JPWO2016047688A1 - 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法 - Google Patents

扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法 Download PDF

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Abstract

扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも高い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。

Description

本発明は、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法、又は該方法に用いられる薬剤に関する。
扁平上皮がんは、扁平重層上皮等の基底細胞が悪性化したものであり、主に、食道がん、頭頸部がん、子宮頸部がん、肺がん等において見られる。
こと、食道がんにおいて、東アジアの黄色人種では扁平上皮がんが90%以上を占め、欧米の白色人種でも扁平上皮がんがもう一つの食道がんである腺上皮がんよりも多い。この2種のがん、扁平上皮がんと腺上皮がんは、病理組織からも発生系譜からも別のものである。しかし、この2種の食道がんは現在同じ治療が行われており、病期がII、III期の局所進行がんの標準治療は、日本では術前補助化学療法(CT,chemotherapy)と根治的化学放射線療法(CRT,chemoradiotherapy)であり、欧米では術前補助化学放射線療法である。根治的CRTによる5年生存率は50%ほどで、術前CTの55%より、やや劣るが、臓器温存ができ、高齢な患者や約10%ある胃がんや頭頸部がん併発患者にとって非常に有効である。そのため、治療前に術前CRTが有効である患者を予知、選択することが強く望まれている。
このような治療法の有効性を評価する方法として、乳がんや大腸がん等においては、生検の遺伝子発現プロファイルを利用する方法があり、特にサブタイプ分類法が有効であることが示されてきた。
食道がんでも、臨床的に有用なサブタイプを同定する試みはなされてきたものの、腺がんのサンプル数が多く、扁平上皮がんのCRT感受性サブタイプを同定するには解析するサンプルの数が少なく、さらにサンプルにおける病期もばらばらである(非特許文献1〜6、なお、非特許文献1〜6において解析されている食道扁平上皮がんのサンプル数は、各々33、2、26、21、7及び0である)。そのため、局所進行がんの予知医療に貢献できる確固な結果が得ることができず、扁平上皮がんの化学放射線療法の感受性、予後を予測する方法は、未だ開発されていない。
Ashida A.ら、Int J Oncology、2006年、28巻、1345−1352ページ Luthra R.ら、Journal of Clinical Oncology、2006年、24巻、259−267ページ Greenawalt.ら、Int J Cancer、2007年、120巻、1914−1921ページ Duong C.ら、Ann Surg Oncol、2007年、14巻、3602−3609ページ Maher SG.ら、Ann Surg、2009年、250巻、729−737ページ Kim SM.ら、Plos one、2010年、5:e15074
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、扁平上皮がんの化学放射線療法の有効性を、精度高く評価する(感受性、予後を予測する)ことを可能とする、方法及び薬剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記目的を達成すべく、網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析により、扁平上皮がんの化学放射線療法(CRT)による治療の予後に相関したサブタイプの同定を行った。その結果、扁平上皮がんを再現性良く、特定の遺伝子プローブセットを高発現する5種の症例クラスター(サブタイプ)に分類できることを見出した。そして、それら5種のサブタイプのうち、サブタイプ−7に属する症例は予後良好群であり、一方サブタイプ−5に属する症例は予後不良群であることが明らかになった。
さらに、サブタイプ−7において、高発現している遺伝子群の発現を支配している転写因子を症例ごとの発現量の相関解析によって探索したところ、SIM2遺伝子を見出した。また、サブタイプ−5においても同様の探索を行った結果、該サブタイプの遺伝子群の発現を支配している転写因子は、FOXE1であることを見出した。そして、CRT感受性であるサブタイプ−7を規定する遺伝子、すなわちSIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子(191遺伝子)を同定し、さらに、CRT非感受性であるサブタイプ−5を規定する遺伝子、すなわちFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子(121遺伝子)を同定した。
また、扁平上皮がんの症例において、サブタイプ−7に分類されるが、サブタイプ−5には分類されない症例を純サブタイプ−7として選択し、同様にサブタイプ−5に分類されるが、サブタイプ−7には分類されない症例を純サブタイプ−5として選択した、そして、これら再分類した純サブタイプ−7及び純サブタイプ−5に属する症例について、CRT施行後の完全寛解率、生存曲線及び5年生存率を分析したところ、精度高く、純サブタイプ−7に属する症例を予後良好群に、純サブタイプ−5に属する症例を予後不良群に分類できることが明らかになった。一方、驚くべきことに、CRTではなく外科的切除治療を施した症例についても同様の解析を行ったが、純サブタイプ−7に属する症例と純サブタイプ−5に属する症例との間で生存率に関し、有意差は認められなかった。したがって、サブタイプ−5とサブタイプ−7、又はこのサブタイプ分類法は、外科的切除治療の予後の予知、予後因子ではなく、CRTの有効性を予知するのに特化して有効であることが明らかになった。
また、上述の通り、扁平上皮がんのCRT感受性に関与する遺伝子として同定されたSIM2遺伝子について、その分化誘導活性を評価したところ、SIM2遺伝子が未分化基底細胞の分化を誘導できることが明らかになった。さらに、扁平上皮がん細胞にSIM2遺伝子を導入することにより、当該がんにおける抗がん剤感受性及びγ線感受性が亢進することも見出し、サブタイプ−7(SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子の発現)を指標として、扁平上皮がんに対するCRTの有効性を評価できることが、分子メカニズムの観点からも確認された。
さらに、中国の食道扁平上皮がん及びフランスの頭頚部扁平上皮がんのマイクロアレイデータを上記同様の方法にて解析した結果、他国の食道扁平上皮がんにおいても、さらには食道扁平上皮がんではない扁平上皮がん(頭頚部扁平上皮がん)においても、サブタイプ−5、−7の存在を確認することができ、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子の発現、並びにFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子の発現を指標として、食道扁平上皮がんのみならず、他の扁平上皮がんについてもCRTの有効性を評価できることを見出した。
さらに、上述の遺伝子の網羅的発現解析結果を、遺伝子解析数に限りのあるPCR等による解析に適用すべく、扁平上皮がんのサンプル間で発現変動の少ない遺伝子(参照遺伝子)を多数同定することに成功した。また、それら参照遺伝子の中で最も有用であると判断したSRSF3遺伝子の発現に基づき、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子(191遺伝子)、並びにFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子(121遺伝子)において、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価できる遺伝子の絞込みを各々行った結果、いずれの遺伝子群に関しても、1の遺伝子を検出しても高い精度で評価できることを確認した。さらに、少なくとも5の遺伝子を検出することにより極めて高い精度で評価できること、すなわちSIM2遺伝子等に関しては、少なくとも5の遺伝子を検出することにより、191遺伝子全てを検出した場合に準ずる精度で有効性を判定することができ、またFOXE1遺伝子等に関しては、少なくとも5の遺伝子を検出することにより、121遺伝子全てを検出した場合に準ずる精度で有効性を判定することができることも確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法、又は該方法に用いられる薬剤に関し、より詳しくは以下に関する。
(1) 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも高い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
