JP2023503840A - 免疫療法のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、例えば腫瘍特異的な遺伝子改変されたリンパ球のサブセットを養子移入することによって、細胞免疫療法により媒介される免疫応答を付与しかつ/または増大させるための方法および組成物に関する。本開示は、免疫系と、自然および適応免疫応答とを調節する能力を有する少なくとも2つのトランスジーンを発現する遺伝子改変リンパ球を含む組成物を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、35U.S.C.§119（e）の下で、2019年11月14日に出願された米国仮特許出願第62/935,308号に基づく優先権を主張するものである。前述の出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本発明は、一般に、対象における癌または腫瘍を治療するための組成物および方法に関し、さらに特定すると、対象の免疫系を調節することによって対象における癌または腫瘍を治療するための組成物および方法に関する。

発明の背景
養子細胞移入または養子細胞療法（adoptive cell therapy：ACT）は癌患者の治療法として有望視されている。しかし、それは2つの大きな障害に直面しており、すなわち、移植された細胞の癌患者体内での短期生存と、敵対的な免疫抑制性の腫瘍微小環境である。

これらの限界を克服するために、いくつかの選択肢が提案されている。例えば、ある治験では、ACTと同時にインターロイキン2（IL-2）を投与することが試験された。IL-2は強力な免疫賦活剤である；そのため、それは免疫反応を促進して、移植された細胞の生存率を高める。ところが、この方法はIL-2に伴う毒性のために成功しなかった。米国特許第7,381,405号（特許文献1）は、IL-2を分泌するACT用のIL-2遺伝子導入リンパ球を調製する方法を記載している。このアプローチは、リンパ球が自身の成長因子（IL-2など）を分泌するため、インビボでの生存のために他の外因性因子にあまり依存しないという仮説に基づいている。インビトロ設定での成功した結果にもかかわらず、臨床治験ではこのアプローチは有効でないと判断された。IL-2遺伝子導入リンパ球は、癌を治療する上で非導入リンパ球よりも有効でなかった（Heemskerk et al., Human Gene Therapy, 2008（非特許文献1））。

キメラ抗原受容体（CAR）T細胞の出現は、ACTを改善するための有用なツールを提供してきた。TRUCK（国際公開WO 2017/108805（特許文献2））およびArmored CAR（米国特許第10,124,023号（特許文献3））は、それぞれ、組換えインターロイキン12（IL-12）およびCD40Lを分泌するようにさらに遺伝子改変されたCAR T細胞の代表例である。しかし、これらの戦略には欠点がある。例えば、TRUCKでは、高いトランスジェニックIL-12の産生がT細胞の増殖を制限してアポトーシスを増加させ、治療効果は限定的であった。また、armored CAR T細胞の臨床応用は、これまで液性腫瘍に限定されてきた。

固形腫瘍とその微小環境は、ACT療法の成功に一連の課題を与えてきた。これらの課題には、腫瘍の効率的な移行（trafficking）と浸潤、および腫瘍介在性免疫抑制の克服が含まれる。多くの努力にもかかわらず、最先端のACT療法は、免疫抑制性の固形腫瘍微小環境内での長期有効性のための機能的持続性を提供していない。

したがって、細胞に機能的持続性を与え、かつ/または免疫抑制性の腫瘍微小環境を克服するためにサイトカイン環境を変化させることができる新規ACT療法を特定することの差し迫った必要性が存在している。

米国特許第7,381,405号 国際公開WO 2017/108805 米国特許第10,124,023号

Heemskerk et al., Human Gene Therapy, 2008

本開示は、多くの局面において上記の必要性に対処するものである。一局面において、本開示は、対象の免疫系を調節するための少なくとも2つのトランスジーン（例えば、治療用トランスジーン）を発現する複数の遺伝子改変リンパ球を含む、組成物を提供する。

いくつかの態様では、トランスジーンは、抗体、抗体フラグメント、受容体、デコイ（decoy）、チェックポイント遮断モジュレーター、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、細胞排除タグ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。

いくつかの態様では、デコイは、PD1、CTLA4、LAG3、VEGFR1、TIM3、TIGIT、およびSIRPαデコイからなる群より選択される。ある態様では、デコイはPD1デコイである。ある態様では、PD-1デコイは、PD-1.IgG4（例えば、PD-1.IgG4Fc）デコイである。

いくつかの態様では、サイトカインは、LIGHTまたはそのバリアント/断片、IL-33またはそのバリアント/断片、IL-2またはそのバリアント/断片、IL-15またはそのバリアント/断片、IL-12またはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、サイトカインは変異型サイトカインである。

いくつかの態様では、細胞排除タグは、tEGFR、Her2、CD20、およびCD19からなる群より選択される。

いくつかの態様では、少なくとも2つのトランスジーンは、PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、IL-2バリアント/断片、LIGHTまたはそのバリアント/断片、IL-33またはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片の2つ以上を含む。いくつかの態様では、少なくとも2つのトランスジーンは、切断型EGFR（tEGFR）もしくはそのバリアント/断片、切断型HER2（tHER2）もしくはそのバリアント/断片、またはCD20もしくはそのバリアント/断片をさらに含む。いくつかの態様では、PD-1デコイもしくはそのバリアント/断片と、tEGFRもしくはそのバリアント/断片（またはtHER2もしくはそのバリアント/断片、CD20もしくはそのバリアント/断片、CD19もしくはそのバリアント/断片）が同じベクター上に保持される。

いくつかの態様では、少なくとも2つのトランスジーンは、（a）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびtEGFRまたはそのバリアント；（b）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアント；（c）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアント；（d）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアント；（e）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアント；（f）PD-1デコイまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびIL-33またはそのバリアント；（g）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-2バリアント；（h）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびLIGHTまたはそのバリアント；（i）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-33またはそのバリアント；（j）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント；（k）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびIL-33またはそのバリアント；（l）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント；または（m）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-33バリアント、およびCD40Lまたはそのバリアントを含む。

いくつかの態様では、PD-1デコイは、SEQ ID NO：1～4、6～17、42、44、47～48および51～52のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：1～4、6～17、42、44、47～48および51～52のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、IL-2バリアントは、SEQ ID NO：21～23のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：21～23のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、IL-33は、SEQ ID NO：25および27のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：25および27のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、LIGHTは、SEQ ID NO：28～29および31のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：28～29および31のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、CD40Lは、SEQ ID NO：32～34、36、および38のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：32～34、36、および38のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、tEGFRは、SEQ ID NO：40に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：40のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、HER2は、SEQ ID NO：45に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：45のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、CD20は、SEQ ID NO：49に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：49のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、トランスジーンは、VEGF、TGF-B、4-1BB、CD28、CD27、NKG2D、PD1、PDL1、およびCTLA4抗体からなる群より選択される抗体または抗体フラグメントを含む。ある態様では、抗体はPD1抗体である。

いくつかの態様では、複数のリンパ球は、少なくとも2つのリンパ球サブセットを含む。ある態様では、複数のリンパ球は、2つのリンパ球サブセットからなる。いくつかの態様では、複数のリンパ球の各サブセットは、少なくとも1つのトランスジーンを発現する。いくつかの態様では、少なくとも2つのトランスジーンは、互いに異なっている。

いくつかの態様では、複数のリンパ球は、（i）少なくとも2つのトランスジーンを発現する第1のサブセット；および（ii）少なくとも2つのトランスジーンを発現する第2のサブセットを含み、ここで、第1のサブセットのトランスジーンの少なくとも1つは、第2のサブセットのトランスジーンと異なっているか、または第1のサブセットのトランスジーンの少なくとも1つは、第2のサブセットのトランスジーンと共通している。

いくつかの態様では、（i）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現するか；（ii）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現するか；（iii）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現するか；（iv）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現するか；（v）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現するか；または（vi）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現する。

いくつかの態様では、第1のサブセットまたは第2のサブセットは、tEGFRもしくはそのバリアント、切断型HER2（tHER2）もしくはそのバリアント、CD20もしくはそのバリアント、またはCD19もしくはそのバリアントをさらに発現する。

いくつかの態様では、（i）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現するか；（ii）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現するか；（iii）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現するか；（iv）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現するか；（v）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現するか；または（vi）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現する。

いくつかの態様では、第1のサブセットまたは第2のサブセットは、tEGFRもしくはそのバリアント、tHER2もしくはそのバリアント、またはCD20もしくはそのバリアントをさらに発現する。

いくつかの態様では、これら2つのサブセットは、約1：1～約1：100の比率で組み合わされる。いくつかの態様では、これら2つのサブセットは、約1：1の比率で組み合わされる。

いくつかの態様では、リンパ球は自己由来である。いくつかの態様では、リンパ球は腫瘍浸潤リンパ球である。いくつかの態様では、リンパ球はキメラ抗原受容体（CAR）を発現する。いくつかの態様では、リンパ球は組換えT細胞受容体（TCR）を発現する。いくつかの態様では、組換えT細胞受容体（TCR）は、NY-ESO1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE A-10、MAGE-C2、SSX2、MAGE-A12、またはそれらの組み合わせに対する反応性を示す。

また、本開示の範囲内には、有効量の上記組成物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も含まれる。いくつかの態様では、薬学的組成物は第2の治療剤をさらに含む。

さらに、本開示では、有効量の上記組成物を含むキットが提供される。

別の局面において、本開示は、上記組成物を調製する方法を提供する。本方法は、（a）複数のリンパ球を提供する段階；（b）該複数のリンパ球に少なくとも2つのトランスジーンをコードする核酸分子を導入して、複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階；および（c）細胞培地中で該複数の遺伝子改変リンパ球を拡大培養する段階を含む。

あるいは、本方法は、（a）複数のリンパ球を提供する段階；（b）該複数のリンパ球に2つ以上の核酸分子を導入し、それによって複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階であって、該2つ以上の核酸分子の各々が少なくとも1つのトランスジーンをコードする、段階；および（c）細胞培地中で該複数の遺伝子改変リンパ球を拡大培養する段階を含む。

いくつかの態様では、少なくとも2つのトランスジーンは、PD-1デコイ、IL-2バリアント/断片、LIGHTまたはそのバリアント/断片、IL-33またはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片の2つ以上を含む。いくつかの態様では、少なくとも2つのトランスジーンは、tEGFRまたはそのバリアント/断片をさらに含む。いくつかの態様では、PD-1デコイもしくはそのバリアント/断片と、tEGFRもしくはそのバリアント/断片（あるいは、tHER2もしくはそのバリアント/断片、CD20もしくはそのバリアント/断片、またはCD19もしくはそのバリアント/断片）は、同じベクター上に保持される。

いくつかの態様では、前記方法は、（a）第1の複数のリンパ球に、少なくとも2つのトランスジーンをコードする第1の核酸分子を導入して、第1の複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階；および（b）第2の複数のリンパ球に、少なくとも2つのトランスジーンをコードする第2の核酸分子を導入して、第2の複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階を含む。

いくつかの態様では、前記方法は、第1の核酸を導入する工程の後に、細胞培地中で第1の複数のリンパ球を拡大培養する段階、または第2の核酸を導入する工程の後に、細胞培地中で第2の複数のリンパ球を拡大培養する段階をさらに含む。

いくつかの態様では、前記方法は、第1の複数の遺伝子改変リンパ球を、第1の複数の遺伝子改変リンパ球と、約1：1～約1：100（例えば、1：1）の所定の比率で組み合わせる段階をさらに含む。

いくつかの態様では、細胞培地は、規定された細胞培地である。いくつかの態様では、細胞培地は、ネオアンチゲンペプチドを含む。

さらに別の局面において、本開示は、対象における癌/腫瘍または慢性感染症を治療する方法をさらに提供する。この方法は、治療有効量の、上記のような組成物または薬学的組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む。

いくつかの態様では、前記癌は、メラノーマ、肉腫、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、MSI-high腫瘍、頭頸部腫瘍、腎臓癌、および乳癌からなる群より選択される。

いくつかの態様では、前記組成物は、静脈内注入により投与される。いくつかの態様では、前記方法は、第2の治療剤を対象に投与する段階をさらに含む。いくつかの態様では、第2の治療剤は、抗癌剤または抗腫瘍剤である。いくつかの態様では、前記組成物または薬学的組成物は、第2の治療剤の前、後またはそれと同時に対象に投与される。

前述の概要は、本開示のあらゆる局面を定義することを意図したものではなく、以下の詳細な説明などの他のセクションには、追加の局面が記載される。本文書全体は、統一された開示として関連付けられることを意図しており、本明細書に記載の特徴の組み合わせが本文書の同じ文、または段落、またはセクションに一緒に見出されない場合でも、本文書に記載の特徴の全ての組み合わせが想定されていることを理解すべきである。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本開示の特定の態様を示しているが、例示としてのみ与えられていることを理解されたい。なぜなら、本開示の精神および範囲内での様々な変更および修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。

OT-1 CD8⁺ T細胞が、PD1.IgG4デコイをIL-2バリアント（IL-2^Vという）、LIGHT、IL-33、またはCD40Lのいずれかと組み合わせて分泌するように遺伝子改変され得ることを示す一連の図である。図1Aは、OT-1 CD8⁺ T細胞がPD1.IgG4と変異型IL2の両方を分泌するように遺伝子改変されたことを示す。形質導入効率はFACSによって決定し（図1A；左パネル）、分泌はELISAによって評価した（図1A；中央および右パネル）。図1Bは、OT-1 CD8⁺ T細胞がPD1.IgG4とLIGHTの両方を分泌するように遺伝子改変されたことを示す。形質導入効率はFACSによって決定し（図1B；左および左中パネル）、分泌はELISAによって評価した（図1B；中右および右パネル）。図1Cは、OT-1 CD8⁺ T細胞がPD1.IgG4とIL-33の両方を分泌するように遺伝子改変されたことを示す。形質導入効率はFACSによって決定し（図1C；左および左中パネル）、分泌はELISAによって評価した（図1C；中右および右パネル）。図1Dは、OT-1 CD8⁺ T細胞がPD1.IgG4とCD40Lの両方を分泌するように遺伝子改変されたことを示す。形質導入効率はFACSによって決定し（図1D；左および左中パネル）、分泌はELISAによって評価した（図1C；中右および右パネル）。 図1-1の説明を参照のこと。 3つの免疫調節因子の組み合わせを分泌するように遺伝子改変されたOT-1 CD8⁺ T細胞の養子移入が、プレコンディショニングの非存在下で、定着した大きなB16-OVA腫瘍の腫瘍制御を有意に改善したことを示す一連の図である。図2Aおよび図2Bは、PD-1.IgG4、IL-2^V、およびLIGHTを分泌するOT-1 CD8⁺ T細胞を投与したマウスの腫瘍成長曲線（図2A）および全生存期間曲線（図2B）を示す。図2Cおよび図2Dは、PD-1.IgG4、IL-33、およびLIGHTを分泌するOT-1 CD8⁺ T細胞を投与したマウスの腫瘍成長曲線（図2C）および全生存期間曲線（図2D）を示す。図2Eおよび図2Fは、PD-1.IgG4、IL-33、およびIL-2^Vを分泌するOT-1 CD8⁺ T細胞を投与したマウスの腫瘍成長曲線（図2E）および全生存期間曲線（図2F）を示す。実験は1群6匹の動物を用いて盲検的に実施した。図2Gおよび図2Hは、PD-1.IgG4、IL-2^V、およびCD40Lを分泌するOT-1 CD8⁺ T細胞を投与したマウスの腫瘍成長曲線（図2G）および全生存期間曲線（図2H）を示す。生存期間解析は、ログランク（log-rank）のマンテル・コックス（mantel-cox）モデルを用いて行った。27日目の腫瘍成長の比較は、UT OT-1 CD8⁺ T細胞を投与したマウスに対して各群を比較するクラスカル・ウォリス（Kruskal Wallis）検定を用いて行った。多重比較の補正はダン（Dunn）検定を用いて行った；*p＜0.05、**p＜0.001、****p＜0.0001。 図2-1の説明を参照のこと。 直交的T細胞エンジニアリング（orthogonal T-cell engineering）が、養子移入されたCD8⁺ T細胞の増殖および内因性抗腫瘍免疫の動員を通じて、免疫能のある宿主におけるACT有効性を改善することを示す一連の図である。図3Aは、実験デザインを示す。図3Bは、17日目からの腫瘍体積の変化を示すウォーターフォールプロット（waterfall plot）である。1回目のACTの少なくとも12日後に各動物で観察された最良の応答（最小の腫瘍体積）を計算に使用した（* 腫瘍接種後24日目、** 腫瘍接種後31日目）。客観的奏効率（ORR）には、完全奏効（CR；腫瘍体積の100％減少）と部分奏効（PR；≦－30％の腫瘍変化）が含まれる。図3C、図3D、図3E、および図3Fは、B16-OVA腫瘍担持マウスが、示されるような遺伝子導入OT1細胞または非導入OT1細胞のいずれかで治療されたことを示す；その後、腫瘍を17日目と24日目に採取し、細胞の定量化をフローサイトメトリーにより行った。データは3回の独立した実験から得たものである（n≧5匹/群）。図3Cは、24日目のCD8⁺ TILの総数を示す。図3Dは、17日目と24日目のCD45.1⁺ OT1の総数を示す。図3Eは、17日目と24日目の内因性CD45.1^neg CD8 TILの総数を示す。図3Fは、24日目の内因性および外因性TCF1⁺ CD8⁺ TILの総数を示す。図3Gは、OT1および内因性TCF1⁺ CD8⁺ TILを示す、24日目の各実験群からの腫瘍切片の代表的な免疫蛍光顕微鏡写真を示す。塗りつぶされた三角形：TCF1⁺ OT1、白抜きの三角形：TCF1^negOT1、白の矢印：TCF1⁺ 内因性CD8⁺ TIL。図3Hは、PD1d/2^V/33+ OT-1細胞が、100μg/マウスの薬物FTY720（1回目の細胞移入の2日前に開始して3日おきにi.p.投与）でも治療されたB16-OVA-腫瘍担持CD8KOマウスまたはwtC57BL6マウスに、先に示したように投与されたことを示す。図3Iは、B16-OVA腫瘍担持マウスを示したように治療し、その後腫瘍を24日目に採取し、Tregの定量化をフローサイトメトリーにより行ったことを示す。データは3回の独立した実験から得たものである（n≧5匹/群）。CD8⁺/Treg比の棒グラフを示す。図3Jおよび図3Kは、1回目の細胞移入の1日前からi.p.投与し、3日おきに維持した、示された表面マーカーに特異的な枯渇抗体250μg/マウスの存在下または非存在下に、PD1d/2^V/33+ OT-1細胞で治療したB16-OVA腫瘍担持マウスの経時的な腫瘍成長制御を示す；CD4（腫瘍接種後55日目まで維持）（図3J）およびLy6G（図3K）。2つの独立した実験（n＝6匹/群）のうちの代表的な実験を示す（図3H、図3J、および図3K）。多重比較を補正するためのテューキー（Tukey）検定と組み合わせたブラウン・フォーサイス（Brown-Forsythe）およびウェルチ（Welch）ANOVA検定を、異なる群（図3C、図3D、図3E、および図3F）および腫瘍体積（図3H、図3J、および図3K）の比較に使用した。17日目と24日目（DおよびF）の比較には、ウェルチの補正を加えた両側スチューデントのt検定を使用した。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001、**** p＜0.0001。 図3-1の説明を参照のこと。 図3-1の説明を参照のこと。 直交的エンジニアリングが、終末型疲弊状態（terminal-exhausted state）および一過性のCX3CR1⁺ エフェクター様とは異なるエフェクター様CD8 T細胞の新規サブセットを誘導することを示す一連の図である。図4Aは、実験デザインを示す。B16-OVA腫瘍担持マウスを、示されたように治療した；その後、17日目と24日目に腫瘍を採取し、FACSソーティングによりCD8+ TILに富むCD45+ の細胞懸濁液を得て、10X Genomicsを用いてシングルセルのシーケンシングを行った。図4Bは、細胞の不均一性および教師なしクラスタリング（unsupervised clustering）の結果の低次元表現を示すUMAPプロットを示し、ここで等高線プロットは各治療についての高い細胞密度領域を描いている。図4Cは、TILPREDで予測されたCD8 TIL状態（上）およびGzmC⁺ C5細胞とGzmC^neg終末型疲弊細胞の間の有意差発現遺伝子を示すボルケーノプロット（Volcano Plot）（下）を示す。図4Dは、ProjecTILsを用いたPD-1d/2^V/33（24日目）TILの参照TILマップへの投影を示す。右側には、投影されたT細胞状態と参照疲弊T細胞状態の重要なT細胞マーカーの発現レベルを示すレーダープロット。図4Eは、クラスター特異的マーカーを示すドットプロットである。図4Fは、Gzmc+ C5細胞とGzmc^neg C4細胞のCD8 TIL Toxノックアウト遺伝子シグネチャーエンリッチメント解析（Gene Signature Enrichment Analysis：GSEA）を示す。図4Gは、B16-OVA腫瘍担持マウスが、腫瘍細胞の接種後12日目と15日目に、遺伝子導入OT1細胞または非導入OT1細胞のいずれかで治療されたことを示す。24日目に腫瘍または脾臓（PD1d/2^V/33 OT1）を採取し、グランザイムC（granzymeC）の細胞内発現をフローサイトメトリーにより行った。2つの独立した実験の要約が示される（n≧5匹/群）（UT：非形質導入）。一元配置ANOVA検定を多重比較の補正のためのダネット（Dunnet）検定と組み合わせて使用した。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001、**** p＜0.0001。 図4-1の説明を参照のこと。 図4-1の説明を参照のこと。 直交的エンジニアリングが、GzmC⁺ TCF1^neg CD8⁺ TILにおけるTOXの発現と共抑制性受容体の発現とを切り離すことを示す一連の図である。図5Aは、24日目のグランザイムCおよびTCF1発現に基づく、外因性および内因性CD8⁺ T細胞コンパートメントの分析を示す。OT1 TILはPD1d/33 ACT後の腫瘍から採取されなかった（UT：非形質導入）。図5Bは、TOXおよび表現型マーカーを評価するためのゲーティング戦略を示す。PD1d/2^Vは、CD8 TILがほとんどTCF1⁺であったため、統計解析に含めなかった。図5Cは、TCF1^neg CD8⁺ TIL細胞におけるPD-1の表面発現を示す。図5Dは、PD-1⁺ TCF1^neg CD8⁺ TILにおけるTIM-3の表面発現を示す。これら2つの表面マーカーについては、4つの独立した実験（PD1d/2^V/33）または2つの実験（他のグループ）から得られたデータを示す（n＝4または5匹/実験、腫瘍接種後24日目）。図5Eは、PD-1⁺ TCF1^neg CD8⁺ TILにおけるTOX発現を示す。2つの独立した実験（PD1d/2^V/33、PD1d/33）または1つの実験（他のグループ）から得られたデータを示す（n＝4または5匹/実験、腫瘍接種後24日目）。図5Fは、TCF1^neg CD8 TILにおけるKLRG1の表面発現を示す。2つの独立した実験（n＝5匹/群）のうち代表的な実験を示す。一元配置ANOVA検定を多重比較の補正のためのダネット検定と組み合わせて使用した；* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001、**** p＜0.0001。非腫瘍担持マウスの脾臓から分離されたナイーブOT-1 T細胞をFACS染色の内部陰性対照として使用した。 GzmC⁺ TCF1^neg CD8⁺ TILが共抑制性受容体の取るに足りない発現を有する多機能エフェクター細胞であることを示す一連の図である。遺伝子導入OT1細胞または非形質導入（UT）OT1細胞で治療した動物からのOT1および内因性CD8 TILを、PD-1⁺ TCF1^neg CD8⁺ TILにおけるエフェクター分子の定量化のために24日目に分析した。OT1 TILはPD1d/33 ACTまたはUT後の腫瘍から回収されなかった。PD1d/2^Vは、CD8 TILがほとんどTCF1⁺であったため、統計解析に含めなかった。図6Aは、CD69の表面発現を示す。図6Bは、Ki-67の細胞内発現を示す。図6Cは、グランザイムBの細胞内発現を示す。図6Dは、非腫瘍担持マウスから分離したナイーブOT-1 T細胞に対するグランザイムB発現の正規化MFIを示す。図6Eは、グランザイムBの共発現を示し、図6Fは、aCD3抗体とaCD28抗体で4時間エクスビボ刺激した後のTNFαおよびINFγの細胞内発現を示す。図6Aおよび図6Bに示したデータは、2つの独立した実験（PD1d/2^V/33、PD1d/33）または1つの実験（他のグループ）から得られた（n＝4～6匹/群）。図6C、図6D、図6E、および図6Fに示したデータは、2つの独立した実験（PD1d/2^V/33）または1つの実験（他のグループ）から得られた（n＝4～6匹/群）。一元配置ANOVA検定を多重比較の補正のためのダネット検定と組み合わせて使用した；* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001、**** p＜0.0001。非腫瘍担持マウスの脾臓から分離したナイーブOT-1 T細胞を、FACS染色の内部陰性対照として使用した。図6Gおよび図6Hは、1回目の細胞移入の1日前からi.p.投与し、最大6用量を3日おきに維持した、示された表面マーカーに特異的な抗体250μg/マウスの存在下または非存在下に、PD1d/2^V/33+ OT-1細胞で治療したB16-OVA腫瘍担持マウスの経時的な腫瘍成長制御を示す；αPD-L1（図6G）およびαPD-L1＋αTIM3（図6H）。図6Iは、PD1d/2^V/33⁺ OT1細胞で、またはIL-2^VとIL-33を分泌するように遺伝子改変されたOT1 T細胞（PD-1エクトドメインなし）で治療したB16-OVA腫瘍担持マウスの経時的な腫瘍成長制御を示す。PD1d/2^V/33と同様に、このアームは、IgG4/IL-33を発現するOT-1（PD-1デコイ産生なし）とIgG4/IL-2^Vを発現するOT-1細胞を1：1の比率で混合したものである。IgG4 FcとIL-33の両方の発現をFACSおよびELISAで確認したところ、PD1d/33と有意差はなかった（n＝8匹/群）。図6G、図6H、および図6Iの実験について、2つの独立した実験（n＝6匹/群）のうちの代表的な実験を示す。非腫瘍担持マウスの脾臓から分離したナイーブOT-1 T細胞をFACS染色の内部陰性対照として使用した。 図6-1の説明を参照のこと。 直交的エンジニアリングがTOX^neg/low GzmC⁺ 前駆細胞の分化を推進することを示す一連の図である。図7Aは、24日目に採取したTCF1⁺ CD8⁺ TILにおけるPD-1発現の解析を示す。図7Bは、PD-1⁺ TCF1⁺ 細胞におけるTOX発現を評価するためのゲーティング戦略を示す。図7Cは、PD1d/2^VからのGzmC⁺PD-1⁺TCF1⁺ CD8 TIL細胞とGzmC^negPD-1⁺TCF1⁺ CD8 TIL細胞におけるTOX発現の解析を示す。図7A、図7B、および図7Cに示したデータは、2つの独立した実験から得られた（n＝4～6匹/群）。一元配置ANOVA検定を多重比較の補正のためのダネット検定と組み合わせて使用した；* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001、**** p＜0.0001。図7Dは、腫瘍接種後12日目に採取した内因性TCF1⁺ CD8 TIL（ベースライン、n＝6匹）およびインビトロ増殖後のTCF1⁺遺伝子導入OT1細胞（ACT前、n＝14）に対する、PD1d/2^V/33+ OT1で治療したマウスから24日目に採取したTCF1⁺ CD8⁺ TILにおけるグランザイムC発現（ナイーブOT1に対する正規化MFI）の比較分析（3つの独立した実験、n≧4匹/群）を示す。非腫瘍担持マウスの脾臓から分離したナイーブOT-1 T細胞をFACS染色の内部陰性対照として使用した。 直交的エンジニアリングによって誘導された新規TCF1^negCD8⁺ TILエフェクター状態が腫瘍応答と動的に関連していることを示す一連の図である。図8Aは、実験デザインを示す。B16-OVA腫瘍担持マウスを、腫瘍細胞の接種後12日目と15日目に、示されるように治療した。腫瘍を17日目、24日目、および38日目に採取し、FACSソーティングによりCD8+ TILに富むCD45+の細胞懸濁液を得て、10X Genomicsを用いてシングルセルシーケンシングを行った。図8Bは、異なる時点にわたるPD1d/2^V/33サンプルのみの細胞の不均一性および教師なしクラスタリングの結果の低次元表現を示すUMAPプロットを示し、ここで等高線プロットは各治療についての高い細胞密度領域を描写している。クラスター特異的マーカーを示すドットプロット（下）。図8Cは、ProjecTILsを用いた参照TILマップへのクラスターC5およびC6の投影を示す。独立成分IC26はまた、腫瘍制御中に観察されたユニークなクラスターC5を、エスケープ（escape）中に得られたTILから有意に分離する。右下：クラスターC6およびC5間の有意に発現差のある遺伝子（significant differentially expressed gene）を示すボルケーノプロット。図8Dは、腫瘍制御中（24日目）およびエスケープ中（38日目）に採取した総CD8⁺ TIL細胞におけるグランザイムC発現の解析を示す。未治療マウスまたはUT OT1治療マウスのCD8⁺ TILと同様に、Triple_Combo治療マウスの脾臓に存在するCD8⁺ T細胞を対照として含めた。2つのいずれかの独立した実験（PD1d/2^V/33）から得られたデータを示す。図8Eは、腫瘍制御中（24日目）およびエスケープ中（38日目）に採取した総CD8⁺ TILにおけるOT1（CD45.1⁺）腫瘍内存続の解析を示す。図8Fは、PD-1およびTCF1発現に基づく、腫瘍制御中（24日目）およびエスケープ中（38日目）に採取した外因性および内因性CD8⁺ TILの解析を示す。抗CD3抗体および抗CD28抗体による4時間のエクスビボ刺激後の、腫瘍制御中（24日目）またはエスケープ中（38日目）に採取したPD-1⁺ TCF1^neg CD8 TILにおけるグランザイムB（図8G）、TNFαおよびINFγ（図8H）の細胞内発現の解析。2つのいずれかの独立した実験（腫瘍制御）または1つの実験（エスケープ）から得られたデータを示す（n＝4～6匹/群）。2群を比較するために両側スチューデントのt検定を用いた。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001、**** p＜0.0001。非腫瘍担持マウスの脾臓から分離したナイーブOT-1 T細胞をFACS染色の内部陰性対照として使用した。 図8-1の説明を参照のこと。 PD-1デコイバリアントおよびPD-1デコイバリアントとtEGFRで形質導入されたhCD8+ T細胞の特徴付けを示す一連の図である。図9Aは、ヒトPDL1タンパク質をコーティングしたプレートに対する可溶性モノマーPD1デコイバリアント（細菌生産）のタイトレーションELISAを示す。結合したPD1デコイ分子を抗Hisタグ抗体で検出した。WT PD1デコイと比較して、PD-1デコイバリアント4XMUT_M70は10倍、バリアント6XDMは約7.5倍、PD-L1に結合しやすくなっている。 PD-1デコイバリアントおよびPD-1デコイバリアントとtEGFRで形質導入されたhCD8+ T細胞の特徴付けを示す一連の図である。図9Bは、レトロウイルスにより形質導入されたCD8⁺ T細胞のtEGFRおよび細胞内PD1デコイの検出を示す。 PD-1デコイバリアントおよびPD-1デコイバリアントとtEGFRで形質導入されたhCD8+ T細胞の特徴付けを示す一連の図である。図9Cは、PD-1デコイ（バリアント）とtEGFRの共発現を示すNY-TCR（I53F）導入CD8⁺ T細胞によるIFNγ産生を示す。この遺伝子導入T細胞を、異なるPD-L1+ 標的腫瘍細胞（各細胞種100,000個）と1：1の比率で48時間共培養した。NA8はHLA/A2+ NY-ESO-1-であり、SAOS2およびA375はHLA/A2+ NY-ESO-1+である。上清を48時間後に回収し、1/25に希釈し、Thermo社製の市販ELISAキットを用いてIFNγの存在を評価した。代表的なT細胞ドナーのデータを示す。全てのアッセイにおいて、バリアントはWT PD-1デコイよりも良好な結果を示した。 PD-1デコイバリアントおよびPD-1デコイバリアントとtEGFRで形質導入されたhCD8+ T細胞の特徴付けを示す一連の図である。図9Dは、PD1デコイ（4XMUT_M70E）およびtEGFRを発現するように形質導入されたヒトT細胞のADCCアッセイの結果を示す。PD1デコイ_tEGFRレトロウイルスで遺伝子導入されたCD8 T細胞をクロムにより標識した。この遺伝子導入T細胞を抗EGFR Abと共培養し、同じドナー由来のPBMCと異なる比率で共培養した。陰性対照はNT（非形質導入）T細胞であり、死滅を4時間で評価した。陽性対照として、T細胞をHClで処理した。 T細胞がtEGFRを発現するように遺伝子改変された場合の抗体依存性細胞傷害（ADCC）アッセイの結果を示す一連の図である。図10Aは、tEGFR導入CD8⁺ T細胞にクロムを負荷し、減少する濃度の抗EGFR抗体セツキシマブと共に異なる比率でPBMCと4～5時間培養したことを示す。陰性対照として、tCD30導入T細胞を、最大濃度のセツキシマブ（100μg/ml）と共にアッセイで使用した。溶解したT細胞の指標として、放出されたクロムが使用される。 T細胞がtEGFRを発現するように遺伝子改変された場合の抗体依存性細胞傷害（ADCC）アッセイの結果を示す一連の図である。図10Bおよび図10Cは、tHER2導入CD8⁺ T細胞に対するADCCアッセイの結果を示す（左：ハーセプチン（図10B）；右：カドサイラ（Kadcyla）（図10C））。 T細胞がtEGFRを発現するように遺伝子改変された場合の抗体依存性細胞傷害（ADCC）アッセイの結果を示す一連の図である。図10Bおよび図10Cは、tHER2導入CD8⁺ T細胞に対するADCCアッセイの結果を示す（左：ハーセプチン（図10B）；右：カドサイラ（Kadcyla）（図10C））。 T細胞がtEGFRを発現するように遺伝子改変された場合の抗体依存性細胞傷害（ADCC）アッセイの結果を示す一連の図である。図10Dは、CD20導入CD8⁺ T細胞に対するADCCアッセイの結果を示す。 リンパ球の形質導入のために使用されたトランスジーンを保有する代表的な構築物を示す一連の図である。代表的な構築物は、PD-1デコイとtEGFR（図11A）、CD40Lバリアント（図11B）、およびIL-2バリアント（IL-2^Vともいう）（図11C）をそれぞれ保有する。 図11Aの説明を参照のこと。 図11Aの説明を参照のこと。

