR 베타 서열 사이에 링커 도메인을 포함한다. 발현 벡터는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 또한 본원에 기재된 발현 벡터일 수 있다. 링커 도메인은 1개 이상의 펩티드 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 1개 이상의 절단 부위는 푸린(Furin) 절단 부위 및/또는 P2A 절단 부위일 수 있다. 일부 측면에서, TCR 알파 서열 및 TCR 베타 서열은 IRES 서열에 의해 연결된다.
본 개시내용의 숙주 세포는 발현 벡터로 형질도입되어 TCR 알파 및/또는 베타 쇄를 발현하는 조작된 세포를 생성할 수 있다. 일부 측면에서, 숙주 세포는 면역 세포이다. 면역 세포는 T 세포일 수 있고, 조작된 세포는 조작된 T 세포로 지칭될 수 있다. T 세포는 본원에 기재된 T 세포의 유형, 예컨대 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 γδ T 세포일 수 있다. 면역 이펙터 세포의 출발 집단은 SARS-Cov-2 감염을 갖는 대상체로부터 수득될 수 있고, 숙주 세포는 대상체에 대해 동종이형 또는 자가이다. 코로나바이러스-특이적 T 세포는 자가 또는 동종이형일 수 있다. CD4-양성 또는 CD8-양성 및 펩티드 MHC 사량체-양성 조작된 T 세포의 집단은 형질도입된 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 일부 측면에서, 코로나바이러스-특이적 조작된 T 세포의 클론 집단은 제한 또는 계열 희석, 이어서 급속 확장 프로토콜에 의한 개별적 클론의 확장에 의해 생성된다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 방법에서 정제는 공동-배양 후 면역 이펙터 세포로부터 CD4-양성 또는 CD8-양성 및 펩티드 MHC 사량체-양성 T 세포의 집단을 정제하는 것으로 정의된다.
펩티드는 고체 지지체에 연결될 수 있다. 일부 측면에서, 펩티드는 고체 지지체에 접합되거나 또는 고체 지지체에 접합된 항체에 결합된다. 고체 지지체는 마이크로플레이트, 비드, 유리 표면, 슬라이드, 또는 세포 배양 디쉬를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 고체 지지체는 나노유체 칩을 포함한다. T 세포 반응을 검출하는 것은 T 세포 또는 TCR에의 펩티드의 결합을 검출하는 것을 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함한다. 일부 측면에서, T 세포 반응을 검출하는 것은 ELISA, ELISPOT, 또는 사량체 검정을 포함한다.
본 개시내용의 방법은 또한 백신, 예컨대 코로나바이러스, SARS, 또는 SARS-CoV2 백신의 효능을 결정하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 키트 측면은 본 개시내용의 펩티드를 용기에 포함할 수 있다. 펩티드는 제약 제제에 포함될 수 있다. 제약 제제는 비경구 투여 또는 흡입을 위해 제제화될 수 있다. 일부 측면에서, 펩티드는 세포 배양 배지에 포함된다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 인간 대상체를 지칭할 수 있다. 대상체는 포유동물 대상체로 정의될 수 있다. 대상체는 또한 마우스, 래트, 돼지, 말, 비-인간 영장류, 고양이, 개, 소 등일 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 상기 값을 결정하는데 채용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 지시하기 위해 세포 및 분자 생물학의 분야에서의 그의 평범하고 통상적인 의미에 따라 사용된다.
용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 단수 형태의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.
본원에 사용된 용어 "또는" 및 "및/또는"은 서로와 조합으로 또는 배제하여 다수의 성분을 기재하는데 이용된다. 예를 들어, "x, y, 및/또는 z"는 "x" 단독, "y" 단독, "z" 단독, "x, y, 및 z", "(x 및 y) 또는 z", "x 또는 (y 및 z)", 또는 "x 또는 y 또는 z"를 지칭할 수 있다. x, y, 또는 z는 실시양태로부터 구체적으로 배제될 수 있음이 구체적으로 구상된다.
단어 "포함하는(comprising)" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다"), "갖는" (및 갖는의 임의의 형태, 예컨대 "갖다"), "포함하는(including)" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다"), "특징으로 하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "로서 특징화되는"), 또는 "함유하는" (및 함유하는의 임의의 형태, 예컨대 "함유하다")는 포함적이거나 또는 개방-단부이고, 추가의 나열되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
조성물 및 그의 사용 방법은 본 명세서 전반에 걸쳐 개시된 임의의 성분 또는 단계를 "포함하거나", 이로 "본질적으로 이루어지거나", 또는 이로 "이루어질" 수 있다. 어구 "이루어진"은 특정되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 어구 "본질적으로 이루어진"은 기재된 요지의 범주를 특정된 물질 또는 단계 및 그의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들에 제한한다. 용어 "포함하는"의 맥락에서 기재된 실시양태는 또한 용어 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"의 맥락에서 실행될 수 있음이 구상된다.
치료, 진단, 또는 생리학적 목적 또는 효과의 맥락에서 임의의 방법은 또한 "용도" 청구항 언어, 예컨대 기재된 치료, 진단, 또는 생리학적 목적 또는 효과를 달성하거나 또는 실행하기 위한 본원에서 논의된 임의의 화합물, 조성물, 또는 작용제의 "용도"로 기재될 수 있다.
하나 이상의 서열 또는 조성물의 용도는 본원에 기재된 임의의 방법에 기반하여 채용될 수 있다. 다른 실시양태는 본 출원 전반에 걸쳐 논의된다. 본 개시내용의 한 측면에 관하여 논의된 임의의 실시양태는 또한 본 개시내용의 다른 측면에도 적용되며, 그 역도 마찬가지이다.
본 발명의 한 실시양태에 관하여 논의된 임의의 제한은 본 발명의 임의의 다른 실시양태에 적용될 수 있음이 구체적으로 구상된다. 더욱이, 본 발명의 임의의 조성물은 본 발명의 임의의 방법에 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 방법은 본 발명의 임의의 조성물을 생산하거나 또는 이용하는데 사용될 수 있다. 실시예에 제시된 실시양태의 측면은 또한 상이한 실시예의 다른 곳에서 또는 본 출원의 다른 곳에서, 예컨대 발명의 개요, 실시양태의 상세한 설명, 청구범위, 및 도면 범례의 설명에서 논의된 실시양태의 맥락에서 실행될 수 있는 실시양태이다.
본 발명의 다른 목적, 특색 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이기 때문에, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는, 본 발명의 구체적인 실시양태를 지시하면서, 단지 예시로 주어짐을 이해해야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 구체적인 실시양태의 상세한 설명과 조합으로 이들 도면 중 하나 이상을 참고하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1. MHC 면역-침전 (IP) 방법으로부터의 SARS-Cov-2 막 당-단백질(MGP) HLA-A0201 제한된 펩티드 확인.
도 2. SARS-Cov-2 HLA-A0201 제한된 펩티드 (MGP-65, FVLAAVYRI - 서열식별번호:22) CTL 생성.
도 3A 내지 C. MGP-65 펩티드 특이적 CTL 세포주의 기능적 입증.
도 4. 저온 표적 억제 검정으로의 특이성 검출을 인식하는 MGP-65 CTL 세포주.
도 5. 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정을 사용한 MGP-65 특이적 CTL 세포주의 기능적 입증.
도 6. SARS CoV-2 특이적 TCR-T 생성.
도 7A 내지 C. SARS-CoV-2 특이적 TCR-T의 기능적 입증. (A) 표적 세포를 용해시키는 SARS-CoV-2 특이적 TCR-T의 능력이 제시된다 (Cr51 방출 검정, CRA). 다양한 농도의 SARS-CoV-2 펩티드로 펄싱된 T2 세포를 표적으로서 사용하였다. 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 20:1이다. (B, C) 상이한 표적을 용해시키는 SARS-CoV-2 TCR-T의 능력이 제시된다 (CRA). eGFP 또는 SARS-Cov-2 전장 단백질을 과발현하는 A375, Mel624 세포주를 표적으로서 사용하였다.
도 8A 내지 L. 질량 분광법으로의 SARS-CoV-2 유래 HLA 부류-I 펩티드 확인. (A) HLA-I 펩티드 확인의 개략적 표시. 이뮤노펩티돔 및 프로테옴 분석의 MS/MS 스펙트럼을 스위스-프롯(Swiss-Prot) 인간 및 바이러스 단백질 데이터베이스에 대해 검색하고, 1% FDR에서 필터링하였다. (B) NSP13-400 펩티드 (VYIGDPAQL- 서열식별번호:37)에 대한 MS/MS 주석. (C 내지 E) NSP13-448 펩티드 (IVDTVSALVY - 서열식별번호:34), NSP13-242 펩티드 (TLVPQEHYV - 서열식별번호:35) 및 MGP-65 펩티드 (FVLAAVYRI - 서열식별번호:22)에 대한 PRM 분석. 각각의 표적화된 펩티드에 대한 MS1 XIC 면적 및 MS/MS를 스카이라인(Skyline) 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다. (F 내지 J) 인간을 감염시키는 것으로 공지된 모든 코로나바이러스에 대한 5종의 후보 펩티드 서열의 다중 서열 정렬. (K) 넥스트스트레인(Nextstrain) 프로젝트 (http://nextstrain.org)로부터 적응됨. 5종의 후보 SARS-CoV-2 펩티드 서열은 SARS-CoV-2 게놈의 보존된 영역에 위치하였다. (L) 4개의 돌연변이가 NSP13 단백질로부터 보고되었다: E341D, A368V (P.1 계통), K460R (B.1.1.7 계통) 및 T588I (B.1.351 계통). 하기 약어가 사용된다: VAR: 변이체, 점 (.)은 그 위치에서 동일한 아미노산을 지시한다.
도 9A 내지 G. 막 글리콜-단백질 (MGP) 유래 HLA-A0201 펩티드 MGP-65의 T 세포 생성 및 기능적 입증. (A) HLA-A0201 건강한 공여자로부터 유래된 성숙한 수지상 세포 (DC)를 MGP-65 펩티드 (FVLAAVYRI - 서열식별번호:22)로 펄싱하고, 자가 PBMC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, 작은 CD8+ 및 MGP-65 사량체+ 집단이 관찰되었다 (좌측). 이어서 CD8+ 및 MGP-65 사량체-양성 세포를 분류하고, 표준 급속 확장 프로토콜 (REP)을 사용하여 확장시켰다. 2주 동안 확장 후, 고 순도 CTL (90% 초과의 사량체+ 집단)이 생성되었다 (우측). (B) 다양한 농도의 MGP-65 펩티드로 펄싱된 51Cr 표지된 T2 세포를 MGP-65 특이적 CTL과 20:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비로 공동-배양하였다. MGP-65 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 51Cr 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (C, D) 51Cr 표지된 MGP 또는 GFP 강제 발현 HLA-A0201 세포주 A375 (A375-MGP, A375-GFP) 및 Mel624 (Mel624-MGP, Mel624-GFP)를 MGP-65 특이적 CTL과 다양한 E:T 비 (40:1 내지 1.25:1)로 공동-배양하였다. 상이한 표적에 대한 MGP-65 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (E, F) 저온 표적 억제 검정. 51Cr 표지된 A375-MGP 및 Mel624-MGP는 고온 표적으로서였다. MGP-65 펩티드 또는 M26 무관한 펩티드로 펄싱된 비-방사성표지된 T2 세포는 저온 표적으로서였다. 저온 표적: 고온 표적 비는 10:1 또는 20:1이었다. MGP-65 특이적 CTL을 단독으로 고온 표적 또는 저온 표적과 함께 고온 표적과 20:1 E: 고온 T 비로 공동-배양하였다. MGP-65 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (G) 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정. MGP-65 특이적 CTL을 MGP-65 펩티드 또는 M26 무관한 펩티드로 펄싱된 T2, 뿐만 아니라 A375-MGP, A375-GFP, Mel624-MGP, Mel624-GFP와 10:1 E:T 비로 브레펠딘(Brefeldin) A (BFA)의 존재 하에서 밤새 동안 공동-배양하였다. 인큐베이션 후, IFN-γ 및 TNF-α, 뿐만 아니라 TCR 경로 하류 활성화된 마커 CD137 및 CD69의 수준을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 10A 내지 G. 비-구조 단백질 NSP13 유래 HLA-A0201 펩티드 NSP13-242의 T 세포 생성 및 기능적 입증. (A) HLA-A0201 건강한 공여자로부터의 PBMC를 NSP13-242 펩티드 (TLVPQEHYV - 서열식별번호:35) 펄싱된 자가 DC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, CD8+ 및 NSP13-242 사량체-양성 T 세포가 유도되었다 (좌측). CD8+ 및 사량체+ T 세포를 분류하고, 이어서 REP로 2주 동안 확장시켜 고 순도의 NSP13-242 특이적 CTL을 생성하였다 (우측). (B) 다양한 농도의 NSP13-242 펩티드로 펄싱된 51Cr 표지된 T2 세포를 NSP13-242 특이적 CTL과 20:1 E:T 비로 공동-배양하였다. NSP13-242 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (C, D) 51Cr 표지된 NSP13 또는 GFP 강제 발현 HLA-A0201 세포주 A375 (A375-NSP13, A375-GFP) 및 Mel624 (Mel624-NSP13, Mel624-GFP)를 NSP13-242 특이적 CTL과 다양한 E:T 비 (40:1 내지 1.25:1)로 공동-배양하였다. 상이한 표적에 대한 NSP13-242 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (E, F) 저온 표적 억제 검정. 51Cr 표지된 A375-NSP13 및 Mel624-NSP13은 고온 표적으로서였다. NSP13-242 펩티드 또는 M26 무관한 펩티드로 펄싱된 비-방사성표지된 T2 세포는 저온 표적으로서였다. 저온 표적: 고온 표적 비는 10:1 또는 20:1이었다. NSP13-242 특이적 CTL을 단독으로 고온 표적 또는 저온 표적과 함께 고온 표적과 20:1 E: 고온 T 비로 공동-배양하였다. NSP13-242 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (G) 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정. NSP13-242 특이적 CTL을 NSP13-242 펩티드 또는 M26 무관한 펩티드로 펄싱된 T2, 뿐만 아니라 A375-NSP13, A375-GFP, Mel624-NSP13, Mel624-GFP와 10:1 E:T 비로 BFA의 존재 하에서 밤새 동안 공동-배양하였다. 인큐베이션 후, IFN-γ 및 TNF-α, 뿐만 아니라 TCR 경로 하류 활성화된 마커 CD137 및 CD69의 수준을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 11A 내지 G. 비-구조 단백질 NSP13 유래 HLA-A0101 펩티드 NSP13-448의 T 세포 생성 및 기능적 입증. (A) HLA-A0101 건강한 공여자로부터의 PBMC를 NSP13-448 펩티드 (VYIGDPAQL- 서열식별번호:37) 펄싱된 자가 DC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, CD8+ 및 NSP13-448 사량체-양성 T 세포가 유도되었다 (좌측). CD8+ 및 사량체+ T 세포를 분류하고, 이어서 REP로 2주 동안 확장시켜 고 순도의 NSP13-448 특이적 CTL을 생성하였다 (우측). (B) 다양한 농도의 NSP13-448 펩티드로 펄싱된 51Cr 표지된 A375 세포를 NSP13-448 특이적 CTL과 20:1 E:T 비로 공동-배양하였다. NSP13-448 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (C, D) 51Cr 표지된 NSP13 또는 GFP 강제 발현 HLA-A0101 세포주 A375 (A375-NSP13, A375-GFP) 및 RPMI-7951 (RPMI-7951-NSP13, RPMI-7951-GFP)을 NSP13-448 특이적 CTL과 다양한 E:T 비 (40:1 내지 1.25:1)로 공동-배양하였다. 상이한 표적에 대한 NSP13-448 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (E, F) 저온 표적 억제 검정. 51Cr 표지된 A375-NSP13 및 RPMI-7951-NSP13은 고온 표적으로서였다. NSP13-448 펩티드 또는 무관한 HLA-A0101 펩티드로 펄싱된 비-방사성표지된 A375 세포는 저온 표적으로서였다. 저온 표적: 고온 표적 비는 10:1 또는 20:1이었다. NSP13-448 특이적 CTL을 단독으로 고온 표적 또는 저온 표적과 함께 고온 표적과 20:1 E: 고온 T 비로 공동-배양하였다. NSP13-448 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (G) 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정. NSP13-448 특이적 CTL을 NSP13-448 펩티드 또는 무관한 HLA-A0101 펩티드로 펄싱된 A375, 뿐만 아니라 A375-NSP13, A375-GFP, RPMI-7951-NSP13, RPMI-7951-GFP와 10:1 E:T 비로 BFA의 존재 하에서 밤새 동안 공동-배양하였다. 인큐베이션 후, IFN-γ 및 TNF-α, 뿐만 아니라 TCR 경로 하류 활성화된 마커 CD137 및 CD69의 수준을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 12A 내지 E. 비-구조 단백질 NSP13 유래 HLA-A0301 펩티드 NSP13-134의 T 세포 생성 및 기능적 입증. (A) NSP13-134 펩티드 (KLFAAETLK - 서열식별번호:36) 펄싱된 DC를 HLA-A0301 건강한 공여자의 자가 PBMC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, CD8+ 및 NSP13-134 사량체-양성 T 세포가 유도되었다 (좌측). CD8+ 및 사량체+ T 세포를 분류하고, 이어서 REP로 2주 동안 확장시켜 고 순도의 NSP13-134 특이적 CTL을 생성하였다 (우측). (B) 다양한 농도의 NSP13-134 펩티드로 펄싱된 51Cr 표지된 HLA-A0301 세포주 Hs-578T를 NSP13-134 특이적 CTL과 20:1 E:T 비로 공동-배양하였다. NSP13-134 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (C) 51Cr 표지된 NSP13 또는 GFP 강제 발현 HLA-A0301 세포주 Hs-578T (Hs-578T-NSP13, Hs-578T-GFP)를 NSP13-134 특이적 CTL과 다양한 E:T 비 (40:1 내지 1.25:1)로 공동-배양하였다. 상이한 표적에 대한 NSP13-134 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (D) 저온 표적 억제 검정. 51Cr 표지된 Hs-578T-NSP13 세포는 고온 표적으로서였다. NSP13-134 펩티드 또는 무관한 HLA-A0301 펩티드로 펄싱된 비-방사성표지된 Hs-578T 세포는 저온 표적으로서였다. 저온 표적: 고온 표적 비는 10:1 또는 20:1이었다. NSP13-134 특이적 CTL을 단독으로 고온 표적 또는 저온 표적과 함께 고온 표적과 20:1 E: 고온 T 비로 공동-배양하였다. NSP13-134 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (E) 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정. NSP13-134 특이적 CTL을 NSP13-134 펩티드 또는 무관한 HLA-A0301 펩티드로 펄싱된 Hs-578T, 뿐만 아니라 Hs-578T-NSP13, Hs-578T-GFP와 10:1 E:T 비로 BFA의 존재 하에서 밤새 동안 공동-배양하였다. 인큐베이션 후, IFN-γ 및 TNF-α, 뿐만 아니라 TCR 경로 하류 활성화된 마커 CD137 및 CD69의 수준을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 13A 내지 G. 비-구조 단백질 NSP13 유래 HLA-A2402 펩티드 NSP13-400의 T 세포 생성 및 기능적 입증. (A) HLA-A2402 건강한 공여자로부터의 PBMC를 NSP13-400 펩티드 (VYIGDPAQL - 서열식별번호:37) 펄싱된 자가 DC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, CD8+ 및 NSP13-400 사량체-양성 T 세포가 유도되었다 (좌측). 2주로 CD8+ 및 사량체+ T 세포에 대한 분류 및 REP 후, 고 순도의 NSP13-400 특이적 CTL이 확장되었다 (우측). (B) 다양한 농도의 NSP13-400 펩티드로 펄싱된 51Cr 표지된 HLA-A2402 세포주 M14를 NSP13-400 특이적 CTL과 20:1 E:T 비로 공동-배양하였다. NSP13-400 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (C, D) 51Cr 표지된 NSP13 또는 GFP 강제 발현 HLA-A2402 세포주 Hs-578T (Hs-578T-NSP13, Hs-578T-GFP) 및 M14 (M14-NSP13, M14-GFP)를 NSP13-400 특이적 CTL과 다양한 E:T 비 (40:1 내지 1.25:1)로 공동-배양하였다. 상이한 표적에 대한 NSP13-400 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (E, F) 저온 표적 억제 검정. 51Cr 표지된 Hs-578T-NSP13 및 M14-NSP13은 고온 표적으로서였다. NSP13-400 펩티드 또는 무관한 HLA-A2402 펩티드로 펄싱된 비-방사성표지된 M14 세포는 저온 표적으로서였다. 저온 표적: 고온 표적 비는 10:1 또는 20:1이었다. NSP13-400 특이적 CTL을 단독으로 고온 표적 또는 저온 표적과 함께 고온 표적과 20:1 E: 고온 T 비로 공동-배양하였다. NSP13-242 특이적 CTL의 용해 능력을 표준 CRA로 검출하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (G) 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정. NSP13-400 특이적 CTL을 NSP13-400 펩티드 또는 무관한 HLA-A2402 펩티드로 펄싱된 M14, 뿐만 아니라 Hs-578T-NSP13, Hs-578T-GFP, M14-NSP13, M14-GFP와 10:1 E:T 비로 BFA의 존재 하에서 밤새 동안 공동-배양하였다. 인큐베이션 후, IFN-γ 및 TNF-α, 뿐만 아니라 TCR 경로 하류 활성화된 마커 CD137 및 CD69의 수준을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 14A 내지 E. MGP-65 펩티드 특이적 T 세포 수용체 조작된 T 세포 (TCR-T) 생성 및 기능적 입증. (A) FP2A 펩티드와 연결된 전장 MGP-65 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄를 레트로바이러스 벡터 pMSGV1 내로 삽입하고, 이어서 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 OKT3 활성화된 HLA-A0201 알로-PBMC를 감염시켰다. 감염 약 5일 후, CD8+ 및 MGP-65-사량체+ T 세포 집단을 유동 세포계측법에 의해 분석하였다 (중간). 이어서 CD8+ 및 MGP-65 사량체-양성 세포를 분류하고, REP로 확장시켰다. 2주 동안 확장 후, 고 순도 CTL (90% 초과의 사량체+ 집단)이 생성되었다 (우측). (B) MGP-65 특이적 TCR-T에 대한 펩티드 적정 검정. 다양한 농도의 MGP-65 펩티드로 펄싱된 51Cr 표지된 T2 세포를 MGP-65 특이적 TCR-T와 공동-배양하였다. MGP-65 특이적 TCR-T의 용해 수준을 표준 CRA로 분석하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (C, D) MGP-65 특이적 TCR-T에 대한 항원-특이적 세포용해 분석. 51Cr 표지된 A375-MGP, A375-GFP, Mel624-MGP 또는 Mel624-GFP를 MGP-65 특이적 TCR-T와 다양한 E:T 비로 공동-배양하였다. 상이한 표적에 대한 MGP-65 특이적 TCR-T의 용해 수준을 표준 CRA로 분석하였다. 데이터를 삼중실험의 평균으로서 제시하였다. (E) 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정. MGP-65 특이적 TCR-T를 MGP-65 펩티드 또는 M26 무관한 펩티드로 펄싱된 T2, 뿐만 아니라 A375-MGP, A375-GFP, Mel624-MGP, Mel624-GFP와 10:1 E:T 비로 BFA의 존재 하에서 밤새 동안 공동-배양하였다. 인큐베이션 후, IFN-γ 및 TNF-α, 뿐만 아니라 TCR 경로 하류 활성화된 마커 CD137 및 CD69의 수준을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 15. SARS-CoV-2 MHC 결합된 펩티드 확인 및 특이적 T 생성 작업흐름. SARS-CoV-2에 대한 항원 발견 플랫폼의 개략적 표시. (1) 고 빈도의 HLA 대립유전자를 갖는 SARS-CoV-2 구조 단백질 막 글리콜-단백질 (MGP) 및 비-구조 단백질 헬리카제 (NSP13) 유전자 강제 발현 세포주를 확립하였다. 이뮤노펩티돔 측정을 위해, 확장된 MGP 또는 NSP13 강제 발현 세포를 용해시키고, MHC 펩티드 복합체를 항-MHC 항체 (W6/32)로 면역침전시키고, 산으로 용리하였다. 이어서 용리된 MHC 결합된 펩티드를 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. (2) 내인성 T 세포 (ETC) 생성 작업흐름을 사용하여 펩티드-특이적 CTL을 생성하였다. (3) SARS-CoV-2 표적 인식으로의 생성된 SARS-CoV-2 특이적 CTL의 입증. (4) 특이적 CTL 입증에 기반한 SARS-CoV-2 기능적 T 세포 수용체 (TCR) 조작된 T 세포 (TCR-T)의 개발.
도 16. 예측된 SARS-CoV-2 HLA-A0201 제한된 펩티드에 대한 T 세포 생성 및 기능적 입증. 3종의 예측된 막 글리콜-단백질 (MGP) HLA-A0201 펩티드 MGP-53 (FLWLLWPVTL - 서열식별번호:63), MGP-56 (LLWPVTLACFV - 서열식별번호:67), MGP-89 (GLMWLSYFI - 서열식별번호:43), 및 4종의 예측된 스파이크 단백질 (SP) HLA-A0201 펩티드 SP-424 (KLPDDFTGCV - 서열식별번호:78), SP-821 (LLFNKVTLA - 서열식별번호:79), SP-983 (RLDKVEAEV - 서열식별번호:80), SP-995 (RLITGRLQSL - 서열식별번호:81)를 내인성 T 세포 (ETC) 생성 작업흐름을 사용하여 항원 특이적 T 세포 생성을 위해 선택하였다 (좌측). 항원 특이적-세포용해를 표적으로서 MGP, SP 또는 GFP 강제 발현 HLA-A0201 세포주 (A375-MGP, A375-SP, A375-GFP, Mel624-MGP, Mel624-GFP, SK-MEL-5-SP, SK-MEL-5-GFP)를 사용하여 표준 51Cr 방출 검정 (CRA)으로 분석하였다 (우측).
도 17. NSP13 예측된 HLA-A0301 펩티드에 대한 PRM 스크린. NSP13으로부터의 10종의 예측된 고 잠재성 HLA-A0301 결합 펩티드를 선택하고, PRM 방법에 의해 분석하였다.
도 18. ETC 작업흐름을 사용한 MGP-65 특이적 T 세포 생성. HLA-A0201 건강한 공여자로부터 유래된 성숙한 수지상 세포 (DC)를 MGP-65 펩티드 (FVLAAVYRI - 서열식별번호:22)로 펄싱하고, 1개의 48 웰 플레이트에서 자가 PBMC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, 개별적 웰 내의 CD8+ 및 MGP-65 사량체+ 집단을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 19. ETC 작업흐름을 사용한 NSP13-242 특이적 T 세포 생성. HLA-A0201 건강한 공여자로부터 유래된 성숙한 수지상 세포 (DC)를 NSP13-242 펩티드 (TLVPQEHYV - 서열식별번호:35)로 펄싱하고, 1개의 48 웰 플레이트에서 자가 PBMC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, 개별적 웰 내의 CD8+ 및 NSP13-242 사량체+ 집단을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 20. ETC 작업흐름을 사용한 NSP13-448 특이적 T 세포 생성. HLA-A0101 건강한 공여자로부터 유래된 성숙한 수지상 세포 (DC)를 NSP13-448 펩티드 (IVDTVSALVY - 서열식별번호:34)로 펄싱하고, 1개의 48 웰 플레이트에서 자가 PBMC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, 개별적 웰 내의 CD8+ 및 NSP13-134 사량체+ 집단을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 21. ETC 작업흐름을 사용한 NSP13-134 특이적 T 세포 생성. HLA-A0301 건강한 공여자로부터 유래된 성숙한 수지상 세포 (DC)를 NSP13-134 펩티드 (KLFAAETLK - 서열식별번호:36)로 펄싱하고, 1개의 48 웰 플레이트에서 자가 PBMC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, 개별적 웰 내의 CD8+ 및 NSP13-134 사량체+ 집단을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 22. ETC 작업흐름을 사용한 NSP13-400 특이적 T 세포 생성. HLA-A0201 건강한 공여자로부터 유래된 성숙한 수지상 세포 (DC)를 NSP13-400 펩티드 (VYIGDPAQL - 서열식별번호:37)로 펄싱하고, 1개의 48 웰 플레이트에서 자가 PBMC와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, 개별적 웰 내의 CD8+ 및 NSP13-400 사량체+ 집단을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 23. NSP13-134 펩티드 특이적 TCR-T 세포 생성. 전장 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄를 레트로바이러스 벡터 pMSGV3 내로 삽입하고, 이어서 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 PBMC를 감염시켰다. 감염 후, CD8+/사량체+ 집단을 유동 세포계측법에 의해 검출하였다. 사량체 가이드 분류 및 확장 후, 고도로 순수한 TCR-T 세포가 생성되었다.
도 24A 내지 C. NSP13-134 펩티드 특이적 TCR-T 세포의 표적 살해 검정. (A) 다양한 농도의 NSP13-134 펩티드로 펄싱된 T2 세포를 표적으로서 사용하였다. NSP13-134 특이적 TCR-T 세포의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. 사용된 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 20:1이었다. (B, C) GFP 또는 SARS-Cov-2 NSP13 펩티드의 강제된 발현을 갖는 SK-MES-1 (HLA-A0301+), Hs-578T (HLA-A0301+) 세포주를 표적으로서 사용하고, NSP13-134 특이적 TCR-T 세포와 공동-배양하였다. 사용된 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 40:1 내지 1.25:1이었다. 상이한 표적에 대한 NSP13-134 TCR-T 세포의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. NSP13-134 TCR-T 세포는 음성 대조군에 대해서보다 양성 표적에 대해 유의하게 더 높은 살해 수준을 나타낸다.
도 25. 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정으로의 NSP13-134 TCR-T 세포의 기능적 입증. NSP13-134 특이적 TCR-T 세포를 SK-MES-1+대조군 A0301 펩티드, SK-MES-1+NSP13-134, SK-MES-1-GFP, SK-MES-1-NSP13, Hs-578T-GFP 및 Hs-578T-NSP13과 공동-배양하였다 (E:T=10:1). 밤새 공동-배양한 후, TCR 경로 하류 활성화된 마커, CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α를 ICS 검정으로 검출하였다. NSP13-134 특이적 TCR-T의 CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α의 수준은 이들을 음성 대조군 표적에 비해 양성 표적과 공동-배양한 경우 유의하게 증진되었다.
도 26. NSP13-242 펩티드 특이적 TCR-T 세포 생성. 전장 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄를 레트로바이러스 벡터 pMSGV3 내로 삽입하고, 이어서 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 PBMC를 감염시켰다. 감염 후, CD8+/사량체+ 집단을 유동 세포계측법에 의해 검출하였다. 사량체 가이드 분류 및 확장 후, 고도로 순수한 TCR-T 세포가 생성되었다.
도 27A 내지 C. NSP13-242 펩티드 특이적 TCR-T 세포의 표적 살해 검정. (A) 다양한 농도의 NSP13-242 펩티드로 펄싱된 T2 세포를 표적으로서 사용하였다. NSP13-242 특이적 TCR-T 세포의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. 사용된 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 20:1이었다. (B, C) GFP 또는 SARS-Cov-2 NSP13의 강제된 발현을 갖는 A375 (HLA-A0201+), RPMI-7951 (HLA-A0201+) 세포주를 표적으로서 사용하고, NSP13-242 특이적 TCR-T 세포와 공동-배양하였다. 사용된 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 40:1 내지 1.25:1이었다. 상이한 표적에 대한 NSP13-242 TCR-T의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. NSP13-242 TCR-T는 음성 대조군에 대해서보다 양성 표적에 대해 유의하게 더 높은 살해 수준을 나타내었다.
도 28. 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정으로의 NSP13-242 TCR-T의 기능적 입증. NSP13-242 특이적 TCR-T 세포를 T2+M26, T2+NSP13-242, A375-GFP, A375-NSP13, RPMI-7951-GFP 및 RPMI-7951-NSP13과 공동-배양하였다 (E:T=10:1). 밤새 공동-배양한 후, TCR 경로 하류 활성화된 마커, CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α를 ICS 검정으로 검출하였다. NSP13-242 특이적 TCR-T 세포의 CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α의 수준은 이들을 음성 대조군 표적에 비해 양성 표적과 공동-배양한 경우 유의하게 증진되었다.
