JPWO2016047688A1 - 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも高い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
(2) 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベル、並びに、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体におけるSIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも高く、かつ前記被検体におけるFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
(3) (1)又は(2)に記載の方法により、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための薬剤であって、下記(a)〜(d)から選択される少なくとも1の化合物を含む薬剤
(a)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド、
(b)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド、
(c)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、
(d)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体。
後述の実施例において示す通り、網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析により、扁平上皮がんの化学放射線療法による治療の予後(生存率)に相関したサブタイプの同定を行った。その結果、得られた予後良好なサブタイプにおいて、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子が高発現していることが明らかになった。したがって、本発明は、下記工程(a)〜(c)を含む、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法を提供する。
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも高い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベル、並びに、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体におけるSIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも高く、かつ前記被検体におけるFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
上述の通り、本発明の評価方法においては、SIM2共発現遺伝子群等の発現レベルをmRNA(転写産物)レベル又は蛋白質(翻訳産物)レベルにて検出することにより、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価することができる。したがって、本発明は、上述の評価方法により、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための薬剤であって、下記(a)〜(d)から選択される少なくとも1の化合物を含む薬剤を提供する。
(a)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド、
(b)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド、
(c)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、
(d)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体。
扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価する方法を開発するため、網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析により、扁平上皮がんの化学放射線療法による治療の予後に相関したサブタイプの同定を行った。
Agilent Technologies社の遺伝子発現解析アレイのデータマイニングソフトGeneSpringを用い、生物学的な意義を持ってCRT感受性サブタイプ−7と非感受性サブタイプ−5を分類できる遺伝子セットの選抜と、それら遺伝子を用いた再分類を、以下のA)〜C)の手順で行った。
サブタイプ−7と−5に分類後、両方のサブタイプに属する一部のサンプルは、どちらのサブタイプにも属さないこととし、純サブタイプ−7、純サブタイプ−5、及び、その他に分類した(図3 参照)。
〔3〕で分類された純サブタイプ−7、純サブタイプ−5、及び、それ以外について、CRT治療2ヵ月後の完全寛解率、生存曲線、及び5年生存率を比較した(表15、図4 参照)。さらに外科的切除(手術)施行65例についても同様にサブタイプ分類を行い、生存曲線と5年生存率を比較した(図4 参照)。
SIM2遺伝子の分化誘導活性を評価するため、理化学研究所BRC又はJCRBから入手した食道扁平上皮がん由来細胞株KYSE510、TE8へ、Lipofectamin(登録商標) 2000(Invitrogen社)を用い、pCMV−AC−GFPプラスミドベクターに連結されたSIM2遺伝子cDNAを一過的に導入した。対照群として、pCMV−neoプラスミドベクターを一過的に導入した。通常培地(RPMI1640又はDMEM、10%FBS)で1日間培養した後に、NanoCulture(登録商標) Plate (SCIVAX社)に播種し、通常培地で3日間培養した。total RNAを抽出し定量的RT−PCR法にて遺伝子の発現量を測定した。cDNAは、SuperScript(登録商標) III First−Strand Synthesis System for RT−PCR (Invitrogen社)に従い作製した。希釈したcDNAは、iQTM SYBER(登録商標) Green Supermix(BIO−RAD社)、プライマー及びヌクレアーゼフリー水と混合し、MyiQ(登録商標)(BIO−RAD社)により定量した。表13にプライマーの塩基配列を示す。その結果は図5に示した。