発明の詳細な説明
本開示は、例えば腫瘍特異的遺伝子改変サブセットのリンパ球を養子移入することによって、細胞免疫療法により媒介される免疫応答を付与しかつ/または増大させるための方法および組成物に関する。本開示は、免疫系と、自然および適応免疫応答とを調節する能力を有する少なくとも2つのトランスジーンを発現する遺伝子改変リンパ球を含む組成物を提供する。開示された方法および組成物は、T細胞の性能増強のための遺伝子工学（Genetic Engineering for the Enhanced Performance of T-cells：GEEP-T（商標））と称されるプラットフォーム技術の具体例である。GEEP-T（商標）は、抗腫瘍機能が増強された遺伝子改変リンパ球と、そのようなリンパ球の開発方法を提供することを目的としている。

A. 組成物およびキット
一局面において、本開示は、対象の免疫系を調節するための少なくとも2つのトランスジーン（例えば、治療用トランスジーン）を発現する複数の遺伝子改変リンパ球を含む、組成物を提供する。

ある態様では、リンパ球は末梢血リンパ球（PBL）である。ある態様では、リンパ球は腫瘍浸潤リンパ球（TIL）である。リンパ球としては、T細胞、B細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、および好塩基球が挙げられる。いくつかの態様では、リンパ球は、CD34造血幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞に由来する。リンパ球は、自己由来、同種由来、同系由来、または異種由来であり得る。ある態様では、リンパ球は自己由来である。ある態様では、リンパ球はヒトリンパ球である。

いくつかの態様では、リンパ球は腫瘍浸潤リンパ球（TIL）であり得る。いくつかの態様では、リンパ球はキメラ抗原受容体（CAR）を発現し得る。いくつかの態様では、リンパ球は組換えT細胞受容体（TCR）を発現し得る。CARまたはTCRは癌抗原に結合することができる。いくつかの態様では、CARまたはTCRは、NY-ESO1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE A-10、MAGE-C2、SSX2、MAGE-A12、またはそれらの組み合わせに対する反応性を示してもよい。

いくつかの態様では、トランスジーンは、可溶性受容体、デコイ、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、酵素、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ（lysase）、イソメラーゼ、トランスロカーゼ、キナーゼ、トランスポーター、修飾因子、分子シャペロン、イオンチャネル、抗体、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、DNA、リボザイム、バイオセンサー、エピジェネティック修飾因子、転写因子、コーディングRNA、ノンコーディングRNA、スモールRNA、ロングRNA、IRESエレメント、またはエクソソームシャトルRNAからなる群より選択される分子をコードする。

いくつかの態様では、トランスジーンは、可溶性受容体、デコイ、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、酵素、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスロカーゼ、キナーゼ、トランスポーター、修飾因子、分子シャペロン、イオンチャネル、抗体、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、DNA、リボザイム、バイオセンサー、エピジェネティック修飾因子、転写因子、コーディングRNA、ノンコーディングRNA、スモールRNA、ロングRNA、IRESエレメント、またはエクソソームシャトルRNAからなる群より選択される少なくとも2つの分子をコードする。

いくつかの態様では、トランスジーンによってコードされる2つ以上の分子は、自己切断ペプチド配列によって連結される。いくつかの態様では、トランスジーンの発現は、構成的に活性化されるプロモーターによって制御される。いくつかの態様では、トランスジーンの発現は、誘導性プロモーターによって制御される。いくつかの態様では、トランスジーンの発現は、リンパ球の活性化状態によって誘導される。いくつかの態様では、トランスジーンは、組込み能力のあるガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス、DNA転移などを介して、リンパ球に導入される。

いくつかの態様では、トランスジーンは、抗体、抗体フラグメント、受容体、デコイ、チェックポイント遮断モジュレーター、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、細胞排除タグ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。

いくつかの態様では、抗体または抗体フラグメントは、VEGF、TGF-B、4-1BB、CD28、CD27、NKG2D、PD1、PDL1、またはCTLA4抗体であり得る。ある態様では、抗体はPD1抗体である。いくつかの態様では、デコイは、PD1、CTLA4、LAG3、VEGFR1、TIM3、TIGIT、またはSIRPαデコイであり得る。ある態様では、デコイはPD1デコイ、例えばPD-1.IgG4デコイである。

いくつかの態様では、サイトカインは、LIGHTまたはそのバリアント/断片、IL-33またはそのバリアント/断片、IL-2またはそのバリアント/断片、IL-15またはそのバリアント/断片、IL-12またはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、サイトカインは、変異型サイトカインである。

いくつかの態様では、細胞排除タグは、tEGFR、Her2、CD20、およびCD19からなる群より選択される。

いくつかの態様では、トランスジーンは、PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、IL-2バリアント/断片、LIGHTまたはそのバリアント/断片、IL-33またはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片の2つ以上を含む。いくつかの態様では、トランスジーンは、tEGFRもしくはそのバリアント/断片、tHER2もしくはそのバリアント/断片、CD20もしくはそのバリアント/断片、またはCD19もしくはそのバリアント/断片をさらに含む。

いくつかの態様では、PD-1デコイまたはそのバリアント/断片は、tEGFRまたはそのバリアント/断片、tHER2またはそのバリアント/断片、CD20またはそのバリアント/断片、CD19またはそのバリアント/断片などの、細胞排除タグ（CET）と同じベクター上に保持される。

いくつかの態様では、少なくとも2つのトランスジーンは、（a）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびtEGFRまたはそのバリアント/断片；（b）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびIL-2バリアント/断片；（c）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびLIGHTまたはそのバリアント/断片；（d）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびIL-33またはそのバリアント/断片；（e）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびCD40Lまたはそのバリアント/断片；（f）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、IL-2バリアント/断片、およびIL-33またはそのバリアント/断片；（g）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびIL-2バリアント/断片；（h）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびLIGHTまたはそのバリアント/断片；（i）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびIL-33またはそのバリアント/断片；（j）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片；（k）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、IL-2バリアント/断片、およびIL-33またはそのバリアント/断片；（l）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、IL-2バリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片；または（m）PD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、IL-33バリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片を含む。

いくつかの態様では、PD-1デコイは、SEQ ID NO：1～4、6～17、42、44、47～48および51～52のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：1～4、6～17、42、44、47～48および51～52のいずれか1つに対して少なくとも80％（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、IL-2バリアントは、SEQ ID NO：21～23のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：21～23のいずれか1つに対して少なくとも80％（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、IL-33は、SEQ ID NO：25および27のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：25および27のいずれか1つに対して少なくとも80％（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、LIGHTは、SEQ ID NO：28～29および31のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：28～29および31のいずれか1つに対して少なくとも80％（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、CD40Lは、SEQ ID NO：32～34、36、および38のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：32～34、36、および38のいずれか1つに対して少なくとも80％（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、tEGFRは、SEQ ID NO：40に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：40のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、HER2は、SEQ ID NO：45に対して少なくとも80％（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：45のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、CD20は、SEQ ID NO：49に対して少なくとも80％（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：49のアミノ酸配列を含む。

また、本開示の範囲内には、SEQ ID NO：6～17、42、44、47～48および51～52のいずれか1つに対して少なくとも80％（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：6～17、42、44、47～48および51～52のいずれか1つのアミノ酸配列を含む新規PD-1デコイバリアントが含まれる。

いくつかの態様では、前記組成物は、少なくとも2つのリンパ球サブセットを含む。例えば、組成物は、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の遺伝子改変されたリンパ球サブセットを含み得る。遺伝子改変リンパ球の各サブセットは、少なくとも1つのトランスジーンを発現することができる。例えば、遺伝子改変リンパ球の各サブセットは、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のトランスジーンを発現し得る。

いくつかの態様では、前記組成物は、2つの遺伝子改変されたリンパ球サブセットを含み、各サブセットは少なくとも1つのトランスジーンを発現する。いくつかの態様では、組成物は、2つの遺伝子改変されたリンパ球サブセットを含み、各サブセットは2つのトランスジーンを発現する。いくつかの態様では、組成物は、3つの遺伝子改変されたリンパ球サブセットを含み、各サブセットは少なくとも1つのトランスジーンを発現する。いくつかの態様では、組成物は、4つの遺伝子改変されたリンパ球サブセットを含み、各サブセットは少なくとも1つのトランスジーンを発現する。いくつかの態様では、組成物は、5つまたはそれ以上の遺伝子改変されたリンパ球サブセットを含み、各サブセットは少なくとも1つのトランスジーンを発現する。

いくつかの態様では、前記組成物は、少なくとも2つの遺伝子改変されたリンパ球サブセットを含み、ここで、各サブセットは少なくとも2つのトランスジーンを発現し、かつ各サブセットは1つのトランスジーンを共有する。いくつかの態様では、組成物は、少なくとも2つの遺伝子改変されたリンパ球サブセットを含み、ここで、各サブセットは少なくとも2つのトランスジーンを発現し、かつ各サブセットは異なるトランスジーンを発現する。

いくつかの態様では、前記複数のリンパ球は、(i）少なくとも2つのトランスジーンを発現する第1のサブセット；および（ii）少なくとも2つのトランスジーンを発現する第2のサブセットを含むことができ、ここで、第1のサブセットのトランスジーンの少なくとも1つは、第2のサブセットのトランスジーンと異なるか、または第1のサブセットのトランスジーンの少なくとも1つは、第2のサブセットのトランスジーンと共通している。いくつかの態様では、リンパ球の組成物は、第1のサブセットと第2のサブセットとを組み合わせた後に、3つのトランスジーンを発現することができる。

いくつかの態様では、（i）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびIL-2バリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびLIGHTまたはそのバリアント/断片を発現するか；（ii）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびIL-2バリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびIL-33またはそのバリアント/断片を発現するか；（iii）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびIL-2バリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびCD40Lまたはそのバリアント/断片を発現するか；（iv）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびLIGHTまたはそのバリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびIL-33またはそのバリアント/断片を発現するか；（v）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびLIGHTまたはそのバリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびCD40Lまたはそのバリアント/断片を発現するか；または（vi）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびIL-33またはそのバリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片およびCD40Lまたはそのバリアント/断片を発現する。

いくつかの態様では、第1のサブセットまたは第2のサブセットは、tEGFRもしくはそのバリアント、tHER2もしくはそのバリアント、CD20もしくはそのバリアント、またはCD19もしくはそのバリアントをさらに発現する。

いくつかの態様では、（i）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびIL-2バリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびLIGHTまたはそのバリアント/断片を発現するか；（ii）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびIL-2バリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびIL-33またはそのバリアント/断片を発現するか；（iii）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびIL-2バリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片を発現するか；（iv）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびLIGHTまたはそのバリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびIL-33またはそのバリアント/断片を発現するか；（v）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびLIGHTまたはそのバリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片を発現するか；または（vi）第1のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびIL-33またはそのバリアント/断片を発現し、かつ第2のサブセットは、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント/断片、tEGFRまたはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片を発現する。

本明細書で使用する用語「バリアント」とは、第2の分子（「親」分子とも呼ばれる）に関連する第1の分子を指す。バリアント分子は、親分子に由来するもの、親分子から単離されたもの、親分子に基づくもの、または親分子に相同なものであり得る。本明細書で使用するタンパク質の「機能的バリアント」とは、そのタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持する該タンパク質のバリアントを指す。機能的バリアントには、多形体などを含む変異体（挿入、欠失、または置換変異体であり得る）が含まれる。また、機能的バリアントには、そのようなタンパク質と別の、通常は無関係な、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとの融合産物も含まれる。機能的バリアントは、天然に存在することもあれば、人工的に作られることもある。

いくつかの態様では、トランスジーンのバリアントは、1つまたは複数の保存的修飾を含むことができる。1つまたは複数の保存的修飾を有するトランスジーンのバリアントは、所望の機能特性を保持することができ、そうした特性は当技術分野で公知の機能アッセイを用いて試験することができる。

本明細書で使用する用語「保存的配列修飾」とは、そのアミノ酸配列を含むタンパク質の結合特性に著しい影響または変化を与えないアミノ酸の修飾を指す。そのような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発、PCRを介した変異誘発など、当技術分野で知られた標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）；非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）；β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）；および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれ、1つまたは複数の保存的修飾が含まれる。1つまたは複数の保存的修飾を有するCasタンパク質は、所望の機能特性を保持することができ、そうした特性は当技術分野で公知の機能アッセイを用いて試験することができる。

本明細書で使用する場合、2つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、2つの配列間の同一性パーセントと同等である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、これらの配列が共有する同一位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一位置の数/位置の総数×100）である。配列の比較および2つの配列間の同一性パーセントの決定は、以下の非限定的な例で説明されるような、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。

2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを使用し、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、ギャップペナルティ4を用いて、決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラム（www.gcg.comで入手可能）に組み込まれたNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムを使用し、Blossum62行列またはPAM250行列のいずれかと、ギャップ重み16、14、12、10、8、6または4、長さ重み1、2、3、4、5または6を用いて、決定することができる。

ポリペプチドに関して使用する「ホモログ」または「相同」という用語は、2つのポリペプチド間の高度の配列同一性、または3次元構造間の高度の類似性、または活性部位と作用機序の間の高度の類似性を指す。いくつかの態様では、ホモログは、参照配列との60％を超える配列同一性、より好ましくは75％を超える配列同一性、さらにより好ましくは90％を超える配列同一性を有する。ポリペプチドに適用される用語「実質的同一性」とは、2つのペプチド配列が、例えばGAPまたはBESTFITプログラムによって、デフォルトのギャップ重みを用いて、最適にアラインメントされたときに、少なくとも75％の配列同一性を共有することを意味する。

本明細書で使用するペプチドまたはポリペプチドの「断片」とは、全長未満のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。例えば、ペプチドまたはポリペプチド断片は、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40アミノ酸の長さ、またはその単一の単位長さを有することができる。例えば、断片は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、またはそれ以上のアミノ酸の長さであり得る。ペプチド断片のサイズに上限はない。しかしながら、いくつかの態様では、ペプチド断片は、約500アミノ酸未満、約400アミノ酸未満、約300アミノ酸未満、または約250アミノ酸未満の長さであり得る。

また、本開示の範囲には、トランスジーンに対して実質的同一性を有するバリアント、変異体、およびホモログも含まれる。例えば、そのようなバリアントおよびホモログは、本明細書に記載のトランスジーンの配列と、少なくとも約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、または約99％の配列同一性を有する配列を有していてよい。

いくつかの態様では、記載されるトランスジーンのバリアントは、融合パートナーに融合された（例えば、N末端またはC末端で融合された）トランスジーン配列を含む融合ポリペプチドである。いくつかの態様では、融合パートナーは、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列の断片（例えば、CH3ドメイン；またはIgG4FcなどのFc領域の一部もしくは全体）を含む。例えば、PD-1もしくはそのバリアント/断片、IL-2もしくはそのバリアント/断片、IL-33もしくはそのバリアント/断片、CD40Lもしくはそのバリアント/断片、またはLIGHTもしくはそのバリアント/断片は、IgG4Fcまたはそのバリアント/断片などの融合パートナーに、直接またはリンカーを介して間接的に、N末端またはC末端で融合され、連結され得る。

「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、2つ以上のポリペプチド配列を一緒に結合することによって作成されるタンパク質を意味する。本発明に包含される融合ポリペプチドは、第1のポリペプチドをコードする核酸配列と第2のポリペプチドをコードする核酸配列とを結合して単一のオープンリーディングフレームを形成するキメラ遺伝子構築物の翻訳産物を含む。言い換えれば、「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、ペプチド結合によって、またはいくつかのペプチドを介して、結合された2つ以上のタンパク質の組換えタンパク質である。また、融合タンパク質は、2つのドメイン間にペプチドリンカーを含んでもよい。

結合することによって免疫応答を抑制または減少させることが知られている免疫抑制ポリペプチドには、CD47、PD-1、CTLA-4、およびそれらの対応するリガンド、例えば、SIRPα、PD-L1、PD-L2、B7-1、およびB7-2が含まれる。このようなポリペプチドは、腫瘍微小環境に存在して、腫瘍性細胞に対する免疫応答を阻害する。様々な態様では、トランスジーンを介して免疫抑制ポリペプチドおよび/またはそのリガンドの相互作用を阻害し、遮断し、それに拮抗することは、免疫応答性細胞の免疫応答を増強する。一局面において、トランスジーンは、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、VISTA、TIM-3、およびCBL-Bを含むがこれらに限定されない抑制/チェックポイント分子の遺伝子ノックダウンとして機能することができる。

結合することによって免疫応答を刺激または増大させることが知られている共刺激ポリペプチドには、CD28、OX-40、4-1BB、CD27、NKG2D、およびそれらの対応するリガンド、例えば、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL、CD70、およびNKG2Dリガンドが含まれる。このようなポリペプチドは、腫瘍微小環境に存在して、腫瘍性細胞に対する免疫応答を活性化する。様々な態様では、トランスジーンを介して炎症性ポリペプチドおよび/またはそのリガンドを促進し、刺激し、作動させることは、免疫応答性細胞の免疫応答を増強する。

いくつかの態様では、トランスジーンは、サイトカインまたは成長因子である。用語「成長因子」および「サイトカイン」は、細胞の活動をオートクリン（autocrine）、パラクリン、またはエンドクリン的に制御するシグナル伝達分子を意味する。それらは、特定の受容体に結合して、関連する下流のシグナル伝達経路を活性化することによってそれらの生物学的機能を発揮し、次に、それらは核における遺伝子転写を調節し、最終的に生物学的応答を刺激する（Nicola N. Oxford; New York: Oxford University Press; 1994）。成長因子とサイトカインは、成体における細胞増殖、分化、アポトーシス、免疫または造血反応、形態形成、血管新生、代謝、創傷治癒、組織の恒常性維持など、様々な生理学的過程に影響を与える。歴史的には、成長因子は細胞の成長と増殖にプラスの影響を与える生物学的成分であると考えられたが、サイトカインは一般的に免疫または造血反応を示すと考えられた。しかし、異なるラインの研究が合流したことにより、「サイトカイン」と「成長因子」は同様の機能を持つ可能性があることが判明した；したがって、これらの用語は本明細書では互いに交換可能に使用される。