도 29. NSP13-400 항원 특이적 TCR-T 세포 생성. 알파 쇄 및 베타 쇄 TCR 유전자를 NSP13-400 특이적 CTL 세포주 중 하나로부터 클로닝하였다. 전장 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄를 레트로바이러스 벡터 pMSGV3 내로 삽입하고, 이어서 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 PBMC를 감염시켰다. 감염 후, CD8+/사량체+ 및 CD4+/사량체+ 집단 둘 다가 관찰되었다. 사량체 가이드 분류 및 확장 후, 고 순도의 CD8+ 및 CD4+ TCR-T 세포가 생성되었다.
도 30A 내지 F. 살해 검정으로의 MGP-65 특이적 TCR-T 세포의 특이성의 입증. (A, D) 다양한 농도의 NSP13-400 펩티드로 펄싱된 M14 세포를 표적으로서 사용하였다. NGP13-400 CD8+ 및 CD4+ 특이적 TCR-T 세포의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 20:1이다. (B, C, E, F) GFP 또는 SARS-Cov-2 NSP13의 강제된 발현을 갖는 Hs-578T (HLA-A2402+), M14 (HLA-A2402+) 세포주를 표적으로서 사용하고, NSP13-400 특이적 TCR-T 세포와 공동-배양하였다. 사용된 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 40:1 내지 1.25:1이었다. 상이한 표적에 대한 NSP13-400 특이적 TCR-T 세포의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다.
도 31. 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정으로의 NSP13-400 TCR-T의 기능적 입증. NSP13-400 특이적 CD8+ 및 CD4+ TCR-T를 M14+대조군 펩티드, M14+NSP13-400, Hs-578T-GFP, Hs-578T-NSP13, M14-GFP 및 M14-NSP13과 공동-배양하였다 (E:T=10:1). 밤새 공동-배양한 후, TCR 경로 하류 활성화된 마커, CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α를 ICS 검정으로 검출하였다. NSP13-400 특이적 CTL 세포주의 CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α의 수준은 이들을 음성 대조군 표적에 비해 양성 표적과 공동-배양한 경우 유의하게 증진되었다.
도 32. NSP13-448 펩티드 특이적 TCR-T 세포 생성. 전장 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄를 레트로바이러스 벡터 pMSGV3 내로 삽입하고, 이어서 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 PBMC를 감염시켰다. 감염 후, CD8+/사량체+ 집단을 유동 세포계측법에 의해 검출하였다. 사량체 가이드 분류 및 확장 후, 고 순도의 TCR-T 세포가 생성되었다.
도 33A 내지 C. NSP13-448 펩티드 특이적 TCR-T 세포의 표적 살해 검정. (A) 다양한 농도의 NSP13-448 펩티드로 펄싱된 A375 세포를 표적으로서 사용하였다. NSP13-448 특이적 TCR-T의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 20:1이다. (B, C) GFP 또는 SARS-Cov-2 NSP13을 강제 발현하는 A375 (HLA-A0101+), RPMI-7951 (HLA-A0101+) 세포주를 표적으로서 사용하고, NSP13-448 특이적 TCR-T와 공동-배양하였다. 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 40:1 내지 1.25:1이다. 상이한 표적에 대한 NSP13-448 TCR-T의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. NSP13-448 TCR-T는 음성 대조군보다 양성 표적에 대해 유의하게 더 높은 살해 수준을 나타낸다.
도 34. 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정으로의 NSP13-448 TCR-T 세포의 기능적 입증. NSP13-448 특이적 TCR-T를 A375+대조군 A0101 펩티드, A375+NSP13-448, A375-GFP, A375-NSP13, RPMI-7951-GFP 및 RPMI-7951-NSP13과 공동-배양하였다 (E:T=10:1). 밤새 공동-배양한 후, TCR 경로 하류 활성화된 마커, CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α를 ICS 검정으로 검출하였다. NSP13-448 특이적 TCR-T의 CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α의 수준은 이들을 음성 대조군 표적에 비해 양성 표적과 공동-배양한 경우 유의하게 증진되었다.
SARS-CoV-2 감염은 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 다를 유발한다. SARS-CoV-2에 의해 유발되는 질환인 COVID19의 예방 및 치료를 위해, 회복 및 면역-보호를 매개하는데 있어서 체액성 반응보다 더 중요하지는 않더라도, 그와 동등하게 T 세포 반응이 중요함이 점점 더 명백해졌다. 감염성 및 악성 질환에 대한 T 세포-기반 요법을 개발하는데 있어서 주요한 난제 중 하나는 유의미한 T 세포 반응을 유발할 수 있는 면역원성 에피토프의 확인이었다. 전통적으로, 이는 결합 친화도 및 컨센서스 데이터로부터 추론된 추정적 에피토프르 예측하는 정교한 인 실리코 방법을 사용하여 달성되었다. 본 발명자들은 이 방식으로 정의된 '면역우세' SARS-CoV-2 펩티드가 천연적으로 제시된 SARS-CoV-2 에피토프를 인식하는 T 세포 반응을 유발하는데 실패할 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 SARS-CoV-2에 대한 면역원성 에피토프가 천연적으로-프로세싱된 펩티드-MHC 복합체로부터 용리된 펩티드를 직접적으로 분석하고, 이어서 이러한 펩티드가 SARS-CoV-2 항원-발현 세포를 인식하는 T 세포를 유발할 수 있는지를 결정하는 것에 의해 면역원성을 입증함으로써 경험적으로 가장 잘 정의된다고 상정하였다. 탠덤 질량 분광법 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 최근에 인식된 변이체를 포함하는 SARS-CoV-2 균주 중에서 고도로 보존된 영역에서 구조적 뿐만 아니라 비-구조적 유전자로부터 유래된 SARS-CoV-2의 에피토프를 확인하였다. 마지막으로, 재조합 벡터 내로 조작되는 경우, SARS-CoV-2 표적 세포를 인식하고 살해하도록 T 세포 특이성을 재지정할 수 있는 TCR 서열은 보고되어 있지 않다. 본 발명자들은 MHC-용리된 펩티드의 질량-분광법적 분석에 의해 정의된 몇몇 신규한 SARS-CoV-2 에피토프가 그들의 면역원성에 대한 경험적 증거를 제공하고, 조작된 TCR-재지정된 살해를 입증함을 여기에서 최초로 보고한다.
본원에 기재된 펩티드는 SARS-Cov-2 감염 (COVID19)을 갖는 환자의 면역반응을 검출하는데 또는 백신접종을 위해 사용될 수 있다. 이는 COVID19 면역의 보다 나은 이해를 초래할 것이고, COVID19를 갖는 환자의 관리에 직접적으로 영향을 줄 것이며, 백신의 면역반응의 평가를 허용할 것이다. 더욱이, 이 펩티드 세포독성 T 세포 및 조작된 TCR은 HLA-매칭된 표적에 대한 SARS-Cov-2 특이적 T 세포를 생성하고, 따라서 COVID19 질환을 갖는 환자를 위한 기성 T 세포 요법을 제공하는데 사용될 수 있다.
I. 본 개시내용의 펩티드를 사용한 면역요법
본원에 기재된 바와 같은 펩티드 (예를 들어, 서열식별번호:22 내지 81의 펩티드)는 바이러스 감염을 치료하기 위한 면역요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드는 상기 펩티드를 인식하거나 또는 이에 결합하는 T 세포의 증식을 유도하기 위해 T 세포의 집단과 접촉되거나 또는 이를 자극하는데 사용될 수 있다. 다른 측면에서, 본 개시내용의 펩티드는 SARS-Cov-2 감염에 대한 대상체의 면역 반응을 증진시키기 위해 대상체, 예컨대 인간 환자에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 펩티드는 능동 면역요법 (예를 들어, 백신) 또는 수동 면역요법 (예를 들어, 입양 면역요법)에 포함될 수 있다. 능동 면역요법은 대상체를 정제된 펩티드 항원 또는 면역우세 펩티드 (천연 또는 변형된)로 면역화하는 것을 포함하고; 대안적으로, 본 개시내용의 펩티드로 펄싱된 (또는 펩티드를 포함하는 항원을 코딩하는 유전자로 형질감염된) 항원 제시 세포가 대상체에게 투여될 수 있다. 펩티드는 변형되거나 또는 1개 이상의 돌연변이, 예컨대, 예를 들어, 치환 돌연변이를 함유할 수 있다. 수동 면역요법은 입양 면역요법을 포함한다. 입양 면역요법은 일반적으로 세포를 대상체에게 투여하는 것을 수반하고, 여기서 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포)는 본 개시내용의 펩티드에 대해 시험관내에서 감작화되었다 (예를 들어, US 7910109를 참조한다).
일부 측면에서, 유동 세포계측법은 예를 들어, 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)-기반 증식 검정과 조합으로 T-세포 수용체 (TCR) Vβ 항체를 사용함으로써 인간 종양 항원-특이적 T-세포 클론의 급속 단리를 위한 입양 면역요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 모든 목적을 위해 참조로 포함되는 문헌 [Lee et al., J. Immunol. Methods, 331:13-26, 2008]을 참조한다. 일부 측면에서, 사량체-가이드 세포 분류, 예컨대, 예를 들어, 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Pollack, et al., J Immunother Cancer. 2014; 2: 36]에 기재된 방법이 사용될 수 있다. 다양한 배양 프로토콜은 또한 입양 면역요법에 대해 공지되어 있으며, 본 개시내용의 측면에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 항원 제시 세포의 사용을 요구하지 않는 조건에서 배양될 수 있다 (예를 들어, 참조로 포함되는 문헌 [Hida et al., Cancer Immunol. Immunotherapy, 51:219-228, 2002]). 다른 측면에서, T 세포는 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포를 이용하는 배양 조건 하에서 확장될 수 있고 (Nestle et al., 1998, 본원에 참조로 포함됨), 일부 측면에서 인공 항원 제시 세포가 이 목적을 위해 사용될 수 있다 (Maus et al., 2002, 참조로 포함됨). 본 개시내용의 측면에 사용될 수 있는 입양 면역요법을 위한 추가의 방법은 참조로 포함되는 문헌 [Dudley et al. (2003)]에 개시되어 있다. 다양한 방법은 공지되어 있으며, 인간 항원-특이적 T 세포를 클로닝하고 확장시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Riddell et al., 1990]을 참조한다).
특정 측면에서, 하기 프로토콜은 본 개시내용의 펩티드를 선택적으로 인식하는 T 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 펩티드-특이적 T-세포주는 이전에 보고된 방법을 사용하여 정상 공여자 또는 HLA-제한된 정상 공여자 및 환자로부터 생성될 수 있다 (Hida et al., 2002). ENREF 32 간략하게, PBMC (1 × 105개의 세포/웰)를 약 200 μl의 배양 배지에서 96-웰, U-바닥-미세배양 플레이트 (코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated), 미국 매사추세츠주 로웰)에서 약 10 μg/ml의 각각의 펩티드로 사중으로 자극할 수 있다. 배양 배지는 50% AIM-V 배지 (인비트로젠(Invitrogen)), 50% RPMI1640 배지 (인비트로젠), 10% 인간 AB 혈청 (밸리 바이오메디칼(Valley Biomedical), 미국 버지니아주 윈체스터), 및 100 IU/ml의 인터류킨-2 (IL-2)로 이루어질 수 있다. 세포를 상응하는 펩티드로 약 3일마다 재자극할 수 있다. 5회의 자극 후, 각각의 웰로부터의 T 세포를 세척하고, 상응하는 펩티드의 존재 또는 부재 하에서 T2 세포와 인큐베이션할 수 있다. 약 18시간 후, 인터페론 (IFN)-γ의 생산을 ELISA에 의해 상청액에서 결정할 수 있다. 다량의 IFN-γ를 분비하는 T 세포를 급속 확장 프로토콜에 의해 추가로 확장시킬 수 있다 (Riddell et al., 1990; Yee et al., 2002b).
일부 측면에서, 면역요법은 세포 투과인자, 예컨대 리포솜 또는 세포 투과 펩티드 (CPP)와 회합된 본 개시내용의 펩티드를 이용할 수 있다. 펩티드로 펄싱된 항원 제시 세포 (예컨대 수지상 세포)는 항종양 면역을 증진시키는데 사용될 수 있다 (Celluzzi et al., 1996; Young et al., 1996). 리포솜 및 CPP는 하기에 추가로 상세하게 기재된다. 일부 측면에서, 면역요법은 본 개시내용의 펩티드를 코딩하는 핵산을 이용할 수 있고, 여기서 핵산은 예를 들어, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터에서 전달된다.
II. 세포 투과 펩티드
본 개시내용의 펩티드는 또한 세포 투과 펩티드 (CPP)와 회합되거나 또는 그에 공유 결합될 수 있다. 본 개시내용의 펩티드에 공유 결합될 수 있는 세포 투과 펩티드는 예를 들어, HIV Tat, 헤르페스 바이러스 VP22, 드로소필라(Drosophila) 안텐나페디아(Antennapedia) 호메오박스 유전자 생성물, 신호 서열, 융합 서열, 또는 프로테그린 I을 포함한다. 펩티드를 CPP에 공유 결합시키는 것은 수지상 세포에 의한 펩티드의 제시를 연장시키고, 따라서 항종양 면역을 증진시킬 수 있다 (Wang and Wang, 2002). 일부 측면에서, 본 개시내용의 펩티드 (예를 들어, 펩티드 또는 폴리에피토프 스트링 내에 포함됨)는 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해) CPP에 공유 결합되어 융합 단백질을 생성할 수 있다. 다른 측면에서, 본 개시내용에 따른 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산은 리포솜, 예컨대 다층판성, 소포성, 또는 다소포성 리포솜 내에 캡슐화되거나 또는 그와 회합될 수 있다.
본원에 사용된 "회합"은 물리적 회합, 화학적 회합 또는 둘 다를 의미한다. 예를 들어, 회합은 공유 결합, 소수성 상호작용, 캡슐화, 표면 흡착 등을 수반할 수 있다.
본원에 사용된 "세포 투과인자"는 항원 제시 세포에의 펩티드/폴리에피토프 스트링의 세포내 전달을 증진시키는 조성물 또는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 세포 투과인자는 펩티드와 회합되는 경우 혈장 막을 횡단하는 그의 능력을 증진시키는 지질일 수 있다. 대안적으로, 세포 투과인자는 펩티드일 수 있다. 세포 투과 펩티드 (CPP)는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, HIV의 Tat 단백질 (Frankel and Pabo, 1988), HSV의 VP22 단백질 (Elliott and O'Hare, 1997) 및 섬유모세포 성장 인자 (Lin et al., 1995)를 포함한다.
세포-투과 펩티드 (또는 "단백질 형질도입 도메인")는 드로소필라 안텐나페디아 호메오박스 유전자 (Antp), HIV Tat, 및 헤르페스 바이러스 VP22의 제3나선으로부터 확인되었으며, 이들 모두는 아르기닌 및 리신 잔기에 대해 풍부화된 양으로 하전된 도메인을 함유한다 (Schwarze et al., 2000; Schwarze et al., 1999). 또한, 신호 서열로부터 유래된 소수성 펩티드는 세포-투과 펩티드로서 확인되었다. (Rojas et al., 1996; Rojas et al., 1998; Du et al., 1998). 이들 펩티드를 마커 단백질, 예컨대 β-갈락토시다제에 커플링시키는 것은 세포 내로의 마커 단백질의 효율적인 내재화를 부여하는 것으로 제시되었으며, 이들 펩티드를 함유하는 키메라, 프레임내 융합 단백질은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 폭넓은 스펙트럼의 세포 유형에 단백질을 전달하는데 사용되었다 (Drin et al., 2002). 본 개시내용의 펩티드에의 이들 세포 투과 펩티드의 융합은 폴리펩티드의 세포 흡수를 증진시킬 수 있다.
일부 측면에서, 세포 흡수는 폴리펩티드에의 지질, 예컨대 스테아레이트 또는 미리스틸레이트의 부착에 의해 용이하게 된다. 지질화는 세포 내로의 펩티드의 통과를 증진시키는 것으로 제시되었다. 지질 모이어티의 부착은 본 발명이 세포에 의한 폴리펩티드 흡수를 증가시키는 또 다른 방식이다.
본 개시내용의 펩티드는 리포솜 백신 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 리포솜 조성물은 프로테오리포솜 조성물이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 프로테오리포솜 조성물을 생산하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Neelapu et al. (2007)] 및 [Popescu et al. (2007)]에 기재되어 있다. 일부 측면에서, 프로테오리포솜 조성물은 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩티드의 흡수를 증진시킴으로써, 치료를 위해 요구되는 단백질 또는 펩티드의 양을 감소시키는 것이 가능할 수 있다. 이는 다시 치료의 비용을 유의하게 감소시키고, 치료 작용제의 공급을 증가시킬 수 있다. 보다 낮은 투여량은 또한 펩티드의 잠재적인 면역원성을 최소화하고, 독성 부작용을 제한할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 펩티드는 나노입자와 회합되어 나노입자-폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있다. 일부 측면에서, 나노입자는 리포솜 또는 다른 지질-기반 나노입자, 예컨대 지질-기반 소포 (예를 들어, DOTAP:콜레스테롤 소포)이다. 다른 측면에서, 나노입자는 철-산화물 기반 초상자성 나노입자이다. 약 10 내지 100 nm의 직경 범위의 초상자성 나노입자는 비장에 의한 격리를 회피하는데 충분히 작지만, 간에 의한 청소를 회피하는데 충분히 크다. 이 크기의 입자는 매우 작은 모세관을 투과할 수 있으며, 신체 조직에서 효과적으로 분포될 수 있다. 초상자성 나노입자-폴리펩티드 복합체는 펩티드를 흡수하는 세포를 확인하고 추적하는 MRI 조영제로서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 나노입자는 반도체 나노결정 또는 반도체 양자 점이며, 이들 둘 다는 광학 영상화에 사용될 수 있다. 추가의 측면에서, 나노입자는 실리카의 코어 위에 금 층을 포함하는 나노쉘일 수 있다. 나노쉘의 한 가지 이점은 폴리펩티드가 표준 화학을 사용하여 금 층에 접합될 수 있다는 것이다. 다른 측면에서, 나노입자는 풀러렌 또는 나노튜브일 수 있다 (Gupta et al., 2005).
펩티드는 신장에 의해 순환으로부터 급속하게 제거되며, 혈청에서 프로테아제에 의한 분해에 민감성이다. 펩티드를 나노입자와 회합시킴으로써, 본 발명의 나노입자-폴리펩티드 복합체는 분해에 대해 보호되고/거나 신장에 의한 청소를 감소시킬 수 있다. 이는 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키고, 그에 의해 유효한 요법에 필요한 폴리펩티드 용량을 감소시킬 수 있다. 또한, 이는 치료의 비용을 감소시킬 수 있고, 면역학적 문제 및 요법의 독성 반응을 최소화한다.
III. 폴리에피토프 스트링
일부 측면에서, 펩티드는 폴리에피토프 스트링에 포함되거나 또는 포함된다. 폴리에피토프 스트링은 함께 연결된 1개 이상의 항원으로부터의 복수개의 항원성 에피토프를 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 폴리에피토프 스트링은 대상체, 예컨대 인간 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 폴리에피토프 스트링은 이전에 말라리아 및 다른 병원체를 표적화하는데 사용되었다 (Baraldo et al., 2005; Moorthy et al., 2004; Baird et al., 2004). 폴리에피토프 스트링은 핵산 (예를 들어, 본 개시내용의 펩티드를 포함하는 복수개의 항원을 코딩하는 핵산) 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 본 개시내용의 펩티드를 포함하는 복수개의 항원을 함유함)를 지칭할 수 있다. 폴리에피토프 스트링은 백신 조성물에 포함될 수 있다.
IV. 항원성 펩티드의 적용
다양한 측면은 특정 바이러스 감염을 치료하고 예방하는데 유용한 항원성 펩티드의 개발 및 용도에 관한 것이다. 많은 측면에서, 항원성 펩티드는 화학적 합성에 의해 또는 숙주 세포에서의 분자적 발현에 의해 생산된다. 펩티드는 정제되고, 펩티드 면역원성을 결정하는 검정, T 세포에 의한 인식을 결정하는 검정, 바이러스 감염의 치료를 위한 펩티드 백신, T 세포의 변형된 TCR의 개발, 및 항체의 개발을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 적용에 이용될 수 있다.
펩티드는 다수의 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 한 통상적인 방법은 고상 펩티드 합성 (SPPS)을 사용하는 것이다. 일반적으로, SPPS는 c-말단에서 n-말단으로 펩티드를 만들어가는 교대 N-말단 탈보호 및 커플링 반응의 사이클을 반복함으로써 수행된다. 제1 아미노산의 c-말단을 수지에 커플링시키고, 여기서 이어서 아민을 사용중단시키고, 이어서 제2 아미노산의 유리 산과 커플링시킨다. 이 사이클은 펩티드가 합성될 때까지 반복된다.
펩티드는 또한 분자 툴 및 숙주 세포를 이용하여 합성될 수 있다. 항원성 펩티드와 상응하는 핵산 서열이 합성될 수 있다. 일부 측면에서, 합성 핵산은 시험관내 합성기 (예를 들어, 포스포르아미다이트 합성기), 박테리아 재조합 시스템, 또는 다른 적합한 방법에서 합성된다. 더욱이, 합성된 핵산은 정제되고 동결건조되거나, 또는 생물학적 시스템 (예를 들어, 박테리아, 효모)에서 저장되어 유지될 수 있다. 생물학적 시스템에 사용하기 위해, 합성 핵산 분자는 플라스미드 벡터, 또는 유사한 것 내로 삽입될 수 있다. 플라스미드 벡터는 또한 발현 벡터일 수 있고, 여기서 적합한 프로모터 및 적합한 3'-폴리A 꼬리는 전사체 서열과 조합된다.
측면은 또한 항원성 펩티드 또는 단백질을 생산하는 발현 벡터 및 발현 시스템에 관한 것이다. 이들 발현 시스템은 적합한 발현 시스템에서 전사체 및 단백질을 발현하는 발현 벡터를 혼입할 수 있다. 전형적인 발현 시스템은 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 곤충 (예를 들어, SF9), 효모 (예를 들어, 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)), 동물 (예를 들어, CHO), 또는 인간 (예를 들어, HEK 293) 세포주를 포함한다. RNA 및/또는 단백질 분자는 표준 생명공학 생산 절차를 사용하여 이들 시스템으로부터 정제될 수 있다.
면역원성 및/또는 TCR 결합을 결정하는 검정이 수행될 수 있다. 한 예는 덱스트라머 유동 세포계측법 검정이다. 일반적으로, 주문-제작 HLA-매칭된 MHC 부류 I 덱스트라머:펩티드 (pMHC) 복합체가 개발되어 있거나 또는 구입된다 (이뮤덱스(Immudex), 덴마크 코펜하겐). 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 종양-침윤 림프구 (TIL)로부터의 T 세포를 pMHC 복합체와 인큐베이션하고, 염색하고, 이어서 이를 유동 세포계측기를 통해 실행하여 펩티드가 T 세포의 TCR에 결합할 수 있는지를 결정한다.
본 개시내용의 펩티드는 또한 펩티드에 결합하는 T-세포 수용체를 단리하고/거나 확인하는데 사용될 수 있다. T-세포 수용체는 디술피드 결합에 의해 연결된, T-세포 수용체 α (TCRα) 및 β (TCRβ) 쇄로 용어화되는 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 이들 α:β 이종이량체는 구조에 있어서 이뮤노글로불린 분자의 Fab 단편과 매우 유사하며, 이들은 대부분의 T 세포에 의한 항원 인식을 처리한다. 소수의 T 세포는 γ 및 δ로 지정된 폴리펩티드 쇄의 상이한 쌍으로 구성된 대안적이지만 구조적으로 유사한 수용체를 보유한다. T-세포 수용체의 둘 다의 유형은 B-세포 수용체로서 역할을 하는 막-결합된 이뮤노글로불린과는 상이하다: T-세포 수용체는 단지 1개의 항원-결합 부위를 갖는 반면, B-세포 수용체는 2개를 가지며, T-세포 수용체는 결코 분비되지 않는 반면, 이뮤노글로불린은 항체로서 분비될 수 있다.
T-세포 수용체의 둘 다의 쇄는 이뮤노글로불린 V 도메인과 상동성을 갖는 아미노-말단 가변 (V) 영역, 이뮤노글로불린 C 도메인과 상동성을 갖는 불변 (C) 영역, 및 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 함유하는 짧은 힌지 영역을 갖는다. 각각의 쇄는 소수성 막횡단 도메인에 의해 지질 이중층에 걸쳐 있으며, 짧은 세포질 꼬리에서 종료한다.
T-세포 수용체의 3차원 구조는 결정되었다. 구조는 사실 항체 Fab 단편의 그것과 유사한데, 이는 이를 코딩한 유전자에 대한 초기 연구로부터 의심된 바와 같다. T-세포 수용체 쇄는 Fab 단편의 그것들과 매우 동일한 방식으로 폴딩되지만, 최종 구조는 약간 더 짧고 더 넓게 보인다. 그러나, T-세포 수용체 및 Fab 단편 사이에 일부 뚜렷한 차이가 있다. 가장 현저한 차이는 폴딩이 임의의 다른 이뮤노글로불린-유사 도메인의 그것과는 같지 않은 Cα 도메인에 있다. Cβ 도메인과 병치된 도메인의 절반은 다른 이뮤노글로불린-유사 도메인에서 발견되는 것과 유사한 β 쉬트를 형성하지만, 도메인의 다른 절반은 느슨하게 패킹된 가닥 및 α 나선의 짧은 절편으로 형성된다. 이뮤노글로불린-유사 도메인에서 통상적으로 2개의 β 가닥을 연결시키는 분자내 디술피드 결합은, Cα 도메인에서 β 가닥을 α 나선의 이 절편에 연결시킨다.
또한 도메인이 상호작용하는 방식에는 차이가 있다. 둘 다의 T-세포 수용체 쇄의 V 및 C 도메인 사이의 계면은 항체에서보다 더 광범위하며, 이는 도메인 사이의 힌지 연결을 덜 유연성으로 만든다. 그리고 Cα 및 Cβ 도메인 사이의 상호작용은 탄수화물에 의해 보조됨에 있어서 독특하며, Cα 도메인으로부터의 당 기는 Cβ 도메인에의 다수의 수소 결합을 만든다. 마지막으로, 가변 결합 부위의 비교는, 상보성-결정 영역 (CDR) 루프가 항체 분자의 그것들과 꽤 가깝게 정렬되지만, 항체 분자의 그것들에 비해 일부 변위가 있음을 제시한다. 이 변위는 도메인의 한 면으로부터의 루프의 한 단부를 다른 것에 고착시키는 β 가닥의 이동의 결과로서, 항체 V 도메인에서의 등가의 루프에 대략 직각으로 배향되는 Vα CDR2 루프에서 특히 현저하다. 가닥 변위는 또한 그의 구조가 공지된 7개의 Vβ 도메인 중 2개에서 Vβ CDR2 루프의 배향의 변화를 유발한다. 이제까지, 7개의 T-세포 수용체의 결정학적 구조는 이 해상도의 수준까지 해결되었다.
본 개시내용의 측면은 본 개시내용의 펩티드, 예컨대 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드에 결합하는 조작된 T 세포 수용체에 관한 것이다. 용어 "조작된"은 본 개시내용의 펩티드 및 항원에 결합하는 키메라 폴리펩티드를 만드는 TCR 불변 영역 상으로 그라프팅된 TCR 가변 영역을 갖는 T 세포 수용체를 지칭한다. 특정 측면에서, TCR은 클로닝, 증진된 발현, 검출을 위해, 또는 구축물의 치료 제어을 위해 사용되지만, 내인성 TCR에는 존재하지 않는 개재 서열, 에컨대 다중 클로닝 부위, 링커, 힌지 서열, 변형된 힌지 서열, 변형된 막횡단 서열, 검출 폴리펩티드 또는 분자, 또는 TCR을 포함하는 세포의 선택 또는 스크리닝을 허용할 수 있는 치료 제어를 포함한다.
일부 측면에서, TCR은 비-TCR 서열을 포함한다. 따라서, 특정 측면은 TCR 유전자로부터의 것이 아닌 서열을 갖는 TCR에 관한 것이다. 일부 측면에서, TCR은, 그것이 TCR 유전자에서 통상적으로 발견되는 서열을 함유하지만, 자연에서 반드시 함께 발견되지는 않는 적어도 2개의 TCR 유전자로부터의 서열을 함유한다는 점에서, 키메라이다.
V. 항체
본 개시내용의 측면은 본 개시내용의 펩티드, 또는 그의 단편을 표적화하는 항체에 관한 것이다. 용어 "항체"는 표적 항원에의 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소형의 무손상 이뮤노글로불린, 또는 그의 단편을 지칭하며, 키메라, 인간화, 완전히 인간, 및 이중특이적 항체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체" 또는 "이뮤노글로불린"은 상호교환가능하게 사용되며, IgG, IgD, IgE, IgA, IgM을 포함하는, 동물의 면역 반응의 일부로서 기능하는 구조적으로 관련된 단백질의 임의의 몇몇 부류, 및 관련된 단백질, 뿐만 아니라 항원-결합 활성을 보유하는 항체 CDR 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "항원"은 선택적 결합제, 예컨대 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다. 항원은 상이한 항체와 상호작용할 수 있는 1개 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "에피토프"는 이뮤노글로불린에 또는 T-세포 수용체에 결합함으로써 면역 반응을 유발할 수 있는 분자의 임의의 영역 또는 부분을 포함한다. 에피토프 결정자는 화학적으로 활성인 표면 기, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐 기를 포함할 수 있고, 특이적 3차원 구조적 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정한 표적 항원에 대해 특이적인 항체는 복합체 혼합물 내의 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
주어진 폴리펩티드의 에피토프 영역은 x-선 결정학, 핵 자기 공명 분광법, 부위-지정 돌연변이유발 맵핑, 단백질 제시 어레이를 포함하는 관련 기술분야에 널리 공지된 많은 상이한 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있으며, 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, (Johan Rockberg and Johan Nilvebrant, Ed., 2018) Humana Press, New York, N.Y.]을 참조한다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,708,871; 문헌 [Geysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al. Molec. Immunol. 23:709-715 (1986)]에 기재되어 있다. 추가로, 단백질의 항원성 영역은 또한 표준 항원성 및 소수성 플롯을 사용하여 예측되고 확인될 수 있다.
용어 "면역원성 서열"은 분자가 적절한 숙주에서 항체의 생산을 자극할 수 있도록 적어도 1개의 에피토프의 아미노산 서열을 포함하는 분자를 의미한다. 용어 "면역원성 조성물"은 적어도 1개의 면역원성 분자 (예를 들어, 항원 또는 탄수화물)를 포함하는 조성물을 의미한다.
무손상 항체는 일반적으로 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄로 구성되지만, 일부 경우에, 예컨대 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타과에서 천연 발생하는 항체는 보다 적은 쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 항체는 단지 단일 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 "키메라"일 수 있으며, 즉, 항체의 상이한 부분이 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 가변 또는 CDR 영역은 래트 또는 뮤린 공급원으로부터 유래될 수 있는 반면, 불변 영역은 상이한 동물 공급원, 예컨대 인간으로부터 유래된다. 항체 또는 결합 단편은 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는 그의 유도체, 변이체, 단편, 및 뮤테인을 포함하며, 그의 예는 하기에 기재되어 있다 (Sela-Culang et al., Front Immunol. 2013; 4: 302; 2013).
용어 "경쇄"는 결합 특이성을 부여하는 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 그의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 대략 25,000 달톤의 분자량을 가지며, 가변 영역 도메인 (본원에서 VL로 약칭됨), 및 불변 영역 도메인 (본원에서 CL로 약칭됨)을 포함한다. 카파 (κ) 및 람다 (λ)로서 확인되는 경쇄의 2가지 분류가 있다. 용어 "VL 단편"은 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 모노클로날 항체의 경쇄의 단편을 의미한다. VL 단편은 경쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함할 수 있다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다.
