CN118103062A

CN118103062A - 靶向sars-cov-2抗原的肽和工程化t细胞受体及其使用方法

Info

Publication number: CN118103062A
Application number: CN202280038172.0A
Authority: CN
Inventors: 余嘉诚; 潘科; 邱裕伦
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: Pan Ke; Qiu Yulun; Yu Jiacheng
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2024-05-28

Abstract

本公开提供了可以用于疫苗接种和其他应用的肽、工程化T细胞受体(TCR)、包括肽和TCR的细胞，以及制备和使用肽和TCR的方法。本公开涉及特异性识别来自膜糖蛋白(MGP)的SARS‑Cov‑2HLA‑A2限制性肽MGP‑65:FVLAAVYRI(SEQ ID NO:22)的TCR。

Description

靶向SARS-COV-2抗原的肽和工程化T细胞受体及其使用方法

发明背景

I.相关申请的交叉引用

本申请要求2021年3月29日提交的美国临时专利申请序列号63/167,433；2021年6月14日提交的美国临时专利申请序列号63/210,198；和2022年2月28日提交的美国临时专利申请序列号63/314,870的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

II.技术领域

本发明涉及免疫疗法和病毒感染治疗领域。

III.背景技术

自2019年12月出现SARS-CoV-2以来，世界卫生组织已经报告传播至超过200个国家，全球感染人数超过1.7亿，并且死亡人数超过350万。尽管有这样的负担，但寻找有效的疫苗、疗法和保护性生物标志物的努力仍在继续。

SARS-CoV-2表现为与人高发病率和死亡率相关的严重非典型肺炎。与T细胞淋巴细胞减少相关的失调/过度先天反应是导致该综合征的肺部病理的主要原因。T细胞数量的减少与人SARS疾病急性期的严重程度以及病毒清除延迟相关。来自其他呼吸道病毒感染诸如甲型流感(influenza A)和副流感的多条证据已确定，初级反应和记忆反应过程中生成的病毒特异性CD4和CD8 T细胞可以清除病毒并保护宿主免受严重感染。事实上，对感染SARS和MERS的患者和动物的研究也指出，T细胞介导的适应性免疫应答在保护和清除呼吸道冠状病毒感染方面发挥重要作用。在SARS恢复患者中，中和抗体滴度和记忆B细胞反应是短暂的，并且仅持续数月，而对SARS-CoV具有特异性的记忆T细胞在感染后可存活最多达6年。

对病毒具有特异性的CD4和CD8 T细胞在SARS-CoV清除和宿主保护中的作用的直接证据来自过继转移研究。在易感染SARS的小鼠体内过继输注对SARS-Cov具有特异性的效应CD4和CD8 T细胞，可快速清除病毒并改善动物的临床疾病和存活。本领域需要有效的冠状病毒治疗和预防。

发明内容

本公开提供了可以用于疫苗接种和其他应用的肽、工程化T细胞受体(TCR)、包括肽和TCR的细胞，以及制备和使用肽和TCR的方法。本公开涉及特异性识别冠状病毒肽的TCR，诸如由SEQ ID NO:22-81所示的那些。

因此，本公开的方面涉及包括抗原结合可变区的多肽，该抗原结合可变区包括本公开的CDR3的氨基酸序列或与本公开的CDR3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。其他方面涉及工程化T细胞受体(TCR)，其包括TCR-b多肽和TCR-a多肽，其中该TCR-b多肽包括本公开的CDR3的氨基酸序列或与本公开的CDR3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且该TCR-a多肽包括本公开的CDR3的氨基酸序列或与本公开的CDR3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。其他方面涉及核酸，其编码TCR-b多肽和/或TCR-a多肽，该TCR-b多肽包括本公开的CDR3的氨基酸序列或包括与本公开的CDR3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，该TCR-a多肽包括本公开的CDR3的氨基酸序列或具有与本公开的CDR3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。CDR3可以是SEQ ID NO:7、14、21、92、99、106、113、120、127、134和141的CDR3。TCR-a CDR3方面包括具有SEQ ID NO:7、14、92、106、120和134的氨基酸序列的CDR。TCR-b CDR3方面包括具有SEQ ID NO:21、99、113、127和141的氨基酸序列的CDR。

又一些方面涉及核酸，其编码肽、多肽、融合蛋白和工程化TCR。本公开还描述了核酸载体，其包括本公开的一种或多种核酸，以及包括本公开的肽、融合蛋白、多肽、工程化TCR和/或核酸的细胞。还提供了包括本公开的肽、多肽、细胞、核酸或工程化TCR的组合物。其他方面涉及制备工程化细胞的方法，其包括将本公开的核酸或载体转移至细胞中。其他方面涉及用于治疗或预防受试者中冠状病毒感染的方法，该方法包括向受试者给药多肽、组合物、细胞、核酸或工程化TCR。在一些方面，该方法用于治疗长期冠状病毒疾病(longcovid)，该方法包括向受试者给药多肽、组合物、细胞、核酸或工程化TCR。。还提供了刺激受试者的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给药本公开的组合物或细胞。方法还包括减少肿瘤负荷的方法；裂解癌细胞的方法；杀死肿瘤/癌细胞的方法；提高总体生存率的方法；降低患癌症或肿瘤风险的方法；增加复发自由生存的方法；预防癌症的方法；和/或降低、消除或减少癌症的扩散或转移的方法，该方法包括向有需要的受试者给药多肽、组合物、细胞、核酸或工程化TCR。

其他方面涉及融合蛋白，其包括本公开的TCR或其抗原结合片段，和CD3结合区。CD3结合区可以包括CD3特异性抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、单域抗体或单链抗体。示例性CD3特异性抗原结合片段(Fab)是本领域已知的。例如，US20180222981(其通过引用并入本文)公开了特异性结合CD3的可变区，其可用于本公开的方面。抗CD3抗体和可变区公开于US20180117152中，其也通过引用并入。

本公开的方面涉及包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少60％序列同一性的肽。还提供了包括与SEQ ID NO:22-38中一项的肽具有至少60％序列同一性的肽。该肽或多肽可以具有或具有与SEQ ID NO:22-81中之一至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性。该肽可以具有或具有与SEQ ID NO:22-38中一项至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性。还提供了包括本公开的肽的多肽。其他方面涉及分子复合物，其包括本公开的肽或多肽和MHC多肽。本公开的其他方面涉及产生肽/冠状病毒特异性免疫效应细胞的方法，包括：(a)获得免疫效应细胞的起始群体(startingpopulation)；和(b)使该免疫效应细胞的起始群体与本公开的肽接触，从而生成肽/冠状病毒特异性免疫效应细胞。本公开还描述了根据本公开的方法产生的肽/冠状病毒特异性工程化T细胞和TCR。其他方面涉及体外分离的树突细胞，其包括本公开的肽、多肽、核酸或表达载体。

还提供了用于预测患者或用于检测患者T细胞应答的方法，该方法包括：使来自患者的生物样品与本公开的组合物、肽或多肽接触。又一些方面涉及肽/冠状病毒特异性结合分子，其与本公开的肽结合或与肽-MHC复合物结合。示例性结合分子包括抗体、TCR模拟抗体、scFv、纳米抗体、骆驼抗体(camellids)、适体和DARPIN。相关方法提供了一种方法，包括使包括至少一种MHC多肽和本公开的肽或多肽的组合物与包括T细胞的组合物接触，并通过对检测标签进行检测来检测具有结合肽和/或MHC多肽的T细胞。其他方面涉及试剂盒，包括本公开的肽、多肽、核酸、表达载体或组合物。其他方法方面涉及克隆冠状病毒T细胞受体(TCR)的方法，该方法包括(a)获得免疫效应细胞的起始群体；(b)使该免疫效应细胞的起始群体与本公开的冠状病毒肽接触，从而生成冠状病毒特异性免疫效应细胞；(c)纯化冠状病毒肽特异性的免疫效应细胞，和(d)从纯化的免疫效应细胞中分离TCR序列。其他方面涉及制备细胞的方法，包括将本公开的核酸或表达载体转移至细胞中。其他方面涉及用于制备治疗性T细胞疫苗的体外方法，包括将T细胞与本公开的肽共培养。在一些方面，该方法用于治疗或预防SARS。在一些方面，该方法用于治疗或预防COVID-19。在一些方面，COVID-19被进一步限定为长COVID。

本公开的核酸包括编码本文所述的CDR区、可变区、工程化TCR、多肽、TCR-a多肽、TCR-b多肽、肽、多肽和融合蛋白的核酸。核酸可以是RNA。核酸还可以是编码肽或多肽、或肽或多肽的互补体的DNA或cDNA。核酸可以包括SEQ ID NO:1、8、15、86、93、100、107、114、121、128或135中一项或其片段。在一些方面，核酸包括具有SEQ ID NO:1、8、15、86、93、100、107、114、121、128或135中一项或其片段或具有与SEQ ID NO:1、8、15、86、93、100、107、114、121、128或135中一项或其片段至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核苷酸。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:7或具有与SEQ ID NO:7至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。在一些方面，多肽或TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:14或具有与SEQ ID NO:14至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。在一些方面，多肽或TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3。多肽可以包括包含SEQ ID NO:7、14或21中一项的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:21或具有与SEQ ID NO:21至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括：(i)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；(ii)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；以及该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与SEQ IDNO:21具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括：(i)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或具有SEQ ID NO:7或具有与SEQ ID NO:7至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3；或(ii)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列、或具有SEQ ID NO:14或具有与SEQ ID NO:14至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3；以及该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:21或具有与SEQ ID NO:21具有至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的的氨基酸序列的CDR3。

多肽或TCR可以包括可变区，该可变区包括来自TCR-a多肽和/或TCR-b多肽的CDR1、CDR2和/或CDR3。可变区可以包括具有SEQ ID NO:5、12或19中一项，或与SEQ ID NO:5、12或19中一项具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。可变区可以包括具有SEQID NO:5、12或19中一项，或具有与SEQ ID NO:5、12或19中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR1。

多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:5和12中一项，或具有与SEQID NO:5和12中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:5和12中一项的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:19或具有与SEQ ID NO:19至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:5和12中一项或具有与SEQ ID NO:5和12中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1，以及该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:19或具有与SEQ IDNO:19至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:5或12的氨基酸序列的CDR1，以及该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR1。

多肽、TCR-a或TCR-b可以包括可变区。可变区可以包括具有SEQ ID NO:6、13和20中一项，或与SEQ ID NO:6、13和20中一项具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。可变区可以包括具有SEQ ID NO:6、13和20中一项，或具有与SEQ ID NO:6、13和20中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR2。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:6和13中一项，或具有与SEQ IDNO:6和13中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:6和13中一项的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:20或具有与SEQ ID NO:20至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:6和13中一项或具有与SEQ ID NO:6和13中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2，以及该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:20或具有与SEQ IDNO:20至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:6和13中一项的氨基酸序列的CDR2，以及该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2。

可变区可以包括与SEQ ID NO:3、10和17中一项具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括具有SEQ ID NO:3、10和17中一项，或具有与SEQ ID NO:3、10和17中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括SEQ ID NO:3、10和17中一项的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括与SEQ ID NO:3和10中一项具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括具有SEQ ID NO:3和10中一项或具有与SEQ ID NO:3和10中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括SEQ ID NO:3和10中一项的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括与SEQ ID NO:17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括具有SEQ ID NO:17或具有与SEQ ID NO:17至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列。

多肽可以包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。可变区可以包括CDR1、CDR2和/或CDR3。多肽可以包括TCR-a可变区和恒定区。多肽可以包括或进一步包括信号肽。信号肽可以包括与SEQ ID NO:4、11和18中一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括具有SEQ ID NO:4、11和18中一项，或具有与SEQ ID NO:4、11和18中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括SEQ ID NO:4、11和18中一项的氨基酸序列。

本公开的TCR方面涉及包括TCR-a多肽和TCR-b多肽的TCR，其中TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括：(i)SEQ ID NO:5、6和7的氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:12、13和14的氨基酸序列；并且其中TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:2或具有与SEQID NO:2至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b多肽可以包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:16或具有与SEQ ID NO:16至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-a多肽可以包括SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:9或具有与SEQ ID NO:9至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b多肽包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:16或具有与SEQ ID NO:16至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:1的核酸序列，或具有SEQ ID NO:1或具有与SEQ ID NO:1至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列，并且TCR-b多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:15的核酸序列，或具有SEQ ID NO:15或具有与SEQ ID NO:15至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列。TCR-a多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:8的核酸序列，或具有SEQ ID NO:8或具有与SEQ ID NO:8至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列，并且TCR-b多肽可以由以下编码：SEQ IDNO:15的核酸序列，或具有SEQ ID NO:15或具有与SEQ ID NO:15至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:92或具有与SEQ ID NO:92至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。在一些方面，多肽或TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:99或具有与SEQ ID NO:99至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列或与SEQ ID NO:92具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；并且该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:99具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽可以包括SEQ IDNO:92的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:92或具有与SEQ ID NO:92至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3，并且该TCR-b多肽包括SEQ ID NO:99的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:99或具有与SEQ ID NO:99至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

多肽或TCR可以包括可变区，该可变区包括来自TCR-a多肽和/或TCR-b多肽的CDR1、CDR2和/或CDR3。可变区可以包括具有SEQ ID NO:90或97或与SEQ ID NO:90或97具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。可变区可以包括具有SEQ ID NO:90或97中一项或具有与SEQ ID NO:90或97中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR1。

多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:90或具有与SEQ ID NO:90至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:97或具有与SEQ ID NO:97至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR1。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:90或具有与SEQ ID NO:90至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:97或具有与SEQ ID NO:97具有至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR1，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR1。

多肽、TCR-a或TCR-b可以包括可变区。可变区可以包括具有SEQ ID NO:91或98中一项或具有与SEQ ID NO:91或98中一项至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。可变区可以包括具有SEQ ID NO:91或98中一项或具有与SEQ ID NO:91或98中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR2。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:91或具有与SEQ ID NO:91至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ IDNO:98或具有与SEQ ID NO:98至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR2。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:91或具有与SEQ ID NO:91至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:98或具有与SEQ ID NO:98至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR2，该TCR-b多肽包括具有SEQID NO:98的氨基酸序列的CDR2。

可变区可以包括与SEQ ID NO:88或95具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括具有SEQ ID NO:88或95或具有与SEQ ID NO:88或95至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括SEQ ID NO:88或95的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括与SEQ ID NO:88具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括具有SEQ ID NO:88或具有与SEQ ID NO:88至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括SEQ ID NO:88的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括与SEQ ID NO:95具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括具有SEQ ID NO:95或具有与SEQ ID NO:95至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括SEQ ID NO:95的氨基酸序列。

多肽可以包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。可变区可以包括CDR1、CDR2和/或CDR3。多肽可以包括TCR-a可变区和恒定区。多肽可以包括或进一步包括信号肽。信号肽可以包括与SEQ ID NO:89和96中一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括具有SEQID NO:89和96中一项或具有与SEQ ID NO:89和96中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括SEQ ID NO:89和96中一项的氨基酸序列。

本公开的TCR方面涉及包括TCR-a多肽和TCR-b多肽的TCR，其中TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:90、91和92的氨基酸序列；并且其中TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:87或具有与SEQ ID NO:87至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b多肽可以包括SEQ ID NO:94的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:94或具有与SEQ ID NO:94至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:86的核酸序列，或具有SEQ ID NO:86或具有与SEQ ID NO:86至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列，并且TCR-b多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:93的核酸序列，或具有SEQ ID NO:93或具有与SEQ IDNO:93至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:106或具有与SEQ ID NO:106至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。在一些方面，多肽或TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:113或具有与SEQ ID NO:113至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列或与SEQ ID NO:106具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；并且该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列或与SEQ ID NO:113具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽可以包括SEQ ID NO:106的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:106或具有与SEQ ID NO:106至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3，并且该TCR-b多肽包括SEQ ID NO:113的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:113或具有与SEQ ID NO:113具有至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

多肽或TCR可以包括可变区，该可变区包括来自TCR-a多肽和/或TCR-b多肽的CDR1、CDR2和/或CDR3。可变区可以包括具有SEQ ID NO:104或111或与SEQ ID NO:104或111具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。可变区可以包括具有SEQ ID NO:104或111或具有与SEQ ID NO:104或111至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR1。

多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:104或具有与SEQ ID NO:104至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:111或具有与SEQ ID NO:111至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR1。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:104或具有与SEQ ID NO:104至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:111或具有与SEQ ID NO:111至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR1，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR1。

多肽、TCR-a或TCR-b可以包括可变区。可变区可以包括具有SEQ ID NO:105或112或与SEQ ID NO:105或112具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。可变区可以包括具有SEQ ID NO:105或112或具有与SEQ ID NO:105或112至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR2。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:105或具有与SEQ ID NO:105至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ IDNO:112或具有与SEQ ID NO:112至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:105或具有与SEQ ID NO:105至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:112或具有与SEQ ID NO:112至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR2，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR2。

可变区可以包括与SEQ ID NO:102或109具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括具有SEQ ID NO:102或109或具有与SEQ ID NO:102或109具有至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括SEQ ID NO:102或109的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括与SEQ ID NO:102具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括具有SEQ ID NO:102或具有与SEQ ID NO:102至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括SEQ ID NO:102的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括与SEQ ID NO:109具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括具有SEQ ID NO:109或具有与SEQ ID NO:109具有至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括SEQ IDNO:109的氨基酸序列。

多肽可以包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。可变区可以包括CDR1、CDR2和/或CDR3。多肽可以包括TCR-a可变区和恒定区。多肽可以包括或进一步包括信号肽。信号肽可以包括与SEQ ID NO:103和110中一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括具有SEQ ID NO:103和110中一项或具有与SEQ ID NO:103和110中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括SEQ ID NO:103和110中一项的氨基酸序列。

本公开的TCR方面涉及包括TCR-a多肽和TCR-b多肽的TCR，其中TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:104、105和106的氨基酸序列；并且其中TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:111、112和113的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列，或具有SEQ IDNO:101或具有与SEQ ID NO:101至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b多肽可以包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:108或具有与SEQ ID NO:108至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:100的核酸序列，或具有SEQ ID NO:100或具有与SEQ ID NO:100至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列，并且TCR-b多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:107的核酸序列，或具有SEQ ID NO:107或具有与SEQ ID NO:107至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:120或具有与SEQ ID NO:120至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。在一些方面，多肽或TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:127或具有与SEQ ID NO:127至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列或与SEQ ID NO:120具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；并且该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列或与SEQ ID NO:127具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽可以包括SEQ ID NO:120的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:120或具有与SEQ ID NO:120至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3，并且该TCR-b多肽包括SEQ ID NO:127的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:127或具有与SEQ ID NO:127至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

多肽或TCR可以包括可变区，该可变区包括来自TCR-a多肽和/或TCR-b多肽的CDR1、CDR2和/或CDR3。可变区可以包括具有SEQ ID NO:118或125或与SEQ ID NO:118或125具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。可变区可以包括具有SEQ ID NO:118或125或具有与SEQ ID NO:118或125至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR1。

多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:118或具有与SEQ ID NO:118至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:125或具有与SEQ ID NO:125至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR1。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:118或具有与SEQ ID NO:118至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:125或具有与SEQ ID NO:125至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR1。

多肽、TCR-a或TCR-b可以包括可变区。可变区可以包括具有SEQ ID NO:119或126或与SEQ ID NO:119或126具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。可变区可以包括具有SEQ ID NO:119或126或具有与SEQ ID NO:119或126至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR2。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:119或具有与SEQ ID NO:119至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ IDNO:126或具有与SEQ ID NO:126至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR2。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:119或具有与SEQ ID NO:119至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:126或具有与SEQ ID NO:126具有至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR2。

可变区可以包括与SEQ ID NO:116或123具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括具有SEQ ID NO:116或123或具有与SEQ ID NO:116或123至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括SEQ ID NO:116或123的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括与SEQ ID NO:116具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括具有SEQ ID NO:116或具有与SEQ ID NO:116至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括SEQ ID NO:116的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括与SEQ ID NO:123具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括具有SEQ ID NO:123或具有与SEQ ID NO:123具有至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括SEQ ID NO:123的氨基酸序列。

多肽可以包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。可变区可以包括CDR1、CDR2和/或CDR3。多肽可以包括TCR-a可变区和恒定区。多肽可以包括或进一步包括信号肽。信号肽可以包括与SEQ ID NO:117和124中一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括具有SEQ ID NO:117和124中一项或具有与SEQ ID NO:117和124中一项至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括SEQ ID NO:117和124中一项的氨基酸序列。

本公开的TCR方面涉及包括TCR-a多肽和TCR-b多肽的TCR，其中TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:118、119和120的氨基酸序列；并且其中TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:125、126和127的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以包括SEQ ID NO:115的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:115或具有与SEQ ID NO:115至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b多肽可以包括SEQ ID NO:122的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:122或具有与SEQ IDNO:122至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:114的核酸序列，或具有SEQ ID NO:114或具有与SEQ ID NO:114至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列，并且TCR-b多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:121的核酸序列，或具有SEQ ID NO:121或具有与SEQ ID NO:121至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:134或具有与SEQ ID NO:134至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。在一些方面，多肽或TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:141或具有与SEQ ID NO:141至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列或与SEQ ID NO:134至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；并且该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列或与SEQ ID NO:141具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽可以包括SEQ ID NO:134的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:134或具有与SEQ ID NO:134少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3，并且该TCR-b多肽包括SEQ ID NO:141的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:141或具有与SEQ ID NO:141至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

多肽或TCR可以包括可变区，该可变区包括来自TCR-a多肽和/或TCR-b多肽的CDR1、CDR2和/或CDR3。可变区可以包括具有SEQ ID NO:132或139或与SEQ ID NO:132或139具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。可变区可以包括具有SEQ ID NO:132或139或具有与SEQ ID NO:132或139至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR1。

多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:132或具有与SEQ ID NO:132至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:139或具有与SEQ ID NO:139至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。多肽、TCR或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR1。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:132或具有与SEQ ID NO:132至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:139或具有与SEQ ID NO:139至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR1。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1，以及该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR1。

多肽、TCR-a或TCR-b可以包括可变区。可变区可以包括具有SEQ ID NO:133或140或与SEQ ID NO:133或140具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。可变区可以包括具有SEQ ID NO:133或140或具有与SEQ ID NO:133或140至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的CDR2。

多肽或TCR-a多肽可以包括包含具有SEQ ID NO:133或具有与SEQ ID NO:133至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-a多肽可以包括包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含具有SEQ IDNO:140或具有与SEQ ID NO:140至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。多肽或TCR-b多肽可以包括包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR2。

工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:133或具有与SEQ ID NO:133至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:140或具有与SEQ ID NO:140至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR2。工程化TCR可以包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，该TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2，该TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR2。

可变区可以包括与SEQ ID NO:130或137具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括具有SEQ ID NO:130或137或具有与SEQ ID NO:130或137至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。可变区可以包括SEQ ID NO:130或137的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括与SEQ ID NO:130具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括具有SEQ ID NO:130或具有与SEQ ID NO:130至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可以包括SEQ ID NO:130的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括与SEQ ID NO:137至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括具有SEQ ID NO:137或具有与SEQ ID NO:137至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-b可变区可以包括SEQ ID NO:137的氨基酸序列。

多肽可以包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。可变区可以包括CDR1、CDR2和/或CDR3。多肽可以包括TCR-a可变区和恒定区。多肽可以包括或进一步包括信号肽。信号肽可以包括与SEQ ID NO:131和138中一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括具有SEQ ID NO:131和138中一项或具有与SEQ ID NO:131和138中一项具有至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。信号肽可以包括SEQ ID NO:131和138中一项的氨基酸序列。

本公开的TCR方面涉及包括TCR-a多肽和TCR-b多肽的TCR，其中TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:132、133和134的氨基酸序列；并且其中TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:1139、140和141的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以包括SEQ ID NO:129的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:129或具有与SEQ ID NO:129至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b多肽可以包括SEQ ID NO:136的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:136或具有与SEQ IDNO:136至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的氨基酸序列。

TCR-a多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:128的核酸序列，或具有SEQ ID NO:128或具有与SEQ ID NO:128至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列，并且TCR-b多肽可以由以下编码：SEQ ID NO:135的核酸序列，或具有SEQ ID NO:135或具有与SEQ ID NO:135至少75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其中任何可推导的范围)序列同一性的核酸序列。

TCR可以包括修饰或可以是嵌合的。TCR的可变区可以与TCR恒定区融合，该TCR恒定区不同于特异性结合本公开的肽的克隆的TCR的恒定区。

[TCR-a多肽和TCR-b多肽可以可操作地连接。术语“可操作地连接”可以是指共价连接，诸如肽键(例如，两个元件是多肽并且位于同一多肽上)，或非共价连接，诸如范德华力(例如，两个彼此具有一定程度的特异性结合亲和力的多肽)。TCR-a多肽和TCR-b多肽可以通过肽键可操作地连接。TCR-a多肽和TCR-b多肽可以位于同一多肽上，并且其中TCP-b位于TCR-a的氨基近端。TCR-a多肽和TCR-b多肽可以位于同一多肽上，并且其中TCR-a位于TCR-b的氨基近端。因此，TCR可以是单链TCR。单链TCR可以包括或进一步包括TCR-a和TCR-b多肽之间的接头。接头可以是本文所述的或本领域已知的接头。接头还可以包括甘氨酸和丝氨酸残基或由其组成。在一些方面，接头仅由甘氨酸和丝氨酸残基组成(甘氨酸-丝氨酸接头)。接头可以是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n、(GSGGS)n、(G₄S)n和(GGGS)n，其中n是至少一的整数。在一些方面，n至少、至多或恰好是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中任何可推导的范围)。甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头可以用作本公开的多肽中的接头。示例性接头可以包括GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG、GSSSG等或由其组成。当第一区域附接至第二区域的羧基末端时，第一区域位于第二区域的羧基近端。在第一区域和第二区域之间可以存在另外的插入氨基酸残基。因此，这些区域不需要紧邻，除非特别指定不具有插入的氨基酸残基。术语“氨基近端”的类似定义在于，当第一区域附接至第二区域的氨基末端时，第一区域位于第二区域的氨基近端。类似地，除非另有说明，否则在第一区域和第二区域之间可以存在另外的插入氨基酸残基。

在TCR-a或TCR-b多肽的可变区的背景下，CDR还可以包括位于特定CDR序列的一侧或两侧的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、16、18、19、20、21、22、23个或更多个连续氨基酸残基(或其中可推导的任何范围)；因此，在特定CDR序列的N-末端或C-末端处可能存在一个或多个另外的氨基酸，诸如SEQ ID NO:3、10和17的可变区中所示的那些。可选地或组合地，CDR还可以是本文所述的CDR的片段并且可以缺失来自特定CDR序列的C-末端或N-末端的至少1、2、3、4或5个氨基酸。

TCR或融合蛋白可以与检测剂或治疗剂缀合。该试剂可以包括荧光分子、辐射分子或毒素。TCR或融合蛋白可以与本文所述的试剂缀合。

该肽可以包括SEQ ID NO:22-81中一项的肽的至少6个连续氨基酸。该肽可以包括SEQ ID NO:22-81中一项的肽的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个连续氨基酸。该肽可以包括SEQ ID NO:22-81中一项或由其组成。该肽可以包括SEQ ID NO:22-38中一项或由其组成。在一些方面，肽的长度为13个氨基酸或更短。该肽可以具有至少、至多、恰好7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸(或其中可推导的任何范围)，或由其组成。在具体方面，该肽由9个氨基酸组成。该肽可由10个氨基酸组成。该肽可由11个氨基酸组成。该肽可由12个氨基酸组成。该肽可由13个氨基酸组成。在一些方面，该肽是免疫原性的。术语免疫原性可以是指免疫应答的产生，诸如保护性免疫应答。该肽可以经修饰。修饰可以包括与分子缀合。该分子可以是抗体、脂质、佐剂或检测部分(标签)。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽100％序列同一性。本公开的肽还包括具有SEQ ID NO:22-81中一项或具有与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的肽。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少63％同一性。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少66％同一性。该肽可以包括与SEQ IDNO:22-81中一项的肽至少70％同一性。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少72％同一性。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少77％同一性。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少80％同一性。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少80％同一性。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少81百分之同一性。该肽可以包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽至少88％同一性。该肽可以包括与SEQ IDNO:22-81中一项的肽至少90％同一性。相对于SEQ ID NO:18-21中一项的肽，本公开的肽可以具有1、2或3个置换。相对于SEQ ID NO:22-81中一项的肽，该肽可以具有至少或至多1、2、3、4或5个置换。

药物组合物可以被配制为用于肠胃外给药、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。肽可以被包括在脂质体、包含脂质的纳米颗粒中或基于脂质的载体中。药物制剂可以被配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。在一些方面，本公开的组合物被配制成疫苗。该组合物可以进一步包括佐剂。

在关于本公开的树突细胞的一些方面，树突细胞包括成熟树突细胞。细胞可以是具有HLA-A型的细胞。HLA可以是HLA-A、HLA-B或HLA-C。在一些方面，细胞是HLA-A24型。在一些方面，细胞是HLA-A11型。在一些方面，细胞是HLA-A01、HLA-A02、HLA-A11、HLA-A24、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B15或HLA-B40。