(2) 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベル、並びに、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体におけるSIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも高く、かつ前記被検体におけるFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
(3) (1)又は(2)に記載の方法により、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための薬剤であって、下記(a)〜(d)から選択される少なくとも1の化合物を含む薬剤
(a)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド、
(b)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド、
(c)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、
(d)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体。
本発明によれば、扁平上皮がんの化学放射線療法の有効性を、精度高く評価することが可能となる。
網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析により、扁平上皮がんの化学放射線療法(CRT)による生存率に相関したサブタイプの同定を行った結果を示すグラフである。 SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子の高発現を指標として分類された扁平上皮がん患者群(図中、サブタイプ−7)と、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子の高発現を指標として分類された扁平上皮がん患者群(図中、サブタイプ−5)との、CRT後の生存率の比較を示すグラフである。 扁平上皮がんの患者群において、サブタイプ−7、サブタイプ−5及び両サブタイプに属する患者数を示すベン図である。 純サブタイプ−7に分類された(サブタイプ−7に分類されるが、サブタイプ−5には分類されない)扁平上皮がん患者群と、純サブタイプ−5に分類された(サブタイプ−5に分類されるが、サブタイプ−7には分類されない)扁平上皮がん患者群との、CRT又は外科的切除治療後の生存率の比較を示すグラフである。図中、右下のグラフのみ、外科的切除治療による治療後の生存率を示す。他はCRT後の生存率を示すグラフである。 SIM2遺伝子の分化誘導活性について解析した結果を示す図である。図中、左の2つのグラフは、SIM2遺伝子を一過的に発現させた食道扁平上皮がん細胞株(KYSE510及びTE8)における、未分化基底細胞マーカーであるPDPNと分化マーカーSPRR1AとのmRNA発現量を示すグラフである。右の写真は、食道扁平上皮がん細胞株KYSE510、TE8、及びT.TnのSIM2安定発現細胞株(KYSE510−SIM2−27,−37、TE8−SIM2−2,−3、T.Tn−SIM2−9,−23)における、SIM2、分化マーカー(CEA,FLG,KRT1,SPRR1A,MUC4)、及び未分化マーカー(VIM,PDPN,NGFR)の発現量を示すゲル電気泳動の写真である。 SIM2遺伝子安定発現株の抗がん剤(シスプラチン(CDDP)、5−フルオロウラシル(5FU)、ドセタキセル(DTX))への感受性を、2次元培養法により分析した結果を示すグラフである。 SIM2遺伝子安定発現株のCDDPの長期投与への感受性を、3次元培養法により分析した結果を示すグラフ及び顕微鏡写真である。 SIM2遺伝子安定発現株のγ線への感受性を、2次元培養法により分析した結果を示す、グラフである。 サブタイプ−5に関し、解析する遺伝子数を1から延べ20まで増加させた場合において、サブタイピング用107症例セット(セット−1)及びバリデーション用の167症例セット(セット−2)における各々の予測誤差を、重み付け多数決決定法により解析した結果を示すグラフである。 サブタイプ−7に関し、解析する遺伝子数を1から延べ20まで増加させた場合において、前記セット−1及び前記セット−2における各々の予測誤差を、重み付け多数決決定法により解析した結果を示すグラフである。 前記セット−1及び前記セット−2を対象とし、サブタイプ−5を規定する遺伝子群から選択された5遺伝子(表33 参照)の発現レベルを指標として、純サブタイプ−5に分類された扁平上皮がん患者群と、その他の扁平上皮がん患者群との、CRT後の生存率の比較を示すグラフである。 前記セット−1及び前記セット−2を対象とし、サブタイプ−7を規定する遺伝子群から選択された5遺伝子(表34 参照)の発現レベルを指標として、純サブタイプ−7に分類された扁平上皮がん患者群と、その他の扁平上皮がん患者群との、CRT後の生存率の比較を示すグラフである。 サブタイプ−5に関し、前記セット−1の症例データから1000回のリサンプリングを行い、モデル構築を行った。そして、これらのモデル(各リサンプリングで選択された1〜延べ20の遺伝子)を用い、前記セット−1及び−2を対象とした評価を行い、平均予測誤差を算出した結果を示すグラフである。 サブタイプ−7に関し、前記セット−1の症例データから1000回のリサンプリングを行い、モデル構築を行った。そして、これらのモデル(各リサンプリングで選択された1〜延べ20の遺伝子)を用い、前記セット−1及び−2を対象とした評価を行い、平均予測誤差を算出した結果を示すグラフである。
<扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法>
後述の実施例において示す通り、網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析により、扁平上皮がんの化学放射線療法による治療の予後(生存率)に相関したサブタイプの同定を行った。その結果、得られた予後良好なサブタイプにおいて、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子が高発現していることが明らかになった。したがって、本発明は、下記工程(a)〜(c)を含む、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法を提供する。
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも高い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
また、後述の実施例において示す通り、扁平上皮がんの化学放射線療法による治療の予後に相関した上記サブタイプの同定を行った結果、得られた予後不良なサブタイプにおいて、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子が高発現していることも明らかになった。さらに、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子の発現に加え、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子の発現を指標とすることで化学放射線療法後の予後良好群と予後不良群とを、より精度高く判別できることを見出した。したがって、本発明は、その好ましい態様として、下記工程(a)〜(c)を含む、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法も提供する。
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベル、並びに、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体におけるSIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも高く、かつ前記被検体におけるFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
本発明において、「扁平上皮がん」とは、扁平重層上皮等の基底細胞が悪性化したものであればよく、特に制限はないが、食道(上部食道、中部食道、下部食道)及び直腸等の消化器官、鼻腔、上顎、上顎洞、舌、口腔底、歯肉、頬粘膜、上咽頭、中咽頭、下咽頭及び喉頭等の頭頚部、肺、肛門、外陰部、腟、並びに子宮頸部における扁平上皮がんが挙げられる。本発明における化学放射線療法の有効性を評価する対象としては、食道扁平上皮がん及び頭頚部扁平上皮がんが好ましく、食道扁平上皮がんがより好ましい。