용어 "중쇄"는 결합 특이성을 부여하는 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 그의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 대략 50,000 달톤의 분자량을 가지며, 가변 영역 도메인 (본원에서 VH로 약칭됨), 및 3개의 불변 영역 도메인 (본원에서 CH1, CH2, 및 CH3으로 약칭됨)을 포함한다. 용어 "VH 단편"은 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 모노클로날 항체의 중쇄의 단편을 의미한다. VH 단편은 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역 도메인의 수는 이소형에 좌우될 것이다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, CH 도메인은 카르복시-말단에 있으며, CH3은 -COOH 단부와 가장 가깝다. 항체의 이소형은 IgM, IgD, IgG, IgA, 또는 IgE일 수 있고, 5개의 분류가 존재하는 중쇄에 의해 정의된다: 각각 뮤 (μ), 델타 (δ), 감마 (γ), 알파 (α), 또는 엡실론 (ε) 쇄. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇몇 하위유형을 갖는다. IgM 하위유형은 IgM1 및 IgM2를 포함한다. IgA 하위유형은 IgA1 및 IgA2를 포함한다.
VI. 항체 접합체
본 개시내용의 측면은 적어도 1종의 작용제에 연결되어 항체 접합체를 형성하는, 일반적으로 모노클로날 유형의 본 개시내용의 펩티드에 대한 항체에 관한 것이다. 진단 또는 치료 작용제로서의 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 1종의 목적하는 분자 또는 모이어티를 연결하거나 공유 결합시키거나 또는 복합체화하는 것이 통상적이다. 이러한 분자 또는 모이어티는 적어도 1종의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이펙터 분자는 목적하는 활성, 예를 들어, 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 이펙터 분자의 비-제한적 예는 독소, 항-종양제, 치료 효소, 방사성-표지된 뉴클레오티드, 항바이러스제, 킬레이트화제, 시토카인, 성장 인자, 및 올리고- 또는 폴리-뉴클레오티드를 포함한다. 대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비-제한적 예는 효소, 방사성표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 광친화성 분자, 색상 있는 입자 또는 리간드, 예컨대 비오틴을 포함한다.
충분한 선택성, 특이성 또는 친화도의 임의의 항체는 항체 접합체에 대한 기초로서 채용될 수 있다. 이러한 특성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 면역학적 스크리닝 방법론을 사용하여 평가될 수 있다. 정준 항원 결합 부위 외에도, 항체 분자에서 생물학적 활성 분자에의 결합을 위한 부위는 병원체, B-세포 초항원, T 세포 공-수용체 CD4 및 HIV-1 외피에 결합할 수 있는 가변 도메인에 있는 부위를 포함한다 (Sasso et al., 1989; Shorki et al., 1991; Silvermann et al., 1995; Cleary et al., 1994; Lenert et al., 1990; Berberian et al., 1993; Kreier et al., 1991). 또한, 가변 도메인은 항체 자기-결합에 관여하고 (Kang et al., 1988), 항-항체에 의해 인식되는 에피토프 (이디오토프)를 함유한다 (Kohler et al., 1989).
항체 접합체의 특정 예는 항체가 검출가능한 표지에 연결된 접합체이다. "검출가능한 표지"는 그들의 특이적 기능적 특성, 및/또는 화학적 특징으로 인해 검출될 수 있는 화합물 및/또는 요소이며, 그들의 사용은 이들이 부착되는 항체가 검출되는 것, 및/또는 목적하는 경우 추가로 정량화되는 것을 허용한다. 또 다른 이러한 예는 세포독성 또는 항-세포 작용제에 연결된 항체를 포함하는 접합체의 형성이며, "면역독소"로 용어화될 수 있다.
항체 접합체는 일반적으로 진단 작용제로서의 용도에 바람직하다. 항체 진단제는 일반적으로 2가지 부류, 즉, 시험관내 진단제에, 예컨대 다양한 면역검정에 사용하기 위한 것들, 및/또는 일반적으로 "항체-지정 영상화"로 공지된 생체내 진단 프로토콜에 사용하기 위한 것들 내에 해당한다.
많은 적절한 영상화제는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 항체에의 그들의 부착을 위한 방법도 그러하다 (예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,021,236; 4,938,948; 및 4,472,509를 참조한다). 사용되는 영상화 모이어티는 상자성 이온; 방사성 동위원소; 형광색소; NMR-검출가능한 물질; X-선 영상화일 수 있다.
상자성 이온의 경우, 예로서 크로뮴 (III), 망간 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III) 및/또는 에르븀 (III)과 같은 이온을 언급할 수 있으며, 가돌리늄이 특히 바람직하다. 다른 맥락, 예컨대 X-선 영상화에서 유용한 이온은 란탄 (III), 금 (III), 납 (II), 및 특히 비스무트 (III)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
치료 및/또는 진단 적용을 위한 방사성 동위원소의 경우, 아스타틴211, 14탄소, 51크로뮴, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 아이오딘123, 아이오딘125, 아이오딘131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90을 언급할 수 있다. 125I는 종종 특정 측면에서 사용하기 위해 바람직하고, 테크니슘99m 및/또는 인듐111은 또한 종종 그들의 낮은 에너지 및 긴 범위 검출에 대한 적합성으로 인해 바람직하다. 본 발명의 방사성 표지된 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 생산될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 아이오드화나트륨 및/또는 칼륨 및 화학적 산화제, 예컨대 하이포아염소산나트륨, 또는 효소적 산화제, 예컨대 락토퍼옥시다제와의 접촉에 의해 아이오드화될 수 있다. 본 발명에 따른 모노클로날 항체는 리간드 교환 프로세스에 의해, 예를 들어, 퍼테크네이트를 주석함유 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스(Sephadex) 칼럼 상으로 킬레이트화하고, 항체를 이 칼럼에 적용함으로써 테크네튬99m으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 퍼테크네이트, 환원제, 예컨대 SNCl2, 완충제 용액, 예컨대 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액, 및 항체를 인큐베이션하는 것에 의한 직접 표지화 기술이 사용될 수 있다. 금속성 이온으로서 존재하는 방사성동위원소를 항체에 결합시키는데 종종 사용되는 중재적 관능기는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.
접합체로서 사용하기 위해 구상되는 형광 표지 중에서는 알렉사(Alexa) 350, 알렉사 430, AMCA, 보디피(BODIPY) 630/650, 보디피 650/665, 보디피-FL, 보디피-R6G, 보디피-TMR, 보디피-TRX, 캐스케이드 블루, Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그라핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드를 포함한다.
본 발명에서 구상되는 항체 접합체의 또 다른 유형은 항체가 발색성 기질과의 접촉시 색상 있는 생성물을 생성할 2차 결합 리간드에 및/또는 효소 (효소 태그)에 연결되는, 주로 시험관내에서 사용하기 위해 의도되는 것들이다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼리성 포스파타제, (서양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및/또는 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241에 기재되어 있다.
항체에의 분자의 부위-특이적 부착의 또한 또 다른 공지된 방법은 항체와 합텐-기반 친화성 표지의 반응을 포함한다. 본질적으로, 합텐-기반 친화성 표지는 항원 결합 부위에서 아미노산과 반응하고, 그에 의해 이 부위를 파괴하고, 특이적 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이는 그것이 항체 접합체에 의한 항원 결합의 소실을 발생시키기 때문에 유리하지 않을 수 있다.
아지도 기를 함유하는 분자는 또한 저 강도 자외광에 의해 생성되는 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에의 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있다 (Potter & Haley, 1983). 특히, 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조 세포 추출물에서 뉴클레오티드 결합 단백질을 확인하기 위한 부위-지정 포토프로브로서 사용되었다 (Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인을 맵핑하는데 사용되었으며 (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; 및 Dholakia et al., 1989), 항체 결합제로서 사용될 수 있다.
항체의 그의 접합체 모이어티에의 부착 또는 접합을 위한 몇몇 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은 예를 들어, 항체에 부착된 유기 킬레이트화제, 예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔술폰아미드; 및/또는 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리쿠릴-3을 채용하는 금속 킬레이트 복합체의 사용을 수반한다 (미국 특허 번호 4,472,509 및 4,938,948, 각각 본원에 참조로 포함됨). 모노클로날 항체는 또한 커플링제, 예컨대 글루타르알데히드 또는 퍼아이오데이트의 존재 하에서 효소와 반응될 수 있다. 플루오레세인 마커를 갖는 접합체는 이들 커플링제의 존재 하에서 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 번호 4,938,948에서, 유방 종양의 영상화는 모노클로날 항체를 사용하여 달성되며, 검출가능한 영상화 모이어티는 링커, 예컨대 메틸-p-히드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트를 사용하여 항체에 결합된다.
다른 측면에서, 항체 조합 부위를 변경시키지 않는 반응 조건을 사용하여, 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 술프히드릴 기를 선택적으로 도입하는 것에 의한 이뮤노글로불린의 유도체화가 구상된다. 이 방법론에 따라 생산된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 민감성을 나타내는 것으로 개시되어 있다 (미국 특허 번호 5,196,066, 본원에 참조로 포함됨). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역에서 탄수화물 잔기에 접합되는 이펙터 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착은 또한 문헌에 개시되었다 (O'Shannessy et al., 1987). 이 접근법은 현재 임상 평가 중인 진단적으로 및 치료적으로 유망한 항체를 생산하는 것으로 보고되었다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 항체는 반도체 나노결정, 예컨대 미국 특허 번호 6,048,616; 5,990,479; 5,690,807; 5,505,928; 5,262,357 (이들 모두는 그 전문이 본원에 포함됨); 뿐만 아니라 PCT 공개 번호 99/26299 (1999년 5월 27일에 공개됨)에 기재된 것들에 연결될 수 있다. 특히, 본 발명의 생물학적 및 화학적 검정에서 반도체 나노결정으로서 사용하기 위한 예시적인 물질은 그룹 II-VI, III-V 및 그룹 IV 반도체, 예컨대 ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb, AlS, AlP, AlSb, PbS, PbSe, Ge 및 Si 및 이들의 3차 및 4차 혼합물을 포함하는 상기 기재된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 반도체 나노결정을 항체에 연결시키는 방법은 미국 특허 번호 6,630,307 및 6,274,323에 기재되어 있다.
또한 추가의 측면에서, 본 발명은 생물학적 성분, 예컨대 T 세포 또는 본 개시내용의 펩티드에 선택적으로 결합하거나 또는 이를 인식하는 것을 결합시키고/거나, 정제하고/거나, 제거하고/거나, 정량화하고/거나, 다른 방식으로 일반적으로 검출하는 면역검출 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 사량체 검정은 본 발명에 사용될 수 있다. 사량체 검정은 일반적으로 항원 특이적 T 림프구에 결합할 수 있는 가용성 펩티드-MHC 사량체를 생성하는 것을 수반하며, 사량체 검정을 위한 방법은 예를 들어, 문헌 [Altman et al. (1996)]에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 일부 면역검출 방법은 예를 들어, 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), 면역방사성계측 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생체발광 검정, 사량체 검정, 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계는 과학 문헌, 예컨대, 예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Doolittle and Ben-Zeev, 1999]; [Gulbis and Galand, 1993]; [De Jager et al., 1993]; 및 [Nakamura et al., 1987]에 기재되었다.
VII. MHC 폴리펩티드
본 개시내용의 측면은 MHC 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, MHC 폴리펩티드는 별개의 폴리펩티드로서 또는 융합 단백질로서 발현될 수 있는 적어도 2, 3, 또는 4개의 MHC 폴리펩티드를 포함한다. T 세포에의 항원의 제시는 별개의 항원 프로세싱 경로를 이용하는 분자 MHC 부류 I (MHC-I) 및 MHC 부류 II (MHC-II) (또한 본원에서 "pMHC"로 확인됨)의 2가지 별개의 부류에 의해 매개된다. 세포내 항원으로부터 유래된 펩티드는 사실상 모든 세포 상에 발현되는 MHC 부류 I 분자에 의해 CD8+ T 세포에 제시되는 반면, 세포외 항원-유래 펩티드는 MHC-II 분자에 의해 CD4+ T 세포에 제시된다. 특정 측면에서, 특정한 항원은 적절한 MHC 부류 I 또는 II 폴리펩티드의 맥락에서 항원-MHC 복합체에서 확인되고 제시된다. 특정 측면에서, 대상체의 유전적 구성을 평가하여 어느 MHC 폴리펩티드가 특정한 환자 및 특정한 펩티드의 세트에 사용되어야 하는지를 결정할 수 있다. 특정 측면에서, MHC 부류 1 폴리펩티드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 또는 CD-1 분자의 전부 또는 일부를 포함한다. MHC 폴리펩티드가 MHC 부류 II 폴리펩티드인 측면에서, MHC 부류 II 폴리펩티드는 HLA-DR, HLA-DQ, 또는 HLA-DP의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
비-고전적 MHC 폴리펩티드는 또한 본 발명의 MHC 복합체에서 사용하기 위해 구상된다. 비-고전적 MHC 폴리펩티드는 비-중합체성이고, 종 중에서 보존되며, 좁고, 깊은 소수성 리간드 결합 포켓을 갖는다. 이들 결합 포켓은 당지질 및 인지질을 자연 킬러 T (NKT) 세포 또는 CD8+ T-세포의 특정 하위세트, 예컨대 Qa1, HLA-E-제한된 CD8+ T-세포, 또는 MAIT 세포에 제시할 수 있다. NKT 세포는 NK 세포 마커 및 반-불변 T 세포 수용체 (TCR)를 공동-발현하는 고유한 림프구 집단을 나타낸다. 이들은 폭넓은 범위의 질환과 연관된 면역 반응의 조절에 연루되어 있다.
VIII. 추가의 작용제
일부 측면에서, 방법은 추가의 작용제의 투여를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 추가의 작용제는 면역자극제이다. 본원에 사용된 용어 "면역자극제"는 대상체에서 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물을 지칭하고, 아주반트를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 면역자극제는 특이적 항원을 구성하지 않지만, 항원에 대한 면역 반응의 강도 및 수명을 신장시킬 수 있는 작용제이다. 이러한 면역자극제는 패턴 인식 수용체, 예컨대 톨(Toll)-유사 수용체, RIG-1 및 NOD-유사 수용체 (NLR)의 자극제, 광물 염, 예컨대 백반, 엔테로박테리아(Enterobacteria), 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherihia coli), 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 또는 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)의 모노포스포릴 지질 (MPL) A와 또는 구체적으로 MPL.RTM. (ASO4)과 조합된 백반, 개별적으로 상기 언급된 박테리아의 MPL A, 사포닌, 예컨대 QS-21, 퀼(Quil)-A, ISCOM, ISCOMATRIX, 에멀젼, 예컨대 MF59, 몬타나이드(Montanide), ISA 51 및 ISA 720, AS02 (QS21+스쿠알렌+MPL.), 리포솜 및 리포솜 제제, 예컨대 AS01, 합성된 또는 특이적으로 제조된 미세입자 및 미세담체, 예컨대 엔. 고노레아에(N. gonorrheae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 다른 것들의 박테리아-유래 외막 소포 (OMV), 또는 키토산 입자, 데포-형성제, 예컨대 플루로닉(Pluronic) 블록 공-중합체, 특이적으로 변형된 또는 제조된 펩티드, 예컨대 무라밀 디펩티드, 아미노알킬 글루코스아미니드 4-포스페이트, 예컨대 RC529, 또는 단백질, 예컨대 박테리아 톡소이드 또는 독소 단편을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 추가의 작용제는 톨-유사 수용체 (TLR), 구체적으로 TLR 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 및/또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 패턴 인식 수용체 (PRR)에 대한 효능제를 포함한다. 일부 측면에서, 추가의 작용제는 톨-유사 수용체 3에 대한 효능제, 톨-유사 수용체 7 및 8에 대한 효능제, 또는 톨-유사 수용체 9에 대한 효능제를 포함하고; 바람직하게는 나열된 면역자극제는 이미다조퀴놀린; 예컨대 R848; 아데닌 유도체, 예컨대 미국 특허 번호 6,329,381, 미국 공개 특허 출원 2010/0075995, 또는 WO 2010/018132에 개시된 것들; 면역자극 DNA; 또는 면역자극 RNA를 포함한다. 일부 측면에서, 추가의 작용제는 또한 면역자극 RNA 분자, 예컨대 dsRNA, 폴리 I:C 또는 폴리 I:폴리 C12U (암플리겐(Ampligen).RTM.으로 입수가능함, 폴리 I:C 및 폴리 I:폴리C12U 둘 다는 TLR3 자극제로 공지되어 있음), 및/또는 문헌 [F. Heil et al., "Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8" Science 303(5663), 1526-1529 (2004)]; 제이. 볼머(J. Vollmer) 등, "화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드 및 올리고리보뉴클레오티드에 의한 면역 조정" WO 2008033432 A2; 에이. 포스바흐(A. Forsbach) 등, "특이적 서열 모티프(들)를 함유하고 톨-유사 수용체 8 경로를 표적화하는 면역자극 올리고리보뉴클레오티드" WO 2007062107 A2; 이. 울만(E. Uhlmann) 등, "증진된 면역자극 활성을 갖는 변형된 올리고리보뉴클레오티드 유사체" 미국 특허 출원 공개 US 2006241076; 지. 리프포드(G. Lipford) 등, "면역자극 바이러스 RNA 올리고뉴클레오티드 및 암 및 감염을 치료하기 위한 용도" WO 2005097993 A2; 지. 리프포드 등, "면역자극 G,U-함유 올리고리보뉴클레오티드, 조성물, 및 스크리닝 방법" WO 2003086280 A2에 개시된 것들 (그러나 이에 제한되지 않음)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 추가의 작용제는 TLR-4 효능제, 예컨대 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS), VSV-G, 및/또는 HMGB-1일 수 있다. 일부 측면에서, 추가의 작용제는 미국 특허 번호 6,130,082, 6,585,980, 및 7,192,725에 개시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 TLR-5 효능제, 예컨대 플라겔린, 또는 그의 부분 또는 유도체를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 추가의 작용제는 괴사성 세포로부터 방출된 염증유발성 자극 (예를 들어, 우레이트 결정)일 수 있다. 일부 측면에서, 추가의 작용제는 보체 캐스케이드의 활성화된 성분 (예를 들어, CD21, CD35 등)일 수 있다. 일부 측면에서, 추가의 작용제는 면역 복합체의 활성화된 성분일 수 있다. 추가의 작용제는 또한 보체 수용체 효능제, 예컨대 CD21 또는 CD35에 결합하는 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 보체 수용체 효능제는 합성 나노담체의 내인성 보체 옵소닌화를 유도한다. 일부 측면에서, 면역자극제는 세포에 의해 방출되고, 세포-세포 상호작용, 다른 세포의 통신 및 거동에 대한 특이적 효과를 갖는 작은 단백질 또는 생물학적 인자 (5 kD 내지 20 kD의 범위)인 시토카인이다. 일부 측면에서, 시토카인 수용체 효능제는 소분자, 항체, 융합 단백질, 또는 압타머이다.
IX. 조작된 T 세포 수용체
T-세포 수용체는 디술피드 결합에 의해 연결된, T-세포 수용체 α (TCRα) 및 β (TCRβ) 쇄로 용어화되는 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 이들 α:β 이종이량체는 구조에 있어서 이뮤노글로불린 분자의 Fab 단편과 매우 유사하며, 이들은 대부분의 T 세포에 의한 항원 인식을 처리한다. 소수의 T 세포는 γ 및 δ로 지정된 폴리펩티드 쇄의 상이한 쌍으로 구성된 대안적이지만 구조적으로 유사한 수용체를 보유한다. T-세포 수용체의 둘 다의 유형은 B-세포 수용체로서 역할을 하는 막-결합된 이뮤노글로불린과는 상이하다: T-세포 수용체는 단지 1개의 항원-결합 부위를 갖는 반면, B-세포 수용체는 2개를 가지며, T-세포 수용체는 결코 분비되지 않는 반면, 이뮤노글로불린은 항체로서 분비될 수 있다.
T-세포 수용체의 둘 다의 쇄는 이뮤노글로불린 V 도메인과 상동성을 갖는 아미노-말단 가변 (V) 영역, 이뮤노글로불린 C 도메인과 상동성을 갖는 불변 (C) 영역, 및 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 함유하는 짧은 힌지 영역을 갖는다. 각각의 쇄는 소수성 막횡단 도메인에 의해 지질 이중층에 걸쳐 있으며, 짧은 세포질 꼬리에서 종료한다.
T-세포 수용체의 3차원 구조는 결정되었다. 구조는 사실 항체 Fab 단편의 그것과 유사한데, 이는 이를 코딩한 유전자에 대한 초기 연구로부터 의심된 바와 같다. T-세포 수용체 쇄는 Fab 단편의 그것들과 매우 동일한 방식으로 폴딩되지만, 최종 구조는 약간 더 짧고 더 넓게 보인다. 그러나, T-세포 수용체 및 Fab 단편 사이에 일부 뚜렷한 차이가 있다. 가장 현저한 차이는 폴딩이 임의의 다른 이뮤노글로불린-유사 도메인의 그것과는 같지 않은 Cα 도메인에 있다. Cβ 도메인과 병치된 도메인의 절반은 다른 이뮤노글로불린-유사 도메인에서 발견되는 것과 유사한 β 쉬트를 형성하지만, 도메인의 다른 절반은 느슨하게 패킹된 가닥 및 α 나선의 짧은 절편으로 형성된다. 이뮤노글로불린-유사 도메인에서 통상적으로 2개의 β 가닥을 연결시키는 분자내 디술피드 결합은, Cα 도메인에서 β 가닥을 α 나선의 이 절편에 연결시킨다.
또한 도메인이 상호작용하는 방식에는 차이가 있다. 둘 다의 T-세포 수용체 쇄의 V 및 C 도메인 사이의 계면은 항체에서보다 더 광범위하며, 이는 도메인 사이의 힌지 연결을 덜 유연성으로 만든다. 그리고 Cα 및 Cβ 도메인 사이의 상호작용은 탄수화물에 의해 보조됨에 있어서 독특하며, Cα 도메인으로부터의 당 기는 Cβ 도메인에의 다수의 수소 결합을 만든다. 마지막으로, 가변 결합 부위의 비교는, 상보성-결정 영역 (CDR) 루프가 항체 분자의 그것들과 꽤 가깝게 정렬되지만, 항체 분자의 그것들에 비해 일부 변위가 있음을 제시한다. 이 변위는 도메인의 한 면으로부터의 루프의 한 단부를 다른 것에 고착시키는 β 가닥의 이동의 결과로서, 항체 V 도메인에서의 등가의 루프에 대략 직각으로 배향되는 Vα CDR2 루프에서 특히 현저하다. 가닥 변위는 또한 그의 구조가 공지된 7개의 Vβ 도메인 중 2개에서 Vβ CDR2 루프의 배향의 변화를 유발한다. 이제까지, 7개의 T-세포 수용체의 결정학적 구조는 이 해상도의 수준까지 해결되었다.
본 개시내용의 측면은 조작된 T 세포 수용체에 관한 것이다. 용어 "조작된"은 본 개시내용의 펩티드 및 항원에 결합하는 키메라 폴리펩티드를 만드는 TCR 불변 영역 상으로 그라프팅된 TCR 가변 영역을 갖는 T 세포 수용체를 지칭한다. 특정 측면에서, TCR은 클로닝, 증진된 발현, 검출을 위해, 또는 구축물의 치료 제어를 위해 사용되지만, 내인성 TCR에는 존재하지 않는 개재 서열, 에컨대 다중 클로닝 부위, 링커, 힌지 서열, 변형된 힌지 서열, 변형된 막횡단 서열, 검출 폴리펩티드 또는 분자, 또는 TCR을 포함하는 세포의 선택 또는 스크리닝을 허용할 수 있는 치료 제어를 포함한다.
일부 측면에서, TCR은 비-TCR 서열을 포함한다. 따라서, 특정 측면은 TCR 유전자로부터의 것이 아닌 서열을 갖는 TCR에 관한 것이다. 일부 측면에서, TCR은, 그것이 TCR 유전자에서 통상적으로 발견되는 서열을 함유하지만, 자연에서 반드시 함께 발견되지는 않는 적어도 2개의 TCR 유전자로부터의 서열을 함유한다는 점에서, 키메라이다.
일부 측면에서 본 개시내용의 조작된 TCR은 하기 제시된 바와 같은 측면을 포함한다.
표 1: TCR 측면
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X. 단백질성 조성물
본원에 사용된 "단백질", "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 적어도 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "야생형"은 유기체에서 천연적으로 발생하는 분자의 내인성 버전을 지칭한다. 일부 측면에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 야생형 버전이 채용되지만, 본 개시내용의 많은 측면에서, 면역 반응을 생성하기 위해 변형된 단백질 또는 폴리펩티드가 채용된다. 상기 기재된 용어는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드" 또는 "변이체"는 그의 화학적 구조, 특히 그의 아미노산 서열이 야생형 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 변경된 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 측면에서, 변형된/변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 적어도 하나의 변형된 활성 또는 기능을 갖는다 (그 단백질 또는 폴리펩티드를 인식하는 것은 다수의 활성 또는 기능을 가질 수 있다). 변형된/변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 하나의 활성 또는 기능에 관하여 변경될 수 있지만, 다른 측면에서 야생형 활성 또는 기능, 예컨대 면역원성을 보유함이 구체적으로 구상된다.
단백질이 본원에서 구체적으로 언급되는 경우, 이는 일반적으로 천연 (야생형) 또는 재조합 (변형된) 단백질 또는, 임의로, 임의의 신호 서열이 제거된 단백질에 대한 언급이다. 단백질은 그것이 천연적인 유기체로부터 직접적으로 단리되거나, 재조합 DNA/외인성 발현 방법에 의해 생산되거나, 또는 고상 펩티드 합성 (SPPS) 또는 다른 시험관내 방법에 의해 생산될 수 있다. 특정한 측면에서, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 그의 단편)를 코딩하는 핵산 서열을 혼입하는 단리된 핵산 절편 및 재조합 벡터가 있다. 용어 "재조합"은 폴리펩티드 또는 특이적 폴리펩티드의 명칭과 함께 사용될 수 있으며, 이는 일반적으로 시험관내에서 조작된 또는 이러한 분자의 복제 생성물인 핵산 분자로부터 생산된 폴리펩티드를 지칭한다.
특정 측면에서 단백질 또는 폴리펩티드 (야생형 또는 변형된)의 크기는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000개의 아미노산 잔기 또는 핵산 잔기 또는 그 초과, 및 그 안의 추론가능한 임의의 범위, 또는 본원에 기재된 또는 언급된 상응하는 아미노산 서열의 유도체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드는 이들을 그들의 상응하는 야생형 형태보다 더 짧게 만드는 말단절단에 의해 돌연변이될 수 있으며, 또한, 이들은 특정한 기능을 갖는 이종 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 융합하거나 또는 접합시킴으로써 변경될 수 있음 (예를 들어, 표적화 또는 국재화를 위해, 증진된 면역원성을 위해, 정제 목적을 위해 등)이 구상된다.
본 개시내용의 폴리펩티드, 단백질, 또는 이러한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:1 내지 141의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 또는 그 초과의 변이체 아미노산 또는 핵산 치환을 포함하거나, 또는 적어도, 또는 많아야 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000개 또는 그 초과의 인접한 아미노산 또는 핵산, 또는 그 안의 추론가능한 임의의 범위와 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 유사하거나, 동일하거나, 또는 상동일 수 있다. 구체적인 측면에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 인간 서열이거나 또는 그에 기반한다. 특정 측면에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 천연 발생이 아니고/거나 펩티드 또는 폴리펩티드의 조합이다.
일부 측면에서, 단백질, 폴리펩티드, 또는 핵산은 서열식별번호:1 내지 141의 아미노산 또는 뉴클레오티드 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 또는 320 (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위)을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 서열식별번호:1 내지 141 중 하나의 펩티드 또는 폴리펩티드의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 또는 400에서의 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린으로 치환된다.
일부 측면에서, 단백질, 폴리펩티드, 또는 핵산은 서열식별번호:1 내지 141의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 또는 320 (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위)개의 인접한 아미노산 또는 핵산을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산은 서열식별번호:1 내지 141 중 하나와 적어도, 많아야, 또는 정확하게 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위) 유사하거나, 동일하거나, 또는 상동인 서열식별번호:1 내지 141의 적어도, 많아야, 또는 정확하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 또는 320 (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위)개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 측면에서 서열식별번호:1 내지 141 중 임의의 것의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 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277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 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677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 또는 950 (또는 그 안의 임의의 추론가능한 범위)개의 인접한 아미노산 또는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 있다.
다양한 유전자에 대한 뉴클레오티드 뿐만 아니라 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드 서열은 이전에 개시되었으며, 인식된 컴퓨터화 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 2가지 통상적으로 사용되는 데이터베이스는 미국 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 진뱅크(Genbank) 및 진펩트(GenPept) 데이터베이스 (웰드 와이드 웹 상의 ncbi.nlm.nih.gov/에서) 및 더 유니버셜 프로테인 리소스(The Universal Protein Resource) (유니프롯(UniProt); 월드 와이드 웹 상의 uniprot.org)이다. 이들 유전자에 대한 코딩 영역은 본원에 개시된 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 바와 같은 기술을 사용하여 증폭되고/거나 발현될 수 있다.
본 개시내용의 조성물에서, ml 당 약 0.001 mg 내지 약 10 mg의 총 폴리펩티드, 펩티드, 및/또는 단백질이 있음이 구상된다. 조성물 중의 단백질의 농도는 약, 적어도 약 또는 많아야 약 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 mg/ml 또는 그 초과 (또는 그 안의 추론가능한 임의의 범위)일 수 있다.
하기는 단백질의 아미노산 서브유닛을 변화시켜 등가의, 또는 훨씬 개선된 제2-세대 변이체 폴리펩티드 또는 펩티드를 생성하는 것의 논의이다. 예를 들어, 특정 아미노산은 구조, 예컨대, 예를 들어, 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자 상의 결합 부위와의 상호작용적 결합 능력의 주목할 만한 소실과 함께 또는 없이 단백질 또는 폴리펩티드 서열에서 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 단백질의 기능적 활성을 정의하는 것은 그 단백질의 상호작용적 능력 및 성질이기 때문에, 특정 아미노산 치환은 단백질 서열에서 및 그의 상응하는 DNA 코딩 서열에서 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 또는 바람직한 특성을 갖는 단백질을 생성한다. 따라서 다양한 변화는 그들의 생물학적 유용성 또는 활성의 주목할 만한 소실 없이 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열에서 이루어질 수 있음이 본 발명자들에 의해 구상된다.
용어 "기능적으로 등가의 코돈"은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 예컨대 아르기닌에 대해 6개의 상이한 코돈을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 또한 생물학적으로 등가의 아미노산을 코딩하는 코돈 또는 코돈들의 변화를 지칭하는 "중성 치환" 또는 "중성 돌연변이"가 고려된다.
본 개시내용의 아미노산 서열 변이체는 치환, 삽입, 또는 결실 변이체일 수 있다. 본 개시내용의 폴리펩티드의 변이는 야생형에 비해 단백질 또는 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 초과의 비-인접한 또는 인접한 아미노산 (또는 그 안의 추론가능한 임의의 범위)에 영향을 미칠 수 있다. 변이체는 본원에서 제공된 또는 언급된 임의의 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% (그 사이의 모든 값 및 범위를 포함함) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변이체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 초과의 치환체 아미노산을 포함할 수 있다.
또한 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 잔기, 예컨대 각각 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산, 또는 5' 또는 3' 서열을 포함할 수 있으며, 또한 서열이 단백질 발현이 관심 있는 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하는 상기 제시된 기준을 충족시키는 한, 본원에 개시된 서열 중 하나에 제시된 것과 본질적으로 동일할 수 있음이 이해될 것이다. 말단 서열의 첨가는 특히 예를 들어, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중 어느 하나에 플랭킹된 다양한 비-코딩 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.
결실 변이체는 전형적으로 천연 또는 야생형 단백질의 1개 이상의 잔기를 결여한다. 개별적 잔기는 결실될 수 있거나, 또는 다수의 인접한 아미노산은 결실될 수 있다. 정지 코돈은 말단절단된 단백질을 생성하기 위해 코딩 핵산 서열 내로 도입될 수 있다 (치환 또는 삽입에 의해).
삽입 돌연변이체는 전형적으로 폴리펩티드 내의 비-말단 점에서의 아미노산 잔기의 첨가를 수반한다. 이는 1개 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 말단 첨가는 또한 생성될 수 있으며, 본원에 기재된 또는 언급된 1종 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드의 다량체 또는 콘카테머인 융합 단백질을 포함할 수 있다.