该方法可以进一步包括分离表达的肽或多肽。在一些方面，T细胞包括CD8+T细胞。在一些方面，T细胞是CD4+T细胞、Th1、Th2、Th17、Th9或Tfh T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞。

在本公开的方法方面，接触进一步被定义为将免疫效应细胞的起始群体与抗原呈递细胞(APC)、人工抗原呈递细胞(aAPC)或人工抗原呈递表面(aAPS)共培养；其中APC、aAPC或aAPS在其表面上呈递所述肽。在一些方面，APC是树突细胞。

在本公开的方面，免疫效应细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、恒定NK细胞或NKT细胞。免疫效应细胞可以是已从间充质干细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPS)分化的细胞。T细胞方面包括进一步被定义为CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或γδT细胞的T细胞。在某些方面，T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一些方面，获得包括从外周血单核细胞(PBMC)分离免疫效应细胞的起始群体。

核酸可以包括TCR-a(TRA)和TCR-b(TRB)基因。核酸可以是多顺反子的。核酸可以包括内部核糖体进入位点(IRES)或2A可切割接头，诸如P2A接头。核酸可以包括编码TCR-a和/或TCR-b基因的cDNA。核酸可以进一步编码包括CD3结合区的多肽。CD3结合区可以包括CD3特异性抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、单域抗体或单链抗体。

载体可以包括TCR-a和TCR-b基因。载体可以包括引导核酸表达的启动子。启动子可以包括鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。细胞可以包括干细胞、祖细胞、免疫细胞或自然杀伤(NK)细胞。细胞可以包括造血干细胞或祖细胞、T细胞、从间充质干细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPSC)分化的细胞。细胞可以分离自或源自外周血单核细胞(PBMC)。T细胞可以包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、恒定NK T(iNKT)细胞、γ-ΔT细胞、NKT细胞或调节性T细胞。细胞可以分离自当前或既往患有冠状病毒感染的患者。在一些方面，细胞分离自当前或过去未患有冠状病毒感染的健康受试者。在一些方面，细胞分离自健康患者。细胞可能被冷冻或可能从未被冷冻过。细胞可以是细胞培养物中的细胞。在一些方面，细胞缺失TCR基因的内源表达。细胞可以进一步包括嵌合抗原受体(CAR)。

组合物可以是已确定无血清、无支原体、无内毒素和/或无菌的组合物。该方法进一步包括在培养基中培养细胞，在允许细胞分裂的条件下孵育细胞，筛选细胞，和/或冷冻细胞。

在本公开的各方面中，冠状病毒可以是指分离自蝙蝠的冠状病毒。在本公开的一些方面，冠状病毒是SARS-CoV，其是在人中引起SARS的病毒。在一些方面，冠状病毒是SARS-CoV-2，其中是在人中引起COVID-19的病毒。在一些方面，该方法用于治疗或预防SARS。在一些方面，该方法用于治疗或预防COVID-19。在一些方面，冠状病毒是表达包括SEQ ID NO:22-81中一项的多肽的冠状病毒。受试者可以包括实验室测试动物，诸如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、马或猪。在一些方面，受试者是人。受试者可以是具有冠状病毒感染的一种或多种症状的受试者。在一些方面，受试者没有冠状病毒感染的任何症状。受试者可以是已诊断和/或已被诊断患有冠状病毒感染的受试者。在一些方面，受试者尚未诊断和/或尚未被诊断患有冠状病毒感染。在一些方面，受试者既往已接受过冠状病毒感染治疗。受试者可以是已确定对既往治疗有抗性或无反应的受试者。在一些方面，向受试者给药另外的治疗剂。在一些方面，另外的治疗剂包括类固醇或抗病毒治疗剂。在一些方面，另外的治疗剂包括地塞米松(dexamethasone)、单克隆抗体、瑞德西韦(remdesivir)、帕罗韦德(Paxlovid)、莫诺拉韦(Molnupiravir)、恢复期血浆或其组合。

在一些方面，受试者已诊断和/或已被诊断患有SARS。在一些方面，受试者已被诊断患有与冠状病毒感染相关的并发症。在一些方面，受试者已被诊断患有与COVID-19或SARS相关的并发症。并发症可以包括肺炎、呼吸困难或呼吸急促、胸痛或胸部压力、急性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、急性心肌损伤、继发感染、急性肾损伤、脓毒性休克、血块、多系统炎性综合征、慢性疲劳、横纹肌溶解、弥散性血管内凝血或急性肝损伤。在一些方面，受试者针对冠状病毒接种疫苗。在一些方面，受试者针对SARS-CoV-2或SARS-CoV接种疫苗。受试者还可以是未针对冠状病毒接种疫苗的受试者。在一些方面，受试者已被诊断患有长期冠状病毒疾病。在一些方面，患者免疫受损或被免疫抑制。

本公开的组合物可以被配制成疫苗。本公开的组合物和方法提供了预防COVID-19或SARS-Cov-2感染的预防性治疗。该组合物可以进一步包括佐剂。佐剂是本领域已知的并且包括，例如，TLR激动剂和铝盐。

本公开的方法可以进一步包括筛选细胞的一种或多种细胞特性，诸如TCR表达、编码TCR基因的核酸的掺入，或免疫原性特性，诸如TCR与抗原的结合。

该方法可以包括给药细胞或包括细胞的组合物，并且其中细胞包括自体细胞。在一些方面，细胞包括非自体细胞。细胞还可以被定义为同种异体或异种细胞。

本公开的方法中的生物样品可以包括血液样品或其级分。在一些方面，生物样品包括淋巴细胞。在一些方面，生物样品包括包含淋巴细胞的级分样品。生物样品还可以是本文所述的一种。

组合物可以包括本公开的MHC多肽和肽，并且其中MHC多肽和/或肽缀合至检测标签。因此，合适的检测标签包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白，包括酶。标签可以被简单地检测或其可以被定量。简单地检测到的反应通常包括仅确认其存在的反应，而定量的反应通常包括具有可定量(例如，可数字报告)值(例如强度、极化和/或其他属性)的反应。在发光或荧光测定中，可以直接使用与实际参与结合的测定组分缔合的发光团或荧光团生成可检测的反应，或间接使用与另一(例如，报告分子或指示剂)组分缔合的发光团或荧光团。产生信号的发光标签的实例包括但不限于生物发光和化学发光。合适的荧光标签的实例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、荧光黄、Cascade Blue.TM.和德克萨斯红。其他合适的光学染料描述于Haugland,Richard P.(1996)荧光探针和研究化学品手册(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)(第6版)中。检测标签还包括链霉亲和素或其结合伴侣，生物素。

MHC多肽和肽可以可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个组分组合或能够组合形成复合物的情况。例如，组分可以共价附接和/或附接在同一多肽上，诸如在融合蛋白中，或组分可以彼此具有一定程度的结合亲和力，诸如通过范德华力发生的结合亲和力。因此，本公开的方面涉及其中MHC多肽和肽通过肽键可操作地连接。其他方面涉及其中MHC多肽和肽通过范德华力可操作地连接。肽-MHC可以可操作地连接以形成pMHC复合物。在一些方面，至少两个pMHC复合物可操作地连接在一起。其他方面包括、包括至少或包括至多2、3、4、5、6、7、8、9或10个彼此可操作地连接的pMHC复合物。在一些方面，至少两个MHC多肽与一个肽连接。在其他方面，MHC多肽与肽的平均比率为1:1至4:1。在一些方面，比率或平均比率为至少、至多或约1、2、3、4、5或6至约1、2、3、4、5或6(或其中的任何可推导的范围)。

在本公开的一些方面，肽与MHC络合。在一些方面，MHC包括HLA-A型。MHC可以进一步被限定为HLA-A3或HLA-A11型。可以将肽负载至树突细胞、类淋巴母细胞、外周血单核细胞(PBMC)、人工抗原呈递细胞(aAPC)或人工抗原呈递表面上。在一些方面，人工抗原呈递表面包括缀合或连接至表面的MHC多肽。示例性表面包括珠粒、微孔板、玻璃载玻片或细胞培养板。

本公开的方法可以进一步包括对与肽和/或MHC结合的T细胞的数量进行计数。包括T细胞的组合物可以分离自受试者。受试者可以是如本文所定义的一种受试者，诸如人受试者。该方法可以进一步包括对与肽和/或MHC结合的T细胞的数量进行分选。本公开的方法还可以包括或进一步包括对来自与肽和/或MHC结合的T细胞的一个或多个TCR基因进行测序。在一些方面，该方法包括或进一步包括对来自TCR(诸如结合本公开的肽的TCR)的一种或多种TCRα和/或β基因进行测序。该方法还可以包括或进一步包括通过胞旁热点对淋巴细胞相互作用进行分组(grouping of lymphocyte interactions by paratope hotspots，GLIPH)分析。Glanville et al.,Nature.2017Jul 6；547(7661):94–98(其通过引用并入本文)对此进行进一步描述。

本公开的组合物可以是无血清、无支原体、无内毒素和/或无菌的。该方法可以进一步包括在培养基中培养本公开的细胞、在允许细胞分裂的条件下孵育细胞、筛选细胞和/或冷冻细胞。该方法还可以进一步包括从本公开的细胞分离表达的肽或多肽。

本公开的方法可以包括或进一步包括筛选树突细胞的一种或多种细胞特性。在一些方面，该方法进一步包括使细胞与一种或多种细胞因子或生长因子接触。一种或多种细胞因子或生长因子可以包括GM-CSF。在一些方面，细胞特性包括CD86、HLA和CD14中的一种或多种的细胞表面表达。树突细胞可以源自CD34+造血干细胞或祖细胞。

本公开的方法中的接触可以进一步被定义为将免疫效应细胞的起始群体与抗原呈递细胞(APC)共培养，其中APC在其表面上呈递肽。在具体方面，APC是树突细胞。在一些方面，树突细胞源自外周血单核细胞(PBMC)。在一些方面，树突细胞分离自PBMC。树突细胞或DC来源的细胞通过白细胞分离术分离。

本公开的方面中的肽-MHC(pMHC)复合物可以通过使本公开的肽与MHC复合物接触进行制备。在一些方面，肽在细胞中表达并结合内源MHC复合物以形成pMHC。在一些方面，肽交换用于制备pMHC复合物。例如，可切割的肽诸如可光切割的肽可以被设计成结合并稳定MHC。肽的切割(例如，通过照射可光切割肽)将肽从HLA复合物中解离，并产生快速分解的空HLA复合物，除非在“救援肽”存在的情况下进行UV暴露。因此，本公开的肽可以用作肽交换程序中的“救援肽”。本公开的其他方面涉及包括本公开的肽的pMHC复合物。pMHC复合物可以可操作地连接至固体载体或可以附接至可检测部分，诸如荧光分子、放射性同位素或抗体。本公开的其他方面涉及肽-MHC多聚复合物，其包括、至少包括或至多包括1、2、3、4、5或6个可操作地连接在一起的肽-MHC分子。连接可以是共价的，诸如通过肽键，或非共价的。在一些方面，pMHC分子可以与生物素分子结合。此类pMHC分子可以通过与链霉亲和素分子结合而多聚化。pMHC多聚体可以用于检测组合物或组织中的抗原特异性T细胞或TCR分子。多聚体可以用于检测原位或活检样品中对肽或冠状病毒具有特异性的T细胞。多聚体可以与固体载体结合或沉积在固体载体，诸如阵列或载玻片上。然后，可以将细胞添加至载玻片上，并且可以进行pMHC多聚体和细胞之间的结合的检测。因此，本公开的pMHC分子和多聚体可以用于检测和诊断受试者的SARS-Cov-2感染或确定患有COVID-19的个体的免疫应答。

如本文所述方法中所定义的，获得可以包括或进一步包括从外周血单核细胞(PBMC)中分离免疫效应细胞的起始群体。在一些方面，免疫效应细胞的起始群体获自受试者。本公开的方法可以包括或进一步包括在共培养之前，将肽或编码肽的核酸引入至树突细胞中。可以通过用编码肽的核酸转染或感染树突细胞或通过将肽与树突细胞一起孵育来进行肽的引入。肽或编码肽的核酸可以通过电穿孔引入。转移核酸的其他方法是本领域已知的，诸如脂转染、磷酸钙转染、用DEAE-葡聚糖转染、显微注射和病毒介导的转导，并且可以用于本公开的方法中用于转移本公开的核酸进入至细胞中。在一些方面，通过将肽或编码肽的核酸添加至树突细胞培养基中来引入肽或编码肽的核酸。在一些方面，将免疫效应细胞与其中已引入肽或编码肽的核酸的第二树突细胞群共培养。在一些方面，在共培养后，从免疫效应细胞中纯化CD4阳性或CD8阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞的群。在一些方面，通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化CD4阳性或CD8阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞的群。在一些方面，通过限制性或连续稀释生成冠状病毒特异性免疫效应细胞的克隆群体，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆。

在一些方面，纯化进一步包括通过以下产生冠状病毒特异性免疫效应细胞的克隆群体：限制性或连续稀释分选的细胞，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆。本公开的方法可以包括或进一步包括从冠状病毒特异性免疫效应细胞的克隆群体中克隆T细胞受体(TCR)。本公开的方法中的术语分离可以被定义或进一步被定义为从冠状病毒特异性免疫效应细胞的克隆群体中克隆T细胞受体(TCR)。在一些方面，克隆所述TCR是克隆TCRα和β链。在一些方面，使用5'-cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆TCR。在一些方面，使用5'-cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆TCRα链和β链。在一些方面，将克隆的TCR亚克隆至表达载体中。在一些方面，表达载体包括TCRα序列和TCRβ序列之间的接头结构域。表达载体可以是逆转录病毒或慢病毒载体。载体还可以是本文所述的表达载体。接头结构域可以包括编码一个或多个肽切割位点的序列。一个或多个切割位点可以是Furin切割位点和/或P2A切割位点。在一些方面，TCRα序列和TCRβ序列通过IRES序列连接。

可以用表达载体转导本公开的宿主细胞以生成表达TCRα和/或β链的工程化细胞。在一些方面，宿主细胞是免疫细胞。免疫细胞可以是T细胞并且工程化细胞可以称为工程化T细胞。T细胞可以是本文所述的T细胞类型，诸如CD8⁺T细胞、CD4+T细胞或γδT细胞。免疫效应细胞的起始群体可以从患有SARS-Cov-2感染的受试者获得，并且宿主细胞对于受试者是同种异体的或自体的。冠状病毒特异性T细胞可以是自体的或同种异体的。可以从转导的宿主细胞中纯化CD4阳性或CD8阳性和肽MHC四聚体阳性工程化T细胞的群。在一些方面，通过限制性或连续稀释生成冠状病毒特异性工程化T细胞的克隆群体，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆。在一些方面，本公开的方法中的纯化被定义为，在共培养后从免疫效应细胞中纯化CD4阳性或CD8阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞的群。

肽可以与固体载体连接。在一些方面，肽与固体载体缀合或与缀合固体载体的抗体结合。固体载体可以包括微孔板、珠粒、玻璃表面、载玻片或细胞培养皿。在一些方面，固体载体包括纳米流体芯片。检测T细胞应答可以包括或进一步包括检测肽与T细胞或TCR的结合。在一些方面，检测T细胞应答包括ELISA、ELISPOT或四聚体测定。

本公开的方法还可以用于确定疫苗诸如冠状病毒、SARS或SARS-CoV2疫苗的功效。

本公开的试剂盒方面可以包括在容器中的本公开的肽。肽可以被包括在药物制剂中。药物制剂可以被配制成用于肠胃外给药或吸入。在一些方面，肽被包括在细胞培养基中。

术语“受试者”和“患者”可以互换使用并且可以是指人受试者。受试者可以被定义为哺乳动物受试者。受试者还可以是小鼠、大鼠、猪、马、非人灵长类动物、猫、犬、牛等。

在整个本申请中，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的简单和普通含义来使用，以指示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。

当与术语“包括”结合使用时，词语“一个(a或an)”的使用可以表示“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述彼此组合或互斥的多个组成部分。例如，“x、y和/或z”可以是指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别设想x、y或z可以被明确地从实施方式中排除。

词语“包括(comprising)”(以及任何形式的包括，诸如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)、“特征在于”(以及任何形式的包括，诸如“特征为”)或“包含(containing)”(以及任何形式的包含，例如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包容性的或开放式的，并且不排除另外的、未叙述的要素或方法步骤。

组合物及其使用方法可以“包括”、“基本上由……组成”或“由……组成”整个说明书中公开的任何成分或步骤。短语“由……组成”排除任何未指定的要素、步骤或成分。短语“基本上由……组成”将所描述的主题的范围限制为指定的材料或步骤以及那些不实质上影响其基本和新颖特征的材料或步骤。设想在术语“包括”的背景下描述的实施方式还可以在术语“由……组成”或“基本上由……组成”的背景下实现。

在治疗、诊断或生理目的或效果的背景下的任何方法还可以以“用途”权利要求语言来描述，例如本文讨论的任何化合物、组合物或剂的“用途”，用于实现或实施所述的治疗、诊断或生理目的或效果。

可以基于本文所述的任何方法来采用一种或多种序列或组合物的用途。本申请全文讨论了其他实施方式。关于本公开的一方面讨论的任何实施方式也适用于本公开的其他方面，反之亦然。

特别设想了关于本发明的一种实施方式讨论的任何限制可以适用于本发明的任何其他实施方式。此外，本发明的任何组合物可以用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可以用于产生或利用本发明的任何组合物。实施例中阐述的实施方式的方面还是可以在不同实施例中其他之处或本申请中的其他之处讨论的实施方式的背景下实施的实施方式，例如在发明内容、具体实施方式、权利要求和附图说明中。

本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应当理解的是，详细描述和具体实例，虽然指示本发明的具体实施方式，但是仅以示例的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文呈现的具体实施方式的详细描述可以更好地理解本发明。

图1.通过MHC免疫沉淀(IP)方法鉴定SARS-Cov-2膜糖蛋白(MGP)HLA-A0201限制性肽。

图2.SARS-Cov-2 HLA-A0201限制性肽(MGP-65,FVLAAVYRI–SEQ ID NO:22)CTL生成。

图3A-C.MGP-65肽特异性CTL细胞系的功能验证。

图4.MGP-65CTL细胞系通过冷靶抑制测定识别特异性检测。

图5.使用细胞内细胞因子染色(ICS)测定对MGP-65特异性CTL细胞系进行功能验证。

图6.SARS CoV-2特异性TCR-T生成。

图7A-C.SARS-CoV-2特异性TCR-T的功能验证。(A)显示了SARS-CoV-2特异性TCR-T裂解靶细胞的能力(Cr51释放测定，CRA)。使用不同浓度的SARS-CoV-2肽脉冲的T2细胞作为靶标。效应子与靶标(E:T)比为20:1。(B、C)显示了SARS-CoV-2TCR-T裂解不同靶标的能力(CRA)。使用过表达eGFP或SARS-Cov-2全长蛋白的A375、Mel624细胞系作为靶标。

图8A-L.通过质谱鉴定SARS-CoV-2来源的HLA I类肽。(A)HLA-I肽鉴定的示意图。免疫肽组和蛋白质组分析的MS/MS谱针对Swiss-Prot人和病毒蛋白数据库进行搜索，并以1％ FDR过滤。(B)NSP13-400肽的MS/MS注释(VYIGDPAQL–SEQ ID NO:37)。(C-E)NSP13-448肽(IVDTVSALVY–SEQ ID NO:34)、NSP13-242肽(TLVPQEHYV–SEQ ID NO:35)和MGP-65肽(FVLAAVYRI–SEQ ID NO:22)的PRM分析。使用Skyline软件绘制每个靶向肽的MS1 XIC面积和MS/MS。(F-J)五个候选肽序列与所有已知感染人的冠状病毒的多重序列比对。(K)改编自Nextstrain项目(http://nextstrain.org)。五个候选SARS-CoV-2肽序列位于SARS-CoV-2基因组的保守区。(L)NSP13蛋白报告四种突变：E341D、A368V(P.1谱系)、K460R(B.1.1.7谱系)和T588I(B.1.351谱系)。使用以下缩写：VAR：变体，点(.)表示该位置的相同氨基酸。

图9A-G.膜糖蛋白(membrane glycol-protein，MGP)来源的HLA-A0201肽MGP-65的T细胞生成和功能验证。(A)用MGP-65肽(FVLAAVYRI–SEQ ID NO:22)脉冲源自HLA-A0201健康供体的成熟树突细胞(DC)，并与自体PBMC共培养。两轮刺激后，观察到小CD8+和MGP-65四聚体+群体(左侧)。然后，使用标准快速扩增方案(REP)对CD8+和MGP-65四聚体阳性细胞进行分选和扩增。扩增两周后，生成高纯度CTL(四聚体+群体超过90％)(右侧)。(B)用不同浓度的MGP-65肽脉冲的⁵¹Cr标记的T2细胞与MGP-65特异性CTL以20:1的效应子与靶标(E:T)比共培养。使用标准⁵¹Cr释放测定(CRA)检测MGP-65特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(C、D)⁵¹Cr标记的MGP或GFP强制表达HLA-A0201细胞系A375(A375-MGP，A375-GFP)和Mel624(Mel624-MGP，Mel624-GFP)与MGP-65特异性CTL以不同E:T比(40:1至1.25:1)共培养。用标准CRA检测MGP-65特异性CTL对不同靶标的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(E，F)冷靶抑制测定。⁵¹Cr标记的A375-MGP和Mel624-MGP作为热靶。用MGP-65肽或M26无关肽脉冲的非放射性标记T2细胞作为冷靶。冷靶:热靶比为10:1或20:1。MGP-65特异性CTL与单独的热靶或热靶与冷靶以20:1E:热T比共培养。用标准CRA检测MGP-65特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(G)细胞内细胞因子染色(ICS)测定。在存在布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)的情况下，MGP-65特异性CTL与用MGP-65肽或M26无关肽脉冲的T2以及A375-MGP、A375-GFP、Mel624-MGP、Mel624-GFP以10:1E:T比共培养过夜。孵育后，使用流式细胞仪检测IFN-γ、TNF-α以及TCR通路下游激活标志物CD137和CD69的水平。

图10A-G.非结构蛋白NSP13来源的HLA-A0201肽NSP13-242的T细胞生成和功能验证。(A)来自HLA-A0201健康供体的PBMC与NSP13-242肽(TLVPQEHYV–SEQ ID NO:35)脉冲的自体DC共培养。两轮刺激后，诱导CD8+和NSP13-242四聚体阳性T细胞(左侧)。对CD8+和四聚体+T细胞进行分选，然后用REP扩增两周，以生成高纯度的NSP13-242特异性CTL(右侧)。(B)用不同浓度的NSP13-242肽脉冲的⁵¹Cr标记的T2细胞与NSP13-242特异性CTL以20:1E:T比共培养。用标准CRA检测NSP13-242特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(C,D)⁵¹Cr标记的NSP13或GFP强制表达HLA-A0201细胞系A375(A375-NSP13，A375-GFP)和Mel624(Mel624-NSP13，Mel624-GFP)与NSP13-242特异性CTL以不同E:T比(40:1至1.25:1)共培养。用标准CRA检测NSP13-242特异性CTL对不同靶标的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(E，F)冷靶抑制测定。⁵¹Cr标记的A375-NSP13和Mel624-NSP13作为热靶。用NSP13-242肽或M26无关肽脉冲的非放射性标记T2细胞作为冷靶。冷靶:热靶比为10:1或20:1。NSP13-242特异性CTL与单独的热靶或热靶与冷靶以20:1E:热T比共培养。用标准CRA检测NSP13-242特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(G)细胞内细胞因子染色(ICS)测定。在存在BFA的情况下，NSP13-242特异性CTL与用NSP13-242肽或M26无关肽脉冲的T2以及A375-NSP13、A375-GFP、Mel624-NSP13、Mel624-GFP以10:1E:T比共培养过夜。孵育后，使用流式细胞仪检测IFN-γ、TNF-α以及TCR通路下游激活标志物CD137和CD69的水平。

图11A-G.非结构蛋白NSP13来源的HLA-A0101肽NSP13-448的T细胞生成和功能验证。(A)来自HLA-A0101健康供体的PBMC与NSP13-448肽(VYIGDPAQL–SEQ ID NO:37)脉冲的自体DC共培养。两轮刺激后，诱导CD8+和NSP13-448四聚体阳性T细胞(左侧)。对CD8+和四聚体+T细胞进行分选，然后用REP扩增两周，以生成高纯度的NSP13-448特异性CTL(右侧)。(B)用不同浓度的NSP13-448肽脉冲的⁵¹Cr标记的A375细胞与NSP13-448特异性CTL以20:1E:T比共培养。用标准CRA检测NSP13-448特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(C，D)⁵¹Cr标记的NSP13或GFP强制表达HLA-A0101细胞系A375(A375-NSP13，A375-GFP)和RPMI-7951(RPMI-7951-NSP13，RPMI-7951-GFP)与NSP13-448特异性CTL以不同E:T比(40:1至1.25:1)共培养。用标准CRA检测NSP13-448特异性CTL对不同靶标的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(E，F)冷靶抑制测定。⁵¹Cr标记的A375-NSP13和RPMI-7951-NSP13作为热靶。用NSP13-448肽或无关HLA-A0101肽脉冲的非放射性标记A375细胞作为冷靶。冷靶:热靶比为10:1或20:1。NSP13-448特异性CTL与单独的热靶或热靶与冷靶以20:1E:热T比共培养。用标准CRA检测NSP13-448特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(G)细胞内细胞因子染色(ICS)测定。在存在BFA的情况下，NSP13-448特异性CTL与用NSP13-448肽或无关HLA-A0101肽脉冲的A375以及A375-NSP13、A375-GFP、RPMI-7951-NSP13、RPMI-7951-GFP以10:1E:T比共培养过夜。孵育后，使用流式细胞仪检测IFN-γ、TNF-α以及TCR通路下游激活标志物CD137和CD69的水平。

图12A-E.非结构蛋白NSP13来源的HLA-A0301肽NSP13-134的T细胞生成和功能验证。(A)NSP13-134肽(KLFAAETLK-SEQ ID NO:36)脉冲的DC与HLA-A0301健康供体的自体PBMC共培养。两轮刺激后，诱导CD8+和NSP13-134四聚体阳性T细胞(左侧)。对CD8+和四聚体+T细胞进行分选，然后用REP扩增两周，以生成高纯度的NSP13-134特异性CTL(右侧)。(B)用不同浓度的NSP13-134肽脉冲的⁵¹Cr标记的HLA-A0301细胞Hs-578T与NSP13-134特异性CTL以20:1E:T比共培养。用标准CRA检测NSP13-134特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(C)⁵¹Cr标记的NSP13或GFP强制表达HLA-A0301细胞系Hs-578T(Hs-578T-NSP13、Hs-578T-GFP)与NSP13-134特异性CTL以不同E:T比(40:1至1.25:1)共培养。用标准CRA检测NSP13-134特异性CTL对不同靶标的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(D)冷靶抑制测定。⁵¹Cr标记的Hs-578T-NSP13细胞作为热靶。用NSP13-134肽或无关HLA-A0301肽脉冲的非放射性标记的Hs-578T细胞作为冷靶。冷靶:热靶比为10:1或20:1。NSP13-134特异性CTL与单独的热靶或热靶与冷靶以20:1E:热T比共培养。用标准CRA检测NSP13-134特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(E)细胞内细胞因子染色(ICS)测定。在存在BFA的情况下NSP13-134特异性CTL与用NSP13-134肽或无关HLA-A0301肽脉冲的Hs-578T以及Hs-578T-NSP13、Hs-578T-GFP以10:1E:T比共培养过夜。孵育后，使用流式细胞仪检测IFN-γ、TNF-α以及TCR通路下游激活标志物CD137和CD69的水平。

图13A-G.非结构蛋白NSP13来源的HLA-A2402肽NSP13-400的T细胞生成和功能验证。(A)来自HLA-A2402健康供体的PBMC与NSP13-400肽(VYIGDPAQL–SEQ ID NO:37)脉冲的自体DC共培养。两轮刺激后，诱导CD8+和NSP13-400四聚体阳性T细胞(左侧)。经过两周对CD8+和四聚体+T细胞进行分选和REP后，扩增高纯度NSP13-400特异性CTL(右侧)。(B)用不同浓度的NSP13-400肽脉冲的⁵¹Cr标记的HLA-A2402细胞系M14与NSP13-400特异性CTL以20:1E:T比共培养。用标准CRA检测NSP13-400特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(C，D)⁵¹Cr标记的NSP13或GFP强制表达HLA-A2402细胞系Hs-578T(Hs-578T-NSP13，Hs-578T-GFP)和M14(M14-NSP13，M14-GFP)与NSP13-400特异性CTL以不同E:T比(40:1至1.25:1)共培养。用标准CRA检测NSP13-400特异性CTL对不同靶标的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(E，F)冷靶抑制测定。⁵¹Cr标记的Hs-578T-NSP13和M14-NSP13细胞作为热靶。用NSP13-400肽或无关HLA-A2402肽脉冲的非放射性标记M14细胞作为冷靶。冷靶:热靶比为10:1或20:1。NSP13-400特异性CTL与单独的热靶或热靶与冷靶以20:1E:热T比共培养。用标准CRA检测NSP13-242特异性CTL的裂解能力。数据显示为一式三份的平均值。(G)细胞内细胞因子染色(ICS)测定。在存在BFA的情况下，NSP13-400特异性CTL与用NSP13-400肽或无关HLA-A2402肽脉冲的M14以及Hs-578T-NSP13、Hs-578T-GFP、M14-NSP13、M14-GFP以10:1E:T比共培养过夜。孵育后，使用流式细胞仪检测IFN-γ、TNF-α以及TCR通路下游激活标志物CD137和CD69的水平。