「化学放射線療法」とは、抗がん剤投与等による「化学療法」と放射線照射による「放射線療法」との両方を組み合わせた治療法であり、本発明において、「化学放射線療法」は該治療法のみを単独で行う治療法であってもよく、手術前に行う術前化学放射線療法であってもよく、手術後に行う術後化学放射線療法であってもよく、手術以外のその他の治療法と組み合わせて行う化学放射線療法であってもよい。化学療法における、抗がん剤の種類は特に制限されず、当業者に周知の抗がん剤であればよく、例えば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、オキサリプラチン及びネタブラチン等の白金製剤、5−フルオロウラシル(5FU)、テガフール・ウラシル、TS−1(テガフールとギメラシルとオテラシルカリウムとを配合)、メトレキサート及び塩酸ゲムシタビン等の代謝拮抗剤、ドセタキセル(DTX)及びイリノテカン等の植物アルカロイド、シクロホスファミド、メルファラン、ラニムスチン、ニムスチン及びテモゾロミド等のアルキル化剤、ドキソルビシン等の抗がん性抗生物質、並びにインターフェロンα等の生物学的応答調節剤が挙げられる。抗がん剤の投与量、投与スケジュール等は、抗がん剤の種類や被検体の条件によって選択され、複数種の抗がん剤が共投与されてもよい。放射線療法における、放射線の種類(例えば、γ線、X線、電子線、陽子線、重粒子線)、放射線強度、放射時間等はがんの治療に通常使用される範囲であればよく、特に制限されない。
本発明において、「扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性」とは、例えば、被検体の化学放射線療法による治療後(予後)の生存率又は完全寛解率が挙げられる。すなわち、前記有効性が高いとは前記生存率が高いことであり、より具体的には、化学放射線療法による治療後5年(1800日)経過後の生存率が50%以上となることである。一方、前記有効性が低いとは前記生存率が低いことであり、より具体的には、化学放射線療法による治療後5年経過後の生存率が50%未満となることである(後述の図1、2及び4 参照のこと)。また、前記有効性が高いとは前記完全寛解率が高いことであり、より具体的には、化学放射線療法による治療後2〜3ヶ月における完全寛解率が50%以上となることである。一方、前記有効性が低いとは前記完全寛解率が低いことであり、より具体的には、化学放射線療法による治療後2〜3ヶ月における完全寛解率が50%未満となることである(後述の表15 参照のこと)。
本発明において、「被検体」とは、化学放射線療法による治療前の扁平上皮がんの患者のみならず、化学放射線療法による治療中の扁平上皮がんの患者、化学放射線療法による治療後の扁平上皮がんの患者であってもよい。また、扁平上皮がんを患っているヒトのみならず、扁平上皮がんを治療により除去したが再発が懸念されるヒトも、本発明に係る「被検体」の例として挙げられる。
「被検体から分離された扁平上皮がん試料」としては、被検体(ヒトの生体)から摘出され、その由来の生体と完全に隔離されている状態にある扁平上皮がん又はそれを含む組織であればよく、例えば、治療開始前に被検体から検査のために採取された扁平上皮がんを含む組織(生検サンプル)、手術により摘出された扁平上皮がんを含む組織が挙げられるが、「被検体から分離された扁平上皮がん試料」としては、生検サンプルがより好ましい。また、「扁平上皮がん試料」が被検体より分離される時期としては特に制限はないが、該がんの遠隔転移を認めない時期(病期:II、III期)が好ましい。
本発明において発現レベルを検出する対象となる「SIM2遺伝子」は、シングル−マインディド ホモログ2(ショウジョウバエ)、シングル−マインディド ファミリー bHLH 転写因子2、SIM、bHLHe15、HMC13F06又はHMC29C01とも称される遺伝子のことであり、ヒト由来であれば典型的には、Entrez Gene ID:6493で特定される遺伝子(Ref Seq ID:NM_005069で特定されるDNA配列からなる遺伝子、Ref Seq ID:NP_005060で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子)である。
また、本発明において発現レベルを検出する対象となる「SIM2遺伝子と共発現している遺伝子」とは、SIM2遺伝子の発現と相関して発現が変動する(SIM2遺伝子の発現パターンと同様のそれを示す)遺伝子のことである。該遺伝子とSIM2遺伝子とが遺伝子発現において高度に相関しているかどうかは、当業者であれば当該技術分野の公知の方法を用いて解析して判別することができる。例えば、サンプル(前述の扁平上皮がん試料等)間の遺伝子発現量について、ピアソン相関係数若しくはスピアマン相関係数を計算することにより、又はクラスタリング法により計算することができる。また、共発現の分析は、正規化された又は標準化かつ正規化された発現データを用いて計算することもできる。本発明において、「SIM2遺伝子と共発現している遺伝子」としては、SIM2遺伝子の発現との相関がピアソンの積率相関係数で0.4以上である遺伝子が好ましい。また、より好ましい「SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子」としては下記表1〜7に示す191の遺伝子が挙げられ、さらに好ましい遺伝子としては、後述の表36に示す69の遺伝子が挙げられる。
本発明において発現レベルを検出する対象となる「FOXE1遺伝子」は、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)、TTF2、FOXE2、HFKH4、HFKL5、TITF2、TTF−2又はFKHL15とも称される遺伝子のことであり、ヒト由来であれば典型的には、Entrez Gene ID:2304で特定される遺伝子(Ref Seq ID:NM_004473で特定されるDNA配列からなる遺伝子、Ref Seq ID:NP_004464で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子)である。
また、本発明において発現レベルを検出する対象となる「FOXE1遺伝子と共発現している遺伝子」とは、前述のSIM2遺伝子の場合と同様に、FOXE1遺伝子の発現と相関して発現が変動する(FOXE1遺伝子の発現パターンと同様のそれを示す)遺伝子のことであり、該遺伝子とFOXE1遺伝子とが遺伝子発現において高度に相関しているかどうかも、前述のSIM2遺伝子の場合と同じ解析方法にて判別することができる。本発明において、「FOXE1遺伝子と共発現している遺伝子」としては、FOXE1遺伝子の発現との相関がピアソンの積率相関係数で0.4以上である遺伝子が好ましい。また、より好ましい「FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子」としては下記表8〜12に示す121の遺伝子が挙げられ、さらに好ましい遺伝子としては、後述の表35に示す56の遺伝子が挙げられる。
なお、表1〜12における「ID」は、「Entrez Gene ID」を意味し、「SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子(以下「SIM2共発現遺伝子群」とも称する)」並びに「FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子(以下「FOXE1共発現遺伝子群」とも称する)」の各遺伝子は、ヒト由来であれば典型的には、各Entrez Gene IDで特定される遺伝子である。しかしながら、遺伝子のDNA配列は、その変異等により、自然界において(すなわち、非人工的に)変異しうる。したがって、本発明においては、このような天然の変異体も、検出対象となりうる。
本発明の評価方法は、「SIM2共発現遺伝子群」から少なくとも1の遺伝子の発現を検出するものであり、1の遺伝子の発現を検出してもよく(例えば、SPRR3の遺伝子発現のみを検出してもよく)、2の遺伝子の発現を検出してもよく、3の遺伝子の発現を検出してもよい(例えば、SPRR3、CEACAM1及びPPLの遺伝子発現を検出してもよい)が、極めて高い精度にて扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するという観点から、少なくとも5の遺伝子の発現(例えば、表34の示す全ての遺伝子の発現)を検出すれば十分ではあるが、少なくとも10の遺伝子の発現を検出することが好ましく、少なくとも20の遺伝子の発現を検出することがより好ましく、少なくとも30の遺伝子の発現を検出することがさらに好ましく、少なくとも50の遺伝子の発現を検出することがより好ましく、少なくとも100の遺伝子の発現を検出することがさらに好ましく、SIM2共発現遺伝子群の全ての遺伝子の発現を検出することが特に好ましい。また、後述の実施例に示す通り、表36に示すSIM2共発現遺伝子の順位は、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性の評価における精度向上に寄与する順位である。したがって、本発明の評価方法においては、当該順位に基づいた遺伝子を選択して、その発現を検出することが望ましい。
また、本発明の評価方法においては、より高い精度にて扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するという観点から、SIM2共発現遺伝子群からの少なくとも1の遺伝子発現の検出に加え、「FOXE1共発現遺伝子群」から少なくとも1の遺伝子の発現を検出してもよい。FOXE1共発現遺伝子群からは1の遺伝子の発現を検出してもよく(例えば、LOC344887の遺伝子発現を検出してもよく)、2の遺伝子の発現を検出してもよく、3の遺伝子の発現を検出してもよい(例えば、LOC344887、 NTRK2及びTMEM116の遺伝子発現を検出してもよい)が、極めて高い精度にて評価するという観点から、少なくとも5の遺伝子の発現(例えば、表33に示す全ての遺伝子の発現)を検出すれば良く、少なくとも10の遺伝子の発現を検出することが好ましく、少なくとも20の遺伝子の発現を検出することがより好ましく、少なくとも30の遺伝子の発現を検出することがさらに好ましく、少なくとも50の遺伝子の発現を検出することがより好ましく、少なくとも100の遺伝子の発現を検出することがさらに好ましく、FOXE1共発現遺伝子群の全ての遺伝子の発現を検出することが特に好ましい。また、後述の実施例に示す通り、表35に示すFOXE1共発現遺伝子の順位は、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性の評価における精度向上に寄与する順位である。したがって、本発明の評価方法においては、当該順位に基づいた遺伝子を選択して、その発現を検出することが望ましい。