치환 변이체는 전형적으로 단백질 또는 폴리펩티드 내의 1개 이상의 부위에서 한 아미노산의 또 다른 것에 대한 교환을 함유하고, 다른 기능 또는 특성의 소실과 함께 또는 없이 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 조정하도록 디자인될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있으며, 즉, 한 아미노산은 유사한 화학적 특성의 것으로 대체된다. "보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 부류의 구성원의 동일한 부류의 또 다른 구성원으로의 교환을 수반할 수 있다. 보존적 치환은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 알라닌의 세린으로의; 아르기닌의 리신으로의; 아스파라긴의 글루타민 또는 히스티딘으로의; 아스파르테이트의 글루타메이트로의; 시스테인의 세린으로의; 글루타민의 아스파라긴으로의; 글루타메이트의 아스파르테이트로의; 글리신의 프롤린으로의; 히스티딘의 아스파라긴 또는 글루타민으로의; 이소류신의 류신 또는 발린으로의; 류신의 발린 또는 이소류신으로의; 리신의 아르기닌으로의; 메티오닌의 류신 또는 이소류신으로의; 페닐알라닌의 티로신, 류신 또는 메티오닌으로의; 세린의 트레오닌으로의; 트레오닌의 세린으로의; 트립토판의 티로신으로의; 티로신의 트립토판 또는 페닐알라닌으로의; 및 발린의 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 생물학적 시스템에서의 합성에 의해서라기 보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입되는 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이들은 아미노산 모이어티의 펩티드모방체 또는 다른 반전된 또는 도치된 형태를 포함한다.
대안적으로, 치환은 폴리펩티드의 기능 또는 활성이 영향을 받도록 "비-보존적"일 수 있다. 비-보존적 변화는 전형적으로 아미노산 잔기를 화학적으로 다른 것으로, 예컨대 극성 또는 하전된 아미노산을 비극성 또는 비하전된 아미노산에 대해 치환하는 것을 수반하며, 그 역도 마찬가지이다. 비-보존적 치환은 아미노산 부류 중 하나의 구성원의 또 다른 부류로부터의 구성원에 대한 교환을 수반할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 널리 공지된 기술을 사용하여 본원에 제시된 바와 같은 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 활성에 중요한 것으로 믿어지지 않는 영역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않으면서 변화될 수 있는 분자의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 통상의 기술자는 또한 유사한 단백질 또는 폴리펩티드 중에서 보존된 분자의 아미노산 잔기 및 부분을 확인할 수 있을 것이다. 추가의 측면에서, 생물학적 활성에 또는 구조에 중요할 수 있는 영역은 생물학적 활성을 유의하게 변경시키지 않으면서 또는 단백질 또는 폴리펩티드 구조에 유해하게 영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환에 적용될 수 있다.
이러한 변화를 생성하는데 있어서, 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다. 단백질의 소수성 프로파일은 각각의 아미노산에 수치 값 ("소수성 지수")을 할당하고, 이어서 펩티드 쇄를 따라 이들 값을 반복적으로 평균함으로써 계산된다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징에 기반하여 값이 할당되었다. 이들은 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스테인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5)이다. 단백질에 대한 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서의 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 관련 기술분야에서 이해되어 있다 (Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-131 (1982)). 아미노산의 상대 소수성 특징은 생성된 단백질 또는 폴리펩티드의 2차 구조에 기여하며, 이는 다시 단백질 또는 폴리펩티드와 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원, 및 기타의 상호작용을 정의한다는 것이 용인된다. 또한 특정 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖고, 유사한 생물학적 활성을 여전히 보유하는 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있음이 공지되어 있다. 소수성 지수에 기반하여 변화를 생성하는데 있어서, 특정 측면에서, 그의 소수성 지수가 ±2 내인 아미노산의 치환이 포함된다. 본 발명의 일부 측면에서, ±1 내인 것들이 포함되고, 본 발명의 다른 측면에서, ±0.5 내인 것들이 포함된다.
또한 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기반하여 효과적으로 생성될 수 있음이 이해된다. 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,554,101은 그의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같은 단백질의 최대 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상관됨을 진술하고 있다. 특정 측면에서, 그의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같은 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 그의 면역원성 및 항원 결합과, 즉, 단백질의 생물학적 특성으로서 상관된다. 하기 친수성 값은 이들 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값에 기반하여 변화를 생성하는데 있어서, 특정 측면에서, 그의 친수성 값이 ±2 내인 아미노산의 치환이 포함되고, 다른 측면에서, ±1 내인 것들이 포함되고, 또한 다른 측면에서, ±0.5 내인 것들이 포함된다. 일부 경우에, 또한 친수성에 기반하여 1차 아미노산 서열로부터의 에피토프를 확인할 수 있다. 이들 영역은 또한 "에피토프 코어 영역"으로 지칭된다. 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 것에 대해 치환될 수 있고, 여전히 생물학적으로 등가의 및 면역학적으로 등가의 단백질을 생산함이 이해된다.
추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드 또는 단백질에서 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교의 관점에서, 유사한 단백질에서 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질에서의 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 예측된 중요한 아미노산 잔기에 대한 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 유사한 단백질 또는 폴리펩티드에서 3차원 구조 및 아미노산 서열을 그 구조에 관하여 분석할 수 있다. 이러한 정보의 관점에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그의 3차원 구조에 관하여 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단백질의 표면 상에 있는 것으로 예측된 아미노산 잔기에 대한 변화를 생성하지 않는 것을 선택할 수 있는데, 이는 이러한 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문이다. 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성할 수 있다. 이어서 이들 변이체는 결합 및/또는 활성에 대한 표준 검정을 사용하여 스크리닝되고, 따라서 이러한 통상적인 실험으로부터 모인 정보를 생성할 수 있으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합으로 추가의 치환이 회피되어야 할 아미노산 위치를 결정하는 것을 허용할 수 있다. 2차 구조를 결정하는데 이용가능한 다양한 툴은 월드 와이드 웹 상에서 expasy.org/proteomics/protein structure에서 발견될 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고/거나, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고/거나, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경시키고/거나, (4) 리간드 또는 항원 결합 친화도를 변경시키고/거나, (5) 이러한 폴리펩티드에 대해 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 또는 변형시키는 아미노산 치환이 생성된다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환 (특정 측면에서, 보존적 아미노산 치환)은 천연 발생 서열에서 생성될 수 있다. 치환은 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들)의 외부에 있는 항체의 그 부분에서 생성될 수 있다. 이러한 측면에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 천연 항체를 특징화하는 2차 구조를 파괴하지 않는 1개 이상의 대체 아미노산)이 사용될 수 있다.
XI. 핵산
특정 측면에서, 핵산 서열은 다양한 사례로, 예컨대: 항체, 또는 그의 단편, 유도체, 뮤테인, 또는 변이체의 하나 또는 둘 다의 쇄를 코딩하는 혼입된 서열 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 단리된 절편 및 재조합 벡터, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인하거나, 분석하거나, 돌연변이시키거나 또는 증폭시키기 위한 혼성화 프로브, PCR 프라이머 또는 시퀀싱 프라이머로서 사용하는데 충분한 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하기 위한 안티-센스 핵산, 및 본원에 기재된 상기 것들의 상보적 서열로 존재할 수 있다. 본원에서 제공된 특정 항체에 대한 에피토프를 코딩하는 핵산이 또한 제공된다. 이들 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 또한 제공된다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 뉴클레오티드 및 그의 인공 변이체 (예를 들어, 펩티드 핵산)를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 재조합이거나 또는 총 게놈 핵산으로부터 단리된 핵산 분자를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 내에는 올리고뉴클레오티드 (100개의 잔기 이하의 길이의 핵산), 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등을 포함하는 재조합 벡터가 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 특정 측면에서, 그들의 천연 발생 유전자 또는 단백질 코딩 서열로부터 실질적으로 단리된 조절 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, RNA, DNA (게놈, cDNA 또는 합성), 이들의 유사체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열은 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 그럴 필요는 없다.
이와 관련하여, 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", 또는 "핵산"은 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드 (적절한 전사, 번역후 변형, 또는 국재화에 요구되는 임의의 서열을 포함함)를 코딩하는 핵산을 지칭하기 위해 사용된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 것인 바와 같이, 이 용어는 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드, 융합 단백질, 및 돌연변이체를 발현하거나, 또는 발현하도록 적응될 수 있는 게놈 서열, 발현 카세트, cDNA 서열, 및 보다 작은 조작된 핵산 절편을 포괄한다. 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 이러한 폴리펩티드의 전부 또는 부분을 코딩하는 인접한 핵산 서열을 함유할 수 있다. 또한 특정한 폴리펩티드는 약간 상이한 핵산 서열을 갖지만, 그럼에도 불구하고, 동일한 또는 실질적으로 유사한 단백질을 코딩하는 변이를 함유하는 핵산에 의해 코딩될 수 있음이 구상된다.
특정 측면에서, 본원에 개시된 서열과 실질적 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 변이체; 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 표준 파라미터를 사용한 BLAST 분석)을 사용하여 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열에 비해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 초과의 서열 동일성 (그 사이의 모든 값 및 범위를 포함함)을 포함하는 것들이 있다. 특정 측면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열의 전체 길이에 걸쳐, 본원에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 95% 및 그 초과의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다.
핵산 절편은, 코딩 서열 자체의 길이와 무관하게, 그들의 전체 길이가 상당히 다양할 수 있도록, 다른 핵산 서열, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 절편 등과 조합될 수 있다. 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 이들은 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이일 수 있고/거나, 1개 이상의 추가의 서열, 예를 들어, 조절 서열을 포함하고/거나, 보다 큰 핵산, 예를 들어, 벡터의 일부일 수 있다. 따라서 거의 임의의 길이의 핵산 단편이 채용될 수 있으며, 총 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도되는 재조합 핵산 프로토콜에서의 용도에 의해 제한됨이 구상된다. 일부 경우에, 핵산 서열은 예를 들어 폴리펩티드의 정제, 수송, 분비, 번역후 변형, 또는 치료적 이익, 예컨대 표적화 또는 효능을 허용하는 추가의 이종 코딩 서열을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 태그 또는 다른 이종 폴리펩티드는 변형된 폴리펩티드-코딩 서열에 첨가될 수 있고, 여기서 "이종"은 변형된 폴리펩티드와 동일하지 않은 폴리펩티드를 지칭한다.
혼성화
특정한 혼성화 조건 하에서 다른 핵산과 혼성화하는 핵산. 핵산을 혼성화하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]을 참조한다. 본원에서 정의된 바와 같이, 중간정도로 엄격한 혼성화 조건은 5× 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충액, 6×SSC, 및 55℃의 혼성화 온도를 함유하는 사전세척 용액 (또는 다른 유사한 혼성화 용액, 예컨대 42℃의 혼성화 온도를 갖는 약 50% 포름아미드를 함유하는 것), 및 0.5×SSC, 0.1% SDS에서 60℃의 세척 조건을 사용한다. 엄격한 혼성화 조건은 45℃에서 6×SSC에서 혼성화하고, 이어서 68℃에서 0.1×SSC, 0.2% SDS에서 1회 이상 세척한다. 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 서로와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로 서로에 혼성화되어 잔류하도록, 혼성화의 엄격성을 증가시키거나 또는 감소시키기 위해 혼성화 및/또는 세척 조건을 조작할 수 있다.
혼성화 조건의 선택에 영향을 미치는 파라미터 및 적합한 조건을 고안하기 위한 지침은 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11 (1989)]; [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4 (1995)]에 의해 제시되고, 이들 둘 다는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되며, 예를 들어, DNA의 길이 및/또는 염기 조성에 기반하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
B. 돌연변이
핵산 내로 돌연변이에 의해 변화가 도입되고, 그에 의해 핵산이 코딩하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 항체 유도체)의 아미노산 서열의 변화를 초래할 수 있다. 돌연변이는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 한 측면에서, 1개 이상의 특정한 아미노산 잔기는 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 프로토콜을 사용하여 변화된다. 또 다른 측면에서, 1개 이상의 무작위로 선택된 잔기는 예를 들어, 무작위 돌연변이유발 프로토콜을 사용하여 변화된다. 어떻게 만들어지든지, 돌연변이체 폴리펩티드는 목적하는 특성을 위해 발현되고 스크리닝될 수 있다.
돌연변이는 핵산이 코딩하는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유의하게 변경시키지 않으면서 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 비-필수 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 초래하는 뉴클레오티드 치환을 생성할 수 있다. 대안적으로, 1개 이상의 돌연변이는 그것이 코딩하는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 선택적으로 변화시키는 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Romain Studer et al., Biochem. J. 449:581-594 (2013)]을 참조한다. 예를 들어, 돌연변이는 생물학적 활성을 정량적으로 또는 정성적으로 변화시킬 수 있다. 정량적 변화의 예는 활성을 증가시키거나, 감소시키거나 또는 제거하는 것을 포함한다. 정성적 변화의 예는 항체의 항원 특이성을 변경시키는 것을 포함한다.
C. 프로브
또 다른 측면에서, 핵산 분자는 핵산 서열의 검출을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용하는데 적합하다. 핵산 분자는 전장 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 단지 부분, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 단편 또는 주어진 폴리펩티드의 활성 부분을 코딩하는 단편을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 핵산 분자는 특이적 항체 서열에 대한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자 프로브는 진단 방법에 사용될 수 있거나, 또는 핵산 분자 PCR 프라이머는 그 중에서도 항체의 가변 도메인을 생성하는데 사용하기 위한 핵산 서열을 단리하는데 사용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gaily Kivi et al., BMC Biotechnol. 16:2 (2016)]을 참조한다. 바람직한 측면에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 보다 바람직한 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 관심의 항체 또는 TCR의 중쇄 및 경쇄 또는 알파 및 베타 쇄의 고도로 가변 영역으로부터의 것이다. 보다 더 바람직한 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 CDR 또는 TCR의 전부 또는 일부를 코딩한다.
핵산의 목적하는 서열에 기반한 프로브는 핵산 또는 유사한 핵산, 예를 들어, 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 전사체를 검출하는데 사용될 수 있다. 프로브는 표지 기, 예를 들어, 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조-인자를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 확인하는데 사용될 수 있다.
XII. 폴리펩티드 발현
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어 TCR 유전자)가 있다. 이들은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있으며, 예를 들어, 면역화되고 단리된 마우스의 B 세포로부터 단리되고, 파지 제시, 임의의 적합한 재조합 발현 시스템에서 발현되고, 어셈블리하여 항체 분자를 형성하는 것을 허용할 수 있거나, 또는 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다.
발현
핵산 분자는 다량의 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 핵산 분자가 비-인간, 비-트랜스제닉 동물로부터 유래되는 경우, 핵산 분자는 TCR 유전자의 인간화에 사용될 수 있다.
B. 벡터
일부 측면에서, 목적하는 서열 또는 그의 부분 (예를 들어, 1개 이상의 CDR 또는 1개 이상의 가변 영역 도메인을 함유하는 단편)의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 구상된다. 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 중쇄, 경쇄, 알파 쇄, 베타 쇄, 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 그의 프로브를 코딩할 수 있다. 전사 및 번역을 지배하는 제어 서열 외에도, 벡터 및 발현 벡터는 또한 다른 기능에 역할을 하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩티드 또는 펩티드를 발현하기 위해, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 DNA는 유전자 영역이 전사 및 번역 제어 서열에 작동적으로 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입된다. 일부 측면에서, 임의의 가변 영역 서열이 용이하게 삽입되고 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위를 갖는 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 이뮤노글로불린 또는 TCR 서열을 코딩하는 벡터. 일부 측면에서, 임의의 가변 서열 또는 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3이 용이하게 삽입되고 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위를 갖는 기능적으로 완전한 인간 TCR 알파 또는 TCR 베타 서열을 코딩하는 벡터. 전형적으로, 임의의 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 유지를 위한 및 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유한다. 집합적으로 "플랭킹 서열"로 지칭되는 이러한 서열은 전형적으로 하기 작동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열 중 1종 이상을 포함한다: 프로모터, 1개 이상의 인핸서 서열, 복제 원점, 전사 종결 서열, 공여자 및 수용자 스플라이스 부위를 함유하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩티드 분비를 위한 리더 서열을 코딩하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리 링커 영역, 및 선택가능한 마커 요소. 이러한 서열 및 이를 사용하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
C. 발현 시스템
상기 논의된 발현 벡터의 적어도 일부 또는 전부를 포함하는 다수의 발현 시스템이 존재한다. 원핵생물- 및/또는 진핵생물-기반 시스템은 핵산 서열, 또는 그들의 동종체 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드를 생산하기 위한 측면에 사용하기 위해 채용될 수 있다. 상업적으로 및 폭넓게 입수가능한 시스템은 박테리아, 포유동물, 효모, 및 곤충 세포 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 번역후 프로세싱 및 변형을 위한 특징 및 특이적 메카니즘을 갖는다. 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 발현 시스템을 사용하여 벡터를 발현시켜 핵산 서열 또는 그의 동종체 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드를 생산할 수 있다.
D. 유전자 전달 방법
본원에 기재된 바와 같이 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 바와 같이, 핵산 (예를 들어, 바이러스 및 비바이러스 벡터를 포함하는 DNA)이 세포, 조직 또는 유기체 내로 도입될 수 있는 사실상 임의의 방법을 포함하는 조성물의 발현을 달성하기 위한 적합한 핵산 전달 방법이 예상된다. 이러한 방법은 DNA의 직접 전달, 예컨대 미세주사 (Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 5,789,215, 본원에 참조로 포함됨)를 포함하는 주사에 의해 (미국 특허 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859, 각각은 본원에 참조로 포함됨); 전기천공에 의해 (미국 특허 번호 5,384,253, 본원에 참조로 포함됨); 인산칼슘 침전에 의해 (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); DEAE 덱스트란, 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용함으로써 (Gopal, 1985); 직접 음파 로딩에 의해 (Fechheimer et al., 1987); 리포솜 매개 형질감염에 의해 (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); 미세투사물 포격에 의해 (PCT 출원 번호 WO 94/09699 및 95/06128; 미국 특허 5,610,042; 5,322,783, 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 및 5,538,880, 및 각각은 본원에 참조로 포함됨); 탄화규소 섬유와의 교반에 의해 (Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765, 각각은 본원에 참조로 포함됨); 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환에 의해 (미국 특허 5,591,616 및 5,563,055, 각각은 본원에 참조로 포함됨); 또는 원형질체의 PEG 매개 형질전환에 의해 (Omirulleh et al., 1993; 미국 특허 4,684,611 및 4,952,500, 각각은 본원에 참조로 포함됨); 건조/억제 매개 DNA 흡수에 의해 (Potrykus et al., 1985)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 방법은 바이러스 형질도입, 예컨대 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 형질도입에 의한 유전자 전달을 포함한다.
숙주 세포
또 다른 측면에서, 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포의 용도가 구상된다. 항체는 다양한 세포 유형에서 발현될 수 있다. 항체를 코딩하는 발현 구축물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 따라 세포 내로 형질감염될 수 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 벡터는 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 복제되고/거나 발현되는 것을 허용하는 제어 서열을 채용할 수 있다. 특정 측면에서, 항체 발현 구축물은 T-세포 활성화에 관련된 프로모터, 예컨대 NFAT-1 또는 NF-κB (이들 둘 다는 T-세포 활성화시 활성화될 수 있는 전사 인자임)에 의해 제어되는 것의 제어 하에 놓일 수 있다. 항체 발현의 제어는 T 세포, 예컨대 종양-표적화 T 세포가 그들의 주변을 감지하고, T 세포 자체 및 주변의 내인성 면역 세포 둘 다에서 시토카인 신호전달의 실시간 조정을 수행하는 것을 허용한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 숙주 세포를 인큐베이션하여 이들을 유지하고 벡터의 복제를 허용하는 조건을 이해할 것이다. 또한 벡터의 대규모 생산, 뿐만 아니라 벡터에 의해 코딩되는 핵산 및 그들의 동종체 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드의 생산을 허용할 기술 및 조건이 이해되고 공지되어 있다.
포유동물 세포의 안정한 형질감염을 위해, 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 기술에 따라, 단지 세포의 작은 분획만이 외래 DNA를 그들의 게놈 내로 통합할 수 있음이 공지되어 있다. 이들 구성요소를 확인하고 선택하기 위해, 선택가능한 마커 (예를 들어, 항생제에 대한 저항성을 위해)는 일반적으로 관심의 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 도입되는 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법 중에서도, 약물 선택에 의해 확인될 수 있다 (예를 들어, 선택가능한 마커 유전자가 혼입된 세포는 다른 세포가 죽는 동안 생존할 것이다).
2. 단리
항체 또는 TCR의 전체 중쇄, 경쇄, 알파, 및 베타 쇄 중 어느 하나 또는 둘 다, 또는 그의 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자는 항체를 생산하는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 항체를 코딩하는 mRNA를 단리하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook et al.]을 참조한다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Kabat et al., 1991]을 참조한다. 이어서 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 이들이 도입된 세포에서 발현되고, 항체가 단리될 수 있다.
XIII. 제제 및 세포의 배양
특정한 측면에서, 본 개시내용의 세포는 특이적으로 제제화될 수 있고/거나, 이들은 특정한 배지에서 배양될 수 있다. 세포는 유해한 효과 없이 수용자에의 전달에 적합하도록 하는 방식으로 제제화될 수 있다.
배지는 특정 측면에서 동물 세포를 배양하는데 사용되는 배지, 예컨대 AIM V, X-VIVO-15, 뉴로베이설(NeuroBasal), EGM2, TeSR, BME, BGJb, CMRL 1066, 글라스고우(Glasgow) MEM, 임프루브드(Improved) MEM 징크 옵션(Zinc Option), IMDM, 배지 199, 이글(Eagle) MEM, αMEM, DMEM, Ham, RPMI-1640, 및 피셔(Fischer) 배지 중 임의의 것, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합을 그들의 기저 배지로서 사용하여 제조될 수 있지만, 배지는 그것이 동물 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 특히, 배지는 이종-무함유 또는 화학적으로 정의될 수 있다.
배지는 혈청-함유 또는 혈청-무함유 배지, 또는 이종-무함유 배지일 수 있다. 이질 동물-유래 성분으로의 오염을 방지하는 측면에서, 혈청은 줄기 세포(들)의 그것과 동일한 동물로부터 유래될 수 있다. 혈청-무함유 배지는 비프로세싱된 또는 비정제된 혈청을 갖지 않는 배지를 지칭하고, 따라서, 정제된 혈액-유래 성분 또는 동물 조직-유래 성분 (예컨대 성장 인자)을 갖는 배지를 포함할 수 있다.
배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대체물은 알부민 (예컨대 지질-풍부 알부민, 소 알부민, 알부민 치환체, 예컨대 재조합 알부민 또는 인간화 알부민, 식물 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해물), 트랜스페린 (또는 다른 철 수송체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 요소, 2-머캅토에탄올, 3'-티오글리세롤, 또는 이에 대한 등가물을 적절하게 함유하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대체물은 예를 들어 국제 공개 번호 98/30679 (그 전문이 본원에 포함됨)에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 임의의 상업적으로 입수가능한 물질은 보다 편리함을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 물질은 넉아웃 혈청 대체물 (KSR), 농축된 화학적으로-정의된 지질 (깁코(Gibco)), 및 글루타맥스(Glutamax) (깁코)를 포함한다.
특정 측면에서, 배지는 하기 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20종 또는 그 초과를 포함할 수 있다: 비타민, 예컨대 비오틴; DL 알파 토코페롤 아세테이트; DL 알파-토코페롤; 비타민 A (아세테이트); 단백질, 예컨대 BSA (소 혈청 알부민) 또는 인간 알부민, 지방산 유리 분획 V; 카탈라제; 인간 재조합 인슐린; 인간 트랜스페린; 슈퍼옥시드 디스뮤타제; 다른 성분, 예컨대 코르티코스테론; D-갈락토스; 에탄올아민 HCl; 글루타티온 (환원됨); L-카르니틴 HCl; 리놀레산; 리놀렌산; 프로게스테론; 푸트레신 2HCl; 아셀레늄산나트륨; 및/또는 T3 (트리오도-I-티로닌). 구체적인 측면에서, 이들 중 1종 이상은 명백하게 배제될 수 있다.
일부 측면에서, 배지는 비타민을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 하기 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13종 (및 그 안의 추론가능한 임의의 범위): 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파-토코페롤, 비타민 A, 염화콜린, 판토텐산칼슘, 판토텐산, 폴산 니코틴아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 이노시톨, 비타민 B12를 포함하거나, 또는 배지는 이들의 조합 또는 이들의 염을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파-토코페롤, 비타민 A, 염화콜린, 판토텐산칼슘, 판토텐산, 폴산 니코틴아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 이노시톨, 및 비타민 B12를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 측면에서, 비타민은 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파-토코페롤, 비타민 A, 또는 이들의 조합 또는 염을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 측면에서, 배지는 단백질을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 단백질은 알부민 또는 소 혈청 알부민, BSA의 분획, 카탈라제, 인슐린, 트랜스페린, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 하기 중 1종 이상을 추가로 포함한다: 코르티코스테론, D-갈락토스, 에탄올아민, 글루타티온, L-카르니틴, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀레늄산나트륨, 또는 트리오도-I-티로닌, 또는 이들의 조합. 일부 측면에서, 배지는 하기 중 1종 이상을 포함한다: B-27® 보충물, 이종-무함유 B-27® 보충물, GS21TM 보충물, 또는 이들의 조합. 일부 측면에서, 배지는 아미노산, 모노사카라이드, 무기 이온을 포함하거나 또는 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산은 아르기닌, 시스틴, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 글루타민, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신, 또는 발린, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 무기 이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 질소, 또는 인, 또는 이들의 조합 또는 염을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 하기 중 1종 이상을 추가로 포함한다: 몰리브덴, 바나듐, 철, 아연, 셀레늄, 구리, 또는 망간, 또는 이들의 조합. 특정 측면에서, 배지는 본원에서 논의된 1종 이상의 비타민 및/또는 본원에서 논의된 1종 이상의 단백질, 및/또는 하기 중 1종 이상을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다: 코르티코스테론, D-갈락토스, 에탄올아민, 글루타티온, L-카르니틴, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀레늄산나트륨, 또는 트리오도-I-티로닌, B-27® 보충물, 이종-무함유 B-27® 보충물, GS21TM 보충물, 아미노산 (예컨대 아르기닌, 시스틴, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 글루타민, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신, 또는 발린), 모노사카라이드, 무기 이온 (예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 질소, 및/또는 인) 또는 이들의 염, 및/또는 몰리브덴, 바나듐, 철, 아연, 셀레늄, 구리, 또는 망간. 구체적인 측면에서, 이들 중 1종 이상은 명백하게 배제될 수 있다.
배지는 또한 1종 이상의 외부적으로 첨가된 지방산 또는 지질, 아미노산 (예컨대 비-필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 시토카인, 항산화제 물질, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 및/또는 무기 염을 함유할 수 있다. 구체적인 측면에서, 이들 중 1종 이상은 명백하게 배제될 수 있다.
배지 성분 중 1종 이상은 적어도, 많아야, 또는 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 180, 200, 250 ng/L, ng/ml, μg/ml, mg/ml, 또는 그 안의 추론가능한 임의의 범위의 농도로 첨가될 수 있다.
구체적인 측면에서, 본 개시내용의 세포는 특이적으로 제제화된다. 이들은 세포 현탁액으로서 제제화될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 구체적인 경우에 이들은 단일 용량 형태로 제제화된다. 이들은 전신 또는 국소 투여를 위해 제제화될 수 있다. 일부 경우에 세포는 사용 전에 저장을 위해 제제화되고, 세포 제제는 1종 이상의 동결보존제, 예컨대 DMSO (예를 들어, 5% DMSO 중)를 포함할 수 있다. 세포 제제는 인간 알부민을 포함하는 알부민을 포함할 수 있으며, 구체적인 제제는 2.5% 인간 알부민을 포함한다. 세포는 정맥내 투여를 위해 특이적으로 제제화될 수 있으며; 예를 들어, 이들은 1시간 미만에 걸친 정맥내 투여를 위해 제제화된다. 특정한 측면에서 세포는 해동시로부터 1, 2, 3, 또는 4시간 또는 그 초과 동안 실온에서 안정한 제제화된 세포 현탁액 중에 있다.
특정한 측면에서, 본 개시내용의 세포는 정의된 항원 특이성의 것일 수 있는 외인성 TCR을 포함한다. 일부 측면에서, TCR은 의도되는 수용자에 대해 부재하는 또는 감소된 동종이식편반응에 기반하여 선택될 수 있다. 외인성 TCR이 비-동종이식편반응성인 예에서, T 세포 분화 동안 외인성 TCR은 대립유전자 배제로 지칭되는 발달 과정을 통해 내인성 TCR 유전자좌의 재배열 및/또는 발현을 억제하여, 단지 비-동종이식편반응성 외인성 TCR만을 발현하고 따라서 비-동종이식편반응성인 T 세포를 발생시킨다. 일부 측면에서, 외인성 TCR의 선택은 반드시 동종이식편반응의 결여에 기반하여 정의되지는 않을 수 있다. 일부 측면에서, 내인성 TCR 유전자는 이들이 단백질을 발현하지 않도록 게놈 편집에 의해 변형되었다. 유전자 편집 방법, 예컨대 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 기재되어 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 세포는 1종 이상의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 추가로 포함한다. CAR이 지정될 수 있는 종양 세포 항원의 예는 예를 들어 적어도 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR 패밀리, 예컨대 ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, EPCAM, EphA2, EpCAM, 폴레이트 수용체-a, FAP, FBP, 태아 AchR, FRα, GD2, G250/CAIX, GD3, 글리피칸-3 (GPC3), Her2, IL-13Rα2, 람다, 루이스(Lewis)-Y, 카파, KDR, MAGE, MCSP, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSC1, PSCA, PSMA, ROR1, SP17, 서비빈, TAG72, TEM, 암배아 항원, HMW-MAA, AFP, CA-125, ETA, 티로시나제, MAGE, 라미닌 수용체, HPV E6, E7, BING-4, 칼슘-활성화된 클로라이드 채널 2, 시클린-B1, 9D7, EphA3, 텔로머라제, SAP-1, BAGE 패밀리, CAGE 패밀리, GAGE 패밀리, MAGE 패밀리, SAGE 패밀리, XAGE 패밀리, NY-ESO-1/LAGE-1, PAME, SSX-2, 멜란-A/MART-1, GP100/pmel17, TRP-1/-2, P. 폴리펩티드, MC1R, 전립선-특이적 항원, β-카테닌, BRCA1/2, CML66, 피브로넥틴, MART-2, TGF-βRII, 또는 VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR2)를 포함한다. CAR은 제1, 제2, 제3, 또는 그 초과의 세대 CAR일 수 있다. CAR은 임의의 2개의 비동일한 항원에 대해 이중특이적일 수 있거나, 또는 이는 2개 초과의 비동일한 항원에 대해 특이적일 수 있다.
XIV. 치료 조성물의 투여
본원에서 제공된 요법은 치료 작용제, 예컨대 제1 항-바이러스 요법 및 제2 항-바이러스 요법의 조합의 투여를 포함할 수 있다. 요법은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 항-바이러스 치료는 순차적으로 (상이한 시간에) 또는 공동으로 (동시에) 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 제1 및 제2 항-바이러스 치료는 별개의 조성물에서 투여된다. 일부 측면에서, 제1 및 제2 항-바이러스 치료는 동일한 조성물 중에 있다.
본 개시내용의 측면은 치료 조성물을 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상이한 요법은 1종의 조성물에서 또는 1종 초과의 조성물, 예컨대 2종의 조성물, 3종의 조성물, 또는 4종의 조성물에서 투여될 수 있다. 작용제의 다양한 조합은 채용될 수 있다.
본 개시내용의 치료 조성물은 동일한 투여의 경로에 의해 또는 상이한 투여의 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 펩티드, 폴리펩티드, 조작된 TCR, 조작된 T 세포, 핵산, 항-바이러스 요법, 또는 제약 조성물은 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 삽입에 의해, 흡입에 의해, 경막내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여된다. 일부 측면에서, 항생제는 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 삽입에 의해, 흡입에 의해, 경막내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여된다. 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 개체의 임상적 상태, 개체의 임상적 내력 및 치료에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 기반하여 결정될 수 있다.
