KR102251864B1 - miR-320c를 유효성분으로 포함하는 백금계 항암제에 대한 삼중음성유방암 환자의 약물 반응성 예측용 바이오마커 조성물 - Google Patents

miR-320c를 유효성분으로 포함하는 백금계 항암제에 대한 삼중음성유방암 환자의 약물 반응성 예측용 바이오마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 miR-320c를 유효성분으로 포함하는 백금계 항암제에 대한 삼중음성유방암 환자의 약물 반응성 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 CHEK1 발현이 miR-320c에 의해 직접 조절된다는 것을 확인하였는데, 이는 대부분의 TNBC 세포주에서 하향-조절되었다. 추가적인 연구를 통해, 본 발명자들은 옥살리플라틴-처리된 TNBC 세포에서 miR-320c의 이소성 도입(ectopic restoration)은 CHEK1의 음성 조절을 통해, DNA 손상 반응, DNA 수선을 억제하고, 유전체 불안정성을 향상시키며, 세포 사멸을 활성화시키는 것을 밝혀냈다. 또한, miR-320c 유사체 및 옥살리플라틴의 조합은 종양 진행을 효과적으로 억제하였다. 상기 결과들은 miR-320c가 CHEK1 발현을 조절함으로써, TNBC 세포의 옥살리플라틴에 대한 반응성에 중요한 역할을 한다는 것을 나타내는데, 이는 화학치료 반응성을 증가시키기 위한 치료 표적으로서, 삼중음성유방암 치료 전략에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

miR-320c를 유효성분으로 포함하는 백금계 항암제에 대한 삼중음성유방암 환자의 약물 반응성 예측용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for predicting drug responsiveness to platinum-based anti-cancer agents in triple negative breast cancer comprising miR-320c}
본 발명은 miR-320c를 유효성분으로 포함하는 백금계 항암제에 대한 삼중음성유방암 환자의 약물 반응성 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
전세계적으로 유방암은 여성에게 가장 흔한 암으로서, 이 중에서 삼중음성유방암(Triple Negative Breast Cancer; TNBC)은 전체 유방암 환자의 12-20%를 차지한다. TNBC는 유방암 서브타입인데, 3가지 호르몬성 멤브레인 수용체인 에스트로겐 수용체(estrogen receptor; ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor, PR) 및 인간 상피 성장인자 수용체(human epidermal growth factor receptor; HER2)가 존재하지 않는다. 유방암 서브타입 중에서도 TNBC 환자들은 공격적이고 가장 나쁜 예후를 나타낸다. 다른 유방암 서브타입들(Luminal A, Luminal B 및 HER2)과 달리, TNBC 치료는 치료 표적인 3가지 호르몬 수용체가 없기 때문에 특히 어렵다.
MicroRNAs(miRNAs)는 작은 비-코딩 RNA로서, 이는 표적 mRNAs의 3'-비번역 영역(untranslated regions; UTR)에 결합하여 표적 유전자 발현을 조절한다. 세포 증식, 세포 사멸, 발달, 신호 전달을 포함하는 생물학적 과정 및 암과의 관련성에 있어, miRNAs가 중요하다는 것은 많은 연구에서 밝혀졌다. 또한, miRNA는 유방암 및 비소세포성 폐암에서 표적 유전자 발현을 조절하여 약물 반응성 및 저항성에 영향을 미친다고 여러 연구에서 보고되고 있다. 이전 연구에 따르면, miR-320 패밀리는 난소암, 자궁경부암 및 위암에서 다양한 암의 특징 및 종양 미세환경의 리프로그래밍과 관련되어 있다. 또한, miR-320c는 SMARCC1을 통한 췌장암에서의 젬시타빈-내성에 관련되어 있고, CDK6 조절을 통한 방광암에서의 종양 행동에 관련되어 있다고 보고되었다.
일반적으로, 암세포의 생존은 증가된 스트레스 수준, 예컨대 종양 형성 과정 동안 유도되는 DNA 손상 및 복제 스트레스 증가의 완화 정도에 의존한다. 따라서, 스트레스 감소 경로의 억제 및 스트레스 과부하의 적용은 종양 세포에서 특이적으로 스트레스 수준을 임계 수준으로 증가시킬 것으로 예상된다. 사실, DNA 수선(백금계 화합물) 또는 p53(탁산)을 표적으로 하는 화학치료가 TNBC 환자에게 많은 케이스에서 사용된다. 백금계 화합물로서, 유방암에 대한 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)의 임상 활성이 여러 차례 보고되었으나, TNBC 종양에 대한 임상적 효과는 충분하지 않다. 따라서, TNBC 환자에 대한 새로운 조합 치료 전략이 필요하다. 옥살리플라틴(Oxaliplatin)은 백금계 화합물 중 하나로서, 시스플라틴 및 카보플라틴과 교차-반응을 나타내지 않는다. 이전 연구에서, 옥살리플라틴은 난소암, 비소세포성 폐암 및 유방암에서 항-종양 활성을 나타냈다. 하지만, TNBC의 이질성으로 인해, TNBC에 대한 치료 예후를 예측하고 치료 전략을 수립하기는 여전히 어려움이 있다.
DNA 손상은 Rad9-Hus1-Rad1(9-1-1)-ATR-Chk1에 의해 매개되는 신호전달 경로를 통해, DNA 손상 반응(DNA damage response; DDR)을 활성화시키고, 이는 상동 재조합(homologous recombination; HR)과 같은 DNA 수선 경로를 통해 DNA 병변을 수선한다. 활성화된 Chk1은 DNA 손상된 암세포가 생존을 위해 손상을 수선하도록 하고, 이는 화학치료 또는 방사선치료에 대한 암세포의 저항성을 유도한다. 실제로 화학치료의 효과를 향상시키기 위해, Chk1 억제제들을 개발하기 위한 많은 시도가 있었다. 또한, 비소세포성 폐암 및 자궁경부암에서 체크포인트 키나제 1(Checkpoint kinase 1; CHEK1)을 조절하는 것으로 알려진 microRNAs가 보고되었다. 하지만, TNBC에서 옥살리플라틴의 반응성에 있어서, CHEK1 조절에 의한 miRNA의 효과를 보고한 연구는 없었다.
