JP4900884B2 - 腫瘍抗原 - Google Patents
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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Description
本発明は、腫瘍抗原に関し、さらに詳しくは腫瘍特異的細胞傷害性T細胞により認識されるペプチドまたはポリペプチド、該ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ペプチドまたは該ポリペプチドに対する抗体、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物、該ペプチドおよび/または該ポリペプチドからなる細胞傷害性T細胞誘導剤、およびこれらの1種以上を含む医薬組成物、並びに該ポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物のスクリーニング方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドを用いる細胞傷害性T細胞の誘導方法、該ペプチドまたは該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの測定方法、および該測定方法に使用する試薬キットに関する。
背景技術
生体における癌の排除には免疫系、特に細胞傷害性T細胞(Cytotoxic T Lymphocyte)(以下、CTLと略称することもある)が重要な役割を果たしている。癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す細胞傷害性T細胞の浸潤が認められている(Arch.Surg.,126:200〜205,1990)。この腫瘍特異的な細胞傷害性T細胞の標的分子(腫瘍抗原)は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて8〜11個のアミノ酸からなるペプチド(腫瘍抗原ペプチド)になり、主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原(HLA)分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性T細胞はHLAと腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。すなわち、細胞傷害性T細胞はHLA拘束性に腫瘍抗原ペプチドを認識する。
HLAは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。HLAはクラスI抗原とクラスII抗原に大別されるが、細胞傷害性T細胞により抗原ペプチドとともに認識されるHLAはクラスI抗原である。HLAクラスI抗原はさらにHLA−A、HLA−B、HLA−C等に分類され、それらの遺伝子は多型に富むことが報告されている。HLA−A亜領域の多型の1つであるHLA−A2対立遺伝子(allele)は、アフリカ黒人の約23%、中国人の約53%、日本人の約40%、北アメリカコーカサス人の約49%、および南アメリカコーカサス人の約38%でみられる。
ここにおいて、腫瘍抗原とは腫瘍特異的な細胞傷害性T細胞を誘導し得る、腫瘍細胞が有する蛋白質、ポリペプチド、またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、HLA分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的細胞傷害性T細胞を誘導または活性化し得るペプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性T細胞を誘導し得るアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原エピトープ(腫瘍抗原決定基)という。
近年、細胞傷害性T細胞により認識されうる腫瘍抗原をコードする多くの遺伝子が、ヒトの癌細胞のcDNAから同定されている(Science,254:1643〜1647,1991)(J.Exp.Med.,183:1185〜1192,1996)(J.Immunol.,163:4994〜5004,1999)。これらは、HER/neu(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:432〜436,1995)、変異cdk(Science,269:1281〜1284,1995)、そして変異CASP−8(J.Exp.Med.,186:785〜793,1997)等であり、増殖性細胞および悪性形質転換体中に含まれる。
また、腫瘍拒絶抗原遺伝子やT細胞抗原レセプター(TCR)等の特異免疫に関与する分子が、過去10年において、メラノーマ、食道癌、およびその他の癌で同定されてきており、進行癌または転移性癌のペプチドによる特異的免疫療法が検討されてきている。
現在欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性T細胞を活性化させる癌ワクチン療法の開発がなされており、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原gp100ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−2(IL−2)を静脈注射投与すると、42%の患者で腫瘍の縮小が認められている(Nature Medicine,4:321,1998)。このように腫瘍抗原は、ワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。
しかしながら、同定されている腫瘍抗原はメラノーマ由来のものが多く、発病頻度の高い上皮性の癌や腺癌、例えば膵臓癌についてのこのような特異的免疫療法に関する研究はほとんど報告されていない。膵臓癌は、世界における癌による死因の最たるものの一つであり、米国では年間約27,000人、欧州では約50,000人が膵臓癌によって死亡している。この膨大な数の死因は、主に、有効な治療法の欠如、診断の困難性、そしてこの癌の活動性によるものである。膵臓癌患者のほんの1〜4%が病気を克服しているにすぎず、発病率と死亡率が実質的に同一である。それゆえ、新治療手法、例えば特異的免疫療法の開発が期待されている。
さらに、癌の多様性を考えた場合、全ての癌細胞において同一の腫瘍抗原が同程度発現されているとは考えられない。もちろん、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性T細胞を活性化させる癌ワクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。しかし、癌の治療において腫瘍抗原に特異的な細胞傷害性T細胞を誘導・活性化し、かつ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、癌の多様性に応じた数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが重要である。
発明の開示
本発明の一態様は、配列表の配列番号1から配列番号44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号45から配列番号53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号1から配列番号44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45から配列番号53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドからなる医薬である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号1から配列番号44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45から配列番号53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有する癌ワクチンである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号1から配列番号44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45から配列番号53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有し、膵臓癌、大腸癌、若しくは胃癌の治療に用いられる癌ワクチンである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号1から配列番号44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45から配列番号53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有する細胞傷害性T細胞の誘導剤である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号1から配列番号44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45から配列番号53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性T細胞の誘導方法である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号1から配列番号53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号54から配列番号62のいずれか1に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号54から配列番号62のいずれか1に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞傷害性T細胞を誘導するおよび/または細胞傷害性T細胞により認識される、ポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターである。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する発現組換えベクターである。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター若しくは発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、前記ポリペプチドの製造方法である。
本発明の一態様は、前記ペプチドまたは前記ポリペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドおよび/またはHLA−A2と相互作用して少なくともHLA−A2拘束性細胞傷害性T細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および/または前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、前記組換えベクター若しくは発現組換えベクター、前記形質転換体、または前記抗体のうちの少なくとも1つを用いることを特徴とするスクリーニング方法である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドおよび/またはHLA−A2と相互作用して少なくともHLA−A2拘束性細胞傷害性T細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および/または前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、前記組換えベクター若しくは前記発現組換えベクター、前記形質転換体、または前記抗体のうちの少なくとも1つを用いることを特徴とするスクリーニング方法により得られた化合物である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドの少なくとも1つに対するHLA−A2拘束性細胞傷害性T細胞による認識を増強する化合物、または前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物である。