치료는 다양한 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 단위 용량은 치료 조성물의 미리 결정된 양을 함유하는 것으로 정의된다. 투여될 양, 및 특정한 경로 및 제제는 임상 기술분야의 통상의 기술자의 결정의 기술 내이다. 단위 용량은 단일 주사로서 투여될 필요는 없지만, 설정된 기간에 걸쳐 연속적 주입을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 단위 용량은 단일 투여가능한 용량을 포함한다.
치료 조성물의 정확한 양은 또한 실시자의 판단에 좌우되며, 각각의 개체에 대해 특유하다. 용량에 영향을 미치는 인자는 환자의 물리적 및 임상적 상태, 투여의 경로, 치료의 의도된 목표 (증상의 경감 대 치유) 및 대상체가 겪고 있을 수 있는 특정한 치료 물질 또는 다른 요법의 효력, 안정성 및 독성을 포함한다.
XV. 샘플 제조
특정 측면에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 수반한다. 본원에서 제공된 수득 방법은 생검의 방법, 예컨대 미세 바늘 흡인, 코어 바늘 생검, 진공 보조 생검, 절개 생검, 절제 생검, 펀치 생검, 표층 생검 또는 피부 생검을 포함할 수 있다. 특정 측면에서 샘플은 이전에 언급된 임의의 생검 방법에 의해 난소 또는 자궁내막 조직으로부터의 생검으로부터 수득된다. 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 땀, 모낭, 협측 조직, 눈물, 생리혈, 대변, 또는 타액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다른 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 방법의 특정 측면에서, 임의의 의학 전문가, 예컨대 의사, 간호사 또는 의학 기술자는 시험을 위한 생물학적 샘플을 수득할 수 있다. 또한 추가로, 생물학적 샘플은 의학 전문가의 보조 없이 수득될 수 있다.
샘플은 조직, 세포, 또는 대상체의 세포로부터의 또는 그로부터 유래된 생물학적 물질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직의 이질 또는 균질 집단일 수 있다. 생물학적 샘플은 본원에 기재된 분석 방법에 적합한 샘플을 제공할 수 있는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 샘플은 피부 또는 자궁경관의 스크래핑, 뺨의 스와빙, 타액 수집, 소변 수집, 대변 수집, 생리혈, 눈물, 또는 정액의 수집을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-침습적 방법에 의해 수득될 수 있다.
샘플은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 특정 측면에서 샘플은 생검에 의해 수득된다. 다른 측면에서 샘플은 스와빙, 내시경술, 스크래핑, 정맥절개술, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수득된다. 일부 경우에, 샘플은 본 방법의 키트의 성분을 사용하여 수득되거나, 저장되거나, 또는 수송될 수 있다. 일부 경우에, 다수의 샘플, 예컨대 다수의 혈장 또는 혈청 샘플은 본원에 기재된 방법에 의해 진단을 위해 수득될 수 있다. 다른 경우에, 다수의 샘플, 예컨대 한 조직 유형으로부터의 1개 이상의 샘플 (예를 들어 난소 또는 관련된 조직) 및 또 다른 시편으로부터의 1개 이상의 샘플 (예를 들어 혈청)은 방법에 의해 진단을 위해 수득될 수 있다. 샘플은 상이한 시간에 수득되고, 상이한 방법에 의해 저장되고/거나 분석될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 통상적인 염색 방법 또는 임의의 다른 세포학적 분석 방법에 의해 수득되고 분석될 수 있다.
일부 측면에서 생물학적 샘플은 의사, 간호사, 또는 다른 의학 전문가, 예컨대 의학 기술자, 내분비학자, 세포학자, 사혈전문의, 방사선전문의, 또는 호흡기내과전문의에 의해 수득될 수 있다. 의학 전문가는 샘플 상에서 수행하는 적절한 시험 또는 검정을 지시할 수 있다. 특정 측면에서 분자 프로파일링 비즈니스는 어느 검정 또는 시험이 가장 적절하게 지시되는지에 대해 상의할 수 있다. 본 방법의 추가의 측면에서, 환자 또는 대상체는 전혈 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 협측 샘플, 또는 타액 샘플을 수득하는 것과 같이 의학 전문가의 보조 없이 시험을 위한 생물학적 샘플을 수득할 수 있다.
다른 경우에, 샘플은 생검, 바늘 흡인, 채혈, 내시경술, 또는 정맥절개술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 침습적 절차에 의해 수득된다. 바늘 흡인의 방법은 미세 바늘 흡인, 코어 바늘 생검, 진공 보조 생검, 또는 대형 코어 생검을 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 생물학적 물질의 충분한 양을 보장하기 위해 다수의 샘플이 본원의 방법에 의해 수득될 수 있다.
생물학적 샘플을 수득하는 일반적 방법은 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 간행물, 예컨대 문헌 [Ramzy, Ibrahim Clinical Cytopathology and Aspiration Biopsy 2001]은 생검 및 세포학적 방법에 대한 일반적 방법을 기재한다.
본 방법의 일부 측면에서, 분자 프로파일링 비즈니스는 생물학적 샘플을 대상체로부터 직접적으로, 의학 전문가로부터, 제3자로부터, 또는 분자 프로파일링 비즈니스 또는 제3자에 의해 제공되는 키트로부터 수득할 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 대상체, 의학 전문가, 또는 제3자가 생물학적 샘플을 획득하고 이를 분자 프로파일링 비즈니스에 보낸 후에 분자 프로파일링 비즈니스에 의해 수득될 수 있다. 일부 경우에, 분자 프로파일링 비즈니스는 적합한 용기, 및 분자 프로파일링 비즈니스로의 생물학적 샘플의 저장 및 수송을 위한 부형제를 제공할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 측면에서, 의학 전문가는 초기 진단 또는 샘플 획득에 관여할 필요는 없다. 개체는 대안적으로 처방전 없이 살 수 있는 (OTC) 키트의 사용을 통해 샘플을 수득할 수 있다. OTC 키트는 본원에 기재된 바와 같은 상기 샘플을 수득하기 위한 수단, 검사를 위해 상기 샘플을 저장하기 위한 수단, 및 키트의 적절한 사용을 위한 지시서를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 분자 프로파일링 서비스는 키트의 구입을 위한 가격에 포함된다. 다른 경우에, 분자 프로파일링 서비스는 별개로 청구된다. 분자 프로파일링 비즈니스에 의해 사용하는데 적합한 샘플은 시험될 개체의 조직, 세포, 핵산, 유전자, 유전자 단편, 발현 생성물, 유전자 발현 생성물, 또는 유전자 발현 생성물 단편을 함유하는 임의의 물질일 수 있다. 샘플 적합성 및/또는 적절성을 결정하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, 대상체는 전문가, 예컨대 종양학자, 외과의사, 또는 내분비학자에게 추천될 수 있다. 전문가는 마찬가지로 시험을 위한 생물학적 샘플을 수득하거나, 또는 개체를 생물학적 샘플의 제출을 위한 시험 센터 또는 실험실에 추천할 수 있다. 일부 경우에 의학 전문가는 대상체를 생물학적 샘플의 제출을 위한 시험 센터 또는 실험실에 추천할 수 있다. 다른 경우에, 대상체는 샘플을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 분자 프로파일링 비즈니스는 샘플을 수득할 수 있다.
XVI. 검출 및 백신접종 키트
본 개시내용의 펩티드 또는 항체는 키트에 포함될 수 있다. 키트 내의 펩티드 또는 항체는 검출가능하게 표지되거나 또는 또한 키트에 포함되는 지지체 기재의 표면 상에 고정화될 수 있다. 펩티드(들) 또는 항체는 예를 들어, 적합한 형태로, 예컨대 멸균, 동결건조된, 또는 둘 다로 키트에 제공될 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 지지체 기재는 수행될 방법에 기반하여 선택될 수 있다. 비제한적 예로서, 지지체 기재는 다중-웰 플레이트 또는 마이크로플레이트, 막, 필터, 페이퍼, 에멀젼, 비드, 마이크로비드, 미소구, 나노비드, 나노구, 나노입자, 에토솜, 리포솜, 니오솜, 트랜스페로솜, 딥스틱, 카드, 셀룰로이드 스트립, 유리 슬라이드, 마이크로슬라이드, 바이오센서, 측방 유동 장치, 마이크로칩, 콤, 실리카 입자, 자기 입자, 또는 자기-어셈블리 단층일 수 있다.
수행되는 방법에 적절한 바와 같이, 키트는 조성물을 대상체에게 전달하기 위한 또는 다른 방식으로 본 발명의 조성물을 취급하기 위한 1개 이상의 장치를 추가로 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 키트는 시린지, 아이 드로퍼, 탄도 입자 어플리케이터 (예를 들어, 미국 특허 5,797,898, 5,770,219 및 5,783,208, 및 미국 특허 출원 2005/0065463에 개시된 어플리케이터), 스쿠풀라, 마이크로슬라이드 커버, 시험 스트립 홀더 또는 커버 등인 장치를 포함할 수 있다.
키트의 성분을 표지화하기 위한 검출 시약은 본 발명의 방법을 수행하기 위해 키트에 임의로 포함될 수 있다. 특정한 측면에서, 표지화 또는 검출 시약은 관련 기술분야에 통상적으로 사용되고, 제한 없이, 방사성 원소, 효소, UV 범위의 광을 흡수하는 분자, 및 형광단, 예컨대 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드, AMCA 블루 및 루시퍼 옐로우를 포함하는 시약을 포함하는 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 1개 이상의 용기 수단 및 방사성 원소, 효소, UV 범위의 광을 흡수하는 분자, 및 형광단을 포함하는 군으로부터 선택되는 검출 시약으로부터 이미 표지된 BST 단백질 작용제를 포함하는 키트가 제공된다.
키트를 포함하는 시약 및/또는 성분이 동결건조된 형태 (동결건조물)로 또는 건조 분말로서 제공되는 경우, 동결건조물 또는 분말은 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 특정한 측면에서, 용매는 멸균, 제약상 허용되는 완충제 및/또는 다른 희석제일 수 있다. 이러한 용매는 또한 키트의 일부로서 제공될 수 있음이 상정된다.
키트의 성분이 1개 및/또는 초과의 액체 용액에서 제공되는 경우, 액체 용액은 비-제한적 예로서, 멸균 수용액일 수 있다. 조성물은 또한 투여 조성물로 제제화될 수 있다. 이 경우에, 용기 수단은 그 자체가 제제가 신체의 병에 걸린 영역에 적용되고/거나, 대상체 내로 주사되고/거나, 키트의 다른 성분에 적용되거나 또는 그와 혼합될 수 있는 시린지, 피펫, 국소 애플리케이터 등일 수 있다.
XVII. 서열
표 1
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XVIII. 실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 바람직한 측면을 입증하기 위해 포함된다. 이어지는 실시예에 개시된 기술은 본 개시내용의 실시에 있어서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 그의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인식해야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본 개시내용의 관점에서, 개시된 구체적인 측면에서 많은 변화가 이루어질 수 있고, 본 개시내용의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 비슷한 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1: SARS-Cov-2 막 당-단백질-65 (MGP-65) 펩티드, CTL 및 TCR
서열식별번호:22의 HLA-A2 제한된 SARS-Cov-2 에피토프는 COVID-19 감염을 갖는 환자의 면역반응을 검출하는데 또는 질환을 예방하기 위한 환자의 백신접종에 사용될 수 있다. 이 펩티드는 COVID19 면역의 보다 나은 이해를 초래할 연구를 허용할 것이고, COVID-19 감염을 갖는 환자의 관리에 직접적으로 영향을 미칠 것이다. 더욱이, 이 펩티드, CTL, 뿐만 아니라 상응하는 TCR은 HLA-매칭된 표적에 대한 제3자 SARS-Cov-2-특이적 T 세포를 생성하고, 따라서 COVID19 질환을 갖는 환자에 대한 기성 T 세포 요법을 제공하는데 사용될 수 있다. 이어서 생명을 위협하는 바이러스 질환의 치료를 위한 기성 동종이형 T 세포 요법을 뱅킹하는 능력은 전례 없는 것이며, COVID 19-특이적 T 세포 요법에 용이하게 적용될 수 있다.
MGP를 강제 발현하는 A375 세포주 (HLA-A0201+)를 NP-40 완충액을 사용하여 용해시키고, 용해물을 항-MHC 부류 I 항체 (W6/32)와 커플링된 세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow) 비드와 인큐베이션하였다. 비결합된 단백질을 세척한 후, MHC 결합 펩티드를 아세트산을 사용하여 용리하였다. 용리된 펩티드 용액을 농축시키고, 탠덤 질량 스펙트럼을 사용하여 분석하였다. MGP 서열의 하나의 펩티드 히트 (MGP-65, FVLAAVYRI (서열식별번호:22)를 발견하였다. (도 1)
MGP-65 (FVLAAVYRI - 서열식별번호:22) 펩티드를 건강한 공여자의 HLA-A0201 성숙한 수지상 세포 (MDC)에 대해 펄싱하고, 이어서 48 웰 플레이트에서 자가 세포와 공동-배양하였다. 2 라운드의 자극 후, 각각의 웰로부터의 T 세포의 일부를 MGP-65 사량체 및 항-CD8 염색으로의 유동 세포계측법 검출을 위해 수집하였다. 작은 CD8+/사량체+ 집단을 자극 후에 관찰하였다. 사량체+/CD8+ 집단을 나타내는 웰 내의 T 세포를 풀링하고, 사량체+/CD8+ 집단을 분류하고, 급속 확장 프로토콜 (REP)로 확장시켰다. 2주 동안 REP 후, 고 순도 CTL (90% 초과의 사량체+ 집단)을 검출하였다 (도 2).
다양한 농도의 MGP-65 펩티드로 펄싱된 T2 세포를 세포 용해 실험을 위한 표적으로서 사용하였다. MGP-65 특이적 CTL 세포주의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다. 사용된 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 20:1이었다 (도 3A). A375 (HLA-A0201+). eGFP 또는 SARS-Cov-2 MGP의 강제된 발현을 갖는 Mel624 (HLA-A0201+) 세포주를 표적으로서 사용하고, MGP-65 특이적 CTL 세포주와 공동-배양하였다. 사용된 이펙터 대 표적 (E:T) 비는 40:1 내지 1.25:1이었다. 상이한 표적에 대한 MGP-65 CTL 세포주의 용해 능력을 Cr51 방출 검정 (CRA)으로 검출하였다 (도 3B 내지 C). MGP-65 CTL 세포주는 음성 대조군보다 양성 표적에 대해 유의하게 더 높은 살해 수준을 나타낸다 (도 3).
A375-MGP 및 Mel624-MGP를 "고온" 표적 세포로서 사용하고, Cr51로 표지하였다. Cr51 표지화 없이 MGP-65 펩티드로 펄싱된 T2 세포는 "저온" 표적을 나타낸다. 무관한 펩티드 M26으로 펄싱된 T2 세포를 대조군 "저온" 표적으로서 사용하였다. 사용된 E:T는 20:1이었다. 사용된 저온 표적:고온 표적 비는 10:1 또는 20:1이었다. MGP-65 CTL에 대한 저온 표적의 살해 억제를 CRA로 검출하였다. Hormad1-56 펩티드로 펄싱된 T2를 저온 표적으로서 사용하는 경우, 고온 표적에 대한 MGP-65 CTL의 살해는 고온 표적 단독 그룹에 비해 유의하게 억제되었다. M26 음성 대조군으로 펄싱된 T2는 고온 표적에 대한 MGP-65 CTL의 살해를 억제하지 않았다 (도 4).
MGP-65 특이적 CTL 세포주를 T2+M26, T2+MGP-65, A375-eGFP, A375-MGP, Mel624-eGFP 및 Mel624-MGP와 공동-배양하였다 (E:T=10:1). 밤새 공동-배양한 후, TCR 경로 하류 활성화된 마커, CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α를 ICS 검정으로 검출하였다. MGP-65 특이적 CTL 세포주의 CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α의 수준은 이들을 음성 대조군 표적에 비해 양성 표적과 공동-배양한 경우 유의하게 증진되었다 (도 5).
알파 쇄 및 베타 쇄를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR)를 5-RACE PCR 프로토콜을 사용하여 클로닝하였다. 서열을 IMGT의 웹사이트 툴 (IMGT/V-QUEST)을 사용하여 주석하였다 (표 1 내지 3).
표 1
표 2
표 3
TCR 알파 및 베타 쇄를 클로닝하고, 레트로바이러스 벡터 내로 삽입하였다. 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 PBMC를 감염시켰다. CD8+/사량체+ 집단을 감염 후에 검출하였다. 사량체 가이드 분류 및 확장 후, 고도로 순수한 TCR-T 집단이 생성되었다 (도 6). 유사한 방법을 사용하여, TCR-T 세포 집단이 또한 NSP13-134 펩티드 (KLFAAETLK - 서열식별번호:36) (도 23), NSP13-242 펩티드 (TLVPQEHYV - 서열식별번호:35) (도 26), NSP13-400 펩티드 (VYIGDPAQL -서열식별번호:37) (도 29), 및 NSP13-448 펩티드 (IVDTVSALVY - 서열식별번호:34) (도 32)에 대해 생성되었다.
표적 세포를 용해시키는 SARS-CoV-2 특이적 TCR-T의 능력을 Cr51 방출 검정에 의해 시험하였다. 도 7, 24, 27, 30, 및 33에 제시된 바와 같이, SARS-CoV-2 TCR-T는 음성 대조군에 비해 유의하게 더 높은 양성 표적의 용해를 나태난다. NSP13-134 특이적 TCR-T를 SK-MES-1+대조군 A0301 펩티드, SK-MES-1+NSP13-134, SK-MES-1-GFP, SK-MES-1-NSP13, Hs-578T-GFP 및 Hs-578T-NSP13과 공동-배양하였다 (E:T=10:1) (도 25). NSP13-242 특이적 TCR-T를 T2+M26, T2+NSP13-242, A375-GFP, A375-NSP13, RPMI-7951-GFP 및 RPMI-7951-NSP13과 공동-배양하였다 (E:T=10:1) (도 28). NSP13-400 특이적 CD8+ 및 CD4+ TCR-T를 M14+대조군 펩티드, M14+NSP13-400, Hs-578T-GFP, Hs-578T-NSP13, M14-GFP 및 M14-NSP13과 공동-배양하였다 (E:T=10:1) (도 31). NSP13-448 특이적 TCR-T를 A375+대조군 A0101 펩티드, A375+NSP13-448, A375-GFP, A375-NSP13, RPMI-7951-GFP 및 RPMI-7951-NSP13과 공동-배양하였다 (E:T=10:1) (도 34). 밤새 공동-배양한 후, TCR 경로 하류 활성화된 마커, CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α를 ICS 검정으로 검출하였다. 펩티드-특이적 TCR-T의 CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α의 수준은 이들을 음성 대조군 표적에 비해 양성 표적과 공동-배양한 경우 유의하게 증진되었다 (도 25, 28, 31, 및 34).
결론적으로, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 특이적 CTL, 클로닝된 TCR 및 TCR 조작된 T 세포 (TCR-T)를 생성하였고, CTL 및 TCR T 세포를 기능적으로 입증하였다. TCR-T을 사용한 세포 요법은 중증 SARS-CoV-2 감염된 환자의 치료를 위한 임의적 치료 접근법으로서 채용될 수 있다. 확인된 SARS-CoV-2 펩티드 또는 코딩 서열은 제시 세포 내로 로딩되고, T 세포와 공동-배양되어 항원 특이적 CTL 세포주 또는 클론을 생성할 수 있다. 자가 또는 동종이형 CTL 세포주 또는 클론은 SARS-CoV-2 감염을 갖는 HLA-매칭된 환자를 위한 입양 면역요법에 사용될 수 있다.
실시예 2: COVID19 질환의 T 세포-기반 요법을 위한 면역원성 SARS-CoV-2 에피토프 및 동종체 TCR의 질량 분광법적 확인
A. 도입
COVID-19 범유행 발발의 원인이 되는 고도로 전염성 호흡기 바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 세계 공중 보건에 대한 상당한 지속적인 영향을 계속 주고 있으며, 정확한 면역진단, 및 효과적인 치료 전략을 개발해야 할 긴급한 필요를 낳았다 (Hui et al., 2020; Wu et al., 2020b). 창 용첸(Zhang Yongzhen) 박사에 의해 최초로 밝혀진 SARS-CoV-2 게놈 서열의 급속한 보급은 체액성 (항체) 및 세포성 (T 세포) 반응을 유발할 수 있는 보호 백신을 개발하려는 전 세계적인 대규모 노력을 초래하였다 (Wu et al., 2020a). 따라서, 인간 면역계에 의해 인식되는 SARS-CoV-2의 면역원성 에피토프의 확인은 합리적인 백신 개발을 위해 중요할 것이다.
인 실리코 예측 알고리즘을 사용하여, 몇몇 조사자들은 SARS-CoV-2-특이적 T 세포 반응을 탐색하는 부류 I 및 부류 II 제한된 에피토프의 광범위한 패널을 축적하였으며, 일부 경우에, 이들을 게놈의 중첩하는 '메가풀' 스패닝 영역 보존된 영역과 조합하였다 (Campbell et al., 2020; Grifoni et al., 2020a). 이들 펩티드는 감염된 및 회복기 개체에서 반응을 추적하고 (Kar et al., 2020; Peng et al., 2020), 다중-에피토프 백신을 디자인하는데 사용되었고, COVID19 질환의 폭 및 중증도를 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는데 사용되었다 (Braun et al., 2020; Grifoni et al., 2020b; Kar et al., 2020; Le Bert et al., 2020; Nolan et al., 2020; Snyder et al., 2020; Weiskopf et al., 2020). 이들 연구는 COVID19의 T 세포 면역생물학에 대한 통찰을 밝혀내었지만, 인 실리코 예측된 반응 및 중첩하는 긴 펩티드 (OLP) 풀을 사용한 T 세포 반응의 정확성은 이러한 에피토프가 면역원성인지 여부를 고려하지 못함으로써 감소된다. 이러한 의미에서 면역원성 에피토프는 자기-MHC에 의해 제시되는 것으로 공지되어 있고, 펩티드-특이적 T 세포-매개 인식에 대해 표적 세포를 민감화하도록 충분한 표면 밀도를 갖는 MHC 복합체의 맥락에서 T 세포가 항원을 내인적으로 발현하고 항원-유래 펩티드를 제시하는 표적 세포를 인식할 수 있는 충분한 친화도의 이러한 T 세포를 유발할 수 있는 펩티드로 정의된다. 본질적으로, SARS-CoV-2의 면역원성 에피토프는 MHC에 의해 제시되는 펩티드의 직접 시퀀싱 뿐만 아니라 T 세포 면역원성의 경험적 입증 둘 다를 요구한다.
본 발명자들이 알고 있는 바로는, 이 연구는 SARS-CoV-2-발현 세포의 MHC 복합체로부터의 펩티드 용리 후 SARS-CoV-2의 T 세포 에피토프를 확인하는 탠덤 MS의 최초의 사용이며, SARS-CoV-2-특이적 CTL의 시험관내 생성에 의해 면역원성을 경험적으로 입증하는 최초의 연구이다. 말초 혈액 내의 매우 낮은 전구체 빈도 집단으로부터의 희귀한 종양-반응성 T 세포의 단리를 위한 본 발명자들의 그룹에 의해 개발된 실시가능한 기술이 적용되었다 (Chapuis et al., 2017). 본 발명자들은 SARS-CoV-2 게놈의 막 당단백질의 고도로 보존된 영역 및 비-구조적 단백질 영역의 5개의 면역원성 에피토프의 확인에 대한 데이터를 제시하고, 이러한 MGP65- 및 NSP13-특이적 CTL이 SARS-CoV-2 항원 발현 표적 세포를 인식하고 살해함을 입증하며; 본 발명자들은 TCR 알파 및 베타 쇄를 추가로 시퀀싱하였고, 폴리클로날 림프구에서 이 TCR의 발현을 조작함으로써 특이성이 전달될 수 있음을 입증한다.
B. 결과
1. '인 실리코' 정의된 SARS-CoV-2 펩티드는 SARS-CoV-2 항원 발현 표적을 인식하는 T 세포를 유발하는데 실패한다.
면역원성에 대한 공지된 예측된 에피토프의 초기 스크린으로서, 본 발명자들은 이러한 '인 실리코' 예측된 펩티드가 '면역우세'로서 기재된 연구의 문헌 검색에 기반하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 및 막 당단백질 (MGP)에 대한 부류 I-제한된 펩티드를 선택하였다. 이들 펩티드는 COVID19+ 환자 및 놀랍게도, 또한 일부 건강한 공여자에서의 PBMC로부터의 높은 수준의 펩티드-특이적 반응을 생성하는 그들의 능력에 기반하여 '면역우세'인 것으로 이전에 보고되었다 (명백하게 비-병원성 SARS 바이러스에 대한 과거에 유발된 T 세포로부터의 교차-반응성 반응의 결과로서) (Agerer et al., 2021; Ahmed et al., 2020; Gao et al., 2020; Grifoni et al., 2020a; Kar et al., 2020; Safavi et al., 2020; Shomuradova et al., 2020; Sohail et al., 2021; V. Gauttier, 2020; William Chour, 2020). 본 발명자들은 이들 스파이크 단백질 펩티드 중 4종 및 막 당단백질 (MGP) 펩티드 중 3종을 합성하였다. 내인성 T 세포 (ETC) 생성 작업흐름 (방법 섹션을 참조한다)을 사용하여, 본 발명자들은 모든 4종의 스파이크 펩티드 및 모든 3종의 MGP 펩티드에 대한 개별적 T 세포 배양물을 생성하였다 (도 16). 그러나, 이들 고도로 풍부화된 (> 80% 사량체+) T 세포 배양물을 관련된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 막 당단백질을 발현하도록 조작된 HLA-매칭된 표적 세포에 대해 시험한 경우, 표적 세포 살해의 증거는 관찰되지 않았다 (도 16). 본 발명자들은 이들 인 실리코 예측된 펩티드가 내인적으로 제시되지 않았으며; 내인적으로 제시된 면역원성 에피토프를 확인하는 보다 정확한 수단이 요망될 것이고, SARS-CoV-2-발현 세포의 MHC로부터의 펩티드를 직접적으로 용리하고 시퀀싱함으로써 달성될 수 있다고 상정하였다.
2. SARS-CoV-2의 MHC 부류-I 제한된 에피토프의 프로파일링
SARS-CoV-2에 대한 항원 발견 플랫폼은 4개의 단계로 구성된다: (1) SARS-CoV-2 표적에 대한 질량 분광법 (MS)으로의 펩티드 용리 및 확인; (2) 펩티드-특이적 CTL을 유발하는 내인성 T 세포 (ETC) 생성 작업흐름; (3) SARS-CoV2 표적에 대한 항원 특이적 CTL의 경험적 입증; 및 (4) SARS-CoV-2 특이적 T 세포 수용체 (TCR) 조작된 T 세포 (TCR-T) 개발 (도 15). SARS-CoV-2로부터 유래된 MHC 결합된 펩티드를 용리하고 시퀀싱하기 위해, SARS-CoV-2 유전자를 상이한 HLA 대립유전자 발현을 갖는 표적 세포에서 과발현시켰다. SARS-CoV-2 영역의 고도로 보존된 영역에 걸치는 렌티바이러스 발현 벡터: 막 글리콜-단백질 (MGP) 또는 비-구조 단백질 헬리카제 (NSP13) (Keller et al., 2020; Le Bert et al., 2020)를 구축하고, 표적 세포주 A375 (HLA-A0101/0201), Mel624 (HLA-A0201), RPMI-7951 (HLA-A0101/0201), Hs-578T (HLA-A0301/A2402) 및 M14 (HLA-A1101/2402)를 감염시키는데 사용하였다. MGP 또는 NSP13을 안정하게 발현하는 세포주의 푸로마이신 선택 및 확장 후, 90% 초과의 순도를 달성하였다 (데이터는 제시되지 않음). MGP 또는 NSP13-발현 세포주를 3억 내지 5억개로 확장시키고, 수거하고, NP40 세정제 용해 완충액으로 용해시키고, 총 HLA 부류 I 면역침전 (항-HLA-A, B, C) 및 산 용리, 이어서 탠덤 질량 분광법 (MS)에 적용하여 HLA-결합된 펩티드를 분석하였다.
본 발명자들은 처음에 상기 확립된 SARS-CoV-2 표적으로부터 유래된 용리된 HLA 결합된 펩티드를 데이터 의존적 분석 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 (DDA MS/MS)을 사용함으로써 분석하였다. 용리된 스펙트럼을 스위스-프롯 인간 프로테옴 데이터베이스 (버전 2020_05), 이어서 바이러스 프로테옴 데이터베이스 (버전 2020_05)를 갖는 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer) (버전 2.3) 프로세싱 작업흐름 내의 마스코트(Mascot) 검색 엔진 노드 (버전 2.6)를 사용하여 검색하였다. 인간 프로테옴으로부터의 가양성 히트를 감소시키기 위해, 프로테옴 디스커버러 프로세싱 작업흐름 내의 "스펙트럼 컨피던스 필터(Spectrum Confidence Filter)" 노드는 인간 프로테옴으로부터 주석된 고도로 확실한 펩티드-스펙트럼 매치를 갖는 모든 스펙트럼을 필터링하였다. 나머지 스펙트럼을 바이러스 프로테옴에 대해 추가로 검색하였다 (도 8A). 전체적으로, 12,770개의 MS/MS를 획득하고, 9731개의 펩티드-스펙트럼-매치 (PSM)를 주석하여 마스코트 이온 점수 ≥ 25를 갖는 357개의 펩티드를 생성하였다. 357개의 펩티드 중에서 마스코트 이온 점수=27을 갖는 NSP13 (NSP13-400, VYIGDPAQL - 서열식별번호:37)으로부터 유래된 펩티드를 주석하였다 (도 8B). 이 펩티드를 M14-NSP13 세포 (HLA-A1101/A2402)로부터 용리하였다. HLA 결합 검정 (IEDB 툴)으로부터, NSP13-400 펩티드는 HLA-A2402 대립유전자에 대한 높은 예측된 결합 친화도를 득점하였으며 (표 2), 이는 NSP13-400 펩티드가 HLA-A2402에 의해 제시될 가능성이 있음을 시사한다.
SARS-CoV-2로부터의 잠재적 HLA 부류-I 제한된 펩티드의 보다 포괄적인 프로파일링을 가능하게 하기 위해, 본 발명자들은 용리된 펩티드를 SARS-CoV-2로부터 유래되지만 DDA 접근법에 의해 성공적으로 검출되지 않는 예측된 고 확률 HLA 결합 펩티드에 초점을 맞추는 평행 반응 모니터링 질량 분광법 (PRM-MS)에 의해 추가로 분석하였다. PRM-MS 전에, MGP 또는 NSP13으로부터의 10개의 예측된 고 잠재성 HLA-A0101, HLA-0201 또는 HLA-A0301 결합 펩티드를 각각 선택하였다 (표 S1). A375-NSP13으로부터의 용리된 펩티드에 대해, 10개의 잠재적 펩티드의 전구체 이온 포함 목록을 스카이라인을 사용하여 생성하였고, 본 발명자들은 높은 질량 정확성 및 해상도를 갖는 나노플로우 LC-PRM-MS를 사용하여 이들 10개의 펩티드를 표적화하고 모니터링하였다. 피어스(Pierce)™ 펩티드 체류 시간 보정 혼합물 펩티드를 사용하여 체류 시간 이동을 모니터링하고, 스케줄화된 PRM 방법을 조정하였다. 본 발명자들은 먼저 합성 펩티드를 사용하여 스펙트럼 라이브러리를 생성하였고, 본 발명자들은 합성 펩티드 및 피어스™ 펩티드 체류 시간 보정 혼합물 펩티드 둘 다를 사용하여 정규화된 무한한 펩티드-특이적 값인 iRT를 정의하여 각각의 표적화된 펩티드의 체류 시간을 정확하게 예측하였다. 본 발명자들은 -0.7 ppm에서 평균 생성물 이온 ppm 오차를 갖는 IVDTVSALVY (서열식별번호:34) (NSP13-448) (도 8C), -0.7 ppm에서 평균 생성물 이온 ppm 오차를 갖는 TLVPQEHYV (서열식별번호:35) (NSP13-242) (도 8D)를 검출하였다. 동일한 규칙이 적용되었다. A375-MGP로부터, 본 발명자들은 -0.3 ppm에서 평균 생성물 이온 ppm 오차를 갖는 FVLAAVYRI (서열식별번호:22) (MGP-65)를 검출하였다 (도 8E). 이들 XIC MS1 분석은 좁은 m/z 창을 갖는 충분한 크로마토그래피 분리 및 고-해상도 MS1 검출을 보고하였으며, 이는 이들 표적화된 펩티드가 용리된 펩티드 샘플에 존재함을 시사한다. 또한, 추가의 면역원성 기능적 검정을 위해 1개의 잠재적 펩티드 KLFAAETLK (서열식별번호:36) (NSP13-134)를 PRM-MS 스크린으로부터 선택하였다 (도 17) (MS/MS는 제시되지 않음).