TGF-βスーパーファミリー： TGF-βスーパーファミリーには、TGF-βタンパク質、骨形成タンパク質（BMP）、成長分化因子（GDF）、グリア由来神経栄養因子（GDNF）、アクチビン、インヒビン、ノーダル（Nodal）、レフティ（Lefty）、およびミュラー管抑制物質（MIS）が含まれる。TGF-βスーパーファミリーのメンバーは、形態形成、胚発生、成体幹細胞の分化、免疫調節、創傷治癒、炎症、癌などの、様々な生物学的過程の多機能制御因子である。
（1）BMP様ファミリー：BMP類（すなわち、BMP1-10、BMP-15）、GDF類（すなわちGDF1-15）、AMH
（2）GDNFファミリー：GDNF、アルテミン（Artemin）、ニューツリン（Neuturin）、およびパーセフォン（Persephone）
（3）TGF-β様ファミリー：TGF-β類（すなわち、TGF-β-1、TGF-β-2、TGF-β-3）、アクチビン類（すなわち、アクチビンA/AB/B、インヒビンA/B)、ノーダル（Nodal）

上皮成長因子（EGF）： EGFファミリーのメンバーには、EGF、TGF-α、ニューレグリン（Neuregulin）、アンフィレグリン（Amphiregulin）、ベータセルリン（Betacellulin）などが含まれる。EGFファミリーのメンバーは、細胞の増殖、分化、生存を刺激するそれらの能力で最もよく知られている。このファミリーのメンバーとそれらの受容体の脱制御は、腫瘍形成と密接に関連している（Herbst RS. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics 2004, 59(2 Suppl):21-26）。

血小板由来成長因子（PDGF）： 血小板由来成長因子（PDGF）は、強力な有糸分裂促進性および走化性タンパク質である。現在、4つの遺伝子によりコードされる4つのPDGFタンパク質（PDGFA、PDGFB、PDGFC、およびPDGFD）が知られている。PDGFは、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、およびPDGF-ABを含むジスルフィド結合型のホモ二量体またはヘテロ二量体として分泌される。内因性チロシンキナーゼ活性を持つ2つのPDGF受容体PDGFRαとPDGFRβが知られており、どちらもヘテロ二量体とホモ二量体を形成することができる。リガンドが結合すると、受容体の二量体化、自己リン酸化が促進され、その結果、複数の下流の細胞内シグナル伝達カスケードが活性化される。PDGFRαを介したシグナル伝達は、顔面骨格、毛包、精子形成、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトの発達、ならびに肺および腸絨毛の発達に不可欠であり、一方PDGFRβを介したシグナル伝達は血管、腎臓、および白色脂肪細胞の発達に極めて重要である（Heldin CH. Cell Commun Signal 2013, 11:97）。

線維芽細胞成長因子（FGF）ファミリー： ヒトでは、FGFファミリーの22のメンバーが同定されており、いずれもヘパリン結合性タンパク質である。細胞表面に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンとの高親和性相互作用は、受容体型チロシンキナーゼによって媒介されるFGFシグナル伝達に不可欠である（Ornitz DM, Itoh N. Genome Biology 2001, 2(3): REVIEWS3005）。FGFは多能性タンパク質であって、主に分裂促進作用があるが、調節作用、形態形成作用、および内分泌作用もある。FGFは、胚発生過程（Heldin CH: Targeting the PDGF signaling pathway in tumor treatment. Cell Commun Signal 2013, 11:97）、成熟組織/システムの血管新生（Kim BS, et al. Biochemical and biophysical research communications 2014, 450(4):1333-1338）、ケラチノサイトの組織化（Tsuboi R, et al. The Journal of Investigative Dermatology 1993, 101(1):49-53）、および創傷治癒過程（Lee JG, Kay EP. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2006, 47(4):1376-1386）に関与している。

インスリン様成長因子（IGF）： インスリン様成長因子（IGF）は、インスリンと高い配列類似性を有するタンパク質である。IGF受容体は、細胞質チロシンキナーゼドメインを持つジスルフィド結合型のヘテロ四量体膜貫通タンパク質である。IGF受容体には、IGFI-RとIGFII-Rの2つのタイプがある。IGFの利用可能性は、IGF結合タンパク質1～6によって制御され得る（Griffeth RJ, et al. Basic and clinical andrology 2014, 24:12）。IGFの主な作用は、細胞の成長にある。実際、下垂体成長ホルモンの作用のほとんどは、IGF、主にIGF-1によって媒介される。成長ホルモンは、多くの組織、特に肝臓を刺激して、IGF-1を合成しかつ分泌させ、次いで、それが、骨を含めて、ほとんどの組織において肥大（細胞サイズの増加）と過形成（細胞数の増加）の両方を刺激する。また、IGFはニューロンの生存を誘導し、軟骨細胞を保護し、かつ骨細胞を活性化することができる（Brahmkhatri VP, et al. BioMed research international 2015, 2015:538019）。

血管内皮細胞成長因子（VEGF）： VEGFは、内皮細胞に特異的に作用するホモ二量体型の糖タンパク質成長因子である（Ferrara N, Gerber HP, LeCouter. Nature Medicine 2003, 9(6):669-676）。それらは、特に胚の発生、骨格の成長、および生殖機能において、血管新生と血管透過性を制御している。また、それらは造血においても重要な役割を担っている。VEGFは主にチロシンキナーゼVEGFR1およびVEGFR2を通じてシグナルを送り、細胞の生存、増殖、移動、および/または接着を刺激する（Ferrara N. Endocrine Reviews 2004, 25(4):581-611）。VEGFの脱制御は、腫瘍、眼内新生血管障害、その他の疾患と関連している（Ferrara N, et al. Nature Medicine 2003, 9(6):669-676）。VEGF遺伝子ファミリーのメンバーには、VEGF/VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、および胎盤成長因子（Placental Growth Factor：PlGF）が含まれる（Holmes DI, Zachary I. Genome Biology 2005, 6(2):209）。

肝細胞成長因子（HGF）： HGFは間葉系細胞から分泌され、主に上皮および内皮由来の細胞に対して多機能なサイトカインとして作用する。それは、HGFRを介してチロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化することにより、細胞の成長、細胞運動性、および形態形成を制御している（Okada M, et al. Pediatric Research 2004, 56(3):336-344）。HGFは、胚性器官の発生、成体器官の再生、および創傷治癒に大きな役割を果たすことが示されている。さらに、有糸分裂誘発、細胞運動性、およびマトリックス浸潤を刺激するその能力は、血管新生および腫瘍形成において中心的な役割をそれに与えている（Sharma NS, et al. FASEB 2010, 24(7):2364-2374）。

腫瘍壊死因子（TNF）： 腫瘍細胞のアポトーシスに関与することが知られていたサイトカインは、当初、腫瘍壊死因子（またはTNFファミリーの下）に分類された。全てのTNFファミリーメンバーは、「TNFホモロジードメイン」またはTHDと呼ばれる三量体の保存されたC末端ドメインを共有している。受容体への結合に関与していて、THDはファミリーメンバー間で約20～30％の配列同一性を共有する。大部分のリガンドは膜結合型タンパク質として合成されるが、可溶性形態が限定的なタンパク質分解によって生成され得る（Bodmer JL, et al. Trends in Biochemical Sciences 2002, 27(1):19-26）。最初に同定されたこのファミリーの2つのメンバーはTNFαとTNFβであった。現在までに、19のTNFスーパーファミリーリガンドが32のTNFスーパーファミリー受容体と共に同定されている。多くのTNFスーパーファミリーメンバーはアポトーシスを促進または阻害する一方で、それらはまた、ナチュラルキラー細胞の活性化、T細胞の共刺激、およびB細胞の恒常性と活性化を含めて、自然免疫系と適応免疫系の両方の重要な機能をも制御している（Croft M. Nature Reviews Immunology 2009, 9(4):271-285）。LIGHT（リンホトキシンと相同で、誘導性発現を示し、Tリンパ球によって発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターについてHSV糖タンパク質Dと競合する）は、TNFリガンドスーパーファミリーのタイプII膜貫通型糖タンパク質である。LIGHTは未成熟DCおよび活性化T細胞上に発現され、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（HVEM）、リンホトキシンβ受容体（LTβR）、およびデコイ受容体3/TR6という3つの異なる受容体に結合する。HVEMに結合すると、LIGHTはT細胞を共刺激し、増殖とサイトカイン産生を促進する。別の例は、CD40リガンドまたはCD40Lとも呼ばれるCD154である。これは主に活性化T細胞上に発現されるタンパク質であり、TNFスーパーファミリーの分子のメンバーである。これは抗原提示細胞上のCD40に結合し、標的細胞の種類に応じて様々な作用をもたらす。さらに別の例は、Fasリガンド（FasLまたはCD95LまたはCD178）である。Fasリガンド/受容体の相互作用は、免疫系の制御および癌の進行に重要な役割を担っている。

インターロイキン（IL）： インターロイキンは、免疫応答の間に免疫系または造血系の細胞の成長、分化、および活性化を制御する免疫調節タンパク質の大きなグループである。際立った構造的特徴に基づいて、公知のILは、次の4つのグループに大別される：IL1様サイトカイン、クラスIヘリカルサイトカイン（IL4様、γ鎖、およびIL-6/12様）、クラスIIヘリカルサイトカイン（IL-10様およびIL-28様）、およびIL-17様サイトカイン（表1）。

インターフェロン（IFN）： IFNは、ウイルス、細菌、寄生虫、または腫瘍細胞などの病原体の存在に応答して宿主細胞により作られ、放出される一群のシグナル伝達タンパク質である。インターフェロンには免疫調節機能もある；それらはB細胞の活性化を抑制し、T細胞の活性を増強し、かつナチュラルキラー細胞の細胞破壊能力を高める。ヒトを含む動物では、20種を超える異なるIFN遺伝子およびタンパク質が同定されている。それらは一般的に、I型IFNとII型IFNの2つのクラスに分類される。I型IFNはウイルスIFNとしても知られており、IFN-α、IFN-β、およびIFN-ωが含まれる。II型IFNは免疫IFN（IFN-γ）としても知られている。ウイルスIFNはウイルス感染によって誘導されるのに対して、II型IFNは細胞分裂刺激または抗原刺激によって誘導される。ほとんどの種類のウイルス感染細胞は、細胞培養でI型IFNを合成することができる。対照的に、IFN-γは、ナチュラルキラー細胞、CD4 Th1細胞、およびCD8細胞傷害性サプレッサー細胞などの免疫系の特定の細胞によってのみ合成される（Samuel CE. Clinical Microbiology Reviews 2001, 14(4):778-809, 目次）。

いくつかの態様では、トランスジーンはデコイ受容体である。「デコイ受容体」とは、特定の成長因子またはサイトカインを効率的に認識して、それに結合することができるが、意図した受容体複合体のシグナル伝達または活性化を行うことが構造上できない受容体を意味する。それは、リガンドに結合して、そのリガンドが正規の受容体に結合しないようにする、阻害剤として作用する。

いくつかの態様では、トランスジーンは可溶性デコイである。「可溶性デコイ」とは、ある細胞から発現および分泌され、別の細胞上の特定の受容体に結合し、それゆえ、その受容体への天然のリガンドの結合を阻害するポリペプチドを意味する。可溶性デコイの非限定的な例は、PD1デコイ、CTLA-4デコイ、LAG3デコイ、VEGFR1デコイ、TIM3デコイ、TIGITデコイ、およびSIRPαデコイである。一態様では、PD-1デコイは、リンパ系細胞によって発現および分泌され、そのようなPD-1デコイは、抗原提示細胞（APC）上のPD-L1の結合部位を占有することによって、T細胞上の天然PD-1とAPC上のPDL-1との結合を阻害するため、T細胞の免疫抑制性のシグナル伝達を阻害し、それゆえにT細胞の免疫応答を高める。

PD-1デコイ： PD-1は、腫瘍微小環境におけるTリンパ球の強力な負の制御因子である。一態様では、レトロウイルス形質導入によりPD-1のドミナントネガティブ欠失変異体（PD-1デコイの非限定的な例）を発現するT細胞が作製された。このPD-1デコイは、コグネイト抗原を発現する腫瘍細胞に応答して、抗原特異的T細胞のIFN-γ分泌を増加させた。別の態様では、PDL-1に対してより高い結合親和性を有するPD-1エクトドメインの可溶性断片（PD-1デコイの非限定的な例）は、PDL-1の競合的アンタゴニストとして投与される。可溶性PD-1エクトドメインバリアントの非限定的な例は、Maute et al. PNAS 2015 Nov 24; 112(47): E6506-E6514に開示されている。さらに別の態様では、ヒトIgG4のFc領域に融合されたPD1のエクトドメインを含むPD-1デコイ分子（PD-1.IgG4）は、増強された腫瘍制御のためにインビボで使用され得る。別の態様では、そのようなPD-1デコイは、TILによって発現および分泌され得る。

本開示に記載されるようなPD-1デコイは、PD-1のエクトドメインの結合性および/または溶解性を高めたバリアントを開発するために、コンピュータに基づいた合理的設計によって作成することも可能である。例えば、PD-1のPD-L1に対する結合親和性を高めると予測される単一および複数のアミノ酸置換が、細菌発現系で生産された組換え可溶性タンパク質で評価される。これらのバリアントは、プレートに捕捉されたPD-L1への結合について直接タイトレーションELISAで評価され得る；次に、関心対象のバリアントは、T細胞による分泌を評価するために、レトロウイルスベクターにクローニングされた。細菌による生産時に難溶性を示したPD-1デコイは、一般的に難溶性がT細胞による生産なしまたは低生産に相当するため、廃棄した。

遺伝子改変ヒトT細胞によって産生されたPD-1デコイはまた、タンパク質の結合性と安定性を高めるためにFc部分（例えばIgG4Fc）を含んでいた。初代ヒトT細胞によって産生されたPD1-Fcデコイは、ELISAで評価することができる。機能性を評価するために、共培養アッセイが確立され、このアッセイでは、初代ヒトT細胞が、腫瘍細胞の認識を可能にするためのA2/NY-ESO-1 T細胞受容体（TCR）（レンチウイルス形質導入による）、ならびにPD1-Fcデコイおよび細胞表面tEGFR（バイシストロン性レトロウイルスベクターにコードされる）を発現するように共遺伝子改変された。これらの共形質導入T細胞（またはTCRのみもしくはPD1デコイのみを含む対照T細胞）を、PDL1^POSである標的腫瘍細胞と共培養した。共培養上清に存在するIFNγレベルを評価して、最適なPD-1デコイバリアントを決定した（すなわち、IFNγレベルが高いほど、PD1デコイは標的腫瘍細胞表面上のPD-L1をブロックするのに優れている）。4XMUT_M70および6XDMは、PD-L1に対する高い結合親和性と高い溶解性を示すPD1-Fcデコイバリアントの1つである（図9A～D）。

細胞排除タグ（Cellular Elimination Tag：CET）： PD1-Fcデコイなどのトランスジーンは、tEGFR、tHER2、CD20、またはCD19などの、CETをもコードするバイシストロン性レトロウイルスベクターから構成的に発現させることができる（図10A～D）。CETの目的は4つある。第一に、それは、形質導入効率を評価する手段として、第二に、必要に応じて（抗EGFRコーティングビーズ上で）遺伝子改変細胞を濃縮するために使用できる。第三に、それは、生着後の患者の遺伝子改変T細胞を（採血サンプルまたは腫瘍生検からFACSにより）追跡する手段としても利用できる。そして最後に、それは、セツキシマブ投与患者に毒性が生じた場合に、ADCCを介した排除タグとして使用できる。細胞外N末端リガンド結合ドメインと細胞内受容体チロシンキナーゼ活性を欠くが、天然のアミノ酸配列、タイプI膜貫通細胞表面局在、および医薬品グレードの抗EGFRモノクローナル抗体セツキシマブ（Erbitux）の立体構造的に無傷の結合エピトープを保持する切断型ヒトEGFRポリペプチド（huEGFRt）については、Wantら（Wang X, et al. Blood. 2011 Aug 4;118(5):1255-63. Epub 2011 Jun 7)に記載されている。CET ADCCの他の例としては、tHER2（ハーセプチンまたはカドサイラを使用）、CD20（リツキシマブを使用）、およびCD19が挙げられる。CETとしてのCD20は、Griffioenら（Griffioen M, et al. Haematologica. 2009 Sep;94(9):1316-20）に記載されている。CETとしてのCD19は、Buddeら（Budde, et al. Blood 2013; 122 (21): 1660）およびAnnesleyら（Annesley et al., Blood 2019; 134 (Supplement_1): 223）に記載されている。

LIGHT： LIGHTはTNFリガンドスーパーファミリーのタイプII膜貫通型糖タンパク質である（Mauri et al. Immunity 1998 Jan; 8(1):21-30)。それは、未成熟樹状細胞と活性化T細胞上に発現され（Tamada K et al. J Immunol. 2000 Apr 15; 164(8):4105-10)、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（HVEM）、リンホトキシンβ受容体（LTβR）、およびデコイ受容体3/TR6という3つの異なる受容体に結合する。HVEMに結合すると、LIGHTはT細胞を共刺激し、増殖とサイトカイン産生を促進する（Tamada et al. Nat Med. 2000 Mar; 6(3):283-9）。一態様では、LIGHTタンパク質はTILから発現および分泌されるように遺伝子改変され得る。

IL-33： サイトカインは、炎症性腫瘍の微小環境における細胞間の中心的なメディエーターであり、その中でもインターロイキン-33（IL-33）は細胞の損傷後に放出されるアラルミン（alarmin）と見なされる。IL-33は、サイトカインのIL-1ファミリーのメンバーとして発見された。IL-1遺伝子ファミリーは11のメンバー（IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-18、IL-36RA、IL-36α、IL-37、IL-36β、IL-36γ、IL-38、IL-33）を含み、炎症性サイトカインの複雑なネットワークを誘導し、かつ白血球および内皮細胞上でのインテグリンの発現を介して、炎症反応を制御および開始する（炎症性疾患の病因と治療におけるインターロイキン-1。（Dinarello CA., Blood. 2011 Apr 7; 117(14):3720-32）。腫瘍発生のプロセスは、抗腫瘍免疫反応を引き起こす可能性がある。タイプ1免疫反応は、腫瘍誘発性IFN-γ産生Th1細胞、細胞傷害性Tリンパ球、NK T細胞、およびγδT細胞を含む細胞性免疫の重要な要素であり、腫瘍の成長と転移を制限する（Galon J et al. Science. 2006 Sep 29; 313(5795):1960-4）。炎症は悪性腫瘍のもう一つの重要な要素であることから、IL-33は癌の監視および腫瘍に対する免疫を改善する役割を果たす可能性がある。本発明の一態様では、IL-33は、TILから発現および分泌されるように遺伝子改変され得る。

IL-2： インターロイキン-2（IL-2）は、発見された最初のサイトカインの1つであり、分子的に特徴付けられた。それは、主にT細胞とNK細胞の成長および増殖をサポートすることが示された。IL-2は1992年に臨床使用が承認されたが、その受容体の生物学の正確な記述はまだ研究中である。全身的な高用量（HD）IL-2治療は、メラノーマと腎臓癌の患者に持続的反応をもたらすが、それは比較的少数の患者においてのみである。さらに、全身的HD IL-2治療は重大な毒性を誘発し、その臨床的関連がさらに限定的である。IL-2はインビトロでT細胞とNK細胞の活性化および増殖を促進する。一態様では、IL-2またはその機能的バリアントは、TILから発現および分泌されるように遺伝子改変され得る。そのようなTILは、追加のトランスジーンを分泌するようにさらに設計することができる。

CD40L： 免疫共刺激分子として、CD40とそのリガンドCD40Lは互いに補完し合うことができる。これまでの研究で、CD40とCD40Lは体液性免疫と細胞性免疫において極めて重要な役割を担っており、CD40とCD40Lの発現は様々な疾患の発症・進行に密接に関連することが示されている（Elgueta et al. Immunol Rev 2009; 229:152-172）。CD40は、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、およびその他の腫瘍で高発現していることが見出された（Hussain et al. Br J Cancer 2011; 88:586）。CD40Lは、CD40の主要なリガンドとして、活性化されたCD4+ T細胞の表面に主に発現している。CD40がCD40Lに結合すると、CD40LはTリンパ球を活性化し、かつ腫瘍細胞においてFasを介したアポトーシス経路を活性化することができる。

別の局面において、上記の遺伝子改変リンパ球は、投与に適した薬学的組成物に組み込むことができる。薬学的組成物は、一般に、対象への投与に適した形態で、実質的に単離/精製されたリンパ球と薬学的に許容される担体とを含む。薬学的に許容される担体は、一部には、投与される特定の組成物によってだけでなく、その組成物を投与するために使用される特定の方法によっても決定される。薬学的組成物は、一般に、米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（GMP）規制に完全に準拠して製剤化される。

組成物、担体、希釈剤、および試薬に言及される「薬学的に許容される」、「生理学的に許容される」という用語は、交換可能に使用され、組成物の投与を禁止する程度に望ましくない生理作用を生じることなく対象に投与することが可能な材料を含む。例えば、「薬学的に許容される賦形剤」には、一般的に安全で、無毒で、望ましい薬学的組成物を調製するのに有用な賦形剤が含まれ、ヒトの薬学的用途だけでなく、獣医学的用途にも許容される賦形剤が含まれる。

そのような担体または希釈剤の例には、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、および5％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および化合物の使用は、当技術分野でよく知られている。従来の媒体または化合物が開示された組成物と適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。いくつかの態様では、抗癌剤または抗腫瘍剤などの第2の治療剤もまた、薬学的組成物に組み入れることができる。

注射用に適した薬学的組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF社, Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が含まれる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、また、容易な注射針通過性が存在する程度にまで流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌、真菌などの微生物の汚染作用から保護される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性の維持は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって、行うことができる。

いくつかの態様では、組成物は、上記のような遺伝子改変リンパ球と、任意で凍結保護剤（例えば、グリセロール、DMSO、PEG）とを含む。

本明細書に記載の組成物または薬学的組成物は、キットで提供することができる。一態様では、キットは、（a）組成物を含む容器と、任意で（b）情報資料とを含む。情報資料は、本明細書に記載の方法および/または治療上の利益のための剤の使用に関連する、説明、指導、マーケティングまたは他の資料であり得る。例えば、キットは、製造、使用される治療レジメン、および投与期間についての指示を含むことができる。ある態様では、キットは、追加の治療剤（例えばチェックポイントモジュレーター）をも含む。キットは、それぞれ異なる試薬が入った、1つまたは複数の容器を含んでもよい。例えば、キットは、組成物を含む第1の容器と、追加の治療剤のための第2の容器を含む。

容器は、薬学的組成物の単位投与量を含むことができる。組成物に加えて、キットは他の成分、例えば、溶媒もしくは緩衝剤、アジュバント、安定剤、または防腐剤を含み得る。

キットは、任意で、組成物の投与に適したデバイス、例えば、シリンジまたは他の適切な送達デバイスを含む。デバイスは、一方または両方の剤を予めロードして提供することができ、また、デバイスは空でもよいが、ロードに適したものであり得る。

B. 組成物を調製する方法
別の局面において、本開示は、上記組成物を調製する方法をさらに提供する。本方法は、（a）複数のリンパ球を提供する段階；（b）該複数のリンパ球に少なくとも2つのトランスジーンをコードする核酸分子を導入して、複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階；および（c）細胞培地中で該複数の遺伝子改変リンパ球を拡大培養する段階を含む。

いくつかの態様では、前記方法は、（a）複数のリンパ球を提供する段階；（b）該複数のリンパ球に2つ以上の核酸分子を導入し、それによって複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階であって、該2つ以上の核酸分子の各々が少なくとも1つのトランスジーンをコードする、段階；および（c）細胞培地中で該複数の遺伝子改変リンパ球を拡大培養する段階を含む。

いくつかの態様では、トランスジーンは、PD-1デコイ、IL-2バリアント/断片、LIGHTまたはそのバリアント/断片、IL-33またはそのバリアント/断片、およびCD40Lまたはそのバリアント/断片の2つ以上を含む。いくつかの態様では、トランスジーンは、tEGFRまたはそのバリアント/断片をさらに含む。いくつかの態様では、PD-1デコイもしくはそのバリアント/断片と、tEGFRもしくはそのバリアント/断片（またはtHER2もしくはそのバリアント/断片、CD20もしくはそのバリアント/断片、またはCD19もしくはそのバリアント/断片）は、同じベクター上に保持される。

いくつかの態様では、少なくとも2つのトランスジーンは、（a）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびtEGFRまたはそのバリアント；（b）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアント；（c）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアント；（d）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアント；（e）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアント；（f）PD-1デコイまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびIL-33またはそのバリアント；（g）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-2バリアント；（h）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびLIGHTまたはそのバリアント；（i）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-33またはそのバリアント；（j）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント；（k）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびIL-33またはそのバリアント；（l）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント；または（m）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-33バリアント、およびCD40Lまたはそのバリアントを含む。

いくつかの態様では、前記方法は、（a）第1の複数のリンパ球に、少なくとも2つのトランスジーンをコードする第1の核酸分子を導入して、第1の複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階；および（b）第2の複数のリンパ球に、少なくとも2つのトランスジーンをコードする第2の核酸分子を導入して、第2の複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階を含むことができる。いくつかの態様では、前記方法は、第1の複数の遺伝子改変リンパ球を、第1の複数の遺伝子改変リンパ球と、約1：1～約1：100（例えば、1：1、1：2、1：5、1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100）の所定の比率で組み合わせる段階をさらに含む。

いくつかの態様では、前記方法は、a）異なるリンパ球のサブセットにトランスジーンを導入する段階、ここで、各サブセットは少なくとも1つのトランスジーンを発現すること；およびb）少なくとも2つのサブセットのリンパ球を組み合わせる段階を含む。いくつかの態様では、各サブセットは、上記の態様に従って、少なくとも2つのトランスジーンを発現する。いくつかの態様では、リンパ球の組成物は、少なくとも3つの異なるトランスジーンを発現する。

いくつかの態様では、上記の腫瘍特異的な遺伝子改変されたリンパ球のサブセットの組成物を取得する方法は、インビトロまたはエクスビボで行うことができる。より特定の形態での方法は、PCT/EP2018/080343に開示されるとおりであってよく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様では、前記方法は、第1の核酸を導入する工程の後に細胞培地中で第1の複数のリンパ球を拡大培養する段階、または第2の核酸を導入する工程の後に細胞培地中で第2の複数のリンパ球を拡大培養する段階を追加的に含むことができる。