图14A-E.MGP-65肽特异性T细胞受体工程化T细胞(TCR-T)生成和功能验证。(A)将与FP2A肽连接的全长MGP-65TCRα链和β链插入至逆转录病毒载体pMSGV1中，并且然后使用重组逆转录病毒载体感染OKT3激活的HLA-A0201 allo-PBMC。感染约5天后，通过流式细胞仪分析CD8+和MGP-65-四聚体+T细胞群(中间)。然后，用REP对CD8+和MGP-65四聚体阳性细胞进行分选和扩增。扩增两周后，生成高纯度CTL(四聚体+群体超过90％)(右侧)。(B)MGP-65特异性TCR-T的肽滴定测定。用不同浓度的MGP-65肽脉冲的⁵¹Cr标记的T2细胞与MGP-65特异性TCR-T共培养。用标准CRA分析MGP-65特异性TCR-T的裂解水平。数据显示为一式三份的平均值。(C、D)MGP-65特异性TCR-T的抗原特异性细胞溶解分析。将⁵¹Cr标记的A375-MGP、A375-GFP、Mel624-MGP或Mel624-GFP与MGP-65特异性TCR-T以不同E:T比共培养。用标准CRA分析MGP-65特异性TCR-T对不同靶标的裂解水平。数据显示为一式三份的平均值。(E)细胞内细胞因子染色(ICS)测定。在存在BFA的情况下，MGP-65特异性TCR-T与用MGP-65肽或M26无关肽脉冲的T2以及A375-MGP、A375-GFP、Mel624-MGP、Mel624-GFP以10:1E:T比共培养过夜。孵育后，使用流式细胞仪检测IFN-γ、TNF-α以及TCR通路下游激活标志物CD137和CD69的水平。

图15.SARS-CoV-2MHC结合肽鉴定和特异性T生成工作流。SARS-CoV-2抗原发现平台的示意图。(1)建立具有高HLA等位基因频率的SARS-CoV-2结构蛋白膜糖蛋白(MGP)和非结构蛋白解旋酶(NSP13)基因强制表达细胞系。对于免疫肽组测量，裂解扩增的MGP或NSP13强制表达细胞，并用抗MHC抗体(W6/32)免疫沉淀MHC肽复合物并用酸洗脱。然后，通过LC-MS/MS分析洗脱的MHC结合肽。(2)采用内源性T细胞(ETC)生成工作流生成肽特异性CTL。(3)通过SARS-CoV-2靶标识别验证生成的SARS-CoV-2特异性CTL。(4)基于特定CTL验证开发SARS-CoV-2功能性T细胞受体(TCR)工程化T细胞(TCR-T)。

图16.用于预测的SARS-CoV-2HLA-A0201限制肽的T细胞生成和功能验证。选择3种预测的膜糖蛋白(MGP)HLA-A0201肽MGP-53(FLWLLWPVTL–SEQ ID NO:63)、MGP-56(LLWPVTLACFV–SEQ ID NO:67)、MGP-89(GLMWLSYFI–SEQ ID NO:43)和4种预测的刺突蛋白(SP)HLA-A0201肽SP-424(KLPDDFTGCV–SEQ ID NO:78)、SP-821(LLFNKVTLA–SEQ ID NO:79)、SP-983(RLDKVEAEV–SEQ ID NO:80)、SP-995(RLITGRLQSL–SEQ ID NO:81)用于使用内源性T细胞(ETC)生成工作流(左侧)生成抗原特异性T细胞。使用MGP、SP或GFP强制表达HLA-A0201细胞系(A375-MGP、A375-SP、A375-GFP、Mel624-MGP、Mel624-GFP、SK-MEL-5-SP、SK-MEL-5-GFP)作为靶标(右侧)，用标准⁵¹Cr释放测定(CRA)分析抗原特异性细胞溶解。

图17.用于NSP13的PRM筛选预测HLA-A0301肽。通过PRM方法选择并分析来自NSP13的十种预测的高潜力HLA-A0301结合肽。

图18.使用ETC工作流生成MGP-65特异性T细胞。用MGP-65肽(FVLAAVYRI–SEQ IDNO:22)脉冲源自HLA-A0201健康供体的成熟树突细胞(DC)，并在一块48孔板中与自体PBMC共培养。两轮刺激后，使用流式细胞仪检测各个孔中的CD8+和MGP-65四聚体+群体。

图19.使用ETC工作流生成NSP13-242特异性T细胞。用NSP13-242肽(TLVPQEHYV–SEQ ID NO:35)脉冲源自HLA-A0201健康供体的成熟树突细胞(DC)，并在一块48孔板中与自体PBMC共培养。两轮刺激后，使用流式细胞仪检测各个孔中的CD8+和NSP13-242四聚体+群体。

图20.使用ETC工作流生成NSP13-448特异性T细胞。用NSP13-448肽(IVDTVSALVY–SEQ ID NO:34)脉冲源自HLA-A0101健康供体的成熟树突细胞(DC)，并在一块48孔板中与自体PBMC共培养。两轮刺激后，使用流式细胞仪检测各个孔中的CD8+和NSP13-134四聚体+群体。

图21.使用ETC工作流生成NSP13-134特异性T细胞。用NSP13-134肽(KLFAAETLK–SEQ ID NO:36)脉冲源自HLA-A0301健康供体的成熟树突细胞(DC)，并在一块48孔板中与自体PBMC共培养。两轮刺激后，使用流式细胞仪检测各个孔中的CD8+和NSP13-134四聚体+群体。

图22.使用ETC工作流生成NSP13-400特异性T细胞。用NSP13-400肽(VYIGDPAQL–SEQ ID NO:37)脉冲源自HLA-A0201健康供体的成熟树突细胞(DC)，并在一块48孔板中与自体PBMC共培养。两轮刺激后，使用流式细胞仪检测各个孔中的CD8+和NSP13-400四聚体+群体。

图23.NSP13-134肽特异性TCR-T细胞生成。将全长TCRα链和β链插入至逆转录病毒载体pMSGV3中，并且然后使用重组逆转录病毒载体感染PBMC。感染后，通过流式细胞仪检测CD8+/四聚体+群体。经过四聚体指导分选和扩增后，生成高纯度TCR-T细胞。

图24A-C.NSP13-134肽特异性TCR-T细胞的靶标杀伤测定。(A)将使用不同浓度的NSP13-134肽脉冲的T2细胞作为靶标。使用Cr51释放测定(CRA)检测NSP13-134特异性TCR-T细胞的裂解能力。使用的效应子与靶标(E:T)比为20:1。(B，C)将具有强制表达GFP或SARS-Cov-2 NSP13肽的SK-MES-1(HLA-A0301+)、Hs-578T(HLA-A0301+)细胞系用作靶标，并与NSP13-134特异性TCR-T细胞共培养。使用的效应子与靶标(E:T)比为40:1至1.25:1。使用Cr51释放测定(CRA)检测NSP13-134 TCR-T细胞对不同靶标的裂解能力。NSP13-134 TCR-T细胞对阳性靶标的杀伤水平显著高于阴性对照。

图25.通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定对NSP13-134 TCR-T细胞进行功能验证。将NSP13-134特异性TCR-T细胞与SK-MES-1+对照A0301肽、SK-MES-1+NSP13-134、SK-MES-1-GFP、SK-MES-1-NSP13、Hs-578T-GFP和Hs-578T-NSP13共培养(E:T＝10:1)。共培养过夜后，通过ICS测定检测TCR通路下游激活标志物CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α。与阴性对照靶标相比，当与阳性靶标共培养时，NSP13-134特异性TCR-T的CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α水平显著增强。

图26.NSP13-242肽特异性TCR-T细胞生成。将全长TCRα链和β链插入至逆转录病毒载体pMSGV3中，并且然后使用重组逆转录病毒载体感染PBMC。感染后，通过流式细胞仪检测CD8+/四聚体+群体。经过四聚体指导分选和扩增后，生成高纯度TCR-T细胞。

图27A-C.NSP13-242肽特异性TCR-T细胞的靶标杀伤测定。(A)使用不同浓度的NSP13-242肽脉冲的T2细胞作为靶标。使用Cr51释放测定(CRA)检测NSP13-242特异性TCR-T细胞的裂解能力。使用的效应子与靶标(E:T)比为20:1。(B，C)将具有强制表达GFP或SARS-Cov-2 NSP13的A375(HLA-A0201+)、RPMI-7951(HLA-A0201+)细胞系用作靶标，并与NSP13-242特异性TCR-T细胞共培养。使用的效应子与靶标(E:T)比为40:1至1.25:1。使用Cr51释放测定(CRA)检测NSP13-242 TCR-T对不同靶标的裂解能力。NSP13-242 TCR-T对阳性靶标的杀伤水平显著高于对阴性对照。

图28.通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定对NSP13-242 TCR-T进行功能验证。NSP13-242特异性TCR-T细胞与T2+M26、T2+NSP13-242、A375-GFP、A375-NSP13、RPMI-7951-GFP和RPMI-7951-NSP13共培养(E:T＝10:1)。共培养过夜后，通过ICS测定检测TCR通路下游激活标志物CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α。与阴性对照靶标相比，当与阳性靶标共培养时，NSP13-242特异性TCR-T细胞的CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α的水平显著增强。

图29.NSP13-400抗原特异性TCR-T细胞生成。α链和β链TCR基因从NSP13-400特异性CTL细胞系中的一种中克隆出来。将全长TCRα链和β链插入至逆转录病毒载体pMSGV3中，并且然后使用重组逆转录病毒载体感染PBMC。感染后，观察到CD8+/四聚体+和CD4+/四聚体+群体。经过四聚体引导分选和扩增后，生成高纯度CD8+和CD4+TCR-T细胞。

图30A-F.通过杀伤测定验证MGP-65特异性TCR-T细胞的特异性。(A，D)将使用不同浓度的NSP13-400肽脉冲的M14细胞作为靶标。使用Cr51释放测定(CRA)检测NGP13-400 CD8+和CD4+特异性TCR-T细胞的裂解能力。效应子与靶标(E:T)比为20:1。(B，C，E，F)将具有强制表达GFP或SARS-Cov-2 NSP13的Hs-578T(HLA-A2402+)、M14(HLA-A2402+)细胞系用作靶标，并与NSP13-400特异性TCR-T细胞共培养。使用的效应子与靶标(E:T)比为40:1至1.25:1。使用Cr51释放测定(CRA)检测NSP13-400特异性TCR-T细胞对不同靶标的裂解能力。

图31.通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定对NSP13-400 TCR-T进行功能验证。将NSP13-400特异性CD8+和CD4+TCR-T与M14+对照肽、M14+NSP13-400、Hs-578T-GFP、Hs-578T-NSP13、M14-GFP和M14-NSP13共培养(E:T＝10:1)。共培养过夜后，通过ICS测定检测TCR通路下游激活标记CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α。与阴性对照靶标相比，当与阳性靶标共培养时，NSP13-400特异性CTL细胞系的CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α水平显著增强。

图32.NSP13-448肽特异性TCR-T细胞生成。将全长TCRα链和β链插入至逆转录病毒载体pMSGV3中，并且然后使用重组逆转录病毒载体感染PBMC。感染后，通过流式细胞仪检测CD8+/四聚体+群体。经过四聚体引导分选和扩增后，生成高纯度TCR-T细胞。

图33A-C.NSP13-448肽特异性TCR-T细胞的靶标杀伤测定。(A)将使用不同浓度的NSP13-448肽脉冲的A375细胞作为靶标。使用Cr51释放测定(CRA)检测NSP13-448特异性TCR-T的裂解能力。效应子与靶标(E:T)比为20:1。(B，C)将强制表达GFP或SARS-Cov-2NSP13的A375(HLA-A0101+)、RPMI-7951(HLA-A0101+)细胞系用作靶标，并与NSP13-448特异性TCR-T共培养。效应子与靶标(E:T)比为40:1至1.25:1。使用Cr51释放测定(CRA)检测NSP13-448 TCR-T对不同靶标的裂解能力。NSP13-448 TCR-T对阳性靶标的杀伤水平显著高于阴性对照。

图34.通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定对NSP13-448 TCR-T细胞进行功能验证。将NSP13-448特异性TCR-T与A375+对照A0101肽、A375+NSP13-448、A375-GFP、A375-NSP13、RPMI-7951-GFP和RPMI-7951-NSP13共培养(E:T＝10:1)。共培养过夜后，通过ICS测定检测TCR通路下游激活标记CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α。与阴性对照靶标相比，当其与阳性靶标共培养时，NSP13-448特异性TCR-T的CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α水平显著增强。

具体实施方式

SARS-CoV-2感染引起体液和细胞免疫应答。对于由SARS-CoV-2引起的疾病COVID19的预防和治疗，越来越明显的是，T细胞应答在介导恢复和免疫保护方面与体液应答同等重要，甚至更重要。开发针对感染和恶性疾病的基于T细胞的疗法的主要挑战之一是鉴定能够引发有意义的T细胞应答的免疫原性表位。传统上，这是通过使用复杂的计算机方法来预测从结合亲和力和共识数据推导出的推定表位来实现的。本发明人发现，以这种方式定义的“免疫显性”SARS-CoV-2肽可能无法引发识别天然存在的SARS-CoV-2表位的T细胞应答。他们推测，SARS-CoV-2的免疫原性表位最好通过直接分析从自然加工的肽-MHC复合物中洗脱的肽来凭经验定义，然后通过确定此类肽是否可以引发识别SARS-CoV-2抗原表达细胞的T细胞来验证免疫原性。使用串联质谱方法，本发明人鉴定了SARS-CoV-2的表位，该表位不仅源自SARS-CoV-2毒株(包括最近识别的变体)中高度保守的区域中的结构基因，还源自非结构基因。最后，尚无报道表明TCR序列在经工程化到重组载体中时可以重定向T细胞特异性以识别和杀死SARS-CoV-2靶细胞。本发明人在此首次报道了通过MHC洗脱肽的质谱分析定义的几种新SARS-CoV-2表位，为其免疫原性提供了经验证据，并证明工程化TCR重定向杀伤。

本文所述的肽可以用于检测患有SARS-Cov-2感染(COVID19)的患者的免疫应答或用于疫苗接种。这将有助于更好地了解COVID19免疫，并将直接影响COVID19患者的管理，并将实现评价疫苗的免疫应答。此外，这种肽细胞毒性T细胞和工程化TCR可以用于生成针对HLA匹配靶标的SARS-Cov-2特异性T细胞，从而为COVID19疾病患者提供现成的T细胞疗法。

I.使用本公开的肽的免疫疗法

本文所述的肽(例如，SEQ ID NO:22-81的肽)可以用于治疗病毒感染的免疫疗法。例如，SEQ ID NO:22-81中一项的肽可以与T细胞群接触或用于刺激T细胞群以诱导识别或结合所述肽的T细胞的增殖。在其他方面，本公开的肽可以给药于受试者，诸如人患者，以增强受试者针对SARS-Cov-2感染的免疫应答。

本公开的肽可以被包括在主动免疫疗法(例如，疫苗)或被动免疫疗法(例如，过继性免疫疗法)中。主动免疫疗法包括用纯化的肽抗原或免疫显性肽(天然的或修饰的)对受试者进行免疫；可选地，可以将用本公开的肽脉冲(或用编码包括该肽的抗原的基因转染)的抗原呈递细胞给药于受试者。肽可以经修饰或包含一种或多种突变，例如置换突变。被动免疫疗法包括过继免疫疗法。过继免疫疗法通常涉及向受试者给药细胞，其中所述细胞(例如，细胞毒性T细胞)已经在体外对本公开的肽致敏(参见，例如，US 7910109)。

在一些方面，流式细胞仪可以用于过继免疫疗法，通过使用以下方法快速分离人肿瘤抗原特异性T细胞克隆：例如，T细胞受体(TCR)Vβ抗体与基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)的增殖测定相结合。参见，例如，Lee et al.,J.Immunol.Methods,331:13-26,2008，其出于所有目的通过引用并入。在一些方面，可以使用四聚体指导的细胞分选，诸如，例如，Pollack,etal.,J Immunother Cancer.2014；2:36中描述的方法，其出于所有目的通过引用并入本文。对于过继性免疫疗法，各种培养方案也是已知的并且可以用于本公开的各方面中。在一些方面，细胞可以在不需要使用抗原呈递细胞的条件下培养(例如，Hida etal.,Cancer Immunol.Immunotherapy,51:219-228,2002，其通过引用并入)。在其他方面，T细胞可以在利用抗原呈递细胞诸如树突细胞的培养条件下扩增(Nestle et al.,1998，通过引用并入)，并且在一些方面人工抗原呈递细胞可以用于此目的(Maus et al.,2002，通过引用并入)。过继免疫疗法的其他方法公开于Dudley et al.(2003)，其通过引用并入，其可以与本公开的各方面一起使用。多种方法是已知的并且可以用于克隆和扩增人抗原特异性T细胞(参见，例如，Riddell et al.,1990，其通过引用并入本文)。

在某些方面，以下方案可以用于生成选择性识别本公开的肽的T细胞。可以使用先前报道的方法从正常供体或HLA限制的正常供体和患者产生肽特异性T细胞系(Hida etal.,2002)。ENREF32简言之，可以在96孔U形底微量培养板(Corning Incorporated，Lowell，MA)中以一式四份用约10μg/ml的每种肽在约200μl的培养基中刺激PBMC(1×10⁵个细胞/孔)。培养基可以由50％ AIM-V培养基(Invitrogen)、50％ RPMI1640培养基(Invitrogen)、10％人AB血清(Valley Biomedical,Winchester,VA)和100IU/ml的白介素2(IL-2)组成。约每3天可以用相应的肽重新刺激细胞。5次刺激后，可以洗涤来自每孔的T细胞，并在存在或不存在相应肽的情况下与T2细胞孵育。约18小时后，可以通过ELISA测定上清液中干扰素(IFN)-γ的产生。分泌大量IFN-γ的T细胞可以通过快速扩增方案进一步扩增(Riddell et al.,1990；Yee et al.,2002b)。

在一些方面，免疫疗法可以利用与细胞穿透剂诸如脂质体或细胞穿膜肽(CPP)缔合的本公开的肽。用肽脉冲的抗原呈递细胞(诸如树突细胞)可以用于增强抗肿瘤免疫(Celluzzi et al.,1996；Young et al.,1996)。以下进一步详细描述脂质体和CPP。在一些方面，免疫疗法可以利用编码本发明的肽的核酸，其中该核酸例如在病毒载体或非病毒载体中递送。

II.细胞穿膜肽

本公开的肽还可以与细胞穿膜肽(CPP)缔合或共价结合。可以与本公开的肽共价结合的细胞穿膜肽包括，例如，HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蝇触角足同源盒(DrosophilaAntennapedia homeobox)基因产物、信号序列、融合序列或protegrin I。肽与CPP共价结合可以延长由树突细胞对肽的呈递，从而增强抗肿瘤免疫力(Wang and Wang,2002)。在一些方面，本公开的肽(例如，包括在肽或多表位串内)可以共价结合(例如，经由肽键)至CPP以生成融合蛋白。在其他方面，根据本公开的肽或编码肽的核酸可以被封装在脂质体内或与脂质体诸如多层、囊泡或多囊泡脂质体缔合。

如本文所用，“缔合”意指物理缔合、化学缔合或两者。例如，缔合可以涉及共价键、疏水相互作用、封装、表面吸附等。

如本文所用，“细胞渗透剂”是指增强肽/多表位串向抗原呈递细胞的细胞内递送的组合物或化合物。例如，细胞穿透剂可以是脂质，当其与肽缔合时，增强其穿过质膜的能力。可选地，细胞穿透剂可以是肽。细胞穿膜肽(CPP)是本领域已知的，并且包括，例如，HIV的Tat蛋白(Frankel and Pabo,1988)、HSV的VP22蛋白(Elliott and O'Hare,1997)和成纤维细胞生长因子(Lin et al.,1995)。

已从果蝇触角足同源框基因(Antp)、HIV Tat和疱疹病毒VP22的第三螺旋中鉴定细胞穿膜肽(或“蛋白转导结构域”)，所有这些均包含富集精氨酸和赖氨酸残基的带正电荷的结构域(Schwarze et al.,2000；Schwarze et al.,1999)。此外，源自信号序列的疏水性肽已被鉴定为细胞穿膜肽。(Rojas et al.,1996；Rojas et al.,1998；Du et al.,1998)。将这些肽与标志物蛋白诸如β-半乳糖苷酶偶联已被证明可以使标志物蛋白有效内化至细胞中，并且在体外和体内包含这些肽的嵌合框内融合蛋白已被用于将蛋白质递送至多种细胞类型(Drin et al.,2002)。这些细胞穿膜肽与本公开的肽的融合可以增强多肽的细胞摄取。

在一些方面，通过将脂质诸如硬脂酸盐或肉豆蔻酸盐附接至多肽来促进细胞摄取。已证明脂化增强肽进入至细胞内。脂质部分的附接是本发明增加细胞对多肽摄取的另一种方式。

本公开的肽可以被包括在脂质体疫苗组合物中。例如，脂质体组合物可以是或包括蛋白脂质体组合物。用于产生可以用于本发明的脂蛋白体组合物的方法描述于例如Neelapu et al.(2007)和Popescu et al.(2007)。在一些方面，脂蛋白体组合物可以用于治疗黑色素瘤。

通过增强本公开的多肽的摄取，可以减少治疗所需的蛋白或肽的量。这反过来又可以显著降低治疗成本并增加治疗剂的供应。更低剂量还可以最大限度地减少肽的潜在免疫原性并限制毒副作用。

在一些方面，本公开的肽可以与纳米颗粒缔合以形成纳米颗粒-多肽复合物。在一些方面，纳米颗粒是脂质体或其他基于脂质的纳米颗粒，诸如基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。在其他方面，纳米颗粒是基于氧化铁的超顺磁性纳米颗粒。直径范围为约10至100nm的超顺磁性纳米颗粒足够小，以避免被脾脏隔离，但又足够大，以避免被肝脏清除。这种尺寸的颗粒可以穿透非常小的毛细血管，并可以有效地在身体组织中分布。超顺磁性纳米颗粒-多肽复合物可以用作MRI造影剂来识别和跟踪那些吸收所述肽的细胞。在一些方面，纳米颗粒是半导体纳米晶体或半导体量子点，两者均可以用于光学成像。在其他方面，纳米颗粒可以是纳米壳，其包括二氧化硅核上方的金层。纳米壳的一个优点是可以使用标准化学将多肽缀合至金层。在其他方面，纳米颗粒可以是富勒烯或纳米管(Gupta etal.,2005)。

肽通过肾脏从循环中快速去除并且对血清中的蛋白酶的降解敏感。通过将肽与纳米颗粒缔合，本发明的纳米颗粒-多肽复合物可以防止降解和/或减少被肾脏的清除。这可以增加多肽的血清半衰期，从而减少有效治疗所需的多肽剂量。此外，这可以降低治疗成本，并最大限度地减少免疫问题和治疗的毒性反应。

III.多表位串

在一些方面，肽被包括在或被包含在多表位串中。多表位串是包含来自连接在一起的一种或多种抗原的多个抗原表位的肽或多肽。多表位串可以用于诱导受试者诸如人受试者的免疫应答。多表位串先前已经用于靶向疟疾和其他病原体(Baraldo et al.,2005；Moorthy et al.,2004；Baird et al.,2004)。多表位串可以指核酸(例如，编码包括本公开的肽的多种抗原的核酸)或肽或多肽(例如，包含多种抗原，包括本公开的肽)。多表位串可以被包括在疫苗组合物中。

IV.抗原肽的应用

多个方面涉及可用于治疗和预防某些病毒感染的抗原肽的开发和用途。在许多方面，通过化学合成或通过宿主细胞中的分子表达产生抗原肽。肽可以被纯化并用于多种应用，包括(但不限于)确定肽免疫原性的测定、确定T细胞识别的测定、用于治疗病毒感染的肽疫苗、T细胞的修饰TCR的开发以及抗体开发。

肽可以通过多种方法化学合成。一种常见方法是使用固相肽合成(SPPS)。通常，通过重复交替的N-末端脱保护和偶联反应循环进行SPPS，从而构建从c-末端到n-末端的肽。第一个氨基酸的c-末端与树脂偶联，然后其中胺被弃用，并且然后与第二个氨基酸的游离酸偶联。重复该循环直至合成肽。

还可以利用分子工具和宿主细胞合成肽。可以合成与抗原肽相对应的核酸序列。在一些方面，合成核酸在体外合成器(例如，亚磷酰胺合成器)、细菌重组系统或其他合适的方法中合成。此外，合成的核酸可以被纯化和冻干，或保存在生物系统(例如细菌、酵母)中。为了在生物系统中使用，可以将合成的核酸分子插入质粒载体或类似载体中。质粒载体还可以是表达载体，其中合适的启动子和合适的3'-polyA尾与转录物序列组合。

各方面还涉及产生抗原肽或蛋白的表达载体和表达系统。这些表达系统可以掺入表达载体以在合适的表达系统中表达转录物和蛋白。典型的表达系统包括细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫(例如，SF9)、酵母(例如，酿酒酵母)、动物(例如，CHO)或人(例如，HEK 293)细胞系。可以使用标准生物技术产生程序从这些系统中纯化RNA和/或蛋白分子。

可以进行确定免疫原性和/或TCR结合的测定。其中一种是右旋聚体流式细胞仪测定。通常，定制的HLA匹配的MHC I类右旋聚体:肽(pMHC)复合物是开发或购买的(Immudex,Copenhagen,Denmark)。来自外周血单核细胞(PBMC)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的T细胞与pMHC复合物一起孵育并染色，然后通过流式细胞仪检测肽是否能够结合T细胞的TCR。

本公开的肽还可以用于分离和/或鉴定与肽结合的T细胞受体。T细胞受体包括通过二硫键连接的两条不同多肽链，称为T细胞受体α(TCRα)和β(TCRβ)链。这些α:β异二聚体在结构上与免疫球蛋白分子的Fab片段非常相似，并且它们负责大多数T细胞的抗原识别。少数T细胞携带可选的结构相似的受体，由一对不同多肽链(称为γ和δ)组成。两种类型的T细胞受体均不同于充当B细胞受体的膜结合免疫球蛋白：T细胞受体仅具有一个抗原结合位点，而B细胞受体具有两个，并且T细胞受体从不被分泌，而免疫球蛋白可以作为抗体被分泌。

T细胞受体的两条链均具有与免疫球蛋白V结构域同源的氨基末端可变(V)区、与免疫球蛋白C结构域同源的恒定(C)区和包含形成链间二硫键的半胱氨酸残基。每条链通过疏水性跨膜结构域跨越脂质双层，并以短细胞质尾结束。

已确定T细胞受体的三维结构。正如对编码其的基因的早期研究所怀疑的那样，该结构确实与抗体Fab片段的结构相似。T细胞受体链的折叠方式与Fab片段的折叠方式非常相似，尽管最终的结构似乎更短和更宽。然而，T细胞受体和Fab片段之间存在一些明显的差异。最显著的差异在于Cα结构域，其中折叠不同于任何其他免疫球蛋白样结构域。与Cβ结构域并置的结构域的一半形成类似于其他免疫球蛋白样结构域中发现的β片层，但该结构域的另一半由松散堆积的链和α螺旋的短区段形成。分子内二硫键在免疫球蛋白样结构域中通常连接两个β链，在Cα结构域中将β链连接至α螺旋的该区段。

结构域相互作用的方式也存在差异。两条T细胞受体链的V和C结构域之间的界面比抗体中的更广泛，这可能使结构域之间的铰链接头灵活性较低。Cα和Cβ结构域之间的相互作用的独特之处在于碳水化合物的帮助，来自Cα结构域的糖基基团与Cβ结构域形成许多氢键。最后，可变结合位点的比较表明，虽然互补决定区(CDR)环与抗体分子的环比对相当接近，但相对于抗体分子的环存在一些置换。这种位移在VαCDR2环中尤其明显，该环与抗体V结构域中的等效环大致成直角，这是由于从结构域的一个面锚定环一端的β链发生移位到另一个。链置换还导致结构已知的七个Vβ结构域中的两个中的VβCDR2环的方向发生变化。迄今为止，七种T细胞受体的晶体结构已达到这种分辨率水平。