PCT공개특허 WO 2019-115748 (2019.06.20 공개)
본 발명의 목적은 miR-320c를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 miR-320c의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물 또는 이를 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 키트를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 삼중음성유방암 환자에서 분리된 시료로부터 miR-320c의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 miR-320c, miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 miR-320c, miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제; 및 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 miR-320c의 발현이 증가된 환자의 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 miR-320c의 발현 수준 측정을 통한 백금계 항암제에 대한 민감성 증진제 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 miR-320c의 발현 수준이 증가된 삼중음성유방암 환자를 선별하여, 백금계 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암 치료방법을 제공하는데 있다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 miR-320c를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-320c의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 시료로부터 miR-320c의 발현수준을 측정하는 단계; (2) 상기 측정된 miR-320c의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 miR-320c의 발현수준이 대조군 시료보다 높을 경우 백금계 항암제에 대한 민감성을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-320c, miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-320c, miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-320c, miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제; 및 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 miR-320c의 발현이 증가된 환자의 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 삼중음성유방암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 삼중음성유방암 세포에서 miR-320c의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 miR-320c의 발현 수준이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 백금계 항암제에 대한 민감성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-320c의 발현 수준이 증가된 삼중음성유방암 환자를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 삼중음성유방암 환자에게 백금계 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암 치료방법을 제공한다.
본 발명은 miR-320c를 유효성분으로 포함하는 백금계 항암제에 대한 삼중음성유방암 환자의 약물 반응성 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 CHEK1 발현이 miR-320c에 의해 직접 조절된다는 것을 확인하였는데, 이는 대부분의 TNBC 세포주에서 하향-조절되었다. 추가적인 연구를 통해, 본 발명자들은 옥살리플라틴-처리된 TNBC 세포에서 miR-320c의 이소성 도입(ectopic restoration)은 CHEK1의 음성 조절을 통해, DNA 손상 반응, DNA 수선을 억제하고, 유전체 불안정성을 향상시키며, 세포 사멸을 활성화시키는 것을 밝혀냈다. 또한, miR-320c 모방체(mimic) 및 옥살리플라틴의 조합은 종양 진행을 효과적으로 억제하였다. 상기 결과들은 miR-320c가 CHEK1 발현을 조절함으로써, TNBC 세포의 옥살리플라틴에 대한 반응성에 중요한 역할을 한다는 것을 나타내는데, 이는 화학치료 반응성을 증가시키기 위한 치료 표적으로서, 삼중음성유방암 치료 전략에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 TNBC에서 miR-320c의 발현이 하향조절되는 결과를 나타낸다. (A) 본 발명의 실험 모식도를 나타낸다. (B) 정상 인접 조직에 비해, TNBC 환자 종양 조직(n=3)에서 더 낮게 발현되는 miRNAs의 히트맵을 나타낸다. 발현 수준은 색칠된 바로 표시하였다. 높음(파랑) 또는 낮음(빨강). (C) TaqMan 정량적 RT-PCR을 이용한 유방암 세포주에서의 miR-320c 발현을 나타낸다. RNU48을 내재성 대조군으로 사용하였다. (D) Luminal A (n=10), Luminal B (n=9), HER2 (n=4) 및 TNBC (n=26)에서 miR-320c 차등 발현을 보이는 GEO dataset 분석 결과를 나타낸다. (E) KM plotter database(www.kmplot.com)로부터 얻은 삼중음성유방암 환자의 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meier 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 miR-320c 결합에 의해 CHEK1 발현이 음성적으로 조절되는 결과를 나타낸다. (A) TNBC 종양 조직에서 miR-320c와 음성적으로 연관된 발현 패턴을 갖는 miR-320c의 잠재적 표적 및 TargetScan을 사용하여 miR-320c 결합 사이트를 갖는 것으로 예측된 잠재적 표적을 나타내는 표이다. (B) cbioprotal (Cerami et al, 2012; Gao et al, 2013)로부터 얻은 TCGA datasets를 사용하여, 여러 서브타입의 유방암에서의 CHEK1 mRNA 발현 수준을 나타낸다. Lum A; Luminal A, Lum B; Luminal B, HER2, CL; Claudin-low, Basal; like TNBC. (C) cbioprotal로부터 얻은 METABRIC datasets을 사용하여 분석한 CHEK1 발현 수준을 나타낸다. Lum A; Luminal A, Lum B; Luminal B, HER2, CL; Claudin-low, Basal; like TNBC. (D) 특정 프라이머를 사용하여, qRT-PCR을 통해 측정된 CHEK1 mRNA 발현을 나타낸다. h18s rRNA를 내재성 대조군으로 사용하였다. (E) 유방암 세포주에서 Chk1의 웨스턴블랏 분석 결과를 나타낸다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (F) miR-320c 및 2개의 결합 사이트를 포함하는 CHEK1의 3'UTR의 서열 정렬 결과를 나타낸다. WT1 및 WT2; 야생형 CHEK1 3'UTR 시드 서열, MT1 및 MT2; 돌연변이 CHEK1 3'UTR 시드 서열. 돌연변이된 서열은 흰색 글자로 표시하였다. (G) miR-320c 모방체(miR-320c) 또는 음성 대조군 모방체(NC)로 형질감염시킨 후, HEK293T 세포에서 CHEK1 야생형(WT) 또는 돌연변이 3'UTR 구조체(MT)의 루시퍼라제 활성을 나타낸다. N.S., 유의성 없음. (H) 음성 대조군(NC) 또는 miR-320c (320c)로 48시간 동안 형질감염시킨 후, TNBC 세포주(MDA-MB-231, HS578T, MDA-MB-468)에서 miR-320c 형질감염 효율을 나타내는 qRT-PCR 분석 결과이다. (I-J) TNBC 세포주(MDA-MB-231, HS578T, MDA-MB-468)에서의 miR-320c 과발현이 CHEK1 mRNA 및 단백질 발현 수준을 감소시킨다는 결과를 나타낸다.