本発明の一態様は、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、前記組換えベクター若しくは前記発現組換えベクター、前記形質転換体、前記抗体、および前記化合物のうちの少なくとも1つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物である。
本発明の一態様は、前記医薬、前記癌ワクチン、前記細胞傷害性T細胞の誘導剤、または前記医薬組成物の癌疾患への使用である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法に使用する試薬キットであって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または前記抗体を少なくとも1つ以上含んでなる試薬キットである。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法に使用する試薬キットであって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または前記抗体を少なくとも1つ以上含んでなる試薬キットの癌疾患検査への使用である。
発明を実施するための最良の形態
本発明者は、膵臓癌の特異的免疫療法に使用し得る腫瘍拒絶抗原遺伝子および該遺伝子がコードする腫瘍抗原を同定するために、大腸癌患者からHLA−A2と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるHLA−A2拘束性・腫瘍特異的細胞傷害性T細胞を樹立し(以下この細胞をOK−CTLpと呼ぶこともある)、この腫瘍特異的細胞傷害性T細胞(CTL)に認識され得る腫瘍抗原をコードする遺伝子を、遺伝子発現クローニング法を用いて、ヒト膵臓腺癌細胞株であるPanc−1細胞のcDNAライブラリーから単離・同定した。また、SEREX(Serological analysis of recombinant cDNA expression libraries)法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:11910−11813,1995)で腫瘍抗原をコードしている遺伝子として同定されたものから、上記同様にCTLに認識され得るものを同定した。さらに、得られた遺伝子にコードされる腫瘍抗原に基づいて、腫瘍抗原エピトープを有するペプチドを見い出した。
本明細書においては、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している2個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち長鎖ペプチドをポリペプチドという。例えばタンパク質も本明細書においてはポリペプチドに含まれる。また、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを、単にペプチドという。
またここで、「認識する(recognize)」とは、認識するものが、認識される対象を他の物質と見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、CTLが腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ペプチドを認識するとは、CTLがHLAにより提示された腫瘍抗原ペプチドにT細胞受容体を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに増強するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、CTLが活性化するとは、CTLがHLAにより提示された抗原を認識することにより、IFN−γを産生すること、あるいはCTLが認識した標的細胞に対し細胞傷害性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性若しくは該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的なCTLを誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識するCTLを分化および/または増殖させることを意味する。また、本明細書において細胞傷害性T細胞の誘導剤とは、ある抗原を特異的に認識するCD8陽性T細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性T細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。
(腫瘍抗原遺伝子、腫瘍抗原、および腫瘍抗原ペプチドの単離・同定)
本発明においてはまず、上記HLA−A2拘束性細胞傷害性T細胞であるOK−CTLpをエフェクター細胞として用い、この細胞を活性化し得る腫瘍抗原を、遺伝子発現クローニング法を用いて単離・同定した。すなわち、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1のcDNAとHLA−A0207のcDNAとをCOS−7細胞に共遺伝子導入し、該導入遺伝子が発現された細胞のうち、OK−CTLpからのIFN−γ産生を促進するものを選択することにより、CTLを活性化し得る腫瘍抗原をコードする遺伝子を同定した。具体的な方法は、後述する実施例に示す。その結果、OK−CTLpによりHLA−A2拘束性に認識される7個のcDNAクローンが得られた。
また、ヒト膵臓腺癌細胞株CFPAC−1のcDNAライブラリーからSEREX法により検出されて既に報告されている腫瘍抗原をコードする遺伝子(Biochem.Biophys.Res.Commun.,281:936−944,2001)から、HLA−A2拘束性にCTLを活性化し得る2つの腫瘍抗原をコードする遺伝子、KM−PA−2およびKM−PA−4を上記同様の方法により見い出した。SEREX法は腫瘍抗原の検出に用いることができる方法であるが、同方法で検出された1,500種余りの腫瘍抗原のうち細胞性および液性免疫を惹起し得る腫瘍抗原として同定されたものはMAGE−1、チロシナーゼ、およびNY−ESO−1のみである。この様に、SEREX法により腫瘍抗原として同定されたものであってもCTLを活性化し得るとは限らない。上記腫瘍抗原遺伝子、KM−PA−2およびKM−PA−4がHLA−A2拘束性にCTLを活性化し得ることは、本発明において初めて見い出された。
上記のPanc−1細胞から得られた7個のcDNAクローンは全て、完全なオープンリーディングフレーム(ORF)を含むものであった。これら遺伝子の塩基配列をサンガー法(チェインターミネーター法)により決定し、該塩基配列からアミノ酸配列を推定した。これらの塩基配列および推定アミノ酸配列について、GenBank等の既存のデータベースに対して相同性検索を行ったところ、下記に示すような遺伝子と高い相同性はあるものの、これらは新規な塩基配列を有するcDNAであった。相同性のある既知遺伝子についても腫瘍抗原としての機能は報告されていない。なお、得られた7個のcDNAクローン(クローン1〜7)のうちクローン3は、上記遺伝子発現クローニング法で得た当初のクローンがWolf−Hirschhorn syndrome candidate 2蛋白質(WHSC2)の遺伝子と高い相同性が認められたものの塩基配列が5′末端領域において25bp短かったので、その完全長のcDNAをPanc−1細胞のcDNAライブラリーから、32P標識当該クローンをプローブとして用いて標準的コロニーハイブリダイゼーション法で得たものである。以下、上記クローン1〜7が由来したPanc−1細胞の遺伝子をそれぞれ遺伝子1〜7と呼ぶ。また、各遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドを遺伝子産物1〜7と呼ぶこともある。これら各遺伝子がコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号45〜51に、その塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号54〜60に示した。上記遺伝子1〜6は平成12年6月12日に、遺伝子7は平成12年8月2日に、国立遺伝子研究所・日本DNAデータバンク(DDBJ)に登録された(表1)。
KM−PA−2およびKM−PA−4についても、表1に示す相同性の高い遺伝子が既に報告されている(Biochem.Biophys.Res.Commun.,281:936−944,2001)。KM−PA−2およびKM−PA−4の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号52および配列番号53に、推定アミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号61および配列番号62に示した。
遺伝子1の塩基配列は、GenBank(アクセッション番号:AF155120)に登録されたユビキチン結合酵素異型体Kua(UBE2V)遺伝子のものと高い相同性が認められた。遺伝子1がコードする推定アミノ酸(aa)長は、わずかにUBE2V遺伝子のものより長かった(第109〜111位の3個のaa)。UBE2Vの機能については、現在まで報告されていない。
遺伝子2の塩基配列は、異種核リボ核蛋白質L遺伝子〔heterogeneous nuclear ribonucleoprotein(HNRPL)遺伝子、アクセッション番号:NM001533〕のものと高い相同性が認められた。しかし、推定されるアミノ酸長は、N末端第1〜31位においてHNRPL遺伝子よりわずかに長かった。HNRPL遺伝子産物は、異種性の核リボ核蛋白質複合体であり、mRNA前駆体が細胞質内で受けるプロセシングのための基質を提供するものである。
遺伝子3の塩基配列は、GenBank(アクセッション番号:AK001304)に登録されたWolf−Hirschhorn syndrome candidate 2蛋白質(WHSC2)の遺伝子と高い相同性が認められた。このWHSC2遺伝子は、第4染色体短腕の部分欠損に起因する精神的・発育的障害によって特定される多発性奇形症候群であるWHSの表現型(phenotype)において、何らかの機能を有するとされている。
遺伝子4の塩基配列は、eIF−4E結合蛋白質1遺伝子(EIF4EBP1、アクセッション番号:NM004095)のものと高い相同性が認められた。EIF4EBP1遺伝子産物は、4E−BP1のインシュリン依存性リン酸化を開始する翻訳開始因子として知られ、活性のあるcap結合性複合体の形成を可能にする。
遺伝子5の塩基配列は、GenBankに登録された部分的に推定されたマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ キナーゼ キナーゼ(ppMAPkkk、アクセッション番号:AJ242724)遺伝子のものと相同性が認められた。遺伝子5がコードする推定アミノ酸配列は、登録されたppMAPkkk遺伝子(その機能の報告は未だ無い)のものと比較して、N末端において230aaそしてC末端において258aa長かった。
遺伝子6の塩基配列は、6,707bpからなり、2’,5’−オリゴアデニレート合成酵素3遺伝子(2−5 OAS3遺伝子、アクセッション番号:NM006187)と相同性が認められたが、第18位、第159位、第249位、第287位、第288位、第316位、第393−第398位、および第984位における合計13aaが異なっていた。2−5 OAS3は、IFN誘導蛋白質として知られ、微生物感染に対する免疫防御において重要な機能を有する。
遺伝子7の塩基配列は、Human cleavage and polyadenylation specificity factor(CPSF、アクセッション番号:U37012)(ヒトの分裂およびポリアデニル化特異性因子)の第3701〜4463位と相同性が認められたが、アミノ酸配列が約1226aa短かかった。