本公开的方面涉及结合本公开的肽诸如SEQ ID NO:22-81中一项的肽的工程化T细胞受体。术语“工程化”是指T细胞受体具有接枝到TCR恒定区上的TCR可变区以产生与本公开的肽和抗原结合的嵌合多肽。在某些方面，TCR包括用于克隆、增强表达、检测或用于构建体的治疗控制但不存在于内源TCR中的间插序列，诸如多克隆位点、接头、铰链序列、修饰的铰链序列、修饰的跨膜序列、检测多肽或分子、或可以实现选择或筛选包括TCR的细胞的治疗对照。

在一些方面，TCR包括非TCR序列。因此，某些方面涉及具有并非来自TCR基因的序列的TCR。在一些方面，TCR是嵌合的，因为它包含通常在TCR基因中发现的序列，但包含来自至少两个在自然界中不一定一起发现的TCR基因的序列。

V.抗体

本公开的方面涉及靶向本公开的肽或其片段的抗体。术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，或其可以与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的片段，并且包括嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体和双特异性抗体。如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，并且是指作为动物免疫应答的一部分起作用的几类结构相关的蛋白中的任一种，包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白，以及包括保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。

术语“抗原”是指能够被选择性结合剂诸如抗体结合的分子或分子的一部分。抗原可以拥有能够与不同抗体相互作用的一个或多个表位。

术语“表位”包括能够通过与免疫球蛋白或T细胞受体结合而引发免疫应答的分子的任何区域或部分。表位决定簇可以包括化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原具有特异性的抗体将优先识别在复合物混合物内的靶抗原上的表位。

给定多肽的表位区可以使用本领域熟知的许多不同表位定位技术进行鉴定，包括：x-射线晶体学、核磁共振波谱学、定点诱变定位、蛋白质展示阵列，参见，例如，EpitopeMapping Protocols,(Johan Rockberg and Johan Nilvebrant,Ed.,2018)Humana Press,New York,N.Y.。此类技术是本领域已知的并且描述于，例如，美国专利号4,708,871；Geysen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1984)；Geysen etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:178-182(1985)；Geysen et al.Molec.Immunol.23:709-715(1986)中。此外，还可以使用标准抗原性和亲水图来预测和鉴定蛋白的抗原区。

术语“免疫原性序列”意指包括至少一个表位的氨基酸序列的分子，使得该分子能够刺激适当宿主中抗体的产生。术语“免疫原性组合物”意指包括至少一种免疫原性分子(例如抗原或碳水化合物)的组合物。

完整抗体通常由两条全长重链和两条全长轻链组成，但在一些情况下可以包括更少的链，诸如天然存在于骆驼科动物中的抗体可以仅包括重链。本文公开的抗体可以仅源自单一来源或可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可以源自两种不同抗体。例如，可变区或CDR区可以源自大鼠或鼠源，而恒定区源自不同动物源，诸如人。抗体或结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割在杂交瘤中产生。除非另有说明，否则术语“抗体”包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其实例如下所述(Sela-Culang et al.,Front Immunol.2013；4:302；2013)。

术语“轻链”包括全长轻链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链具有约25,000道尔顿的分子量并且包括可变区结构域(本文缩写为VL)和恒定区结构域(本文缩写为CL)。轻链有两种分类，鉴定为kappa(κ)和lambda(λ)。术语“VL片段”意指单克隆抗体的轻链片段，其包括全部或部分轻链可变区，包括CDR。VL片段可以进一步包括轻链恒定区序列。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。

术语“重链”包括全长重链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链具有约50,000道尔顿的分子量并且包括可变区结构域(本文缩写为VH)和三个恒定区结构域(本文缩写为CH1、CH2和CH3)。术语“VH片段”意指单克隆抗体的重链片段，其包括全部或部分重链可变区，包括CDR。VH片段可以进一步包括重链恒定区序列。重链恒定区结构域的数量将取决于同种型。VH结构域位于多肽的氨基末端，并且CH结构域位于羧基末端，其中CH3最接近-COOH末端。抗体的同种型可以是IgM、IgD、IgG、IgA或IgE，并且由重链定义，其中分别有五种分类：mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)或epsilon(ε)链。IgG有多种亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM1和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。

VI.抗体缀合物

本公开的方面涉及抗本公开的肽的抗体，通常为单克隆类型，其与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，通常连接或共价结合或络合至少一种期望的分子或部分。这种分子或部分可以是但不限于至少一种效应子或报告分子。效应分子包括具有期望活性(例如细胞毒性活性)的分子。已附接至抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗酶、放射性标记的核苷酸、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报告分子被定义为可以使用测定检测的任何部分。已缀合至抗体的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体，诸如生物素。

任何具有足够选择性、特异性或亲和力的抗体均可以用作抗体缀合物的基础。可以使用本领域技术人员已知的常规免疫学筛选方法来评价此类性质。除了典型的抗原结合位点外，抗体分子中与生物活性分子结合的位点还包括位于可变结构域中的位点，这些位点可以结合病原体、B细胞超抗原、T细胞共受体CD4和HIV-1包膜(Sasso et al.,1989；Shorki et al.,1991；Silvermann et al.,1995；Cleary et al.,1994；Lenert et al.,1990；Berberian et al.,1993；Kreier et al.,1991)。此外，可变结构域参与抗体自结合(Kang et al.,1988)，并包含被抗抗体识别的表位(独特位)(Kohler et al.,1989)。

抗体缀合物的某些实例是其中抗体与可检测标记连接的那些缀合物。“可检测标记”是由于其特异性功能特性和/或化学特性而可以被检测的化合物和/或元素，它们的使用实现了检测它们所附接的抗体，和/或在需要时进一步定量。另一个这种实例是包括与细胞毒性剂或抗细胞剂连接的抗体的缀合物的形成，并且可以被称为“免疫毒素”。

抗体缀合物通常优选用作诊断剂。抗体诊断通常分为两类，用于体外诊断的那些，诸如用于各种免疫测定的那些，和/或用于体内诊断方案的那些，通常称为“抗体引导成像”。

许多合适的成像剂以及它们附接至抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号5,021,236；4,938,948；和4,472,509，各自通过引用并入本文)。使用的成像部分可以是顺磁性离子；放射性同位素；荧光染料；核磁共振可检测物质；X-射线成像。

在顺磁性离子的情况下，可以提及例如诸如离子，例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，特别优选钆。可用于其他情况诸如X-射线成像的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，并且尤其是铋(III)。

在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可以提及砹²¹¹、¹⁴碳、⁵¹铬、³⁶氯、⁵⁷钴、⁵⁸钴、铜⁶⁷、¹⁵²铕(Eu)、镓⁶⁷、³氢、碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、⁵⁹铁、³²磷、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、⁷⁵硒、³⁵硫、锝(technicium)^99m和/或钇⁹⁰。¹²⁵I通常优选用于某些方面，并且锝^99m和/或铟¹¹¹也通常由于其低能量和适合长距离检测而优选。本发明的放射性标记的单克隆抗体可以根据本领域熟知的方法产生。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾以及化学氧化剂诸如次氯酸钠或酶促氧化剂诸如乳过氧化物酶接触而被碘化。根据本发明的单克隆抗体可以通过配体交换方法用锝^99m标记，例如通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上并将抗体施加到该柱上。可选地，可以使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂诸如SNCl₂、缓冲溶液诸如邻苯二甲酸钠-钾溶液和抗体。经常用于将作为金属离子存在的放射性同位素与抗体结合的中间官能团是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

预期用作缀合物的荧光标记包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5,6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红。

本发明中设想的另一种类型的抗体缀合物是主要预期用于体外的那些，其中抗体连接至第二结合配体和/或酶(酶标签)，该酶在与发色底物接触时将生成有色产物。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和/或抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白化合物。此类标记的使用是本领域技术人员熟知的并且描述于，例如，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241；各自通过引用并入本文。

将分子位点特异性附接至抗体的又一已知方法包括抗体与基于半抗原的亲和标记物的反应。本质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸发生反应，从而破坏该位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能不是有利的，因为它导致抗体缀合物失去抗原结合。

包含叠氮基团的分子也可用于通过低强度紫外光生成的反应性氮宾中间体与蛋白形成共价键(Potter&Haley,1983)。特别地，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物已被用作定点光探针来鉴定粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens&Haley,1987；Atherton etal.,1985)。2-和8-叠氮基核苷酸也已用于绘制纯化的蛋白的核苷酸结合结构域图谱(Khatoon et al.,1989；King etal.,1989；and Dholakia et al.,1989)，并且可用作抗体结合剂。

本领域已知几种用于将抗体附接或缀合至其缀合物部分的方法。一些附接方法涉及使用金属螯合络合物，例如采用有机螯合剂，例如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或附接至抗体的四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利号4,472,509和4,938,948，各自通过引用并入本文)。单克隆抗体还可以在偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐的存在下与酶反应。与荧光素标志物的缀合物在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应进行制备。在美国专利号4,938,948中，乳腺肿瘤的成像使用单克隆抗体实现，并且可检测的成像部分使用接头诸如对羟基苯甲亚胺甲酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯)与抗体结合。

在其他方面，设想了通过使用不改变抗体结合位点的反应条件在免疫球蛋白的Fc区中选择性引入巯基来衍生化免疫球蛋白。公开了根据该方法产生的抗体缀合物表现出改善的寿命、特异性和灵敏度(美国专利号5,196,066，其通过引用并入本文)。文献(O'Shannessy et al.,1987)中也已公开效应子或报告分子的位点特异性附接，其中报告分子或效应分子与Fc区中的碳水化合物残基缀合。已报告这种方法可以产生具有诊断和治疗前景的抗体，目前正处于临床评价中。

在本公开的另一方面，抗体可以与半导体纳米晶体连接，诸如以下公开的那些：美国专利号6,048,616；5,990,479；5,690,807；5,505,928；5,262,357(全部专利以其全文并入本文)；以及PCT公开号99/26299(1999年5月27日公开)。具体地，在本发明的生物和化学测定中用作半导体纳米晶体的示例性材料包括但不限于上述那些，包括II-VI族、III-V族和IV族半导体，诸如ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs、InSb、AlS、AlP、AlSb、PbS、PbSe、Ge和Si及其三元和四元混合物。将半导体纳米晶体与抗体连接的方法描述于美国专利号6,630,307和6,274,323中。

在还一些方面，本发明涉及用于结合、纯化、去除、定量和/或通以其他方式常检测生物组分诸如T细胞或选择性结合或识别本公开的肽的免疫检测方法。在一些方面，四聚体测定可以与本发明一起使用。四聚体测定通常涉及产生可以结合抗原特异性T淋巴细胞的可溶性肽-MHC四聚体，并且用于四聚体测定的方法描述于，例如，Altman et al.(1996)。可以使用的一些免疫检测方法包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、四聚体测定和蛋白质印迹。各种有用的免疫检测方法的步骤已在科学文献中描述，例如，Doolittle and Ben-Zeev,1999；Gulbis and Galand,1993；De Jager et al.,1993；和Nakamura et al.,1987，各自通过引用并入本文。

VII.MHC多肽

本公开的方面涉及包括MHC多肽的组合物。在一些方面，MHC多肽包括可以表达为单独多肽或融合蛋白的至少2、3或4种MHC多肽。向T细胞呈递抗原由两种不同类别的分子MHC I类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)(本文也称为“pMHC”)介导，它们利用不同抗原加工途径。源自细胞内抗原的肽由几乎在所有细胞上表达的MHC I类分子呈递至CD8+T细胞，而源自细胞外抗原的肽则由MHC-II分子呈递至CD4+T细胞。在某些方面，在适当的MHC I类或II类多肽的背景下，鉴定并在抗原-MHC复合物中呈递特定抗原。在某些方面，可以评估受试者的基因构成以确定哪种MHC多肽将用于特定患者和特定肽组。在某些方面，MHC 1类多肽包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G或CD-1分子的全部或部分。在其中MHC多肽是MHC II类多肽的方面，MHC II类多肽可以包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。

还设想了将非经典MHC多肽用于本发明的MHC复合物中。非经典MHC多肽是非多态性的，具有物种间保守性，并且具有窄的、深的、疏水性配体结合口袋。这些结合口袋能够将糖脂和磷脂呈递至自然杀伤T(NKT)细胞或某些CD8+T细胞亚群诸如Qa1、HLA-E限制性CD8+T细胞或MAIT细胞。NKT细胞代表共表达NK细胞标志物和半恒定T细胞受体(TCR)的独特淋巴细胞群。它们参与与多种疾病相关的免疫应答的调节。

VIII.另外的试剂

在一些方面，该方法进一步包括给药另外的试剂。在一些方面，另外的试剂是免疫刺激剂。如本文所用，术语“免疫刺激剂”是指可以刺激受试者的免疫应答的化合物，并且可以包括佐剂。在一些方面，免疫刺激剂是不构成特定抗原但可以增强对抗原的免疫应答的强度和寿命的试剂。此类免疫刺激剂可以包括但不限于模式识别受体的刺激剂，诸如Toll样受体，RIG-1和NOD样受体(NLR)，矿物盐诸如明矾(alum)，明矾与肠道菌(诸如大肠杆菌(Escherihia coli)、明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或福氏志贺氏菌(Shigella flexneri))的单磷酰脂质(MPL)特别是MPL.RTM.(ASO4)组合，上述细菌各自的MPL A(ASO4)，皂苷，诸如QS-21、Quil-A、ISCOMs、ISCOMATRIX，乳剂，诸如MF59、Montanide、ISA 51和ISA 720、AS02(QS21+角鲨烯+MPL.)，脂质体和脂质体制剂诸如AS01，合成或专门制备的微粒和微载体，诸如淋病奈瑟菌(N.gonorrheae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)等细菌来源的外膜囊泡(OMV)，或壳聚糖颗粒，贮库形成剂诸例如Pluronic嵌段共聚物，特别修饰或制备的肽诸如胞壁酰二肽，氨烷基氨基葡萄糖4-磷酸酯诸如RC529，或蛋白诸如细菌类毒素或毒素片段。

在一些方面，另外的试剂包括模式识别受体(PRR)的激动剂，包括但不限于Toll样受体(TLR)，具体地TLR 2、3、4、5、7、8、9和/或其组合。在一些方面，另外的试剂包括Toll样受体3的激动剂、Toll样受体7和8的激动剂、或Toll样受体9的激动剂；优选地，所述免疫刺激剂包括咪唑并喹啉(imidazoquinoline)；诸如R848；腺嘌呤衍生物，诸如美国专利号6,329,381、美国专利申请公开号2010/0075995或WO 2010/018132中公开的那些；免疫刺激DNA；或免疫刺激性RNA。在一些方面，另外的试剂还可以包括免疫刺激性RNA分子，诸如但不限于dsRNA、poly I:C或poly I:poly C12U(可以Ampligen.RTM.获得，poly I:C和poly I:polyC12U两者被称为TLR3刺激剂)，和/或F.Heil et al.,"Species-SpecificRecognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7and 8"Science 303(5663),1526-1529(2004)；J.Vollmer et al.,"Immune modulation by chemicallymodified ribonucleosides and oligoribonucleotides"WO 2008033432 A2；A.Forsbachet al.,"Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequencemotif(s)and targeting the Toll-like receptor 8pathway"WO 2007062107A2；E.Uhlmann et al.,"Modified oligoribonucleotide analogs with enhancedimmunostimulatory activity"美国专利申请公开号US2006241076；G.Lipford et al.,"Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer andinfections"WO 2005097993 A2；G.Lipford et al.,"Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides,compositions,and screening methods"WO2003086280 A2中公开的那些。在一些方面，另外的试剂可以是TLR-4激动剂，诸如细菌脂多糖(LPS)、VSV-G和/或HMGB-1。在一些方面，另外的试剂可以包括TLR-5激动剂，诸如鞭毛蛋白，或其部分或衍生物，包括但不限于美国专利号6,130,082、6,585,980和7,192,725中公开的那些。

在一些方面，另外的试剂可以是从坏死细胞(例如，尿酸盐晶体)释放的促炎刺激物。在一些方面，另外的试剂可以是补体级联的激活组分(例如，CD21、CD35等)。在一些方面，另外的试剂可以是免疫复合物的激活组分。另外的试剂还包括补体受体激动剂，诸如与CD21或CD35结合的分子。在一些方面，补体受体激动剂诱导合成纳米载体的内源补体调理作用。在一些方面，免疫刺激剂是细胞因子，其是由细胞释放的小蛋白或生物因子(在5kD-20kD的范围内)并且对细胞与细胞的相互作用、通讯和其他细胞行为具有特定影响。在一些方面，细胞因子受体激动剂是小分子、抗体、融合蛋白或适体。

IX.工程化T细胞受体

T细胞受体包括通过二硫键连接的两条不同多肽链，称为T细胞受体α(TCRα)和β(TCRβ)链。这些α:β异二聚体在结构上与免疫球蛋白分子的Fab片段非常相似，并且它们负责大多数T细胞的抗原识别。少数T细胞携带可选的结构相似的受体，由一对不同多肽链(称为γ和δ)组成。两种类型的T细胞受体均不同于充当B细胞受体的膜结合免疫球蛋白：T细胞受体仅具有一个抗原结合位点，而B细胞受体具有两个，并且T细胞受体从不被分泌，而免疫球蛋白可以作为抗体被分泌。

本公开的方面涉及工程化T细胞受体。术语“工程化”是指T细胞受体具有接枝到TCR恒定区上的TCR可变区以产生与本公开的肽和抗原结合的嵌合多肽。在某些方面，TCR包括用于克隆、增强表达、检测或用于构建体的治疗控制但不存在于内源TCR中的间插序列，诸如多克隆位点、接头、铰链序列、修饰的铰链序列、修饰的跨膜序列、检测多肽或分子、或可以实现选择或筛选包括TCR的细胞的治疗对照。

在一些方面，本公开的工程化TCR包括如下所示的方面

表1：TCR方面

X.蛋白组合物

如本文所用，“蛋白”、“肽”或“多肽”是指包括至少五个氨基酸残基的分子。如本文所用，术语“野生型”是指生物体中天然存在的分子的内源形式。在一些方面，采用蛋白或多肽的野生型形式，然而，在本公开的许多方面，采用修饰的蛋白或多肽来生成免疫应答。上述术语可以互换使用。“修饰的蛋白”或“修饰的多肽”或“变体”是指其化学结构、特别是其氨基酸序列相对于野生型蛋白或多肽被改变的蛋白或多肽。在一些方面，修饰/变体蛋白或多肽具有至少一种修饰的活性或功能(认识到蛋白或多肽可以具有多种活性或功能)。特别设想了修饰/变体蛋白或多肽的一种活性或功能可以改变，但在其他方面诸如免疫原性保留野生型活性或功能。

当本文具体提及蛋白时，其通常指天然(野生型)或重组(修饰)蛋白，或任选地，其中已去除任何信号序列的蛋白。该蛋白可以直接从其天然生物体中分离，通过重组DNA/外源表达方法产生，或通过固相肽合成(SPPS)或其他体外方法产生。在具体方面，存在分离的核酸片段和掺入编码多肽(例如抗体或其片段)的核酸序列的重组载体。术语“重组”可以与多肽或特定多肽的名称结合使用，并且这通常是指由已在体外操作的核酸分子产生的多肽或是此类分子的复制产物。

在某些方面，蛋白或多肽(野生型或修饰的)的大小可以包括但不限于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000个氨基酸残基或核酸残基或更大，以及其中可衍生的任何范围，或本文描述或引用的相应氨基酸序列的衍生物。设想了多肽可以通过截短进行突变，使它们比其相应的野生型形式短，而且，它们可以通过融合或缀合具有特定功能的异源蛋白质或多肽序列而被改变(例如，用于靶向或定位、用于增强免疫原性、纯化目的等)。

本公开的多肽、蛋白或编码此类多肽或蛋白的多核苷酸可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个(或其中任何可推导的范围)或更多个变体氨基酸或核酸置换，或与SEQ ID NO:1-141的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000个或更多个连续氨基酸或核酸(或其中任何可推导的范围)具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可推导的范围)相似性、同一性或同源性。在具体方面，肽或多肽是或基于人序列。在某些方面，肽或多肽不是天然存在的和/或是肽或多肽的组合。

在一些方面，蛋白、多肽或核酸可以包括SEQ ID NO:1-141的1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319或320个氨基酸或核苷酸(或其中任何可推导的范围)。

在一些方面，SEQ ID NO:1-141中一项的肽或多肽的氨基酸第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399或400位被丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸置换。

在一些方面，蛋白、多肽或核酸可以包括SEQ ID NO:1-141的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319或320个(或其中任何可推导的范围)连续氨基酸或核酸。

在一些方面，多肽、蛋白或核酸可以包括SEQ ID NO:1-141的至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319或320个(或其中任何可推导的范围)连续氨基酸，其与SEQID NO:1-141中一项具有至少、至多或恰好60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中任何可推导的范围)相似性、同一性或同源性。

在一些方面，存在起始于SEQ ID NO:1-141中任一项的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949或950位的核酸分子或多肽，或包括SEQ ID NO:1-141中任一项的至少、至多或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949或950个(或其中任何可推导的范围)连续氨基酸或核苷酸。

先前已公开各种基因的核苷酸以及蛋白、多肽和肽序列，并且可以在公认的计算机化数据库中找到。两个常用的数据库是国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的Genbank和GenPept数据库(万维网上ncbi.nlm.nih.gov/)和通用蛋白资源(The Universal Protein Resource)(UniProt；万维网上uniprot.org)。这些基因的编码区可以使用本文公开的技术或如本领域普通技术人员已知的技术进行扩增和/或表达。

设想了在本公开的组合物中，每ml存在约0.001mg至约10mg的总多肽、肽和/或蛋白。组合物中蛋白的浓度可以是约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更高(或其中可推导的任何范围)。

以下是改变蛋白的氨基酸亚基以产生等效的、甚至改进的第二代变体多肽或肽的讨论。例如，某些氨基酸可以被置换位蛋白或多肽序列中的其他氨基酸，而与结构诸如例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点的相互作用结合能力有或没有明显损失。由于蛋白的相互作用能力和性质决定了该蛋白的功能活性，因此可以在蛋白序列及其相应的DNA编码序列中进行某些氨基酸置换，但仍产生具有相似或期望特性的蛋白。因此，本发明人设想可以对编码蛋白的基因的DNA序列进行各种改变，而不明显损失其生物效用或活性。

术语“功能等同密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，诸如精氨酸的六种不同密码子。还设想了“中性置换”或“中性突变”，其指编码生物等效氨基酸的一个或多个密码子的改变。

本公开的氨基酸序列变体可以是置换变体、插入变体或缺失变体。与野生型相比，本公开的多肽中的变异可以影响蛋白或多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个非连续或连续氨基酸(或其中可衍生的任何范围)。变体可以包括与本文提供或引用的任何序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％(包括其间的所有值和范围)同一性的氨基酸序列。变体可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个置换氨基酸。

还应当理解，氨基酸和核酸序列可以分别包括另外的残基，诸如另外的N-末端或C-末端氨基酸，或5’或3’序列，并且仍然基本上相同，如在本文中公开的序列中之一所述，只要该序列满足上述标准，包括在涉及蛋白表达的情况下维持生物蛋白活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，其可以例如包括位于编码区的5’或3’部分侧翼的各种非编码序列。

缺失变体通常缺乏天然或野生型蛋白的一个或多个残基。可以缺失单个残基或可以缺失多个连续的氨基酸。可以将终止密码子引入(通过酯化或插入)至编码核酸序列中以生成截短蛋白。

插入突变体通常涉及在多肽的非末端点处添加氨基酸残基。这可以包括插入一个或多个氨基酸残基。还可以生成末端添加并且可以包括融合蛋白，该融合蛋白是本文描述或引用的一种或多种肽或多肽的多聚体或多联体。

置换变体通常在蛋白或多肽内的一个或多个位点处包含一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以设计成调节多肽的一种或多种性质，同时具有或不具有其他功能或性质的丧失。置换可以是保守的，即，一种氨基酸被一种相似化学性质的氨基酸替换。“保守氨基酸置换”可以涉及一种氨基酸类别的成员与同一种类别的另一个成员的交换。保守置换是本领域熟知的并且包括例如以下改变：丙氨酸转为丝氨酸；精氨酸转为赖氨酸；天冬酰胺转为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸转为谷氨酸；半胱氨酸转为丝氨酸；谷氨酰胺转为天冬酰胺；谷氨酸转为天冬氨酸；甘氨酸转为脯氨酸；组氨酸转为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸转为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸转为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸转为精氨酸；甲硫氨酸转为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸转为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸转为苏氨酸；苏氨酸转为丝氨酸；色氨酸转为酪氨酸；酪氨酸转为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸转为异亮氨酸或亮氨酸。保守氨基酸置换可以涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成来掺入。这些包括肽模拟物或氨基酸部分的其他反转或反向形式。

可选地，置换可以是“非保守的”，使得多肽的功能或活性受影响。非保守变化通常涉及用化学上不相似的氨基酸残基置换氨基酸残基，诸如用极性或带电氨基酸置换非极性或不带电氨基酸，反之亦然。非保守置换可以涉及一种氨基酸类别的成员与另一种类别的成员交换。

本领域技术人员可以使用熟知的技术确定本文所述的多肽的合适变体。本领域技术人员可以通过靶向被认为对活性不重要的区域来鉴定可以改变而不破坏活性的分子的合适区域。技术人员还能够鉴定相似蛋白或多肽之间保守的氨基酸残基和分子部分。在其他方面，对生物活性或结构可能重要的区域可以进行保守氨基酸置换，而不显著改变生物活性或没有不利地影响蛋白或多肽结构。

在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。蛋白的亲水特性通过为每个氨基酸指定数值(“亲水指数”)，以及然后沿肽链重复对这些值求平均值来计算。每个氨基酸均根据其疏水性和电荷特性分配值。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物功能方面的重要性是本领域普遍理解的(Kyte et al.,J.Mol.Biol.157:105-131(1982))。人们普遍认为，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白或多肽的二级结构，这反过来又限定了蛋白或多肽与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。还已知某些氨基酸可以被置换为具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸，并且仍然保留相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在某些方面，包括亲水指数在±2以内的氨基酸置换。在本发明的一些方面，包括±1内的那些，并且在本发明的其他方面，包括±0.5内的那些。

本领域还应当理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸置换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)指出，蛋白的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性控制)与蛋白的生物学特性相关。在某些方面，蛋白的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性控制)与其免疫原性和抗原结合相关，即，作为蛋白的生物学特性。这些氨基酸残基已指定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行改变时，在某些方面，包括亲水性值在±2以内的氨基酸置换，在其他方面，包括±1以内的那些，并且在还一些方面，包括±0.5以内的那些。在一些情况下，还可以基于亲水性从一级氨基酸序列中鉴定表位。这些区域也称为“表位核心区域”。应当理解，氨基酸可以被置换成具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然产生生物学等同的和免疫学等同的蛋白。

另外，本领域技术人员可以回顾鉴定类似多肽或蛋白中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于此类比较，人们可以预测蛋白中与对类似蛋白的活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择化学上相似的氨基酸置换此类预测的重要氨基酸残基。

本领域技术人员还可以分析类似蛋白或多肽中的三维结构和与该结构相关的氨基酸序列。鉴于这些信息，本领域技术人员可以预测抗体的氨基酸残基相对于其三维结构的排列。本领域技术人员可以选择对预测在蛋白表面上的氨基酸残基不进行改变，因为此类残基可能涉及与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以生成在每个期望的氨基酸残基处包含单个氨基酸置换的测试变体。然后，可以使用针对结合和/或活性的标准测定来筛选这些变体，从而产生从此类常规实验收集的信息，这可以使本领域技术人员单独或与其他突变组合来确定应避免进一步置换的氨基酸位置。可用于确定二级结构的各种工具可见于万维网expasy.org/proteomics/protein structure。

在本发明的一些方面，进行氨基酸置换：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或(5)赋予或修饰此类多肽的其他物理化学或功能特性。例如，可以在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸置换(在某些方面，保守氨基酸置换)。可以在位于形成分子间接触的一种或多种结构域之外的抗体部分中进行置换。在此类方面，可以使用基本上不改变蛋白或多肽的结构特征的保守氨基酸置换(例如，不破坏表征天然抗体的二级结构的一个或多个替换氨基酸)。

XI.核酸

在某些方面，核酸序列可以存在于多种情况下，诸如：编码抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的一条或两条链的掺入序列或重组多核苷酸的分离区段和重组载体，足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物的多核苷酸以鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸，用于抑制多核苷酸表达的反义核酸，以及本文前述的互补序列。还提供了编码本文提供的某些抗体的表位的核酸。还提供了编码包括这些肽的融合蛋白的核酸。核酸可以是单链或双链的，并且可以包括RNA和/或DNA核苷酸及其人工变体(例如，肽核酸)。

术语“多核苷酸”是指重组的或已从总基因组核酸中分离的核酸分子。术语“多核苷酸”包括寡核苷酸(长度为100个残基或更少的核酸)、重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。在某些方面，多核苷酸包括基本上与其天然存在的基因或编码蛋白的序列分离的调节序列。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并且可以是RNA、DNA(基因组、cDNA或合成的)、其类似物或其组合。另外的编码或非编码序列可以但不一定存在于多核苷酸内。