도 3은 miR-320c의 상향조절이 Chk1 발현 조절을 통해 세포사멸을 증가시킨다는 결과를 나타낸다. (A-B) 세포사멸된 세포의 유세포분석 결과를 나타낸다. (C) 음성 대조군 모방체(NC) 또는 miR-320c 모방체(miR-320c)로 형질감염시킨 후와, 72시간 동안 옥살리플라틴(50μM) 처리한 후, MDA-MB-23 세포에서 miR-320c 형질감염 효율을 나타내는 qRT-PCR 분석 결과이다. (D-E) miR-320c 모방체로 형질감염된 MDA-MB-231를 옥살리플라틴(oxa)으로 72시간 동안 처리한 결과를 나타낸다. (F) CHEK1 siRNA가 Chk1 단백질 발현 수준을 감소시킨 결과를 나타낸다. (G-H) 세포사멸된 세포의 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 4는 miR-320c 증가가 Chk1 조절을 통해 DNA 손상 축적을 유도한다는 결과를 나타낸다. (A) 음성 대조군 모방체(NC) 또는 miR-320c 모방체(miR-320c)의 형질감염 및 옥살리플라틴 처리 후, MDA-MB-231의 대표 이미지를 나타낸다. 핵(DAPI; 파랑) 및 수선되지 않은 DNA 손상(감마-H2AX; 빨강)을 확인하기 위해 각 샘플을 염색하였다. (B) 손상된 세포의 백분율을 나타낸 결과이다. (C) 250μM 옥살리플라틴 또는 3'DW로 1시간 동안 처리하고, 48시간 동안의 수선 기간이 지난 후, MDA-MB-231 세포에 대해 알칼라인 코멧 분석을 수행한 결과를 나타낸다. (D) 현미경을 이용하여 측정한 테일 모멘트(Tail moments) 결과를 나타낸다. (E) MDA-MB-231 세포에서 RAD51 foci 형성에 대한 대표 이미지를 나타낸다. (F) 각 세포당 foci 수를 나타낸다.
도 5는 시험관 내에서(in vitro) 상향조절된 miR-320c는 Chk1 조절을 통해 집락 형성 생존을 억제한다는 결과를 나타낸다. (A-B) 옥살리플라틴으로 처리한 MDA-MB-231(TNBC) 및 MCF7(non-TNBC) 세포를 나타낸다. 콜로니 염색은 크리스털 바이올렛 염색을 수행하였다. (C) TaqMan 정량적 RT-PCR을 이용한 HS578T 안정화 세포주에서의 miR-320c 발현 수준을 나타낸다. CON-GFP; 대조군 miRNA 과발현된 HS578T 안정화 세포주, 320C-GFP; miR-320c 과발현된 HS578T 안정화 세포주. RNU48을 내재성 대조군으로 사용하였다. (D) HS578T miRNA 과발현 안정화 세포주에서 Chk1의 웨스턴블랏 분석 결과를 나타낸다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (E-F) CON-GFP, 320c-GFP 세포를 6웰에 접종한 후(1000 세포/웰), 옥살리플라틴을 처리한 결과를 나타낸다. 콜로니 염색은 크리스털 바이올렛 염색을 수행하였다.
도 6은 생체 내에서(in vivo) miR-320c 모방체가 약물 반응을 하향조절한다는 결과를 나타낸다. (A) 이종이식 종양에서 Chk1 발현을 측정하기 위해 사용한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다. 핵(DAPI; 파랑) 및 Chk1(녹색)을 확인하기 위해 각 샘플을 염색하였다. (B) NC 모방체- 및 3'DW-처리, NC 모방체- 및 옥살리플라틴 처리, miR-320c 모방체- 및 3'DW-처리와, miR-320c 모방체- 및 옥살리플라틴 처리한 이종이식 마우스 종양으로부터 얻은 Chk1 염색 ICC 세기 점수를 나타낸다. (C) MDA-MB-231/A 세포를 누드 마우스 피하에 투여한 후, 음성 대조군 모방체(NC) 및 miR-320c 모방체를 종양에 투여한 결과를 나타낸다. (D) 각 그룹의 종양 크기를 나타낸다. (E) 마우스를 희생시킨 후, 측정한 종양 무게를 나타낸다. (F) 마우스를 희생시키기 전, 측정한 각 그룹의 몸무게를 나타낸다. (G-H) γ-H2AX 측정을 위한 면역조직화학 염색 결과 및 γ-H2AX 양성 세포의 백분율 히스토그램을 나타낸다. 핵(DAPI; 파랑) 및 γ-H2AX(빨강)을 확인하기 위해 각 샘플을 염색하였다. γ-H2AX; gamma-H2A histone member X. (I) TNBC에서 miR-320c에 의해 조절되는 CHEK1에 대한 모식도를 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 miR-320c가 CHEK1 발현 및 DDR을 조절함으로써, 옥살리플라틴에 대한 TNBC의 반응성을 향상시킨다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 miR-320c를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "miR-320c"는 miRBase accession no. MIMAT0005793 일 수 있고, 구체적인 서열은 서열번호 1(AAAAGCUGGGUUGAGAGGGU)로 기재하였다.