DDA 또는 PRM-MS로 확인된 이들 5종의 후보 SARS-CoV-2 HLA 부류-I 제한된 펩티드가 SARS-CoV, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV), 뿐만 아니라 다른 4가지 코로나바이러스 229E, NL63, OC43 및 HKU1을 포함하는 다른 코로나바이러스와 상동인지를 평가하기 위해, 다중 서열 정렬 (MSA) 분석을 수행하였다. NSP13-242 (도 8G), NSP13-134 (도 8H), 및 MGP-65 (도 8J)는 SARS-CoV의 서열과 높은 정도의 상동성을 나타낸다. NSP13-400 (도 8I)은 SARS-CoV, HCoV-OC43 및 HCoV-HKU1 (적색으로 밑줄침)의 서열과 높은 정도의 상동성을 나타낸다. NSP13-448 (도 8F)은 SARS-CoV, HCoV-OC43 (적색으로 밑줄침)의 서열과 높은 정도의 상동성을 나타낸다. 이들 5종의 후보가 비-코로나바이러스 종과 상동인지를 평가하기 위해, 펩티드를 BLAST 검색을 사용함으로써 분석하여 모든 잠재적 공급원 단백질을 확인하였다. 최대 88.99% 동일성 또는 100% 동일성, 그러나 관련된-코로나바이러스와 최대 88.99% 또는 100% 동일성의 커버리지를 보고한 각각의 표적 서열에 대한 상위 250개의 히트는 이들 5종의 후보 펩티드가 단지 코로나바이러스와 상동이지만, 다른 종은 그렇지 않음을 지시하였다 (데이터는 제시되지 않음).
3. 새롭게 정의된 에피토프는 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV2 변이체의 고도로 보존된 영역에서 발견된다
올베라(Olvera) 등은 최근 SARS-CoV-2 컨센서스 서열의 중첩을 사용한 COVID19 백신의 개발을 기재하였다 (Olvera et al., 2020). 이 논문은 NCBI 내의 1700개 초과의 바이러스 게놈 엔트리에 대한 엔트로피-기반 계산을 이용하였고, 최근에 기재된 격자-이동된 및 길이 변이체 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 모든 기재된 SARS-CoV-2 ORF를 포괄하였다. 유행병학적 이해를 돕고 발발 반응을 개선시키는 강력한 분석 및 시각화 툴과 함께 공개적으로 이용가능한 데이터의 계속적으로 업데이트되는 뷰를 제공하는 오픈-소스 프로젝트인 넥스트스트레인 프로젝트 (nextstrain.org에서 온라인으로 발견됨)는 SARS-CoV-2 게놈에 걸친 유전적 다양성을 분석하는 수단을 제공한다. 둘 다의 이들 소스를 사용하여, 본 발명자들은 이들 5종의 펩티드가 SARS-CoV-2 게놈의 고도로 보존된 영역에 위치하였음을 입증하였다 (도 8K). 최근, SARS-CoV-2의 유전적 변이체, 예를 들어, SARS-CoV-2를 보다 감염성이 되게 하는 것으로 믿어지는 스파이크 단백질 상에 위치한 돌연변이 23403 A>G-(D614G)가 전세계적 규모로 나타났다 (Garcia-Beltran et al., 2021; Tzou et al., 2020). 최근 보고된 변이체가 이들 5종의 후보 SARS-CoV-2 HLA 부류-I 제한된 에피토프 내에 위치하는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 영국 (B.1.1.7), 덴마크 (B.1.1.298), 미국 (B.1.429), 브라질 및 일본 (P.2 및 P.1), 및 남아프리카 (B.1.351)에서 최초로 기재된 관심의 변이체에 초점을 맞추었다. NSP-13 영역에 대해, 2개의 돌연변이, E341Y 및 A368V가 P.1 변이체에 존재하며, 하나의 돌연변이 K460R은 B.1.1.7 변이체에 존재하고, 하나의 돌연변이 T588I는 B.1.351 변이체에 존재하며, 이들 중 어느 것도 이들 4개의 NSP-13 HLA 부류-I 제한된 펩티드와 중첩하지 않는다. 막 글리콜-단백질 (MGP) 영역으로부터 변이체 균주는 보고되지 않았다 (도 8L).
4. 말초 혈액으로부터 생성된 MGP-65 펩티드 특이적 세포독성 T 세포는 SARS-CoV-2-MGP-발현 표적 세포를 인식한다
백혈구성분채집술 후, HLA-A0201 건강한 공여자 PBMC를 MGP-65 펩티드 (FVLAAVYRI - 서열식별번호:22)-펄싱된 자가 DC로 자극하였다. 2 라운드의 자극 후, MGP-65-A2 사량체-양성 염색 집단을 검출하였다 (도 9A). 1개의 48 웰 플레이트로부터의 약 33개의 웰은 명백한 MGP-65 펩티드 사량체 양성 CD8+ T 세포 집단을 나타내었으며 (도 8), 이는 MGP-65 펩티드 특이적 T 세포가 심지어 SARS-CoV-2 감염의 내력이 없는 건강한 공여자의 PBMC에서도 동종체 펩티드 자극으로 용이하게 확장됨을 지시한다. 확장된 MGP-65 CTL을 표준 51Cr 방출 검정 (CRA)을 사용하여 기능적으로 시험하였다. 적정된 양의 MGP-65 펩티드로 펄싱된 T2 세포 (HLA-A0201)는 10 pM만큼 낮은 펩티드 농도에서 CTL 인식 및 살해를 유발하였으며 (도 9B), 이는 동종체 펩티드에 대한 MGP-65 CTL의 매우 높은 인식 친화도를 지시한다.
MGP-65 특이적 CTL이 내인적으로 제시된 동종체 펩티드를 인식하였음을 입증하기 위해, HLA-A0201+ 표적 세포를 SARS-CoV-2 MGP 유전자를 발현하도록 조작하였다 (A375-MGP, Mel624-MGP). MGP-65 특이적 CTL은 A375-MGP 및 Mel624-MGP 세포주를 용해시킬 수 있었지만, A375-GFP 및 Mel624-GFP 대조군 세포주는 그렇지 않았다 (도 9C 및 9D). MGP-65 특이적 CTL의 표적 인식이 내인적으로 제시된 동종체 펩티드의 결속을 통한 것이었음을 추가로 확인하기 위해, 저온 표적 억제 검정을 수행하였다. 51Cr 펄싱된 MGP-발현 세포를 51Cr로 방사성표지한 반면, MGP-65 또는 M26 무관한 펩티드 펄싱된 T2 세포는 비표지된 상태로 남겨 두고, 각각 저온 표적 또는 대조군 저온 표적으로서 사용하였다. 20:1 및 10:1 저온 대 고온 표적 (C:H) 비 둘 다에서 저온 표적을 첨가하는 경우, 방사성표지된 MGP-65 펩티드 표적에 대한 MGP-65 특이적 CTL의 세포독성은 유의하게 억제되었다 (도 9E 및 9F). 그러나, 대조군 저온 표적을 첨가한 경우 억제는 없었으며, 이는 MGP-65 CTL이 이어서 내인적으로 제시된 동종체 펩티드의 인식을 통해 MGP-65 표적을 용해시킬 수 있었음을 지시한다. 이 데이터는 MGP-65 펩티드가 천연적인 내인적으로 제시된 MHC 펩티드라는 추가의 증거를 제공하였다.
MGP-65 특이적 CTL의 기능을 추가로 평가하기 위해, 세포내 염색 (ICS) 검정을 수행하여 IFN-γ 및 TNF-α 생산을 검출하였다. MGP-65 특이적 CTL과 MGP-65 펩티드 펄싱된 또는 MGP 조작된 표적 세포의 공동-배양은 무관한 펩티드로 펄싱된 또는 대조군 GFP를 발현하도록 조작된 대조군 표적에 비해 생산된 IFN-γ 및 TNF-α에 의한 특이적 인식을 입증하였다 (도 9G). 관련된 SARS-CoV-2 표적를 대면하는 경우, T 세포 활성화 마커, CD137 및 CD69의 상응하는 증가는 또한 대조군 그룹에 비해 특이적으로 및 유의하게 상승되었다 (도 9G).
5. 말초 혈액으로부터 생성된 NSP13-242-펩티드 특이적 세포독성 T 세포는 SARS-CoV-2-NSP13-발현 표적 세포를 인식한다
구조적 단백질, 예컨대 MGP 및 스파이크 단백질과 대조적으로, SARS-CoV-2의 비-구조적 단백질은 이들이 비리온 표면 상에 발현되지 않기 때문에 체액성 반응을 유도하고 항체를 중화시킬 가능성이 낮다. 그러나, SARS-CoV-2 감염된 세포의 비-구조적 단백질은 MHC 결합된 펩티드로서 제시되고, 오래 지속할 수 있는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 여기서, 동일한 작업흐름을 사용하여, NSP13 헬리카제로부터 유래된 HLA-A0201 제한된 펩티드, NSP13-242 (TLVPQEHYV - 서열식별번호:35)를 MS/MS에 의해 확인하였다. MGP-65와 유사하게, NSP13-242 특이적 T 세포는 ETC 작업흐름을 사용하여 용이하게 생성되었다 (도 10A). 놀랍게도, NSP13-242 펩티드로의 자극 후, 1개의 48 웰 플레이트로부터의 모든 48개의 웰은 명백한 NSP13-242 펩티드 사량체 양성 CD8+ T 세포 집단을 나타내었으며 (도 19), 이는 NSP13-242 펩티드가 고도로 면역원성일 수 있음을 시사한다.
세포독성 검정은 또한 NSP13-242 특이적 CTL이 100pM만큼 낮은 동종체 펩티드를 인식할 수 있었음을 입증하였으며 (도 10B), 이는 고 친화도 TCR의 발현을 지시한다. 보다 중요하게는, NSP13-242 특이적 CTL은 심지어 매우 낮은 E:T 비 (2.5:1)에서도 NSP13 발현 표적 A375-NSP13 및 Mel624-NSP13을 용해시킬 수 있었지만, 대조군 표적은 그렇지 않았으며 (도 10C 및 10D), 이는 NSP13-242 특이적 CTL이 NSP13 단백질의 내인성 제시된 펩티드를 인식할 수 있음을 지시한다. MGP-65 CTL과 유사하게, 저온 표적 억제 검정은 또한 저온 표적이 첨가되는 경우, 고온 표적, A375-NSP13 및 Mel624-NSP13에 대한 NSP13-242 특이적 CTL의 용해 능력이 유의하게 억제되었음을 제시하였으며 (도 10E 및 10F), 이는 NSP13-242 특이적 CTL이 내인적으로 제시된 동종체 펩티드의 인식을 통해 표적을 용해시킴을 추가로 확인시켜 준다.
ICS 검정은 NSP13-242 특이적 CTL이 대조군 표적에 비해, NSP13-242 펩티드 펄싱된 표적 또는 NSP13 발현 표적과 공동-배양되는 경우, 보다 높은 수준의 염증성 시토카인 IFN-γ 및 TNF-α를 생산하고, 보다 높은 수준의 항원-유도된 활성화 마커 CD137 및 CD69를 발현함을 입증하였다 (도 10G). 따라서, MGP-65 특이적 CTL과 유사하게, NSP13-242 특이적 CTL은 또한 SARS-CoV-2를 대면하는 경우 특이적 세포성 면역 반응을 개시할 것이다.
6. 말초 혈액으로부터 생성된 NSP13-448 펩티드 특이적 세포독성 T 세포는 SARS-CoV-2-NSP13-발현 표적 세포를 인식한다
HLA-A0201 대립유전자는 백인 및 아시아인 집단의 약 45%에서 발현된다 (Kessler et al., 2003). COVID19의 전세계적 영향권을 고려하면 SARS-CoV-2의 다른 고도로 만연한 HLA-A 대립유전자의 특이적 T 세포 표적화가 요망될 것이다. MGP65 및 NSP13-242 펩티드에 대한 동일한 작업흐름을 사용하여, 본 발명자들은 HLA-A0101 제한된 펩티드, NSP13-448 (IVDTVSALVY - 서열식별번호:34) 유래 NSP13 단백질을 MS/MS에 의해 확인하였으며; 이 대립유전자는 백인의 약 26% 및 아시아인 집단의 7%를 커버한다 (Kessler et al., 2003). NSP13-242와 유사하게, NSP13-448 특이적 T 세포는 ETC 작업흐름을 사용하여 용이하게 생성되었다 (도 11A). 그러나, NSP13-448 펩티드로의 자극 후, 1개의 48 웰 플레이트로부터의 단지 1개의 웰만이 명백한 NSP13-448 펩티드 사량체-양성 CD8+ T 세포 집단을 나타내었으며 (도 20), 이는 NSP13-448 펩티드가 고도로 면역원성이 아닐 수 있음을 시사한다.
세포독성 검정은 또한 NSP13-448 특이적 CTL이 100nM만큼 낮은 동종체 펩티드를 인식할 수 있었음을 입증하였으며 (도 11B), 이는 중간 내지 낮은 TCR 친화도를 지시한다. 흥미롭게도, NSP13-448 특이적 CTL은 심지어 매우 낮은 E:T 비 (2.5:1)에서도 여전히 NSP13 발현 표적 A375-NSP13 및 RPMI-7951-NSP13을 용해시킬 수 있었지만, 대조군 표적은 그렇지 않았으며 (도 11C 및 11D), 이는 NSP13-448 특이적 CTL이 NSP13 단백질의 내인성 제시된 펩티드를 인식할 수 있음을 지시한다. 저온 표적 억제 검정은 저온 표적이 첨가되는 경우, 고온 표적, A375-NSP13 및 RPMI-7951-NSP13에 대한 NSP13-448 특이적 CTL의 용해 능력이 유의하게 억제되었음을 입증하였으며 (도 11E 및 11F), 이는 NSP13-448 특이적 CTL이 내인적으로 제시된 동종체 펩티드의 인식을 통해 이들 표적을 용해시킴을 추가로 확인시켜 준다.
ICS 검정은 NSP13-448 특이적 CTL이 대조군 표적에 비해, NSP13-448 펩티드 펄싱된 표적 또는 NSP13 발현 표적과 공동-배양되는 경우, 보다 높은 수준의 염증성 시토카인, IFN-γ 및 TNF-α를 생산하고, 보다 높은 수준의 항원-유도된 활성화 마커 CD137 및 CD69를 발현함을 입증하였다 (도 12G).
7. 말초 혈액으로부터 생성된 NSP13-134 펩티드 특이적 세포독성 T 세포는 SARS-CoV-2-NSP13-발현 표적 세포를 인식한다
HLA-A0101 및 HLA-A0201 대립유전자 외에도, HLA-A0301 대립유전자는 백인의 약 22% 및 아프리카인 집단의 13%를 커버한다 (Kessler et al., 2003). 동일한 작업흐름을 사용하여, 본 발명자들은 HLA-A0301 제한된 펩티드, NSP13-134 (KLFAAETLK - 서열식별번호:36) 유래 NSP13 단백질을 확인하였다. ETC 작업흐름을 사용한 시험관내 자극 후, 48개의 웰 중 11개의 웰은 명백한 NSP13-134 펩티드 사량체 양성 CD8+ T 세포 집단을 나타내었으며 (도 21), 이는 NSP13-134 펩티드가 사전 SARS-CoV-2 감염 없이 건강한 공여자에서 T 세포 반응을 유도하도록 충분하게 면역원성임을 지시하였다. 분류 및 확장 후, 고 순도의 CD8+ 및 사량체+ NSP13-134 CTL이 생성되었다 (도 12A). 펩티드 적정 검정은 NSP13-134 특이적 CTL이 100pM만큼 낮은 동종체 펩티드를 인식할 수 있었음을 제시하였으며 (도 12B), 이는 상대적으로 고 친화도 TCR의 발현을 지시한다. MGP-65 및 NSP13-242 특이적 CTL과 유사하게, NSP13-134 특이적 CTL은 심지어 낮은 E:T 비 (2.5:1)에서도 NSP13 발현 표적 Hs-578T-NSP13을 용해시킬 수 있었지만, 대조군 표적은 그렇지 않았다 (도 12C). MGP-65 및 NSP13-242 CTL과 유사하게, 저온 표적 억제 검정은 내인적으로 제시된 동종체 펩티드의 특이적 인식을 확인시켜 주었다 (도 12D). ICS 검정은 또한 NS13 발현 표적의 특이적 인식을 확인시켜 주었다 (도 12E).
8. 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터의 NSP13-400 펩티드 특이적 세포독성 T 세포의 확장 및 기능적 검정
HLA-A0101, HLA-A0201 및 HLA-A0301 외에도, HLA-A2402 대립유전자는 추가의 40% 아시아인 및 20% 백인을 커버한다 (Kessler et al., 2003). 동일한 작업흐름을 사용하여, 본 발명자들은 NSP13의 HLA-A2402 제한된 펩티드, NSP13-400 (VYIGDPAQL - 서열식별번호:37)을 확인하였다. 48개의 웰 중 9개를 사용한 시험관내 자극 후 명백한 NSP13-400 펩티드 사량체 양성 CD8+ T 세포 집단을 나타내었다 (도 22). 분류 및 확장 후, 고 순도의 CD8+ 및 사량체+ NSP13-400 CTL이 생성되었다 (도 13A). MGP-65 CTL과 유사하게, NSP13-400 특이적 CTL은 10pM 농도만큼 낮은 펩티드 적정 검정에서 동종체 펩티드에 대한 매우 높은 인식 친화도 (도 13B) 및 펩티드 적정 검정에 따라, 심지어 1.25:1만큼 낮은 E:T 비에서도 NSP13 발현 표적 Hs-578T-NSP13 및 M14-NSP13의 매우 높은 특이적 용해 (도 13C 및 13D)를 나타내었다. 유사하게, 저온 표적 억제 검정은 저온 표적의 첨가로 유의하게 억제된 고온 표적 Hs-578T-NSP13 및 M14-NSP13에 대한 NSP13-400 CTL의 특이적 수준을 제시하였으며 (도 13E 및 13F), 이는 NSP13-400 특이적 CTL이 내인적으로 제시된 동종체 펩티드의 인식을 통해 SARS-CoV-2 표적을 용해시킴을 추가로 확인시켜 주었다.
ICS 검정은 또한 NS13 발현 표적의 특이적 인식을 확인시켜 주었다 (도 13G). IFN-γ 및 TNF-α 수준은 다른 SARS-CoV-2 CTL 표적 검정에 비해 현저하게 상승되었으며, 이는 고 밀도 내인성 제시를 시사한다.
요약하면, 본 발명자들의 MHC IP 용리 및 MS 확인 작업흐름을 사용하여, 본 발명자들은 백인 및 아시아인 집단의 대략 80%를 커버하는 몇몇 HLA 대립유전자 (HLA-A0101, HLA-A0201, HLA-A0301 및 HLA-A2402)에 의해 제시된 SARS-CoV-2의 구조 단백질 MGP 및 비-구조 단백질 NSP13으로부터 유래된 5종의 HLA 부류-I 제한된 펩티드를 발견하였다. 모든 5종의 펩티드는 고도로 면역원성이고, 건강한 COVID19-음성 공여자 중에서 T 세포 반응을 용이하게 유발할 수 있었다. 모든 5종의 SARS-CoV-2 특이적 CTL은 내인적으로 제시된 동종체 펩티드를 인식하고, SARS-CoV-2 + 표적을 특이적으로 용해시킨다.
9. MGP-65 특이적 T 세포 수용체 조작된 T 세포 (TCR-T)는 SARS-CoV-2 MGP-65 발현 표적 세포를 인식한다
이들 발견이 COVID19 환자의 "기성" SARS-CoV-2 특이적 T 세포 요법의 개발을 초래할 수 있다는 원리의 증거로서, 본 발명자들은 MGP-65 특이적 T 세포로부터의 TCR 알파 및 베타 쇄를 시퀀싱 및 클로닝하고, 말초 혈액 림프구 (PBL)에 대한 특이성 및 기능을 전달하는 것이 가능한지를 결정하였다. 서열 주석은 TRAV17*01F/TRAJ50*01F 하위유형에 속하는 알파 쇄 (TCR-α) 및 TRBV9*02F/TRBJ2-1*01F/TRBD1*01F에 속하는 베타 쇄 (TCR-β)를 밝혀내었다 (표 3). 절단 펩티드 푸린 및 P2A와 연결된 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄의 전장을 함유하는 레트로바이러스 벡터 pMSGV1을 구축하고, 또 다른 HLA-A0201 건강한 공여자의 OKT3 활성화된 동종이형 PBL을 감염시키는데 사용하였다. 5일의 감염 후, 약 37% CD8+사량체+ T 세포 집단이 관찰되었으며 (도 14A), 이는 동종이형 PBL에서 성공적인 외인성 TCR 쌍형성을 지시한다. 분류 및 확장 후, 고 순도 MGP-65 특이적 TCR-T 세포가 생성되었다 (도 14A).
MGP-65 특이적 TCR-T의 기능 및 특이성을 평가하기 위해, 세포독성 51Cr 방출 검정 (CRA) 및 세포내 염색 (ICS) 검정을 수행하고, 모 MGP-65-특이적 CTL 주와 비교하였다. MGP-65 TCR-T는 10 pM만큼 낮은 펩티드 농도에서 적정된 펩티드 펄싱 표적을 인식할 수 있었으며 (도 14B), 이는 TCR-T가 또한 동종체 펩티드의 고 친화도 인식을 나타내었음을 지시한다. 더욱이, MGP-65 TCR-T는 MGP 발현 표적 A375-MGP 및 M624-MGP를 특이적으로 용해시켰으며 (도 14C 및 14D), 이는 모 CTL에 비해, MGP-65 특이적 TCR-T가 MGP 발현 표적 또는 MGP-65 펩티드 펄싱 표적과 공동-배양되는 경우, 보다 높은 수준의 IFN-γ 및 TNF-α, 뿐만 아니라 활성화 마커, CD137 및 CD69를 생산하였음을 입증하는 ICS 검정과 상응한다 (도 14E).
C. 논의
지금까지, SARS-CoV2에 대한 거의 1,500개의 예측된 부류 I 에피토프가 인 실리코 예측 방법에 의해 확인되었고, 일부 경우에, COVID19를 갖는 환자의 PBMC를 사용하여 T 세포 반응을 유발함으로써 '입증되었다' (Campbell et al., 2020; Grifoni et al., 2020a). 이들 펩티드는 COVID19에 대한 환자, 및 가끔 건강한 공여자의 T 세포 반응, 및 COVID19 백신을 평가하는데, 및 점점 더, T 세포-기반 요법을 개발하는데 광범위하게 사용되었다. 그러나, 입증되지 않은 것은 임의의 이들 1,500개의 예측된 펩티드가 실제로 SARS-CoV2+ 세포에 의해 프로세싱되고 제시되는지 및 T 세포에 의해 인식되는 천연-발생 에피토프를 나타내는지 여부이다. 폭넓게 인용된 보고 중에서 "면역우세"로 간주되는 예측된 SARS-CoV2 에피토프의 예비 스크린은 이 전제를 뒷받침하는 것으로 보인다: 본 발명자들은 이들 8종의 예측된 펩티드 중 7종이 SARS-CoV2+ 표적의 인식을 초래할 T 세포 반응을 유발할 수 없었음을 발견하였으며, 이는 이들 펩티드에 대한 반응이 인위적이거나, 또는 기껏해야 교차-반응성일 수 있음을 시사한다 (도 15) (Agerer et al., 2021; Ahmed et al., 2020; Gao et al., 2020; Grifoni et al., 2020a; Kar et al., 2020; Safavi et al., 2020; Shomuradova et al., 2020; Sohail et al., 2021; V. Gauttier, 2020; William Chour, 2020). 지금까지, 면역원성에 대한 SARS-CoV2 에피토프의 경험적 입증은 없었다.
본 발명자들은 SARS-CoV-2에 대한 면역원성 에피토프가 MHC로부터 용리된 펩티드를 직접적으로 분석하고, 이어서 이러한 펩티드가 SARS-CoV-2 항원-발현 표적을 인식하는 T 세포를 유발할 수 있는지를 결정함으로써 면역원성을 입증함으로써 경험적으로 가장 잘 정의되고 상정한다. 질량 분광법 (MS)은 천연적으로 발현되는 항원성 에피토프를 정확하게 확인하는 이상적인 분석 접근법이며, 조사자들이 감염된 세포에 의한 항원성 단백질의 차등적 발현 및 프로세싱과 연관된 복잡성을 다루는 것을 가능하게 한다. SARS-CoV2 유전자를 발현하도록 조작된 세포로부터의 MHC-항원성 펩티드 복합체의 면역친화성 포획에 기반하여, 이 접근법은 SARS-CoV2 이뮤노펩티돔의 직접 프로파일링 및 확인을 허용하였다. 이들 후보 에피토프에 대한 T 세포 반응을 유발함으로써, 본 발명자들은 SARS-CoV2+ 세포의 경험적 인식 및 이들 펩티드의 내인성 제시를 확인한다.
본 연구에서, 본 발명자들은 일반적 집단의 > 75% 중에서 만연한 부류 I 대립유전자 (HLA-A*0101, A*0201, A*0301, HLA-A*2402)에 의해 제시된, 구조적 (MGP) 및 비-구조적 유전자 (NSP13)에 의해 발현되는 5종의 부류 I-제한된 SARS-CoV2 에피토프를 확인하고 입증한다. 이들 대립유전자를 코딩하는 재조합 벡터를 사용하여, 본 발명자들은 SARS-CoV2 막 당단백질 (MGP) 및 비-구조적 단백질-13 (NSP13) 유전자의 고도로 보존된 영역의 발현을 조작하고, MHC를 회수하고, 펩티드를 용리하고, 데이터 의존적 분석 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법 (DDA MS/MS)을 적용하여 12,000개 초과의 스펙트럼을 생성하고, 이어서 이를 몇몇 후보 펩티드 에피토프에 대해 디콘볼루션하고 필터링하였다. SARS-CoV2-발현 표적 세포를 인식하고 살해하며, 한 예에서, SARS-CoV2 MGP에 대한 조작된 TCR을 갖는 말초 혈액 림프구의 특이성을 재지정할 수 있는 펩티드-특이적 T 세포를 유발하는 그들의 능력에 기반하여 5종의 펩티드의 면역원성을 입증하였다.
유의미한 항-바이러스 T 세포 반응을 유발하는 것의 중요성은 널리 문서화되었으며; SARS- 및 MERS-반응성 T 세포는 보호적 역할을 갖는 것으로 밝혀졌다 (Poland et al., 2020). SARS-CoV-2-특이적 T 세포 반응의 출현은 지속된 바이러스 청소와 연관되는 것으로 최근 제시되었으며, SARS-CoV-2에 대한 세포성 면역을 촉진시키는 백신을 개발하는 것의 중요성을 강조한다 (Gallais et al., 2021; Long et al., 2020; Sekine et al., 2020).
최근, SARS-CoV2의 돌연변이체 탈출 변이체의 출현은 우세하게 혈청학적 반응을 유발하는 현재의 백신으로의 면역화 후 바이러스 보호에 있어서 가능한 돌파구에 대한 세계적 관심을 초래하였다 (Abdool Karim and de Oliveira, 2021; Agerer et al., 2021; Darby and Hiscox, 2021; Kuzmina et al., 2021; Plante et al., 2021). 비-표면, 비-구조적 단백질을 표적화함으로써, 이 경우 바이러스 헬리카제, 탈출 변이체를 코딩하는 nsp13은 개발될 가능성이 적으며; 사실, 공지된 변이체 중 어느 것도 여기서 확인된 에피토프 서열 중에서 돌연변이를 보유하지 않는다. 더욱이, 제시된 전략은 거의 임의의 SARS-CoV2 유전자에 걸치는 에피토프의 확인을 허용하며; 바이러스-필수 유전자 표적의 선택은 항원-소실 변이체의 선택을 완화시키는 합리적인 T 세포-기반 접근법 및 장기 바이러스 면역보호에 대한 잠재성을 제공한다.
COVID19 감염 및 제어의 풍경을 정의하는데 동등하게 중요하게, 그의 자연적 내력, 백신 효능 및 치료 개입은 SARS-CoV2-특이적 면역 반응의 정확한 척도이다. 부류 II 및 부류 I-제한된 반응을 평가하는데 현재 사용중인 예측된 펩티드의 풀은 광범위하게 사용되었고, 전체 면역 반응의 척도를 제공하는 것으로 보이지만, SARS-CoV2-특이적 면역은 대다수의 펩티드가 면역원성이 아닐 수 있는 경우 불량하게 정의되며; 고도로 정의된 펩티드의 하위세트의 사용은 COVID19 감염에 대한 T 세포 면역 반응의 보다 정확한 표시를 제공할 수 있다. 5종의 펩티드의 본 발명자들의 현재 패널은 광범위하지 않지만, 이는 몇몇 고도로 만연한 대립유전자형에 의해 제시된 SARS-CoV2 게놈의 고도로 보존된 영역을 나타내며, 부류 II 뿐만 아니라 부류 I-제한된 에피토프에 용이하게 적용될 수 있다. 18개의 에피토프의 보다 광범위한 패널이 제조되었으며, 임상적 상관관계 연구를 위해 평가될 것이다.
마지막으로, 이 방식으로 정의된 에피토프에 대한 면역원성의 추가의 증거로서 (탠덤 질량 분광법, 이어서 경험적 시험관내 입증에 의해), 본 발명자들은 MGP65-특이적 T 세포의 알파 및 베타 쇄를 코딩하는 벡터를 사용하여 기능적 SARS-CoV2-특이적 TCR을 재구성하였다. 이 전략은 추가로 입양 TCR-T-기반 요법에 대한 기성 시약을 제공하며, 바이러스 게놈의 고도로 보존된 영역에 걸치고, COVID19-감염된 환자의 세포-기반 요법에 대한 고 만연성 HLA 대립유전자의 폭넓은 패널을 나타내는 MS/MS-정의된 SARS-CoV2 에피토프의 매트릭스를 인식하는 TCR-T 벡터의 집합을 상상할 수 있다.
D. 표
표 2. 확인된 SARS-CoV-2 에피토프의 개요
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표 3: 알파 및 베타 쇄 개요
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표 S1. PRM-MS 분석을 위한 MGP 또는 NSP13의 예측된 고 HLA 결합 펩티드
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E. STAR 방법
혈액 공여자 및 세포주: HLA-A0101, HLA-A0201, HLA-A0301 또는 HLA-A2402 대립유전자를 발현하는 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플을 반응하는 T 세포 및 자가 항원 제시 세포의 공급원으로서 헤마케어(HemaCare) (미국 캘리포니아주)로부터 구입하였다. TAP-결핍성 T-B 세포 하이브리드 세포주 T2, 흑색종 세포주 A375 (HLA-A0101/0201), RPMI-7951 (HLA-A0101/0201) 및 피닉스(Phoenix)-GP를 ATCC (미국 버지니아주)로부터 구입하였다. 흑색종 세포주 Hs-578T (HLA-A0301/2402) 및 M14 (HLA-A1101/2402)를 NCI로부터 구입하였다. 흑색종 세포주 Mel624 (HLA-A0201)는 스티븐 로젠버그(Steven Rosenberg) 박사 (NCI)로부터 받은 것이었다. 림프모구성 세포주 (LCL)는 본 발명자들의 실험실에서 확립된 EBV-형질전환된 림프모구성 세포주이다. 암 세포주를 헤페스(Hepes) (25 mM), L-글루타민 (4mM), 페니실린 (50 U/ml), 스트렙토마이신 (50 mg/ml), 피루브산나트륨 (10 mM), 비필수 아미노산 (1 mM), 및 10% 소 태아 혈청 (FBS) (시그마(Sigma), 미국 미주리주)을 갖는 RPMI-1640 배지에서 유지하였다. 피닉스-GP를 헤페스 (25 mM), L-글루타민 (4mM) 및 10% FBS를 갖는 DMEM 배지에서 배양하였다.