遺伝子KM−PA−2の塩基配列は、KIAA0124およびmouse block of proliferation 1(Bop1)のヒトホモログと高い相同性を有していた。KIAA0124遺伝子では第1466位の塩基がグアニン(G)であり、そのため第465位のアミノ酸残基がヒスチジン(H)であるが、遺伝子KM−PA−2ではそれぞれアデニン(A)およびアルギニン(R)である。
遺伝子KM−PA−4の塩基配列および該遺伝子がコードするアミノ酸配列は、coactosin−like protein(CLP)と同一であった。
腫瘍抗原をコードする上記9つの遺伝子から腫瘍抗原ペプチドを得るために、上記遺伝子のコードするアミノ酸配列に基づいてペプチドを設計して合成した。遺伝子7については、該遺伝子がより長い塩基配列からなる遺伝子の一部であると考えられるので、該遺伝子と相同性の高い遺伝子(CPSF)がコードするアミノ酸配列由来のペプチドも設計し合成した。HLA−A2に結合可能な腫瘍抗原ペプチドには、そのアミノ酸配列にモチーフ(規則的配列)があることが知られている。そこで、まずHLA−A2に結合し得るモチーフ(規則的配列)を有するペプチドについて文献(J.Immunol.,152:163,1994)(Immunogenetics,41:178,1994)検索し、得られたモチーフに適合するそれぞれ異なる9〜11merのペプチドを上記遺伝子がコードするアミノ酸配列に基づいて設計し合成した。各ペプチドのCTLによる認識は、OK−CTLpまたはこれを限界希釈法によりクローン化して得た数種のOK−CTLクローンを用い、これらCTLから産生されるIFN−γを指標として測定した。OK−CTLクローンは上記遺伝子1〜7のいずれかを認識する細胞であるが、OK−CTLpは遺伝子1〜7のいずれをも認識することから複数の種類の腫瘍抗原を認識する細胞集団であることが判明した。そこでOK−CTLクローンを用いてペプチドのCTL活性化能を検討するときは、検討するペプチドに対して該ペプチドをコードする遺伝子産物を認識するクローンを用いた。合成したペプチドのうち44個のペプチド(配列表の配列番号1〜44)(表2および表3)が、OK−CTLpまたはOK−CTLクローンにより認識され、CTLからのIFN−γ産生を促進した。これらのペプチドのうちP1〜P5、P6〜P9、P10〜P13、P14およびP15、P16〜P18、並びにP19は、それぞれ遺伝子1、遺伝子2、遺伝子3、遺伝子4、遺伝子5、並びに遺伝子6がコードするアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドであり、それぞれの遺伝子と相同性の高い遺伝子、UBE2V、HNPRL、WHSC2、EIF4−EBP1、ppMAPkkk、および2−5 OAS3にもコードされている。また、P25、P26、P27、P28、P30およびP31は、遺伝子7および該遺伝子と相同性の高い遺伝子CPSFがコードするアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドである。P20、P21、P22、P23、P24、P29、およびP32は、CPSFに特異的なアミノ酸配列の部分配列からなる。
これら腫瘍抗原ペプチドは、HLA−A2によって細胞表面に提示されており、ペプチド特異的OK−CTLクローン上に発現されているT細胞受容体(TCR)により認識される。遺伝子1およびUBE2V、遺伝子2およびHNPRL、または遺伝子6および2−5 OAS3由来のペプチドは、TCR・Vβ8.1、TCR・Vβ3.2、またはTCR・Vβ14を発現しているOK−CTLクローンにより認識されるものであった。また、遺伝子3およびWHSC2、遺伝子4およびEIF4EBP1、または遺伝子5およびppMAPkkk由来のペプチドは、それぞれTCR・Vβ13.1、TCR・Vβ8.1、またはTCR・Vβ18を発現しているOK−CTLクローンにより認識されるものであった。
また、遺伝子1およびUBE2V、遺伝子2およびHNPRL、並びに遺伝子6および2−5 OAS3由来のペプチドを認識するOK−CTLクローンの各2つは、それぞれ異なった相補性決定領域3(CDR3)(HLAクラスI分子の溝上の抗原エピトープへの結合性を担う要素)を有するTCRを発現していた。遺伝子3およびWHSC2、遺伝子4およびEIF4EBP1、並びに遺伝子5およびppMAPkkk由来のペプチドを認識するOK−CTLクローンもそれぞれ異なったCDR3を有するTCRを発現していた。
さらに、OK−CTLpによって認識される上記44個のペプチドはそれぞれ、OK−CTLpを得た大腸癌患者の自己末梢血単核細胞(以下、PBMCと略すこともある)、および/またはHLA−A0201+癌患者(膵臓癌患者、大腸癌患者、および胃癌患者)のPBMCから、HLA−A2拘束性腫瘍特異的CTLをインビトロで誘導した。癌患者末梢血単核細胞から誘導された上記CTLは、HLA−A2+腫瘍細胞を用量依存的に溶解(lysis)した。しかし、HLA−A2−腫瘍細胞RERF−LC−MS並びにHLA−A+ではあるが正常細胞由来の自己EBV−B細胞およびPHAで刺激したT細胞は溶解しなかった。さらに、上記CTLは、刺激に用いたペプチドと同じペプチドをパルスしたT2細胞に対して用量依存的に細胞傷害性を示した。
上記の検討により、OK−CTLpを活性化することのできる44個の腫瘍抗原ペプチドが得られ、さらにこれらのペプチドが膵臓癌、大腸癌、および/または胃癌患者由来のPBMCからHLA−A2拘束性腫瘍特異的CTLを誘導し得ることを確認した。また、膵臓腺癌細胞株Panc−1と大腸腺癌細胞株SW620の両方が、OK−CTLpおよび上記ペプチドでPBMCから誘導されたCTLにより認識されることが判明した。この結果は、膵臓癌および大腸癌が、宿主のCTLによって認識される同じ腫瘍抗原エピトープを共有していることを示唆する。
(ポリペプチドおよびペプチド)
本発明に係るポリペプチドは、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得られた上記遺伝子1〜7またはヒト膵臓腺癌細胞株CFPAC−1から得られた遺伝子KM−PA−2若しくはKM−PA−4がそれぞれコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、好ましくは配列表の配列番号45〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、腫瘍抗原としてCTLを誘導および/または活性化するために使用できる。また、該ポリペプチドは腫瘍抗原エピトープを特定し腫瘍抗原ペプチドを得るための材料として用いることもできる。
本発明に係るペプチドは、上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、例えばHLA−A2拘束性モチーフに適合するものを設計し、該設計されたペプチドからCTLにより認識されるもの、例えばCTLを活性化および/または誘導するものを選択することにより得ることができる。本発明においてペプチドは、HLA−A2と結合して抗原提示細胞表面上に提示され、かつCTLにより認識される腫瘍抗原エピトープとしての性質を有するものであればよく、少なくとも約5個以上、好ましくは約7個以上、さらに好ましくは9個乃至10個のアミノ酸残基からなるペプチドである。特に好ましくは、配列表の配列番号1〜44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。これらのペプチドは、腫瘍抗原ペプチドとして、HLA−A2拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性T細胞を誘導および/または活性化するために使用できる。
上記ポリペプチドまたはペプチドは、CTLを誘導および/または活性化するために単独で使用してもよいし、2つ以上を組み合わせて使用してもよい。上記のようにCTLは種々の抗原を認識する複数の細胞集団であることから、好ましくはこれらを2つ以上組み合わせて用いることが推奨される。
また、このように特定されたポリペプチドまたはペプチドに1乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入等の変異を導入したものであって、少なくともHLA−A2拘束性CTLにより認識されるポリペプチドまたはペプチドも本発明の範囲に包含される。欠失、置換、付加、または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術(Science,219:666,1983)を利用することができる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質(物性、活性、または免疫学的活性等)を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸(極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等)の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基若しくはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
(ポリヌクレオチド)
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のようにヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1またはヒト膵臓腺癌細胞株CFPAC−1から得られた遺伝子1〜7またはKM−PA−2若しくはKM−PA−4であって、配列表の配列番号54〜62のいずれか1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。また、該ポリヌクレオチドは、配列表の配列番号1〜44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくは配列番号45〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをそれぞれコードするものまたはその相補鎖であってもよい。さらに、上記ポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列中で腫瘍抗原エピトープをコードする領域に対応する少なくとも約15個以上、好ましくは約21〜30個以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドおよびその相補鎖であってもよい。この有用なポリヌクレオチドの選択および塩基配列の決定は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して、発現ペプチドのCTL誘導能および/または活性化能の確認を行うことにより可能である。
さらに、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。ポリヌクレオチド分子としてDNA分子を代表例にとると、「DNA分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA分子」は、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual(コールドスプリングハーバーラボラトリー,1989)等に記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、6×SSC、0.5%SDSおよび50%ホルムアミドの溶液中で42℃にて加温した後、0.1×SSC、0.5%SDSの溶液中で68℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
上記ポリヌクレオチドは、HLA−A2を有する細胞で発現させたときに、HLA−A2拘束性のCTLを誘導および/または活性化することができる。また、上記ポリヌクレオチドは、その3′末端にポリ(A)〔poly(A)〕構造を有しているが、ポリ(A)の数は腫瘍抗原として作用するアミノ酸のコード部位に影響するものではなく、該ポリヌクレオチドの有するポリ(A)の数は特に限定されるものではない。
上記ポリヌクレオチドは、いずれも本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸としての試薬・標準品としても利用できる。