在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指编码蛋白、多肽或肽的核酸(包括正确转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。如本领域技术人员将理解的，该术语涵盖基因组序列、表达盒、cDNA序列和表达或可能适于表达蛋白、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的较小工程化核酸区段。编码全部或部分多肽的核酸可以包含编码全部或部分此类多肽的连续核酸序列。还设想了特定的多肽可以由包含具有稍微不同核酸序列的变体的核酸编码，但尽管如此，其编码相同或基本相似的蛋白。

在某些方面，存在与本文公开的序列具有基本上同一性的多核苷酸变体；与使用本文所述的方法(例如，使用标准参数的BLAST分析)提供的多核苷酸序列相比，包括至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的那些，包括它们之间的所有值和范围。在某些方面，分离的多核苷酸将包括编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有在序列的整个长度上与本文所述的氨基酸序列至少90％、优选95％及更高的同一性；或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。

核酸片段，无论编码序列本身的长度如何，可以与其他核酸序列组合，诸如启动子、聚腺苷酸化信号、另外的限制性酶位点、多克隆位点、其他编码片段等，因此它们的总长度可能有很大差异。核酸可以是任何长度。它们的长度可以为，例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000个或更多个核苷酸，和/或可以包括一个或多个另外的序列，例如调节序列，和/或是较大核酸(例如载体)的一部分。因此，设想可以采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地受制备的容易性和在预期的重组核酸方案中使用的限制。在一些情况下，核酸序列可以编码具有另外的异源编码序列的多肽序列，例如以允许多肽的纯化、运输、分泌、翻译后修饰，或用于治疗获益，诸如靶向或功效。如上所述，可以将标签或其他异源多肽添加至修饰的多肽编码序列中，其中“异源”是指与修饰的多肽不同的多肽。

杂交

在特定杂交条件下与其他核酸杂交的核酸。用于杂交核酸的方法是本领域熟知的。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定义，中等严格杂交条件使用预洗涤溶液，其包含5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6×SSC，和杂交温度55℃(或其他类似的杂交溶液，诸如包含约50％甲酰胺的杂交溶液，杂交温度42℃)，并且洗涤条件为60℃，在0.5×SSC，0.1％ SDS中。严格杂交条件在45℃下在6×SSC中杂交，随后在68℃下在0.1×SSC、0.2％SDS中进行一次或多次洗涤。此外，本领域技术人员可以操纵杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交的严格性，使得包括彼此具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。

影响杂交条件选择的参数和设计合适条件的指导由，例如，Sambrook,Fritsch,and Maniatis(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,chapters 9and 11(1989)；CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.,John Wiley and Sons,Inc.,sections 2.10and 6.3-6.4(1995)所述，出于所有目的其全部内容通过引用并入本文，并且可以基于例如DNA的长度和/或碱基组成由本领域普通技术人员容易地确定。

B.突变

可以通过突变将改变引入至核酸中，从而导致其编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列改变。可以使用本领域已知的任何技术引入突变。在一方面，使用例如定点诱变方案改变一个或多个特定氨基酸残基。在另一方面，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。不管其如何产生，突变体多肽均可以被表达并筛选期望的特性。

可以将突变引入至核酸中而不显著改变其编码的多肽的生物活性。例如，可以进行核苷酸置换，导致在非必需氨基酸残基处的氨基酸置换。可选地，可以将一个或多个突变引入至核酸中，选择性地改变其编码的多肽的生物活性。参见，例如，Romain Studer etal.,Biochem.J.449:581-594(2013)。例如，突变可以定量或定性地改变生物活性。定量变化的实例包括增加、减少或消除活性。定性变化的实例包括改变抗体的抗原特异性。

C.探针

在另一方面，核酸分子适合用作用于检测核酸序列的引物或杂交探针。核酸分子可以仅包括编码全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可以用作探针或引物的片段或编码给定多肽的活性部分的片段。

在另一方面，核酸分子可以用作特定抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸分子探针可以用于诊断方法，或核酸分子PCR引物可以用于扩增DNA区域，其尤其可用于分离用于产生抗体可变结构域的核酸序列。参见，例如，Gaily Kivi et al.,BMC Biotechnol.16:2(2016)。在优选的方面，核酸分子是寡核苷酸。在更优选的方面，寡核苷酸来自目标抗体或TCR的重链和轻链或α链和β链的高可变区。在甚至更优选的方面，寡核苷酸编码一个或多个CDR或TCR的全部或部分。

基于期望的核酸序列的探针可以用于检测核酸或类似核酸，例如，编码目标多肽的转录物。探针可以包括标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可以用于鉴定表达多肽的细胞。

XII.多肽表达

在一些方面，存在编码本公开的多肽或肽的核酸分子(例如TCR基因)。这些可以通过本领域已知的方法生成，例如，从已免疫和分离的小鼠的B细胞中分离、噬菌体展示、在任何合适的重组表达系统中表达并允许组装以形成抗体分子或通过重组方法产生。

表达

核酸分子可用于表达大量多肽。如果核酸分子源自非人、非转基因动物，则核酸分子可用于TCR基因的人源化。

B.载体

在一些方面，设想了包括编码期望序列的多肽或其部分(例如，包含一个或多个CDR或一个或多个可变区结构域的片段)的核酸分子的表达载体。包括核酸分子的表达载体可以编码重链、轻链、α链、β链或其抗原结合部分。在一些方面，包括核酸分子的表达载体可以编码融合蛋白、修饰的抗体、抗体片段及其探针。除了管控转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可以包含发挥其他功能的核酸序列。

为了表达本公开的多肽或肽，将编码多肽或肽的DNA插入至表达载体中，使得基因区域可操作地连接至转录和翻译控制序列。在一些方面，编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白或TCR序列的载体具有适当的限制性位点，其经工程化使得任何可变区序列可以容易地被插入和表达。在一些方面，具有合适的限制性位点的编码功能完整的人TCRα或TCRβ序列的载体经工程化，使得任何可变序列或CDR1、CDR2和/或CDR3可以容易地被插入和表达。通常，任何宿主细胞中使用的表达载体包含用于维持质粒或病毒以及用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。统称为“侧翼序列”的此类序列通常包括以下可操作地连接的核苷酸序列中的一种或多种：启动子、一种或多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区域以及选择性标志物元件。此类序列及其使用方法是本领域熟知的。

C.表达系统

存在许多包括至少部分或全部上述表达载体的表达系统。基于原核生物和/或真核生物的系统可以用于产生核酸序列或其关联多肽、蛋白和肽的方面。商业上广泛可用的系统包括但不限于细菌、哺乳动物、酵母和昆虫细胞系统。不同宿主细胞对蛋白的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。本领域技术人员能够使用合适的表达系统表达载体以产生核酸序列或其关联多肽、蛋白或肽。

D.基因转移的方法

用于核酸递送以实现组合物表达的合适方法预期实际上包括可以将核酸(例如，DNA，包括病毒和非病毒载体)引入至细胞、组织或生物体中的任何方法，如本文所述或如本领域普通技术人员已知的。此类方法包括但不限于直接递送DNA，诸如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用并入本文)，包括微注射(Harland and Weintraub,1985；美国专利5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过引用并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham and Van Der Eb,1973；Chen and Okayama,1987；Rippeet al.,1990)；通过使用DEAE葡聚糖，随后使用聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声波负载(Fechheimer et al.,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau and Sene,1982；Fraley etal.,1979；Nicolau et al.,1987；Wong et al.,1980；Kaneda et al.,1989；Kato et al.,1991)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且各自通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler et al.,1990；美国专利5,302,523和5,464,765，各自通过引用并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利5,591,616和5,563,055，各自通过引用并入本文)；或通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh et al.,1993；美国专利4,684,611和4,952,500，各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus et al.,1985)。其他方法包括病毒转导，诸如通过慢病毒或逆转录病毒转导进行的基因转移。

宿主细胞

在另一方面，设想了其中已引入重组表达载体的宿主细胞的用途。抗体可以在多种细胞类型中表达。可以根据本领域已知的多种方法将编码抗体的表达构建体转染至细胞中。载体DNA可以通过常规转化或转染技术引入至原核或真核细胞中。一些载体可以采用允许其在原核和真核细胞两者中复制和/或表达的控制序列。在某些方面，抗体表达构建体可以置于与T细胞激活相关的启动子的控制下，诸如由NFAT-1或NF-κΒ控制的启动子，两者均是可以在T细胞激活后被激活的转录因子。抗体表达的控制使T细胞诸如肿瘤靶向T细胞能够感知周围环境并在T细胞本身和周围内源性免疫细胞中实时调节细胞因子信号传导。本领域技术人员将理解孵育宿主细胞以维持它们并允许载体复制的条件。还理解和已知的是将允许大规模产生载体以及产生由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白或肽的技术和条件。

对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知取决于所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将选择标志物(例如，抗生素抗性)与目标基因一起引入宿主细胞中。除本领域已知的其他方法外，可以通过药物选择来鉴定用引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已掺入选择标志物基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。

2.分离

编码抗体或TCR的完整重链、轻链、α链和β链或其可变区中的一者或两者的核酸分子可以从产生抗体的任何来源获得。分离编码抗体的mRNA的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook et al.，同上。人重链和轻链恒定区基因的序列也是本领域已知的。参见，例如，Kabat et al.,1991，同上。然后，编码全长重链和/或轻链的核酸分子可以在它们已被引入的细胞中表达并分离出抗体。

XIII.细胞的制剂和培养

在特定方面，本公开的细胞可以被具体配制和/或它们可以在特定培养基中培养。细胞可以以适合递送至接受者而无有害作用的方式配制。

某些方面中的培养基可以使用用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养基进行制备，诸如AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、GlasgowMEM、改良型MEM Zinc Option、IMDM、培养基(Medium)199、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640和Fischer培养基中的任一种，以及它们的任何组合，但培养基可以不特别限于此，只要它可用于培养动物细胞。特别地，培养基可以是无异源的或化学成分确定的。

培养基可以是含血清或无血清培养基，或无异源的培养基。从防止异源动物来源组分污染的角度来看，血清可以源自与一种或多种干细胞的动物相同的动物。无血清培养基是指不含未加工或未纯化的血清的培养基，因此，可以包括具有纯化的血液来源组分或动物组织来源组分(诸如生长因子)的培养基。

培养基可以包含或不包含血清的任何替代品。血清的替代品可以包括适当包含白蛋白(诸如富含脂质的白蛋白、牛白蛋白、白蛋白替代品诸如重组白蛋白或人源化白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白水解产物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫甘油或其等同物。血清的替代品可以通过例如国际公开号98/30679中公开的方法进行制备(以其全文并入本文)。可选地，为了更方便，可以使用任何市售材料。市售材料包括敲除血清替代品(KSR)、化学限定脂质浓缩物(Gibco)和Glutamax(Gibco)。

在某些方面，培养基可以包括以下中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种：维生素诸如生物素；DLα-生育酚乙酸酯；DLα-生育酚；维生素A(乙酸盐)；蛋白诸如BSA(牛血清白蛋白)或人白蛋白，不含脂肪酸的V组分(Fraction V)；过氧化氢酶；人重组胰岛素；人转铁蛋白；超氧化物歧化酶；其他组分诸如皮质酮；D-半乳糖；乙醇胺HCl；谷胱甘肽(还原型)；L-肉碱HCl；亚油酸；亚麻酸；孕酮；腐胺2HCl；亚硒酸钠；和/或T3(三碘-I-甲状腺氨酸(triodo-I-thyronine))。。在具体方面，可以明确排除这些中的一种或多种。

在一些方面，培养基进一步包括维生素。在一些方面，培养基包括以下中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种(以及其中可衍生的任何范围)：生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素B12，或包括其组合或其盐的培养基。在一些方面，培养基包括生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇和维生素B12，或基本上由其组成。在一些方面，维生素包括生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A或其组合或盐，或基本上由其组成。在一些方面，培养基进一步包括蛋白。在一些方面，蛋白包括白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的级分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或其组合。在一些方面，培养基进一步包括以下中的一种或多种：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲状腺氨酸或其组合。在一些方面，培养基包括以下中的一种或多种：补充剂、不含异源物质的补充剂、GS21TM补充剂或其组合。在一些方面，培养基包括或进一步包括氨基酸、单糖、无机离子。在一些方面，氨基酸包括精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸或其组合。在一些方面，无机离子包括钠、钾、钙、镁、氮或磷，或其组合或盐。在一些方面，培养基进一步包括以下中的一种或多种：钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰，或其组合。在某些方面，培养基包括或基本上由以下组成：本文讨论的一种或多种维生素和/或本文讨论的一种或多种蛋白，和/或以下中的一种或多种：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲状腺氨酸、补充剂、无异源补充剂、GS21TM补充剂、氨基酸(诸如精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸)、单糖、无机离子(诸如钠、钾、钙、镁、氮和/或磷)或其盐，和/或钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰。在具体方面，可以明确排除这些中的一种或多种。

培养基还可以包含一种或多种外部添加的脂肪酸或脂质、氨基酸(诸如非必需氨基酸)、一种或多种维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和/或无机盐。。在具体方面，可以明确排除这些中的一种或多种。

可以以至少、至多或约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250ng/L、ng/ml、μg/ml、mg/ml，或其中可推导的任何范围的浓度添加培养基组分中的一种或多种。

在具体方面，本公开的细胞被专门配制。它们可以被配制成或可以不被配制成细胞悬液。在特定情况下，它们被配制成单剂量形式。它们可以被配制成用于全身或局部给药。在一些情况下，细胞被配制用于在使用前储存，并且细胞配制物可以包括一种或多种冷冻保存剂，诸如DMSO(例如，在5％ DMSO中)。细胞制剂可以包括白蛋白(包括人白蛋白)，其中特定制剂包括2.5％人白蛋白。细胞可以被专门配制用于静脉内给药；例如，它们被配制用于在小于一小时的时间内静脉内给药。在特定方面，细胞处于配制的细胞悬液中，其在室温下从解冻时起稳定1、2、3或4小时或更长时间。

在特定方面，本公开的细胞包括外源TCR，其可以具有确定的抗原特异性。在一些方面，可以基于对预期接受者的同种反应性的缺失或减少来选择TCR。在外源TCR是非同种异体反应性的实例中，在T细胞分化过程中，外源TCR通过称为等位基因排斥的发育过程抑制内源TCR基因座的重排和/或表达，导致T细胞仅表达非同种反应性外源性TCR，因此是非同种反应的。在一些方面，外源TCR的选择可能不一定基于缺乏同种异体反应性来限定。在一些方面，内源TCR基因已通过基因组编辑进行修饰，使得它们不表达蛋白。基因编辑的方法诸如使用CRISPR/Cas9系统的方法是本领域已知的并在本文中描述。

在一些方面，本公开的细胞进一步包括一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以针对的肿瘤细胞抗原的实例包括至少5T4、8H9、αvβ6整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族(包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、EPCAM、EphA2、EpCAM)、叶酸受体-a、FAP、FBP、胎儿AchR、FRα、GD2、G250/CAIX、GD3、Glypican-3(GPC3)、Her2、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、KDR、MAGE、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSC1、PSCA、PSMA、ROR1、SP17、生存素、TAG72、TEM、癌胚抗原、HMW-MAA、AFP、CA-125、ETA、酪氨酸酶、MAGE、层粘连蛋白受体、HPVE6、E7、BING-4、钙激活氯离子通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、EphA3、端粒酶、SAP-1、BAGE家族、CAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族、XAGE家族、NY-ESO-1/LAGE-1、PAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、GP100/pmel17、TRP-1/-2、P.多肽、MC1R、前列腺特异性抗原、β-连环蛋白、BRCA1/2、CML66、纤连蛋白、MART-2、TGF-βRII或VEGF受体(例如，VEGFR2)。CAR可以是第一代、第二代、第三代或更多代CAR。CAR可以对任何两种非相同抗原具有双特异性，或可以对多于两种的非相同抗原具有特异性。

XIV.治疗组合物的给药

本文提供的疗法可以包括给药治疗剂的组合，诸如第一抗病毒疗法和第二抗病毒疗法。可以以本领域已知的任何合适的方式给药治疗。例如，第一和第二抗病毒治疗可以序贯(在不同时间)或同时(在相同时间)给药。在一些方面，第一和第二抗病毒治疗在单独的组合物中给药。在一些方面，第一和第二抗病毒治疗在同一组合物中。

本公开的方面涉及包括治疗组合物的组合物和方法。不同疗法可以以一种组合物或多于一种组合物的形式给药，诸如2种组合物、3种组合物或4种组合物。可以采用这些试剂的各种组合。

本公开的治疗组合物可以通过相同给药途径或通过不同给药途径给药。在一些方面，肽、多肽、工程化TCR、工程化T细胞、核酸、抗病毒疗法或药物组合物通过静脉内、肌内、皮下、外用、口服、经皮、腹腔、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内给药。在一些方面，抗生素通过静脉内、肌内、皮下、外用、口服、经皮、腹腔、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内给药。合适的剂量可以根据待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的反应以及主治医师的判断来确定。

治疗可以包括各种“单位剂量”。单位剂量被定义为包含预定量的治疗组合物。待给药的量以及具体途径和制剂在临床领域技术人员的技术范围内确定。单位剂量不需要作为单次注射给药，而是可以包括在设定的时间段内连续输注。在一些方面，单位剂量包括可单次给药的剂量。

治疗组合物的精确量也取决于从业者的判断并且对于每个个体而言是特有的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态、给药途径、治疗的预期目标(缓解症状相对于治愈)以及特定治疗物质或受试者可能正在接受的其他疗法的效力、稳定性和毒性。

XV.样品制备

在某些方面，方法涉及从受试者获得样品。本文提供的获得方法可以包括活检方法，诸如细针抽吸、空心针活检、真空辅助活检、切开活检、切除活检、穿孔活检、刮取活检或皮肤活检。在某些方面，通过先前提及的任何活检方法从卵巢或子宫内膜组织的活检获得样品。样品可以从任何其他来源获得，包括但不限于血液、血清、血浆、汗液、毛囊、口腔组织、眼泪、月经、粪便或唾液。在本方法的某些方面，任何医疗专业人员诸如医生、护士或医疗技术人员可以获得生物样品用于测试。此外，无需医疗专业人员的帮助即可获得生物样品。

样品可以包括但不限于组织、细胞或来自受试者的细胞或源自受试者的细胞的生物材料。生物样品可以是异质或同质的细胞或组织群体。可以使用本领域已知的任何能够提供适合于本文所述的分析方法的样品的方法获得生物样品。可以通过非侵入性方法获得样品，包括但不限于：刮擦皮肤或子宫颈、擦拭脸颊、收集唾液、收集尿液、收集粪便、收集月经、眼泪或精液。

可以通过本领域已知的方法获得样品。在某些方面，通过活检获得样品。在其他方面，通过拭子、内窥镜检查、刮擦、静脉切开术或本领域已知的任何其他方法获得样品。在一些情况下，可以使用本方法的试剂盒的组件来获得、储存或运输样品。在一些情况下，可以获得多个样品，诸如多个血浆或血清样品，用于通过本文所述的方法进行诊断。在其他情况下，可以获得多个样品，诸如来自一种组织类型(例如卵巢或相关组织)的一个或多个样品和来自另一样品(例如血清)的一个或多个样品，用于通过该方法进行诊断。样品可以在不同时间获得并通过不同方法储存和/或分析。例如，可以通过常规染色方法或任何其他细胞学分析方法来获得和分析样品。

在一些方面，生物样品可以由医生、护士或其他医疗专业人员诸如医疗技术员、内分泌学家、细胞学家、抽血学家、放射科医生或肺病学家获得。医疗专业人员可以指示对样品进行适当的测试或测定。在某些方面，分子谱分析企业可以就最适合指示的测定或测试进行咨询。在本方法的其他方面，患者或受试者可以获得用于测试的生物样品而无需医疗专业人员的帮助，诸如获得全血样品、尿液样品、粪便样品、口腔样品或唾液样品。

在其他情况下，通过侵入性操作获得样品，包括但不限于：活组织检查、针抽吸、抽血、内窥镜检查或静脉切开术。针抽吸方法还可以包括细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或大芯活检。在一些方面，可以通过本文的方法获得多个样品以确保足够量的生物材料。

用于获得生物样品的一般方法也是本领域已知的。出版物例如Ramzy，IbrahimClinical Cytopathology and Aspiration Biopsy 2001，其全部内容通过引用并入本文，描述了活检和细胞学方法的一般方法。

在本方法的一些方面，分子谱分析企业可以直接从受试者、从医学专业人员、从第三方、或从由分子谱分析企业或第三方提供的试剂盒获得生物样品。在一些情况下，生物样品可以在受试者、医学专业人员或第三方获取生物样品并将其发送至分子谱分析企业之后由分子谱分析企业获得。在一些情况下，分子谱分析企业可以提供合适的容器和辅料，用于将生物样品储存和运输到分子谱分析企业。

在本文所述的方法的一些方面，医疗专业人员不需要参与初始诊断或样品采集。个人也可以通过使用非处方(OTC)试剂盒获取样品。OTC试剂盒可以含有用于获得如本文所述的所述样品的工具、用于储存所述样品以供检查的工具以及正确使用试剂盒的说明。在某些情况下，分子分析服务被包括在试剂盒购买价格中。在其他情况下，分子分析服务单独计费。适合分子谱分析企业使用的样品可以是含有待测试个体的组织、细胞、核酸、基因、基因片段、表达产物、基因表达产物或基因表达产物片段的任何材料。提供了确定样品适用性和/或充分性的方法。

在一些方面，受试者可以被转介给专家诸如肿瘤学家、外科医生或内分泌学家。专家同样可以获得生物样品用于测试或将个人转介至测试中心或实验室以提交生物样品。在某些情况下，医疗专业人员可能会将受试者转介至测试中心或实验室以提交生物样品。在其他情况下，受试者可以提供样品。在某些情况下，分子分析公司可以获得样品。

XVI.检测和疫苗接种试剂盒

本公开的肽或抗体可以被包括在试剂盒中。试剂盒中的肽或抗体可以可检测地标记或固定在也包括在试剂盒中的支持基底的表面上。例如，一种或多种肽或抗体可以以合适的形式诸如无菌的、冻干的或两者在试剂盒中提供。

包括在本发明的试剂盒中的支持基底可以基于待进行的方法来选择。作为非限制性实例，支持基底可以是多孔板或微孔板、膜、过滤器、纸、乳液、珠、微珠、微球、纳米珠、纳米球、纳米颗粒、醇质体、脂质体、脂质体、泡囊(niosome)、转移体、油标尺、卡、赛璐珞条、玻璃载玻片、显微载玻片、生物传感器、侧流装置、微芯片、梳子、二氧化硅颗粒、磁性颗粒或自组装单层。

适合于所进行的方法，试剂盒可以进一步包括用于将组合物递送至受试者或用于以其他方式处理本发明的组合物的一个或多个装置。作为非限制性实例，试剂盒可以包括注射器、滴眼器、弹道颗粒施加器(例如，美国专利5,797,898、5,770,219和5,783,208以及美国专利申请2005/0065463中公开的施加器)、勺、显微载玻片盖、测试条保持器或盖等的装置。

用于标记试剂盒的组分的检测试剂可以任选地被包括在用于进行本发明的方法的试剂盒中。在特定方面，标记或检测试剂选自以下的组：本领域常用的试剂，并且包括但不限于放射性元素、酶、吸收UV范围内的光的分子和荧光团诸如荧光素、罗丹明、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和路西法黄。在其他方面，提供了试剂盒，其包括一个或多个容器装置和已经用检测试剂标记的BST蛋白试剂，该检测试剂选自包括放射性元素、酶、吸收UV范围内的光的分子和荧光团的组。

当包括试剂盒的试剂和/或组分以冻干形式(冻干物)或作为干粉提供时，可以通过添加合适的溶剂来复溶冻干物或粉末。在特定方面，溶剂可以是无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其他稀释剂。设想这样的溶剂也可以作为试剂盒的一部分提供。

当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液形式提供时，作为非限制性实例，该液体溶液可以是无菌的水溶液。该组合物还可以被配制成给药组合物。在这种情况下，容器装置本身可以是注射器、移液管、外用施加器等，制剂可以从其中施加至身体的累及区域、注射到受试者体内和/或施加至试剂盒的其他组分或与试剂盒的其他组分混合。

XVII.序列

表1

XVIII.实施例

包括以下实施例以证明本公开的优选方面。本领域技术人员应当理解，在随后的实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开应当理解，在不背离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体方面进行许多改变并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1：SARS-Cov-2膜糖蛋白65(MGP-65)肽、CTL和TCR

SEQ ID NO:22的HLA-A2限制性SARS-Cov-2表位可以用于检测患有COVID-19感染的患者的免疫应答或用于对患者进行疫苗接种以预防该疾病。该肽将有助于更好地了解COVID-19免疫力，并将直接影响对COVID-19感染患者的管理。此外，这种肽、CTL以及相应的TCR可以用于生成针对HLA匹配靶标的第三种SARS-Cov-2特异性T细胞，从而为COVID19疾病患者提供现成的T细胞治疗。储存现成的同种异体T细胞疗法来治疗危及生命的病毒性疾病的能力并不是史无前例的，并且可以很容易地应用于COVID 19特异性T细胞疗法。

使用NP-40缓冲液裂解强制表达MGP的A375细胞系(HLA-A0201+)，并将裂解物与偶联有抗MHC I类抗体(W6/32)的Sepharose Fast Flow珠一起孵育。洗涤未结合的蛋白后，使用乙酸洗脱MHC结合肽。将洗脱的肽溶液浓缩并使用串联质谱进行分析。发现MGP序列的一个肽命中物(MGP-65，FVLAAVYRI(SEQ ID NO:22))。(图1)

将MGP-65(FVLAAVYRI-SEQ ID NO:22)肽脉冲至健康供体的HLA-A0201成熟树突细胞(MDC)，然后与自体细胞在48孔板中共培养。两轮刺激后，收集来自每孔的部分T细胞，用MGP-65四聚体和抗CD8染色进行流式细胞仪检测。刺激后观察到少量CD8+/四聚体+群体。将显示四聚体+/CD8+群体的孔中的T细胞合并，并对四聚体+/CD8+群体进行分选并用快速扩增方案(REP)进行扩增。REP两周后，检测到高纯度CTL(四聚体+群体超过90％)(图2)。

将用不同浓度的MGP-65肽脉冲的T2细胞用作细胞裂解实验的靶标。用Cr51释放测定(CRA)检测MGP-65特异性CTL细胞系的裂解能力。使用的效应子与靶标(E:T)比为20:1(图3A)。A375(HLA-A0201+)。使用强制表达eGFP或SARS-Cov-2 MGP的Mel624(HLA-A0201+)细胞系作为靶标，并与MGP-65特异性CTL细胞系共培养。使用的效应子与靶标(E:T)比为40:1至1.25:1。用Cr51释放测定(CRA)检测MGP-65CTL细胞系对不同靶标的裂解能力(图3B-C)。MGP-65CTL细胞系对阳性靶标的杀伤力显著高于阴性对照(图3)。

将A375-MGP和Mel624-MGP用作“热”靶细胞并用Cr51标记。用没有Cr51标记的MGP-65肽脉冲的T2细胞代表“冷”靶。用无关肽M26脉冲的T2细胞用作对照“冷”靶。使用的E:T为20:1。使用的冷靶:热靶比为10:1或20:1。用CRA检测冷靶对MGP-65CTL的杀伤抑制作用。当使用Hormad1-56肽脉冲的T2作为冷靶时，与仅热靶组相比，MGP-65CTL对热靶的杀伤被显著抑制。用M26阴性对照脉冲的T2不抑制MGP-65CTL对热靶的杀伤(图4)。

MGP-65特异性CTL细胞系与T2+M26、T2+MGP-65、A375-eGFP、A375-MGP、Mel624-eGFP和Mel624-MGP共培养(E:T＝10:1)。共培养过夜后，通过ICS测定检测TCR通路下游激活标志物CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α。与阴性对照靶标相比，MGP-65特异性CTL细胞系与阳性靶标共培养时CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α的水平显著增强(图5)。

使用5-RACE PCR方案克隆出包括α链和β链的T细胞受体(TCR)。使用IMGT(IMGT/V-QUEST)网站工具对序列进行注释(表1-3)。

表1

表2

表3

TCRα和β链被克隆并插入至逆转录病毒载体中。重组逆转录病毒载体用于感染PBMC。感染后检测到CD8+/四聚体+群体。经过四聚体引导的分选和扩增后，生成高纯度TCR-T群体(图6)。使用类似的方法，还产生针对NSP13-134肽(KLFAAETLK–SEQ ID NO:36)(图23)、NSP13-242肽(TLVPQEHYV–SEQ ID NO:35)(图26)、NSP13-400肽(VYIGDPAQL–SEQ IDNO:37)(图29)和NSP13-448肽(IVDTVSALVY–SEQ ID NO:34)(图32)的TCR-T细胞群。