なお、後述の実施例において示す通り、後述の発現検出方法及び統計学的解析方法によっては、1つの遺伝子に複数のプローブが設けられる場合や、1つの遺伝子に関し異なるシグナル比の閾値やモデルの重みが設定される場合等がある。かかる場合、上述の本発明の方法において検出する遺伝子の数は、延べ数でもあり得る。
本発明において「遺伝子の発現レベルを検出する」とは、遺伝子の発現の程度を検出することを意味する。また、遺伝子の発現レベルは、絶対量として又は相対量として把握することができる。
また、本発明における相対量は、後述の実施例に示す通り、参照遺伝子の発現量を基準として算出することができる。本発明にかかる「参照遺伝子」は、サンプル(前述の扁平上皮がん試料等)において安定して発現しており、また異なるサンプル間において、その発現量の差が小さい遺伝子であればよく、好ましくは、後述の表16〜32に記載の遺伝子であり、より好ましくは、SRSF3、TPM3、ZNF207、ZNF143、PUM1、RAB1A及びLOC101059961であり、特に好ましくはSRSF3である。
さらに、本発明において「遺伝子の発現レベル」とは、遺伝子の転写レベル及び翻訳レベルの双方を含む意である。したがって、本発明における「遺伝子の発現レベルの検出」には、mRNAレベル及び蛋白質レベルでの検出の双方が含まれる。
本発明における遺伝子の発現の検出には、公知の手法を用いることができる。mRNAレベルを定量的に検出する方法としては、例えば、PCR(RT−PCR、リアルタイムPCR、定量PCR)、DNAマイクロアレイ解析法が挙げられる。また、所謂次世代シークエンシング法においてリード数をカウントすることにより、mRNAレベルを定量的に検出することができる。次世代シークエンシング法としては特に制限はないが、合成シークエンシング法(sequencing−by−synthesis、例えば、イルミナ社製Solexaゲノムアナライザー又はHiseq(登録商標)2000によるシークエンシング)、パイロシークエンシング法(例えば、ロッシュ・ダイアグノステックス(454)社製のシークエンサーGSLX又はFLXによるシークエンシング(所謂454シークエンシング))、リガーゼ反応シークエンシング法(例えば、ライフテクノロジー社製のSoliD(登録商標)又は5500xlによるシークエンシング)等が挙げられる。さらに、mRNAレベルを定量的に検出する方法としては、ノーザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、ドットブロット、RNaseプロテクションアッセイ法、質量分析法も挙げられる。
また、蛋白質レベルで定量的に検出する方法としては、例えば、ELISA法、抗体アレイ、イムノブロッティング、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫組織化学的染色法等の抗体を用いて検出する方法(免疫学的手法)や、質量分析法が挙げられる。
なお、上記検出方法の検出対象となる、mRNA、その相補的核酸であるcDNA若しくはcRNA、又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。
本発明の評価方法においては、このようにして検出された遺伝子の発現と、同遺伝子の基準発現レベルとを比較する。かかる比較は、当業者であれば、上記発現検出方法に合った統計学的解析方法を適宜選択して行うことができる。統計学的解析方法としては、例えば、t検定、分散分析(ANOVA)、クラスカル・ウォリス検定、ウィルコクソン検定、マン・ホイットニー検定、及びオッズ比が挙げられる。また、比較の際には、正規化された又は標準化かつ正規化された発現データを用いることもできる。
また、比較対象である「各遺伝子の基準発現レベル」としては特に制限はなく、当業者であれば上記発現検出方法及び統計学的解析方法に合わせ、それを基準とすることにより扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性が高い又は低いと判断することのできる、所謂カットオフ値として設定することができる。かかる基準発現レベルは、後述の実施例において示すような、複数の扁平上皮がんにおいて検出された遺伝子発現レベルの各遺伝子毎の平均値であってもよい。また扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性の高い患者の集団と、該有効性の低い患者の集団とにおいて、検出された各遺伝子の発現レベルを比較することにより決定される値であってもよい。また、非がん部や細胞株等の遺伝子発現量を基準にCRTの有効性の高い患者と該有効性の低い患者の集団において設定される定値であってもよい。また、SIM2共発現遺伝子群から選択される少なくとも1の遺伝子の基準発現レベルとしては、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性が低いことが事前に判明している患者から分離された扁平上皮がん試料における各遺伝子の発現レベルを用いることもできる。一方、FOXE1共発現遺伝子群から選択される少なくとも1の遺伝子の基準発現レベルとしては、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性が高いことが事前に判明している患者から分離された扁平上皮がん試料における各遺伝子の発現レベルを用いることもできる。
そして、このような比較の結果、前記被検体におけるSIM2共発現遺伝子群から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも高い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定することができる。ここで「各基準発現レベルよりも高い」とは、当業者であれば上記統計学的解析方法に基づき適宜判断することができる。例えば、後述の実施例において示すように、検出された遺伝子の発現レベルと対応する基準発現レベルより高く、t検定においてその差が有意と認められること(P<0.05)が挙げられる。また、検出された遺伝子の発現レベルが対応する基準発現レベルの2倍以上であることも挙げられる。
また、本発明の評価方法においては、より高い精度にて扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するという観点から、前記SIM2共発現遺伝子群の発現レベルに基づく判断に加え、FOXE1共発現遺伝子群の発現レベルに基づく判断を行うことが好ましい。すなわち、SIM2共発現遺伝子群から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも高く、かつ前記被検体におけるFOXE1共発現遺伝子群から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定することが好ましい。ここで「各基準発現レベルよりも低い」とは、当業者であれば上記統計学的解析方法に基づき適宜判断することができる。例えば、後述の実施例において示すように、検出された遺伝子の発現レベルと対応する基準発現レベルよりも低く、t検定においてその差が有意と認められること(P<0.05)が挙げられる。また、検出された遺伝子の発現レベルが対応する基準発現レベルの2分の1以下であることも挙げられる。
以上の通り、本発明の扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法の好適な実施形態について説明したが、本発明の評価方法は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、上述の通り、網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析により、得られた予後不良なサブタイプにおいて、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子が高発現していることが明らかになったことに基づき、本発明は、下記工程(a)〜(c)を含む、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法をも提供し得る。
(a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
(c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