(組換えベクター)
上記ポリヌクレオチドを適当なベクターDNAに組み込むことにより、組換えベクターを得ることができる。用いるベクターDNAは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターDNAは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、SV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等をあげることができる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等、とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組み合わせて作製される。前記ベクターDNAに本発明に係るポリヌクレオチドを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してDNAを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるDNAと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターを得ることができる。
(形質転換体)
上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターDNAにより、自体公知の宿主、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、または動物細胞等を自体公知の方法で形質転換することにより形質転換体が得られる。形質転換を行う場合、より好ましい系としては遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法があげられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を用いることができる。ベクターDNAの宿主細胞への導入は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年)等に記載されている標準的な方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷(scrape loading)、バリスティック導入(ballistic introduction)および感染等をあげることができる。
(ポリペプチドまたはペプチドの製造)
上記形質転換体に導入するベクターDNAとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターDNAを導入した形質転換体は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件で培養される。培養は、形質転換体により発現される本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの作用、特に少なくともCTLを誘導および/または活性化する作用あるいは宿主中または宿主外に産生された該ペプチドまたはペプチド量を指標にして行ってもよいし、または培地中の形質転換体量を指標にして継代培養若しくはバッチ培養を行ってもよい。
また、本発明に係るペプチドは、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば、ペプチド合成(丸善)1975年、“Peptide Synthesis,Interscience,New York,1996”が例示されるが、無論既知の方法が広く利用可能である。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの回収は、該ポリペプチド若しくは該ペプチドのCTL活性化作用を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、またはアフィニティクロマトグラフィー等の方法を組合せて、あるいは硫安やアルコール等を用いる溶解度差に基づく分画手段により精製回収できる。より好ましくは、これらのアミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作製し、得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。
(抗体)
本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドまたはペプチドを抗原として用いて作製される。抗原は上記ポリペプチド若しくはペプチド自体でもまたはその断片でもよく、少なくとも5個、より好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸で構成される。上記ポリペプチドまたはペプチドに特異的な抗体を作製するためには、該ポリペプチドまたは該ペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが望ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも該ポリペプチドまたは該ペプチドのアミノ酸配列と相同である必要はなく、該ポリペプチドまたは該ペプチドの立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に該ポリペプチドまたは該ペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。
抗体を産生するためには、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば本発明に係るポリペプチドまたはペプチドをアジュバントの存在下または非存在下で単独または担体に結合して動物に投与し、体液性免疫および/または細胞性液等を誘導することにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、またはアルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞(例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球)を回収し、自体公知の永久増殖性細胞(例えば、P3/X63−Ag8細胞等のミエローマ株)への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ポリペプチドまたはペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
かくして得られた上記ポリペプチドまたはペプチドを認識して結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用できる。
(スクリーニングおよび該スクリーニングにより得られた化合物)
上記ポリペプチドまたはペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数を組み合せることによってCTLを誘導および/または活性化し得る物質のスクリーニングに有効な手段を提供する。スクリーニング方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。例えば、実施例に示したように、腫瘍抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞によるCTLの活性化をCTLからのIFN−γ産生量により測定する実験系を用いて、該実験系に被検物質を加えることにより、CTLを誘導および/または活性化する物質、並びに誘導および/または活性化を増強する物質等を選別することができる。この実験系はスクリーニング方法の1つを説明するものであり、本発明に係るスクリーニング方法はこれに限定されるものではない。
本発明は、上記スクリーニング方法によって得られた化合物も対象とする。該化合物は、本発明に係るポリペプチド若しくはペプチドおよび/またはHLA−A2と相互作用してCTLによる該ポリペプチドまたはペプチドの認識を増強する化合物、または本発明に係るポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物等でありうる。かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、医薬組成物として調製可能である。
(医薬組成物)
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドとして、HLA−A2拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性T細胞を誘導および/または活性化するために使用することができる。すなわち、上記ポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とするCTLの誘導方法並びに上記ポリペプチドまたはペプチドを含有するCTLの誘導剤も、本発明の範囲に包含される。
また、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき作製した組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換させた細胞、または該ポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体、該ポリペプチド若しくはペプチドおよび/またはHLA−A2と相互作用してCTLによる該該ポリペプチド若しくはペプチドの認識を増強する化合物、または該ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物を、単独または複数組み合せて利用することによって、これらのうち少なくとも1つを含有する医薬組成物を提供できる。
具体的には、例えば本発明に係るポリペプチドまたはペプチドからなる医薬、さらに本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用することができる。このとき、細胞性免疫の活性化のために、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で用いるかまたは担体に結合して用いる。担体は、それ自体が人体に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。剤形は、自体公知のポリペプチドまたはペプチドを製剤化する手段を応用して適宜選択できる。その投与量は、CTLによる当該ペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には活性本体として0.01mg〜100mg/日/成人ヒト、好ましくは0.1mg〜10mg/日/成人ヒトである。これを数日乃至数月に1回投与する。
または、患者の末梢血より単核細胞画分を採取し、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドと共に培養し、CTLが誘導および/または活性化された該単核細胞画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果を得ることができる。培養するときの単核細胞濃度、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの濃度等の培養条件は、簡単な実験により決定することができる。また、培養時、インターロイキン2(IL−2)等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
癌ワクチンとして本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを使用する場合、1つのポリペプチドまたはペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数の種類の上記ポリペプチドまたはペプチドを組み合せて使用することもできる。癌患者のCTLは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であるため、1種類のポリペプチドまたはペプチドを癌ワクチンとして使用するより複数を組み合せて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られるときがある。