또한, 본 발명은 miR-320c의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는 상기 miR-320c의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 miR-320c에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 시료로부터 miR-320c의 발현수준을 측정하는 단계; (2) 상기 측정된 miR-320c의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 miR-320c의 발현수준이 대조군 시료보다 높을 경우 백금계 항암제에 대한 민감성을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 miR-320c의 발현수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 또는 단백질 칩을 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "삼중음성유방암 환자에서 분리된 시료"란 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 반응성 예측용 바이오마커인 상기 miR-320c의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "백금계 항암제에 대한 반응성 예측"이란, 환자가 백금계 항암제에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응할지 여부를 예측하는 것, 또는 백금계 항암제에 대한 내성의 위험성을 예측하는 것, 백금계 항암제에 대한 치료 후 환자의 예후 즉, 재발, 전이, 생존, 또는 무병생존 등을 예측하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 miR-320c, miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제는 miR-320c에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 앱타머 또는 항체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 조성물은 체크포인트 키나제 1(Checkpoint kinase 1; CHEK1)의 발현을 억제시키고, 삼중음성유방암 세포의 세포사멸을 증가시켜, 백금계 항암제에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 miR-320c에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 miR-320c, miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제에 대한 항암 효과 증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 유기산, 인산염, 항산화제, 유당 카제인, 덱스트린, 포도당, 설탕 및 솔비톨로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 유기산은 이에 제한되는 것은 아니지만 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 또는 사과산일 수 있으며, 인산염은 이에 제한되는 것은 아니지만 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염 또는 폴리인산염(중합인산염)일 수 있으며, 항산화제는 이에 제한되는 것은 아니지만 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산 또는 피틴산 등의 천연 항산화제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 건강식품은 상기 유효성분 이외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 일실시예에 따른 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 건강식품의 제형은 이에 제한되는 것은 아니지만 고형, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강식품은 이에 제한되는 것은 아니지만 과자류, 당류, 아이스크림 제품류, 유가공품, 식육제품, 어육제품, 두부류 또는 묵류, 식용유지류, 면류, 다류, 음료류, 특수영양식품, 건강보조식품, 조미식품, 얼음, 인삼제품류, 김치절임식품, 건포류, 과일, 야채, 과일 또는 야채의 건조제품, 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스, 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등의 식품의 제조에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 miR-320c, miR-320c 발현 촉진제 또는 활성화제; 및 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 백금계 항암제를 유효성분으로 포함하는 miR-320c의 발현이 증가된 환자의 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 삼중음성유방암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 삼중음성유방암 세포에서 miR-320c의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 miR-320c의 발현 수준이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 백금계 항암제에 대한 민감성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 miR-320c의 발현 수준이 증가된 삼중음성유방암 환자를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 삼중음성유방암 환자에게 백금계 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암 치료방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백금계 항암제는 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포 배양
HEK293T, SK-BR-3, MCF7, MDA-MB-468, HS578T 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, WelGENE, South Korea)에서 배양하였고, MDA-MB-231, BT-20, HCC-1937, ZR-75-1, BT-549, T47D 세포는 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (RPMI, WelGENE)에서 배양하였다. 배양 배지에는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)(Gibco, Carlsbad, CA, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(WelGENE)이 첨가되었다. MCF-10A 세포는 5% 말 혈청(Invitrogen) 내 DMEM:F12 (1:1)로 이루어진 성장 배지에서 배양하였고, 20 ng/mL EGF, 0.5 mg/mL 하이드로코르티손(hydrocortisone), 100ng/mL 콜레라 독소(cholera toxin) 및 10ug/mL 인슐린(Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 모든 세포주는 37℃, 5% CO2 대기 조건 하에서 배양하였다. 또한, 모든 세포주는 2018년 DNA 핑거프린팅 분석(Korean Cell Line Bank)에 사용되었다.
2. miRNA 모방체(mimics)의 형질감염
miRVanaTM miR-320c mimic (Ambion, USA)은 제조사의 지시에 따라 siPORTTM NeoFXTM transfection agent (Ambion, USA)를 이용하여, 30nM의 최종농도로 역-형질감염시켰다. 실험 대조군으로는 miRVanaTM miR-negative control mimic (Negative control #1, Ambion, USA)을 형질감염시켰다.
3. 렌티바이러스 벡터 형질도입
HS578T 및 MDA-MB-231 세포에서 miR-320c를 안정적으로 과발현시키기 위해 miRNA 렌티바이러스 벡터를 사용하였다. miR-320c 과발현 구조체 및 관련 음성 대조군 구조체는 Abm® (Richmond)로부터 구입하였다. 바이러스의 생산을 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 상기 구조체 및 lentiviral packaging vector (Abm®) by lentifectin (Abm®)로 HEK293T 세포를 형질감염시켰고, 바이러스들은 형질감염 48시간 후에 수집되었다. 스핀-감염(spin-fection) 방법을 통해, HS578T 및 MDA-MB-231 세포는 miR-320c 과발현 바이러스 또는 음성 대조군 바이러스로 감염시켰고, 퓨로마이신(puromycin)(Sigma) 및 GFP를 통해 선별하였다. 감염된 세포들의 miR-320c 발현 수준은 miRNA 발현 분석을 통해 확인하였다. 생산된 안정화 세포주는 10% 우태아혈청(FBS, Gibco) 및 퓨로마이신(1μg/ml)(Sigma)이 첨가된 DMEM (WelGENE)에서 배양하였다.
4. 총 RNA 분리 및 miRNA RT- PCR
miRNA-마이크로어레이를 위해, 제조사의 지시에 따라 Trizol® (Ambion, USA)을 사용하여, 총 RNAs를 분리하였다. 본 발명자들은 miRNeasy RNA isolation kit (Qiagen)를 사용하여, 배양된 세포로부터 miRNA 및 다른 작은 RNAs를 포함하는 총 RNA를 추출하였다. 500ng의 총 RNA는 TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)으로 역전사시켰다.
5. 정량적 RT- PCR ( qRT - PCR )
miRNA 발현 분석을 위한 정량적 RT-PCR은 LightCycler® System (Roche)을 이용하여 Taqman® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 수행하였고, RNU48은 내부 대조군으로 사용되었다. PCR 조건은 다음과 같다. 전-반응 과정(95℃, 10분) 및 증폭 과정(95℃, 10분 및 60℃, 30초) 45회이다.
정량적 RT-PCR을 위한 mRNAs는 NucleoSpin® RNA/Protein kit (MACHEREY-NAGEL)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 추출하였다. M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, USA), 10pM oligo-dT, 2.5nM dNTP mixture 및 RNAse inhibitor를 사용하여, 5ug mRNAs를 역전사시켰다. 100ng cDNA가 주형으로 사용되었고, SYBR Green qPCR Master Mix (PCR Biosystem, London, UK) 및 LightCycler® System (Roche)을 이용하여, qPCR을 수행하였다. 각각의 표적 유전자는 특이적인 프라이머를 사용하여 검출하였다. 표적 유전자 또는 miRNA의 상대 발현 수준은 2^(-ΔΔCq) 방법에 따라 계산되었고, 내재성 대조군으로 사용되는 18s rRNA 또는 RNU48의 수준으로 표준화시켰다.
6. 웨스턴 블랏팅
NucleoSpin® RNA/Protein kit (MACHEREY-NAGEL) 및 RIPA 완충액을 이용하여, 단백질을 정제하였다. 단백질 함량은 Bicinchoninic acid Solution (Sigma) 및 Copper (Ⅱ) sulfate solution (Sigma)을 사용하여 측정하였다. 단백질은 15% 또는 8% SDS-PAGE 젤에서 분리하였다. 웨스턴 블랏팅은 표준 방법으로 수행하였다. 본 발명에서 사용된 1차 항체는 Chk1 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 β-액틴 (Bethyl laboratories, USA)이었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 면역반응성 단백질은 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase)-접합 2차 항체 및 향상된 화학발광 시약, EzWestLumi plus (ATTO, JAPAN)로 검출하였다.