また、以上の通り、本発明によれば、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を精度よく評価することができる。そして、かかる評価の結果により、扁平上皮がんの治療方法として化学放射線療法を選択するか、別の治療方法(外科的手術又は内視鏡的手術により扁平上皮がんを除去する治療法、レーザー光照射により扁平上皮がんを除去する治療法等)を選択するかを判断することもできる。
したがって、本発明は、本発明の評価方法により扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性が高いと判定された被検者に、化学放射線療法を施す工程を含む、扁平上皮がんの治療方法を提供することもできる。また、本発明は、本発明の評価方法により扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性が高いと判定されなかった被検者に、外科的手術若しくは内視鏡的手術により扁平上皮がんを除去する治療法、又はレーザー光照射により扁平上皮がんを除去する治療法を施す工程を含む、扁平上皮がんの治療方法を提供することもできる。
また、被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性の評価は、通常、医師(医師の指示を受けた者も含む、以下同じ)によって行われるが、本発明の方法によって得られる、上述の遺伝子発現レベル等に関するデータは、医師による治療法の選択も含めた診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
<扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための薬剤>
上述の通り、本発明の評価方法においては、SIM2共発現遺伝子群等の発現レベルをmRNA(転写産物)レベル又は蛋白質(翻訳産物)レベルにて検出することにより、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価することができる。したがって、本発明は、上述の評価方法により、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための薬剤であって、下記(a)〜(d)から選択される少なくとも1の化合物を含む薬剤を提供する。
(a)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド、
(b)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド、
(c)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、
(d)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体。
本発明の薬剤に含まれるオリゴヌクレオドは、上記mRNA(転写産物)レベルでの検出方法に合わせ、プライマーの態様であってもよく、プローブの態様であってもよい。
本発明の薬剤に含まれるプライマーは、SIM2共発現遺伝子群及びFOXE1共発現遺伝子群から選択される少なくとも1の遺伝子(以下「予後関連遺伝子」とも称する)の転写産物(mRNA)又はその相補的核酸(cDNA、cRNA)にハイブリダイズし、該転写産物等の増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。プライマーは、DNAのみであってもよく、またその一部又は全部において、架橋化核酸等の人工核酸(修飾核酸)によって置換されているものであってもよい。また、プライマーのサイズは、少なくとも約15ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは15〜100ヌクレオチド長、より好ましくは18〜50ヌクレオチド長、さらに好ましくは20〜40ヌクレオチド長である。また、上記検出方法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、本発明の薬剤に含まれるプライマー数は特に限定されないが、本発明の薬剤は、1の予後関連遺伝子に対して2以上のプライマーを含んでもよい。また、このようなプライマーは、上記検出方法に合わせ、当業者であれば公知の方法により設計し、作製することができる。
本発明の薬剤に含まれるプローブは、予後関連遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズし、該転写産物等の検出を可能とする限り特に限定されない。プローブはDNA、RNA、人工核酸又はそれらのキメラ分子等であり得る。プローブは、1本鎖又は2本鎖のいずれでもよい。プローブのサイズは、少なくとも約15ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは15〜1000ヌクレオチド長、より好ましくは20〜500ヌクレオチド長、さらに好ましくは30〜300ヌクレオチド長である。このようなプローブは、当業者であれば公知の方法により作製することができる。また、プローブは、マイクロアレイのように、基板上に固定された形態で提供されてもよい。
本発明の薬剤に含まれる抗体は、予後関連遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得る限り特に限定されない。例えば、該翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、また抗体の機能的断片(Fab、Fab’、scFv等)であってもよい。このような抗体は、当業者であれば公知の方法により作製することができる。また、抗体は、ELISA法や抗体アレイ等に用いるべく、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。
また、本発明の薬剤に含まれるオリゴヌクレオチド又は抗体は、上記検出方法に合わせ、標識用物質で標識されていてもよい。標識用物質としては、例えば、FITC、FAM、DEAC、R6G、TexRed、Cy5等の蛍光物質、β−D−グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、HRP等の酵素、H、14C、32P、35S、123I等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質が挙げられる。
また、本発明の薬剤は、前記オリゴヌクレオチド又は抗体の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、二次抗体等が挙げられる。
また、上記本発明の薬剤の他、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせることができ、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するためのキットとすることもできる。さらに、かかるキットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔1〕網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析によるサブタイプの同定
扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価する方法を開発するため、網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析により、扁平上皮がんの化学放射線療法による治療の予後に相関したサブタイプの同定を行った。
すなわち先ず、病期II−III期の局所進行食道扁平上皮がんの患者274例の治療前の生検組織からtotal RNAを抽出し、Affymetrix社の推奨する方法に従ってGeneChip(登録商標) Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayによる網羅的遺伝子発現プロファイルを得た。遺伝子発現プロファイルは、サブタイピング用107症例セット(セット−1)と、バリデーション用の167症例セット(セット−2)とに分け、スタンフォード大学から提供されているフリーソフトCluster 3.0及びJava TreeViewを用いて2次元クラスター解析(遺伝子プローブクラスターと症例クラスターの2次元系統樹を作成する方法)を行った。セット−1において、全ての症例で検出限界以下となる遺伝子プローブ(1つの遺伝子に複数のプローブが合成、搭載されている場合がある)、及び、症例間でシグナルの変動がない遺伝子プローブを除くことで2054遺伝子プローブを選び、臨床病理情報を入れない教師無しクラスター解析を行った。次に、得られた遺伝子プローブクラスターと症例クラスターの2次元系統樹のうち、遺伝子プローブクラスターを上位から7種のセットに分割した。7遺伝子プローブセットについて、症例セット−1、−2の遺伝子発現データにて個別にクラスター解析を行い、両セットで再現性良く遺伝子プローブセット全体のシグナル値が高発現を示す5種の症例クラスター、サブタイプ−1a、−2b、−3b、−5、−7を同定した。各サブタイプにおいて、サブタイプとその他のサンプルの生存曲線と5年生存率を全274例中の化学放射線療法(chemoradiotherapy,CRT)121例(セット−1=34例、セット−2=87例)を用いて比較し、再現性良く予後良好なサブタイプ−7と予後不良なサブタイプ−5を同定した(図1 参照)。