上記医薬、細胞傷害性T細胞の誘導剤、癌ワクチン、および医薬組成物は、いずれも癌疾患の治療、例えば膵臓癌、大腸癌または胃癌の治療において有用である。
また、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖も、癌疾患の、例えば膵臓癌、大腸癌、または胃癌の遺伝子治療のために有用である。これらポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入する方法またはヒトから細胞を採取したのち体外で導入する方法があるが、いずれも利用できる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が知られているが、レトロウイルス系が推奨される。無論これらウイルスは複製欠陥性である。その投与量は、CTLによる該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には本発明に係る腫瘍抗原ペプチドをコードするDNA含量として0.1μg〜100mg/日/成人ヒト、好ましくは1μg〜50mg/日/成人ヒトである。これを数日乃至数月に1回投与する。
(診断のための測定方法および試薬)
本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、並びに該ポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。また本発明は、これらのうちの1種またはそれ以上を充填した、1個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの発現または活性に関連した疾患の診断手段は、例えば当該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとの相互作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在量を決定すること、および/または当該ポリペプチドまたはペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、および/または当該ポリペプチドまたはペプチドの存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによって行われる。すなわち、本発明に係るポリペプチド若しくはペプチドまたはこれらをコードしている核酸を診断マーカーとして定性的にあるいは定量的に測定する。試料中の当該ポリペプチド若しくはペプチドまたはこれらをコードしている核酸の定量的または定性的な測定法は当業者に周知の方法を利用することができる。このような測定法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびELISAアッセイ等がある。また、核酸は、例えば増幅、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、RT−PCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いてRNAレベルでの検出および定量することができる。
測定される試料として、個体由来の細胞、例えば血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等を挙げることができる。また、測定される核酸は、上記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核酸は、ゲノムDNAを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にPCR若しくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。RNAまたはcDNAを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出することができる。増幅DNAを標識した上記ポリペプチドをコードするDNAにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定することができる。
上記測定法により本発明に係るポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするDNAの変異、減少、増加を検出することで、当該ポリペプチドが関連する疾患、例えば膵臓癌、大腸癌、または胃癌等の診断が可能となる。
実施例
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1
(HLA−A2拘束性CTLの樹立)
HLA−A2拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球株は、大腸癌患者(HLA−A0207/3101、HLA−B46/51、HLA−Cw1)の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)から樹立した(Int.J.Cancer,81:459−466,1999)(J.Immunol.,163:4997−5004,1999)。まず、大腸癌患者から得たTILを100U/mlの組換えヒト・インターロイキン2(IL−2)を添加して50日以上長期培養した。培養7日毎にIL−2活性化TILの一部を採取し、種々の腫瘍細胞または正常細胞と共に培養して、産生されたIFN−γの測定および該癌細胞からの51Cr遊離試験によってそのCTL活性を検定した(J.Immunol.,163:4997−5004,1999)。IFN−γの測定は、酵素免疫固相法(ELISA)により行った。培養58日目に、HLA−A2拘束性かつ腫瘍特異的にCTL活性を示すサブラインの1つであるOK−CTLpが得られた。得られたOK−CTLpは、CD3+CD4−CD8+の表現型を有する80%の細胞と、CD3+CD4+CD8−の表現型を有する20%の細胞とからなる細胞集団であった。このOK−CTLpをエフェクター細胞として用い、腫瘍細胞等の各種細胞を標的細胞として共に培養し、該標的細胞に対する細胞傷害性を51Cr遊離試験により、またOK−CTLpの活性化をIFN−γの産生を指標にしてそれぞれ測定し、その結果をそれぞれ図1および図2に示した。
得られたOK−CTLpは図1および図2に示すように、HLA−A0201+Panc−1膵臓腺癌細胞およびSW620大腸腺癌細胞、HLA−A0206+KE3食道鱗状細胞癌(SCC)細胞、並びにHLA−A0207+CA9−22口部SCC細胞を認識して、IFN−γを産生し、かつ十分な細胞傷害性を示した。しかし、HLA−A2−腫瘍細胞であるQG56肺腺癌細胞、RERF−LC−MC肺腺癌細胞、COLO320大腸腺細胞、並びに正常細胞由来の自己エプスタインバーウイルス形質転換B細胞(EBV−B)およびフィトヘマグルチニン(PHA)芽球化自己T細胞(Autologous PHA−blastoid T Cells)に対しては細胞傷害性を示さなかった。また、OK−CTLpは試験した全てのHLA−A2+腫瘍細胞(HLA−A0201+のR27乳腺癌細胞、HAK−2原発性肝細胞癌細胞、SK−MEL−5メラノーマ細胞、およびSF126星状細胞腫細胞、HLA−A0206+のPC9肺腺癌細胞、並びにHLA−A0207+の1−87肺腺癌細胞およびOMC−4頚部SCC細胞)を溶解した。そのCTL活性は、抗HLAクラスIモノクローナル抗体(mAb)、抗CD8mAbまたは抗HLA−A2mAbによって阻害されたが、他のmAbによっては阻害されなかった(図2)。このことから、OK−CTLpがHLA−A2拘束性に上記腫瘍細胞を認識して細胞傷害性を示すことが確認された。
なお、上記腫瘍細胞のHLAクラスI対立遺伝子の遺伝子型は、既報(J.Immunol.,163:4997−5004、1999)に開示されている。また上記患者のHLAクラスIの抗原型は、末梢血単核細胞(PBMC)を用いて従来の方法で決定した。さらに、HLA−A2サブタイプは、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ法と直接DNA配列決定法(direct DNA sequencing)によって決定した。OK−CTLpの表面表現型は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識した抗CD3mAb、抗CD4mAb、または抗CD8mAb(ニチレイ)、または抗TCRαβmAb(WT31、Becton Dickinson)による直接免疫蛍光分析によって分析した。また、OK−CTLpのHLA拘束性および特異性を検定するために用いた抗体は、抗HLAクラスImAb(W6/32、IgG2a)、抗HLA−A2mAb(BB7.2、IgG2b)、抗CD8mAb(Nu−Ts/c、IgG2a)、抗HLAクラスIImAb(H−DR−1、IgG2a)、および抗CD4mAb(Nu−Th/i、IgG1)である。抗CD13mAb(MCS−2、IgG2a)および抗CD14mAb(JML−H14,IgG1)は、アイソタイプ適合コントロールmAbとして使用した。
実施例2
(腫瘍抗原をコードするcDNAクローンの単離・同定)
OK−CTLpによって認識されるPanc−1腫瘍細胞の腫瘍抗原をコードする遺伝子は、既知の遺伝子発現クローニング法(J.Immunol.,163:4997−5004,1999)に準拠して単離・同定した。まず、Panc−1腫瘍細胞のpoly(A)+RNAをcDNAに転換してSalIアダプターにライゲーションし、発現ベクターpCMV−SPORT−2(Invitrogen社製)に挿入した。
HLA−A0207、HLA−A2402、またはHLA−A2601のcDNAを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって得て、真核細胞発現ベクターpCR3(Invitrogen社製)にクローン化した。
上記プラスミドDNAプールまたはPanc−1細胞cDNAライブラリーのクローン200ngと、HLA−A0207cDNAの200ngとを、100μlのOpti−MEM(Invitrogen社製)中で30分間混合した。この混合物の50μlをCOS−7細胞(5×103)に加え96ウエルU底型マイクロカルチャープレート(Nunc社製)中で6時間インキュベーションして共遺伝子導入した。次いで10%FCSを含むRPMI−1640培地を加えて2日間培養し、OK−CTLp(5×104細胞)を各ウエルに添加した。さらに18時間インキュベーションした後、上清の100μlを採り、産生されたIFN−γの測定をELISA法により行った。この時、遺伝子導入をしていないCOS−7細胞を標的としてOK−CTLpによるIFN−γ産生を検討し、産生されたIFN−γの値をバックグランドとして各測定値から減算した。その結果、OK−CTLにより認識されて該OK−CTLのIFN−γ産生を促進する7個のcDNAクローンが得られた。
得られた7個のcDNAクローンの塩基配列決定は、DNAシークエンシングキット(Perkin−Elmer社製)を用い、ABIPRISMTM377DNA Sequencer(Perkin−Elmer社製)を使用して、ジデオキシヌクレオチドシークエンシング法により行った。さらに、各クローンがコードするアミノ酸配列を塩基配列により推定した。また、これらのクローンの塩基配列について、GenBankを用いて相同性検索を行った。その結果は上記表1に示した。なお、得られた7個のcDNAクローン(クローン1〜7)のうちクローン3は、上記遺伝子発現クローニング法で得た当初のクローンの塩基配列が相同性の高いWHSC2遺伝子と比較して5′末端領域において25bp短かったので、その完全長のcDNAをPanc−1細胞のcDNAライブラリーから、32P標識当該クローンをプローブとして用いて標準的コロニーハイブリダイゼーション法で得たものである。