「培養する」または「拡大培養する」という用語は、細胞が増殖しかつ老化を回避できる条件下で、細胞を維持または培養することを指す。例えば、細胞は、任意で1つまたは複数の成長因子を含む培地、すなわち、成長因子カクテルで培養することができる。いくつかの態様では、細胞培地は、規定された細胞培地である。細胞培地は、ネオアンチゲンペプチドを含んでもよい。継続的な細胞増殖を可能にするために、安定した細胞株を樹立してもよい。

a. リンパ球
本明細書に記載のリンパ球の拡大培養および遺伝子改変に先立って、対象からのリンパ球のソースを取得する。リンパ球は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍など、いくつかのソースから得ることができる。本明細書に記載するように、当技術分野で入手できる様々なリンパ球株を使用することができる。リンパ球は、Ficoll（商標）分離など、当業者に知られている様々な技術を用いて、対象から採取した血液のユニットから取得することができる。個体の循環血液細胞はアフェレーシスにより得られる。アフェレーシス製品には通常、リンパ球、例えば、Tリンパ球、単球、顆粒球、Bリンパ球、その他の有核白血球、赤血球、および血小板が含まれる。アフェレーシスで採取された細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、その後の処理工程のために適切なバッファーまたは培地中に該細胞を入れることができる。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄してもよい。あるいは、洗浄液は、カルシウムを欠いてもよく、マグネシウムを欠いてもよく、または、全てではないにしても、多くの2価カチオンを欠いてもよい。当業者には容易に理解されるように、洗浄工程は、当業者に公知の方法によって、例えば、半自動連続流遠心機（例えば、Cobe 2991セルプロセッサー、Baxter CytoMate、またはe1Haemonetics Cell Saver 5）をメーカーの指示に従って用いて、達成することが可能である。洗浄した後、細胞は、様々な生体適合性バッファー中に、例えば、Ca2+フリー、Mg2+フリーPBS、PlasmaLyte A、またはバッファーを含むもしくは含まない他の生理食塩水などに、再懸濁することができる。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁することもできる。

本明細書に記載するように、リンパ球は、赤血球の溶解および単球の枯渇により、例えばPERCOLL（商標）勾配による遠心分離または向流遠心溶出により、末梢血から分離することができる。必要に応じて、Tリンパ球（すなわち、Cd3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+またはCD45RO+ Tリンパ球）などの特定の亜集団リンパ球をポジティブまたはネガティブ選択技術によりさらに分離することができる。例えば、Tリンパ球は、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 Tなどの、抗CD3/抗CD28コンジュゲートビーズ（すなわち、3×28）と十分な時間（すなわち、30分～24時間）インキュベートして、目的のTリンパ球をポジティブ選択することにより、分離することができる。白血病患者からTリンパ球を分離する場合、24時間といった、より長いインキュベーション時間を使用することで、細胞の性能を高めることができる。より長いインキュベーション時間は、腫瘍組織または免疫不全個体からの腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の分離など、他の細胞種に比べてTリンパ球が少ない状況においてTリンパ球を分離するために、使用することができる。当業者であれば、複数ラウンドの選択を使用してもよいことを認識するであろう。選択手順を行って、「未選択」細胞を活性化および拡大培養プロセスで使用することが望ましいかもしれない。「未選択」細胞もまた、新たなラウンドの選択を受けることができる。

ネガティブ選択によるリンパ球（例えばTリンパ球）集団の濃縮は、ネガティブ選択される細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて行うことができる。1つの方法は、ネガティブ選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いたネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞のソーティングおよび/または選択である。例えば、ネガティブ選択によってCD4+ 細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体は一般的にCD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。あるいは、制御性Tリンパ球は、抗C25コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇される。

刺激用のリンパ球は、洗浄工程後に凍結することも可能である。理論に拘束されるものではないが、凍結とそれに続く融解の工程は、細胞集団中の顆粒球と、ある程度は単球、を排除することによって、より均質な産物をもたらす。血漿と血小板を除去する洗浄工程の後で、細胞を凍結液に懸濁させることができる。多くの溶液および凍結パラメータが当技術分野で知られており、これに関連して有用であろうが、1つの方法は、20％DMSOと8％ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または10％デキストラン40と5％ブドウ糖、ヒトアルブミンと7.5％DMSO、もしくは31.25％Plasmalyte A、31.25％ブドウ糖5％、0.45％NaCl、10％デキストラン40と5％ブドウ糖、20％ヒト血清アルブミンと7.5％DMSOを含有する培地、または例えばHespanとPlasmaLyte Aを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用することである。その後、細胞を毎分1℃の速度で－80℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存することができる。その他の制御された凍結方法も使用可能であり、－20℃または液体窒素中での即時の無制御凍結を使用することもできる。

凍結保存された細胞は、本明細書に記載するように融解して洗浄し、室温で1時間放置してから、本発明の方法を用いて活性化することができる。本明細書に記載するように、リンパ球を拡大培養し、凍結させ、その後で使用することができる。本明細書に記載するように、サンプルは、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後であるが、あらゆる治療の前に、患者から採取することができる。細胞は、様々な関連する治療法の前に、対象の血液サンプルまたはアフェレーシスから分離することができる；かかる治療法には、剤、例えばナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびFK506、抗体または他の免疫除去剤（immunoablatory）、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、シトキサン（cytoxane）、フルダラビン、シクロスポリジン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、および放射線照射による治療が含まれるが、これらに限定されない。これらの薬物は、カルシウム依存性のカルシニューリンホスファターゼを阻害する（例えば、シクロスポリンおよびFK506）か、または成長因子によって誘導されるシグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73: 316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun., 5: 763-773, 1993）。細胞は、患者から分離されて、骨髄または幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤を用いたTリンパ球アブレーション、放射線療法外部ビーム（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体を用いた療法と一緒に（例えば、前、同時または後に）、あとで使用するために凍結され得る。本明細書に記載するように、細胞は、CD20と反応する剤、例えばリツキサンなどの、Bリンパ球のアブレーションを伴う療法の前に分離され、その療法の後で使用するために凍結され得る。

望ましいトランスジーンを発現するようにリンパ球（例えばTリンパ球）を遺伝子改変する前または後のいずれかで、リンパ球は、一般的に、例えば米国特許第6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載されるような方法を用いて、活性化および拡大培養され得る。

b. ベクター
トランスジーンは、様々な方法を用いてリンパ系細胞に導入することができる。これらの方法には、組込み能力のあるガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスを用いる細胞の形質導入、およびDNA転移が含まれるが、これらに限定されない。

トランスジーンの発現には、多種多様なベクターを使用することができる。ある種のウイルスが細胞に感染するまたは受容体を介したエンドサイトーシスにより細胞に侵入する能力、および宿主細胞のゲノムに組み込まれてウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する該ウイルスの能力は、それらを、外来核酸を細胞に導入するための魅力的な候補としている。したがって、特定の態様では、1つまたは複数のトランスジーンもしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を発現用の宿主細胞に導入するために、ウイルスベクターが使用される。ウイルスベクターは、1つまたは複数の制御配列、例えばプロモーターに機能的に連結された、1つまたは複数のトランスジーンもしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ウイルスベクターは制御配列を含まなくてもよく、その代わりに、トランスジーンまたはその断片の発現を駆動するために宿主細胞内の制御配列を当てにすることになる。核酸を送達するために使用できるウイルスベクターの非限定的な例としては、アデノウイルスベクター、AAVベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。

例えば、アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて、1つまたは複数のトランスジーンもしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を発現用の宿主細胞に導入することができる。AAVシステムは以前に記載されており、当技術分野では一般的によく知られている（Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992）。rAAVベクターの作成および使用に関する詳細は、例えば、米国特許第5,139,941号および同第4,797,368号に記載されており、それぞれはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様では、レトロウイルス発現ベクターを用いて、1つまたは複数のトランスジーンもしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を発現用の宿主細胞に導入することができる。これらのシステムは以前に記載されており、当技術分野では一般的によく知られている（Nicolas and Rubinstein, In, Rodriguez and Denhardt編, Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (編), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986）。哺乳類細胞における真核生物発現用ベクターの例には、AD5、pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPVなどと、CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV、β-アクチンなどのプロモーターを使用する、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルスシステム由来のベクターが含まれる。

レトロウイルスと適切なパッケージング細胞株の組み合わせも利用することができ、この場合にはカプシドタンパク質が標的細胞への感染のために機能することになる。通常、細胞とウイルスを培地中で少なくとも約24時間インキュベートする。その後、細胞を、ある応用例では短い時間間隔、例えば24～73時間、または少なくとも2週間、培地中で増殖させ、また、分析前に5週間またはそれ以上増殖させてもよい。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは「欠損性」であり、すなわち、生産性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製にはパッケージング細胞株での増殖が必要である。レトロウイルスの宿主細胞特異性は、エンベロープタンパク質であるenv（pl20）によって決定される。エンベロープタンパク質はパッケージング細胞株により提供される。エンベロープタンパク質には、少なくとも、同種指向性、両種指向性、および異種指向性という3つのタイプがある。MMLVなどの、同種指向性エンベロープタンパク質によりパッケージングされたレトロウイルスは、ほとんどのマウスおよびラットの細胞種に感染する能力がある。同種指向性パッケージング細胞株としては、BOSC23が挙げられる。4070Aなどの、両種指向性エンベロープタンパク質を持つレトロウイルスは、ヒト、イヌ、マウスを含めて、ほとんどの哺乳動物細胞種に感染する能力がある。両種指向性パッケージング細胞株としては、PA12およびPA317が挙げられる。AKR envなどの、異種指向性エンベロープタンパク質によりパッケージングされたレトロウイルスは、マウス細胞を除いて、ほとんどの哺乳動物細胞種に感染する能力がある。ベクターは、例えばCre/Loxのようなリコンビナーゼシステムを用いて、後で除去されねばならない遺伝子を含むことができ、または、それらを発現する細胞は、例えばヘルペスウイルスTK、BCL-xsなどの選択的毒性を可能にする遺伝子を含めることにより、破壊される。適切な誘導性プロモーターは、所望の標的細胞種、トランスフェクトされた細胞またはその子孫のいずれか、において活性化される。

本発明に有用なベクターの非限定的な例としては、レトロウイルスベクターSFG.MCS、およびヘルパープラスミドRD114、Peg-Pam3（Arber et al. J Clin Invest 2015 Jan 2; 125(1): 157-168）、レンチウイルスベクターpRRL、およびヘルパープラスミドR8.74、pMD2G（例えば、Addgene Plasmid #12259）が挙げられる。いくつかの態様では、Sleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用することができる（Deniger et al. 2016 Mol Ther. Jun;24(6):1078-1089）。いくつかの態様では、トランスジーンは、それが小さな開口部を通過する際に細胞を変形させ、細胞膜を破壊し、細胞内に物質を挿入させることを介して、例えばエレクトロポレーション（Xiaojun et al. 2017 Protein Cell, 8(7): 514-526）、またはCell Squeeze（登録商標）法により、細胞に導入され得る。トランスジーンをコードするRNAのそのようなエレクトロポレーション法は、細胞におけるトランスジーンの一過性の発現を可能にし、遺伝子改変された細胞の毒性および他の望ましくない作用を制限することができる（Barrett et al. 2011 Hum Gene Ther. Dec; 22 (12): 1575-1586）。

いくつかの態様では、ゲノム編集技術、例えば、CRISPR/Cas9システム、デザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（TALE）、またはホーミングメガヌクレアーゼが、免疫細胞におけるトランスジーンの発現を誘導するために利用可能である。一般に、「CRISPR/Cas9システム」とは、CRISPR関連（「Cas」）遺伝子の発現またはその活性の誘導に関与する転写産物とその他の要素を総称して指し、Cas遺伝子をコードする配列、tracr（トランス活性化CRISPR）配列（例えば、tracrRNAまたは活性な部分的tracrRNA）、tracr-mate配列（内因性CRISPRシステムとの関連で「直接反復配列」およびtracrRNAで処理された部分的な直接反復配列を含む）、ガイド配列（内因性CRISPRシステムとの関連で「スペーサー」とも呼ばれる）、またはCRISPR座位からの他の配列および転写産物が含まれる。CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、タイプI、タイプII、またはタイプIIIのCRISPRシステムから誘導され得る。あるいは、CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、内因性CRISPRシステムを含む特定の生物、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）に由来してもよい。一般的に、CRISPRシステムは、標的配列の部位でのCRISPR複合体の形成を促進する要素（内因性CRISPRシステムとの関連ではプロトスペーサーとも呼ばれる）によって特徴付けられる。

いくつかの態様では、遺伝子改変は、1つまたは複数のトランスジーンまたはその機能的断片およびCA9またはその機能的断片をコードするベクター（例えばレンチウイルスベクター）でリンパ球細胞をトランスフェクトすることにより導入される。いくつかの態様では、1つまたは複数のトランスジーンもしくはその機能的断片およびCA9もしくはその機能的断片が1つ、2つ、またはそれ以上のベクターを用いて免疫細胞に導入され得る。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。外因性のベクターおよび/または核酸を含む細胞を作製する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Sambrookら（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）を参照されたい。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散システム、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースのシステム、例えば、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが含まれる。インビトロおよびインビボ放出ビヒクルとして使用するための例示的なコロイドシステムは、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。

非ウイルス性送達システムを使用する場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）のために脂質製剤の使用が企図される。別の局面では、核酸は脂質と会合されていてもよい。脂質と会合された核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化されているか、リポソームの脂質二重層内に散在しているか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に結合された結合分子を介してリポソームに結合しているか、リポソームに封入されているか、リポソームと複合体を形成しているか、脂質を含む溶液中に分散しているか、脂質と混ざっているか、脂質と組み合わされているか、脂質中に懸濁物として含まれているか、ミセルの内容物もしくはミセルとの複合体であるか、または他の方法で脂質と会合している可能性がある。脂質、脂質/DNAまたは脂質/発現ベクターに関連する組成物は、溶液中のどのような特定の構造にも限定されない。例えば、それらは二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在することができる。それらはまた、溶液中に単に散在していることもあり、おそらく、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成している。脂質は脂肪性の物質で、天然または合成脂質であり得る。例えば、脂質には、細胞質内に自然界で生じる脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物のクラス、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどが含まれる。

使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）は、Sigma社（St. Louis, MO）から得ることができる；ジセチルホスフェート（「DCP」）は、K & K Laboratories社（Plainview, NY）から得ることができる；コレステロール（「Choi」）は、Calbiochem-Behring社から得ることができる；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）と他の脂質は、Avanti Polar Lipids社（Birmingham, AL）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質ストック溶液は、約－20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、二重層または閉鎖脂質凝集体の生成により形成される、様々な独特の多重膜脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質の二重層膜と内部水性媒体とを備えた小胞構造を持つものとして特徴付けることができる。マルチラメラリポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液に懸濁させると、自然に生じる。脂質成分は、閉鎖構造を形成する前に自己再配置を受け、脂質二重層の間に溶存水と溶質を閉じ込める（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。ただし、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で示す組成物も含まれる。例えば、脂質はミセル構造をとることもあれば、単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することもある。また、リポフェクタミン-核酸複合体も考えられる。

外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞内に組換えDNA配列が存在することは、一連の試験によって確認することができる。そのようなアッセイには、例えば、当業者によく知られた「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンおよびノーザンブロット、RT-PCR、およびPCRなど；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ELISAおよびウェスタンブロット）によりまたは本発明の範囲内にある剤を同定するための本明細書に記載のアッセイにより、特定のペプチドの存在または不在を検出するなど、が含まれる。

C. 治療方法
本開示は、癌または腫瘍を治療する方法をさらに提供する。本方法は、治療に有効な量の、上記のような、組成物または薬学的組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む。

本明細書で使用する用語「対象」および「患者」は、その対象が何らかの治療を受けているかまたは現在受けているかに関わりなく、交換可能に使用される。本明細書で使用する用語「対象」は、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）およびヒト）を含むが、それらに限定されない任意の脊椎動物を指すことができる。対象はヒトまたは非ヒトであり得る。より例示的な局面では、哺乳類はヒトである。

ある態様では、対象はヒトである。ある態様では、対象は癌を有する。ある態様では、対象は免疫力が低下している（immune-depleted）。

本発明を説明するために使用される「癌」、「腫瘍」、および「悪性腫瘍」は全て、組織または臓器の過形成に同等に関連している。組織がリンパ系または免疫系の一部である場合、悪性細胞は循環細胞の非固形腫瘍を含むことがある。他の組織または臓器の悪性腫瘍は、固形腫瘍を生じる可能性がある。本発明の方法は、リンパ球、循環免疫細胞、および固形腫瘍の治療に使用することができる。

治療可能な癌には、血管新生された腫瘍だけでなく、血管新生されていないまたは実質的に血管新生されていない腫瘍も含まれる。癌は、非固形腫瘍（例えば、白血病、リンパ腫などの血液腫瘍）を構成してもよいし、固形腫瘍を構成してもよい。本発明の組成物で治療される癌の種類には、癌腫、芽細胞腫および肉腫、ならびに特定の白血病または悪性リンパ系腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫、およびメラノーマが含まれるが、これらに限定されない。また、成人の腫瘍/癌および小児の腫瘍/癌も含まれる。

血液学的癌（hematologic cancer）は、血液または骨髄の癌である。血液学的（または血液原性）癌の例には、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤血球性白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病など）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩慢型および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、重鎖症、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、および骨髄異形成症が含まれる。

固形腫瘍は、嚢胞または液状部を通常は含まない、異常な組織塊である。固形腫瘍は良性または悪性であり得る。様々なタイプの固形腫瘍は、それらを形成している細胞の種類（肉腫、癌腫、リンパ腫など）にちなんで名前が付けられている。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、以下が含まれる：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫および他の肉腫、滑膜、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫の皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、メラノーマ、およびCNS腫瘍（グリオーマなど）（脳幹グリオーマ、混合性グリオーマなど）、膠芽腫（星状細胞腫、CNSリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫（Schwannoma）、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫、および脳転移も含む）。

いくつかの態様では、癌は、メラノーマ、肉腫、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、MSI-high腫瘍、頭頸部腫瘍、腎臓癌、および乳癌からなる群より選択される。

記載されるような薬学的組成物は、治療（または予防）すべき疾患に適した方法で投与することができる。投与量と投与頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプと重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定され得る。

「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態の個体差を考慮して、医師により決定され得る。一般に、本明細書に記載のリンパ球を含む薬学的組成物は、10⁴～10⁹細胞/kg体重、例えば10⁵～10⁶細胞/kg体重（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の用量で投与することができると言える。リンパ球組成物はまた、これらの投与量で数回投与することができる。細胞は、免疫療法でよく知られている注入技術を用いて投与され得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988を参照されたい）。特定の患者に最適な用量および治療レジメンは、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって、医学分野の当業者が容易に決定することができる。

本組成物の投与は、注入もしくは注射（すなわち、静脈内、髄腔内、筋肉内、管腔内、気管内、腹腔内、または皮下）、経皮投与、または当技術分野で知られる他の方法を含めて、任意の便利な方法で実施することができる。投与は2週間に1回、1週間に1回、またはそれ以上の頻度であり得るが、疾患または障害の維持期には頻度を減らしてもよい。ある態様では、組成物は静脈内注入によって投与される。

特定の場合には、本明細書に記載の方法を用いて、またはリンパ球が治療レベルにまで拡大培養される当技術分野で公知の他の方法を用いて、活性化および拡大培養された細胞は、多くの関連する治療法と一緒に（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。また、本明細書に記載するように、リンパ球は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、CAMPATH、抗癌抗体、CD3または他の抗体療法、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリジン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および放射線照射と組み合わせて使用することができる。

本発明の組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を用いたTリンパ球アブレーションを伴う療法、放射線療法外部ビーム（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体と一緒に（例えば、前、同時または後に）、患者に投与することも可能である。また、本明細書に記載するように、組成物は、CD20と反応する剤、例えばリツキサンなどの、Bリンパ球の除去療法（ablative therapy）の後に投与することができる。例えば、対象は、大量化学療法による標準的な治療を受けた後に、末梢血幹細胞の移植を受けることができる。特定の場合には、移植後、対象は拡大培養したリンパ球の注入を受けるか、または拡大培養したリンパ球が手術の前もしくは後に投与される。

いくつかの態様では、前記方法は、対象に第2の治療剤を投与することをさらに含み得る。第2の治療剤は、抗癌剤または抗腫瘍剤である。いくつかの態様では、組成物は、化学療法剤および免疫療法剤などの第2の治療剤の前、後、またはそれと同時に、対象に投与される。

いくつかの態様では、前記方法は、治療に有効な量の免疫チェックポイントモジュレーターを投与することをさらに含む。免疫チェックポイントモジュレーターの例としては、PD1、PDL1、CTLA4、TIM3、LAG3、およびTRAILを挙げることができる。チェックポイントモジュレーターは、本発明の組成物と同時に、別々に、または並行して投与することができる。

「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化合物のことである。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤、例えば、チオテパ、シクロホスファミド（CYTOXANTM）；アルキルスルホン酸塩、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン類、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メチルドーパ、およびウレドーパ（uredopa）；エチレンイミン類およびメチラメラミン類、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロールメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログのトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログのKW-2189とCBI-TMIを含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード類、例えば、クロラムブチル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン系抗生物質（例えばカリケアマイシン、例えばAgnew Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)参照）；ジネマイシン（dynemicin）、例えばジネマイシンA；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア類)、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート、および5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU；アンドロゲン類、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬（anti-adrenals）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン；エダトレキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン（elformithine）；エリプチニウムアセタート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド類、例えば、メイタンシン、およびアンサミトシン類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にT-2トキシン、ベルカリンA、ロリジンA、アングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えば、パクリタキセル（TAXOL（登録商標），Bristol-Myers Squibb Oncology社, Princeton, N.J.）およびドセタキセル（TAXOTERE（登録商標），Rhone-Poulenc Rorer社, Antony, フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；CPT-11；トポイソメラーゼ阻害薬RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または抑制するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えば、抗エストロゲン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する4(5)-イミダゾール類、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）など；および抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、ゼローダ、ゲムシタビン、KRAS変異共有結合阻害剤（KRAS mutation covalent inhibitor）、およびゴセレリンなど；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれる。追加の例には、イリノテカン、オキサリプラチン、その他の標準的な大腸癌レジメンが含まれる。

「免疫療法剤」は、癌の治療に有用な生物学的剤を含み得る。いくつかの態様では、免疫療法剤には、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、VISTA、DKG-α、B7-H3、B7-H4、TIGIT、CTLA-4、BTLA、CD160、TIM1、IDO、LAIR1、IL-12の阻害剤、またはそれらの組み合わせ）が含まれる。免疫療法剤の例としては、アテゾリズマブ、アベルマブ、ブリナツモマブ、ダラツムマブ、セミプリマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ、ラヘルパレプベク、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、ペムブロリズマブ、セツキシマブ、およびタリモジン（talimogene）が挙げられる。

D. 定義
本開示による組成物および方法の詳細な説明の理解を助けるために、いくつかの明確な定義が、本開示の様々な局面の明確な開示を容易にするため提供される。特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供するものである：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker編, 1988); The Glossary of Genetics, 第5版, R. Rieger et al. (編), Springer Verlag (1991); およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用する以下の用語は、特に明記されない限り、以下でそれらに帰する意味を有する。

本明細書で使用する「発現」とは、ポリヌクレオチドがDNAテンプレートから（mRNAもしくは他のRNA転写産物などに）転写される過程、および/または転写されたmRNAがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳される過程を指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、総称して「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は、真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含み得る。

本明細書で使用する用語「組換え体」とは、外因性核酸分子の導入によって改変されているか、または内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現が制御されている細胞、微生物、核酸分子またはベクターを指す。構成的に改変されるように脱制御または改変することができ、そのような改変または変更は、遺伝子工学によって導入することができる。遺伝子改変には、例えば、1つまたは複数のタンパク質もしくは酵素をコードする核酸分子（プロモーターなどの発現制御要素を含んでもよい）の導入、または別の核酸分子の付加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質の他の機能的破壊もしくは遺伝物質への機能的付加による変更が含まれる。例示的な改変には、参照分子もしくは親分子またはその機能的断片に由来する異種または同種ポリペプチドのコード領域における改変が含まれる。

「トランスジーン」または「治療用トランスジーン」とは、可溶性受容体、デコイ、デコイ受容体、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、酵素、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスロカーゼ、キナーゼ、トランスポーター、修飾因子、分子シャペロン、イオンチャネル、抗体、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、ホルモン、DNA、リボザイム、バイオセンサー、エピジェネティック修飾因子、転写因子、コーディングRNA、ノンコーディングRNA、スモールRNA、ロングRNA、IRESエレメント、またはエクソソームシャトルRNAからなる群より選択される分子を意味する。

本明細書で使用する用語「機能的バリアント」とは、野生型トランスジーンと実質的なまたは顕著な配列同一性または類似性を有する改変トランスジーンを指し、そのような機能的バリアントは、そのバリアントの野生型トランスジーンの生物学的活性を保持する。いくつかの態様では、トランスジーンの機能的バリアントが使用される。

本明細書で使用する用語「抗原認識受容体」とは、抗原結合に応答して免疫細胞（例えばT細胞）を活性化することができる受容体を指す。例示的な抗原認識受容体は、天然のもしくは遺伝子改変されたTCR、または遺伝子改変されたTCR様mAb（Hoydahl et al. Antibodies 2019 8:32）、または腫瘍抗原結合ドメインが免疫細胞（例えばT細胞）を活性化できる細胞内シグナル伝達ドメインに融合されたCARであり得る。特定の癌抗原に対する天然TCRを発現するT細胞クローンは、以前に開示されている（Traversari et al., J Exp Med, 1992 176:1453-7; Ottaviani et al., Cancer Immunol Immunother, 2005 54:1214-20; Chaux et al., J Immunol, 1999 163:2928-36; Luiten and van der Bruggen, Tissue Antigens, 2000 55:149-52; van der Bruggen et al., Eur J Immunol, 1994 24:3038-43; Huang et al., J Immunol, 1999 162:6849-54; Ma et al., Int J Cancer, 2004 109:698-702; Ebert et al., Cancer Res, 2009 69:1046-54; Ayyoub et al. J Immunol 2002 168:1717-22; Chaux et al., European Journal of Immunology, 2001 31:1910-16; Wang et al., Cancer Immunol Immunother, 2007 56:807-18; Schultz et al., Cancer Research, 2000 60:6272-75; Cesson et al., Cancer Immunol Immunother, 2010 60:23-25; Zhang et al., Journal of Immunology, 2003 171:219-25; Gnjatic et al., PNAS, 2003 100:8862-67; Chen et al., PNAS, 2004)。一態様では、そのようなTCRは、養子免疫細胞療法で使用するために、配列決定されて、TILに遺伝子改変され得る。特定の局面では、MAGE-A1抗原、MAGE-A3抗原、MAGE A-10抗原、MAGE-C2抗原、NY-ESO-1抗原、SSX2抗原、およびMAGE-A12抗原を認識するTCRが、養子免疫細胞療法で使用するために、TILに遺伝子改変され得る。さらに他の態様では、TCRを有する遺伝子改変されたTILは、トランスジーンを分泌するようにさらに改変される。さらに他の態様では、CARが使用される。他の態様では、CARは、トランスジーンを分泌するようにさらに改変される。