〔2〕化学放射線療法への感受性と、非感受性サブタイプの再分類
Agilent Technologies社の遺伝子発現解析アレイのデータマイニングソフトGeneSpringを用い、生物学的な意義を持ってCRT感受性サブタイプ−7と非感受性サブタイプ−5を分類できる遺伝子セットの選抜と、それら遺伝子を用いた再分類を、以下のA)〜C)の手順で行った。
A) 〔1〕で同定したサブタイプ−7と−5それぞれについて、サブタイプとその他のサンプルの間で遺伝子発現シグナル値のt検定(P<0.05)と平均値の比較(2倍以上)をセット−1で行い、サブタイプで有意に高発現している遺伝子を選抜した。
B) A)で選抜した遺伝子の組成から、サブタイプ−7においては転写因子SIM2による分化誘導経路の活性化を、サブタイプ−5においてはFOXE1による放射線、薬剤抵抗性経路の活性化をそれぞれ予測した。次に、SIM2、FOXE1と共発現している遺伝子を、セット−1におけるサンプル間の発現パターンの相関をピアソンの積率相関係数で評価(0.4以上)することで選抜した。選抜した遺伝子セットの組成より予測した2サブタイプで活性化されている分子経路の妥当性を確認した。
C)各サブタイプで、A)とB)に共通な遺伝子を選抜し、サブタイプ−7を分類するための191遺伝子セット(表1〜7)とサブタイプ−5を分類するための121遺伝子セット(表8〜12)を決定した。これら遺伝子セットを用いたクラスタリング解析によりセット−1と−2で各サブタイプの再分類とサブタイプに分類されたサンプル群とそれ以外のサンプル群の生存曲線の比較により、再現性良くCRT感受性サブタイプ−7と非感受性サブタイプ−5が分類されることが明らかになった(図2 参照)。
〔3〕純サブタイプ−7と−5の同定法
サブタイプ−7と−5に分類後、両方のサブタイプに属する一部のサンプルは、どちらのサブタイプにも属さないこととし、純サブタイプ−7、純サブタイプ−5、及び、その他に分類した(図3 参照)。
〔4〕純サブタイプ−7と−5のCRTと外科的切除治療の成績比較
〔3〕で分類された純サブタイプ−7、純サブタイプ−5、及び、それ以外について、CRT治療2ヵ月後の完全寛解率、生存曲線、及び5年生存率を比較した(表15、図4 参照)。さらに外科的切除(手術)施行65例についても同様にサブタイプ分類を行い、生存曲線と5年生存率を比較した(図4 参照)。
〔5〕CRT感受性サブタイプ−7を規定するSIM2遺伝子の分化誘導活性の評価
SIM2遺伝子の分化誘導活性を評価するため、理化学研究所BRC又はJCRBから入手した食道扁平上皮がん由来細胞株KYSE510、TE8へ、Lipofectamin(登録商標) 2000(Invitrogen社)を用い、pCMV−AC−GFPプラスミドベクターに連結されたSIM2遺伝子cDNAを一過的に導入した。対照群として、pCMV−neoプラスミドベクターを一過的に導入した。通常培地(RPMI1640又はDMEM、10%FBS)で1日間培養した後に、NanoCulture(登録商標) Plate (SCIVAX社)に播種し、通常培地で3日間培養した。total RNAを抽出し定量的RT−PCR法にて遺伝子の発現量を測定した。cDNAは、SuperScript(登録商標) III First−Strand Synthesis System for RT−PCR (Invitrogen社)に従い作製した。希釈したcDNAは、iQTM SYBER(登録商標) Green Supermix(BIO−RAD社)、プライマー及びヌクレアーゼフリー水と混合し、MyiQ(登録商標)(BIO−RAD社)により定量した。表13にプライマーの塩基配列を示す。その結果は図5に示した。
理化学研究所BRCから入手したTE8、JCRB細胞バンクから入手したKYSE510、及びT.Tnに、SIM2遺伝子を導入し、400μg/mlのG−418を含む培地で約2週間培養した。G418耐性コロニーを単離培養し、RT−PCR法によってSIM2遺伝子の発現を確認し、SIM2遺伝子安定発現株を樹立した。GFP発現プラスミドベクターのみを導入した細胞株を対照細胞株とした。total RNAを抽出し、SIM2遺伝子安定発現株における分化誘導活性を評価するため、NanoCulture(登録商標) PlateにSIM2遺伝子安定発現株を播種した後、通常培地で3日間培養した。total RNAを抽出し、RT−PCR法を行った。cDNAは、SuperScript(登録商標) III First−Strand Synthesis System for RT−PCRで合成し、希釈したcDNA をAccuPrime(登録商標) Taq DNA Polymerase System(Invitrogen)、プライマー及びヌクレアーゼフリー水と混合し、GeneAmp(登録商標) PCR System 9700(Applied Biosystem社)により増幅し、アガロースゲル電気泳動により、比較定量した。表14にプライマーの塩基配列を示す。その結果は図5に示した。
〔6〕2次元培養によるSIM2遺伝子安定発現株の抗がん剤感受性の評価
SIM2遺伝子安定発現株のシスプラチン(CDDP)、5−フルオロウラシル(5FU)、ドセタキセル(DTX)への感受性を評価するため、抗がん剤感受性試験を行った。6穴プレートにSIM2遺伝子安定発現株を播種し、通常培地にて1日間培養した後に、CDDP(2μM、5μM、10μM)、5FU(10μM)、DTX(1nM)添加培地又は通常培地で3日間培養した。薬物処置終了後、0.25%トリプシン/EDTAを用いて細胞を回収し、トリパンブルー染色後、生細胞数を計測した。その結果は図6に示した。
〔7〕3次元培養によるSIM2遺伝子安定発現株のシスプラチン感受性の評価
SIM2遺伝子安定発現株のCDDPの長期投与への感受性を評価するため、3次元培養を用いた抗がん剤感受性試験を行った。3.5cm NanoCulture(登録商標) PlateにSIM2遺伝子安定発現株を播種し、通常培地にて1日間培養した後に、CDDP(5x10−6M)を含む培地へ交換した。CDDP(5x10−6M)を含む培地を2日おきに交換しつつ、14日間培養した。薬物処置終了後、Spheroid Dispersion Solution(SCIVAX社)を用いて細胞を回収し、トリパンブルー染色後、生細胞数を計測した。その結果は図7に示した。
〔8〕2次元培養によるSIM2遺伝子安定発現株のγ線感受性の評価
SIM2遺伝子安定発現株の放射線への感受性を評価するため、γ線感受性試験を行った。6穴プレートにSIM2遺伝子安定発現株を播種し、通常培地にて1日間培養した後に、γ線照射(0Gy、1Gy、5Gy、10Gy)を行った。その後7日間培養し、0.25%トリプシン/EDTAを用いて細胞を回収し、トリパンブルー染色後、生細胞数を計測し、IC50を計算した。その結果は図8に示した。
以上の方法に基づき、得られた結果を以下に示す。
〔1〕網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく教師なしクラスター解析によるサブタイプの同定
症例セット−1で選抜した2054遺伝子プローブセットで教師なしクラスター解析を行い、遺伝子系統樹を7種に分け、症例セット−2での再現性を確認したところ、7種の遺伝子プローブクラスターのうち、セット−2でも再現されたものは5種の遺伝子プローブクラスターであった。図1に示すように、これら5種の遺伝子プローブセットを高発現する症例クラスター(サブタイプ)のうち、サブタイプ−7はCRTでの5年生存率がセット−1で64%、セット−2で75%と感受性を示した。一方、サブタイプ−5はCRTでの5年生存率がセット−1で11%、セット−2で28%と非感受性であった。
〔2〕化学放射線療法への感受性サブタイプと非感受性サブタイプとの再分類
セット−1においてCRT感受性サブタイプ−7とその他を比べて、t−検定でp<0.05の条件と平均発現強度が2倍以上の条件を満たす遺伝子プローブを選抜した結果、599種であった。その中に含まれるキーとなる転写因子、すなわちこれらの遺伝子の発現を支配している転写因子を症例ごとの発現量の相関解析によって探索したところSIM2を見出した。SIM2の発現と相関して発現する遺伝子は上記統計学的に選抜した599遺伝子プローブのうち256遺伝子プローブであった。同様に非感受性サブタイプ−5で特異的に発現する525遺伝子プローブのうち163遺伝子プローブと相関する転写因子FOXE1を同定した。次に、各256遺伝子プローブと163遺伝子プローブの数値データを使い、セット−1とセット−2でクラスター解析を行い、CRT感受性サブタイプ−7と非感受性サブタイプ−5を再分類し、生存曲線を描き、5年生存率を調べた結果を図2に示した。図2に示した通り、サブタイプ−7は5年生存率がセット−1で67%、セット−2で70%と成績が良かった。一方、サブタイプ−5はCRTでの5年生存率がセット−1で11%、セット−2で32%と不良であった。CRT感受性サブタイプ−7を規定する256遺伝子プローブを重複のない191種の遺伝子名として整理し、上述の表1〜7に示した。このCRT感受性サブタイプ−7を規定する191遺伝子には、食道扁平上皮の分化層で発現する遺伝子(分化マーカー)が多く含まれていた。一方、非感受性サブタイプ−5を規定する163遺伝子プローブは上述の表8〜12に121遺伝子として示した。これらの遺伝子には未分化な基底細胞マーカー等が多く含まれていた。したがって、SIM2は食道がんの分化を誘導し、FOXE1は分化を抑制することによって化学放射線抵抗性の獲得に寄与していることが示された。