図3(A)および図3(B)に示したように、クローン1〜7はそれぞれOK−CTLにより認識され、OK−CTLのIFN−γ産生を促進した。しかし、HLA−A0207cDNAと陰性コントロールとして使用したcDNAクローンとを共遺伝子導入したCOS−7細胞、またはcDNAクローン1〜7のいずれか1つとHLA−A2402若しくはHLA−A2601のcDNAとを共遺伝子導入したCOS−7細胞は、OK−CTLpに認識されず、IFN−γは産生されなかった。また、cDNAクローン1〜6の濃度を変えて、100ngのHLA−A0207またはHLA−A2402cDNAとCOS−7細胞に共遺伝子導入したところ、用量依存的にOK−CTLによるIFN−γ産生が観察された〔図4の(A)〜(F)〕。
また、これら遺伝子のmRNA発現をノーザンブロット分析により検討したところ、遺伝子5を除いて同様の発現パターンがみられた。これら遺伝子は、癌細胞でも正常細胞でも普遍的に発現されているが、Panc−1細胞、SW620細胞、およびCA9−22細胞等の腫瘍細胞での発現レベルはPHAで刺激したT細胞やエプスタインバーウイルスで形質転換されたB細胞(EBV−B)等の正常細胞での発現より有意に高かった。遺伝子5のmRNA発現が本実験条件で殆ど検知できなかったのは、32P標識したクローン5を用いたコロニーハイブリダイゼーションによっても約1×106cDNAライブラリーから3個のクローンしか得られないように、遺伝子5の発現が稀であるためと考えられる。
実施例3
(OK−CTLクローンの樹立)
腫瘍抗原を認識して活性化されるCTLは、複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であると考えられるので、上記のOK−CTLpを限界希釈培養(0.3、0.5、1、2および4細胞/ウエル)によりクローン化してOK−CTLクローンを得た(J.Immunol.,163:4997−5004,1999)。これらのクローンは、上記7個のcDNAクローンのいずれかの100ng/ウエルとHLA−A0207cDNAの100ng/ウエルとを共遺伝子導入したCOS−7細胞または腫瘍細胞と、細胞比1:1で培養し、そのIFN−γ産生能を測定することによりCTL活性を有するクローンを選択したものである。まず、親株OK−CTLpから、限界希釈培養によって300個のCTLクローンを得た。そのうち80個のCTLクローンが、HLA−A2拘束性腫瘍特異的CTL活性を示し、かつCD3+CD4−CD8+およびTCRαβ+の表現型を発現するCTLクローンであった。それらのうち、2個、3個、1個、3個、2個、および4個のCTLクローンが、それぞれクローン1、クローン2、クローン3、クローン4、クローン5、およびクローン6を発現したCOS−7細胞に対して反応性を示した。すなわち、CTLクローンにより、認識する腫瘍抗原が異なることがわかった。表4に典型的な15個のCTLクローンについてデータを示した。このことから、OK−CTLp、すなわち癌患者のCTLは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることが示唆された。
実施例4
(腫瘍抗原ペプチドの調製およびそのCTL誘導活性)
実施例2で得られたHLA−A2拘束性にCTLを誘導し得る7つの腫瘍抗原遺伝子由来の腫瘍抗原ペプチドを得るために、HLA−A2に結合し得るモチーフ(規則的配列)を有するペプチドについて文献(J.Immunol.,152:163,1994)(Immunogenetics,41:178,1994)検索し、得られたモチーフに基づいて、上記遺伝子1〜7がコードするアミノ酸配列並びにこれらと高い相同性を有するUBE2V、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、ppMAPkkk、2−5 OAS3、およびCPSFのアミノ酸配列から、それぞれ異なる9〜11merのペプチドを設計し、自体公知の方法で合成した。得られたペプチドの純度はいずれも70%以上であった。
HLA−A0201分子へのペプチドの結合活性は、T2細胞変異株を用いて試験した(Cancer Res.,54:1071−1076,1994)。T2細胞は、TAP欠損のため、HLA−A2分子がペプチドと結合しない形で細胞表面に発現している。まず、合成したペプチド(10μM)とT2細胞とを26℃で3時間インキュベーションし、次いで5%CO2−95%Airの条件下37℃で3時間インキュベーションして、該ペプチドがHLA−A2により細胞表面上に表出されたT2細胞を得た。この細胞を抗HLA−A2mAb(BB7.2)とインキュベーションし、R−フィコエリスリン(phycoerythrin)を結合したF(ab′)2ウサギ抗マウス・イムノグロブリン(Ig)(DAKO社製)で染色し、FACScan(Beckton Dickinson社製)で発現パターンを分析することにより、ペプチドの結合したHLA−A0201分子が細胞表面上に発現されていることが確認できた。
CTLによるペプチドの認識を試験するために、それぞれのペプチド(10μM)で予めパルスしたT2細胞を標的細胞(T)として用い、OK−CTLp若しくはOK−CTLクローンをエフェクター細胞(E)として用いて、標的細胞とエフェクター細胞とを18時間インキュベーションして上清を回収し、上清中のIFN−γをELISAで測定した。エフェクターとしてOK−CTLpを用いるときはE/T比を10:1とし、OK−CTLクローンを用いるときは2:1として試験を行った。また、OK−CTLクローンを用いてペプチドのCTL活性化能を検討するときは、検討するペプチドに対して該ペプチドをコードする遺伝子産物を認識するクローンを用いた。ペプチドをパルスしていないT2細胞に対するOK−CTLpまたはOK−CTLクローンのIFN−γ産生をバックグランドとして各測定値から減算し、結果を図5〜図10に示した。図5、図6、図7、図8、図9、および図10はそれぞれ、遺伝子1およびUBE2V、遺伝子2およびHNRPL、遺伝子3およびWHSC2、遺伝子4およびEIF4EBP1、遺伝子5およびppMAPkkk、並びに遺伝子6および2−5 OAS3由来のペプチドについての結果を示す。
さらに、T2細胞とインキュベーションするときの各ペプチドの濃度を変えてCTLクローン活性化能を検討し、各ペプチドが用量依存性にCTLクローンを活性化し得ることを見い出した。遺伝子1およびUBE2V、遺伝子2およびHNRPL、遺伝子3およびWHSC2、遺伝子4およびEIF4EBP1、遺伝子5およびppMAPkkk、並びに遺伝子6および2−5 OAS3由来のペプチドの代表的な例をそれぞれ図11の(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、および(F)に示す。また、遺伝子7およびCPSF由来のペプチドについては表5に示す。表5おいてEBV由来のペプチドおよびインフルエンザウイルス由来のペプチドは、CTLを活性化し得る陽性コントロールである。
これらの結果、上記表2に示すペプチドがOK−CTLpおよび/またはOK−CTLクローンを活性化してIFN−γを産生させ得ることが判明した。
実施例5
(ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのCTL誘導)
実施例4において、OK−CTLpまたはOK−CTLクローンからIFN−γ産生を促進し得たペプチドのうちP1〜P19について、癌患者末梢血単核細胞からのCTL誘導能を検討した。ペプチドでCTLを誘導する方法は、既知の方法に準じた(J.Exp.Med.,187:277−288,1998)(Cancer Res.,59:4056−4063,1999)。まず、OK−CTLpを得た大腸癌患者由来の自己末梢血単核細胞(PBMC)をペプチド(10μM)と共にインキュベーションした。この細胞を、培養7日目および14日目に、同じペプチド10μMで2時間パルスして放射線照射(30グレイ)した自己PBMCを抗原提示細胞(APC)として用いて再刺激した。培養21日目に、細胞を回収して、表面表現型について試験した。さらにこの細胞の種々の標的細胞に対する認識を、該標的細胞と共に培養したときに産生されるIFN−γをELISAで測定し、これを指標として検討した。標的細胞としては、HLA−A2+腫瘍細胞であるSW620細胞、CA9−22細胞、およびPanc−1細胞を用いた。結果を表6に示す。
19個のペプチドのうち、P1、P3、P5、P6、P8、P9、P10、P11、P13、P14、P15、P17、またはP18を用いてインビトロで刺激したPBMCは、HLA−A2+腫瘍細胞であるSW620細胞、CA9−22細胞、およびPanc−1細胞を認識して有意なレベルのIFN−γを産生した。しかし、当該PBMCは、HLA−A2−腫瘍細胞をほとんど認識しなかった。また、P2、P4、P7、P12、P16も、HLA−A2+腫瘍細胞のいずれかを認識するCTLを誘導した。P19で刺激したPBMCは、HLA−A2を発現する腫瘍細胞のみでなく他のHLAを発現する腫瘍細胞をも認識した。これらCTLからのIFN−γ産生は、抗HLAクラスImAb、抗CD8mAb、または抗HLA−A2mAbによって阻害されたが、他のmAbでは阻害されなかった。さらに、2人のHLA−A0201+患者(膵臓癌患者および大腸癌患者)の血液から末梢血単核細胞(PBMC)を調製して、ペプチドによるCTL誘導の検討を行ったところ、同様の結果が得られた。すなわち、上記のペプチドは患者末梢血単核細胞からHLA−A2拘束性CTLを誘導し得ることが判明した。
HLA−A0201分子へのペプチド結合親和性は、HLA−A2分子の比平均蛍光強度(MFI)(relative mean fluorescence intensity)として表した。陽性または陰性コントロールのMFIは、各々898または490であった。ペプチドのHLA−A0201分子への結合親和性は、ペプチドによるCTLの誘導とは相関していないと考えられる。
さらに、これら19個のペプチドについて、それらのCTL活性化能を51Cr遊離試験による標的細胞に対する傷害性を指標として直接的に確認した。まず、上記CTLが誘導されたPBMCをさらに、自己のAPC、IL−2、および対応するペプチドの存在下で再培養して増殖させた。再培養の約21〜28日目にPBMCを回収し、その細胞傷害性をIFN−γの測定と6時間の51Cr遊離試験とにより再試験した。結果を図12〜図17に示す。これらのペプチドで刺激した癌患者のPBMCは、HLA−A2+腫瘍細胞を溶解した(lysis)。しかし、HLA−A2−腫瘍細胞RERF−LC−MS並びにHLA−A2を発現しているが正常細胞由来の自己EBV−B細胞およびPHAで刺激したT細胞は溶解しなかった。ただし、ペプチドP14、P15、およびP17で刺激したPBMCは、自己EBV−B細胞に対する細胞傷害性も示した。また、P19で刺激したPBMCは、自己EBV−B細胞に対する傷害性が高かった。さらに、これらのペプチドで刺激したPBMCは、PBMCの刺激に用いたペプチドと同一のペプチドをパルスしたT2細胞に対してペプチドの用量依存的に細胞傷害性を示した。代表的な例を図18の(A)〜(E)に示す。これらのことから、上記ペプチドが癌患者の末梢血単核細胞からHLA−A2拘束性に細胞傷害性を示すCTLを誘導し得ることが判明した。
実施例6
(ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのCTL誘導)
実施例4で得た腫瘍抗原ペプチドのうち、遺伝子7およびCPSF由来のペプチドP20〜P32のうち、純度が95%以上の6個のペプチド(P21、P22、P24、P26、P30、およびP32)についてヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのインビトロでのCTL誘導能を、IFN−γ産生を指標にして検討した。用いたPBMCは、16人のHLA−A2陽性の癌患者(膵臓癌4人、胃癌7人、および大腸癌5人)並びに6人の健常人の末梢血からそれぞれ常法通り調製した。まず、PBMCの1×105個を96ウエルU底型マイクロカルチャープレート(Nunc社製)の各ウエルに加え、10μMの上記各ペプチドと共に200μlの培養培地中でインキュベーションした。培地は45%RPMI−1640、45%AIM−V(Invitrogen社)、10%牛胎児血清(FCS)、100U/mlのヒト・インターロイキン−2、および0.1μM MEM ノンエッセンシャル・アミノ酸溶液(Invitrogen社)からなる。培養4日目および7日目に半量の培地を除き、対応する各ペプチドを含む上記組成の培地と交換した。培養10日目に細胞を回収して洗浄し、対応する各ペプチドをパルスしたT2細胞と反応させ、産生されるIFN−γ量を測定した。