本明細書で使用する用語「抗体」は、無傷の抗体分子だけでなく、免疫原結合能を保持する抗体分子のフラグメントをも意味する。そのようなフラグメントもまた、当技術分野でよく知られており、インビトロとインビボの両方で常時使用されている。したがって、本明細書で使用する用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子だけでなく、よく知られた活性フラグメントf(ab')2およびfabをも意味する。無傷抗体のFeフラグメントを欠いたf(ab')2およびfabフラグメントは、循環からより速くクリアランスされ、無傷抗体の非特異的組織結合が少ない可能性がある（Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)）。本発明の抗体は、完全天然抗体、二重特異性抗体；キメラ抗体；fab、fab'、単鎖v領域フラグメント（scFv）、融合ポリペプチド、および非定型（unconventional）抗体を含む。

本明細書で使用する用語「単鎖可変フラグメント」または「scFv」は、免疫グロブリンの重鎖（VH）と軽鎖（VL）の可変領域が共有結合してVH::VLヘテロ二量体を形成している融合タンパク質である。重鎖（VH）と軽鎖（VL）は直接結合されるか、ペプチドをコードするリンカー（例えば、10、15、20、25アミノ酸）により結合され、リンカーはVHのN末端をVLのC末端と、またはVHのC末端をVLのN末端と接続する。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリンまたはスレオニンが豊富である。定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、scFvタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Fvポリペプチド抗体は、Hustonら（Proc. Nat. Acad. Sci., 85:5879-5883, 1988）に記載されるVHおよびVLコード配列を含む核酸から発現させることができる。また、米国特許第5,091,513号、第5,132,405号および第4,956,778号、ならびに米国特許公開第20050196754号および第20050196754号を参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニストscFvが記載されている（例えば、Zhao et al., Hybridoma (Larchmont) 2008 27(6):455-51; Peter et al., J cachexia sarcopenia muscle 2012 Aug. 12; Shieh et al., J Immunol 2009 183(4):2277-85; Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63; Fife et al., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61; Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84; Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40)を参照されたい)。刺激活性を有するアゴニストscFvが記載されている（例えば、Peter et al., J Bioi Chern 2003 25278(38):36740-7; Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71; Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55; Ho et al., Biochim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66を参照されたい）。

本明細書で使用する「治療する」または「治療」とは、疾患、疾患の症状、疾患に続発する病状、または疾患に対する素因を治療する、緩和する、軽減する、救済する、発症を遅らせる、予防する、または改善する目的で、疾患を有する対象に化合物または剤を投与することを指す。

免疫応答との関連で「誘発する」または「増強する」という用語は、癌細胞を標的化および/もしくは殺傷する、または病原体および病原体感染細胞（例えばEBV陽性の癌細胞）を標的化および/もしくは殺傷する免疫細胞の能力の増加など、免疫応答を引き出すまたは増大させることを指す。

本明細書で使用する用語「免疫応答」とは、自然免疫応答（例えば、Toll受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞性免疫応答（例えば、T細胞（例えば抗原特異的T細胞）および免疫系の非特異的細胞により媒介される応答）、および体液性免疫応答（例えば、B細胞により媒介される応答（例えば、抗体の生成と、血漿、リンパ液および/または組織液への分泌を介する））を含むが、これらに限定されない、任意のタイプの免疫応答を指す。用語「免疫応答」は、抗原および/または免疫原に応答する対象の免疫系の能力のあらゆる側面（例えば、免疫原（例えば病原体）に対する初期応答と、適応免疫応答の結果である獲得（例えば記憶）応答の両方）を包含するものである。

本明細書で使用する用語「インビトロ」とは、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養など、において生じる事象を指す。

本明細書で使用する用語「インビボ」とは、非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。

本明細書で使用する用語「疾患」は、正常な機能を損なうヒトもしくは動物の身体またはその一部の異常な状態を反映し、通常は特徴的な兆候および症状によって現れ、ヒトまたは動物に生存期間または生活の質の低下をもたらすという点で、用語「障害」および（医学的状態におけるような）「状態」と一般的に同義であるとされ、交換可能に使用される。

「低下する」、「減少する」、「減少」、「低下」、または「抑制」という用語は全て、本明細書では、一般に統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかし、誤解を避けるために、「減少された」、「減少」、「低下」、または「抑制」は、基準レベルと比較して少なくとも10％の減少、例えば、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％または最大100％の減少（例えば、基準サンプルと比較したときの消失レベル）、または基準レベルと比較して10～100％の間の任意の減少を意味する。

本明細書で使用する用語「調節する」とは、生物学的状態の何らかの変化、すなわち、増加、低下、および同様のものを指すことを意味する。

「増加された」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は全て、本明細書では、一般に統計的に有意な量の増加を意味するために使用される；誤解を避けるために、用語「増加された」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」は、基準レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％もしくは最大100％の増加、または基準レベルと比較して10～100％の間の任意の増加、または基準レベルと比較して少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍～10倍もしくはそれ以上の間の任意の増加を意味する。

用語「有効量」、「有効用量」、または「有効投与量」とは、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。薬物または治療剤の「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」とは、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用した場合に、症状の重症度の低下、無症状期間の頻度と持続時間の増加、または疾患の苦しみによる機能障害または能力障害の予防によって証明される、疾患退行を促進する薬物の量のことである。薬物の「予防上有効な量」または「予防上有効な投与量」とは、疾患を発症するリスクまたは疾患の再発を被るリスクのある対象に、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与した場合に、疾患の発症または再発を抑制する薬物の量のことである。疾患退行を促進する、または疾患の発生もしくは再発を抑制する治療剤または予防剤の能力は、当業者に知られた様々な方法を用いて、例えば、臨床治験中のヒト対象において、ヒトでの有効性を予測する動物モデル系において、またはインビトロアッセイで剤の活性を測定することによって、評価することが可能である。

用量は、体重との関係で表されることが多い。そのため、[g、mg、または他の単位]/kg（またはg、mgなど）として表される用量は、「体重」という用語が明示的に記載されていない場合でも、通常、「kg（またはg、mgなど）体重あたり」の[g、mg、または他の単位]を指す。

用語「剤」は、本明細書では、化合物、化合物の混合物、生体高分子（核酸、抗体、タンパク質またはその一部、例えばペプチドなど）、または細菌、植物、真菌、もしくは動物（特に哺乳類）の細胞もしくは組織などの生物学的材料から作られた抽出物を示すために使用される。そのような剤の活性は、それを、対象において局所的または全身的に作用する生物学的、生理学的、または薬理学的に活性な物質である「治療剤」として適したものにし得る。

「治療剤」、「治療可能剤」、または「治療薬」という用語は交換可能に使用され、対象への投与時に何らかの有益な効果をもたらす分子または化合物を指す。有益な効果には、診断判断の実施可能性；疾患、症状、障害または病的状態の改善；疾患、症状、障害または状態の発症の抑制または防止；および一般的に疾患、症状、障害または病的状態の解消が含まれる。

本明細書で使用する「併用」療法とは、特に文脈から明確でない限り、2つ以上の治療剤の協調的な方法での投与を包含することを意味し、同時投与を含むが、これに限定されない。具体的には、併用療法は、ある治療剤の投与が別の治療剤の投与に何らかの方法で条件付けられる限り、共投与（例えば、共処方製剤（co-formulation）の投与または別個の治療用組成物の同時投与）と、連続または逐次投与の両方を包含する。例えば、ある治療剤は、別の治療剤を投与して、指示された期間にわたって作用させた後にのみ、投与することができる。例えば、Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423を参照されたい。

「サンプル」、「試験サンプル」、および「患者サンプル」は、本明細書では交換可能に使用され得る。サンプルは、血清、尿、血漿、羊水、脳脊髄液、細胞（例えば、抗体産生細胞）、または組織のサンプルであり得る。そのようなサンプルは、患者から得られたものをそのまま使用することができ、または本明細書で説明するような、あるいは当技術分野で知られるような何らかの方法でサンプルの性質を変更するために、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化、試薬の添加などによって前処理することもできる。本明細書で使用する「サンプル」および「生物学的サンプル」という用語は、一般に、抗体などの関心対象の分析物について試験される、および/またはそのような分析物を含むことが疑われる生物学的材料を指す。サンプルは、対象からの任意の組織サンプルであってよい。サンプルは、対象由来のタンパク質を含んでもよい。

本明細書で使用する「阻害する」および「拮抗する」という用語は、分子、反応、相互作用、遺伝子、mRNA、および/またはタンパク質の発現、安定性、機能もしくは活性を測定可能な量にまで減少させること、または完全に防止することを意味する。阻害剤は、例えば、タンパク質、遺伝子、およびmRNAに結合し、刺激を部分的または全体的に遮断し、それらの安定性、発現、機能および活性を低下させ、阻止し、活性化を遅らせ、不活性化し、感度を減じ、またはダウンレギュレートする化合物、例えばアンタゴニストである。

組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）、もしくは胸骨内注射、または注入技術が含まれる。

本明細書で使用する用語「薬学的組成物」とは、本発明において有用な少なくとも1つの化合物と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、および/または賦形剤などの他の化学成分との混合物を指す。薬学的組成物は生物への化合物の投与を容易にする。

本明細書で使用する用語「薬学的に許容される」とは、組成物の生物学的活性または特性を損なわず、かつ比較的無毒である、担体または希釈剤などの材料を指す；すなわち、そのような材料は、望ましくない生物学的影響を及ぼしたり、それが含まれる組成物の成分のいずれかと有害な方法で相互作用したりすることなく、個体に投与することが可能である。

用語「薬学的に許容される担体」には、本発明の化合物がその意図された機能を果たすように対象内または対象に該化合物を運搬または輸送するのに関与する、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化材料など、が含まれる。典型的には、そのような化合物は、ある器官または体の一部から別の器官または体の一部に運搬または輸送される。各塩または担体は、製剤の他の成分と適合しかつ対象に対して有害でないという意味で、「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる：糖類、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、およびジャガイモデンプン；セルロースとその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター、および坐剤用ワックス；油脂類、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油；グリコール類、例えばプロピレングリコール；ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール；エステル類、例えば、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；希釈剤；造粒剤；滑沢剤；結合剤；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；離型剤；コーティング剤；甘味剤；香味剤；芳香剤；防腐剤；酸化防止剤；可塑剤；ゲル化剤；増粘剤；硬化剤（hardener）；硬化剤（setting agent）；懸濁化剤；界面活性剤；保湿剤；担体；安定剤；および薬学的製剤に用いられる他の無毒の適合性物質、またはそれらの任意の組み合わせ。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」には、化合物の活性に適合し、対象に生理学的に受け入れられる、ありとあらゆるコーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども包含される。補足的な活性化合物もまた、組成物に組み入れることができる。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形の「a」、「an」および「the」は、文脈上明らかな別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意されたい。

用語「含む（including）」、「含む（comprising）」、「包含する（containing）」、または「有する（having）」およびそれらの変形は、特に断りのない限り、その後に記載される項目およびその同等物、ならびに追加の対象物を包含することを意味する。

「一態様では」、「様々な態様では」、「いくつかの態様では」などの表現は、繰り返し使用される。このような表現は、必ずしも同じ態様を指すものではないが、文脈上別段の指示がない限り、それらはそうであり得る。

用語「および/または」または「/」は、この用語が関連している項目のいずれか1つ、該項目の任意の組み合わせ、または該項目の全てを意味する。

「実質的に」という用語は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、用語「実質的に」は、本発明の定義から省くことができる。

本明細書で使用する用語「およそ」または「約」は、関心のある1つまたは複数の値に適用される場合、記載された基準値に類似する値を指す。いくつかの態様では、用語「およそ」または「約」は、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの（より大きいまたはより小さい）方向に25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはそれより小さい範囲内にある数値の範囲を指す（ただし、その数値は可能値の100％を超えてしまう場合を除く）。本明細書で別段の指示がない限り、用語「約」は、個々の成分、組成物、または態様の機能性の観点から同等である、記載された範囲に近似する値、例えば重量パーセント、を含むものである。

本明細書に値と範囲が提供される場合、これらの値と範囲に包含される全ての値と範囲は、本発明の範囲内に包含されることを意味すると理解されたい。さらに、これらの範囲内にある全ての値、ならびに値の範囲の上限または下限もまた、本出願によって企図されている。

本明細書で使用する用語「各」は、項目の集合に関して使用される場合、集合内の個々の項目を識別することを意図しているが、必ずしも集合内のあらゆる項目を指すわけではない。明示的な開示または文脈が明らかにそうでない指示をする場合は、例外が発生する可能性がある。

本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明の理解をより容易にすることを意図しており、特にクレームされる場合を除き、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書のいかなる文言も、クレームされない要素を、本発明の実施に不可欠として示していると解釈されるべきではない。

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に示されない限り、または文脈上明らかに矛盾する場合を除き、任意の適切な順序で実施される。提供される方法のいずれに関しても、方法のステップは、同時に行われても、逐次的に行われてもよい。方法のステップが逐次的に行われる場合には、特に明記されない限り、それらのステップをどのような順序で行ってもよい。

方法がステップの組み合わせを含む場合、本明細書に特に明記されない限り、ステップのありとあらゆる組み合わせまたは部分的組み合わせは、本開示の範囲に包含される。

本明細書で引用される各刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、本開示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に開示される刊行物は、本発明の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなるものも、先行発明という理由でそのような刊行物に本発明が先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される発行日は実際の発行日とは異なることがあり、個別に確認する必要があるかもしれない。

本明細書に記載される例および態様は、例示のみを目的としていること、そして、それらに照らして様々な修飾または変更が当業者に提示されると考えられ、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることを理解されたい。

E. 実施例
実施例1
この実施例では、以後の実施例で使用する材料と方法について説明する。

マウスおよび細胞株
6週齢の雌C57BL/6マウスをHarlan社（Harlan, オランダ）から購入し、ローザンヌ大学（UNIL, Epalinges, スイス）の動物施設にてガイドラインに準拠して飼育した。C57BL/6 OT-1 CD45.1+およびC57BL/6 CD8a-/-マウスは、Hogquist KAら（Hogquist KA et al. Cell 76(1):17-27 PubMed: 8287475MGI: J:92867）およびFung-Leung WPら（Fung-Leung WP et al. Cell 65(3):443-9 PubMed: 1673361MGI: J:68956）に記載されている。全てのインビボ実験は、スイスのヴォー州のService of Consumer and Veterinary Affairs（SCAV）の承認に基づいて実施された。

オボアルブミンを発現するB16メラノーマ細胞株（B16-OVA）は、ATCCから購入したB16.F10細胞株のレトロウイルス形質導入により前もって作製し、10％ウシ胎児血清（FCS）、100U/mlペニシリンおよび100μg/ml硫酸ストレプトマイシンを補充したDMEMで単層として培養した。細胞を週に2回継代して、それらを指数関数的増殖条件下に維持し、マイコプラズマ汚染について定期的に検査した。不死化した正常なヒト胚性腎（HEK）細胞に由来するPhoenix Ecoレトロウイルス同種指向性パッケージング細胞株は、10％熱不活性化FBS、100U/mlペニシリン、および100μg/ml硫酸ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640-Glutamax培地で維持した。

ヒト胚性腎（HEK）293T細胞は、ATCC（CRL-3216）から購入し、RPMI 1640 Glutamax培地（Invitrogen社）、10％FBS（56℃で30分間熱不活性化；Gibco社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ThermoFisher Scientific社）中で培養した。レトロウイルスおよびレンチウイルス粒子を作製するために、HEK 293T細胞を使用した。HLA-A2.1^pos/NY-ESO^posメラノーマ細胞株Me275およびA375、ならびにHLA-A2.1^pos/NY-ESO^neg細胞株NA8（UNIL Department of Oncologyから入手）は、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したIMDM中で培養した。

バイシストロン性発現カセットの設計
MSCVロングターミナルリピート（LTR）を含むレトロウイルスベクターpMSGV1（マウス幹細胞ウイルス（MSCV）ベースのスプライスgagベクター）を、全ての構築物のバックボーンとして使用した。発現カセットは、典型的には、マウスIgGκ鎖領域V-III MOPC 321（例えば、Uniprot ID：P01650）（SEQ ID NO：20）のシグナルペプチドと、これに続くヒトIgG4_Fc（例えば、Uniprot ID：P01861.1、残基P104～K327）（SEQ ID NO：19)に融合されたマウスPD-1のN末端エクトドメイン（例えば、Uniprot ID：Q02242、残基S21～Q167、C83S）（SEQ ID NO：1)（ここでは、PD-1.IgG4デコイと呼ばれる）をコードしていた。制限部位AgeIおよびEcoRIが、それぞれ、この第1の部分の5'末端と3'末端に位置していた。第2の部分はT2A配列に続き、マウスIFN-βのシグナルペプチド（例えば、Uniprot ID：P01575.1）（SEQ ID NO：39）と、これに続く以下の分子の1つをコードする遺伝子ストリングで構成されていた：マウスIL-33（例えば、Uniprot ID：Q8BVZ5.1、残基S109～I266）（SEQ ID NO：27）、マウスLIGHT（例えば、Uniprot ID：Q9QYH9.1、残基D72～V239）（SEQ ID NO：31）、マウスCD40L（例えば、Uniprot ID：P27548、残基M112～L260）（SEQ ID NO：33）および無α変異型IL-2（no alpha mutant IL-2）（例えば、Uniprot ID：P60568.1、残基A21～T153、変異：R58A、F62A、Y65A、E82A、およびC145S）（SEQ ID NO：23)。制限部位MluIおよびSalIが、それぞれ、この第2の部分の5'末端と3'末端に位置していた。その結果、それぞれのクローニングの後に、以下の構築物が得られた：PD-1.IgG4_T2A_IL-2^V、PD-1.IgG4_T2A_IL-33、PD-1.IgG4_T2A_LIGHT、およびPD-1.IgG4_T2A_CD40L。全ての遺伝子ストリングを、GeneArt AG社でマウスコドンに最適化して合成し、全ての構築物を、MSGVベクターにクローニングした後、Microsynth AG社で完全に配列決定した。

図11A～Cに示すように、ピコルナウイルス由来の2A配列によって分離されたPD1デコイと切断型EGFR、ならびにCD40リガンドデコイ、およびIL-2バリアントをコードするコドン最適化遺伝子ストリングを、GeneArt（ThermoFisher Scientific社）から取り寄せ、NFATプロモーターの下での活性化ベースの遺伝子発現のために、レトロウイルスベクターpSFG（構成的発現用）またはpSFG-SIN（自己不活性型）中にクローニングした。ベクターをStellarコンピテントセル（大腸菌HST08、＃636763、Takara社）において増幅し、配列確認（Microsynth AG社）後にplasmid mini/maxi-prepキット（Genomed社）で精製した。

TCRα23とTCRβ13.1を含むHLA/A2:NY-ESO-1ペプチドT細胞受容体（TCR）をコードする遺伝子ストリングをGeneArt（ThermoFisher Scientific社）に発注した。TCRα鎖とTCRβ鎖はコドン最適化され、ピコルナウィルス由来の2A配列により分離された。この遺伝子ストリングをレンチウイルスベクターpRRLに組み込んだところ、3'ロングターミナルリピートのU3領域の大部分が欠失され、自己不活性型3'ロングターミナルリピート（SIN）をもたらした。

レンチウイルスの生産
10×10⁶個のHEK 293T細胞を、RPMI完全培地（RPMI 1640 Glutamax培地（Invitrogen社）、10％FBS（Gibco社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を入れたT150フラスコに播種した。約24時間後（70～80％コンフルエンシーで）、細胞に、107μlのTurbofectと2mlのOptimem培地（51985026、Invitrogen社）の混合物を用いて、7μgのpVSV-G（VSV糖タンパク質発現プラスミド）、18μgのμgR874（RevおよびGag/Pol発現プラスミド）、および15μgのpRRLトランスジーンプラスミドをトランスフェクトした。室温で30分インキュベートした後、DNA混合物を細胞の上に加え、容量を合計30mlに調整した。24時間後、培地をリフレッシュし、トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を回収した。ウイルス粒子を超遠心分離で濃縮して、400μlのRPMI完全培地に再懸濁した。エッペンドルフチューブあたり100～200μlのウイルスのアリコートを調製し、－80℃で保存した。

レトロウイルスの生産
Phoenix Eco細胞を25mlの培地にT-150組織培養フラスコあたり1×10⁷個で播種し、24時間後、Turbofect（Thermo Fisher Scientific社）を用いて14.4μgのpCL-Ecoレトロウイルスパッケージングベクターと21.4μgのpMSGVトランスファープラスミドでトランスフェクトした。全てのプラスミドは、JETSTAR 2.0 Plasmid Maxiprepキット（Genomed社）を用いて精製した。トランスフェクション混合物については、turbofect：プラスミドを3：1の比率で2mlのOptimem中に調製し、室温で30分インキュベートした。その後、80～90％コンフルエントのPhoenix Eco細胞を含むT-150フラスコから培地を取り除き、トランスフェクション混合物を添加して1分間インキュベートし、その後25mlの新鮮な培地を加えた。トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を回収し、続いて25mlの新鮮な培地を加えた。24時間後に2回目の回収を行った。両SN中のウイルス粒子をBeckman JS-24ローター（Beckman Coulter社）を用いて24,000g、4℃で2時間超遠心分離して濃縮し、0.5mlのマウスT細胞培地に懸濁した後、ウイルス力価を測定した。最後に、レトロウイルスを分注し、ドライアイスで凍結して、－80℃で保存した。

別の例では、10×10⁶個のHEK 293T細胞を、T150フラスコ内の17mlのRPMI、10％ウシ胎児血清（FBS、Gibco社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ThermoFisher Scientific社）に37℃で一晩播種した。翌日（293T細胞の85～95％コンフルエンシーで）、（T150フラスコにつき）トランスフェクションあたり120μlのturbofect（LifeTechnologies社）と3mlのOptiMemの混合物を調製し、その後レトロウイルスプラスミド、すなわち、22μgのPamPeg、7μgのRDF-RD114、18μgの関心対象の遺伝子をコードするSFGまたはSFG-SINと組み合わせた。培地を293T細胞から静かに取り出し、レトロウイルスプラスミド混合物を293T細胞にピペッティングした。5分間静止した後、追加の16mlの培地を静かに加えた。37℃で一晩インキュベートした。翌日、培地をリフレッシュし、翌々日（48時間で）、ろ過した上清から超遠心分離（24000xgで2時間）によりウイルスを回収した。72時間での2回目のウイルス回収のため、新鮮な培地を293T細胞に加えた。エッペンドルフチューブあたり100～200μlの両日のウイルスのアリコートを調製し、－80℃で保存した。

マウスT細胞の形質導入
初代マウスOT-1細胞は、マウスPan T cell Isolation Kit II（Miltenyi Biotec社,カタログ番号130-095-130）を用いて、6～10週齢のCD45.1+コンジェニックOT-1 C57BL/6マウス由来の解離脾臓のシングルセル懸濁液から単離し、10％熱不活性化FBS、100U/mlペニシリン、100μg/ml硫酸ストレプトマイシン、1mMピルビン酸、50μM BME、および10mM非必須アミノ酸を補充したRPMI 1640-Glutamax培地（T細胞培地）で培養した。

この培養物を0.5～1×106個の細胞/mlの細胞密度で維持し、15日目まで1日おきに新鮮なT細胞培地を補給した（培地には、3日目まで10IU/mlのヒト無α変異型IL-2のみを補充し、その後は10ng/mlのhIL-7/IL-15を一緒に補充した）。7日目に、分子の細胞発現を細胞内フローサイトメトリー解析により評価し、上清中のそれらの存在をELISAにより評価した。最後に、遺伝子改変されたOT-1 T細胞を、細胞移植の前にPD-1.IgG4デコイの形質導入効率に応じて調整した。組換えヒトIL-7およびヒトIL-15は、Miltenyi Biotec社から入手した。

単離したナイーブOT-1 T細胞を、24ウェルプレートに1×10⁶個/mlでT細胞培地に播き、αCD-3/αCD-28 Abコーティングビーズ（Invitrogen社）と10IU/mlのヒト無α変異型IL-2で刺激した。活性化の24時間後、T細胞に感染多重度（MOI）10でレトロウイルスを初めて導入した。この形質導入は、20mg/mlの組換えレトロネクチン（RetroNectin；Takara社）を4℃で一晩プレコーティングした非組織培養グレードの24ウェルプレート（Becton Dickinson社Labware）で行い、洗浄し、PBS中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）で室温にて30分間ブロックし、その後最終洗浄を行った。レトロウイルス（250μl）を加えた後、プレートを2000xg、32℃で1.5時間遠心分離した。125μlの上清を吸引し、1×10⁶個の活性化T細胞を各コーティングウェルに移した。プレートを1200rpmで10分間遠心分離し、37℃、5％CO₂で一晩インキュベートした。2回目の形質導入は、上記で説明したプロトコルに従って活性化してから48時間後に行った。7日目に、分子の細胞発現を細胞内フローサイトメトリー解析により評価し、上清中のそれらの存在をELISAにより評価した。最後に、遺伝子改変されたOT-1 T細胞を、細胞移植の前にPD-1.IgG4デコイの発現に基づいて調整した。

培養物を0.5～1×10⁶個/mlの細胞密度で維持し、CD44+CD62L+TCF1+セントラルメモリーCD8 T細胞を作製するように最適化されたインビトロ増殖プロトコルに従って、15日目まで1日おきに新鮮なT細胞培地を補給した。T細胞培地には、3日目までは10IU/mlのヒト無α変異型IL-2のみを補充し、その後は培養終了まで10ng/mlのhIL-7/IL-15を一緒に補充した。組換えヒトIL-7およびヒトIL-15は、Miltenyi Biotec社から入手した。