〔3〕純サブタイプ−7と−5の同定
図3に示したように、セット−1の107症例中、サブタイプ−7に分類されるのは30例、サブタイプ−5に分類されるのは29例であった。重複は6例あったので、純サブタイプ−7は24例、純サブタイプ−5に分類されるのは23例であった。これら2種のサブタイプ以外の症例は60例であった。同様に、セット−2の167症例中、純サブタイプ−7は34例、純サブタイプ−5に分類されるのは48例であった。それ以外の症例は85例であった。
〔4〕純サブタイプ−7と−5におけるCRTと外科的切除治療との成績比較
〔3〕で分類された純サブタイプ−7、純サブタイプ−5、及びそれ以外の症例について、CRT治療2ヵ月後の完全寛解(CR,complete response)率を、表15に示した。なお、表15中、「ST」は「サブタイプ」を示し、「CR」は「完全寛解」を示し、「non CR」は「非寛解」を示す。表15に示した通り、CRT施行121例の完全寛解率が47%であるのに対し、純サブタイプ−7はセット−1で100%、セット−2で59%と再現性良く良好で全体では71%であった。一方、純サブタイプ−5は、セット−1で18%、セット−2で24%と再現性良く不良で全体では23%であった。
図4にCRT施行121例における純サブタイプ−7、純サブタイプ−5、及びそれ以外の症例の生存曲線、5年生存率を比較したデータを示した(左上:セット−1、右上:セット−2、左下:セット−1&−2)。また、全274例中の手術65例についても同様にサブタイプ分類を行い、生存曲線と5年生存率を比較した(右下:手術例)。CRT施行121例における5年生存率44%に対して純サブタイプ−7はセット−1で86%、セット−2で70%と再現性良く高く全体(セット−1&−2)では74%であった。一方サブタイプ−5の5年生存率は、セット−1で15%、セット−2で27%と再現性良く低く、全体(セット−1&−2)では24%であった。手術例においては、全65例おける5年生存率59%に対して純サブタイプ−7、純サブタイプ−5、及び、それ以外はそれぞれ62%、61%、57%と有意な差は認められなかった。したがって、サブタイプ−5とサブタイプ−7またはこのサブタイプ分類法は、外科的切除治療の予後の予知、予後因子ではなく、CRTの治療成績を予知するのに特化して有効であることが明らかになった。
〔5〕CRT感受性サブタイプ−7を規定するSIM2遺伝子の分化誘導活性の評価
図5の左に、食道扁平上皮がん細胞株KYSE510とTE8にSIM2遺伝子cDNAを導入後、3日目、5日目において、未分化基底細胞マーカーであるPDPNと分化マーカーSPRR1Aの発現を調べた定量的RT−PCRのデータを示した。SIM2遺伝子を導入後3日目で分化マーカーSPRR1Aが上昇し、未分化基底細胞マーカーPDPNの発現が下降した。この結果から、SIM2が未分化基底細胞の分化を誘導できることが明らかになった。
図5の右に、食道扁平上皮がん細胞株KYSE510、TE8、及びT.TnのSIM2安定発現細胞株(KYSE510−SIM2−27,−37、TE8−SIM2−2,−3、T.Tn−SIM2−9,−23)と対照ベクター導入株(KYSE510−Mock、TE8−Mock、T.Tn−Mock)を3次元培養し、SIM2、分化マーカー(CEA,FLG,KRT1,SPRR1A,MUC4)、及び未分化マーカー(VIM,PDPN,NGFR)の発現を調べたRT−PCRで調べたデータを示した。対照細胞に比べSIM2安定発現細胞では分化マーカーの発現が高く、未分化マーカーの発現が低くなっていた。このデータから、前述(図5の左)の一過性SIM2遺伝子発現誘導のデータと同様に、SIM2が未分化基底細胞の分化を誘導できることが確認された。
〔6〕2次元培養によるSIM2遺伝子安定発現株の抗がん剤感受性の評価
図6に示した通り、SIM2安定発現株(KYSE510−SIM2−27,−37、TE8−SIM2−2,−3、T.Tn−SIM2−9,−23)では、対照ベクター導入株(KYSE510−Mock、TE8−Mock、T.Tn−Mock)と比較して、シスプラチン(CDDP)、5−フルオロウラシル(5FU)、ドセタキセル(DTX)に対する感受性が上昇していることが明らかになった。すなわち、いずれのSIM2安定発現株では、通常のプレート2次元培養にて、3種の抗がん剤をIC50近傍の濃度で添加したところ、3日後の生細胞数が有為(*:p<0.05)に減っていた。
〔7〕3次元培養によるSIM2遺伝子安定発現株のシスプラチン感受性の評価
通常の2次元培養で、IC50近傍の濃度では、5日間以上の長期観察では細胞が飽和するため、3日間での効果を調べた。そのため、図6において示したCDDPの効果は有為ではあったが小さかった。そこで、CDDPに関しては3次元培養にて14日間の長期観察を行った。図7(左に生細胞数、右に細胞集塊)に示したように、SIM2安定発現株(T.Tn−SIM2−9,−23)では、対照ベクター導入株(T.Tn−Mock)と比較して、CDDPに対する感受性が著しく上昇していた。
〔8〕2次元培養によるSIM2遺伝子安定発現株のγ線感受性の評価
図8に示した通り、SIM2安定発現株(TE8−SIM2−2,−3、T.Tn−SIM2−9,−23)では、対照ベクター導入株(TE8−Mock、T.Tn−Mock)と比較して、γ線に対する感受性が上昇することが明らかになった。なお、KYSE510は親株、対照ベクター導入株(KYSE510−Mock)共に、γ線に高感受性のため評価から除外した。
〔9〕他国の食道扁平上皮がん、頭頚部扁平上皮がんでのサブタイプ−5、−7の存在確認
EMBL−EBIのArrayExpressデータベースからアクセス番号E−GEDO−23400の中国の食道扁平上皮がん53例とアクセス番号E−MTAB−1328のフランスの頭頚部扁平上皮がん89例のマイクロアレイデータとを、上記〔1〕−〔2〕と同様の方法でクラスター解析を行った。その結果、図には示さないが、他国の食道扁平上皮がんにおいても、さらには食道扁平上皮がんではない扁平上皮がん(頭頚部扁平上皮がん)においても、サブタイプ−5、−7の存在を確認することができた。
〔10〕網羅的遺伝子発現プロファイルに基づく発現変動の少ない参照遺伝子の同定
上述の通り、SIM2共発現遺伝子群の遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価することができる。さらに、FOXE1共発現遺伝子群の遺伝子の発現レベルも指標とすることにより、より精度高く前記有効性を評価することができる。また、このような遺伝子群の発現レベルを網羅的に解析する上で、本実施例においても用いているDNAマイクロアレイによる解析は有用である。
DNAマイクロアレイ解析法等の網羅的な解析においては、サンプル間で遺伝子の総発現量はほぼ同じであるという前提に基づき、当該サンプル間の遺伝子発現レベルを比較すること(グローバルノーマライゼーション)ができる。
しかしながら、遺伝子解析数に限りのあるPCR等による解析においては、このようなグローバルノーマライゼーションを用いることはできない。そのため、サンプル間で発現変動の少ない遺伝子(参照遺伝子)の発現量を基準として、解析対象である遺伝子の発現量をその相対量(発現レベル)に換算した上で、当該サンプル間の遺伝子発現レベルを比較することが行われる。
また、PCR等による解析においては、通常、恒常的に発現しており、一般的に発現変動が少ないと言われている、β−アクチンやGAPDH等が参照遺伝子として用いられているが、扁平上皮がんを対象とした場合に、それらが参照遺伝子として適当であるとは限らない。そこで、β−アクチン等よりもより有効な扁平上皮がんにおける参照遺伝子を同定すべく、以下の解析を行った。
上述の〔1〕で得られた、GeneChip(登録商標) Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayによる食道扁平上皮癌患者274例の治療前の生検組織からの網羅的遺伝子発現プロファイルに基づき、症例間で発現変動の少ない標準遺伝子の順位付けを行った。発現変動の少ない標準遺伝子の順位付け方法として下記3通りの方法を用いて検討した。
方法1:シグナル値の95%パーセンタイルと5%パーセンタイルを遺伝子プローブごとに算出し、その差を各遺伝子プローブのシグナル値の中央値(50%パーセンタイル)で除算する。
方法2:シグナル値の中央絶対偏差を遺伝子プローブごとに算出し、その差を各遺伝子プローブのシグナル値の中央値で除算する。
方法3:シグナル値の標準偏差を遺伝子プローブごとに算出し、その差を各遺伝子プローブのシグナル値の平均値で除算する。
以上3種類の方法で、遺伝子発現変動の大きさを評価した。すなわち、いずれの方法においても、遺伝子発現変動が小さければ算出される数値も小さくなるため、その数値が小さい順に遺伝子プローブを並べて評価した。なお、1つの遺伝子について、複数のプローブが前記Arrayには合成、搭載されている場合があるため、同一遺伝子については、各方法で算出された最も小さな数値を選択し、残りは除外した。このようにして解析した結果のうち、β−アクチンと同等以上に発現変動の少ないものとして評価された遺伝子を、表16〜32に示す。表16〜19には、前記方法1により同定された計243遺伝子を示し、表20〜26には、前記方法2により同定された計377遺伝子を示し、表27〜32には、方法3により同定された計330遺伝子を示す。