7. 듀얼 - 루시퍼라제 리포터 분석
예상 miR-320c 시드 서열을 포함하는 인간 CHEK1 3'UTR은 PCR을 통해 MDA-MB-231 cDNA로부터 증폭하였다. 또한, 돌연변이 시드 서열을 포함하는 각 유전자의 3'UTR을 증폭하였다. 증폭된 PCR 단편들은 In-fusion® HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, USA)를 사용하여 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega, USA) 내로 클로닝하였다. Lipofectamine 2000 reagents (Invitrogen)를 사용하여, 상기 루시퍼라제 구조체들은 miR-320c 모방체 또는 miR-NC 모방체와 함께 HEK293T 세포 내로 동시-형질감염되었다. Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)을 사용하여 제조사의 지시에 따라, 48시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
8. 면역형광 현미경 분석
커버슬립 상에 배양된 세포들을 10% Neutral Buffered Formalin (Biosesang)으로 10분 동안 고정시켰다. 그 후, 세포를 15분 동안 투과시켰고, Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody (merckmillipore) 또는 Anti-Rad51 antibody(Abcam)로 4℃에서 밤새도록 배양하였다.
이종이식된 종양 파라핀 절편을 사용하였다. 우선, 슬라이드들은 Histoclear, 100%, 95%, 80% 및 70% 에탄올에서 순서대로 재수화시켰다. 그 후, TintoRetriver Pressure Cooker (Bio SB) 및 Borg Decloaker RTU (Biocare medical)를 사용하여 제조사의 지시에 따라, 항원 복구를 진행하였다. 슬라이드들을 차단 시킨 후, Chk1 Antibody(Abcam) 또는 Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody (merckmillipore)로 4℃에서 밤새도록 배양하였다.
다음날, Alexa Fluor 594-접합된 2차 항체로 2시간 동안 반응시켰다. 또한, 핵을 가시화하기 위해서, 세포를 DAPI로 염색하였다. 최종적으로, 슬라이드들을 mounting solution (Dako)으로 마운팅하였다. 이미지들은 Confocal Laser Scanning Microscope (LSM 700, Zeiss)로 가시화시켰고, 각각의 이미지들은 동일한 노출 세팅으로 캡쳐하였다. γ-H2AX 및 RAD51 foci 형성은 i-Solution software (iMTechnology)로 분석하였고, Chk1 세기는 image J software (NIH)로 분석하였으며, 약간 다른 z-평면 초점에 따른 영향을 줄이기 위해서 DAPI 세기로 표준화시켰다.
9. 알칼라인 코멧 분석(Alkaline Comet assay)
DNA 손상은 옥살리플라틴 처리를 통해 유도하였다. 고체 옥살리플라틴 스톡은 Sigma Aldrich로부터 구입하였고, H2O에 녹여 10mM로 제조하였다. DNA 손상은 Alkaline comet assay kit를 통해 제조사의 프로토콜(4250-050-K, Trevigen)에 따라 검출하였다. 간단히 설명하면, 1×105/ml의 트립신화된 세포와 37℃에서 녹인 LMAgarose를 1:10 (v/v)의 비율로 혼합하였다. 이후, 혼합물을 4℃에서 10분 동안 CometSlides 상에 포매시켰다. 슬라이드는 4℃에서 밤새도록 Lysis Solution에 담가놓았다. 다음날, 슬라이드는 암소에서 4℃, 1시간 동안 alkaline Unwinding Solution에 담가놓았다. 그 후, 30분 동안 전기영동을 수행하였다. 다음으로, 슬라이드를 씻어냈고, SYBR로 30분 동안 염색하였다. 이미지들은 공초점 현미경(Nikon)으로 얻었다. 분석은 KORMED에 의뢰하였다.
10. 집락 형성 분석( Clonogenic assay)
약물에 대한 유효성을 측정하기 위해서, 다음의 방법으로 집락 형성 분석을 수행하였다. 0.5 - 1×103/ml 세포를 6-웰 플레이트 상에 접종하였다. 이후, 옥살리플라틴(Sigma)을 각 농도별로 처리하였다. 대조군 플레이트에서 세포가 적당한 크기의 콜로니를 형성할 때까지(적어도 콜로니 당 50개 세포), 세포를 CO2 배양기에서 37℃로 1-3주 동안 배양하였다. 배양 후, 세포들을 고정시켰고, 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액(10% 에탄올 포함)으로 염색하였다.
11. 세포사멸 분석( FACS )
준비된 세포들은 트립신화하였고, PBS로 씻어냈다. 이후, 세포들을 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen™)의 1×Binding Buffer 100μl에 현탁시켰고, FITC 및 Pi로 염색하였다. 그리고 나서, 세포들을 유세포 분석기(FACS Canto II, BD)로 분석하였다. 각 샘플마다 총 30,000 세포를 계수하였다. miR-320c 과발현된 안정화 세포주를 GFP 태그하였고, Sub-G1 분석을 수행하였다. 준비된 세포들은 트립신화하였고, PBS로 씻어냈다. 이후, 세포들을 500μl PBS에 현탁시켰고, 차가운 70% 에탄올로 밤새도록 고정시켰다. 다음날, 고정된 세포들을 PI/RNase Staining Buffer (BD Pharmingen™)로 염색하였고, 유세포 분석기(FACS Canto II, BD)로 분석하였다. 각 샘플마다 총 10,000 세포를 계수하였다. sub-G1 개체를 세포사멸 세포로 가정하였다.