렌티바이러스 형질도입: SARS-CoV-2로부터의 ORF1b의 막 당-단백질 (MGP) 및 비-구조 단백질 13 (NSP13)의 cDNA를 진스크립트(Genscript) (미국 뉴저지주)로부터 구입하고, GFP의 융합을 갖는 렌티바이러스 벡터 pLVX (타카라(TAKARA), 미국 캘리포니아주) 내로 클로닝하였다. 이 벡터에서, 발현 유전자는 인간 EF1 프로모터에 의해 유도되었다. MGP-pLVX 또는 NSP13-pLVX 렌티바이러스 벡터를 VSVG 외피 벡터를 함유하는 패키지 벡터와 함께 패키지 세포주 293T 내로 형질감염시켜 렌티바이러스를 제조하였다. A375, Mel624, RPMI-7951, Hs-578T 및 M14 세포주를 MGP-pLVX 또는 NSP13-pLVX 렌티바이러스 벡터로 감염시키고, 안정한 세포주를 푸로마이신 선택으로 스크리닝하였다. 유동 세포계측법 (노보사이트(NovoCyte) 유동 세포계측기 시스템, 애질런트(Agilent), 미국 캘리포니아주)을 사용하여 GFP의 백분율을 분석함으로써 MGP 또는 NSP13 유전자 발현 효율을 검출하였다.
HLA 부류-I 결합 펩티드 확인: 면역-침전 (IP) 및 탠덤 질량 분광법 (MS) 방법을 통한 HLA 부류-I 결합 펩티드 단리 및 확인은 이전의 연구로부터 참조된다 (Bradley et al., 2020). 간략하게, SARS-CoV-2 MGP 또는 NSP13 유전자를 발현하도록 조작된 약 3억 내지 5억개의 세포를 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈(Roche), 미국 캘리포니아주)로 보충된 저온 NP40 용해 완충액에서 균질화하였다. 용해물을 후속 원심분리 및 여과 단계에 의해 청소하였다. 청소된 용해물로부터의 HLA 부류 I 분자를 실온에서 2시간 동안 항-HLA-A, B, C 모노클로날 항체 (W6/32) 커플링된 세파로스-4B 수지 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 미국 일리노이주)와 인큐베이션하였다. 비-결합된 단백질을 PBS에 의해 세척하였다. 이어서 그들의 펩티드가 결합된 HLA 분자를 0.1N 아세트산을 갖는 친화성 칼럼으로부터 용리하였다. 분리된 펩티드를 3 kDa 컷-오프 원심분리 한외여과기 (밀리포어(Millipore), 미국 미주리주)를 사용하여 HLA 분자로부터 분리하고, 이어서 진공 원심분리를 사용하여 농축시켰다.
펩티드를 질량 분광법 획득 전에 물 중 0.1% 포름산에서 재구성하였다. 뉴 오브젝티브 피코프릿(New Objective PicoFrit) 나노스프레이 칼럼 (360 μm OD x 75 μm ID)을 마이쉬(Maisch) 박사의 3 μm 레프로실-퍼(ReproSil-Pur) C18 비드로 30 cm로 패킹하였다. 동일한 C18 비드를 사용하여 한쪽 단부 상에 카실(Kasil)로 적합화된 360 μm x OD 150 μm ID 융합된 실리카 모세관을 사용하여 25mm 트랩 칼럼을 패킹하였다. 펩티드를 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) EASY-nLC 1200을 사용하여 분리하였다. 용매 A는 물 중 0.1% 포름산이고, 용매 B는 80% 아세토니트릴 중 0.1% 포름산이었다. 각각의 주사에 대해, 10 내지 15 μL를 로딩하고, 250 내지 300 nL/분에서 5에서 40% 용매 B의 25 내지 60분 구배를 사용하여 용리하였다. 써모 사이언티픽 큐-이그잭티브(Q-Exactive) HF 또는 오비트랩 익스플로리스(Orbitrap Exploris) 480 탠덤 질량 분광기를 사용하여 질량 스펙트럼을 데이터-의존적 획득 (DDA) 또는 평행 반응 모니터링 (PRM)을 사용하여 획득하였다.
큐-이그잭티브 HF 상에서의 DDA 획득: 전구체 스펙트럼 (400 내지 1600 m/z)을 3e6에서 자동 이득 제어 (AGC) 표적 세트 및 100 ms의 최대 주사 시간으로 60,000 해상도에서 수집하였다. 단편 스펙트럼을 1e5에서 AGC 표적 세트 및 25 ms의 최대 주사 시간으로 15,000 해상도에서 수집하였다. 단리 폭은 1.6 m/z로 설정되었다. 정규화된 충돌 에너지를 27에서 설정하였다. 단편화를 위한 상위-20개의 가장 강한 전구체 이온을 선택하였다. 단지 5e3의 AGC 역치를 갖는 +2 내지 +4의 전구체 전하를 포함하는 전하 배제가 가능하게 되었다. 동적 배제를 모든 동위원소 클러스터를 배제하기 위해 10초로 설정하였다.
PRM 획득 오비트랩 익스플로리스 480: 전구체 스펙트럼 (400 내지 1600 m/z)을 표준 AGC 표적 세트 및 자동 최대 주사 시간으로 30,000 해상도에서 수집하였다. RF 렌즈를 50%에서, 사이클 시간을 3초에서 설정하였다. 단편 스펙트럼 스캔 범위를 500 내지 1600에서 설정하고, 표준에서 AGC 표적 세트 및 자동 주사 시간으로 15,000 해상도에서 수집하였다. 단리 폭을 비스케줄화된 시간 모드를 갖는 2 m/z로 설정하였다. 정규화된 충돌 에너지를 30%에서 설정하였다. 관심의 양성자화된 전구체 펩티드 이온의 m/z 값을 함유하는 포함 목록을 스카이라인-데일리 (버전 20.2.1.135)에서 생성하였다.
펩티드 선택 및 입증: 획득된 MS/MS 스펙트럼을 분석하기 위해, 프로테옴 디스커버러 2.3 내의 마스코트 검색 엔진 노드 (버전 2.6)를 사용함으로써 스펙트럼을 스위스-프롯 단백질 데이터베이스 (버전 2020_05)에 대해 검색하였다. 효소 명세가 없는 2개의 소실된 절단을 허용하는 단일동위원소 모체 및 단편 이온 질량을 사용하여 15 ppm의 전구체 펩티드 질량 내성 및 15 ppm의 단편 이온 질량 내성으로 검색을 수행하였다. 분류체계는 호모 사피엔스(Homo sapiens) (20,386개의 서열) 및 바이러스 (17,008개의 서열)에 제한되었다. 가발견율 (FDR)을 프로테옴 디스커버러 (버전 2.3) 내의 "타겟 데코이 PSM 밸리데이터(Target Decoy PSM Validator)" 노드 및 추가의 분석을 위해 보유되는 ≤ 1%의 FDR을 갖는 단백질/펩티드를 사용하여 결정하였다. 이들 추정적 펩티드에 대한 예측된 결합을 결정하고, IEDB T 세포 에피토프 예측 툴 (http://tools.iedb.org/main/tcell/)에 의해 필터링하였다.
SARS-CoV-2 특이적 T 세포의 생성: 항원-특이적 T 세포 자극의 생성을 본 발명자들의 내인성 T 세포 (ETC) 생성 작업흐름에 따라 수행하였다 (Chapuis et al., 2016). 간략하게, 부착성 PBMC를 GM-CSF (800 U/mL) 및 IL-4 (500 U/mL)로 6일 동안 처리하여 미성숙한 DC (iDC)를 생성하고, 이어서 iDC를 TNF-α (10 ng/mL), IL-1β (2 ng/mL), IL-6 (1000 U/mL), PGE-2 (1000 ng/mL)를 함유하는 시토카인 칵테일로 추가의 2일 동안 성숙시켰다. 후보 SARS-CoV-2 펩티드를 PBS/HSA 중 MGP-65 (FVLAAVYRI - 서열식별번호:22, HLA-A0201), NSP13-448 (IVDTVSALVY - 서열식별번호:34, HLA-A0101), NSP13-242 (TLVPQEHYV - 서열식별번호:35, HLA-A0201), NSP13-134 (KLFAAETLK - 서열식별번호:36, HLA-A0301), NSP13-400 (VYIGDPAQL - 서열식별번호:37, HLA-A2402) (모두 미국 뉴저지주 진스크립트로부터 구입함)에 대한 HLA-매칭된 성숙한 DC 상에서 펄싱하였다. 이어서 펩티드 펄싱된 DC를 헤페스 (25 mM), L-글루타민 (4mM), 페니실린 (50 U/ml), 스트렙토마이신 (50 mg/ml), 피루브산나트륨 (10 mM), 및 10% 인간 AB 혈청을 갖는 RPMI-1640에서 자가 PBMC와 공동-배양하였다. 배양에서 7일 후, T 세포 배양물을 전과 같이 펩티드-펄싱된 DC로 재자극하였다. IL-2 (10 U/mL) 및 IL-7 (5 ng/mL)을 제2일에 첨가하였다.
분류 및 확장: 2회의 자극 사이클 후, 각각의 웰의 분취물을 HLA 매칭된 SARS-CoV2 펩티드로 폴딩된 주문제작 PE-접합된 MHC 사량체로, 및 APC-Cy7 접합된 항-CD8 항체 (바이오레전드(Biolegend), 미국 캘리포니아주)로 염색하였다. 세포를 세척하고, 유동 세포계측법 (노보사이트 유동 세포계측기 시스템, 애질런트, 미국 캘리포니아주)에 의해 분석하였다. 사량체 양성 염색 웰을 풀링하고, CD8/사량체 이중 양성 집단을 유동 세포계측 분류 (아리아(ARIA) II 분류기, 비디, 미국 캘리포니아주)를 사용하여 분류하고, 이어서 급속 확장 프로토콜 (REP)을 사용하여 헤페스 (25 mM), L-글루타민 (4mM), 페니실린 (50 U/ml), 스트렙토마이신 (50 mg/ml), 피루브산나트륨 (10 mM), 10% 소 태아 혈청 (FBS), 조사된 PBMC 및 LCL 공급자 세포를 갖는 RPMI-1640을 함유하는 멸균 25 mL 플라스크에서 이전에 기재된 바와 같이 확장시켰다 (Chapuis et al., 2012). 확장 후, 항원 특이적 T 세포의 순도를 항-CD8 항체로 결정하고, MGP-65, NSP13-448, NSP13-242, NSP13-134, 또는 NSP13-400 사량체 염색을 다시 하였다.
SARS-CoV-2 특이적 T 세포의 기능 분석: 확장 후 정제된 SARS-CoV-2 특이적 T 세포의 세포독성을 표준 크로뮴 (51Cr) 방출 검정 (CRA)을 사용하여 확인하였다. 펩티드 용량 적정 실험을 수행하여 SARS-CoV-2 CTL의 동종체 펩티드 인식을 시험하였다. 적정 농도의 MGP-65 또는 NSP13-242 펩티드-펄싱된 T2 세포 (HLA-A2+)를 MGP-65 또는 NSP13-242 CTL에 대해 평가하기 위해 사용하고; NSP13-448 CTL에 대해 NSP13-448 펩티드 펄싱된 A375 세포 (HLA-A1+); NSP13-134 CTL에 대해 NSP13-134 펩티드 펄싱된 Hs-578T 세포 (HLA-A3+), 및 NSP13-400 CTL에 대해 NSP13-400 펄싱된 M14 세포 (HLA-A24+)를 사용하였다. 표적 세포를 1 ml의 종양 세포 배양 배지 중 100 μCi 51Cr (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 캘리포니아주)로 1시간 동안 표지하고, 이어서 세척하고, 웰당 2,000개의 표적 세포로 삼중으로 플레이팅하였다. MGP-65, NSP13-448, NSP13-242, NSP13-134 또는 NSP13-400 특이적 T 세포를 20:1의 이펙터-대-표적 (E:T) 세포 비로 4시간 동안 첨가하였다. 상청액을 웰로부터 수집하고, 감마 방사선 카운터로 51Cr 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해의 백분율을 배경 51Cr 방출에 대해 및 NP40 용해된 표적 세포에 의해 측정된 바와 같은 최대 51Cr 방출에 비해 보정하여 계산하였다 (Pollack et al., 2014).
MGP 또는 NSP13 유전자를 발현하도록 조작된 종양 세포주를 표적으로서 사용하여 내인적으로 제시된 에피토프의 SARS-CoV-2 특이적 T 세포 인식을 평가하였다. A375-MGP, Mel624-MGP (HLA-A0201+, MGP+), A375-GFP, Mel624-GFP (HLA-A0201+, GFP+)를 MGP-65 특이적 T 세포 활성을 평가하는데 사용하고; NSP13-448 특이적 T 세포 활성에 대해 A375-NSP13, RPMI-7951-NSP13 (HLA-A0101+, MGP+), A375-GFP, RPMI-7951-GFP (HLA-A0101+, GFP+); NSP13-242 특이적 T 세포 활성에 대해 A375-NSP13, Mel624-NSP13 (HLA-A0201+, NSP13+), A375-GFP, Mel624-GFP; NSP13-134 특이적 T 세포 활성에 대해 Hs-578T-NSP13 (HLA-A0301+, HLA-A2402+, NSP13+), Hs-578T-GFP (HLA-A0301+, HLA-A2402+, GFP+) 및 NSP13-400 특이적 T 세포 활성에 대해 M14-NSP13 (HLA-A2402+, NSP13+), Hs-578T-NSP13, M14-GFP (HLA-A2402+, GFP+), Hs-578T-GFP를 사용하였다. 51Cr 표지된 표적 세포를 다양한 이펙터-대-표적 (E:T) 세포 비로 SARS-CoV-2 특이적 T 세포와 공동-배양하였다. 인큐베이션 기간 후, 항원-특이적 표적 세포 용해를 상기와 같이 결정하였다.
저온 표적 억제 검정: 관련된 종양 표적에 대한 에피토프 및 항원-특이성을 확인하기 위해, 저온 표적 억제 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Park et al., 2017). MGP-65 특이적 T 세포 시험을 위해, 51Cr로 표지된 A375-MGP 및 Mel624-MGP 세포를 '고온' 표적으로서 사용하였다. MGP-65 펩티드 (10μg/ml)로 펄싱된 비-방사성표지된 T2 세포를 저온 표적으로서 사용하였다. M26 대조군 펩티드 (ELAGIGILTV - 서열식별번호:39, HLA-A0201)로 펄싱된 비-방사성표지된 T2 세포를 대조군 저온 표적으로서 사용하였다. MGP-65 특이적 T 세포를 고온 표적과 공동-배양하기 전에, 저온 표적 (방사성표지된 고온 표적보다 10 또는 20배 더 큰 수)을 첨가하고, 주어진 항원-특이적 T 세포와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 51Cr-표지된 고온 표적을 E:T 비 (20:1)로 첨가하고, 추가의 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, MGP-65 특이적 T 세포에 의한 표적 세포 용해를 상기 결정하였다. 유사하게, NSP13-448 특이적 T 세포에 대해, 51Cr로 표지된 A375-NSP13 및 RPMI-7951-NSP13 세포를 고온 표적으로서 사용하였다. NSP13-448 펩티드 또는 VGLL1 HLA-A0101 펩티드 (LSELETPGKY - 서열식별번호:40)로 펄싱된 비-방사성표지된 A375 세포 (Bradley et al., 2020)를 각각 저온 표적 및 대조군 저온 표적으로서 사용하였다. NSP13-242 특이적 T 세포에 대해, 51Cr로 표지된 A375-NSP13 및 Mel624-NSP13 세포를 고온 표적으로서 사용하였다. NSP13-242 펩티드 또는 M26 펩티드로 펄싱된 비-방사성표지된 T2 세포를 각각 저온 표적 및 대조군 저온 표적으로서 사용하였다. NSP13-134 특이적 T 세포에 대해, 51Cr로 표지된 Hs-578T-NSP13 세포를 고온 표적으로서 사용하였다. NSP13-134 펩티드 또는 A3 대조군 펩티드 (KVFPCALINK - 서열식별번호:41, HLA-A0301)로 펄싱된 비-방사성표지된 Hs-578T 세포를 저온 표적 또는 대조군 저온 표적으로서 사용하였다. NSP13-400 특이적 T 세포 시험을 위해, 51Cr로 표지된 Hs-578T-NSP13 및 M14-NSP13 세포를 고온 표적으로서 사용하였다. NSP13-400 펩티드 또는 MAGEA4 HLA-A2402 펩티드 (NYKRCFPVI - 서열식별번호:42)로 펄싱된 비-방사성표지된 M14 세포를 저온 표적 또는 대조군 저온 표적으로서 사용하였다.
세포내 염색 (ICS) 검정: 100만개의 SARS-CoV-2 특이적 T 세포 (MGP-65, NSP13-448, NSP13-242, NSP13-134, NSP13-400)를 1×105개의 관련된 표적 세포 (10:1 E:T 비)와 밤새 브레펠딘 A (BFA) (바이오레전드, 미국 캘리포니아주)의 존재 하에서 공동-배양하고, 다음 날, APC-Cy7 접합된 항-CD8 항체 (바이오레전드, 미국 캘리포니아주)로 염색하였다. 세척 후, 세포를 고정시키고, 세포내 고정 및 투과 완충액 세트 (이바이오사이언스(eBioscience)TM, 미국 뉴욕주)로 고정시키고 투과화하고, 이어서 APC 접합된 항-CD137, FITC 접합된 항-CD69, PE 접합된 항-IFN-γ, 퍼시픽 블루 접합된 항-TNF-α 항체 (모두 미국 캘리포니아주 바이오레전드로부터 구입함)로 염색하였다. 세척 후, CD137, CD69, IFN-γ 및 TNF-α의 발현 수준을 유동 세포계측법 검정 (LSR포르테사(LSRFortessa) X-20 애널라이저, 비디, 미국 캘리포니아주)을 사용하여 결정하였다.
MGP-65 특이적 T 세포의 T 세포 수용체 (TCR) 유전자 클로닝 및 시퀀싱: TCR의 알파 및 베타 쇄를 사소한 변형으로 이전에 기재된 바와 같이, cDNA 5' 단부의 급속 증폭 (5' RACE-PCR) 프로토콜 (타카라, 미국 캘리포니아주)을 사용하여 기능적 MGP-65 특이적 T 세포로부터 클로닝하였다 (Scotto-Lavino et al., 2006). 간략하게, 총 RNA를 RN이지(RNeasy) 키트 (퀴아젠(QIAGEN), 미국 메릴랜드주)를 사용하여 MGP-65 특이적 T 세포로부터 추출하고, 제1-가닥 cDNA를 총 cDNA의 5'-단부에서 유니버셜 서열을 허용하는 SMARTer RACE 5'/3' 키트 (타카라, 미국 캘리포니아주)로 생성하였다. 이 cDNA를 주형으로서 사용하여, TCR 알파 쇄 및 베타 쇄를 TCR 알파 쇄 또는 베타 쇄의 불변 도메인에 어닐링된 5'-단부 센스 유니버셜 프라이머 및 3'-단부 안티센스 특이적 프라이머로 증폭시켰다. 알파 쇄에 대해, 3' -단부 안티센스 특이적 프라이머, TRAC: 5'를 사용하였다 - GATTACGCCAAGCTT TGTTGCTCTTGAAGTCCATAGACCTCATGTCTAGCAC-3' (서열식별번호:84). 베타 쇄에 대해, 3'-단부 안티센스 특이적 프라이머, TRBC: 5'를 사용하였다 - GATTACGCCAAGCTT TTCTGATGGCTCAAACACAGCGACCTCG-3' (서열식별번호:85). 볼드체, 이탤릭체 서열은 인-퓨전(In-Fusion) (시그마 (미국 미주리주))에 사용된 중첩 서열이다. PCR 생성물을 퓨어링크(PureLink)™ 신속 겔 추출 키트 (라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation), 미국 뉴욕주)를 사용하여 정제하고, 인-퓨전 클론 프로토콜 (타카라, 미국 캘리포니아주)을 사용하여 pRACE 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서 TCR 알파 쇄 또는 베타 쇄 유전자를 함유하는 벡터를 생어(Sanger) 시퀀싱 방법을 사용하여 시퀀싱하였다. TCR 알파 및 베타 쇄의 레퍼토리를 IMGT/V-QUEST 검색 툴 (월드 와이드 웹 상에서 imgt.org/IMGT vquest에서 발견될 수 있음)에 의해 분석하였다.
MGP-65 TCR 레트로바이러스 벡터 구축 및 레트로바이러스 생성: MGP-65 특이적 T 세포로부터 유래된 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄의 전장 cDNA를 푸린-SGSG-P2A 자기-절단 링커 펩티드와 어셈블리하여 둘 다의 쇄의 동등한 발현을 허용하였다 (Wargo et al., 2009). 외인성 TCR 알파 및 베타 쇄 사이의 쌍형성을 개선시키고, 내인성 인간 알파 및 베타 쇄와의 쌍형성오류를 감소시키기 위해, Cys 돌연변이를 TCR 알파 및 베타 쇄 둘 다의 불변 도메인에 이전의 보고에 따라 도입하였다 (Kuball et al., 2007). 더욱이, 외인성 TCR의 발현 수준을 증진시키기 위해, 코돈-최적화를 수행하고, 최적화된 TCR 서열을 진스크립트 (미국 뉴저지주)에 의해 합성하였다. 전체 TCR 단편을 MSCV 긴 말단 반복부 (LTR)를 이용하여 유전자 발현을 유도하는 레트로바이러스 벡터 pMSGV1 내로 클로닝하였다.
재조합 레트로바이러스를 이전에 기재된 프로토콜에 따라 생성하였다 (Wargo et al., 2009). 간략하게, MGP-65 특이적 CTL로부터 유래된 전장 TCR을 함유한 10μg 레트로바이러스 벡터 및 5μg 외피 벡터 RD114를 옵티(Opti)-MEM 배지 (라이프 테크놀로지스 코포레이션, 미국 뉴욕주) 중 리포펙타민(Lipofectamine) 3000 시약 (라이프 테크놀로지스 코포레이션, 미국 뉴욕주)으로 패키지 세포주 피닉스-GP 내로 공동-형질감염시켰다. 인큐베이션 후, 레트로바이러스 상청액을 수거하고, 원심분리로 청소하고, 이어서 외인성 TCR을 발현하는 동종이형 PBMC를 형질도입하는데 사용하거나, 또는 -80℃에서 저장하였다.
MGP-65 특이적 TCR 조작된 T 세포 (TCR-T) 생성: TCR-T 생성을 이전에 기재된 스피노큘레이션 프로토콜을 사용하여 수행하였다 (Hughes et al., 2005). HLA-A0201-발현 건강한 공여자 PBMC (1×106/ml)를 5% 인간 AB 혈청으로 보충된 AIM-V 배지 (라이프 테크놀로지스 코포레이션, 미국 뉴욕주) 중 50ng/ml OKT3, 300U/ml IL-2로 2 내지 3일 동안 활성화시켰다. 4 내지 6ml 레트로바이러스 상청액을 레트로넥틴(RetroNectin)-코팅된 (20μg/ml) (타카라, 미국 캘리포니아주) 비-조직 배양-처리된 6-웰 플레이트 상으로 로딩하고, 원심분리를 2000g에서 2시간 동안 32℃에서 수행하였다. 레트로바이러스 상청액을 웰로부터 흡인하고; 5% 인간 AB 혈청 및 300U/ml IL-2로 보충된 AIM-V 배지 중 2×10^6개의 활성화된 PBMC를 웰에 첨가하고, 이어서 1000g에서 10분 동안 원심분리하였다. TCR 유전자-형질도입된 PBMC를 추가의 3 내지 5일 동안 배양하고, TCR 발현을 항-CD8 및 사량체 염색에 의해 결정하였다. CD8+,사량체+ 세포를 분류하고, 상기 기재된 확장 프로토콜을 사용하여 확장시켜 고 순도의 MGP-65 특이적 TCR-T를 생성하였다. MGP-65 특이적 TCR-T의 기능적 분석을 상기 기재된 바와 같이 CRA 및 ICS 검정에 의해 수행하였다.
통계적 분석: 데이터 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 7.03을 사용하여 수행하였다. 정규 분포된 데이터를 파라미터 검정 (ANOVA 또는 독립표본 t 검정)을 사용하여 분석하였다.
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용의 관점에서 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태 또는 측면의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 변동이 방법에 및 본원에 기재된 방법의 단계에서 또는 단계의 순서에서 적용될 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 둘 다 관련된 특정 작용제는 본원에 기재된 작용제에 대해 치환될 수 있지만, 동일한 또는 유사한 결과가 달성될 것임이 명백할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 모든 이러한 유사한 치환체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지, 범주 및 개념 내인 것으로 간주된다.
참고문헌
본 명세서 전반에 걸쳐 언급된 하기 참고문헌 및 간행물은, 이들이 본원에서 제시된 것들에 대해 보충적인 예시적인 절차적 또는 다른 상세사항을 제공하는 정도까지, 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.
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Figure pct00020
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SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> PEPTIDES AND ENGINEERED T CELL RECEPTORS TARGETING SARS-COV-2 ANTIGENS AND METHODS OF USE <130> MDAC.P1270WO/1001206538 <150> 63/167,433 <151> 2021-03-29 <150> 63/210,198 <151> 2021-06-14 <150> 63/314,870 <151> 2022-02-28 <160> 150 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 atggaaactc tcctgggagt gtctttggtg attctatggc ttcaactggc tagggtgaac 60 agtcaacagg gagaagagga tcctcaggcc ttgagcatcc aggagggtga aaatgccacc 120 atgaactgca gttacaaaac tagtataaac aatttacagt ggtatagaca aaattcaggt 180 agaggccttg tccacctaat tttaatacgt tcaaatgaaa gagagaaaca cagtggaaga 240 ttaagagtca cgcttgacac ttccaagaaa agcagttcct tgttgatcac ggcttcccgg 300 gcagcagaca ctgcttctta cttctgtgct acggctcaaa cctcctacga caaggtgata 360 tttgggccag ggacaagctt atcagtcatt ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420 taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480 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His Tyr Val Arg Ile 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 66 Tyr Leu Gly Gly Met Ser Tyr Tyr Cys Lys 1 5 10 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 67 Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 68 His Phe Ala Ile Gly Leu Ala Leu Tyr Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 69 Tyr Val Phe Cys Thr Val Asn Ala Leu 1 5 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 70 Arg Phe Asn Val Ala Ile Thr Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 71 Thr Cys Asp Trp Thr Asn Ala Gly Asp Tyr 1 5 10 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 72 Gly Leu Ala Leu Tyr Tyr Pro Ser Ala 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 73 Tyr Val Phe Thr Gly Tyr Arg Val Thr Lys 1 5 10 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 74 Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Ile Ala 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 75 Cys Thr Glu 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 84 Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Thr 1 5 10 15 Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys 20 25 30 Ala Thr Ala Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Gly Thr Cys Thr Ala 35 40 45 Gly Cys Ala Cys 50 <210> 85 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 85 Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Thr 1 5 10 15 Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Ala Cys Ala 20 25 30 Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Cys Thr Cys Gly 35 40 <210> 86 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 86 atggcctctg cacccatctc gatgcttgcg atgctcttca cattgagtgg gctgagagct 60 cagtcagtgg ctcagccgga agatcaggtc aacgttgctg aagggaatcc tctgactgtg 120 aaatgcacct attcagtctc tggaaaccct tatctttttt ggtatgttca ataccccaac 180 cgaggcctcc agttccttct gaaatacatc acaggggata acctggttaa aggcagctat 240 ggctttgaag ctgaatttaa caagagccaa acctccttcc acctgaagaa accatctgcc 300 cttgtgagcg actccgcttt gtacttctgt gctgtgagag acagaggctt tgggaatgtg 360 ctgcattgcg ggtccggcac tcaagtgatt gttttaccac atatccagaa ccctgaccct 420 gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480 tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540 actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600 aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660 ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 720 acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 780 gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gctaa 825 <210> 87 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 87 Met Ala Ser Ala Pro Ile Ser Met Leu Ala Met Leu Phe Thr Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Arg Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val 20 25 30 Ala Glu Gly Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly 35 40 45 Asn Pro Tyr Leu Phe 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tgggaaggag 540 gtgcacagtg gggtcagcac agacccgcag cccctcaagg agcagcccgc cctcaatgac 600 tccagatact gcctgagcag ccgcctgagg gtctcggcca ccttctggca gaacccccgc 660 aaccacttcc gctgtcaagt ccagttctac gggctctcgg agaatgacga gtggacccag 720 gatagggcca aacccgtcac ccagatcgtc agcgccgagg cctggggtag agcagactgt 780 ggctttacct cggtgtccta ccagcaaggg gtcctgtctg ccaccatcct ctatgagatc 840 ctgctaggga aggccaccct gtatgctgtg ctggtcagcg cccttgtgtt gatggccatg 900 gtcaagagaa aggatttcta a 921 <210> 94 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 94 Met Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Ser Val Phe Ser 1 5 10 15 Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Cys Gln Arg Gly Thr 20 25 30 Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Thr Met Met Phe 35 40 45 Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ala 50 55 60 Asn Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp Lys 65 70 75 80 Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val Ser 85 90 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ggcctggagc 600 aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc 660 ttcttcccca gcccagaaag ttcctgtgat gtcaagctgg tcgagaaaag ctttgaaaca 720 gatacgaacc taaactttca aaacctgtca gtgattgggt tccgaatcct cctcctgaaa 780 gtggccgggt ttaatctgct catgacgctg cggctgtggt ccagctaa 828 <210> 101 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 101 Met Thr Arg Val Ser Leu Leu Trp Ala Val Val Val Ser Thr Cys Leu 1 5 10 15 Glu Ser Gly Met Ala Gln Thr Val Thr Gln Ser Gln Pro Glu Met Ser 20 25 30 Val Gln Glu Ala Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp Thr Ser 35 40 45 Glu Asn Asn Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Arg Gln 50 55 60 Met Ile Leu Val Ile Arg Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn Ala Thr 65 70 75 80 Glu Asn Arg Phe Ser Val Asn Phe Gln Lys Ala Ala Lys Ser Phe Ser 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Asp Ser Gln Leu Gly Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 100 105 110 Ala Phe Met Asn Ser Asn Asn Ala Arg Leu Met Phe Gly Asp Gly Thr 115 120 125 Gln Leu Val Val Lys Pro 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tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600 gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660 cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720 gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780 agagcagact gtggctttac ctcggtgtcc taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840 ctctatgaga tcctgctagg gaaggccacc ctgtatgctg tgctggtcag cgcccttgtg 900 ttgatggcca tggtcaagag aaaggatttc taa 933 <210> 136 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 136 Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg 20 25 30 Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His 35 40 45 Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Val Thr Ser Ala Gln 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305 310 <210> 137 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 137 Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr 50 55 60 Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser 65 70 75 80 Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ile Met 85 90 95 Ala Gly Gly His Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr 100 105 110 Val Leu <210> 138 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 138 Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 139 Leu Asn His Asp Ala 1 5 <210> 140 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 140 Ser Gln Ile Val Asn Asp 1 5 <210> 141 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 141 Ala Ser Ser Ile Met Ala Gly Gly His Gly Glu Leu Phe 1 5 10 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 142 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 143 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 143 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 144 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 144 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 145 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 146 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 147 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 148 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 149 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 150 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 150 Cys Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe 1 5 10

Claims (335)

  1. 서열식별번호:7의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:7과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:5 및 6의 아미노산 서열을 갖는, 또는 각각 서열식별번호:5 및 서열식별번호:6과 적어도 80% 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:3과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:4의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:4와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  9. 서열식별번호:14의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:12 및 서열식별번호:13의, 또는 각각 서열식별번호:12 및 서열식별번호:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:10의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:10과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:11의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:11과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  17. 서열식별번호:21의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:21과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:19 및 20의 아미노산 서열을 갖는, 또는 각각 서열식별번호:19 및 서열식별번호:20과 적어도 80% 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:17의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:17과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 베타 (TCR-b) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-b 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:18의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:18과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  25. 서열식별번호:92의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:92와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:90 및 91의 아미노산 서열을 갖는, 또는 각각 서열식별번호:90 및 91과 적어도 80% 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:88의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:88과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:89의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:89와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  33. 서열식별번호:99의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:99와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:97 및 서열식별번호:98의, 또는 각각 서열식별번호:97 및 서열식별번호:98과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:95의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:95와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-b) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  38. 제37항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-b 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  40. 제39항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:96의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:96과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  41. 서열식별번호:106의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:106과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  42. 제41항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  43. 제42항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:104 및 105의 아미노산 서열을 갖는, 또는 각각 서열식별번호:104 및 105와 적어도 80% 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:102의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:102와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  46. 제45항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  48. 제47항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:103의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:103과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  49. 서열식별번호:113의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:113과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  50. 제49항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  51. 제50항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:111 및 서열식별번호:112의, 또는 각각 서열식별번호:111 및 서열식별번호:112와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:109의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:109와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-b) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  54. 제53항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-b 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  56. 제55항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:110의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:110과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  57. 서열식별번호:120의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:120과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  58. 제57항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  59. 제58항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:118 및 119의 아미노산 서열을 갖는, 또는 각각 서열식별번호:118 및 119와 적어도 80% 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:116의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:116과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  62. 제61항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  64. 제63항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:117의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:117과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  65. 서열식별번호:127의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:127과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  66. 제65항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  67. 제66항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:125 및 서열식별번호:126의, 또는 각각 서열식별번호:125 및 서열식별번호:126과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:123의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:123과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-b) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  70. 제69항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-b 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  72. 제71항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:124의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:124와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  73. 서열식별번호:134의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:134와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  74. 제73항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  75. 제74항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:132 및 133의 아미노산 서열을 갖는, 또는 각각 서열식별번호:132 및 133과 적어도 80% 서열 동일성인 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:130의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:130과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-a) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  78. 제77항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-a 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  80. 제79항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:131의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:131과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  81. 서열식별번호:141의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:141과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드.