ヒトT細胞の精製と活性化
健康なドナーのアフェレーシスとバフィーコートは、大学治験審査委員会（University Institutional Review Board）の承認されたプロトコルの下に書面による同意を得て、Transfusion Interregionale CRS SA（Epalinges, スイス）から購入した。末梢血単核細胞（PBMC）を、Lymphoprep（StemCell Technologies社）密度勾配遠心により調製し、CD8またはCD4磁気マイクロビーズ（Miltenyi社）をメーカーのプロトコルに従って用いて、CD8⁺またはCD4⁺ T細胞をネガティブ分離した。分離されたCD8⁺およびCD4⁺ T細胞を、ヒトIL-2（GlaxoSmithKline社）の存在下に2：1のビーズ：T細胞比で抗CD3/CD28ビーズ（Invitrogen社）により刺激した。

ヒトT細胞のレンチウイルスおよびレトロウイルス形質導入
T細胞のレンチウイルス形質導入は、活性化の24時間後に、培地へのウイルス粒子の直接添加（MOI 20）により実施し、Lentiboost（Sirion Biotech社）の同時添加により増強した。T細胞のレトロウイルス形質導入は、活性化の48時間後に実施した。T細胞を、レトロウイルス粒子を2000xgで1.5時間スピノキュレートしたレトロネクチンコーティングプレートに移した。翌日、レトロネクチンコーティングプレートからT細胞を取り出した。抗CD3/抗CD28ビーズ（Thermo Fisher Scientific社）を活性化の5日後に除去し、それ以降はT細胞を、10％熱不活性化FBS（Gibco社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、10ng/mlヒトIL-7（Miltenyi社）、および10ng/ml IL-15（Miltenyi社）を補充したRPMI 1640-Glutamax（Thermo Fisher社）中に0.5～1×10⁶ T細胞/mlで維持した。

レンチウイルスとレトロウイルスによるヒトT細胞の同時形質導入
同時形質導入では、ヒトT細胞を精製し、18～22時間かけてビーズ活性化（48ウェルあたり：0.5×10⁶ T細胞＋1×10⁶ 抗CD3/抗CD28ビーズ＋50IU/ml IL-2）してから、濃縮レンチウイルス（100μl）を加え、任意で、形質導入効率を高めるために1μlのLentiboost（Sirion Biotech社）も加えた。翌日、形質導入されたT細胞を、レトロウイルス粒子を2000xgで1.5時間予めスピノキュレートしたレトロネクチンコーティングプレートに移した。次の日、T細胞を組織培養プレートに移した。5日目にビーズを取り除き、T細胞をより大きなウェルに移し、10ng/mlのIL-15と10ng/mlのIL-7を補充した新鮮な培地を供給した。新鮮な培地とサイトカインの供給は、2～3日おきに行った。7～10日目から、同時形質導入効率をフローサイトメトリーで測定することができる。

腫瘍浸潤リンパ球（TIL）のレトロウイルス形質導入
解凍したTILは、解離させた患者腫瘍片から前もって増殖させた。0.5×10⁶個のTILを48ウェルプレートで500μl RPMI、10％FBS＋25μl GMPグレードTransAct（1：20，Miltenyi Biotech社）および6000IU/ml IL-2により刺激した。非組織培養プレートにレトロネクチン（Takara Bio社，1mg/mlを50倍に希釈，48ウェルあたり250μl）を4℃で一晩コーティングした。翌日、レトロネクチンを除去し、500μl RPMI、10％FBS（Gibco社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを用いて37℃で30分間ブロックした。続いて、培地を取り除き、50～100μlの濃縮レトロウイルスを50μlの培地に加えて、2000g、25℃で1時間スピンした。その後、上清を除去し、TILを加えて、1000g、25℃で10分間スピンした。37℃で一晩インキュベートしてから、新鮮な培地を含む48ウェル組織培養プレートに移した。5日目に、TILをより大きなウェルプレートに移し、新鮮な培地（RPMI、10％FBS（Gibco社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、6000IU/ml IL-2）を補充した。形質導入効率を7～10日目に評価した。5日目以降は、2～3日おきに新鮮な培地を供給した。

フローサイトメトリー解析
全てのFACSデータは、LCRIIフローサイトメーター（BD社）で取得し、FlowJoソフトウェアを用いて解析した。fixable aqua dead色素L34965またはL34975（Invitrogen社）をメーカーの指示に従って使用し、死細胞の排除を行った。次の抗体をT細胞染色に使用した：抗Vb13.1：PE（IM2292，BD Bioscience社）、抗IFNγ：PeCy7（502527，Biolegend社）。テトラマー（A2/NY-ESO-1_157-165；自社生産）染色を用いて、TCR形質導入効率を評価した。

遺伝子導入T細胞による免疫調節因子の発現を評価するためのフローサイトメトリー解析
形質導入後1週間の遺伝子導入OT-1 T細胞を、50μlのLive/Dead Fixable aqua deadと共にPBS中、室温で30分間インキュベートし、洗浄後、50μlのFCRブロッキング試薬（クローン2.4G2，BD Pharmingen社）と共に4℃で30分間再度インキュベートした。細胞を再度洗浄し、CD3（145-2C11，Invitrogen社）、CD8α（53-6.7，BioLegend社）、およびCD45.1（A20，BioLegend社）に対する表面マーカー抗体と共に4℃でさらに30分間インキュベートした。細胞内染色には、次の抗体を使用した：PD-1.IgG4デコイを検出するための抗ヒトhIgG4-Fc（Abcam社，クローン：HP6025）および抗マウスIL-33（eBioscience社，クローン：396118）。表面染色後、遺伝子導入OT-1細胞を2回洗浄し、FoxP3転写因子染色バッファーセット（Invitrogen社）をメーカーの推奨に従って用いて、固定/透過処理を行った。各分子の検出のために、細胞をさらに洗浄し、それぞれの抗体と共に室温で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、2％BSAと0.01％アジドを補充したPBS（FACSバッファー）に再懸濁し、BDフローサイトメーターであるLSRIIサイトメーターで取得し、FlowJoソフトウェアv11（Tree Star社）を用いて解析した。

細胞内サイトカインまたはPD1-FcデコイもしくはCD40Lデコイの産生を評価するためのフローサイトメトリー解析
細胞内サイトカイン産生またはPD1デコイもしくはCD40Lデコイ産生をFACSで評価するために、丸底96ウェルプレートにおいてウェルあたり50,000個の生T細胞を、プレートコーティング抗CD3（5μg/ml）と可溶性抗CD28（2μg/ml）抗体の組み合わせ（または抗CD3/抗CD28ビーズ）により7時間活性化した。タンパク質の分泌を防ぐために、アッセイ開始の1.5時間後にGolgi stop（BD Biosciences社）を1：400の希釈率でウェルに添加した。標準的な固定/透過処理キット（BD Biosciences社）をメーカーの指示に従って用いてT細胞を固定および透過処理し、その後それらの形質導入効率または関心対象の分子を産生する能力について評価した。デコイの検出には、抗Fc抗体を使用した。関心対象のサイトカイン（IL-2、IFN-γ）の場合は、それらに特異的な抗体を使用した。

遺伝子導入T細胞による免疫調節因子の分泌を評価するためのELISA
活性化および形質導入の1週間後、106個の遺伝子導入OT-1 T細胞を1mlの無血清RPMI培地に72時間播種した。その後、SNを回収し、各分子について試験した。PD1.IgG4については、次のセットアップによる修正ELISAを使用した。プレートに抗マウスPD1 Ab（R＆D社，AF1021，2μg/ml）をコーティングし、そのプレートをSNと共にインキュベートし、PD1.IgG4を抗hIgG4-HRP Ab（Abcam社，ab99817，希釈1：1000）で検出した。

IL-2^Vについては、次のセットアップによる修正ELISAを使用した。プレートに抗ヒトIL-2 Ab（R＆D社，AF-202-NA，3μg/ml）をコーティングし、そのプレートを上清とインキュベートし、IL-2^Vをビオチン化ポリクローナル抗ヒトIL-2 Ab（Invitrogen社，13-7028-81，希釈1：500）、続いてストレプトアビジン-HRP（BioLegend社，希釈1：1000）で検出した。融合分子TIM-3.IgG4またはIL-2^Vのいずれかを発現するように形質導入されたOT-1 T細胞からのSNを陰性対照として使用した。LIGHT、IL-33、およびCD40Lの検出には、3種類の市販のELISAキットを使用した：R＆D社が開発したマウスLIGHT/TNFSF14 DuoSet ELISA（DY1794-05）、BioLegend社が開発したLEGEND MAXTMマウスIL-33 ELISAキット（436407）、Novus Biological社が開発したマウスCD40Ligand/TNFSF5 ELISAキット（NBP1-92662）。

腫瘍担持マウスにおける養子細胞移入
B16-OVA腫瘍細胞を0.05％トリプシンで採取し、洗浄し、注射用のPBS中に再懸濁した。1×10⁵個の腫瘍細胞を7週齢のC57BL/6マウスの右脇腹に皮下注射した。11日目（平均腫瘍体積100～200mm³）に、実験アーム間で同等の平均腫瘍体積をもつようにマウスを再グループ化した（n≧5匹/群）。12日目と15日目に、5×10⁶個の遺伝子導入CD44+ CD62L+ TCF1+ OT-1 T細胞または対照の非導入OT-1のi.v移入によりマウスを治療した。マウスを週に3回モニタリングし、独立した研究者が盲検下に腫瘍の長さ（L；最大縦方向の測定）と幅（W；最大横方向の測定）をキャリパーで測定した。腫瘍体積（V）は、次式：V＝(L×W²)/2を用いて算出した。平均腫瘍体積/群を±SDでプロットした。腫瘍が1000mm³に達した時点で、または規則に従って、マウスが苦痛を感じたり瀕死状態になった場合には、マウスを犠牲にした。

遺伝子導入T細胞による免疫調節因子の分泌を評価するためのELISA
形質導入後1週間の1×10⁶個の遺伝子導入OT-1 T細胞を、24ウェルプレートで1mlの無血清RPMI培地に72時間播種した。その後、SNを回収し、各分子についてELISAで試験した。PD1.IgG4 homemade-ELISA：コーティングAb：抗マウスPD-1（R＆D社，AF1021，2μg/ml）、検出Ab：抗hIgG4-HRP（Abcam社，ab99817，希釈1：1000）。IL-2^V home-made ELISA：コーティングAb：抗ヒトIL-2（R＆D社，AF-202-NA，3μg/ml）、二次Abビオチン化ポリクローナル抗ヒトIL-2（Invitrogen社，13-7028-81，希釈1：500）、ストレプトアビジン-HRP（BioLegend社，希釈1：1000）。融合分子TIM-3.IgG4またはIL-2^Vのいずれかを発現するように形質導入されたOT-1 T細胞からのSNを陰性対照として使用した。IL-33の検出には、BioLegend社が開発した市販のLEGEND MAXTMマウスIL-33 ELISAキット（436407）を使用した。

クロム放出アッセイで測定されるADCC
自己PBMCを解凍し、1×10⁶個/mlの濃度にして、6ウェルプレートにウェルあたり3mlで10ng/ml GM-CSFの存在下に添加した。翌日、0.5×10⁶個のEGFR⁺ T細胞に50μCiのクロム-51をロードし、再懸濁して、37℃の水浴に約1時間入れた。その後、T細胞を2回洗浄し、400,000細胞/mlの濃度で懸濁し、ウェルあたり50μl（＝2,000個）のT細胞を移した。セツキシマブ（抗EGFR抗体）を300μg/mlまたは30μg/mlで調製した。50μlのセツキシマブをT細胞に添加し、37℃で30分間インキュベートした。PBMC（エフェクター細胞）をRPMI、10％FBS（Gibco社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン中に1.2×10⁶細胞/mlで回収した。エフェクターPBMCの1/3希釈液（1.2×10⁶、0.4×10⁶、1.33×10⁶、および0.42×10⁶ PBMC/ml）を調製し、50μlをtEGFR⁺ T細胞と抗EGFR抗体を含むウェルに添加した。エフェクター：標的細胞の異なる比率（30：1、10：1、3：1、1：1、3つ組で）を設定した。陽性対照として、1×TritonXをT細胞に添加した（＝最大クロム放出）。全ての陰性対照（培地のみ、PBMCなしのT細胞、T細胞＋PBMCだが抗体なし、など）を設定した。プレートを1500rpmでスピンし、37℃で4～5時間置いた。50μlの上清をlumaplateウェルに移し、一晩乾燥させた。翌日、クロムレベルをtopCounterで評価した。

サイトカイン産生を測定するための共培養アッセイとELISA
PD1デコイと切断型EGFRを発現するように共遺伝子改変されたTCR-T細胞（および全ての対照T細胞条件）を1×10⁶ TCR⁺ T細胞/mlの濃度で調製し、また、腫瘍細胞を1×10⁶細胞/mlで調製した。それぞれ100μlずつのT細胞と腫瘍細胞を96ウェル丸底プレートで混ぜ合わせた。このプレートを1500rpmで1分間スピンし、37℃で48～72時間インキュベートした。上清中のIFN-γレベルをELISA（Invitrogen社）により、メーカーの推奨に従って評価する。

PD1およびCD40Lデコイの分泌を評価するための共培養アッセイとELISA
1×10⁶個の初代UTDと同時形質導入T細胞（NY TCRを発現しかつPD1デコイとtEGFRを分泌するように改変された）を、96ウェル丸底プレートでウェルあたり1×10⁶個の標的細胞と一緒に、2つ組で、最終容量200μLの完全RPMI培地にて共培養した。このプレートを1500rpmで1分間スピンし、37℃でインキュベートした。24時間後、共培養物の上清を回収し、プレートに結合した抗PD1抗体またはプレートに結合したヒトPD-L1タンパク質で捕捉することにより、PD1-Fc融合デコイ分子の存在を試験した。結合したPD1-Fcデコイ分子を抗IgG-Fc Abで検出した。上清に分泌されたCD40Lデコイを評価するために、市販のELISAキット（Invitrogen社）を使用することを除いて、同じ条件を使用した。

免疫サブセット枯渇、チェックポイント遮断およびFTY720治療
250μg/doseの枯渇抗体（depleting antibody）を、治療の1日前に開始して3日おきにi.p.投与することにより、特定の細胞サブセットを枯渇させた；すなわち、CD4 T細胞をα-マウスCD4（クローンGK1.5，BioXCell社）で、NK細胞をα-マウスNK1.1（クローンPK136，BioXCell社）で、好中球をα-マウスLy6G（クローン1A8，BioXCell社）で枯渇させた。チェックポイント遮断には、マウスに250μg/doseのα-マウスPD-L1（BioXcell社，10F.962）とα-マウスTIM-3（BioXcell社，RMT3-23）を3日おきにi.p.注射した。二次リンパ器官からのリンパ球の漏出をブロックするために、SIGMA社から入手したFTY720のストック溶液（DMSO中10mg/ml）を調製し、投与前に水で1mg/mlに希釈した。最後に、100μgの薬物を治療の2日前に開始して3日おきにi.p.投与した。免疫細胞の枯渇および封鎖（sequestration）（FTY720）の両方が、PBMCのフローサイトメトリーによって確認された。

腫瘍のシングルセル懸濁液の調製、フローサイトメトリー用抗体、およびサイトカイン産生のためのエクスビボ再刺激
最初の養子細胞移入の5日後と12日後に腫瘍を切除し、市販のマウス用腫瘍解離キット（Miltenyi Biotec社，130-096-730）を用いて、機械的解離と細胞外マトリックスの酵素分解を組み合わせることにより、シングルセル懸濁液へと解離させた。シングルセル懸濁液に続いて、2.5×10⁶個の生細胞を96ウェルプレートに播種し、50μlのLive/Dead Fixable aqua deadと共にPBS中室温で30分間インキュベートし、その後50μlの精製抗CD16/CD32 mAb（クローン2.4G2，BD Pharmingen社）と共に4℃で30分間インキュベートすることにより、Fc受容体をブロックした。次に、細胞を、50μlのFACSバッファー中で関心対象の蛍光色素結合mAbにより4℃で30分間染色した。続いて、細胞を2回洗浄し、FoxP3転写因子染色バッファーセット（Invitrogen社）を用いて固定/透過処理を行い、細胞内染色を行った。染色された細胞の解析は、LSRIIサイトメーターとFlowJoソフトウェアを用いて実施した。

以下の抗体を使用した：CD45.1（クローンA20, BioLegend社）、CD3（クローン145-2C11, Invitrogen社）、CD4（クローンGK1.5, BioLegend社)、CD8（クローン53.6.7, BioLegend社)、FOXP3（クローンFJK-16S, Invitrogen社)、NK1.1（クローンPK136, BioLegend社)、CD44（クローンIM7, BioLegend社)、PD-1（クローン29F.1A12, BioLegend社）、LY6C（クローンHK1.4, BioLegend社）、グランザイムC（クローンSFC1D8, BioLegend社）、TCF1（クローンC63D9, Cell Signaling Technology社）、抗ウサギIgG (H+L)、F(ab')₂フラグメントAF488またはPEコンジュゲート（Cell Signaling Technology社）、グランザイムB（クローンGB11, Novul Biological社）、CD69（クローンH1.2F3, BioLegend社）、TIM-3（クローンRMT3-23, BioLegend社）、CD137/4-1BB（クローン17B5, Invitrogen社）、KLRG1（クローン2F1/KLRG1, BioLegend社）、KI67（クローン16A8, BioLegend社）、IFNg（クローンXM61.L, Invitrogen社）、TNFa（クローンMP6-XT22, BioLegend社）、TOX（クローンTXRX10, Invitrogen社）、CD45（クローン30-F11, BioLegend社）。

蛍光マイナスワン（Fluorescence minus one：FMO）対照を、1つの抗体を順次省く抗体パネルを用いて並行して染色した。FMO染色を次の抗体の対照として行った：TCF1、Ki67、4-1BB、グランザイムB、TNFa、IFNg、PD-1、およびTIM-3。グランザイムC染色にはアイソタイプ対照を用いた（クローンHTK888, BioLegend社）。Precision Count Beads（商標）（BioLegend社）を使用して、フローサイトメーターでの取り込み中に細胞の絶対数を得た。

サイトカイン産生の検出のために、腫瘍シングルセル懸濁液（2.5×10⁶個の生細胞）を、24ウェルプレートで、Brefeldin A（5μg/ml）の存在下、1μg/mlのウェルコーティング抗マウスCD3（クローン17A2, Invitrogen社）および2μg/mlの可溶性抗マウスCD28（クローン37.51, Invitrogen社）を用いて4時間、インビトロで再刺激した。上記のように、固定と透過処理の前に細胞の表面染色を行い、その後、細胞内染色を行った。

免疫蛍光標識と顕微鏡検査
免疫組織化学的分析のために、腫瘍組織を単離し、PBS中1％PFAで一晩固定し、翌日30％スクロースを浸潤（一晩）させて、OCTコンパウンドに包埋し凍結させた。クリオスタット切片をSuperfrost Plusスライド（Fisher Scientific社）上に集め、風乾して、BSA、正常マウス血清、正常ロバ血清（Sigma社）、および0.1％トリトンを含むブロッキング溶液を用いてプレインキュベートした。その後、それらを、0.1％トリトン含有PBSで希釈した一次抗体を用いて4℃で一晩標識した。0.1％トリトン含有PBSで洗浄した後、二次試薬を0.1％トリトン含有PBSで希釈し、室温で45分間適用した。最後に、PBSと0.1％トリトンでさらに洗浄した後、DAPI（Sigma社）を用いて核を染色し、続いてPBSで洗浄して、DABCO（自社製）にマウントした。画像は、Zeiss AxioImager Z1顕微鏡とAxioCam MRC5カメラで取得した。Fiji（NIH）またはAdobe Photoshopを用いて画像を処理した。露出と画像加工をマウス群に対して同一にして、それらを直接比較した。

CD8/CD45.1/CD105標識に使用した抗体（ab）： 1°ab：ラット-a-マウスCD8a（クローン53-6.7）、ウサギ-a-マウスCD105（クローンMJ7/18）、マウス-a-マウスCD45.1ビオチン（クローンA20.1）。2°試薬：ロバ-a-ラットAlexa 488（Invitrogen社, ＃A21208）、ロバ-a-ウサギCy3（Jackson ImmunoResearch社 ＃711-165-152）、ストレプトアビジンAPC（Biolegend社, ＃405207）。

CD8-CD45.1-TCF1標識に使用した抗体（ab）： 1°ab：ラット-a-マウスCD8a（53-6.7）、ウサギ-a-マウスTCF-1（Cellsignalling社, クローンC63D9, ＃2203）、マウス-a-マウスCD45.1ビオチン（クローンA20.1）。2°ab：ロバ-a-ラットAlexa 488（Invitrogen社, ＃A21208)、ロバ-a-ウサギCy3（Jackson ImmunoResearch社, ＃711-165-152）、ストレプトアビジンAPC（Biolegend社, ＃405207）。

シングルセルRNAシーケンス解析
高品質のCD8 TILトランスクリプトームを選択するために、CellRangerにより作成された集計UMIカウントマトリックスをフィルタリングした。まず、検出された遺伝子500～5000、UMIカウント数2000～30000、ミトコンドリア含量5％未満、リボソームタンパク質含量50％未満の細胞を保持した。次に、CD8 T細胞を、Cd2、Cd8aおよびCD8b1を発現する（≧1 UMI）がCd4を発現しない（0 UMI）ものとしてフィルタリングした。Cd14、Csf1r、Cd19、Spi1、Foxp3、H2-Aa、およびH2-Ab1を発現する細胞をさらに除去し、1788個の高品質CD8 TILトランスクリプトームを取得した。

次元削減（dimensionality reduction）のために、まず、Seurat 3.1.1 vst法をデフォルトパラメータで用いて、高変動遺伝子（highly variable gene：HVG）を同定した（Stuart et al., Cell, vol. 177, issue 7, p1888-1902.e21, June 13, 2019）。次に、ミトコンドリア、リボソームタンパク質コード遺伝子および細胞周期遺伝子（Gene Ontology term GO：0007049を有するもの）をHVGのセットから削除し、残りのHVG（1649）は平均＝0、分散＝1を有するようにスケーリングした。標準化されたHVGは、PCAを用いた次元削減の第1のステップと、最初の10主成分（デフォルトによる他のパラメータを使用）に対してUMAP（Seurat v3.1.1に実装）を用いた第2のセットに使用した。クラスタリングはSeuratの共有最近傍法（shared nearest neighbor method）を用いて実行し、パラメータはデフォルトのパラメータを有するFindNeighborsと、解像度＝0.2のFindClustersを使用した。CD8 TIL状態の教師付き分類（supervised classification）には、TILPRED（https://github.com/carmonalab/TILPRED; Santiago J. Carmona, et al., OncoImmunology, 9:1(2020)）をデフォルトパラメータで使用した。クラスター間の差次的発現遺伝子（differentially expressed genes）は、FindAllMarkersとMAST v1.10（Finak, G., et al. Genome Biol 16, 278 (2015)）を用いて、min.pct＝0.25およびlogfc.threshold＝0.25のパラメータで同定した。Gzmcクラスターと従来の疲弊（exhausted）クラスターを比較するために、「resolution」パラメータを0.3に上げることにより、元の「疲弊」クラスターをサブクラスター化した。リファインされた疲弊クラスターとGzmcクラスター間の差次的発現解析は、FindAllMarkersとMAST v1.10を用いて、min.pct＝0.1およびlogfc.threshold＝0.25のパラメータで評価した。TOX-KOシグネチャに対するこれらのクラスターの遺伝子セット濃縮解析（gene set enrichment analysis）（Scott, A.C., et al. Nature 571, 270-274 (2019)）は、clusterProfilerパッケージv3.12（Guangchuang Yu, et al., OMICS: A Journal of Integrative Biology. May 2012.284-287）からのGSEA関数をデフォルトパラメータで使用し、倍率変化の小さい順に並べられたp値＜0.01の上位200の差次的発現クラスター遺伝子を用いて計算した。

統計解析
データの正規分布は、シャピロ・ウィルク（Shapiro-Will）の正規性検定を用いて評価した。2群を比較するために両側スチューデントのt検定（正規分布で等分散性がある場合）、またはウェルチ（Welch）の補正を加えたt検定（正規分布だが等分散性がない場合）を使用し、データが正規分布していない場合は、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用した。3群以上を比較する場合にも、同様の戦略に従った。正規分布がない場合は、クラスカル・ウォリス（Kruskal Wallis）検定を使用した。正規分布で等分散性がある場合は一元配置ANOVAを使用し、正規分布だが等分散性がない場合はブラウン・フォーサイス（Brown-Forsythe）とウェルチのANOVA検定を使用した。多重比較の補正は、ダン検定（クラスカル・ウォリス検定の場合）、ダネット（Dunnet）検定（一元配置ANOVA検定の場合）、およびテューキー（Tukey）検定（ブラウン・フォーサイス検定の場合）を用いて行った。生存解析はログランクのマンテル・コックスモデルを用いて行った。TCF1+ OT-1腫瘍内CD8 T細胞の数と腫瘍浸潤OT-1の総数との相関を計算するために、ピアソン（Pearson）相関検定を使用した。これらの全ての統計解析はGraphPad Prism 8.0を用いて行った；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p<0.0001

腫瘍制御の統計解析は、腫瘍接種後17日目に対する腫瘍体積の変化（％）を用いて実施した。1回目のACTの少なくとも12日後に各動物で観察された最良の応答（最小の腫瘍体積）を計算に使用した。治療群別の客観的奏効率および臨床的有用率は、1群あたりのマウスの総数に対して算出し、（1）客観的奏効には、完全奏効（CR；腫瘍体積の100％減少）および部分奏効（PR；≦－30％の腫瘍変化）を、（2）臨床的有用性には、CR、PRおよび病勢安定（－30％＜腫瘍変化≦＋20％）を含めるものとした。

変数「客観的奏効」と「臨床的有用性」の予測確率は、精確ロジスティック回帰を用いて計算した。連続変数としての腫瘍変化の値は、線形回帰を用いてさらに解析した。0.05未満のp値を統計的に有意であるとみなした。

実施例2
PD1デコイ分子を、IL-2^V、LIGHT、またはインターロイキン33（IL-33）の配列を含むレトロウイルス構築物にクローン化した；各構築物は、コドン最適化されて、自己切断ペプチドT2Aによって分離された2つの分子のみをコードしていた。そのため、少なくとも4つの異なる構築物が利用可能であった：i）PD1.IgG4_T2A_IL-2^V，PD1デコイとIL-2^Vの両方を発現する；ii）PD1.IgG4_T2A_LIGHT，PD1デコイとLIGHTを発現する；iii）PD1.IgG4_T2A_IL-33，PD1デコイとIL-33を発現する；およびiv）PD1.IgG4_T2A_CD40L，PD1デコイとCD40Lを発現する。