SIM2遺伝子安定発現株のシスプラチン(CDDP)、5−フルオロウラシル(5FU)、ドセタキセル(DTX)への感受性を評価するため、抗がん剤感受性試験を行った。6穴プレートにSIM2遺伝子安定発現株を播種し、通常培地にて1日間培養した後に、CDDP(2μM、5μM、10μM)、5FU(10μM)、DTX(1nM)添加培地又は通常培地で3日間培養した。薬物処置終了後、0.25%トリプシン/EDTAを用いて細胞を回収し、トリパンブルー染色後、生細胞数を計測した。その結果は図6に示した。
SIM2遺伝子安定発現株のCDDPの長期投与への感受性を評価するため、3次元培養を用いた抗がん剤感受性試験を行った。3.5cm NanoCulture(登録商標) PlateにSIM2遺伝子安定発現株を播種し、通常培地にて1日間培養した後に、CDDP(5x10−6M)を含む培地へ交換した。CDDP(5x10−6M)を含む培地を2日おきに交換しつつ、14日間培養した。薬物処置終了後、Spheroid Dispersion Solution(SCIVAX社)を用いて細胞を回収し、トリパンブルー染色後、生細胞数を計測した。その結果は図7に示した。
SIM2遺伝子安定発現株の放射線への感受性を評価するため、γ線感受性試験を行った。6穴プレートにSIM2遺伝子安定発現株を播種し、通常培地にて1日間培養した後に、γ線照射(0Gy、1Gy、5Gy、10Gy)を行った。その後7日間培養し、0.25%トリプシン/EDTAを用いて細胞を回収し、トリパンブルー染色後、生細胞数を計測し、IC50を計算した。その結果は図8に示した。
症例セット−1で選抜した2054遺伝子プローブセットで教師なしクラスター解析を行い、遺伝子系統樹を7種に分け、症例セット−2での再現性を確認したところ、7種の遺伝子プローブクラスターのうち、セット−2でも再現されたものは5種の遺伝子プローブクラスターであった。図1に示すように、これら5種の遺伝子プローブセットを高発現する症例クラスター(サブタイプ)のうち、サブタイプ−7はCRTでの5年生存率がセット−1で64%、セット−2で75%と感受性を示した。一方、サブタイプ−5はCRTでの5年生存率がセット−1で11%、セット−2で28%と非感受性であった。
セット−1においてCRT感受性サブタイプ−7とその他を比べて、t−検定でp<0.05の条件と平均発現強度が2倍以上の条件を満たす遺伝子プローブを選抜した結果、599種であった。その中に含まれるキーとなる転写因子、すなわちこれらの遺伝子の発現を支配している転写因子を症例ごとの発現量の相関解析によって探索したところSIM2を見出した。SIM2の発現と相関して発現する遺伝子は上記統計学的に選抜した599遺伝子プローブのうち256遺伝子プローブであった。同様に非感受性サブタイプ−5で特異的に発現する525遺伝子プローブのうち163遺伝子プローブと相関する転写因子FOXE1を同定した。次に、各256遺伝子プローブと163遺伝子プローブの数値データを使い、セット−1とセット−2でクラスター解析を行い、CRT感受性サブタイプ−7と非感受性サブタイプ−5を再分類し、生存曲線を描き、5年生存率を調べた結果を図2に示した。図2に示した通り、サブタイプ−7は5年生存率がセット−1で67%、セット−2で70%と成績が良かった。一方、サブタイプ−5はCRTでの5年生存率がセット−1で11%、セット−2で32%と不良であった。CRT感受性サブタイプ−7を規定する256遺伝子プローブを重複のない191種の遺伝子名として整理し、上述の表1〜7に示した。このCRT感受性サブタイプ−7を規定する191遺伝子には、食道扁平上皮の分化層で発現する遺伝子(分化マーカー)が多く含まれていた。一方、非感受性サブタイプ−5を規定する163遺伝子プローブは上述の表8〜12に121遺伝子として示した。これらの遺伝子には未分化な基底細胞マーカー等が多く含まれていた。したがって、SIM2は食道がんの分化を誘導し、FOXE1は分化を抑制することによって化学放射線抵抗性の獲得に寄与していることが示された。
図3に示したように、セット−1の107症例中、サブタイプ−7に分類されるのは30例、サブタイプ−5に分類されるのは29例であった。重複は6例あったので、純サブタイプ−7は24例、純サブタイプ−5に分類されるのは23例であった。これら2種のサブタイプ以外の症例は60例であった。同様に、セット−2の167症例中、純サブタイプ−7は34例、純サブタイプ−5に分類されるのは48例であった。それ以外の症例は85例であった。
〔3〕で分類された純サブタイプ−7、純サブタイプ−5、及びそれ以外の症例について、CRT治療2ヵ月後の完全寛解(CR,complete response)率を、表15に示した。なお、表15中、「ST」は「サブタイプ」を示し、「CR」は「完全寛解」を示し、「non CR」は「非寛解」を示す。表15に示した通り、CRT施行121例の完全寛解率が47%であるのに対し、純サブタイプ−7はセット−1で100%、セット−2で59%と再現性良く良好で全体では71%であった。一方、純サブタイプ−5は、セット−1で18%、セット−2で24%と再現性良く不良で全体では23%であった。
図5の左に、食道扁平上皮がん細胞株KYSE510とTE8にSIM2遺伝子cDNAを導入後、3日目、5日目において、未分化基底細胞マーカーであるPDPNと分化マーカーSPRR1Aの発現を調べた定量的RT−PCRのデータを示した。SIM2遺伝子を導入後3日目で分化マーカーSPRR1Aが上昇し、未分化基底細胞マーカーPDPNの発現が下降した。この結果から、SIM2が未分化基底細胞の分化を誘導できることが明らかになった。