通过Cr51释放测定来测试SARS-CoV-2特异性TCR-T裂解靶细胞的能力。如图7、24、27、30和33所示，相对于阴性对照，SARS-CoV-2TCR-T表现出显著更高的阳性靶标裂解。NSP13-134特异性TCR-T与SK-MES-1+对照A0301肽、SK-MES-1+NSP13-134、SK-MES-1-GFP、SK-MES-1-NSP13、Hs-578T-GFP和Hs-578T-NSP13共培养(E:T＝10:1)(图25)。NSP13-242特异性TCR-T与T2+M26、T2+NSP13-242、A375-GFP、A375-NSP13、RPMI-7951-GFP和RPMI-7951-NSP13共培养(E:T＝10:1)(图28)。NSP13-400特异性CD8+和CD4+TCR-T与M14+对照肽、M14+NSP13-400、Hs-578T-GFP、Hs-578T-NSP13、M14-GFP和M14-NSP13共培养(E:T＝10:1)(图31)。NSP13-448特异性TCR-T与A375+对照A0101肽、A375+NSP13-448、A375-GFP、A375-NSP13、RPMI-7951-GFP和RPMI-7951-NSP13共培养(E:T＝10:1)(图34)。共培养过夜后，通过ICS测定检测TCR通路下游激活标志物CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α。与阴性对照靶标相比，当与阳性靶标共培养时，肽特异性TCR-T的CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α的水平显著增强(图25、28、31和34)。

总之，本发明人已经生成SARS-CoV-2特异性CTL、克隆的TCR和TCR工程化T细胞(TCR-T)，并且已经在功能上验证了CTL和TCR T细胞。使用TCR-T的细胞疗法可作为治疗重度SARS-CoV-2感染患者的任选治疗方法。鉴定出的SARS-CoV-2肽或编码序列可以负载至呈递细胞中并与T细胞共培养，以生成抗原特异性CTL细胞系或克隆。自体或同种异体CTL细胞系或克隆可以用于HLA匹配的SARS-CoV-2感染患者的过继免疫治疗。

实施例2：用于基于T细胞的COVID19疾病治疗的免疫原性SARS-CoV-2表位和同源TCR的质谱鉴定

A.简介

重度急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是导致COVID-19大流行爆发的高度传播性呼吸道病毒，它继续对全球公共卫生产生重大、持久的影响，并且迫切需要开发准确的免疫诊断和有效的治疗策略(Hui et al.,2020；Wu et al.,2020b)。Dr.Zhang Yongzhen首次揭示的SARS-CoV-2基因组序列迅速传播，导致世界各地大规模努力开发可引起体液(抗体)和细胞(T细胞)应答的保护性疫苗(Wu et al.,2020a)。因此，鉴定由人免疫系统识别的SARS-CoV-2免疫原性表位对于合理开发疫苗至关重要。

使用计算机预测算法，一些研究人员已经积累了广泛的I类和II类限制性表位组来探测SARS-CoV-2特异性T细胞应答，在一些情况下，将这些与跨越基因组的保守区域的重叠“大池”相结合(Campbell et al.,2020；Grifoni et al.,2020a)。这些肽已用于追踪感染个体和康复个体的反应(Kar etal.,2020；Peng et al.,2020)，设计多表位疫苗并直接或间接用于测量COVID19疾病的广度和严重程度(Braun et al.,2020；Grifoni et al.,2020b；Kar et al.,2020；Le Bert et al.,2020；Nolan et al.,2020；Snyder et al.,2020；Weiskopf et al.,2020)。虽然这些研究揭示了对COVID19的T细胞免疫生物学的见解，但由于未能考虑此类表位是否具有免疫原性，因此使用计算机预测反应和重叠长肽(OLP)池的T细胞应答的准确性降低。在这个意义上，免疫原性表位被定义为已知由自身MHC呈递的肽，并且能够引发具有足够亲和力的T细胞，使得此类T细胞能够识别内源表达抗原并呈递抗原来源肽的靶细胞在具有足够表面密度的MHC复合物的背景下，使靶细胞对肽特异性T细胞介导的识别敏感。本质上，SARS-CoV-2的免疫原性表位需要对由MHC呈递的肽进行直接测序，并需要对T细胞免疫原性进行经验验证。

据本发明人所知，本研究是首次使用串联MS来在从表达SARS-CoV-2的细胞的MHC复合物中洗脱肽后鉴定SARS-CoV-2的T细胞表位，并且是第一项研究通过体外生成SARS-CoV-2特异性CTL来凭经验验证免疫原性。应用本发明人小组开发的技术，用于从外周血中前体频率非常低的群体中分离罕见的肿瘤反应性T细胞(Chapuis et al.,2017)。本发明人提供了膜糖蛋白高度保守区域和SARS-CoV-2基因组非结构蛋白区域的五个免疫原性表位的鉴定数据，并证明这种MGP65和NSP13特异性CTL识别并杀死SARS-CoV-2抗原表达靶细胞；发明人进一步对TCRα和β链进行测序，并证明可以通过在多克隆淋巴细胞中工程化该TCR的表达来转移特异性。

B.结果

1.“计算机”定义的SARS-CoV-2肽无法诱导识别SARS-CoV-2抗原表达靶标的T细胞。

作为免疫原性的已知预测表位的初始筛选，本发明人基于对研究的文献检索选择了SARS-CoV-2刺突蛋白和膜糖蛋白(MGP)的I类限制性肽，其中此类“计算机模拟”预测的肽被描述为“免疫显性”。这些肽先前已被报道为“免疫显性”，因为它们能够从COVID19+患者的PBMC中生成高水平的肽特异性反应，出乎意料的是，在一些健康供体中也是如此(显然是过去T细胞对非致病性SARS病毒产生交叉反应的结果)(Agerer et al.,2021；Ahmed etal.,2020；Gao et al.,2020；Grifoni et al.,2020a；Kar et al.,2020；Safavi et al.,2020；Shomuradova et al.,2020；Sohail et al.,2021；V.Gauttier,2020；WilliamChour,2020)。本发明人合成了4种这些刺突蛋白肽和3种膜糖蛋白(MGP)肽。使用内源T细胞(ETC)生成工作流(参见方法部分)，本发明人针对所有4种刺突肽和所有3种MGP肽生成单独的T细胞培养物(图16)。然而，当这些高度富集(>80％四聚体+)的T细胞培养物与HLA匹配的靶细胞进行测试时，这些靶细胞被设计成表达相关SARS-CoV-2刺突蛋白或膜糖蛋白，没有观察到靶细胞被杀死的证据(图16)。本发明人推测这些计算机预测的肽不是内源性存在的；并且需要一种更准确的方法来识别内源性免疫原性表位，并且可以通过直接从表达SARS-CoV-2的细胞的MHC中洗脱肽并对其进行测序来实现。

2.SARS-CoV-2的MHC I类限制性表位分析

SARS-CoV-2的抗原发现平台由四个步骤组成：(1)SARS-CoV-2靶标的肽洗脱和质谱(MS)鉴定；(2)内源性T细胞(ETC)生成工作流，以引发肽特异性CTL；(3)针对SARS-CoV2靶标的抗原特异性CTL的经验验证；和(4)SARS-CoV-2特异性T细胞受体(TCR)工程化T细胞(TCR-T)开发(图15)。为了对源自SARS-CoV-2的MHC结合肽进行洗脱和测序，在具有不同HLA等位基因表达的靶细胞中过表达SARS-CoV-2基因。跨越SARS-CoV-2高保守区域的慢病毒表达载体：构建膜糖蛋白(MGP)或非结构蛋白解旋酶(NSP13)(Keller et al.,2020；Le Bertet al.,2020)并用于感染靶细胞系A375(HLA-A0101/0201)、Mel624(HLA-A0201)、RPMI-7951(HLA-A0101/0201)、Hs-578T(HLA-A0301/A2402)和M14(HLA-A1101/2402)。在选择嘌呤霉素并扩增MGP或NSP13稳定表达的细胞系后，纯度达到超过90％(数据未显示)。将MGP或NSP13表达细胞系扩增至3-5亿个，收获，用NP40去污剂裂解缓冲液裂解，并进行总HLA I类免疫沉淀(抗HLA-A、B、C)和酸洗脱，然后通过串联质谱(MS)分析HLA结合肽。

发明人最初通过使用数据依赖性分析液相色谱串联质谱(DDA MS/MS)分析了源自上文建立的SARS-CoV-2靶标的洗脱的HLA结合肽。使用Proteome Discoverer(版本2.3)处理工作流中的Mascot搜索引擎节点(版本2.6)、Swiss-Prot人蛋白质组数据库(版本2020_05)和然后病毒蛋白质组数据库(版本2020_05)搜索洗脱光谱。为了减少人蛋白质组的假阳性命中，Proteome Discoverer处理工作流中的“光谱置信度过滤器”节点过滤掉所有与人蛋白质组注释的高度可信的肽谱匹配的光谱。剩余的光谱进一步针对病毒蛋白质组进行搜索(图8A)。总共获得12,770个MS/MS，注释9731个肽谱匹配(PSM)，产生357个Mascot离子评分≥25的肽。在357个肽中，注释源自NSP13的肽(NSP13-400，VYIGDPAQL-SEQ ID NO:37)，Mascot离子评分＝27(图8B)。该肽从M14-NSP13细胞(HLA-A1101/A2402)中洗脱。根据HLA结合测定(IEDB工具)，NSP13-400肽与HLA-A2402等位基因的预测结合亲和力较高(表2)，表明NSP13-400肽可能由HLA-A2402呈递。

为了能够更全面地分析来自SARS-CoV-2的潜在HLA-I类限制性肽，发明人通过平行反应监测质谱(PRM-MS)进一步分析洗脱的肽，重点预测源自SARS-CoV-2但未通过DDA方法成功检测到的高概率HLA结合肽。在PRM-MS之前，分别选择来自MGP或NSP13的十个预测高潜力HLA-A0101、HLA-0201或HLA-A0301结合肽(表S1)。对于从A375-NSP13中洗脱的肽，使用Skyline生成10种潜在肽的前体离子包含列表，发明人使用纳流LC-PRM-MS以高质量精度和分辨率瞄准并监测这10种肽。Pierce^TM肽保留时间校准混合物(Peptide Retention TimeCalibration Mixture)肽用于监测保留时间漂移并调整预定的PRM方法。发明人首先使用合成肽生成谱库，并且发明人使用合成肽和Pierce^TM肽保留时间校准混合物肽来定义iRT(归一化无量纲肽特异性值)，以准确预测每个目标肽的保留时间。发明人检测到IVDTVSALVY(SEQ ID NO:34)(NSP13-448),其平均产物离子ppm误差为-0.7ppm(图8C)，TLVPQEHYV(SEQ ID NO:35)(NSP13-242)，其平均产物离子ppm误差为-0.7ppm(图8D)。适用相同的规则。从A375-MGP，发明人检测到FVLAAVYRI(SEQ ID NO:22)(MGP-65)，其平均产物离子ppm误差为-0.3ppm(图8E)。这些XIC MS1分析报告了足够的色谱分离和具有窄m/z窗口的高分辨率MS1检测，表明这些目标肽存在于洗脱的肽样品中。另外，从PRM-MS筛选中选择了一种潜在的肽KLFAAETLK(SEQ ID NO:36)(NSP13-134)(图17)用于进一步的免疫原性功能测定(MS/MS未显示)。

为了评价用DDA或PRM-MS鉴定的这五种候选SARS-CoV-2HLA I类限制肽是否与其他冠状病毒(包括SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV))以及其他四种冠状病毒229E、NL63、OC43和HKU1同源，进行多重序列比对(MSA)分析。NSP13-242(图8G)、NSP13-134(图8H)和MGP-65(图8J)显示出与SARS-CoV的序列具有高度同源性。NSP13-400(图8I)显示出与SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-HKU1(以红色下划线)的序列具有高度同源性。NSP13-448(图8F)显示出与SARS-CoV、HCoV-OC43(红色下划线)的序列具有高度同源性。为了评价这五种候选蛋白是否与非冠状病毒物种同源，通过使用BLAST搜索对肽进行分析，以识别所有潜在的来源蛋白。每个靶序列的前250个命中物报告高达88.99％同一性或100％同一性，但与相关冠状病毒的覆盖率高达88.99％或100％同一性，表明这五个候选肽仅与冠状病毒同源，与其他物种不同源(数据未示出)。

3.在SARS-CoV-2和SARS-CoV2变体的高度保守区域中发现了新定义的表位

Olvera等人最近描述了利用SARS-CoV-2共有序列的重叠开发COVID19疫苗(Olvera et al.,2020)。本文对NCBI中1700多个病毒基因组条目进行基于熵的计算，并且涵盖所有描述的SARS-CoV-2开放阅读框(ORF)，包括最近描述的框移和长度变异ORF。Nextstrain项目(可在nextstrain.org上在线找到)是开源项目，提供不断更新的公开数据视图以及强大的分析和可视化工具，以助于流行病学理解和改善疫情应对，提供了分析SARS-CoV-2基因组的遗传多样性的方法。使用这两个来源，发明人验证了这五种肽位于SARS-CoV-2基因组的高保守区(图8K)。最近，SARS-CoV-2的基因变体在全球范围内出现，例如位于刺突蛋白上的突变23403A>G-(D614G)，认为使SARS-CoV-2更具传染性(Garcia-Beltran et al.,2021；Tzou et al.,2020)。为了调查最近报告的变体是否位于这五个候选SARS-CoV-2HLA I类限制性表位内，发明人重点关注了英国(B.1.1.7)、丹麦(B.1.1.298)、美国(B.1.429)、巴西和日本(P.2和P.1)以及南非(B.1.351)首次描述的关注变体。对于NSP-13区域，P.1变体中存在两种突变E341Y和A368V，B.1.1.7变体中存在一种突变K460R，B.1.351变种中存在一种突变T588I，其中没有一个与这些突变重叠四个NSP-13HLA I类限制肽。尚未报道来自膜糖蛋白(MGP)区域的变体菌株(图8L)。

4.从外周血中生成的MGP-65肽特异性细胞毒性T细胞识别表达SARS-CoV-2-MGP的靶细胞

在白细胞分离术之后，用MGP-65肽(FVLAAVYRI-SEQ ID NO:22)脉冲的自体DC刺激HLA-A0201健康供体PBMC。两轮刺激后，检测到MGP-65-A2四聚体阳性染色群体(图9A)。一块48孔板的约33个孔显示出清晰的MGP-65肽四聚体阳性CD8+T细胞群(图8)，表明MGP-65肽特异性T细胞很容易通过同源肽刺激进行扩增，甚至在无SARS-CoV-2感染史的健康供体的PBMC中也是如此。使用标准⁵¹Cr释放测定(CRA)对扩增的MGP-65CTL进行功能测试。用滴定量的MGP-65肽脉冲的T2细胞(HLA-A0201)在低至10pM的肽浓度下引发CTL识别和杀伤(图9B)，表明MGP-65CTL对同源肽的识别亲和力非常高。

为了验证MGP-65特异性CTL识别内源呈递的同源肽，HLA-A0201+靶细胞经工程化以表达SARS-CoV-2MGP基因(A375-MGP、Mel624-MGP)。MGP-65特异性CTL能够裂解A375-MGP和Mel624-MGP细胞系，但不能裂解A375-GFP和Mel624-GFP对照细胞系(图9C和9D)。为了进一步确认MGP-65特异性CTL的靶标识别是通过内源呈递的同源肽的接合，进行了冷靶抑制测定。⁵¹Cr脉冲的MGP表达细胞用⁵¹Cr进行放射性标记，而MGP-65或M26无关肽脉冲的T2细胞则保持未标记，并分别用作冷靶或对照冷靶。当以20:1和10:1冷靶与热靶(C:H)比添加冷靶时，MGP-65特异性CTL对放射性标记的MGP-65肽靶的细胞毒性被显著抑制(图9E和9F)。然而，如果添加对照冷靶，则没有抑制作用，表明MGP-65CTL能够通过识别内源性存在的同源肽来裂解MGP-65靶标。该数据进一步证明MGP-65肽是天然的内源性呈递的MHC肽。

为了进一步评价MGP-65特异性CTL的功能，进行细胞内染色(ICS)测定以检测IFN-γ和TNF-α的产生。MGP-65特异性CTL与MGP-65肽脉冲或MGP工程化靶细胞的共培养证明了与用无关肽脉冲或工程化表达对照GFP的对照靶标相比，产生的IFN-γ和TNF-α的特异性识别(图9G)。当遇到相关SARS-CoV-2靶标时，与对照组相比，T细胞激活标志物CD137和CD69也特异性地和显著地相应增加(图9G)。

5.从外周血中生成的NSP13-242肽特异性细胞毒性T细胞识别表达SARS-CoV-2-NSP13的靶细胞

与结构蛋白诸如MGP和刺突蛋白相比，SARS-CoV-2的非结构蛋白诱导体液应答和中和抗体的可能性较低，因为它们不在病毒体表面上表达。然而，SARS-CoV-2感染细胞的非结构蛋白可以作为MHC结合肽呈递，并诱导持久的细胞免疫应答。此处，使用相同的工作流，通过MS/MS鉴定了源自NSP13解旋酶的HLA-A0201限制性肽NSP13-242(TLVPQEHYV–SEQ IDNO:35)。与MGP-65类似，使用ETC工作流很容易生成NSP13-242特异性T细胞(图10A)。出乎意料的是，在用NSP13-242肽刺激后，来自一块48孔板的所有48孔均显示出清晰的NSP13-242肽四聚体阳性CD8+T细胞群(图19)，表明NSP13-242肽可能具有高度免疫原性。

细胞毒性测定还证明NSP13-242特异性CTL能够识别低至100pM的同源肽(图10B)，表明高亲和力TCR的表达。更重要的是，NSP13-242特异性CTL能够裂解表达NSP13的靶标A375-NSP13和Mel624-NSP13，即使在非常低的E:T比(2.5:1)下，但不能裂解对照靶标(图10C和10D)，表明NSP13-242特异性CTL可以识别NSP13蛋白的内源性呈递肽。与MGP-65CTL类似，冷靶抑制测定也显示，当添加冷靶时，NSP13-242特异性CTL对热靶A375-NSP13和Mel624-NSP13的裂解能力被显著抑制(图10E和10F)，进一步证实NSP13-242特异性CTL通过识别内源性递呈的同源肽来裂解靶标。

ICS测定证明当与NSP13-242肽脉冲靶或表达NSP13的靶标共培养时，与对照靶标相比，NSP13-242特异性CTL产生更高水平的炎性细胞因子IFN-Y和TNF-α并且表达更高水平的抗原驱动的激活标志物CD137和CD69(图10G)。因此，与MGP-65特异性CTL类似，NSP13-242特异性CTL在遇到SARS-CoV-2时也启动特异性细胞免疫应答。

6.从外周血中生成的NSP13-448肽特异性细胞毒性T细胞识别表达SARS-CoV-2-NSP13的靶细胞

HLA-A0201等位基因在约45％的白种人和亚洲人群中表达(Kessler etal.,2003)。鉴于COVID19的全球影响力，针对SARS-CoV-2的其他高度流行的HLA-A等位基因的特异性T细胞靶向将是可取的。使用针对MGP65和NSP13-242肽的相同工作流，发明人通过MS/MS鉴定了HLA-A0101限制性肽、NSP13-448(IVDTVSALVY–SEQ ID NO:34)来源的NSP13蛋白；该等位基因覆盖了约26％的白种人和7％的亚洲人(Kessler et al.,2003)。与NSP13-242类似，使用ETC工作流很容易生成NSP13-448特异性T细胞(图11A)。然而，在用NSP13-448肽刺激后，来自一块48孔板的仅一个孔显示出清晰的NSP13-448肽四聚体阳性CD8+T细胞群(图20)，表明NSP13-448肽可能不具有高度免疫原性。

细胞毒性测定还证明NSP13-448特异性CTL能够识别低至100nM的同源肽(图11B)，表明中度至低TCR亲和力。有意思的是，NSP13-448特异性CTL仍然能够裂解表达NSP13的靶标A375-NSP13和RPMI-7951-NSP13，即使在非常低的E:T比(2.5:1)下，但不能裂解对照靶标(图11C和11D)，表明NSP13-448特异性CTL可以识别NSP13蛋白的内源性呈递肽。冷靶抑制测定表明，当添加冷靶时，NSP13-448特异性CTL对热靶A375-NSP13和RPMI-7951-NSP13的裂解能力被显著抑制(图11E和11F)，进一步证实NSP13-448特异性CTL通过识别内源性呈递的同源肽来裂解这些靶标。

ICS测定证明当与NSP13-448肽脉冲的靶标或表达NSP13的靶标共培养时，与对照靶标相比，NSP13-448特异性CTL产生更高水平的炎性细胞因子、IFN-γ和TNF-α，并且表达更高水平的抗原驱动的激活标志物CD137和CD69靶标(图12G)。

7.从外周血中生成的NSP13-134肽特异性细胞毒性T细胞识别表达SARS-CoV-2-NSP13的靶细胞

除了HLA-A0101和HLA-A0201等位基因之外，HLA-A0301等位基因覆盖了约22％的白种人和13％的非洲人口(Kessler et al.,2003)。使用相同的工作流，发明人鉴定了HLA-A0301限制性肽、NSP13-134(KLFAAETLK–SEQ ID NO:36)来源的NSP13蛋白。使用ETC工作流进行体外刺激后，48孔中的11孔显示出清晰的NSP13-134肽四聚体阳性CD8+T细胞群(图21)，表明NSP13-134肽具有足够的免疫原性，可在健康供体中诱导T细胞应答，而无需既往感染过SARS-CoV-2。分选和扩增后，生成高纯度的CD8+和四聚体+NSP13-134 CTL(图12A)。肽滴定测定显示NSP13-134特异性CTL能够识别低至100pM的同源肽(图12B)，表明相对高亲和力TCR的表达。与MGP-65和NSP13-242特异性CTL类似，NSP13-134特异性CTL能够裂解表达NSP13的靶标Hs-578T-NSP13，即使在低E:T比(2.5:1)下，但不能裂解对照靶标(图12C)类似于MGP-65和NSP13-242 CTL，冷靶抑制测定证实了内源呈递的同源肽的特异性识别(图12D)。ICS测定还证实了表达NS13的靶标的特异性识别(图12E)。

8.从健康供体和功能分析的外周血中扩增NSP13-400肽特异性细胞毒性T细胞

除了HLA-A0101，HLA-A0201和HLA-A0301，HLA-A2402等位基因还涵盖了40％的亚洲人和20％的高加索人(Kessler et al.,2003)。使用相同的工作流，本发明人鉴定了NSP13的HLA-A2402限制性肽NSP13-400(VYIGDPAQL–SEQ ID NO:37)。使用48孔中的9孔显示出体外刺激后，表现出明显的NSP13-400肽四聚体阳性CD8+T细胞群(图22)，分选和扩增后，生成高纯度的CD8+和四聚体+NSP13-400 CTL(图13A)。与MGP-65CTL相似，NSP13-400特异性CTL对肽滴定测定中的同源肽显示出极高识别亲和力，低至10pm浓度(图13B)，并且根据肽滴定测定，NSP13表达靶标Hs-578T-NSP13和M14-NSP13即使在E:T比低至1.25:1时产生极高特异性裂解(图13C和13D)。类似地，冷靶抑制测定显示，NSP13-400 CTL对热靶Hs-578T-NSP13和M14-NSP13具有特异性水平，添加冷靶可显著抑制(图13E和13F)，进一步证实NSP13-400特异性CTL通过识别内源性呈递的同源肽来裂解SARS-CoV-2靶标。

ICS分析还证实了对表达NS13的靶标的特异性识别(图13G)。与其他SARS-CoV-2CTL靶标测定相比，IFN-γ和TNF-α水平显著升高，表明高密度内源性呈递。

总之，使用本发明人的MHC IP洗脱和MS鉴定工作流，本发明人发现了五种源自SARS-CoV-2的结构蛋白MGP和非结构蛋白NSP13的HLA I类限制性肽，这些肽由几个HLA等位基因(HLA-A0101、HLA-A0201、HLA-A0301和HLA-A2402)呈递，覆盖了约80％的高加索和亚洲人群。所有五种肽均具有高免疫原性，并且能够容易地在健康的COVID19阴性供体中引起T细胞应答。所有五种SARS-CoV-2特异性CTL都识别内源性呈递的同源肽，并特异性裂解SARS-CoV-2+靶标。

9.MGP-65特异性T细胞受体工程化T细胞(TCR-T)识别表达SARS-CoV-2MGP-65的靶细胞

作为这些发现可以开发COVID19患者的“现成”SARS-CoV-2特异性T细胞疗法的原理证明，本发明人对MGP-65特异性T淋巴细胞的TCRα和β链进行测序和克隆，并确定是否有可能将特异性和功能转移到外周血淋巴细胞(PBL)。序列注释显示，α链(TCR-α)属于TRAV17*01F/TRAJ50*01F亚型，并且β链(TCR-β)属于TRBV9*02F/TRBJ2-1*01F/TRBD1*01F(表3)。构建了包含与切割肽Furin和P2A连接的全长TCRα链和β链的逆转录病毒载体pMSGV1，并用于感染另一个HLA-A0201健康供体的OKT3激活的异基因PBL。感染5天后，观察到约37％的CD8+四聚体+T细胞群(图14A)，表明在异基因PBL中成功的外源性TCR配对。分选和扩增后，生成高纯度MGP-65特异性TCR-T细胞(图14A)。

为了评价MGP-65特异性TCR-T的功能和特异性，进行细胞毒性⁵¹Cr释放测定(CRA)和细胞内染色(ICS)测定，并与亲本MGP-65特异性CTL系进行比较。MGP-65TCR-T能够在低至10pM的肽浓度下识别滴定的肽脉冲靶标(图14B)，表明TCR-T也显示出对同源肽的高亲和力识别。此外，MGP-65TCR-T特异性裂解表达MGP的靶标A375-MGP和M624-MGP(图14C和14D)，与ICS测定相当，ICS测定表明，与亲本CTL相比，当与MGP表达靶标或MGP-65肽脉冲靶标共培养时，MGP-65-特异性TCR-T产生更高水平的IFN-γ和TNF-α，以及激活标志物CD137和CD69(图14E)。

C.讨论

到目前为止，已经通过计算机预测方法鉴定了近1500个预测的SARS-CoV2的I类表位，并且在某些情况下，还通过使用COVID19患者的PBMC引发T细胞应答来“验证”(Campbellet al.,2020；Grifoni et al.,2020a)。这些肽已被广泛用于评价患者(并且偶尔是健康供体)对COVID19和COVID19疫苗的T细胞应答，并越来越多地用于开发基于T细胞的疗法。然而，尚未证明这1500种预测的肽中是否有任何一种实际上是由SARS-CoV2+细胞处理和呈递的，并代表T细胞识别的天然存在的表位。在被广泛引用的报告中，对被认为是“免疫显性”的预测的SARS-CoV2表位的初步筛选似乎支持了这一前提：发明人发现，这8种预测的肽中有7种无法引发T细胞应答，从而导致对SARS-CoV2+靶标的识别，这表明对这些肽的应答可能是人为的，或充其量是交叉反应(图15)(Agerer et al.,2021；Ahmed et al.,2020；Gaoet al.,2020；Grifoni et al.,2020a；Kar et al.,2020；Safavi et al.,2020；Shomuradova et al.,2020；Sohail et al.,2021；V.Gauttier,2020；William Chour,2020)。迄今为止，尚未对SARS-CoV2表位的免疫原性进行经验验证。

发明人假定SARS-CoV-2的免疫原性表位最好通过直接分析从MHC中洗脱的肽来凭经验限定，然后通过确定此类肽是否可以引发识别表达SARS-CoV-2抗原的靶标的T细胞来验证免疫原性。质谱(MS)是精确鉴定天然表达的抗原表位的理想分析方法，以及使研究人员能够解决与由被感染细胞的抗原蛋白的差异表达和处理相关的复杂性。基于经工程化以表达SARS-CoV2基因的细胞的MHC抗原肽复合物的免疫亲和力捕获，这种方法实现直接分析和鉴定SARS-CoV2免疫肽组。通过引发针对这些候选表位的T细胞应答，发明人证实了对SARS-CoV2+细胞的经验性识别和这些肽的内源性呈递。

在本研究中，发明人鉴定并验证了由结构基因(MGP)和非结构基因(NSP13)表达的5个I类限制性SARS-CoV2表位，这些表位由在>75％的普通人群中流行的I类等位基因(HLA-A*0101,A*0201,A*0301,HLA-A*2402)呈递。使用编码这些等位基因的重组载体，发明人设计了SARS-CoV2膜糖蛋白(MGP)和非结构蛋白13(NSP13)基因的高保守区的表达，回收MHC，洗脱肽，并应用数据依赖性分析液相色谱-串联质谱(DDA MS/MS)，产生超过12000个光谱，然后将其去卷积并过滤成少数候选肽表位。5种肽的免疫原性是基于它们引发肽特异性T细胞的能力来验证的，该T细胞能够识别和杀死SARS-CoV2表达靶细胞，并且在一种实例中，用工程化TCR将外周血淋巴细胞的特异性重定向为SARS-CoV2 MGP。