  82. 제81항에 있어서, 가변 영역이 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  83. 제82항에 있어서, 가변 영역이 각각 서열식별번호:139 및 서열식별번호:140의, 또는 각각 서열식별번호:139 및 서열식별번호:140과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및/또는 CDR2를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 서열식별번호:137의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:137과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 알파 (TCR-b) 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  86. 제85항에 있어서, 폴리펩티드가 TCR-b 가변 및 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  87. 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  88. 제87항에 있어서, 신호 펩티드가 서열식별번호:138의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:138과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  89. T-세포 수용체 (TCR)-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 조작된 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드는
    (i) 서열식별번호:7의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:7과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3; 또는
    (ii) 서열식별번호:14의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:14와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3
    을 포함하고;
    TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:21의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:21과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 것인 TCR.
  90. 제89항에 있어서, TCR이 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드를 포함하는 것인 TCR.
  91. 제90항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가
    (i) 서열식별번호:5의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:5와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 또는
    (ii) 서열식별번호:12의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1
    을 포함하고/거나;
    TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:19의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:19와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 것인 TCR.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가
    (i) 서열식별번호:6의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:6과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 또는
    (ii) 서열식별번호:13의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:13과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2
    를 포함하고/거나;
    TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:20의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:20과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 것인 TCR.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3이
    (i) 각각 서열식별번호:5, 6, 및 7의 아미노산 서열; 또는
    (ii) 각각 서열식별번호:12, 13, 및 14의 아미노산 서열
    을 포함하고;
    TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:19, 20, 및 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가
    (i) 서열식별번호:3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:3과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열식별번호:10의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:10과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하고;
    TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:17의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:17과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  95. T-세포 수용체 (TCR)-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 조작된 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:92의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:92와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:99의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:99와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 것인 TCR.
  96. 제95항에 있어서, TCR이 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드를 포함하는 것인 TCR.
  97. 제96항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:90의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:90과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하고/거나; TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:97의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:97과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 것인 TCR.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:91의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:91과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하고/거나; TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:98의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:98과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 것인 TCR.
  99. 제96항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:90, 91, 및 92의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:97, 98, 및 99의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  100. 제96항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:88의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:88과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:95의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:95와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  101. T-세포 수용체 (TCR)-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 조작된 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:106의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:106과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:113의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:113과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 것인 TCR.
  102. 제101항에 있어서, TCR이 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드를 포함하는 것인 TCR.
  103. 제102항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:104의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:104와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하고/거나; TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:111의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:111과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 것인 TCR.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:105의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:105와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하고/거나; TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:112의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:112와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 것인 TCR.
  105. 제102항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:104, 105, 및 106의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:111, 112, 및 113의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  106. 제102항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:102의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:102와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:109의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:109와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  107. T-세포 수용체 (TCR)-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 조작된 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:120의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:120과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:127의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:127과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 것인 TCR.
  108. 제107항에 있어서, TCR이 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드를 포함하는 것인 TCR.
  109. 제108항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:118의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:118과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하고/거나; TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:125의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:125와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 것인 TCR.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:119의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:119와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하고/거나; TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:126의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:126과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 것인 TCR.
  111. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:118, 119, 및 120의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:125, 126, 및 127의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  112. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:116의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:116과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:123의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:123과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  113. T-세포 수용체 (TCR)-a 폴리펩티드 및 TCR-b 폴리펩티드를 포함하는 조작된 TCR이며, 여기서 TCR-a 폴리펩티드는 서열식별번호:134의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:134와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드는 서열식별번호:141의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:141과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 것인 TCR.
  114. 제113항에 있어서, TCR이 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-b 폴리펩티드 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함하는 TCR-a 폴리펩티드를 포함하는 것인 TCR.
  115. 제114항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:132의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:132와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하고/거나; TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:139의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:139와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함하는 것인 TCR.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:133의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:133과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하고/거나; TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:140의 아미노산 서열을 갖는 또는 서열식별번호:140과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 포함하는 것인 TCR.
  117. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:132, 133, 및 134의 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드의 CDR1, CDR3, 및 CDR3이 각각 서열식별번호:139, 140, 및 141의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  118. 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-a 폴리펩티드가 서열식별번호:130의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:130과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; TCR-b 폴리펩티드가 서열식별번호:137의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:137과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  119. 제89항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 변형을 포함하거나 또는 키메라인 TCR.
  120. 제89항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, TCR-b 폴리펩티드 및 TCR-a 폴리펩티드가 작동가능하게 연결된 것인 TCR.
  121. 제120항에 있어서, TCR-b 폴리펩티드 및 TCR-a 폴리펩티드가 펩티드 결합을 통해 작동가능하게 연결된 것인 TCR.
  122. 제121항에 있어서, TCR이 단일 쇄 TCR인 TCR.
  123. 제121항에 있어서, TCR-b 폴리펩티드 및 TCR-a 폴리펩티드가 동일한 폴리펩티드 상에 있고, TCR-b가 TCR-a에 대해 아미노-근위인 TCR.
  124. 제121항에 있어서, TCR-b 폴리펩티드 및 TCR-a 폴리펩티드가 동일한 폴리펩티드 상에 있고, TCR-a가 TCR-b에 대해 아미노-근위인 TCR.
  125. 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 TCR-a 및 TCR-b 폴리펩티드 사이에 링커를 포함하는 것인 TCR.
  126. 제125항에 있어서, 링커가 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 것인 TCR.
  127. 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 펩티드.
  128. 제127항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22를 포함하는 것인 펩티드.
  129. 제127항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함하는 것인 펩티드.
  130. 제127항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드의 적어도 7개의 인접한 아미노산을 포함하는 것인 펩티드.
  131. 제127항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드의 적어도 8개의 인접한 아미노산을 포함하는 것인 펩티드.
  132. 제127항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드의 적어도 9개의 인접한 아미노산을 포함하는 것인 펩티드.
  133. 제127항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드의 적어도 10개의 인접한 아미노산을 포함하는 것인 펩티드.
  134. 제127항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 13개의 아미노산 이하의 길이인 펩티드.
  135. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 63% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  136. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 66% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  137. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  138. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 72% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  139. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 77% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  140. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 80% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  141. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 81% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  142. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 88% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  143. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  144. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드와 100% 서열 동일성을 포함하는 것인 펩티드.
  145. 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 9개의 아미노산으로 이루어진 것인 펩티드.
  146. 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 10개의 아미노산으로 이루어진 것인 펩티드.
  147. 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 11개의 아미노산으로 이루어진 것인 펩티드.
  148. 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 12개의 아미노산으로 이루어진 것인 펩티드.
  149. 제134항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 13개의 아미노산으로 이루어진 것인 펩티드.
  150. 제127항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드로 이루어진 것인 펩티드.
  151. 제127항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 면역원성인 펩티드.
  152. 제127항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 변형된 것인 펩티드.
  153. 제152항에 있어서, 변형이 분자에의 접합을 포함하는 것인 펩티드.
  154. 제152항 또는 제153항에 있어서, 분자가 항체, 지질, 아주반트, 또는 검출 모이어티를 포함하는 것인 펩티드.
  155. 제127항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 38 중 하나 또는 서열식별번호:22 내지 38 중 하나와 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 펩티드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 펩티드.
  156. 제127항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드에 비해 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 것인 펩티드.
  157. 제127항 내지 제156항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  158. 적어도 1개의 MHC 폴리펩티드 및 제1항 내지 제157항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  159. 제158항에 있어서, MHC 폴리펩티드 및/또는 펩티드가 검출 태그에 접합된 것인 조성물.
  160. 제158항 또는 제159항에 있어서, MHC 폴리펩티드 및 펩티드가 작동적으로 연결된 것인 조성물.
  161. 제160항에 있어서, MHC 폴리펩티드 및 펩티드가 펩티드 결합을 통해 작동적으로 연결된 것인 조성물.
  162. 제161항에 있어서, MHC 폴리펩티드 및 펩티드가 반 데르 발스 힘을 통해 작동적으로 연결된 것인 조성물.
  163. 제158항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 MHC 폴리펩티드가 1개의 펩티드에 연결된 것인 조성물.
  164. 제158항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 폴리펩티드 대 펩티드의 평균 비가 4:1인 조성물.
  165. 제127항 내지 중 어느 한 항의 펩티드 또는 제157항의 폴리펩티드 및 MHC 폴리펩티드를 포함하는 분자 복합체.
  166. 펩티드-특이적 결합 분자이며, 여기서 분자는 제127항 내지 제157항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 제165항의 분자 복합체에 특이적으로 결합하는 것인 결합 분자.
  167. 제166항에 있어서, 결합 분자가 항체, TCR 모방 항체, scFV, 카멜리드, 압타머, 또는 DARPIN인 결합 분자.
  168. (a) 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 수득하고;
    (b) 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 제127항 내지 제157항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 제165항의 분자 복합체와 접촉시키고, 그에 의해 펩티드-특이적 면역 이펙터 세포를 생성하는 것
    을 포함하는, 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포를 생산하는 방법.
  169. 제168항에 있어서, 코로나바이러스가 박쥐로부터 단리된 코로나바이러스인 방법.
  170. 제168항 또는 제169항에 있어서, 코로나바이러스가 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2인 방법.
  171. 제168항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 항원 제시 세포 (APC), 인공 항원 제시 세포 (aAPC), 또는 인공 항원 제시 표면 (aAPS)과 공동 배양하는 것으로 추가로 정의되고; APC, aAPC, 또는 aAPS가 그들의 표면 상에 펩티드를 제시하는 것인 방법.
  172. 제171항에 있어서, APC가 수지상 세포인 방법.
  173. 제168항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포가 T 세포, 말초 혈액 림프구, NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포인 방법.
  174. 제168항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포가 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 유도 다능성 줄기 (iPS) 세포로부터 분화되었던 것인 방법.
  175. 제173항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 γδ T 세포인 방법.
  176. 제173항에 있어서, T 세포가 세포독성 T 림프구 (CTL)인 방법.
  177. 제168항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 수득이 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  178. 제168항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포의 출발 집단이 대상체로부터 수득되는 것인 방법.
  179. 제178항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  180. 제179항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염을 갖는 것인 방법.
  181. 제180항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 COVID-19 또는 SARS를 포함하는 것인 방법.
  182. 제168항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 갖는 것인 방법.
  183. 제168항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염의 임의의 증상을 갖지 않는 것인 방법.
  184. 제168항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염으로 진단되었던 것인 방법.
  185. 제178항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염으로 진단되지 않았던 것인 방법.
  186. 제178항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염에 대해 이전에 치료되었던 것인 방법.
  187. 제178항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 공동-배양 전에 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 수지상 세포 내로 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  188. 제187항에 있어서, 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산이 전기천공에 의해 도입되는 것인 방법.
  189. 제187항에 있어서, 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산이 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 수지상 세포 배양 배지에 첨가함으로써 도입되는 것인 방법.
  190. 제187항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포가 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산이 도입된 수지상 세포의 제2 집단과 공동-배양되는 것인 방법.
  191. 제187항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, CD8 또는 CD4-양성 및 코로나바이러스 펩티드 MHC 사량체-양성 T 세포의 집단이 공동-배양 후 면역 이펙터 세포로부터 정제되는 것인 방법.
  192. 제191항에 있어서, 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포의 클론 집단이 제한 또는 계열 희석, 이어서 급속 확장 프로토콜에 의한 개별적 클론의 확장에 의해 생성되는 것인 방법.
  193. 제192항에 있어서, 방법이 펩티드-특이적 면역 이펙터 세포의 클론 집단으로부터의 T 세포 수용체 (TCR)의 클로닝을 추가로 포함하는 것인 방법.
  194. 제193항에 있어서, TCR의 클로닝이 TCR 알파 및 베타 쇄의 클로닝인 방법.
  195. 제193항 또는 제194항에 있어서, TCR이 cDNA 단부의 5'-급속 증폭 (RACE) 방법을 사용하여 클로닝되는 것인 방법.
  196. 제195항에 있어서, 클로닝된 TCR이 발현 벡터 내로 서브클로닝되는 것인 방법.
  197. 제196항에 있어서, 발현 벡터가 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  198. 제196항 또는 제197항에 있어서, 방법이 숙주 세포를 발현 벡터로 형질도입하여 TCR을 발현하는 조작된 세포를 생성하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  199. 제198항에 있어서, 숙주 세포가 면역 세포인 방법.
  200. 제168항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포이고, 조작된 세포가 조작된 T 세포인 방법.
  201. 제200항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 γδ T 세포이고, 조작된 세포가 조작된 T 세포인 방법.
  202. 제168항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포의 출발 집단이 SARS-Cov-2 감염을 갖는 대상체로부터 수득되고, 숙주 세포가 대상체에 대해 동종이형 또는 자가인 방법.
  203. 제198항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, CD8 또는 CD4-양성 및 펩티드 MHC 사량체-양성 조작된 T 세포의 집단이 형질도입된 숙주 세포로부터 정제되는 것인 방법.
  204. 제168항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드-특이적 조작된 T 세포의 클론 집단이 제한 또는 계열 희석, 이어서 급속 확장 프로토콜에 의한 개별적 클론의 확장에 의해 생성되는 것인 방법.
  205. (a) 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 수득하고;
    (b) 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 제216항 내지 제157항 중 어느 한 항의 코로나바이러스 펩티드 또는 폴리펩티드와 접촉시키고, 그에 의해 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포를 생성하고;
    (c) 코로나바이러스 펩티드에 대해 특이적인 면역 이펙터 세포를 정제하고,
    (d) 정제된 면역 이펙터 세포로부터 T 세포 수용체 (TCR) 서열을 단리하는 것
    을 포함하는, 코로나바이러스 TCR을 클로닝하는 방법.
  206. 제205항에 있어서, 코로나바이러스가 박쥐로부터 단리된 코로나바이러스인 방법.
  207. 제205항 또는 제206항에 있어서, 코로나바이러스가 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2인 방법.
  208. 제206항 또는 제207항에 있어서, 접촉이 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 항원 제시 세포 (APC)와 공동 배양하는 것으로 추가로 정의되고, APC가 그들의 표면 상에 코로나바이러스 펩티드를 제시하는 것인 방법.
  209. 제208항에 있어서, APC가 수지상 세포인 방법.
  210. 제205항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포가 T 세포, 말초 혈액 림프구, NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포인 방법.
  211. 제205항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포가 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 유도 다능성 줄기 (iPS) 세포로부터 분화되었던 것인 방법.
  212. 제210항 또는 제211항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 γδ T 세포인 방법.
  213. 제210항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 세포독성 T 림프구 (CTL)인 방법.
  214. 제205항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 수득이 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 면역 이펙터 세포의 출발 집단을 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  215. 제205항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포의 출발 집단이 대상체로부터 수득되는 것인 방법.
  216. 제215항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  217. 제215항 또는 제216항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염을 갖는 것인 방법.
  218. 제217항에 있어서, 대상체가 COVID-19 또는 SARS를 갖는 것인 방법.
  219. 제205항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 공동-배양 전에 코로나바이러스 펩티드 또는 코로나바이러스 펩티드를 코딩하는 핵산을 수지상 세포 내로 도입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  220. 제219항에 있어서, 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산이 전기천공에 의해 도입되는 것인 방법.
  221. 제219항에 있어서, 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산이 펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 수지상 세포의 배지에 첨가함으로써 도입되는 것인 방법.
  222. 제219항에 있어서, 면역 이펙터 세포가 코로나바이러스 펩티드 또는 코로나바이러스 펩티드를 코딩하는 핵산이 도입된 수지상 세포의 제2 집단과 공동-배양되는 것인 방법.
  223. 제219항에 있어서, 정제가 공동-배양 후 면역 이펙터 세포로부터 CD8-양성 및 코로나바이러스 펩티드 MHC 사량체-양성 T 세포의 집단을 정제하는 것으로 정의되는 것인 방법.
  224. 제223항에 있어서, CD8-양성 및 코로나바이러스 펩티드 MHC 사량체-양성 T 세포의 집단이 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 정제되는 것인 방법.
  225. 제224항에 있어서, 정제가 분류된 세포의 제한 또는 계열 희석, 이어서 급속 확장 프로토콜에 의한 개별적 클론의 확장에 의한 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포의 클론 집단의 생성을 추가로 포함하는 것인 방법.
  226. 제225항에 있어서, 단리가 코로나바이러스-특이적 면역 이펙터 세포의 클론 집단으로부터의 T 세포 수용체 (TCR)의 클로닝으로 정의되는 것인 방법.
  227. 제205항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 TCR 알파 및/또는 베타 유전자(들)를 시퀀싱하고/거나 파라토프 핫스팟에 의한 림프구 상호작용의 그룹핑 (GLIPH) 분석을 수행하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  228. 제226항 또는 제227항에 있어서, TCR의 클로닝이 TCR 알파 및 베타 쇄의 클로닝인 방법.
  229. 제228항에 있어서, TCR 알파 및 베타 쇄가 cDNA 단부의 5'-급속 증폭 (RACE) 방법을 사용하여 클로닝되는 것인 방법.
  230. 제229항에 있어서, 클로닝된 TCR이 발현 벡터 내로 서브클로닝되는 것인 방법.
  231. 제230항에 있어서, 발현 벡터가 TCR 알파 서열 및 TCR 베타 서열 사이에 링커 도메인을 포함하는 것인 방법.
  232. 제231항에 있어서, 링커 도메인이 1개 이상의 펩티드 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  233. 제232항에 있어서, 1개 이상의 절단 부위가 푸린(Furin) 절단 부위 및/또는 P2A 절단 부위인 방법.
  234. 제233항에 있어서, TCR 알파 서열 및 TCR 베타 서열이 IRES 서열에 의해 연결되는 것인 방법.
  235. 제230항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터가 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  236. 제235항에 있어서, 숙주 세포가 발현 벡터로 형질도입되어 TCR 알파 및 베타 쇄를 발현하는 조작된 세포를 생성하는 것인 방법.
  237. 제236항에 있어서, 숙주 세포가 면역 세포인 방법.
  238. 제168항 내지 제267항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 코로나바이러스-특이적 조작된 T 세포.
  239. 제168항 내지 제237항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 TCR.
  240. 제89항 내지 제126항 및 제239항 중 어느 한 항의 TCR, 또는 그의 펩티드 결합 단편 및 CD3 결합 영역을 포함하는 융합 단백질.
  241. 제240항에 있어서, CD3 결합 영역이 CD3-특이적 단편 항원 결합 (Fab), 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 단일 도메인 항체, 또는 단일 쇄 항체를 포함하는 것인 융합 단백질.
  242. 제89항 내지 제126항 및 제239항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 또는 융합 단백질이 검출 또는 치료 작용제에 접합되는 것인 TCR 또는 융합 단백질.
  243. 제242항에 있어서, 작용제가 형광 분자, 방사성 분자, 또는 독소를 포함하는 것인 TCR 또는 융합 단백질.
  244. 제1항 내지 제88항 및 제157항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제89항 내지 제126항, 제239항, 제242항, 및 제243항 중 어느 한 항의 TCR, 제127항 내지 제156항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 제240항 내지 제243항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
  245. 제244항에 있어서, 핵산이 RNA인 핵산.
  246. 제245항에 있어서, 핵산이 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 상보체를 코딩하는 DNA 또는 cDNA인 핵산.
  247. 제244항에 있어서, 핵산이 서열식별번호:1, 8, 15, 또는 그의 단편과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것인 핵산.
  248. 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항의 핵산(들)을 포함하는 핵산 발현 벡터.
  249. 제248항에 있어서, 벡터가 핵산의 발현을 지정하는 프로모터를 포함하는 것인 벡터.
  250. 제249항에 있어서, 프로모터가 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터를 포함하는 것인 벡터.
  251. 제248항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 TCR-a 및 TCR-b 유전자를 포함하는 것인 벡터.
  252. 제1항 내지 제88항 및 제157항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제89항 내지 제126항, 제239항, 제242항, 및 제243항 중 어느 한 항의 TCR, 제127항 내지 제156항 중 어느 한 항의 펩티드, 제240항 내지 제243항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항의 핵산(들), 또는 제248항 내지 제252항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  253. 제252항에 있어서, 세포가 줄기 세포, 전구 세포, 면역 세포, 또는 자연 킬러 (NK) 세포를 포함하는 것인 세포.
  254. 제252항에 있어서, 세포가 조혈 줄기 또는 전구 세포, T 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 분화된 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 포함하는 것인 세포.
  255. 제252항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리되거나 또는 유래된 것인 세포.
  256. 제252항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 세포독성 T 림프구 (CTL), CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 불변 NK T (iNKT) 세포, 감마-델타 T 세포, NKT 세포, 또는 조절 T 세포를 포함하는 것인 세포.
  257. 제252항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 SARS-Cov-2를 갖는 대상체로부터 단리된 것인 세포.
  258. 제127항 내지 제157항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 폴리펩티드, 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항의 핵산(들), 또는 제248항 내지 제252항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 시험관내 단리된 수지상 세포.
  259. 제258항에 있어서, 수지상 세포가 성숙한 수지상 세포인 수지상 세포.
  260. 제258항 또는 제259항에 있어서, 세포가 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 유형을 갖는 세포인 수지상 세포.
  261. 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항의 핵산(들) 또는 제248항 내지 제252항 중 어느 한 항의 벡터를 세포 내로 전달하는 것을 포함하는, 세포를 제조하는 방법.
  262. 제261항에 있어서, 방법이 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  263. T 세포를 제127항 내지 제157항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 폴리펩티드와 공동-배양하는 것을 포함하는, 치료제 T 세포 백신을 제조하는 시험관내 방법.
  264. 제263항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
  265. 제263항 또는 제264항에 있어서, 펩티드가 MHC와 복합체화된 것인 방법.
  266. 제265항에 있어서, MHC가 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 유형을 포함하는 것인 방법.
  267. 제263항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 수지상 세포, 림프모구성 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 인공 항원 제시 세포 (aAPC), 또는 인공 항원 제시 표면 상으로 로딩되는 것인 방법.
  268. 제263항 내지 제267항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 T 세포.
  269. 서열식별번호:22 내지 81 중 하나의 펩티드에 특이적으로 결합하는 TCR을 포함하는 T 세포.
  270. 제268항 또는 제269항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 T 세포.
  271. 제270항에 있어서, T 세포가 세포독성 T 림프구를 포함하는 것인 T 세포.
  272. 제1항 내지 제88항 및 제157항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제89항 내지 126항, 제239항, 제242항, 및 제243항 중 어느 한 항의 TCR, 제127항 내지 제156항 중 어느 한 항의 펩티드, 제165항의 분자 복합체, 제166항 또는 제167항의 펩티드-특이적 결합 분자, 제238항 및 제268항 내지 제271항 중 어느 한 항의 펩티드-특이적 T 세포 또는 제258항 내지 제260항 중 어느 한 항의 수지상 세포, 및 제약 담체를 포함하는 제약 조성물.
  273. 제272항에 있어서, 제약 조성물이 비경구 투여, 정맥내 주사, 근육내 주사, 흡입, 또는 피하 주사를 위해 제제화된 것인 제약 조성물.
  274. 제272항 또는 제273항에 있어서, 펩티드가 리포솜, 지질-함유 나노입자, 또는 지질-기반 담체에 포함되는 것인 제약 조성물.
  275. 제272항 내지 제274항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제가 주사 또는 비강 스프레이로서 흡입을 위해 제제화된 것인 제약 조성물.
  276. 제272항 내지 제275항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 백신으로서 제제화된 것인 제약 조성물.
  277. 제272항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 아주반트를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  278. 제272항 내지 제277항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 혈청-무함유, 미코플라스마-무함유, 내독소-무함유, 및/또는 무균인 것으로 결정된 것인 제약 조성물.
  279. 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제248항 내지 제251항 중 어느 한 항의 벡터를 세포 내로 전달하는 것을 포함하는, 조작된 세포를 제조하는 방법.
  280. 제279항에 있어서, 방법이 세포를 배지에서 배양하고/거나, 세포를 세포의 분열을 허용하는 조건에서 인큐베이션하고/거나, 세포를 스크리닝하고/거나, 세포를 동결시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  281. 제279항 또는 제280항에 있어서, 방법이 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  282. 제158항 내지 제164항 및 제272항 내지 제278항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제238항 및 제268항 내지 제271항 중 어느 한 항의 세포를 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 코로나바이러스 감염을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
  283. 제158항 내지 제164항 및 제272항 내지 제278항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제238항 및 제268항 내지 제271항 중 어느 한 항의 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  284. 제282항 또는 제283항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  285. 제282항 내지 제284항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 자가인 방법.
  286. 제282항 내지 제284항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 동종이형인 방법.
  287. 제282항 또는 제284항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 갖는 것인 방법.
  288. 제282항 또는 제284항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염의 임의의 증상을 갖지 않는 것인 방법.
  289. 제282항 내지 제288항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염으로 진단되었던 것인 방법.
  290. 제282항 내지 제288항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염으로 진단되지 않았던 것인 방법.
  291. 제282항 내지 제290항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염에 대해 이전에 치료되었던 것인 방법.
  292. 제282항 내지 제291항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스가 박쥐로부터 단리된 코로나바이러스를 포함하는 것인 방법.
  293. 제292항에 있어서, 코로나바이러스가 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2인 방법.
  294. 제282항 내지 제293항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 COVID-19 또는 SARS를 예방하거나 또는 치료하는 것을 포함하는 것인 방법.
  295. 제282항 내지 제294항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스와 관련된 합병증으로 진단되었던 것인 방법.
  296. 제295항에 있어서, 합병증이 폐렴, 호흡 곤란 또는 숨참, 흉통 또는 가슴 압박, 급성 호흡 부전, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 심장 손상, 2차 감염, 급성 신장 손상, 패혈성 쇼크, 혈전, 다중계 염증 증후군, 만성 피로, 횡문근융해, 파종성 혈관내 응고, 및/또는 급성 간 손상을 포함하는 것인 방법.
  297. 제282항 내지 제296항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스에 대해 백신접종된 것인 방법.
  298. 제282항 내지 제296항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스에 대해 백신접종되지 않는 것인 방법.
  299. 제291항 내지 제298항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 이전의 치료에 대해 저항성 또는 비-반응성인 것으로 결정되었던 것인 방법.
  300. 제282항 내지 제299항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 추가의 치료제가 투여되는 것인 방법.
  301. 제300항에 있어서, 추가의 치료제가 스테로이드 또는 항-바이러스 치료제를 포함하는 것인 방법.
  302. 제301항에 있어서, 추가의 치료제가 덱사메타손, 모노클로날 항체, 렘데시비르, 팍스로비드(Paxlovid), 몰누피라비르(Molnupiravir), 회복기 혈장, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  303. 환자로부터의 생물학적 샘플을 제127항 내지 제157항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 제165항의 분자 복합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 환자를 진단하거나 또는 환자에서 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  304. 제303항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플 또는 그의 분획을 포함하는 것인 방법.
  305. 제304항에 있어서, 생물학적 샘플이 림프구를 포함하는 것인 방법.
  306. 제305항에 있어서, 생물학적 샘플이 림프구를 포함하는 분획화된 샘플을 포함하는 것인 방법.
  307. 제303항 내지 제306항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 고체 지지체에 연결되는 것인 방법.
  308. 제307항에 있어서, 펩티드가 고체 지지체에 접합되거나 또는 고체 지지체에 접합된 항체에 결합되는 것인 방법.
  309. 제307항에 있어서, 고체 지지체가 마이크로플레이트, 비드, 유리 표면, 슬라이드, 또는 세포 배양 디쉬를 포함하는 것인 방법.
  310. 제303항 내지 제309항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 반응을 검출하는 것이 T 세포 또는 TCR에의 펩티드의 결합을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  311. 제303항 내지 제310항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 반응을 검출하는 것이 ELISA, ELISPOT, 또는 사량체 검정을 포함하는 것인 방법.
  312. 제303항 내지 제311항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스로 진단되었던 것인 방법.
  313. 제303항 내지 제312항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스와 관련된 합병증으로 진단되었던 것인 방법.
  314. 제313항에 있어서, 합병증이 폐렴, 호흡 곤란 또는 숨참, 흉통 또는 가슴 압박, 급성 호흡 부전, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 심장 손상, 2차 감염, 급성 신장 손상, 패혈성 쇼크, 혈전, 다중계 염증 증후군, 만성 피로, 횡문근융해, 파종성 혈관내 응고, 및/또는 급성 간 손상을 포함하는 것인 방법.
  315. 제303항 내지 제311항, 제313항, 및 제314항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스로 진단되지 않았던 것인 방법.
  316. 제303항 내지 제315항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스에 대해 백신접종되었던 것인 방법.
  317. 제312항 내지 제316항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스가 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2인 방법.
  318. 제316항 또는 제317항에 있어서, 방법이 백신의 효능을 결정하기 위한 것인 방법.
  319. 제158항 내지 제164항 중 어느 한 항의 조성물을 T 세포를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 결합된 펩티드 및/또는 MHC 폴리펩티드를 갖는 T 세포를 검출 태그를 검출함으로써 검출하는 것을 포함하는 방법.
  320. 제319항에 있어서, 방법이 펩티드 및/또는 MHC와 결합된 T 세포의 수를 카운팅하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  321. 제319항 또는 제320항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물이 대상체로부터 단리되는 것인 방법.
  322. 제321항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  323. 제321항 또는 제322항에 있어서, 대상체가 SARS-Cov-2 감염의 하나 이상의 증상을 갖는 것인 방법.
  324. 제321항 내지 제323항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 SARS-Cov-2 감염의 임의의 증상을 갖지 않는 것인 방법.
  325. 제321항 내지 제324항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 SARS-Cov-2 감염으로 진단되었던 것인 방법.
  326. 제321항 내지 제324항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 SARS-Cov-2 감염으로 진단되지 않았던 것인 방법.
  327. 제321항 내지 제326항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 SARS-Cov-2 감염에 대해 이전에 치료되었던 것인 방법.
  328. 제202항에 있어서, 대상체가 이전의 치료에 대해 저항성 또는 비-반응성인 것으로 결정되었던 것인 방법.
  329. 제319항 내지 제328항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 펩티드 및/또는 MHC와 결합된 T 세포의 수를 분류하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  330. 제329항에 있어서, 방법이 펩티드 및/또는 MHC와 결합된 T 세포로부터 1개 이상의 TCR 유전자를 시퀀싱하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  331. 제330항에 있어서, 방법이 파라토프 핫스팟에 의한 림프구 상호작용의 그룹핑 (GLIPH) 분석을 추가로 포함하는 것인 방법.
  332. 제127항 내지 제157항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 폴리펩티드를 용기에 포함하는 키트.
  333. 제332항에 있어서, 펩티드가 제약 제제에 포함되는 것인 키트.
  334. 제333항에 있어서, 제약 제제가 비경구 투여 또는 흡입을 위해 제제화된 것인 키트.
  335. 제332항에 있어서, 펩티드가 세포 배양 배지에 포함되는 것인 키트.
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