このようにして得られた、β−アクチンと同等以上の有用な参照遺伝子(コントロール遺伝子)において、いずれの方法においても上位10の遺伝子に含まれている、SRSF3、TPM3、ZNF207、ZNF143、PUM1、RAB1A及びLOC101059961は、扁平上皮がんの遺伝子発現レベルを解析する上でより有用な参照遺伝子である。特に、SRSF3遺伝子は、方法1〜3のいずれでも、最上位であり、最も有用な参照遺伝子である。
〔11〕小数遺伝子セットを用いたサブタイプ分類
上述の通り、PCR等による解析においては、解析する遺伝子の数を少数に限定することが望まれる。そこで、少ない遺伝子群を解析対象としても、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価できることを確認するため、サブタイプ−5の分類に有用な163遺伝子プローブ(表8〜12 参照)、また、サブタイプ−7の分類に有用な256遺伝子プローブ(表1〜7 参照)から、さらなる遺伝子プローブの絞り込みを検討した。
具体的には、効率的な遺伝子組み合わせに基づくモデル構築手法の一種であるブースティング(重み付け多数決決定法)を用い、サブタイピング用107症例セット(上述のセット−1)により遺伝子を選抜し、バリデーション用の167症例セット(上述のセット−2)を用いて評価を行った。また、その際には、[10]において、方法1〜3のいずれも1位であったSRSF3遺伝子を参照遺伝子として用い、各遺伝子プローブのシグナル値をSRSF3遺伝子のシグナル値で除算したシグナル比を用いて検討を行った。なお、ブースティングとは、単純な予測モデルを効率的に選択し、適切な重みを定義し、重み付き多数決により組み合わせ判定することで高精度な予測結果を得る手法である。本実施例では、単純な予測モデルとして各遺伝子に基づく深さ1の決定木を構築し、モデル数を1から20個まで増加させた場合のセット−1、−2のそれぞれの予測誤差をサブタイプごとに算出した。この場合の各遺伝子に基づく深さ1の決定木とは、各遺伝子のシグナル比のある閾値を基準に、2値化したものである。このようにして、モデル数を1から延べ20個まで増加させた場合のセット−1、−2の予測誤差を各サブタイプ(−5、−7)について示した結果を、図9に示す。
図9に示す通り、解析の対象とする遺伝子数が1であっても、その予測誤差が0.1程度に抑えられており、本発明に係る遺伝子の有用性が確認された。また、学習データであるセット−1についてはモデル数の増加とともに予測誤差が低下したが、評価データであるセット−2については、モデル数5が最小誤差を示した。また、いずれのサブタイプ予測でも同様な傾向が得られ、モデル数5のとき、サブタイプ−5で正答率95.8%、サブタイプ−7で正答率98.2%に達した。このことから、セット−1とセット−2で共通の閾値が使用できること、SRSF3遺伝子が参照遺伝子として極めて有用できること、及びわずか5モデルからなる遺伝子セットでも、極めて高い精度にて各サブタイプを予測可能なことが確認できた。なお、各サブタイプに対する5モデルの遺伝子セット、そのシグナル比の閾値、モデルの重みは、表33及び34に示した通りである。また、表33においては、LOC344887が延べ2回選択されているが、これは、シグナル比の閾値やモデルの重みの違いから、同一の遺伝子が重複して選択されている故である。さらに、このときの純サブタイプ−5、−7に関する生存解析は、図11及び12に示すように、サブタイプ−5の分類に有用な163遺伝子プローブ、また、サブタイプ−7の分類に有用な256遺伝子プローブを全て用いた解析に準ずることも確認できた。
〔12〕リサンプリングによる遺伝子セットの評価、及び順位付け
上記[11]等における予備的な検討から、多数の有用な小数遺伝子セットが存在することが示唆された。そこで、セット−1の107症例のデータから、重複を許して200症例分を選択するリサンプリングを行い1000回行った。各リサンプリングで得られた学習用データとしたモデル構築を行い、セット−1と−2を用いて評価を行った。この1000回のリサンプリングに基づき平均予測誤差を算出し、また、各リサンプリングで選択された5モデルの遺伝子セットで選択された遺伝子を、選択回数で遺伝子の順位付けを行った。遺伝子セットは、サブタイプ−5の分類に有用な163遺伝子プローブから、また、サブタイプ−7の分類に有用な256遺伝子プローブから選択し、異なる遺伝子プローブが選ばれても同一遺伝子ならば合算した選択回数を算出した。そして、このようにして、1000回のリサンプリングにおいて、モデル数1〜延べ20までのセット−1、−2における予測誤差の平均値を算出した。得られた結果を、図13及び14に示す。
図13及び14に示した結果から明らかな通り、5モデルの遺伝子セットで、セット−2の予測の正答率が最大になり、より具体的には、サブタイプ−5で平均正答率94.4%、サブタイプ−7で正答率97.6%に達することが確認された。
また、1000回のリサンプリングの5モデルに含まれる遺伝子を集計したところ、上位に選択される遺伝子には偏りがあり、サブタイプ−5においては56遺伝子(表35 参照)が選抜され、またサブタイプ−7では69遺伝子(表36 参照)が選抜された。
したがって、サブタイプ−5の分類に有用な163遺伝子(表8〜12 参照)及びサブタイプ−7の分類に有用な256遺伝子(表1〜7 参照)において、表35及び36の遺伝子が特に、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価する上で有用な遺伝子であることが確認された。
以上説明したように、本発明によれば、SIM2共発現遺伝子群から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価することができる。さらに、FOXE1共発現遺伝子群から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルも指標とすることにより、より精度高く前記有効性を評価することができる。
したがって、本発明の評価方法及び該方法に用いられる薬剤は、扁平上皮がんの治療方針を決定する上で極めて有効である。
配列番号:1〜20
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列

Claims (3)

  1. 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法
    (a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
    (b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
    (c)工程(b)における比較の結果、前記被検体における発現レベルが各基準発現レベルよりも高い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
  2. 扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための方法であって、下記工程(a)〜(c)を含む方法
    (a)被検体から分離された扁平上皮がん試料について、SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベル、並びに、FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルを検出する工程、
    (b)工程(a)で検出した発現レベルを各遺伝子の基準発現レベルと比較する工程、
    (c)工程(b)における比較の結果、前記被検体におけるSIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも高く、かつ前記被検体におけるFOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現レベルが各基準発現レベルよりも低い場合、前記被検体における扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性は高いと判定する工程。
  3. 請求項1又は2に記載の方法により、扁平上皮がんに対する化学放射線療法の有効性を評価するための薬剤であって、下記(a)〜(d)から選択される少なくとも1の化合物を含む薬剤
    (a)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド
    (b)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の転写産物又はその相補的核酸にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオド
    (c)SIM2遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体
    (d)FOXE1遺伝子及び該遺伝子と共発現している遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体。
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