已充分证明引发有意义的抗病毒T细胞应答的重要性；发现SARS和MERS反应性T细胞具有保护作用(Poland et al.,2020)。最近发现，SARS-CoV-2特异性T细胞应答的出现与持续的病毒清除有关，并强调了开发针对SARS-CoV-2促进细胞免疫的疫苗的重要性(Gallais et al.,2021；Long et al.,2020；Sekine et al.,2020)。

最近，SARS-CoV2变异逃逸株的出现引起了全球的担忧，即在使用目前的疫苗进行免疫接种后，病毒保护可能受到破坏，这引发主要的血清学反应(Abdool Karim and deOliveira,2021；Agerer et al.,2021；Darby and Hiscox,2021；Kuzmina et al.,2021；Plante et al.,2021)。通过靶向非表面、非结构蛋白，在这种情况下是编码病毒解旋酶的nsp13，逃逸变体不太可能发展；事实上，在这里鉴定的表位序列中，没有一种已知的变体含有突变。此外，提出的策略实现鉴定几乎跨越任何SARS-CoV2基因的表位；病毒必需基因靶点的选择提供了合理的基于T细胞的方法来减轻抗原损失变体的选择和长期病毒免疫保护的潜力。

在定义COVID19感染和控制的前景、其自然史、疫苗效力和治疗干预方面，同样重要的是对SARS-CoV2特异性免疫应答的准确测量。虽然目前用于评估II类和I类限制性反应的预测肽库已被广泛使用，并似乎提供了总体免疫应答的衡量标准，但当大多数肽可能不是免疫原性时，SARS-CoV2特异性免疫被很差地限定；使用高度限定的肽子集可以更准确地表示T细胞对COVID19感染的免疫应答。尽管本发明人目前的5个肽组并不广泛，但它确实代表了SARS-CoV2基因组的高保守区，由几种高度流行的等位型呈递，并且可以容易地应用于II类和I类限制性表位。已经准备了由18个表位组成的更广泛的panel，并将对其进行临床相关研究评价。

最后，作为以这种方式定义的表位的免疫原性的进一步证明(通过串联质谱法，然后进行体外经验验证)，本发明人使用编码MGP65特异性T细胞的α链和β链的载体重建了功能性SARS-CoV2特异性TCR。该策略还为过继的基于TCR-T的治疗提供了现成的试剂，并且可以设想一组TCR-T载体，其识别MS/MS限定的SARS-CoV2表位的基质，该表位跨越病毒基因组的高保守区，并代表用于COVID19感染患者的基于细胞治疗的广泛的高流行HLA等位基因。

D.表

表2.鉴定的SARS-CoV-2表位的总结

表3：α和β链总结

表S1.预测MGP或NSP13的高HLA结合肽用于PRM-MS分析

E.STAR方法

血液供体和细胞系：表达HLA-A0101、HLA-A0201、HLA-A0301或HLA-A2402等位基因的健康供体外周血单核细胞(PBMC)样品购自HemaCare(CA,USA)，作为应答T细胞和自体抗原呈递细胞的来源。TAP缺陷型T-B细胞杂交细胞系T2、黑色素瘤细胞系A375(HLA-A0101/0201)、RPMI-7951(HLA-A01011/0201)和Phoenix GP购自ATCC(VA,USA)。黑色素瘤细胞系Hs-578T(HLA-A0301/2402)和M14(HLA-A1101/2402)购自NCI。黑色素瘤细胞系Mel624(HLA-A0201)由Dr.Steven Rosenberg(NCI)馈赠。类淋巴母细胞系(LCL)是在我们实验室中建立的EBV转化的类淋巴母细胞系。癌细胞系保持在包含Hepes(25mM)、L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素(50U/ml)、链霉素(50mg/ml)、丙酮酸钠(10mM)、非必需氨基酸(1mM)和10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(Sigma,MO,USA)中。在含Hepes(25mM)、L-谷氨酰胺(4mM)和10％FBS的DMEM培养基中培养Phoenix-GP。

慢病毒转导：来自SARS-CoV-2的ORF1b的膜糖蛋白(MGP)和非结构蛋白13(NSP13)的cDNA购自Genscript(NJ,USA)，并与GFP融合克隆到慢病毒载体pLVX(TAKARA,CA,USA)中。在该载体中，表达基因由人EF1启动子驱动。将MGP-pLVX或NSP13-pLVX慢病毒载体转染到包装细胞系293T中，与包含VSVG包膜载体的包装载体一起制备慢病毒。A375、Mel624、RPMI-7951、Hs-578T和M14细胞系用MGP-pLVX或NSP13-pLVX慢病毒载体感染，并用纯霉素选择筛选稳定细胞系。通过使用流式细胞术(Novocyte流式细胞仪系统，Agilent，CA，USA)分析GFP的百分比，检测MGP或NSP13基因表达效率。

HLA I类结合肽鉴定：通过免疫沉淀(IP)和串联质谱(MS)方法的HLA-I类结合肽分离和鉴定引用自先前研究(Bradley et al.,2020)。简言之，在补充有蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合物(Roche,CA,USA)的冷NP40裂解缓冲液中均质化约3亿至5亿个经工程化以表达SARS-CoV-2MGP或NSP13基因的细胞。通过随后的离心和过滤步骤清除裂解物。将来自清除的裂解物的HLA I类分子与抗HLA-A、B、C单克隆抗体(W6/32)偶联的Sepharose 4B树脂(GEHealthcare,IL,USA)在室温下孵育2小时。未结合的蛋白通过PBS洗涤。然后,用0.1N乙酸从亲和柱上洗脱HLA分子及其结合肽。使用3kDa截止离心超滤机(Millipore,MO,USA)将分离的肽从HLA分子中分离，然后使用真空离心浓缩。

在质谱采集之前，将肽在水中的0.1％甲酸中复溶。将新Objective PicoFrit纳米喷雾柱(360μm OD x 75μm ID)用Dr.Maisch 3μm ReproSil Pur C18珠粒填充至30cm。使用相同的C18珠粒填充25mm捕获柱，使用360μm x OD 150μm ID的熔融石英毛细管，一端装有Kasil。使用Thermo Scientific EASY-nLC 1200分离肽。溶剂A为在水中的0.1％甲酸，并且溶剂B为在80％乙腈中的0.1％甲酸。对于每次进样，上样10-15μL，并使用25–60分钟从5至40％溶剂B的梯度以250–300nL/min洗脱。Thermo Scientific Q-Exactive HF或OrbitrapExploris 480串联质谱仪用于使用数据相关采集(DDA)或平行反应监测(PRM)采集质谱。

Q-Exactive HF上的DDA采集：前体光谱(400–1600m/z)以60,000分辨率采集，其中自动增益控制(AGC)目标设置为3e6并且最大进样时间为100ms。碎片光谱以15,000分辨率收集，AGC目标设置为1e5，并且最大进样时间为25ms。分离宽度设置为1.6m/z。归一化碰撞能量设置为27。选择用于片段化的前20个最强烈的前体离子。启用电荷排除仅包括+2至+4之间的前体电荷，而AGC阈值为5e3。动态排除设置为10秒，以排除所有同位素簇。

PRM采集Orbitrap Exploris 480：前体光谱(400–1600m/z)以30,000的分辨率收集，并使用标准AGC目标集和自动最大进样时间收集。RF镜头设置为50％的周期时间，3秒。片段光谱扫描范围设置为500–1600，并以15,000的分辨率收集，以标准和自动进样时间设置AGC目标。在计划外的时间模式下分离宽度设置为2m/z。归一化碰撞能量设置为30％。包括目标质子化前体肽离子的m/z值的包括列表在Skyline daily(版本20.2.1.135)中生成。

肽选择和验证：为了分析采集的MS/MS光谱，通过使用Proteome Discoverer 2.3中的Mascot搜索引擎节点(版本2.6)，对照Swiss Prot蛋白质数据库(版本2020_05)搜索光谱。使用单同位素母体和片段离子质量以15ppm的前体肽质量容差和15ppm的片段离子质量容差进行搜索，允许在没有酶规范的情况下两次缺失切割。分类法仅限于智人(Homosapiens)(20,386个序列)和病毒(17,008个序列)。错误发现率(FDR)使用蛋白质组发现器(版本2.3)和蛋白/肽中的“目标诱饵PSM验证器”节点确定，保留FDR≤1％用于进一步分析。通过IEDB T细胞表位预测工具(http://tools.iedb.org/main/tcell/)确定并过滤与这些推定肽的预测结合。

SARS-CoV-2特异性T细胞的生成：根据我们的内源性T细胞(ETC)生成工作流生成抗原特异性T细胞刺激(Chapuis et al.,2016)。简言之，用GM-CSF(800U/mL)和IL-4(500U/mL)处理贴壁PBMC持续6天，以生成未成熟的DC(iDC)，并且然后用iDC与含有TNF-α(10ng/mL)、IL-1β(2ng/mL)、IL-6(1000U/mL)、PGE-2(1000ng/mL)的细胞因子混合物使iDC成熟另外2天。在PBS/HSA中，在HLA匹配的成熟DC上针对MGP-65(FVLAAVYRI–SEQ ID NO:22,HLA-A0201)、NSP13-448(IVDTVSALVY–SEQ ID NO:34,HLA-A0101)、NSP13-242(TLVPQEHYV–SEQID NO:35,HLA-A0201)、NSP13-134(KLFAAETLK–SEQ ID NO:36,HLA-A0301)、NSP13-400(VYIGDPAQL–SEQ ID NO:37,HLA-A2402)(全部购自Genscript,NJ,USA)脉冲候选SARS-CoV-2肽。然后，将肽脉冲的DC与在含Hepes(25mM)，L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素(50U/ml)、链霉素(50mg/ml)、丙酮酸钠(10mM)和10％的人AB血清的RPMI-1640中的自体PBMC共培养。在培养7天后，T细胞培养物如前用肽脉冲的DC再刺激。第二天添加IL-2(10U/mL)和IL-7(5ng/mL)。

分选和扩增：在两个刺激循环后，使用用HLA匹配的SARS-CoV2肽折叠的定制PE缀合的MHC四聚体和APC-Cy7缀合的抗CD8抗体(Biolegend,CA,USA)对每个孔的等分试样进行染色。通过流式细胞术(NovoCyte Flow Cytometer Systems,Agilent,CA,USA)洗涤细胞并分析细胞。合并四聚体阳性染色孔，并使用流式细胞术分选CD8/四聚体双阳性群体(ARIAII分选仪,BD,CA,USA)，以及然后使用快速扩增方案(REP)在含有RPMI-1640的无菌25mL烧瓶中扩增，其中含有Hepes(25mM)、L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素(50U/ml)、链霉素(50mg/ml)、丙酮酸钠(10mM)、10％胎牛血清(FBS)、辐照的PBMC和LCL饲养细胞，如前所述(Chapuis etal.,2012)。扩增后，用抗CD8抗体和MGP-65、NSP13-448、NSP13-242、NSP13-134或NSP13-400四聚体染色再次测定抗原特异性T细胞的纯度。

SARS-CoV-2特异性T细胞的功能分析：使用标准铬(⁵¹Cr)释放测定(CRA)证实扩增后纯化的SARS-CoV-2特异性T细胞的细胞毒性。进行肽剂量滴定实验以测试同源肽对SARS-CoV-2CTL的识别。MGP-65或NSP13-242肽脉冲T2细胞(HLA-A2+)的滴定浓度用于评价MGP-65或NSP13-242 CTL；NSP13-448肽脉冲的A375细胞(HLA-A1+)，用于NSP13-448 CTL；NSP13-134肽脉冲的Hs-578T细胞(HLA-A3+)，用于NSP13-134 CTL；以及NSP13-400脉冲的M14细胞(HLA-A24+)，用于NSP13-400 CTL。在1ml肿瘤细胞培养基中用100μCi ⁵¹Cr(Perkin Elmer,CA,USA)标记靶细胞1小时，然后以每孔2,000个靶细胞的速度洗涤和铺板，一式三份。MGP-65、NSP13-448、NSP13-242、NSP13-134或NSP13-400特异性T细胞以20:1的效应细胞与靶细胞(E:T)比添加，进行4小时。从孔中收集上清液，并用γ辐射计数器测量⁵¹Cr。计算特异性靶细胞裂解的百分比，校正背景⁵¹Cr释放和相对于NP40裂解的靶细胞测量的最大⁵¹Cr释放(Pollack et al.,2014)。

将经工程化以表达MGP或NSP13基因的肿瘤细胞系用作靶标，以评价SARS-CoV-2特异性T细胞对内源性递呈表位的识别。A375-MGP、Mel624-MGP(HLA-A0201+,MGP+)、A375-GFP、Mel624-GFP(HLA-A0201+,GFP+)用于评价MGP-65特异性T细胞活性；A375-NSP13、RPMI-7951-NSP13(HLA-A0101+,MGP+)、A375-GFP、RPMI-7951-GFP(HLA-A0101+,GFP+)用于NSP13-448特异性T细胞活性；A375-NSP13、Mel624-NSP13(HLA-A0201+,NSP13+)、A375-GFP、Mel624-GFP用于NSP13-242特异性T细胞活性；Hs-578T-NSP13(HLA-A0301+,HLA-A2402+,NSP13+)、Hs-578T-GFP(HLA-A0301+,HLA-A2402+,GFP+)用于NSP13-134特异性T细胞活性和M14-NSP13(HLA-A2402+,NSP13+)、Hs-578T-NSP13、M14-GFP(HLA-A2402+,GFP+)、Hs-578T-GFP用于NSP13-400特异性T细胞活性。⁵¹Cr标记的靶细胞与SARS-CoV-2特异性T细胞以不同的效应细胞与靶细胞(E:T)比共同培养。孵育期后，如上所述确定抗原特异性靶细胞裂解。

冷靶抑制测定：为了证实表位和抗原对相关肿瘤靶点的特异性，如前所述进行冷靶抑制测定(Park et al.,2017)。对于MGP-65特异性T细胞测试，用⁵¹Cr标记的A375-MGP和Mel624 MGP细胞被用作“热”靶。用MGP-65肽(10μg/ml)脉冲的非放射性标记的T2细胞作为冷靶。用M26对照肽(ELAGIGILTV–SEQ ID NO:39,HLA-A0201)脉冲的非放射性标记的T2细胞作为对照冷靶。在将MGP-65特异性T细胞与热靶共培养之前，添加冷靶(数量是放射性标记的热靶的10倍或20倍)，并与给定的抗原特异性T细胞孵育一小时。⁵¹Cr标记的热靶以E:T比(20:1)添加并再孵育4小时。孵育期后，通过MGP-65特异性T细胞的靶细胞裂解如上所述确定。类似地，对于NSP13-448特异性T细胞，使用用⁵¹Cr标记的A375-NSP13和RPMI-7951-NSP13细胞作为热靶。用NSP13-448肽或VGLL1 HLA-A0101肽(LSELETPGKY–SEQ ID NO:40)脉冲的非放射性标记的A375细胞(Bradley et al.,2020)分别用作冷靶和对照冷靶。对于NSP13-242特异性T细胞，使用用⁵¹Cr标记的A375-NSP13和Mel624-NSP13细胞作为热靶。用NSP13-242肽或M26肽脉冲的非放射性标记的T2细胞分别用作冷靶和对照冷靶。对于NSP13-134特异性T细胞，使用⁵¹Cr标记的Hs-578T-NSP13细胞作为热靶。用NSP13-134肽或A3对照肽(KVFPCALINK–SEQ ID NO:41,HLA-A0301)脉冲的非放射性标记的Hs-578T细胞作为冷靶或对照冷靶。对于NSP13-400特异性T细胞测试，使用⁵¹Cr标记的Hs-578T-NSP13和M14-NSP13细胞作为热靶。用NSP13-400肽或MAGEA4-HLA-A2402肽(NYKRCFPVI–SEQ ID NO:42)脉冲的非放射性标记的M14细胞作为冷靶或对照冷靶。

细胞内染色(ICS)测定：在存在布雷菲德菌素A(BFA)(Biolegend,CA,USA)的情况下，将100万个SARS-CoV-2特异性T细胞(MGP-65、NSP13-448、NSP13-242、NSP13-134、NSP13-400)与1×10⁵个相关靶细胞(10:1E:T比)共培养过夜，次日用APC-Cy7偶联的抗CD8抗体(Biolegend,CA,USA)染色。洗涤后，用细胞内固定和渗透缓冲液组(eBioscienceTM,NY,USA)固定并渗透细胞，并且然后用APC偶联的抗CD137、FITC偶联的抗CD69、PE偶联的抗IFN-γ、太平洋蓝偶联的抗TNF-α抗体(均购自Biolegend,CA,USA)染色。洗涤后，使用流式细胞术测定(LSRFortessa X-20Analyzer,BD,CA,USA)确定CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α的表达水平。

MGP-65特异性T细胞的T细胞受体(TCR)基因克隆和测序：使用cDNA 5’末端快速扩增(5’RACE-PCR)方案(TAKARA,CA,USA)从功能性MGP-65特异性T细胞中克隆TCR的α链和β链，如前所述(Scotto-Lavino et al.,2006)，稍作修改。简言之，使用RNeasy试剂盒(QIAGEN,MD,USA)从MGP-65特异性T细胞中提取总RNA，使用SMARTer RACE 5'/3’试剂盒(TAKARA,CA,USA)生成第一链cDNA，从而在总cDNA的5’-末端生成通用序列。使用该cDNA作为模板，用5’-末端有义通用引物和3’-末端反义特异性引物退火至TCRα链或β链恒定结构域扩增TCRα和β链。对于α链，使用3’-末端反义特异性引物TRAC:5’- (SEQ ID NO:84)。对于β链，使用3'-末端反义特异性引物TRBC:5'- (SEQID NO:85)。加粗斜体序列是用于In-Fusion(Sigma(MO,USA))的重叠序列。使用PureLink^TM快速凝胶提取试剂盒(Life Technologies Corporation,NY,USA)纯化PCR产物，并使用InFusion克隆方案(TAKARA,CA,USA)克隆到pRACE载体中。然后，使用Sanger测序方法对包含TCRα链或β链基因的载体进行测序。通过IMGT/V-QUEST搜索工具(可见于万维网上imgt.org/IMGT vquest)分析TCRα链和β链的库。

MGP-65TCR逆转录病毒载体构建和逆转录病毒生成：源自MGP-65特异性T细胞的TCRα链和β链的全长cDNA用Furin-SGSG-P2A自切割连接肽组装，以允许两条链的等同表达(Wargo et al.,2009)。为了改善外源性TCRα链和β链之间的配对，并减少与内源性人α链和β链的错误配对，根据先前的报道，在TCRα和β链的恒定结构域中引入Cys突变(Kuball etal.,2007)。此外，为了提高外源性TCR的表达水平，进行密码子优化，并通过GenScript(NJ,USA)合成优化的TCR序列。将整个TCR片段克隆到逆转录病毒载体pMSGV1中，该载体利用MSCV长末端重复序列(LTR)来驱动基因表达。

根据先前描述的方案生成重组逆转录病毒(Wargo et al.,2009)。简言之，将包含源自MGP-65特异性CTL的全长TCR的10μg逆转录病毒载体和5μg包膜载体RD114在Opti-MEM培养基(Life Technologies Corporation,NY,USA)中与Lipofectamine 3000试剂(LifeTechnologies Corporation,NY,USA)共转染到包装细胞系Phoenix-GP中。孵育后，收获逆转录病毒上清液，离心清除，以及然后用于转导同种异体PBMC以表达外源性TCR或储存在-80℃下。

MGP-65特异性TCR工程化T细胞(TCR-T)生成：使用先前描述的离心方案(spinoculation protocol)进行TCR-T生成(Hughes et al.,2005)。在补充有5％人AB血清的AIM-V培养基(Life Technologies Corporation,NY,USA)中，用50ng/ml OKT3、300U/mlIL-2激活HLA-A0201阳性健康供体PBMC(1×10⁶/ml)进行2-3天。将4-6ml逆转录病毒上清液负载到RetroNectin包被的(20μg/ml)(TAKARA,CA,USA)非组织培养物处理的六孔板上，并在32℃下以2000g离心2小时。从孔中吸出逆转录病毒上清液；将在补充有5％人AB血清和300U/ml IL-2的AIM-V培养基中的2×10^6激活的PBMC添加至孔中，然后以1000g离心10分钟。将TCR基因转导的PBMC再培养3-5天，并通过抗CD8和四聚体染色测定TCR表达。使用上述扩增方案分选和扩增CD8+、四聚体+细胞以生成高纯度的MGP-65特异性TCR-T。MGP-65特异性TCR-T的功能分析如上所述通过CRA和ICS测定进行。

统计分析：使用GraphPad Prism版本7.03进行数据分析。正态分布数据采用参数检验(ANOVA或非配对t检验)进行分析。

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根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法均可以在没有过度实验的情况下进行和执行。虽然已经根据优选实施方式或方面描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以将变化应用于本文所述的方法、方法的步骤或步骤序列。更具体地，将显而易见的是，化学和生理上相关的某些试剂可以取代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。本领域技术人员显而易见的所有这些类似的取代和修饰被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

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Claims

1.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列，或分别具有与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1和/或CDR2。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。

6.根据权利要求5所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-a可变区和恒定区。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

8.根据权利要求7所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。

9.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

10.根据权利要求9所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

11.根据权利要求10所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:12和SEQID NO:13的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:12和SEQID NO:13具有至少80％序列同一性的CDR1和/或CDR2。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。

14.根据权利要求13所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-a可变区和恒定区。

15.根据权利要求9-14中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述信号肽包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的氨基酸序列。

17.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:21的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

18.根据权利要求17所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

19.根据权利要求18所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:19和20的氨基酸序列，或分别具有与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1和/或CDR2。

20.根据权利要求17-19中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

21.根据权利要求17-20中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体β(TCR-b)可变区。

22.根据权利要求21所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-b可变区和恒定区。

23.根据权利要求17-22中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

24.根据权利要求23所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的氨基酸序列。

25.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:92的氨基酸序列或与SEQ ID NO:92具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

26.根据权利要求25所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

27.根据权利要求26所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:90和91的氨基酸序列，或分别具有与SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1和/或CDR2。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:88的氨基酸序列或与SEQ ID NO:88具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

29.根据权利要求25-28中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。

30.根据权利要求29所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-a可变区和恒定区。

31.根据权利要求25-30中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

32.根据权利要求31所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列或与SEQ ID NO:89具有至少80％同一性的氨基酸序列。

33.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:99具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

34.根据权利要求33所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

35.根据权利要求34所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:97和SEQID NO:98的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:97和SEQID NO:98具有至少80％序列同一性的CDR1和/或CDR2。

36.根据权利要求33-35中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:95的氨基酸序列或与SEQ ID NO:95具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-b)可变区。

38.根据权利要求37所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-b可变区和恒定区。

39.根据权利要求33-38中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

40.根据权利要求39所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:96的氨基酸序列或与SEQ ID NO:96具有至少80％同一性的氨基酸序列。

41.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:106的氨基酸序列或与SEQ ID NO:106具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

42.根据权利要求41所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

43.根据权利要求42所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:104和105的氨基酸序列，或分别具有与SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1和/或CDR2。

44.根据权利要求41-43中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:102的氨基酸序列或与SEQ ID NO:102具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

45.根据权利要求41-44中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。

46.根据权利要求45所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-a可变区和恒定区。

47.根据权利要求41-46中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

48.根据权利要求47所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:103的氨基酸序列或与SEQ ID NO:103具有至少80％同一性的氨基酸序列。

49.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:113的氨基酸序列或与SEQ ID NO:113具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

50.根据权利要求49所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

51.根据权利要求50所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:111和SEQID NO:112的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112具有至少80％序列同一性的CDR1和/或CDR2。

52.根据权利要求49-51中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:109的氨基酸序列或与SEQ ID NO:109具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

53.根据权利要求49-52中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-b)可变区。

54.根据权利要求53所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-b可变区和恒定区。

55.根据权利要求49-54中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

56.根据权利要求55所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与SEQ ID NO:110具有至少80％同一性的氨基酸序列。

57.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:120的氨基酸序列或与SEQ ID NO:120具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

58.根据权利要求57所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

59.根据权利要求58所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:118和119的氨基酸序列，或分别具有与SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1和/或CDR2。

60.根据权利要求57-59中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:116的氨基酸序列或与SEQ ID NO:116具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

61.根据权利要求57-60中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。

62.根据权利要求61所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-a可变区和恒定区。

63.根据权利要求57-62中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

64.根据权利要求63所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与SEQ ID NO:117具有至少80％同一性的氨基酸序列。

65.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:127的氨基酸序列或与SEQ ID NO:127具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

66.根据权利要求65所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

67.根据权利要求66所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:125和SEQID NO:126的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126具有至少80％序列同一性的CDR1和/或CDR2。

68.根据权利要求65-67中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:123的氨基酸序列或与SEQ ID NO:123具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

69.根据权利要求65-68中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-b)可变区。

70.根据权利要求69所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-b可变区和恒定区。

71.根据权利要求65-70中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

72.根据权利要求71所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:124的氨基酸序列或与SEQ ID NO:124具有至少80％同一性的氨基酸序列。

73.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQID NO:134的氨基酸序列或与SEQ ID NO:134具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

74.根据权利要求73所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

75.根据权利要求74所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:132和133的氨基酸序列，或分别具有与SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1和/或CDR2。

76.根据权利要求73-75中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQID NO:130的氨基酸序列或与SEQ ID NO:130具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

77.根据权利要求73-76中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-a)可变区。

78.根据权利要求77所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-a可变区和恒定区。

79.根据权利要求73-78中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

80.根据权利要求79所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列或与SEQ ID NO:131具有至少80％同一性的氨基酸序列。

81.一种包括抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包括包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列或与SEQ ID NO:141具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

82.根据权利要求81所述的多肽，其中，所述可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3。

83.根据权利要求82所述的多肽，其中，所述可变区包括分别具有SEQ ID NO:139和SEQID NO:140的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:140具有至少80％序列同一性的CDR1和/或CDR2。

84.根据权利要求81-83中任一项所述的多肽，其中，所述可变区包括SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与SEQ ID NO:137具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

85.根据权利要求81-84中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括T细胞受体α(TCR-b)可变区。

86.根据权利要求85所述的多肽，其中，所述多肽包括TCR-b可变区和恒定区。

87.根据权利要求81-86中任一项所述的多肽，其中，所述多肽进一步包括信号肽。

88.根据权利要求87所述的多肽，其中，所述信号肽包括SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与SEQ ID NO:138具有至少80％同一性的氨基酸序列。

89.一种工程化T细胞受体(TCR)，其包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，其中所述TCR-a肽包括：

(i)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；或

(ii)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；

并且所述TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

90.根据权利要求89所述的TCR，其中，所述TCR包括TCR-b多肽和TCP-a多肽，所述TCR-b多肽包括包含CDR1、CDR2和CDR3的可变区，并且所述TCP-a多肽包括包含CDR1、CDR2和CDR3的可变区。

91.根据权利要求90所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括：

(i)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1；或

(ii)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1；

和/或所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。

92.根据权利要求90或91所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括：

(i)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2；或

(ii)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2；

和/或所述TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。

93.根据权利要求90-92中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括：

(i)SEQ ID NO:5、6和7的氨基酸序列；或

(ii)SEQ ID NO:12、13和14的氨基酸序列；和

并且其中所述TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列。

94.根据权利要求90-93中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包括：

(i)SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；或

(ii)SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；

并且所述TCR-b多肽包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

95.一种工程化T细胞受体(TCR)，其包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，其中所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列或与SEQ ID NO:92具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；并且所述TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与SEQ ID NO:99具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

96.根据权利要求95所述的TCR，其中，所述TCR包括TCR-b多肽和TCP-a多肽，所述TCR-b多肽包括包含CDR1、CDR2和CDR3的可变区，并且所述TCP-a多肽包括包含CDR1、CDR2和CDR3的可变区。

97.根据权利要求96所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:90具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1；和/或所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列或与SEQ ID NO:97具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。

98.根据权利要求96或97所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:91具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2；和/或所述TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:98具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。

99.根据权利要求96-98中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:90、91和92的氨基酸序列；并且其中所述TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ

ID NO:97、98和99的氨基酸序列。

100.根据权利要求96-99中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包括SEQ ID NO:88的氨基酸序列或与SEQ ID NO:88具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；并且所述TCR-b多肽包括SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与SEQ ID NO:95具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

101.一种工程化T细胞受体(TCR)，其包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，其中所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列或与SEQ ID

NO:106具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；并且所述

TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列或与SEQ ID

NO:113具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

102.根据权利要求101所述的TCR，其中，所述TCR包括TCR-b多肽和

TCP-a多肽，所述TCR-b多肽包括包含CDR1、CDR2和CDR3的可变区，并且所述TCP-a多肽包括包含CDR1、CDR2和CDR3的可变区。

103.根据权利要求102所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括具有SEQ

ID NO:104的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:104具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1；和/或所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID

NO:111的氨基酸序列或与SEQ ID NO:111具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。

104.根据权利要求102或103所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:105具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2；和/或所述TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:112具有至少80％