図6に示した通り、SIM2安定発現株(KYSE510−SIM2−27,−37、TE8−SIM2−2,−3、T.Tn−SIM2−9,−23)では、対照ベクター導入株(KYSE510−Mock、TE8−Mock、T.Tn−Mock)と比較して、シスプラチン(CDDP)、5−フルオロウラシル(5FU)、ドセタキセル(DTX)に対する感受性が上昇していることが明らかになった。すなわち、いずれのSIM2安定発現株では、通常のプレート2次元培養にて、3種の抗がん剤をIC50近傍の濃度で添加したところ、3日後の生細胞数が有為(*:p<0.05)に減っていた。
通常の2次元培養で、IC50近傍の濃度では、5日間以上の長期観察では細胞が飽和するため、3日間での効果を調べた。そのため、図6において示したCDDPの効果は有為ではあったが小さかった。そこで、CDDPに関しては3次元培養にて14日間の長期観察を行った。図7(左に生細胞数、右に細胞集塊)に示したように、SIM2安定発現株(T.Tn−SIM2−9,−23)では、対照ベクター導入株(T.Tn−Mock)と比較して、CDDPに対する感受性が著しく上昇していた。
図8に示した通り、SIM2安定発現株(TE8−SIM2−2,−3、T.Tn−SIM2−9,−23)では、対照ベクター導入株(TE8−Mock、T.Tn−Mock)と比較して、γ線に対する感受性が上昇することが明らかになった。なお、KYSE510は親株、対照ベクター導入株(KYSE510−Mock)共に、γ線に高感受性のため評価から除外した。
EMBL−EBIのArrayExpressデータベースからアクセス番号E−GEDO−23400の中国の食道扁平上皮がん53例とアクセス番号E−MTAB−1328のフランスの頭頚部扁平上皮がん89例のマイクロアレイデータとを、上記〔1〕−〔2〕と同様の方法でクラスター解析を行った。その結果、図には示さないが、他国の食道扁平上皮がんにおいても、さらには食道扁平上皮がんではない扁平上皮がん(頭頚部扁平上皮がん)においても、サブタイプ−5、−7の存在を確認することができた。
上述の通り、SIM2共発現遺伝子群の遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価することができる。さらに、FOXE1共発現遺伝子群の遺伝子の発現レベルも指標とすることにより、より精度高く前記有効性を評価することができる。また、このような遺伝子群の発現レベルを網羅的に解析する上で、本実施例においても用いているDNAマイクロアレイによる解析は有用である。
上述の通り、PCR等による解析においては、解析する遺伝子の数を少数に限定することが望まれる。そこで、少ない遺伝子群を解析対象としても、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価できることを確認するため、サブタイプ−5の分類に有用な163遺伝子プローブ(表8〜12 参照)、また、サブタイプ−7の分類に有用な256遺伝子プローブ(表1〜7 参照)から、さらなる遺伝子プローブの絞り込みを検討した。
上記[11]等における予備的な検討から、多数の有用な小数遺伝子セットが存在することが示唆された。そこで、セット−1の107症例のデータから、重複を許して200症例分を選択するリサンプリングを行い1000回行った。各リサンプリングで得られた学習用データとしたモデル構築を行い、セット−1と−2を用いて評価を行った。この1000回のリサンプリングに基づき平均予測誤差を算出し、また、各リサンプリングで選択された5モデルの遺伝子セットで選択された遺伝子を、選択回数で遺伝子の順位付けを行った。遺伝子セットは、サブタイプ−5の分類に有用な163遺伝子プローブから、また、サブタイプ−7の分類に有用な256遺伝子プローブから選択し、異なる遺伝子プローブが選ばれても同一遺伝子ならば合算した選択回数を算出した。そして、このようにして、1000回のリサンプリングにおいて、モデル数1〜延べ20までのセット−1、−2における予測誤差の平均値を算出した。得られた結果を、図13及び14に示す。
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
Claims (3)
- 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも高い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。 - 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベル、並びに、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体におけるSIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも高く、かつ前記被検体におけるFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。 - 請求項1又は2に記載の方法により、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための薬剤であって、下記(a)〜(d)から選択される少なくとも1の化合物を含む薬剤
(a)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド
(b)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド
(c)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体
(d)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体。
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