12. 이종이식 마우스 & 종양 내 miRNA 형질감염
모든 동물 실험은 연세대학교 의과대학의 임상시험심사위원회에 의해 승인되었고, 대학의 실험동물 사용과 관리에 대한 가이드라인(2018-0155)에 따라 특별한 무-병원균 시설에서 수행하였다. 8주령 암컷 Balb/c-nude Mice (Orient, Seongnam, Korea)를 100 μL의 saline/zoletil/rompun (7:1:1)로 마취시킨 후, 옆구리에 피하로 2.0×106 MDA-MB-231/A 세포를 접종하였다. 2주 후, 종양의 평균 부피가 100 내지 150 mm3에 이르면, 마우스에 합성 miRNA를 종양 내 주입하였고, 옥살리플라틴(Tocris Bioscience) 또는 3'DW를 복막(intraperitoneal; i.p) 투여하였다. 50 μL PBS에 녹인 1.6 μL siPORT™ NeoFX™ Transfection Agent (Ambion)와 혼합된 여러 형태의 합성 miRNA (miR-320c/miR-NC) (6.25 μg)는 각 종양에 대하여 3-5일 간격으로 종양 내로 전달되었다. 그리고, 3'DW 또는 옥살리플라틴은 3-5일 간격으로 i.p 투여(2mg/kg) 되었다. 종양 형성이 확인된 시점부터 실험종료까지, 3 내지 5일 간격으로 칼리퍼를 사용하여 매번 종양 크기를 측정하였고, 종양 부피는 다음의 식으로 계산하였다. 길이 × 너비2 × 0.5. 마우스는 과량의 마취제로 희생시켰고, 면역조직화학 분석 및 다른 분석을 위해 종양을 수확하였다.
13. 통계 분석
독립적 실험에 대한 데이터는 평균±SEM으로 나타냈다. 통계 분석을 위해 GraphPad Prism 5 software (GraphPad, USA)를 사용하여, Student's t-test를 수행하였다. 대조군 대비 <0.05의 P-수치는 통계적 유의성이 있다고 판단하였다. 별표는 독립적인 샘플 t-test에 대하여 측정한 통계적 유의성을 나타낸다. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
< 실시예 1> TNBC에서 조절이상을 나타내는 microRNA -320c의 발현
TNBC에서 miRNA 조절을 확인하기 위한 시도로, 본 발명자들은 도 1에 나타낸 방법에 따라 실험을 수행하였다. 우선, 본 발명자들은 TNBC 환자 조직 microRNA 마이크로어레이 데이터를 사용하였고, 인접 정상 조직과 비교하여 TNBC 조직에서 하향-조절되는 miRNAs 그룹을 확인하였다(도 1B). 이 중에서, miRNA-320c의 발현이 TNBC에서 상당히 감소되어 있다는 것을 확인할 수 있었다. 일관성 있게, 본 발명자들이 유방암 세포주에서 miR-320c 발현을 확인했을 때, 정상 유방암 세포주 MCF10A 뿐만 아니라, 비-TNBC 유방암 세포주에 비해서도 TNBC에서 miR-320c 발현이 감소된 것을 관측하였다(도 1C). 또한, 상기 결과들을 일반화하기 위해서, GEO dataset 분석을 수행하였다. 그 결과, miR-320c의 발현 수준은 다른 비-TNBC 서브타입에 비해 TNBC 서브타입에서 감소하였다(도 1D). 추가적으로, 유방암 환자 데이터를 사용하여, Kaplan-Meier 분석을 수행하였다. TNBC 환자군에서만, 낮은 hsa-miR-320c 발현이 관측되었는데, 이는 낮은 전체 생존율과 유의적 연관성을 갖는다(도 1E). 이뿐 아니라, TCGA pan-cancer atlas data를 이용한 Kaplan-Meier 분석에서도 낮은 miR-320c 발현과 낮은 생존율 간의 유의적 상관관계를 나타내는 유방암 포함 5개의 암 타입을 확인하였다. 종합하면, 상기 결과는 TNBC에서 miR-320c가 하향조절되며, 이는 암에서 잠재적 마커가 될 수 있다는 것을 나타낸다.
< 실시예 2> miR -320c에 의해 직접 표적되는 CHEK1
miR-320c의 표적 유전자들을 밝히기 위해서, mRNA 마이크로어레이 데이터의 삽입 분석을 진행하였다. 또한, TargetScan (http://www.targetscan.org)을 이용하여, 보존된 miR-320c-결합 서열이 존재하는 847개의 후보 유전자를 발굴하였다. 그 결과, 본 발명자들은 7개의 후보 유전자를 선별하였는데, 이는 miR-320c 발현에 유의성 있게 음성 상관관계를 나타냈고, 3'UTR에 miR-320c 표적 서열을 갖는 것으로 miRDB을 통해 예측되었다(도 2A). 상기 결과를 확인하기 위해서, TCGA dataset (Cancer Genome Atlas, 2012)를 이용하였는데, TNBC에서 CHEK1 발현은 상당히 증가되었다(도 2B). 추가적으로, METABRIC dataset에서도 다른 유방암 서브타입에 비해 TNBC에서 CHEK1은 상향조절되었다(도 2C).
또한, CHEK1은 122개의 유전자 후보군에 포함되었는데, 이는 4개의 데이터베이스 모두에서 공통적으로 miR-320c의 표적으로 예측되고, miR-320c-결합 서열이 존재하는 것으로 나타났다. miR-320c 표적 예측 유전자들의 리스트를 얻기 위해서, 4개의 표적 예측 데이터베이스인 TargetScan (Agarwal et al, 2015), miRwalk 2.0 (Dweep & Gretz, 2015), DIANA-microT web server v5.0 (Paraskevopoulou et al, 2013; Reczko et al, 2012) 및 miRDB (Liu & Wang, 2019; Wong & Wang, 2015)를 사용하였다. 또한, GSE 세포주 데이터에 있어서, CHEK1의 mRNA 발현 수준은 TNBC 세포주에서 전체적으로 증가하는 경향을 나타냈다(도 2D). 추가적으로, Chk1 단백질 수준도 TNBC 세포주에서 증가하는 경향을 나타냈다(도 2E). 더구나, cBioPortal을 통해, TCGA pan-cancer data(Cancer Genome Atlas Research et al, 2013)를 사용하여, CHEK1 mRNA 발현 분석을 수행하였다. 유방암 서브타입은 pam50을 통해 분류하였다. 그 결과, 낮은 miR-320c 발현을 보여 낮은 생존율을 가진 4개 타입 암에서의 CHEK1 mRNA 수준이 유방에서와 유사한 것을 확인하였다.