図1は、設計された構築物を用いたOT-1 T細胞のトランスフェクションおよび形質導入の効率を示す。試験した各組成物において、細胞は、高い形質導入効率を示し、かつ発現され分泌されたタンパク質のそれぞれについて高い分泌レベルを示した。

特異的ELISAを用いて、遺伝子改変OT-1 T細胞が免疫調節因子PD1.IgG4_T2A_IL-2^V、PD1.IgG4_T2A_LIGHT、PD1.IgG4_T2A_IL-33、およびPD1.IgG4_T2A_CD40Lのそれぞれの特定の組み合わせを分泌できることも確認された。

これらの結果は、T細胞が2つの異なる外因性分泌タンパク質を発現するように成功裏に遺伝子改変され得ることを示している。これらの細胞は、それぞれの外因性分泌タンパク質を大量に発現して分泌し続けることで、進化した特性を示す。

実施例3
図2Aおよび図2Bに示すように、PD1.IgG4、LIGHT、およびIL-2^Vを分泌するOT-1 T細胞によるACTは、定着した大きなB16-OVA腫瘍の制御を有意に改善した。この組み合わせ戦略は、ACT後に腫瘍退縮を誘導し、非形質導入OT-1 T細胞に対する応答と比較して、全生存期間を改善した。図2Cおよび図2Dに示すように、PD1.IgG4、LIGHT、およびIL-33を分泌するOT-1 T細胞によるACTもまた、定着した大きなB16-OVA腫瘍の制御を有意に改善した。この組み合わせ戦略は、PD1.IgG4とLIGHTの組み合わせ戦略よりも優れた抗腫瘍活性を示した。PD1.IgG4とLIGHTとIL-33の組み合わせ戦略は、非形質導入OT-1 T細胞に対する応答と比較して、全生存期間を改善した。

PD1.IgG4、IL-2^V、およびIL-33を分泌するOT-1 T細胞の養子移入は、非形質導入OT-1 T細胞の投与と比較して、全生存期間をほぼ2倍にし、他の組み合わせ戦略と比較すると、全生存期間が10日以上延長された（図2F）。図2Gおよび図2Hに示すように、PD1.IgG4、IL-2^V、およびCD40Lを分泌するOT-1 T細胞によるACTは、定着した大きなB16-OVA腫瘍の制御を有意に改善した。この組み合わせ戦略は、ACT後に腫瘍退縮を誘導し、非形質導入OT-1 T細胞に対する応答と比較して、全生存期間を改善した。

まとめると、T細胞は、進行した腫瘍を制御するために、免疫調節因子の組み合わせを分泌するように遺伝子改変することができる。上記の例はまた、免疫調節因子の高次組み合わせを得るために、同じ抗原特異性を有するが異なる分泌特性を有するT細胞の集団を混合することの治療上の実現可能性を強調している。このアプローチの重要な利点は、それらの分子が主に腫瘍微小環境において分泌される（つまり、全身的に投与されなかった）ため、安全性が高まることである。

実施例4
養子免疫療法は、T細胞および腫瘍微小環境を再プログラム化する機会を提供する。この例で実証されるように、IL-2Rβγ結合性IL-2バリアント、PD1デコイ、およびIL-33を含む養子移入T細胞の直交的エンジニアリングは、移入されたCD8⁺ 細胞と内因性CD8⁺ 細胞の両方の再プログラミングを通じて、免疫能がある宿主における細胞自律的なT細胞の増殖、生着、および腫瘍制御をもたらした。腫瘍浸潤リンパ球（TIL）は、正規（canonical）のTOX駆動型疲弊（TOX-driven exhaustion）とは異なる、TOX抑制、グランザイムCの豊富さ、ならびにエフェクター分子、生存および細胞前駆体マーカーにより特徴付けられる新規エフェクター状態を取り入れた。IL-2バリアントとIL-33との相互作用によって動的に駆動されると、この状態のTILは、存続（persistence）をTOX駆動型疲弊から切り離し、腫瘍を制御することに成功した。したがって、宿主のリンパ球枯渇（lymphodepletion）を伴わない合理的なT細胞エンジニアリングは、養子移入されたT細胞の最適な再プログラミングを可能にするだけでなく、内因性免疫を腫瘍制御に適合する新しい状態へ動員することを可能にする。

T細胞は、固有の特性を備えていて、リンパ球枯渇の非存在下で必要な増殖状態に自律的に到達し、また、適度に免疫原性の腫瘍への生着と腫瘍拒絶に対応する望ましい機能的状態に達することができる、と仮定された。本開示では、T細胞を直交的組み合わせエンジニアリングで改変すること、すなわち、遺伝子を導入し、その産物が好ましいパータベーション（perturbation）（T細胞を再プログラム化し、さらにT細胞がTMEにおける適応免疫と自然免疫を再プログラム化することを可能にする）を生じさることを目指した。PD-1/PD-L1阻害経路が、分泌型PD-1デコイ（PD1d）、すなわちヒトIgG4のFc領域に結合されたマウスPD-1のエクトドメインを含む融合分子、により標的化された。T細胞の増殖をサポートするために、高親和性IL-2Rα鎖（CD25）とかみ合わないヒトIL-2バリアント（IL-2^V）を使用した（T. Carmenate et al., Journal of immunology 190, 6230-6238 (2013); G. Rojas et al., Scientific Reports 9, 800 (2019)）。野生型IL-2と比較して、この分子の重要な利点は、毒性が低く、制御性T細胞（Treg）による封鎖が少ないことである。また、ターミナルエフェクター分化を促進する野生型IL-2とは異なり、IL-2^VはACTの好ましい特徴であるCD8⁺ T細胞の幹細胞性（stemness）を促進する、と仮定された（J. G. Crompton, et al. Immunol Rev 257, 264-276 (2014)）。最後に、腫瘍に有利な炎症シグナルを生成させるために、IL-33が使用された。2つのレトロウイルスベクターを構築した；1つは可溶性PD1dとIL-2^V（PD1d/2^Vモジュール）をコードし、もう1つは可溶性PD1dとマウスIL-33（PD1d/33モジュール）をコードするものである。CD8⁺ T細胞に、一方または他方のモジュールを保有するレトロウイルスを別々に導入し、それらを1：1の比率でプールして、トリプル組み合わせ（PD1d/2^V/33）を備えたACTカクテルを作成した。また、免疫能のあるレシピエントマウスの進行したB16-OVAメラノーマ腫瘍を治療するために、OT1 T細胞が使用された。以下に示すように、この例では、これらの介入がどのようなCD8⁺ T細胞の状態につながる可能性があるのか、また、リンパ球枯渇の前処理または外因性サイトカインのサポートがない場合に、T細胞生着と腫瘍退縮を達成するために望ましいCD8⁺ T細胞の状態とはどのようなものであるのか、を検討する。

直交的T細胞エンジニアリングは細胞自律的な方法でACTの有効性を向上させる
最初のエンジニアリングモジュールとして、まずPD-1デコイの抗腫瘍能力を評価した。この分子は、遺伝子改変OT1細胞によって十分に発現および分泌され、プレートに固定化されたPD-L1にインビトロで結合した（これは、PD-L1中和抗体の飽和によって競合排除された）。PD1d導入OT1細胞を用いたACTは、リンパ球枯渇（放射線照射）マウスにおいて、インビボで有意な抗腫瘍活性を示した。次に、OT1細胞にPD1d/2^VモジュールまたはPD1d/33モジュールを効率的に導入し、それぞれPD1dとIL-2^V、またはPD1dとIL-33を同時に分泌させることができるかどうかを試験した。PD1dの発現を評価すると、75％を超える形質導入効率が得られ、また、ELISAによる全ての分子の同時分泌が確認された。

次に、直交的エンジニアリングACTを、リンパ球枯渇のプレコンディショニングを行わないで実施した（図3A）。リンパ球枯渇または外因性サイトカインの非存在下で、触知可能（100m³）腫瘍を持つマウスに投与された、約70％のT_CMと約30％のT_EM（エフェクターメモリー）表現型を有する5×10⁶個の非形質導入OT1細胞の2回の注入は、腫瘍成長を制御することができなかった（図3B）。PD1dまたはIL-2^Vのいずれかを導入した同じ用量のOT1細胞は、腫瘍成長にわずかな（しかし有意でない）効果を及ぼし（図3B；表2および表3）、ダブル遺伝子改変されたPD1d/2^V-OT1細胞は、同じ条件下でより有効であることが証明されなかった。抗(α)PD-L1抗体と非形質導入OT1細胞との全身投与は、PD1d-OT1細胞と同等の結果をもたらした。同様に、IL-33導入OT1細胞は最小限の効果しかなく、PD1d/33-OT1細胞も同じようであった。驚くべきことに、PD1d/2^V/33-OT1細胞（すなわち、1：1混合したPD1d/2^V細胞とPD1d/33細胞）による治療は、他のどの治療と比較しても統計的に有意に優れていた（図3B；表2および表3）。この治療アプローチの客観的奏効率（ORR）は85.7％で、予測された発生確率は83.3％であった（表2および3）が、他の全ての場合は0～9％であった。最後に、リンパ球枯渇と外因性サイトカインのサポートがない場合のPD1d/2^V/33-OT1細胞の有効性を確認し、マウスの早期治療（6日目に開始）により、完全な腫瘍の根絶と治癒がもたらされた。

免疫能がある宿主における直交的エンジニアリングは、養子移入されたCD8⁺ 細胞の細胞自律的な増殖と、内因性抗腫瘍免疫の寄与的関与をもたらす
次に、ダブル遺伝子改変PD1d/2^VまたはPD1d/33の抗腫瘍効果をトリプル遺伝子改変PD1d/2^V/33 OT1細胞と比較した（図3A）。ベースライン（12日目）で、治療未経験B16-OVA腫瘍は、CD44⁺ 抗原経験細胞の表現型を示すCD8⁺ T細胞の適度な自発的浸潤を示した。養子移入されたCD8⁺ T細胞は4日以内に腫瘍に蓄積し始め、ACT後5日目（17日目）には、トリプル遺伝子改変細胞で治療したマウスの腫瘍は、すでに有意に高いレベルのCD8⁺ T細胞の生着を示した。1週間後（24日目）、PD1d/2^V/33-OT1細胞で治療したマウスの腫瘍では、ダブル遺伝子改変細胞で治療したマウスに比べてCD8⁺ TILが有意に多く、同様に、そのダブル遺伝子改変細胞は非形質導入OT1細胞を投与したマウスに比べてCD8⁺ TILが有意に多いことが判明した（図3C）。OT1（CD45.1⁺）TILに着目すると、ACT後2週間の腫瘍ではPD1d/2^V/33-OT1細胞の顕著な増殖が観察され（図3D）、一方PD1d/2^V-OT1細胞とPD1d/33-OT1細胞はそれぞれ中程度または最小レベルの生着を示した。このように、トリプル遺伝子改変組み合わせACTの有効性は、養子移入されたT細胞の腫瘍内でのユニークな増殖および腫瘍退縮と関連していた。

完全に免疫能のある宿主においてACTが行われたことを考慮して、内因性の免疫エフェクター細胞がその効果に寄与したかどうかを検討した。驚くべきことに、ACT後2週間で見られた総CD8⁺ TILの約50％以上が内因性（CD45.1^neg CD45.2⁺）であった（図3E）。PD1d/2^V-OT1またはPD1d/33-OT1細胞で治療した腫瘍内に内因性TILの若干の増殖が観察されたけれども、これらはトリプル遺伝子改変細胞で治療した腫瘍において特に顕著であった。

CD8⁺ T細胞コンパートメント内にTCF1転写因子を発現する幹様細胞のプールが存在することは、PD-1遮断時に腫瘍（および慢性ウイルス感染症）に対する免疫を動員する能力と以前に関連付けられていたが、そのような前駆細胞をACTに使用することは、有効性を向上させる可能性がある。しかし、TMEの条件はTCF1⁺CD8⁺ TILの存在または存続を促進しない。注目すべきは、TCF1⁺OT1⁺ TILの顕著な増殖が、トリプル遺伝子改変PD1d/2^V/33またはダブル遺伝子改変PD1d/2^V OT1細胞の移入後に特に観察され（図3Fおよび図3G）、IL-2^Vを共有するこれら2つのアプローチのみが幹様コンパートメントを拡大することが示された。重要なことは、幹様TCF1⁺CD8⁺の拡大が内因性TILにも及んだことである（図3Fおよび図3G）。これらの腫瘍では、PD1d/2^V/33-ACT後に、OT1の10～20％および内因性CD8⁺ TILの30～50％がTCF1を発現し、TCF1⁺ OT1細胞の存在とOT1 TILの総数の間に強い直接的な相関が観察された。したがって、IL-2^Vを含む遺伝子改変アプローチでは、幹細胞性を促進し、その結果、移入されたT細胞ならびに内因性T細胞の存続を促進する条件が達成された。

重要なこととして、遺伝子導入OT1細胞による効果的な腫瘍制御は、TCF1⁺ CD8⁺ TILの存在の増加だけでなく、多数のTCF1^negエフェクター様CD8⁺ TIL（PD1d/2^V/33-ACT後にのみ満たされる条件）とも関連していた（図3G）。実際、これらの腫瘍では、OT1 TILの80～90％および内因性CD8⁺ TILの50～70％がTCF1^negであった。重要なことに、高頻度のTCF1⁺ CD8⁺ TILはPD1d/2^V-ACT後にも見られたが、これらの腫瘍ではTCF1^neg CD8⁺ TILがはるかに少なく、IL-2^VがTCF1⁺ CD8⁺ TILの増殖を促したことを示している；しかし、IL-33の共発現がない場合、これらの細胞はTCF1^neg状態に移行する可能性が低く、Tcf1抑制がエフェクターの分化に関連していることが確認された。対照的に、PD1d/33-ACTは、低いTCF1⁺CD8⁺および高いTCF1^negCD8⁺ TIL頻度、および全体的に不十分なTIL増殖と関連していた（図3Fおよび図3G）。

ACT後の腫瘍制御における内因性T細胞の寄与を理解するために、CD8ノックアウト腫瘍担持マウスを同じ条件下でPD1d/2^V/33-OT1細胞により治療した。内因性CD8⁺ T細胞の非存在下では、ACTの抗腫瘍効果が失われることが観察された（図3H）。したがって、内因性CD8⁺ T細胞の関与は、効果的な腫瘍制御にとって非常に重要であった。驚くべきことに、腫瘍制御は、FTY720（リンパ節からのリンパ球の流出を損なう薬物）の共投与によって証明されるように、リンパ節からの内因性T細胞の動員に依存していなかった（図3H）。このように、トリプル遺伝子改変ACTによる腫瘍制御には、全身性CD8⁺ T細胞の腫瘍への動員ではなく、既存の内因性TILのインサイチュの拡大増殖が利用され、必要であった。

次に、ACTと腫瘍Tregとの相互作用について評価した。移入された細胞によるIL-2^Vの分泌は、TregよりもCD8⁺を優先的に増殖させ、CD8⁺ 細胞の最大増殖と一致して、CD8/Treg比はPD1d/2^V/33-ACT後に最も高かった（図3I）。総CD4⁺ TILはCD8⁺ TILよりも全体的に増殖せず、PD1d/2^V/33-ACT前のCD4⁺ T細胞の抗体媒介性枯渇は、腫瘍制御とマウス生存を損なわず、むしろ有意に改善した（図3J）。

最後に、トリプル遺伝子改変ACTが自然免疫を動員するかどうかを検討した。IL-2^Vを含むACT後、特にPD1d/2^V/33-ACTで、腫瘍NK細胞は増加したが、活性化には至らず、それらはなくても困らなかった。しかし、重要なことに、腫瘍制御は、好中球の動員および活性化に共依存していた（図3K）。このように、直交的エンジニアリングは、適応免疫と自然免疫の両方の動員を介して、免疫能のある宿主における腫瘍退縮を達成する。血液腫瘍を担持するリンパ球枯渇マウスでは、ACTを介した腫瘍制御の限られた例が存在するものの、これは、補助的治療の非存在下で、進行した低免疫原性の固形腫瘍においてACTを成功させた最初の実証例である（S. K. Vodnala et al., Science 363, eaau0135 (2019)）。

直交的エンジニアリングによって誘導された腫瘍内GzmC⁺ TCF1^negエフェクターCD8⁺ T細胞の新規サブセットは、TOXに依存せずに存続する
トリプル遺伝子改変ACTによる腫瘍制御と関連するTILの分子状態、および個々のダブル遺伝子改変モジュールの影響についてさらに理解するために、TILをシングルセル（sc）RNA-seqで解析した（図4A）。異なる実験条件から誘導されたCD8⁺ TILの教師なしクラスター解析（unsupervised clustering analysis）により、5つの異なるトランスクリプトーム状態（クラスターC1～C5）が明らかにされた（図4B）。この結果を解釈するために、未治療のマウス腫瘍で同定された前述の分子TIL状態に細胞を割り当てる機械学習ツールTILPREDを使用した（S. J. Carmona, et al. OncoImmunology 9, 1737369 (2020)）。非導入OT1細胞で治療した腫瘍からのTILは、未治療の腫瘍のTILと同様の特徴を示し、前駆型（progenitor-）および終末型（terminal-）疲弊細胞プール（C4）が優勢で、循環（C3）、エフェクターメモリー（C2）、およびナイーブ細胞（C1）が少ないことが判明した（図4Bおよび図4C）。このように、遺伝子改変および宿主のコンディショニングを行わない場合、ACTはTILの状態に影響を与えなかった。PD1d/2^V-ACT後、TILは、上記のTCF1⁺ 細胞の著しい増殖と一致する、優勢なナイーブ様プール（C1）を示し、さらに、エフェクターメモリー（C2）、循環（C3）、ならびに前駆型および終末型疲弊細胞（C4）が若干追加された。逆に、PD1/33-ACT後のTILは、優勢なエフェクターメモリー状態（C2）を示し、循環細胞（C3）をいくらか含んでいた。このように、IL-2^VのみまたはIL-33のみの局所発現は、TILを、それぞれナイーブ様状態とエフェクターメモリー状態へと方向を変えた。さらに、これら2つのサイトカインの組み合わせは、腫瘍制御に関連する完全に新規な状態（C5）をもたらし、この状態は、各サイトカインにより個別に支持されるいずれの状態とも違っていた。C5は、応答期の間のトリプル遺伝子改変ACTのTILにのみ見られ、他のどの腫瘍条件にも見られなかった（図4B）。この状態の新規性は、（sc）RNAseqデータを参照TILアトラスに投影するツールであるProjecTILsによってさらに裏付けられた；これにより、クラスターC1～C4の細胞は、前述の参照状態に合致したのに対し、C5は、これまでに記述されたことのない新規な状態として現れ、ユニークなエフェクター様転写プログラムのアップレギュレーションを特徴とすることが明らかにされた（図4D）。

TILPREDとProjecTILsの両方によって同定されたTILが大部分を占めたC5は、クラスターC4のTILとまったく同じように、「終末型疲弊（terminal-exhausted）」CD8⁺ 細胞として大きく分類された。実際、両クラスターの細胞は、Pdcd1、Lag3、Tigit、Havcr2/TIM3、およびEntpd1/CD39などの共抑制受容体遺伝子と、共刺激受容体および活性化マーカーTnfsfr9/4-1BBの比較的高い発現を共有していた（図4E）。UMAPによるそれらの分離とProjecTILsエフェクター様転写プログラムのアップレギュレーションを考慮して、C5とC4の終末型疲弊TILの明確に異なる分子的特徴を特定するために、差次的発現解析を使用した。C4の正規の終末型疲弊細胞と比較して、C5 TILは、疲弊関連転写因子Tox、bhlhe40、およびBatf、ならびに複数の抑制性受容体の顕著なダウンレギュレーションを伴った、独自のエフェクターシグネチャーを示した。特に、それは、一過性のエフェクター様疲弊細胞の特徴的なマーカーであるCx3cr1をもダウンレギュレートした（図4C，下部；表3）。さらに、C5 TILは、複数のグランザイム、最も顕著にはC5特異的マーカーを構成するGzmc（図4E）、抗アポトーシス遺伝子Bcl2、および前駆型CD8⁺ T細胞に関連したマーカーであるLy6c2（CX3CR1⁺ 一過性エフェクター様疲弊細胞には存在しない）を含めて、エフェクター細胞マーカーを有意にアップレギュレートした。一貫して、C5細胞は、C4と比較して、ToxノックアウトCD8 TILのシグネチャーに富んでいた（図4F）。それに応じて、応答期におけるOT1（約80％）および内因性（約70％）のCD8⁺ TILの大部分はグランザイムCを発現していることがFACSにより確認された（図4G）。GzmC⁺CD8⁺ 細胞は脾臓では検出されなかった；このことは、再プログラム化TMEでの局所的なきっかけ（cue）が腫瘍においてT細胞をこの状態に特異的に追い込んだことを示している。重要なことには、ごくわずかな頻度のGzmC⁺ CD8⁺ T細胞は、ベースラインでの内因性CD8⁺ TIL、またはインビトロ増殖後のOT1細胞においてだけでなく、残りの実験群（図4G）においても見出された；このことは、PDd1/2^V/33-ACTが、内因性TILを含むTILの高度の腫瘍内再プログラミングをもたらして、CD8⁺ T細胞エフェクターの新しい表現型を生成したが、これには明らかにIL-2^VとIL-33の局所的相互作用が必要であることを示している。

TOX^neg/low GzmC⁺ TCF1^neg エフェクターCD8⁺ TILは、共抑制性受容体の取るに足りない発現を示す多機能細胞である
PD1d/2^V/33-ACT後の腫瘍拒絶の主な原因となるGzmC⁺ エフェクターCD8⁺ TILの状態について、さらに特徴付けた。ゲーティング戦略を用いて、OT1および内因性コンパートメントにおけるTCF1^neg エフェクターCD8⁺ 細胞を同定した。PD1/2^V/33-ACT後のOT1の大部分および内因性GzmC⁺CD8⁺ TILの3分の2は、実際にTCF1^negエフェクター細胞であることがわかった（図5A）。次に、これらの細胞を、入手可能な場合は他のグループからのTCF1^negエフェクターCD8⁺ TILと比較した（図5B）（PD1d/33-OT1、非形質導入OT1、および非形質導入OT1 ACT＋αPD-L1から分析できる）；重要なことには、これらの細胞すべてがGzmC^negであった（図5A）。PD1d/2^V/33-ACTからのGzmC⁺TCF1^negCD8⁺ TIL、ならびに他のグループからのGzmC^negTCF1^negCD8⁺ エフェクターOT1および内因性TILの大部分はPD-1⁺であり（図5C）、これらの細胞の顕著な割合もTIM3⁺であった（図5D）。驚くべきことに、(sc)RNA-seqデータと一致して、OT1はほぼTOXを発現せず、内因性PD-1⁺GzmC⁺TCF1^neg細胞の約40％だけがTOXを発現した(図5E)。Ly6c2がC5（GzmC⁺）およびC4（GzmC^neg）疲弊細胞間で最も差次的に発現される遺伝子の一つであることと一致して、PD1⁺GzmC⁺TCF1^neg OT1および内因性TILの大部分は、終末型疲弊CD8⁺ TILには存在しないマーカーであるLY6Cの高い発現を示した。GzmC⁺TCF1^neg OT1または内因性TILはまた、短命エフェクター細胞のマーカーであるKLRG1の低/無発現を示した（図5F）。さらに、PD1d/2^V/33-ACTからのTOX^low/neg GzmC⁺TCF1^negCD8⁺ TILが正規の終末型疲弊細胞ではないことを示し、大部分のOT1および約半分の内因性細胞がCD69を発現することがわかった；このことは、最近のTCR誘導活性化を示唆している（図6A）。さらに、OT1および内因性コンパートメントの両方からのTOX^neg/lowGzmC⁺PD-1⁺TCF1^negCD8⁺ T細胞は、他のグループからのTILよりも多くのKi-67を発現した（図6B）。最後に、PD1/2^V/33-ACTからの大部分のOT1および内因性CD8⁺ TIL（しかし他のグループからはない）は、（sc）RNAseq解析によれば、GrzmB⁺であった（図6Cおよび図6D）。これらのPD-1⁺ OT1細胞の中には、ダブルGzmC^highおよびGzmB^highである重要な画分が同定され（図6E）、これらは内因性細胞には検出されなかった。最後に、PD1d/2^V/33-ACTからの腫瘍退縮の間に集められたPD-1⁺CD8⁺ TILを、エクスビボCD3/CD28刺激に対するサイトカイン応答について調査した。OT1および内因性TILの約半分は、刺激時にTNFαを産生し、一部の細胞はTNFαとIFNγの両方を産生して（図6F）、多機能エフェクター特性を実証した。したがって、トリプル遺伝子改変ACTは、TOXプログラムを獲得しない強力な腫瘍拒絶CD8⁺ エフェクターTILというユニークな表現型を生じさせる。

達成されたユニークなTIL状態の下で、PD-1またはTIM-3のような共抑制性受容体がTOX疲弊プログラムから切り離されるかどうか、また、それらの抑制機能が取るに足らないものかどうかを検証するため、PD1d/2^V/33-ACTをαPD-L1抗体またはαPD-L1/αTIM3二重抗体と組み合わせた。しかし、腫瘍制御の改善は観察されなかった（図6Gおよび図6H）。したがって、PD-1遮断はIL-2^V/IL-33組み合わせ遺伝子改変ACTとの関連では全く不必要であると推論された。実際、PD-1_IgG4デコイからPD-1エクトドメインを除去しても、活性2^V/33モジュールのみを有するACTによる腫瘍制御には影響しなかった（図6I）。これらのデータをまとめると、免疫能のある宿主におけるβγ結合性IL-2およびIL-33によるT細胞の直交的エンジニアリングは、腫瘍を制御する能力を備えた新規エフェクターTIL状態（TOXが抑制されたままであり、共抑制性受容体は発現されるものの無視できる）の生成を可能にしたことが示される。