また、ペプチドで刺激して10日間培養した上記細胞をさらに10日間培養し、得られた細胞のPanc−1膵臓腺癌細胞(HLA−A2)に対する細胞傷害性を、E/T比10:1における標準的な6時間の51Cr遊離試験で測定し、得られた結果を%特異的溶解で表した(表7)。同時にHLA−A2−腫瘍細胞であるSSTW−9腫瘍細胞に対する細胞傷害性を測定してバックグランドとし、上記結果から減算した。
その結果、P21、P22、P23、P26、P30、およびP32によるPBMCからの各ペプチドに特異的なHLA−A2拘束性CTL誘導が、上記16人の癌患者のうちそれぞれ31%(5/16)、38%(6/16)、25%(4/16)、31%(5/16)、44%(7/16)、および7%(1/16)の患者で認められた。また、P21およびP22により、健常人PBMCからのCTL誘導が、それぞれ50%(3/6)および33%(2/6)で認められたが、他のペプチドは健常人のPBMCからはCTLを誘導しなかった(表7)。また、ペプチドを用いて癌患者PBMCから誘導された上記CTLは、Panc−1膵臓腺癌細胞の他にも、HLA−A2+腫瘍細胞であるSW620大腸腺癌細胞(HLA−A2/A24)およびKWS胃腺癌細胞(HLA−A2)に対する細胞傷害性を示したが、HLA−A2−腫瘍細胞であるSSTW9胃腺癌細胞(HLA−A24)やHLA−A2を発現していても腫瘍細胞ではないPHA芽球化T細胞およびEBV形質転換B細胞は溶解しなかった。上記CTLによる腫瘍細胞の認識は、抗HLAクラスImAb、抗CD8mAb、または抗HLA−A2mAbによって阻害されたが、他のmAbでは阻害されなかった。
実施例7
(腫瘍抗原をコードするcDNAクローンの単離・同定)
膵臓腺癌細胞株CFPAC−1のcDNAライブラリーからSEREX(Serological analysis of recombinant cDNA expression libraries)法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:11910−11813,1995)により検出され既に報告されている腫瘍抗原をコードする遺伝子(Biochem.Biophys.Res.Commun.,281:936−944,2001)から、実施例2と同様の方法で、HLA−A2拘束性にCTLを活性化し得る2つの腫瘍抗原遺伝子、KM−PA−2およびKM−PA−4を見い出した。まず、KM−PA−2、KM−PA−4、KM−PA−5、KM−PA−14、KM−PA−15、およびKM−PA−18をコードするcDNAクローンをそれぞれEcoRIおよびXhoIで消化したpBluescriptベクターに組込み、pCMV−SPORT2に挿入した。これらcDNAを濃度を変えてそれぞれHLA−A0207またはHLA−A2402とともにCOS−7細胞に共発現させた。このCOS−7細胞を標的細胞として、OK−CTLpとともにインキュベーションした。その結果、KM−PA−2またはKM−PA−4とHLA−A0207とを共遺伝子導入したCOS−7細胞が、OK−CTLpからのIFN−γ産生を遺伝子の用量依存的に誘導した〔図19の(A)および(B)〕。SEREX法は、腫瘍抗原の検出に用いることができる方法であるが、同方法で検出された1,500種余りの腫瘍抗原のうち細胞性および液性免疫を惹起し得る腫瘍抗原として同定されたものはMAGE−1、チロシナーゼ、およびNY−ESO−1のみである。従って、SEREX法により同定された腫瘍抗原をコードする遺伝子であってもCTLを活性化し得るとは限らない。上記腫瘍抗原遺伝子、KM−PA−2およびKM−PA−4がHLA−A2拘束性にCTLを活性化し得ることは、本発明において初めて見い出された。
実施例8
(腫瘍抗原ペプチド調製および癌患者PBMCからのCTL誘導活性)
実施例7で得られた腫瘍抗原遺伝子KM−PA−2およびKM−PA−4由来の腫瘍抗原ペプチドを得るために、KM−PA−2およびKM−PA−4がコードするアミノ酸配列に基づいて実施例4と同様にそれぞれ異なる9〜10merのペプチドを設計して自体公知の方法で合成した。
合成したペプチドについて、OK−CTLpを得た大腸癌患者末梢血単核細胞からのCTL誘導能を実施例6と同様に検討した。その結果、図20の(A)および(B)に示すように、KM−PA−2由来のペプチドP33〜P41(配列表の配列番号33〜41)およびKM−PA−4由来のペプチドP42〜P44(配列表の配列番号42〜44)のいずれかを用いてインビトロで刺激したPBMCは、該PBMCの刺激に用いたペプチドに対応するペプチドをパルスしたT2細胞〔図20(A)および(B)の左図〕、またはHLA−A2+腫瘍細胞であるPanc−1細胞〔図20(A)および(B)の右図〕を認識してIFN−γを産生した。しかし、HLA−A2−腫瘍細胞にはほとんど反応しなかった。これらのことから、上記12個のペプチドはいずれも癌患者PBMCからHLA−A2拘束性に抗原特異的なCTLを誘導し得ること、また誘導されたCTLはHLA−A2拘束性に上記ペプチドを認識してIFN−γを産生することが判明した。さらに、ペプチドにより誘導されたこれらCTLの細胞傷害性を51Cr遊離試験により実施例6と同様に直接的に確認した。その結果の代表例を図21に示す。図21に示したようにP35、P39、またはP40により癌患者PBMCから誘導されたCTLは、HLA−A2+腫瘍細胞であるPanc−1細胞およびYPK−3細胞を溶解した(lysis)。しかし、HLA−A2−腫瘍細胞PaCa−2、EBV−B細胞株OKAB2、およびPHAで刺激したT細胞は溶解しなかった。すなわち、上記のペプチドが癌患者の末梢血単核細胞からHLA−A2拘束性に細胞傷害性を示すCTLを誘導できることが確認できた。また、OK−CTLpを得た大腸癌患者以外の癌患者、例えば膵臓癌患者から得たPBMCからも、上記ペプチドによりCTLが誘導された。
実施例9
上記ペプチドを認識するCTLクローンの細胞表面に発現しているTCRの表現型(Phenotype)を決定するため、実施例3で得た各CTLクローン5×106個からRNAzolTMB(TEL−TEST社製)を用いてそれぞれの全RNAを得た。cDNAを、First Strand cDNA synthesisのためのSuperScriptTM Preamplification System(Invitrogen社製)を使用して調製した。一本鎖cDNAを、22種類の異なったVβプライマー(Vβ1〜20)と3’Cβプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅した。PCRは94℃で1分間の変性、58℃で2分間のアニーリング、72℃で3分間の伸長を1サイクルとして35サイクル行った。PCR産物は、プラスミドpCR2に挿入し、TAクローニングシステム(Invitrogen社製)を使用して大腸菌に形質転換し、コロニーの選択を行い、得られたコロニーからプラスミドを調製してcDNAの配列決定を行った。
その結果、UBE2Vおよび遺伝子1由来のペプチド、HNPRLおよび遺伝子2のペプチド、並びに2−5 OAS3および遺伝子6由来のペプチドに反応する各2つのCTLクローンが、それぞれTCR・Vβ8.1、TCR・Vβ3.2、およびTCR・Vβ14を発現していた。また、WHSC2および遺伝子3由来のペプチド、EIF4EBP1および遺伝子4由来のペプチド、並びにppMAPkkkおよび遺伝子5由来のペプチドを認識するCTLクローンは、それぞれ、TCR・Vβ13.1、TCR・Vβ8.1、およびTCR・Vβ18を発現していた(表8−1および表8−2)。
また、UBE2Vおよび遺伝子1由来のペプチド、HNPRLおよび遺伝子2のペプチド、並びに2−5 OAS3および遺伝子6由来のペプチドを認識する各2つのCTLクローンは、それぞれ異なった相補性決定領域3(CDR3)(HLAクラスI分子の溝上の抗原エピトープへの結合性を担う要素)を有するTCRを発現していた。WHSC2および遺伝子3由来のペプチド、EIF4EBP1および遺伝子4由来のペプチド、並びにppMAPkkkおよび遺伝子5由来のペプチドを認識するCTLクローンもそれぞれ異なったCDR3を有するTCRを発現していた。各CDR3のアミノ酸配列は表6に下線で示したアミノ酸配列である。
産業上の利用の可能性
本発明により、HLA−A2拘束性の細胞傷害性T細胞を誘導せしめることができ、膵臓癌、大腸癌、および胃癌等の特異的免疫療法が可能となる。HLA−A2対立遺伝子は、アフリカ黒人の23%、中国人の53%、日本人の40%、北アメリカコーカサス人の49%、および南アメリカコーカサス人の38%でみられる。従って、本発明は、癌治療において多大な貢献を期待し得る。また、本発明は、膵臓癌細胞、大腸癌細胞、および胃癌等のT細胞による認識に関する分子の基礎的研究にも多大に寄与するものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、OK−CTLp(HLA−A0207/A3101)がHLA−A2拘束性に腫瘍細胞を溶解することを示す。
図2は、OK−CTLpによるヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1の認識とその結果としてのインターフェロン−γ産生が、HLA−A2拘束性であることを示す。
図3は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得たcDNAクローン1〜6〔図中(A)〕およびクローン7〔図中(B)〕をそれぞれHLA−A2と共に発現させたCOS7細胞を、HLA−A2拘束性にOK−CTLpが認識することを示す。
図4は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得たcDNAクローン1〜6が、用量依存的にOK−CTLpに認識されることを示す。図中、(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、および(F)はそれぞれ、UBE2V、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、ppMAPkkk、および2−5 OAS3と高い相同性を有するcDNAクローン1〜6をそれぞれHLA−A2と共に発現させたCOS7細胞を、HLA−A2拘束性にOK−CTLpが認識することを示す。また、図中の記号−■−は上記各腫瘍抗原遺伝子と共にHLA−A0207遺伝子を標的細胞で発現させたときのOK−CTLpにより産生されたインターフェロンγ量を示し、−◇−は上記各腫瘍抗原遺伝子と共にHLA−A240遺伝子を標的細胞に発現させたときのOK−CTLpにより産生されたインターフェロンγ量を示す。
図5は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得たUBE2Vと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子1の遺伝子産物に由来する5つのペプチドを、OK−CTLpまたはOK−CTLクローンが認識することを示す。
図6は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得たHNRPLと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子2の遺伝子産物に由来する4つのペプチドを、OK−CTLpまたはOK−CTLクローンが認識することを示す。
図7は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得たWHSC2と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子3の遺伝子産物に由来する4つのペプチドを、OK−CTLpまたはOK−CTLクローンが認識することを示す。
図8は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得たEIF4EBP1と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子4の遺伝子産物に由来する2つのペプチドを、OK−CTLpまたはOK−CTLクローンが認識することを示す。