다음으로, 본 발명자들은 TNBC 세포주에서 miR-320c 과발현에 의해 CHEK1이 조절되는지 확인하였다. 어떤 유전자가 miR-320c의 표적 유전자인지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 miR-320c 결합 시드 서열 영역이 포함된 CHEK1 3'UTR 구조체를 사용하여 듀얼 루시퍼라제 분석을 수행하였다. microRNA의 표적 인지능은 표적의 3'UTR 영역 내 시드 서열에 의존적이다. miR-320c 서열과, TargetScan을 이용하여 얻어낸 CHEK1 3'UTR 내 miR-320c의 상보적 시드 서열 영역 각각을 도 2F에 표시하였다. 야생형 CHEK1 3'UTR 구조체의 루시퍼라제 활성은 miR-320c 과발현에 의해 크게 약해졌다. 하지만, 돌연변이 타입의 CHEK1 3'UTR 구조체는 모두 루시퍼라제 활성이 억제되지 않았다(도 2G). 다음으로, 본 발명자들은 miR-320c 모방체로 형질감염된, 3종의 TNBC 세포주(MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 HS578T)를 사용하였다. miR-320c가 과발현되면(도 2H), 예상대로 3종의 모든 TNBC 세포주에서 CHEK1의 mRNA 및 단백질 발현이 억제되었다(도 2I 및 도 2J). 종합하면, TNBC 조직 및 TNBC 세포주에서 CHEK1은 miR-320c mRNA 및 단백질과 유의성 있는 음성 상관관계를 나타냈고, miR-320c에 의해 조절된다는 것을 나타냈다.
< 실시예 3> miR -320c의 상향조절시 CHEK1 조절을 통해 세포사멸 증가
또한, 본 발명자들은 miR-320c가 CHEK1을 조절하여 DNA 손상 반응을 조절하는지 확인하고자 하였다. 이전 연구에서, Chk1은 체크포인트, DNA 수선 및 세포사멸에 관여하는 다양한 유효인자들의 인산화에 작용하는 것으로 알려졌다. 한편, Chk1는 DNA 손상에 대한 caspase-2 세포사멸 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌다. DNA 손상을 유도하기 위해서, 본 발명자들은 백금계 화합물인 옥살리플라틴을 사용하였다. 우선, 본 발명자들은 CHEK1-상향 조절되고, miR-320c-하향 조절된 MDA-MB-231 세포가 반대되는 발현 패턴을 나타내는 MCF7 유방암 세포에 비해 낮은 세포사멸을 나타내는지 확인하였다. 세포사멸을 관측하기 위해서, 본 발명자들은 FITC 및 PI로 염색하여 FACS 분석을 수행하였다. 옥살리플라틴을 처리하면, MDA-MB-231 세포는 MCF7에 비해 낮은 세포사멸 세포군을 나타냈다(도 3A 및 도 3B). 다음으로, 본 발명자들은 이소성 miR-320c가 CHEK1의 발현을 조절하여 세포사멸을 유도할 수 있는지 FITC 및 PI 염색과 함께 FACS 분석하여 확인하였다. miR-320c 모방체 형질감염을 통해, miR-320c를 성공적으로 증가시켰는데(도 3C), 옥살리플라틴 처리와 miR-320c 모방체 형질감염을 진행한 경우, TNBC 세포주에서 세포사멸된 세포군이 가장 많아졌다(도 3D 및 도 3E). 또한, 상기 결과를 확인하기 위해서, CHEK1 siRNA를 사용하였다. 유사하게, siRNA에 의해 CHEK1을 성공적으로 감소시켰는데(도 3F), 옥살리플라틴 처리 및 CHEK1 녹다운을 동시에 진행한 경우, MDA-MB-231 TNBC 세포에서 가장 효과적으로 세포사멸을 유도하였다(도 3G 및 도 3H). 종합하면, TNBC 세포에서 miR-320c는 CHEK1의 발현을 억제함으로써 세포사멸을 유도한다는 것을 확인하였다.
< 실시예 4> miR -320c 상향조절시 CHEK1 발현을 억제하여 DNA 손상 축적 유도
또한, DNA 손상은 Chk1을 통한 RAD51 인산화에 의해 상동 재조합 수선(Homologous recombinant repair; HRR)을 유도한다. Chk1이 억제되면, DNA 손상은 수선될 수 없고, 세포에 축적된다. 본 발명자들은 옥살리플라틴 유도된 DNA 손상 수선에 있어, CHEK1 발현을 조절함으로써 miR-320c의 역할을 확인하고자 하였다. 본 발명자들은 MDA-MB-231 TNBC 세포에 고농도 옥살리플라틴을 1시간 동안 처리하였고, 이후 48시간의 수선 기간을 두었다. 수선되지 않은 DNA 손상을 검출하기 위해서, 본 발명자들은 DNA 이중-나선 절단 마커인 γ-H2AX(H2AX 인산화)로 면역세포화학(immunocytochemistry; ICC) 염색을 수행하였다. 옥살리플라틴을 처리한 MDA-MB-231 세포에서는 DNA 손상이 유도되었고, γ-H2AX foci가 증가되었다. 추가적으로, miR-320c 과발현 세포에서는 더욱 손상된 것을 관측하였다(도 4A 및 도 4B).
상기 결과를 검증하기 위해서, 본 발명자들은 MDA-MB-231 및 HS578T TNBC 세포에서 DNA 손상에 의해 유도되는 DNA 절단을 검출하기 위해, 알칼라인 코멧 분석을 수행하였다. miR-320c 모방체 또는 음성 대조군(negative control; NC) 모방체로 세포들을 형질감염시켰다. 그 결과, 옥살리플라틴을 처리하면, NC 모방체 형질감염된 세포에 비해 miR-320c 모방체 형질감염된 세포에서 DNA 손상이 증가하는 것으로 나타났다(도 4C 및 도 4D). 또한, CHEK1 siRNA로 CHEK1를 녹다운시킨 경우에도 동일한 경향이 나타났다.
이에 더해, 본 발명자들은 DNA 손상 사이트에 수집된 RAD51을 검출하기 위해서, RAD51 항체로 ICC 염색을 수행하였다. 옥살리플라틴을 처리하면, RAD51 foci 형성이 증가되었다. 다만, 옥살리플라틴 처리된 TNBC 세포에서의 miR-320c 모방체 형질감염은 RAD51 foci의 감소를 유도하였다(도 4E 및 도 4F). 또한, RAD51 foci 형성 감소는 CHEK1-siRNA 형질감염된 TNBC 세포에서도 확인되었다. 상기 결과는 TNBC 세포에서 miR-320c의 상향조절이 CHEK1을 억제하여, 옥살리플라틴 유도된 DNA 손상의 HRR을 억제한다는 것을 나타낸다.