直交的エンジニアリングはTOX^neg/low GzmC⁺前駆細胞の分化を推進する
慢性ウイルス感染と同様に、CD8⁺ T細胞を介した抗腫瘍応答（PD-1遮断後も同様）は、幹様特性を有する腫瘍内TCF1⁺PD-1⁺ 前駆型疲弊CD8⁺ T細胞によって維持されている可能性があり、こうした細胞は、それらの生成と存続に不可欠な転写因子TOXを発現している。TCF1^neg細胞においてTOXを抑制するACT状況下でのIL-2^Vの役割を考慮して、IL-2^VがTCF1⁺ 前駆細胞におけるTOXプログラムも抑制するかどうかを検討した。PD1d/IL-2^V/33-ACT後の応答期の間に、重要な数のTCF1⁺CD8⁺ TILが検出された（図3Fおよび図3G）。これらの細胞の全部はGzmCを発現し（図5A）、大部分はPD-1⁺でもあったが（図7A）、これら（OT1と内因性の両方）はほとんどTOX^negであった（図7Bおよび図7C）。このように、直交的エンジニアリングACTにより、腫瘍応答性TCF1⁺ 前駆細胞はすでにTOXプログラムを失活しており、GzmCをアップレギュレートしている（図7D）。重要なことには、PD1d/2^V-ACT後のTCF1⁺PD-1⁺CD8⁺ TILでのTOXのダウンレギュレーションも見られたが、PD1/33-ACT後の同じTILサブセットでの顕著な発現は、IL-2^VがTCF1⁺ CD8⁺ 前駆細胞状態のレベルでTOXを抑制する、ことを示している。

PD1d/IL-2^V-ACT後、PD-1^negTCF1⁺ 前駆細胞（OT1と内因性の両方）がかなりの頻度で確認された（図7A）。これらはTOX^negでもあり、抗原を経験したT_CMまたはT_EM細胞の特徴を示した。このように、IL-2^Vの存在下では、腫瘍特異的TCF1⁺ TILは、PD-1⁺ 前駆型疲弊細胞だけではない。しかし、IL-33単独の存在下では、内因性TCF1⁺PD-1^negCD8⁺ TILの40％がTOX⁺で、ほとんどがT_EM細胞であった。したがって、直交的エンジニアリングは、TCF1⁺ 幹様コンパートメントを、TOXプログラムの抑制とGzmCの発現によって予告される転写プログラムのアップレギュレーションに向けて再プログラム化すると結論づけられた。重要なこととして、これら2つのプログラムは独立しているようである。IL-2^VはTOX非依存的に幹細胞性と存続をサポートする重要な因子であったが、前駆CD8⁺ TILにおけるGzmC⁺ 分化プログラムの活性化をも引き起こすためには、IL-33との組み合わせが必要であった。

GzmC⁺ エフェクター状態の動的進化
最後に、トリプル遺伝子改変ACT後のGzmC⁺ TIL状態の動的進化（dynamic evolution）を評価した。ACTの5日後（17日目）に収集したCD8⁺ TILからの腫瘍応答時（24日目）の（sc）RNA-seqデータと、PD1d/2^V/33-ACTへの初期応答後にエスケープした腫瘍（38日目）からの（sc）RNA-seqデータを比較した（図8A）。以前の全てのTILにエスケープタイムポイントを追加しても、先に述べた細胞注釈とクラスター分布に変化はなかった。このように、ACT後の初期には、TILは主に増殖（C3）、エフェクターメモリー（C2）、および疲弊プール（C4）に分布していた（図8B）。ACT後12日目までに、細胞は新しいC5状態に移行し、腫瘍の退縮に関連していた。興味深いことに、その後の進行は、C5から新しいC6状態へのTILの移行に関連していた（図8B）。腫瘍エスケープ時のこの新しい適応状態は、拒絶に関連するC5 GzmC⁺ エフェクター状態とは確かに異なっていた（図8Bおよび図8C）。PD-1（またはTIM-3）遮断が腫瘍を制御できないことから予想されるように（図6G、図6H、および図6I）、エスケープする細胞は、C4の疲弊した最終分化細胞から遠く離れ、これらの細胞よりも著しく低いTOXを発現した（図8B）。PD1d/2^V/33サンプル単独のクラスタリングでは分解能が向上し、C6細胞は、ACT後の初期または応答中に観察された正規のエフェクターメモリーC2状態に近いがそれとは区別され、より低いFosl2、Bcl2、Gzma、Gzmb、およびTnfrsf9（CD137）を示すことが明らかにされた(図8B)。一貫して、ProjecTILs解析は、エスケープ期のC6状態が参照マップのエフェクターメモリー状態から外れて、Fosl2駆動のエフェクター遺伝子プログラムをダウンレギュレートすることを明らかにした。したがって、エスケープは正規の疲弊によって媒介されず、細胞は少なくとも大部分がPD1d/2^V/33-ACTに特徴的なTOX抑制プログラムを保持したが、GzmC（およびGzmB）の発現を失った。

上記の観察は、フローサイトメトリーによって検証された。トリプル遺伝子改変ACT後、クラスター5の特徴的なGzmC⁺CD8⁺ TIL集団は、5日目から12日目まで腫瘍内で顕著に増殖して、腫瘍の退縮と一致した（図8D）が、これらの細胞は腫瘍エスケープ時には失われた。また、腫瘍の進行時にはOT1細胞の著しい減少が観察され（図8E）、これはOT1および内因性TILの両方のTCF1^neg集団の縮小と関連していた（図8F）。C6状態と一致して、残存CD8⁺ TILはPD-1^neg/lo T_EM様CD8⁺ 表現型を示し、インビトロで増殖したT_EM様CD8⁺ T細胞と比較してグランザイムBの有意なダウンレギュレーションを示した。最後に、エスケープの間に採取したTCF1^neg PD-1⁺CD8⁺ T細胞は、腫瘍制御の間に採取したTCF1^neg PD-1⁺CD8⁺ T細胞と比較して、グランザイムB発現と多機能性の両方の損失を示した（図8Gおよび図8H）。したがって、最適なTILエフェクター状態は、腫瘍応答と動的に関連していると結論づけられた。

考察
この実施例は、固形腫瘍ACTの状況下での直交的組み合わせT細胞エンジニアリングが、宿主における恒常性の障壁をうまく克服でき、リンパ球枯渇または外因性サイトカインのサポートの非存在下で、TILおよび腫瘍微小環境の深遠な再プログラミングと腫瘍の退縮とをもたらすことを実証している。免疫能のある宿主でACTを実施することは、現在のACTの毒性とコストを劇的に下げるだけでなく、宿主の免疫を全面的に活用できるという独自の利点を提供する。この実施例はさらに、こうした状況下で、内因性CD8⁺ 細胞（特に既存のCD8⁺ TIL）と好中球の両方が腫瘍に対して動員され、腫瘍退縮の達成に不可欠であることを示している。

高次元のコンピュータ解析を用いた最近の研究は、ヒトおよびマウス腫瘍において、ナイーブ様、エフェクターメモリー、細胞傷害性、疲弊性といった複数のタイプのCD8⁺ 状態の存在を明らかにした（S. J. Carmona, et al. OncoImmunology 9, 1737369 (2020)）。主にヒトサンプルで観察される細胞傷害性TIL状態は、ほとんどがバイスタンダー細胞に富んでいるが、疲弊コンパートメントは腫瘍特異的CD8 TILに富んでいることを示す実質的証拠がある（A. M. van der Leun, et al. Nature Reviews Cancer 20, 218-232 (2020)）。特に、このコンパートメントは非常に不均一であって、前駆型または終末型のいずれかの疲弊CD8⁺ T細胞として分化軸に沿って階層的に組織化された一連の細胞状態によって形成されている。免疫チェックポイント遮断（ICB）は現在まで、重要なレベルの臨床反応を達成してきているが、その効果は主に、新規の非疲弊型エフェクター様状態を誘導するのではなく、治療前にすでに存在していた疲弊型CD8 T細胞状態の変化を誘導することに基づいている（J.-C. Beltra et al., Immunity 52, 825-841.e828 (2020)）。したがって、そのような「望ましい」エフェクター状態に向けたCD8 TILの薬理学的再プログラミングは、現在の免疫療法に対する臨床反応を改善するための効果的な戦略を表している。

T細胞エンジニアリングは、TILと、パラクリン方式ではTME、を合理的に再プログラム化するための無限の機会を提供する。この実施例は、βγ鎖受容体のみにかみ合うIL-2バリアントを、CD8⁺ T細胞を刺激するPD-1遮断と、TMEを再プログラム化する強力な自然免疫活性化因子であるIL-33と共に使用する、直交的エンジニアリングを実証している。この組み合わせは、複数のグランザイム（最も顕著なグランザイムC）のユニークな発現と、慢性ウイルス感染中および癌における疲弊CD8⁺ T細胞集団の生成と維持に重要な転写因子であるTOXの抑制とによって区別される新規エフェクター状態の、外因性TILと内因性TILの両方による受け入れ（adoption）につながった（A. C. Scott et al., Nature 571, 270-274 (2019)）。この状態は、TMEにおける著しい局所CD8⁺ T細胞の増殖、強力なエフェクター機能、および効果的な腫瘍制御に再現性よく関連していた。この新規プログラムの下でも、PD-1と他の共抑制性受容体は依然として発現された；このことは、持続的な抗原刺激の状況下でのそれらのアップレギュレーションが、厳密にはTOX依存性ではないことを示している。さらに、PD-1およびTIM3経路の薬理学的遮断により、それらの発現は機能的に重要でないことが裏付けられた。

CD8⁺ T細胞疲弊プログラムは、TOXの発現によりTCF1⁺ 前駆細胞コンパートメントで安定的に実施される。しかし、直交的エンジニアリングによって増えたTCF1⁺ CD8状態は、TOX陰性のままであり、正規の前駆型疲弊細胞コンパートメントでは決して検出されないマーカーであるグランザイムCをアップレギュレートした。それゆえ、治療によって誘導された前駆細胞様の細胞状態は、慢性ウイルス感染の状況下および癌において一貫して報告されてきたTCF1⁺TOX⁺ 前駆細胞状態から分岐している。同様に、直交的エンジニアリングによって増えた多機能GzmC⁺TCF1^negPD-1⁺TOX^low/negエフェクター様状態は、正規の終末型疲弊細胞状態（TOX⁺PD-1⁺ CX3CR1^negGzmC^neg）からだけでなく、一過性のエフェクター様疲弊細胞状態（CX3CR1⁺ TIM3⁺PD-1⁺）からも分岐している。実際、TOXはこの状態ではダウンレギュレートされるが、それは正規のGzmC^negTCF1⁺ 前駆型疲弊細胞から生じて、Gzmcを有意にアップレギュレートすることはない（J.-C. Beltra et al., Immunity 52, 825-841.e828 (2020)）。さらに、それは直交的エンジニアリングによって誘導されたGzmC⁺ エフェクター状態で有意にダウンレギュレートされるCx3cr1とKlrg1を発現する。さらに、CD4⁺ Tヘルプ細胞は、CX3CR1⁺ エフェクター状態の形成に必要である。しかしながら、これらの細胞はこのアプローチの状況下では有害である。したがって、TCF1⁺およびTCF1^neg GzmC⁺CD8⁺ TILは、新規のTOX非依存性CD8⁺ T細胞分化プログラムの、それぞれ前駆状態とエフェクター状態を表していると仮定された。

TOXの治療的操作（therapeutic manipulation）は、癌との関連でT細胞疲弊を廃止する有望な戦略として浮上している。最近、TOXノックダウンまたはTOX2の欠失は、CAR-T細胞の機能を改善し、TOXのヘテロ接合性欠失は抗腫瘍T細胞応答を強化することが実証された（H. Seo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 116, 12410-12415 (2019); O. Khan et al., Nature 571, 211-218 (2019)）。この実施例は、疲弊していない高機能性のCD8⁺ エフェクター状態を誘導するために、TOXを治療標的とする代替の新規アプローチを示している。実際、移入されたT細胞だけでなく、内因性CD8⁺ T細胞の腫瘍内コンパートメントでも、IL-2^VはCD8 T細胞の幹細胞性とTOXの抑制の両方を促進したことが示された。一方、IL-33は、おそらくTMEの再プログラミングを通じて間接的に、Gzmcのアップレギュレーション、Tcf1の抑制、その結果として、CD8⁺ T細胞の多機能エフェクター細胞への分化を推進した。この最適なTIL状態は腫瘍エスケープ時に失われ、その結果生じたEM様状態は、エフェクターGzmC⁺と異なっていただけでなく、正規のエフェクターメモリーCD8 TIL状態とも異なっていた。したがって、直交的T細胞エンジニアリングに対する腫瘍エスケープは、TOXによる疲弊プログラムの再活性化によって媒介されたのではなく、むしろ最適なGzmC⁺ エフェクターCD8⁺ 状態への腫瘍内CD8⁺ T細胞分化の欠如によるものであった。これは、PD-1遮断によって再活性化された疲弊CD8⁺ T細胞が、腫瘍エスケープの間にそれらの疲弊表現型を再び獲得するのと決定的な違いである。

要約すると、この実施例は、ACT用のCD8⁺ T細胞の直交的組み合わせエンジニアリング、特にCD25にかみ合わないIL-2のバリアントとアラーミン（alarmin）IL-33を分泌させることが、プレコンディショニング、サイトカイン療法または他のサポート（例えば、ワクチン接種）の非存在下で、進行したメラノーマ腫瘍を制御できることを示す。組み合わせT細胞療法は非治癒的であったが、CD4枯渇は長期生存を可能にしたことが実証された；このことは、Tregが疾患進行に関与していることを示しており、それゆえ、さらなる組み合わせ治療介入の機会を提供している。したがって、本開示は、TMEを再プログラム化し、かつ進行した低免疫原性の固形腫瘍を制御する能力を備えた高機能CD8⁺ 状態を誘導するための、組み合わせ遺伝子改変T細胞の臨床解釈（clinical translation）の可能性を実証するものである。

（表２）各治療群の客観的奏効と臨床的有用性の観察された応答および予測確率

注釈：客観的奏効には、完全奏効（CR；100％の腫瘍体積減少）と部分奏効（PR；≦－30％の腫瘍変化）が含まれる。臨床的有用性には、CR、PR、および病勢安定（－30％＜腫瘍変化≦＋20％）が含まれる。発生確率は、精確ロジスティック回帰を用いて算出した。

（表３）線形回帰を用いた各群のベースラインからの予測された腫瘍サイズ変化

*: －100％は、腫瘍サイズ変化の最小の推算値（plausible value）である。注釈：p値は、トリプル組み合わせ（PD1d＋IL-2V＋IL-33）に対して各治療効果を比較したものである。モデルの調整済みR²：43.8％。

実施例5
CD40LデコイとIL-2バリアントおよび組み合わせGEEP療法
トリマーCD40Lデコイと、CD25にかみ合わないIL-2のバリアントをコードするSINレトロウイルスベクターを構築した。これらの分子はNFATの下で発現されるため、活性化されたT細胞でのみ産生される；これは腫瘍の微小環境でのみ起こるはずである。前臨床モデルでは、IL-2バリアントは分化度の低い表現型を促進し、インビボでの生着（すなわち、T細胞の存続）をサポートすることが示された。また、前臨床研究では、CD40Lが腫瘍制御を促進することも示された。それは、樹状細胞などの抗原提示細胞に作用して、それらを活性化し、それによって、より良いT細胞サポートを提供することができる。それゆえ、CD40Lデコイは腫瘍微小環境のリプログラマーである。

T細胞は、まずPD1デコイ-tEGFRで遺伝子改変され、その後、同時形質導入により、または異なる遺伝子改変T細胞集団と混合することより、CD40LデコイおよびIL2^Vと組み合わされる。tEGFR（または細胞排除タグ（CET）と呼ばれる）は、形質導入効率を評価する手段として使用され、必要に応じて（抗EGFRコーティングビーズ上で）遺伝子改変細胞を濃縮するために使用され得る。それは、生着後の患者において遺伝子改変T細胞を（採取した血液サンプルまたは腫瘍生検からのFACSによって）追跡する手段としても使用できる。さらに、それは、セツキシマブ投与患者に毒性が生じた場合、ADCCを介した排除タグとして使用され得る。

（表４）トランスジーンの例の代表的な配列

Claims (55)

1. 対象の免疫系を調節するための少なくとも2つのトランスジーンを発現する複数の遺伝子改変リンパ球を含む、組成物。
2. トランスジーンが、抗体、抗体フラグメント、受容体、デコイ、チェックポイント遮断モジュレーター、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、細胞排除タグ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
3. デコイが、PD1、CTLA4、LAG3、VEGFR1、TIM3、TIGIT、およびSIRPαデコイからなる群より選択される、請求項2に記載の組成物。
4. デコイがPD1デコイである、請求項3に記載の組成物。
5. PD-1デコイがPD-1.IgG4デコイである、請求項4に記載の組成物。
6. サイトカインが、LIGHTまたはそのバリアント、IL-33またはそのバリアント、IL-2またはそのバリアント、IL-15またはそのバリアント、IL-12またはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアントからなる群より選択される、請求項2に記載の組成物。
7. サイトカインが変異型サイトカインである、請求項6に記載の組成物。
8. 細胞排除タグが、切断型EGFR（tEGFR）、HER2、CD20、およびCD19からなる群より選択される、請求項2に記載の組成物。
9. 少なくとも2つのトランスジーンが、PD-1デコイまたはそのバリアント、IL-2バリアント、LIGHTまたはそのバリアント、IL-33またはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアントの2つ以上を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
10. 少なくとも2つのトランスジーンが、tEGFRもしくはそのバリアント、切断型HER2（tHER2）もしくはそのバリアント、CD20もしくはそのバリアント、またはCD19もしくはそのバリアントをさらに含む、請求項9に記載の組成物。
11. 少なくとも2つのトランスジーンが、
    （a）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびtEGFRまたはそのバリアント；
    （b）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアント；
    （c）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアント；
    （d）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアント；
    （e）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアント；
    （f）PD-1デコイまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびIL-33またはそのバリアント；
    （g）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-2バリアント；
    （h）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびLIGHTまたはそのバリアント；
    （i）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-33またはそのバリアント；
    （j）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント；
    （k）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびIL-33またはそのバリアント；
    （l）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント；または
    （m）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-33バリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント
    を含む、請求項9または10に記載の組成物。
12. PD-1デコイまたはそのバリアントが、tEGFRもしくはそのバリアント、tHER2もしくはそのバリアント、CD20もしくはそのバリアント、またはCD19もしくはそのバリアントと同じベクター上に保持されている、請求項10に記載の組成物。
13. PD-1デコイが、SEQ ID NO：1～4、6～17、42、44、47～48および51～52のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：1～4、6～17、42、44、47～48および51～52のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項4～5および9～11のいずれか一項に記載の組成物。
14. IL-2バリアントが、SEQ ID NO：21～23のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：21～23のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項6～13のいずれか一項に記載の組成物。
15. IL-33が、SEQ ID NO：25および27のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：25および27のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項6～14のいずれか一項に記載の組成物。
16. LIGHTが、SEQ ID NO：28～29および31のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：28～29および31のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項6～15のいずれか一項に記載の組成物。
17. CD40Lが、SEQ ID NO：32～34、36、および38のいずれか1つのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：32～34、36、および38のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項6～16のいずれか一項に記載の組成物。
18. tEGFRが、SEQ ID NO：40に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：40のアミノ酸配列を含む；HER2が、SEQ ID NO：45に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：45のアミノ酸配列を含む；およびCD20が、SEQ ID NO：49に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列またはSEQ ID NO：49のアミノ酸配列を含む、請求項2および10～17のいずれか一項に記載の組成物。
19. 抗体または抗体フラグメントが、VEGF、TGF-B、4-1BB、CD28、CD27、NKG2D、PD1、PDL1、およびCTLA4抗体からなる群より選択される、請求項2に記載の組成物。
20. 抗体がPD1抗体である、請求項19に記載の組成物。
21. 複数のリンパ球が、少なくとも2つのリンパ球サブセットを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
22. 複数のリンパ球が、2つのリンパ球サブセットからなる、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
23. 複数のリンパ球の各サブセットが、少なくとも1つのトランスジーンを発現する、請求項21または22に記載の組成物。
24. 少なくとも2つのトランスジーンが互いに異なっている、請求項21～23のいずれか一項に記載の組成物。
25. 複数のリンパ球が、
    （i）少なくとも2つのトランスジーンを発現する第1のサブセット；および
    （ii）少なくとも2つのトランスジーンを発現する第2のサブセット
    を含み、第1のサブセットのトランスジーンの少なくとも1つが、第2のサブセットのトランスジーンと異なっているか、または第1のサブセットのトランスジーンの少なくとも1つが、第2のサブセットのトランスジーンと共通している、請求項21～24のいずれか一項に記載の組成物。
26. （i）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現するか；
    （ii）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現するか；
    （iii）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現するか；
    （iv）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現するか；
    （v）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現するか；または
    （vi）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアントを発現する、
    請求項25に記載の組成物。
27. 第1のサブセットまたは第2のサブセットが、tEGFRもしくはそのバリアント、tHER2もしくはそのバリアント、CD20もしくはそのバリアント、またはCD19もしくはそのバリアントをさらに発現する、請求項26に記載の組成物。
28. （i）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびLIGHTまたはそのバリアントを発現するか；
    （ii）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-33またはそのバリアントを発現するか；
    （iii）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-2バリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアントを発現するか；
    （iv）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびLIGHTまたはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-33またはそのバリアントを発現するか；
    （v）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびLIGHTまたはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアントを発現するか；または
    （vi）第1のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-33またはそのバリアントを発現し、かつ第2のサブセットが、少なくともPD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアントを発現する、
    請求項27に記載の組成物。
29. 前記2つのサブセットが、約1：1～約1：100の比率で組み合わされる、請求項21～28のいずれか一項に記載の組成物。
30. 前記2つのサブセットが、約1：1の比率で組み合わされる、請求項29に記載の組成物。
31. リンパ球が自己由来である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
32. リンパ球が腫瘍浸潤リンパ球である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
33. リンパ球がキメラ抗原受容体（CAR）を発現する、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
34. リンパ球が組換えT細胞受容体（TCR）を発現する、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
35. 組換えT細胞受容体（TCR）が、NY-ESO1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE A-10、MAGE-C2、SSX2、MAGE-A12、またはそれらの組み合わせに対する反応性を示す、請求項34に記載のリンパ球の組成物。
36. 有効量の前記請求項のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
37. 第2の治療剤をさらに含む、請求項32に記載の薬学的組成物。
38. 有効量の請求項1～35のいずれか一項に記載の組成物または有効量の請求項36～37のいずれか一項に記載の薬学的組成物を含む、キット。
39. 複数のリンパ球を提供する段階；
    該複数のリンパ球に少なくとも2つのトランスジーンをコードする核酸分子を導入して、複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階；および
    細胞培地中で該複数の遺伝子改変リンパ球を拡大培養する段階
    を含む、請求項1～35のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
40. 複数のリンパ球を提供する段階；
    該複数のリンパ球に2つ以上の核酸分子を導入し、それによって複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階であって、該2つ以上の核酸分子の各々が少なくとも1つのトランスジーンをコードする、段階；および
    細胞培地中で該複数の遺伝子改変リンパ球を拡大培養する段階
    を含む、請求項1～35のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
41. 少なくとも2つのトランスジーンが、PD-1デコイ、IL-2バリアント、LIGHTまたはそのバリアント、IL-33またはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアントの2つ以上を含む、請求項39または40に記載の方法。
42. 少なくとも2つのトランスジーンが、tEGFRもしくはそのバリアント、tHER2もしくはそのバリアント、CD20もしくはそのバリアント、またはCD19もしくはそのバリアントをさらに含む、請求項41に記載の方法。
43. 少なくとも2つのトランスジーンが、
    （a）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびtEGFRまたはそのバリアント；
    （b）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-2バリアント；
    （c）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびLIGHTまたはそのバリアント；
    （d）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびIL-33またはそのバリアント；
    （e）PD-1デコイまたはそのバリアントおよびCD40Lまたはそのバリアント；
    （f）PD-1デコイまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびIL-33またはそのバリアント；
    （g）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-2バリアント；
    （h）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびLIGHTまたはそのバリアント；
    （i）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびIL-33またはそのバリアント；
    （j）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント；
    （k）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびIL-33またはそのバリアント；
    （l）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-2バリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント；または
    （m）PD-1デコイまたはそのバリアント、tEGFRまたはそのバリアント、IL-33バリアント、およびCD40Lまたはそのバリアント
    を含む、請求項41または42に記載の方法。
44. PD-1デコイが、tEGFRもしくはそのバリアント、tHER2もしくはそのバリアント、CD20もしくはそのバリアント、またはCD19もしくはそのバリアントと同じベクター上に保持される、請求項42に記載の方法。
45. 第1の複数のリンパ球に、少なくとも2つのトランスジーンをコードする第1の核酸分子を導入して、第1の複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階；および
    第2の複数のリンパ球に、少なくとも2つのトランスジーンをコードする第2の核酸分子を導入して、第2の複数の遺伝子改変リンパ球を取得する段階
    を含む、請求項21～35のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
46. 第1の核酸を導入する段階の後に、細胞培地中で第1の複数のリンパ球を拡大培養する段階、または第2の核酸を導入する段階の後に、細胞培地中で第2の複数のリンパ球を拡大培養する段階を含む、請求項45に記載の方法。
47. 第1の複数の遺伝子改変リンパ球を、第1の複数の遺伝子改変リンパ球と、約1：1～約1：100の所定の比率で組み合わせる段階をさらに含む、請求項45または46に記載の方法。
48. 細胞培地が、規定された細胞培地である、請求項39～40および46のいずれか一項に記載の方法。
49. 細胞培地が、ネオアンチゲンペプチドを含む、請求項48に記載の方法。
50. 対象における癌/腫瘍または慢性感染症を治療する方法であって、治療有効量の請求項1～35のいずれか一項に記載の組成物または請求項36～37のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、前記方法。
51. 癌が、メラノーマ、肉腫、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、MSI-high腫瘍、頭頸部腫瘍、腎臓癌、および乳癌からなる群より選択される、請求項50に記載の方法。
52. 前記組成物が、静脈内注入により投与される、請求項50または51に記載の方法。
53. 第2の治療剤を対象に投与する段階をさらに含む、請求項50～52のいずれか一項に記載の方法。
54. 第2の治療剤が、抗癌剤または抗腫瘍剤である、請求項53に記載の方法および請求項37に記載の薬学的組成物。
55. 前記組成物または前記薬学的組成物が、第2の治療剤の前、後またはそれと同時に対象に投与される、請求項53または54に記載の方法。

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