図9は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得たppMAPkkkと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子5の遺伝子産物に由来する3つのペプチドを、OK−CTLpまたはOK−CTLクローンが認識することを示す。
図10は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得た2−5 OAS3と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子6の遺伝子産物に由来する1つのペプチドを、OK−CTLpまたはOK−CTLクローンが認識することを示す。
図11は、ヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1から得た腫瘍抗原遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが用量依存的にOK−CTLクローンに認識されることを、代表的なペプチドについて示した図である。図中、(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、および(F)はそれぞれ、UBE2V、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、ppMAPkkk、および2−5 OAS3と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子1〜6の遺伝子産物由来のペプチドがOK−CTLpに認識されることを示す。
図12は、UBE2Vと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子1の遺伝子産物に由来する3つのペプチドが、HLA−A2+腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するCTLを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。図中の記号−■−はヒト膵臓腺癌細胞株Panc−1(HLA−A0201/1101)を、−◆−はヒト大腸腺癌細胞株SW620(HLA−A0201/2402)を、−○−はHLA−A2−肺腺癌細胞株RERF−LC−MS(HLA−A1101/1101)を、−△−はEBV形質転換自己B細胞(HLA−A0207/3101)を、−□−はPHA芽球化自己T細胞(HLA−A0207/3101)を示す。これらの記号の説明は、下記図13から図17の説明に援用される。
図13は、HNRPLと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子2の遺伝子産物に由来する2つのペプチドが、HLA−A2+腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するCTLを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図14は、WHSC2と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子3の遺伝子産物に由来する2つのペプチドが、HLA−A2+腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するCTLを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図15は、EIF4EBP1と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子4の遺伝子産物に由来する2つのペプチドが、HLA−A2+腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するCTLを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図16は、ppMAPkkkと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子5の遺伝子産物に由来する1つのペプチドが、HLA−A2+腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するCTLを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図17は、2−5 OAS3と高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子6の遺伝子産物に由来する1つのペプチドが、HLA−A2+腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有するCTLを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図18は、腫瘍抗原ペプチドが、HLA−A2拘束性に且つペプチド用量依存的に細胞傷害活性を示すCTLを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。図中、(A)、(B)、(C)、(D)、および(E)はそれぞれ、UBE2V、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、およびppMAPkkkと高い相同性を有する腫瘍抗原遺伝子1〜6の遺伝子産物由来のペプチドが癌患者末梢血単核細胞からHLA−A2拘束性に該ペプチドを認識するCTLを誘導することを示す。図中の記号−■−は腫瘍抗原ペプチドを発現させたT2細胞、−◇−はPHA芽球化自己T細胞を示す。
図19は、ヒト膵臓腺癌細胞株CFPAC−1から得た腫瘍抗原遺伝子KM−PA−2〔図中(A)〕およびKM−PA−4〔図中(B)〕の遺伝子産物が、HLA−A2拘束性にOK−CTLpにより認識されることを示す。
図20は、ヒト膵臓腺癌細胞株CFPAC−1から得た腫瘍抗原遺伝子KM−PA−2およびKM−PA−4由来のペプチド〔図中それぞれ(A)および(B)〕が、該PBMCの刺激に用いたペプチドに対応するペプチドをパルスしたT2細胞〔図中(A)および(B)ともに左側の図〕およびHLA−A2+腫瘍細胞Panc−1〔図中(A)および(B)ともに右側の図〕に対する細胞傷害性を有するCTLを、癌患者末梢血単核細胞から誘導し得ることを示す。
図21は、ヒト膵臓腺癌細胞株CFPAC−1から得た腫瘍抗原遺伝子KM−PA−2由来のペプチドにより癌患者末梢血単核細胞から誘導されたCTLが、HLA−A2拘束性に腫瘍細胞を溶解することを示す。
Claims (19)
- 配列表の配列番号1〜44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列表の配列番号45〜47及び配列番号49〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 配列表の配列番号1〜44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45〜47及び配列番号49〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドからなる医薬。
- 配列表の配列番号1〜44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有する癌ワクチン。
- 配列表の配列番号1〜44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有し、膵臓癌、大腸癌、若しくは胃癌の治療に用いられる癌ワクチン。
- 配列表の配列番号1〜44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドを含有する細胞傷害性T細胞の誘導剤。
- 配列表の配列番号1〜44のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列表の配列番号45〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる1種以上のペプチドまたはポリペプチドを使用することを特徴とする人の生体外での細胞傷害性T細胞の誘導方法。
- 配列表の配列番号1〜47及び配列番号49〜53のいずれか1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
- 配列表の配列番号54〜56及び配列番号58〜62のいずれか1に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
- 配列表の配列番号54〜56及び配列番号58〜62のいずれか1に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞傷害性T細胞を誘導するおよび/または細胞傷害性T細胞により認識される、ポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
- 請求項8〜10のいずれか1に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖を含有する組換えベクター。
- 請求項8〜10のいずれか1に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖を含有する発現組換えベクター。
- 請求項8〜10のいずれか1に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖を含有する組換えベクター若しくは発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
- 請求項8〜10のいずれか1に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖を含有する発現組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、請求項1に記載のポリペプチドまたは請求項2に記載のポリペプチドの製造方法。
- 請求項1に記載のペプチドまたは請求項2に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体。
- 請求項1に記載のペプチド若しくは請求項2に記載のポリペプチドおよび/またはHLA−A2と相互作用して少なくともHLA−A2拘束性細胞傷害性T細胞による該ペプチド若しくは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および/または請求項8〜10のいずれか一に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、請求項1に記載のペプチド、請求項2に記載のポリペプチド、請求項8〜10のいずれか一に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、請求項11若しくは12に記載の組換えベクター若しくは発現組換えベクター、請求項13に記載の形質転換体、または請求項15に記載の抗体のうちの少なくとも1つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
- 請求項3に記載の医薬、請求項4若しくは請求項5に記載の癌ワクチン、または請求項6に記載の細胞傷害性T細胞の誘導剤からなる癌疾患治療剤。
- 請求項1に記載のペプチド若しくは請求項2に記載のポリペプチドまたは請求項8〜10のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法。
- 請求項1に記載のペプチド若しくは請求項2に記載のポリペプチドまたは請求項8〜10のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法に使用する試薬キットであって、請求項1に記載のペプチド、請求項2に記載のポリペプチド、請求項8〜10のいずれか1に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または請求項15に記載の抗体を少なくとも1つ以上含んでなる試薬キット。
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