< 실시예 5> TNBC 세포에서 시험관 내(in vitro) miR -320c 상향조절시 Chk1 조절을 통한 약물 반응성 증가
본 발명자들은 miR-320c가 CHEK1 발현을 조절하여 옥살리플라틴에 대한 반응성에 영향을 줄 수 있는지 확인하고자 하였다. 이에, 시험관 내(in vitro)에서 옥살리플라틴 반응성을 측정하기 위한 집락 형성 분석을 수행하였다. 우선, CHEK1 및 miR-320c의 발현 패턴이 다르게 나타나는 2종의 다른 유방암 세포를 사용하여 옥살리플라틴의 유효성을 비교하였다. 이전 결과와 일치하게, MDA-MB-231 세포에 비해 MCF7 세포는 옥살리플라틴에 더욱 효과적이었다(도 5A 및 도 5B). 이후, miR-320c 조절이 옥살리플라틴에 대한 반응성을 증가시키는지 확인하기 위해서, miR-320c 발현을 증가시킨 HS578T 안정화 세포주를 집락 형성 분석에 사용하였다(도 5C 및 도 5D). 도 5E 및 도 5F에 나타낸 바와 같이, miR-320c 발현 증가는 콜로니 형성을 억제하였다. 결론적으로, miR-320c 조절 증가는 Chk1을 조절하는데, TNBC 세포주에서 세포사멸 및 DNA 손상을 조절하여 옥살리플라틴에 대한 반응성을 증가시킨다.
< 실시예 6> 생체 내(in vivo ) miR -320c 상향조절시 Chk1 조절을 통한 약물 반응성 증가
시험관 내(in vitro) 연구를 기초로, TNBC에서 miR-320c 상향조절과 옥살리플라틴 처리로 인해 세포사멸 및 DNA 손상 수선에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 생체 내(in vivo) 이종이식(xenograft) 모델을 제작하였다. 우선, 이종이식 마우스 모델을 제작하기 위하여, MDA-MB-231/A 세포를 누드 마우스 피하로 투여하였다. 종양이 형성되었을 때, 옥살리플라틴(i.p) 및 miR-320c 모방체(종양 내)를 처리하였다. 종양 부피는 3-5 일마다 측정하였다. 3주 후, 마우스를 희생시켰고, 이종이식 종양을 얻어냈다.
먼저, miRNA 모방체의 종양 증식 억제 효과가 Chk1을 하향-조절에 의한 것인지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 면역형광(Immunofluorescence; IF)을 사용하여 Chk1 수준을 측정하였다. miR-320c 모방체 투여에 의해 Chk1 수준은 상당히 하향-조절되었고(도 6A 및 도 6B), miR-320c 모방체 처리된 그룹의 종양 평균 부피는 NC 모방체 처리된 그룹에 비해 낮았다. 또한, miR-320c 모방체와 옥살리플라틴을 모두 처리한 그룹의 종양 부피는 다른 그룹에 비해 가장 낮았다(도 6C 및 도 6D). 추가적으로, 이러한 경향은 종양 무게에서도 관측되었다(도 6E). 하지만, 각 그룹 간 몸무게 비교 결과, 유의성 있는 차이는 나타나지 않았다(도 6F). 더구나, 감마 H2AX 수준은 miR-320c 모방체 및 옥살리플라틴을 둘 다 처리한 종양 그룹에서 상당히 증가하였다(도 6G 및 도 6H). 상기 결과를 종합하면, 모방체 투여에 의한 miR-320c의 상향조절은 옥살리플라틴 처리 효과를 향상시켰다.
본 발명자들은 TNBC에서 CHEK1의 새로운 조절 기작에 있어 miR-320c의 역할을 밝혀냈다(도 6I). 옥살리플라틴을 TNBC 세포에 처리하면, DNA 손상 유도를 통해 CHEK1은 성공적으로 활성화되었다. 활성화된 Chk1은 DNA 손상 유도된 세포사멸 반응을 억제시켰고, DNA 수선을 위한 DNA 손상 사이트로의 RAD51 모집에 관여하였다. 하지만, miR-320c 모방체에 의해 miR-320c가 과발현되면, Chk1은 충분히 번역될 수 없었다. 그 결과, miR-320c 발현이 적은 TNBC 세포에 비해 miR-320c를 상향조절시킨 TNBC 세포에서 세포사멸이 증가하고, RAD51 모집이 감소하는 것으로 나타났다. 이는 DNA 수선을 약화시켰고, DNA 손상을 축적시켰다. 종합하면, miR-320c 상향조절은 TNBC 세포를 옥실리플라틴에 더 민감하게 만들었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, SOOKMYUNG WOMEN'S UNIVERSITY <120> Biomarker composition for predicting drug responsiveness to platinum-based anti-cancer agents in triple negative breast cancer comprising miR-320c <130> ADP-2019-0272 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaaagcuggg uugagagggu 20

Claims (19)

  1. miR-320c를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암(Triple Negative Breast Cancer; TNBC) 환자의 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 반응성 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 삭제
  3. miR-320c의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 반응성 예측용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 miR-320c의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 miR-320c에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 반응성 예측용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제3항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 반응성 예측용 키트.
  7. (1) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 시료로부터 miR-320c의 발현수준을 측정하는 단계;
    (2) 상기 측정된 miR-320c의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 측정된 miR-320c의 발현수준이 대조군 시료보다 높을 경우 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 민감성을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 삭제
  9. miR-320c 또는 이의 miRNA 모방체(mimic)를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 항암 효과 증진용 약학 조성물.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 체크포인트 키나제 1(Checkpoint kinase 1; CHEK1)의 발현을 억제시키고, 삼중음성유방암 세포의 세포사멸을 증가시켜, 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 민감성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 항암 효과 증진용 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. miR-320c 또는 이의 miRNA 모방체(mimic)를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 환자의 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 항암 효과 증진용 건강기능식품 조성물.
  14. miR-320c 또는 이의 miRNA 모방체(mimic); 및 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 삭제
  16. 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)를 유효성분으로 포함하는 miR-320c의 발현이 증가된 환자의 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 삭제
  18. (1) 삼중음성유방암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 삼중음성유방암 세포에서 miR-320c의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 miR-320c의 발현 수준이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 백금계 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)에 대한 민감성 증진제 스크리닝 방법.
  19. 삭제
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