序列同一性的氨基酸序列的CDR2。

105.根据权利要求102-104中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:104、105和106的氨基酸序列；并且其中所述TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:111、112和113的氨基酸序列。

106.根据权利要求102-105中任一项所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括SEQ ID NO:102的氨基酸序列或与SEQ ID NO:102具有至少70％

序列同一性的氨基酸序列；并且所述TCR-b多肽包括SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与SEQ ID NO:109具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

107.一种工程化T细胞受体(TCR)，其包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，其中所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列或与SEQ ID

NO:120具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；并且所述

TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列或与SEQ ID

NO:127具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

108.根据权利要求107所述的TCR，其中，所述TCR包括TCR-b多肽和

109.根据权利要求108所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括具有SEQ

ID NO:118的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:118具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1；和/或所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID

NO:125的氨基酸序列或与SEQ ID NO:125具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。

110.根据权利要求108或109所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:119具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2；和/或所述TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:126具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。

111.根据权利要求108-110中任一项所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:118、119和120的氨基酸序列；并且其中所述TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:125、126和127的氨基酸序列。

112.根据权利要求108-111中任一项所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与SEQ ID NO:116具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；并且所述TCR-b多肽包括SEQ ID NO:123的氨基酸序列或与SEQ ID NO:123具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

113.一种工程化T细胞受体(TCR)，其包括TCR-a多肽和TCR-b多肽，其中所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列或与SEQ ID NO:134具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；并且所述TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列或与SEQ IDNO:141具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

114.根据权利要求113所述的TCR，其中，所述TCR包括TCR-b多肽和TCP-a多肽，所述TCR-b多肽包括包含CDR1、CDR2和CDR3的可变区，并且所述TCP-a多肽包括包含CDR1、CDR2和CDR3的可变区。

115.根据权利要求114所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括具有SEQID NO:132的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:132具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1；和/或所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列或与SEQ ID NO:139具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR1。

116.根据权利要求114或115所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:133具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2；和/或所述TCR-b多肽包括具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:140至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR2。

117.根据权利要求114-116中任一项所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO:132、133和134的氨基酸序列；并且其中所述TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包括SEQ ID NO:139、140和141的氨基酸序列。

118.根据权利要求114-117中任一项所述的TCR，其中，所述TCR-a多肽包括SEQ ID NO:130的氨基酸序列或与SEQ ID NO:130具有至少70％

序列同一性的氨基酸序列；并且所述TCR-b多肽包括SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与SEQ ID NO:137具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

119.根据权利要求89-118中任一项所述的TCR，其中，所述TCR包括修饰或是嵌合的。

120.根据权利要求89-119中任一项所述的TCR，其中，所述TCR-b多肽和TCR-a多肽可操作地连接。

121.根据权利要求120所述的TCR，其中，所述TCR-b多肽和TCR-a多肽通过肽键可操作地连接。

122.根据权利要求121所述的TCR，其中，所述TCR是单链TCR。

123.根据权利要求121所述的TCR，其中，所述TCR-b多肽和TCR-a多肽位于同一多肽上，并且其中所述TCP-b位于所述TCR-a的氨基近端。

124.根据权利要求121所述的TCR，其中，所述TCR-b多肽和TCR-a多肽位于同一多肽上，并且其中所述TCR-a位于所述TCR-b的氨基近端。

125.根据权利要求122-124中任一项所述的TCR，其中，所述TCR包括所述TCR-a和TCR-b多肽之间的接头。

126.根据权利要求125所述的TCR，其中，所述接头包括甘氨酸和丝氨酸残基。

127.一种包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少60％序列同一性的肽。

128.根据权利要求127所述的肽，其中，所述肽包括SEQ ID NO:22。

129.根据权利要求127所述的肽，其中，所述肽包括SEQ ID NO:22-81中一项的至少6个连续氨基酸。

130.根据权利要求127所述的肽，其中，所述肽包括SEQ ID NO:22-81中一项的肽的至少7个连续氨基酸。

131.根据权利要求127所述的肽，其中，所述肽包括SEQ ID NO:22-81中一项的肽的至少8个连续氨基酸。

132.根据权利要求127所述的肽，其中，所述肽包括SEQ ID NO:22-81中一项的肽的至少9个连续氨基酸。

133.根据权利要求127所述的肽，其中，所述肽包括SEQ ID NO:22-81中一项的肽的至少10个连续氨基酸。

134.根据权利要求127-133中任一项所述的肽，其中，所述肽的长度为13个氨基酸或更少。

135.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少63％序列同一性。

136.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少66％序列同一性。

137.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少70％序列同一性。

138.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少72％序列同一性。

139.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少77％序列同一性。

140.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少80％序列同一性。

141.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少81％序列同一性。

142.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少88％序列同一性。

143.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有至少90％序列同一性。

144.根据权利要求127-134中任一项所述的肽，其中，所述肽包括与SEQ ID NO:22-81中一项的肽具有100％序列同一性。

145.根据权利要求134-144中任一项所述的肽，其中，所述肽由9个氨基酸组成。

146.根据权利要求134-144中任一项所述的肽，其中，所述肽由10个氨基酸组成。

147.根据权利要求134-144中任一项所述的肽，其中，所述肽由11个氨基酸组成。

148.根据权利要求134-144中任一项所述的肽，其中，所述肽由12个氨基酸组成。

149.根据权利要求134-144中任一项所述的肽，其中，所述肽由13个氨基酸组成。

150.根据权利要求127-149中任一项所述的肽，其中，所述肽由SEQ ID NO:22-81中一项的肽组成。

151.根据权利要求127-150中任一项所述的肽，其中，所述肽是免疫原性的。

152.根据权利要求127-151中任一项所述的肽，其中，所述肽经修饰。

153.根据权利要求152所述的肽，其中，所述修饰包括与分子缀合。

154.根据权利要求152或153所述的肽，其中，所述分子包括抗体、脂质、佐剂或检测部分。

155.根据权利要求127-154中任一项所述的肽，其中，所述肽包括SEQ ID NO:22-38中任一项或与SEQ ID NO:22-38中任一项具有至少60％序列同一性的肽或由其组成。

156.根据权利要求127-155中任一项所述的肽，其中，相对于SEQ ID NO:22-81中一项的肽，所述肽具有1、2或3个置换。

157.一种包括根据权利要求127-156中任一项的肽的多肽。

158.一种包括至少一种MHC多肽和权利要求1-157中任一项的肽或多肽的组合物。

159.根据权利要求158所述的组合物，其中，所述MHC多肽和/或肽与检测标签缀合。

160.根据权利要求158或159所述的组合物，其中，所述MHC多肽和肽可操作地连接。

161.根据权利要求160所述的组合物，其中，所述MHC多肽和肽通过肽键可操作地连接。

162.根据权利要求161所述的组合物，其中，所述MHC多肽和肽通过范德华力可操作地连接。

163.根据权利要求158-162中任一项所述的组合物，其中，至少两种MHC多肽与一种肽连接。

164.根据权利要求158-163中任一项所述的组合物，其中，MHC多肽与肽的平均比为4:1。

165.一种分子复合物，包括根据权利要求127-中任一项所述的肽或根据权利要求157的多肽和MHC多肽。

166.一种肽特异性结合分子，其中，所述分子特异性结合根据权利要求127-157中任一项所述的肽或多肽或根据权利要求165的分子复合物。

167.根据权利要求166所述的结合分子，其中，所述结合分子是抗体、TCRmimc抗体、scFV、camellid、适体或DARPIN。

168.一种产生冠状病毒特异性免疫效应细胞的方法，包括：

(a)获得免疫效应细胞的起始群体；和

(b)使所述免疫效应细胞的起始群体与根据权利要求127-157中任一项的肽或多肽或根据权利要求165的分子复合物接触，从而生成肽特异性免疫效应细胞。

169.根据权利要求168所述的方法，其中，所述冠状病毒是分离自蝙蝠的冠状病毒。

170.根据权利要求168或169所述的方法，其中，所述冠状病毒是SARS-CoV或SARS-CoV-2。

171.根据权利要求168-170中任一项所述的方法，其中，接触进一步被限定为将所述免疫效应细胞的起始群体与抗原呈递细胞(APC)、人工抗原呈递细胞(aAPC)或人工抗原呈递表面(aAPS)共培养；其中所述APC、aAPC或aAPS在其表面上呈递所述肽。

172.根据权利要求171所述的方法，其中，所述APC是树突细胞。

173.根据权利要求168-172中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞。

174.根据权利要求168-173中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞已从间充质干细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPS)分化。

175.根据权利要求173所述的方法，其中，所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或γδT细胞。

176.根据权利要求173所述的方法，其中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

177.根据权利要求168-176中任一项所述的方法，其中，获得包括从外周血单核细胞(PBMC)中分离所述免疫效应细胞的起始群体。

178.根据权利要求168-177中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞的起始群体从受试者获得。

179.根据权利要求178所述的方法，其中，所述受试者是人。

180.根据权利要求179所述的方法，其中，所述受试者患有冠状病毒感染。

181.根据权利要求180所述的方法，其中，所述冠状病毒感染包括COVID-19或SARS。

182.根据权利要求168-181中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有冠状病毒感染的一种或多种症状。

183.根据权利要求168-181中任一项所述的方法，其中，所述受试者没有冠状病毒感染的任何症状。

184.根据权利要求168-181中任一项所述的方法，其中，所述受试者已被诊断患有冠状病毒感染。

185.根据权利要求178-183中任一项所述的方法，其中，所述受试者尚未被诊断患有冠状病毒感染。

186.根据权利要求178-185中任一项所述的方法，其中，所述受试者既往已接受冠状病毒感染治疗。

187.根据权利要求178-186中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在所述共培养之前，将所述肽或编码所述肽的核酸引入至所述树突细胞中。

188.根据权利要求187所述的方法，其中，通过电穿孔引入所述肽或编码所述肽的核酸。

189.根据权利要求187所述的方法，其中，通过将所述肽或编码所述肽的核酸添加至所述树突细胞培养基中来引入所述肽或编码所述多肽的核酸。

190.根据权利要求187-189中任一项所述的方法，其中，将所述免疫效应细胞与其中已引入所述肽或编码所述肽的核酸的树突细胞的第二群共培养。

191.根据权利要求187-190中任一项所述的方法，其中，在所述共培养后，从所述免疫效应细胞中纯化CD8或CD4阳性和冠状病毒肽MHC四聚体阳性T细胞群。

192.根据权利要求191所述的方法，其中，通过以下生成冠状病毒特异性免疫效应细胞的克隆群体：限制性或连续稀释，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆。

193.根据权利要求192所述的方法，其中，所述方法进一步包括从肽特异性免疫效应细胞的克隆群体中克隆T细胞受体(TCR)。

194.根据权利要求193所述的方法，其中，克隆所述TCR是克隆TCRα和β链。

195.根据权利要求193或194所述的方法，其中，使用5’-cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆所述TCR。

196.根据权利要求195所述的方法，其中，将克隆的TCR亚克隆至表达载体中。

197.根据权利要求196所述的方法，其中，所述表达载体是逆转录病毒或慢病毒载体。

198.根据权利要求196或197所述的方法，其中，所述方法进一步包括用所述表达载体转导宿主细胞以生成表达所述TCR的工程化细胞。

199.根据权利要求198所述的方法，其中，所述宿主细胞是免疫细胞。

200.根据权利要求168-199中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是T细胞，并且所述工程化细胞是工程化T细胞。

201.根据权利要求200所述的方法，其中，所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4+T细胞或γδT细胞，并且所述工程化细胞是工程化T细胞。

202.根据权利要求168-201中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞的起始群体从患有SARS-Cov-2感染的受试者获得，并且所述宿主细胞对于所述受试者是同种异体的或自体的。

203.根据权利要求198-202中任一项所述的方法，其中，从转导的宿主细胞中纯化CD8或CD4阳性和肽MHC四聚体阳性的工程化T细胞的群。

204.根据权利要求168-203中任一项所述的方法，其中，通过以下生成肽特异性工程化T细胞的克隆群体：限制性或连续稀释，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆。

205.一种克隆冠状病毒T细胞受体(TCR)的方法，所述方法包括

(a)获得免疫效应细胞的起始群体；

(b)使所述免疫效应细胞的起始群体与根据权利要求216-157中任一项的冠状病毒肽或多肽接触，从而生成冠状病毒特异性免疫效应细胞；

(c)纯化所述冠状病毒肽特异性免疫效应细胞，

(d)从纯化的免疫效应细胞中分离TCR序列。

206.根据权利要求205所述的方法，其中，所述冠状病毒是分离自蝙蝠的冠状病毒。

207.根据权利要求205或206所述的方法，其中，所述冠状病毒是SARS-CoV或SARS-CoV-2。

208.根据权利要求206-207中任一项所述的方法，其中，接触进一步被定义为将所述免疫效应细胞的起始群体与抗原呈递细胞(APC)共培养，其中所述APC在其表面上呈递所述冠状病毒肽。

209.根据权利要求208所述的方法，其中，所述APC是树突细胞。

210.根据权利要求205-209中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞。

211.根据权利要求205-210中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞已从间充质干细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPS)分化。

212.根据权利要求210或211所述的方法，其中，所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或γδT细胞。

213.根据权利要求210-212中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

214.根据权利要求205-213中任一项所述的方法，其中，获得包括从外周血单核细胞(PBMC)中分离所述免疫效应细胞的起始群体。

215.根据权利要求205-214中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞的起始群体从受试者获得。

216.根据权利要求215所述的方法，其中，所述受试者是人。

217.根据权利要求215或216所述的方法，其中，所述受试者患有冠状病毒感染。

218.根据权利要求217所述的方法，其中，所述受试者患有COVID-19或SARS。

219.根据权利要求205-218中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在所述共培养之前，将所述冠状病毒肽或编码所述冠状病毒肽的核酸引入至所述树突细胞中。

220.根据权利要求219所述的方法，其中，通过电穿孔引入所述肽或编码所述肽的核酸。

221.根据权利要求219所述的方法，其中，通过将所述肽或编码所述肽的核酸添加至所述树突细胞的培养基中来引入所述肽或编码所述肽的核酸。

222.根据权利要求219所述的方法，其中，将所述免疫效应细胞与其中已引入所述冠状病毒肽或编码所述冠状病毒肽的核酸的树突细胞的第二群共培养。

223.根据权利要求219所述的方法，其中，纯化被限定为在所述共培养后，从所述免疫效应细胞中纯化CD8阳性和冠状病毒肽MHC四聚体阳性T细胞的群。

224.根据权利要求223所述的方法，其中，通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化所述CD8阳性和冠状病毒肽MHC四聚体阳性T细胞的群。

225.根据权利要求224所述的方法，其中，纯化进一步包括通过以下生成冠状病毒特异性免疫效应细胞的克隆群体：限制性或连续稀释分选的细胞，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆。

226.根据权利要求225所述的方法，其中，分离被限定为从所述冠状病毒特异性免疫效应细胞的克隆群体中克隆T细胞受体(TCR)。

227.根据权利要求205-226中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括对一种或多种TCRα和/或β基因进行测序和/或进行通过胞旁热点对淋巴细胞相互作用进行分组(GLIPH)分析。

228.根据权利要求226或227所述的方法，其中，克隆所述TCR是克隆TCRα链和β链。

229.根据权利要求228所述的方法，其中，使用5’-cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆所述TCRα链和β链。

230.根据权利要求229所述的方法，其中，将克隆的TCR亚克隆至表达载体中。

231.根据权利要求230所述的方法，其中，所述表达载体包括TCRα序列和TCRβ序列之间的接头结构域。

232.根据权利要求231所述的方法，其中，所述接头结构域包括编码一个或多个肽切割位点的序列。

233.根据权利要求232所述的方法，其中，所述一个或多个切割位点是Furin切割位点和/或P2A切割位点。

234.根据权利要求233所述的方法，其中，所述TCRα序列和TCRβ序列通过IRES序列连接。

235.根据权利要求230-234中任一项所述的方法，其中，所述表达载体是逆转录病毒或慢病毒载体。

236.根据权利要求235所述的方法，其中，用所述表达载体转导宿主细胞以生成表达所述TCRα链和β链的工程化细胞。

237.根据权利要求236所述的方法，其中，所述宿主细胞是免疫细胞。

238.一种冠状病毒特异性工程化T细胞，根据权利要求168-267中任一项所述的方法产生。

239.一种由权利要求168-237中任一项所述的方法产生的TCR。

240.一种融合蛋白，包括根据权利要求89-126或239中任一项所述的TCR，或其肽结合片段和CD3结合区。

241.根据权利要求240所述的融合蛋白，其中所述CD3结合区包括CD3特异性片段抗原结合(Fab)、单链可变片段(scFv)、单域抗体或单链抗体。

242.根据权利要求89-126或239中任一项所述的TCR，或根据权利要求240或241所述的融合蛋白，其中，所述TCR或融合蛋白与检测剂或治疗剂缀合。

243.根据权利要求242所述的TCR或融合蛋白，其中，所述剂包括荧光分子、辐射分子或毒素。

244.一种核酸，编码根据权利要求1-88或157中任一项所述的多肽、根据权利要求89-126、239、242或243中任一项所述的TCR、根据权利要求127-156中任一项所述的肽或根据权利要求240-243中任一项所述的融合蛋白。

245.根据权利要求244所述的核酸，其中，所述核酸是RNA。

246.根据权利要求245所述的核酸，其中，所述核酸是编码所述肽或多肽或所述肽和多肽的互补物的DNA或cDNA。

247.根据权利要求244所述的核酸，其中，所述核酸与SEQ ID NO:1、8、15或其片段具有至少70％序列同一性。

248.一种核酸表达载体，包括根据权利要求244-247中任一项所述的一种或多种核酸。

249.根据权利要求248所述的载体，其中，所述载体包括引导所述核酸表达的启动子。

250.根据权利要求249所述的载体，其中，所述启动子包括鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。

251.根据权利要求248-250中任一项所述的载体，其中，所述载体包括TCR-a和TCR-b基因。

252.一种细胞，其包括根据权利要求1-88或157中任一项所述的多肽、根据权利要求89-126、239、242或243中任一项所述的TCR、根据权利要求127-156中任一项所述的肽、根据权利要求240-243中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求244-247中任一项所述的核酸或根据权利要求248-252中任一项所述的载体。

253.根据权利要求252所述的细胞，其中，所述细胞包括干细胞、祖细胞、免疫细胞或自然杀伤(NK)细胞。

254.根据权利要求252所述的细胞，其中，所述细胞包括造血干细胞或祖细胞、T细胞、从间充质干细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPSC)分化的细胞。

255.根据权利要求252-254中任一项所述的细胞，其中，所述细胞分离自或源自外周血单核细胞(PBMC)。

256.根据权利要求252-255中任一项所述的细胞，其中，所述T细胞包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、恒定NK T(iNKT)细胞、γ-ΔT细胞、NKT细胞或调节性T细胞。

257.根据权利要求252-256中任一项所述的细胞，其中，所述细胞分离自患有SARS-Cov-2的受试者。

258.一种体外分离的树突细胞，其包括根据权利要求127-157中任一项所述的肽或多肽、根据权利要求244-247中任一项所述的核酸或根据权利要求248-252中任一项所述的载体。

259.根据权利要求258所述的树突细胞，其中，所述树突细胞是成熟树突细胞。

260.根据权利要求258或259所述的树突细胞，其中，所述细胞是具有HLA-A、HLA-B或HLA-C型的细胞。

261.一种制备细胞的方法，包括将根据权利要求244-247中任一项所述的核酸或根据权利要求248-252中任一项所述的载体转移至所述细胞中。

262.根据权利要求261所述的方法，其中，所述方法进一步包括分离表达的肽或多肽。

263.一种用于制备治疗性T细胞疫苗的体外方法，包括将T细胞与根据权利要求127-157中任一项所述的肽或多肽共培养。

264.根据权利要求263所述的方法，其中，所述T细胞包括CD8+T细胞。

265.根据权利要求263或264所述的方法，其中，所述肽与MHC复合。

266.根据权利要求265所述的方法，其中，所述MHC包括HLA-A、HLA-B或HLA-C型。

267.根据权利要求263-266中任一项所述的方法，其中，将所述肽负载至树突细胞、类淋巴母细胞、外周血单核细胞(PBMC)、人工抗原呈递细胞(aAPC)或人工抗原呈递表面上。

268.一种T细胞，通过根据权利要求263-267中任一项所述的方法制备。

269.一种T细胞，包括特异性结合SEQ ID NO:22-81中一项的肽的TCR。

270.根据权利要求268或269所述的T细胞，其中，所述T细胞包括CD8+T细胞或CD4+T细胞。

271.根据权利要求270所述的T细胞，其中，所述T细胞包括细胞毒性T淋巴细胞。

272.一种药物组合物，包括权利要求1-88或157中任一项所述的多肽、根据权利要求89-126、239、242或243中任一项所述的TCR、根据权利要求127-156中任一项所述的肽、根据权利要求165所述的分子复合物、根据权利要求166或167所述的肽特异性结合分子、根据权利要求238或268-271所述的肽特性T细胞或根据权利要求258-260中任一项所述的树突细胞，和药物载体。

273.根据权利要求272所述的药物组合物，其中，所述药物组合物被配制成用于肠胃外给药、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。

274.根据权利要求272或273所述的药物组合物，其中，所述肽被包括在脂质体、包含脂质的纳米颗粒或基于脂质的载体中。

275.根据权利要求272-274中任一项所述的药物组合物，其中，药物制剂被配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。

276.根据权利要求272-275中任一项所述的药物组合物，其中，所述组合物被配制成疫苗。

277.根据权利要求272-276中任一项所述的药物组合物，其中，所述组合物进一步包括佐剂。

278.根据权利要求272-277中任一项所述的药物组合物，其中，所述组合物已被确定为无血清、无支原体、无内毒素和/或无菌的。

279.一种制备工程化细胞的方法，包括将权利要求244-247中任一项所述的核酸或权利要求248-251中任一项所述的载体转移至所述细胞中。

280.根据权利要求279所述的方法，其中，所述方法进一步包括在培养基中培养所述细胞，在允许细胞分裂的条件下孵育所述细胞，筛选所述细胞，和/或冷冻所述细胞。

281.根据权利要求279或280所述的方法，其中，所述方法进一步包括分离表达的肽或多肽。

282.一种用于治疗或预防受试者中冠状病毒感染的方法，包括向有此需要的受试者给药根据权利要求158-164或272-278中任一项所述的组合物或根据权利要求238或268-271中任一项所述的细胞。

283.一种刺激受试者产生免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求158-164或272-278中任一项所述的组合物或根据权利要求238或268-271中任一项所述的细胞。

284.根据权利要求282或283所述的方法，其中，所述受试者是人受试者。

285.根据权利要求282-284中任一项所述的方法，其中，所述细胞是自体的。

286.根据权利要求282-284中任一项所述的方法，其中，所述细胞是同种异体的。

287.根据权利要求282或284所述的方法，其中，所述受试者具有冠状病毒感染的一种或多种症状。

288.根据权利要求282或284所述的方法，其中，所述受试者没有冠状病毒感染的任何症状。

289.根据权利要求282-288中任一项所述的方法，其中，所述受试者已被诊断患有冠状病毒感染。

290.根据权利要求282-288中任一项所述的方法，其中，所述受试者尚未被诊断患有冠状病毒感染。

291.根据权利要求282-290中任一项所述的方法，其中，所述受试者既往已接受冠状病毒感染治疗。

292.根据权利要求282-291中任一项所述的方法，其中，所述冠状病毒包括分离自蝙蝠的冠状病毒。

293.根据权利要求292所述的方法，其中，所述冠状病毒是SARS-CoV或SARS-CoV-2。

294.根据权利要求282-293中任一项所述的方法，其中，所述方法包括预防或治疗COVID-19或SARS。

295.根据权利要求282-294中任一项所述的方法，其中，所述受试者已被诊断患有与冠状病毒有关的并发症。

296.根据权利要求295所述的方法，其中，所述并发症包括肺炎、呼吸困难或呼吸急促、胸痛或胸部压力、急性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、急性心肌损伤、继发感染、急性肾损伤、脓毒性休克、血块、多系统炎症综合征、慢性疲劳、横纹肌溶解、弥散性血管内凝血和/或急性肝损伤。

297.根据权利要求282-296中任一项所述的方法，其中，所述受试者针对冠状病毒接种疫苗。

298.根据权利要求282-296中任一项所述的方法，其中，所述受试者未针对冠状病毒接种疫苗。

299.根据权利要求291-298中任一项202所述的方法，其中，已确定所述受试者对既往治疗有抗性或无反应。

300.根据权利要求282-299中任一项所述的方法，其中，向所述受试者给药另外的治疗剂。

301.根据权利要求300所述的方法，其中，所述另外的治疗剂包括类固醇或抗病毒治疗剂。

302.根据权利要求301所述的方法，其中，所述另外的治疗剂包括地塞米松、单克隆抗体、瑞德西韦、帕罗韦德、莫诺拉韦、恢复期血浆或其组合。

303.一种用于预测患者或检测患者T细胞应答的方法，所述方法包括：使来自所述患者的生物样品与根据权利要求127-157中任一项所述的肽或多肽或根据权利要求165所述的分子复合物接触。

304.根据权利要求303所述的方法，其中，所述生物样品包括血液样品或其级分。

305.根据权利要求304所述的方法，其中，所述生物样品包括淋巴细胞。

306.根据权利要求305所述的方法，其中，所述生物样品包括包含淋巴细胞的级分样品。

307.根据权利要求303-306中任一项所述的方法，其中，所述肽与固体载体连接。

308.根据权利要求307所述的方法，其中，所述肽与所述固体载体缀合或与缀合所述固体载体的抗体结合。

309.根据权利要求307所述的方法，其中，所述固体载体包括微孔板、珠粒、玻璃表面、载玻片或细胞培养皿。

310.根据权利要求303-309中任一项所述的方法，其中，检测T细胞应答包括检测所述肽与所述T细胞或TCR的结合。

311.根据权利要求303-310中任一项所述的方法，其中，检测T细胞应答包括ELISA、ELISPOT或四聚体测定。

312.根据权利要求303-311中任一项所述的方法，其中，所述受试者已被诊断患有冠状病毒。

313.根据权利要求303-312中任一项所述的方法，其中，所述受试者已被诊断患有与冠状病毒有关的并发症。

314.根据权利要求313所述的方法，其中，所述并发症包括肺炎、呼吸困难或呼吸急促、胸痛或胸部压力、急性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、急性心肌损伤、继发感染、急性肾损伤、脓毒性休克、血块、多系统炎症综合征、慢性疲劳、横纹肌溶解、弥散性血管内凝血和/或急性肝损伤。

315.根据权利要求303-311、313或314中任一项所述的方法，其中，所述受试者尚未被诊断患有冠状病毒。

316.根据权利要求303-315中任一项所述的方法，其中，所述受试者已接种冠状病毒疫苗。

317.根据权利要求312-316中任一项所述的方法，其中，所述冠状病毒是SARS-CoV或SARS-CoV-2。

318.根据权利要求316或317所述的方法，其中，所述方法用于确定所述疫苗的功效。

319.一种方法，包括使权利要求158-164中任一项所述的组合物与包括T细胞的组合物接触，并通过对检测标签进行检测来检测具有结合肽和/或MHC多肽的T细胞。

320.根据权利要求319所述的方法，其中，所述方法进一步包括计数与肽和/或MHC结合的T细胞的数量。

321.根据权利要求319或320所述的方法，其中，所述包括T细胞的组合物分离自受试者。

322.根据权利要求321所述的方法，其中，所述受试者是人受试者。

323.根据权利要求321或322所述的方法，其中，所述受试者具有SARS-Cov-2感染的一种或多种症状。

324.根据权利要求321-323中任一项所述的方法，其中，所述受试者没有SARS-Cov-2感染的任何症状。

325.根据权利要求321-324中任一项所述的方法，其中，所述受试者已被诊断患有SARS-Cov-2感染。

326.根据权利要求321-324中任一项所述的方法，其中，所述受试者尚未被诊断患有SARS-Cov-2感染。

327.根据权利要求321-326中任一项所述的方法，其中，所述受试者既往已接受SARS-Cov-2感染治疗。

328.根据权利要求202所述的方法，其中，已确定所述受试者对既往治疗有抗性或无反应。

329.根据权利要求319-328中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括分选与肽和/或MHC结合的T细胞的数量。

330.根据权利要求329所述的方法，其中，所述方法进一步包括对来自与肽和/或MHC结合的T细胞的一个或多个TCR基因进行测序。

331.根据权利要求330所述的方法，其中，所述方法进一步包括进行通过胞旁热点对淋巴细胞相互作用进行分组(GLIPH)分析。

332.一种试剂盒，包括在容器中的根据权利要求127-157中任一项所述的肽或多肽。

333.根据权利要求332所述的试剂盒，其中，所述肽被包括在药物制剂中。

334.根据权利要求333所述的试剂盒，其中，所述药物制剂被配制成用于肠胃外给药或吸入。

335.根据权利要求332所述的试剂盒，其中，所述肽被包括在细胞培养基中。