CN108315323A - 尿液ctDNA中PIK3CA基因突变位点的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了尿液ctDNA中PIK3CA基因突变位点的检测，具体提出了从尿液样本中分离ctDNA的方法、基于尿液样本构建测序文库的方法、测序文库、基于尿液样本进行核酸测序方法、用于从尿液样本中分离ctDNA的设备以及确定个体药物敏感性的系统。从尿液样本中分离ctDNA的方法包括：向尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；将混合液进行离心处理，收集上清液；将上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；将浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及将洗脱液进行纯化处理，以便得到ctDNA。本发明能够从大量尿液样本中快速、大量地提取出ctDNA，并能够对其进行核酸测序，还可以确定个体药物敏感性，从而提高了尿液ctDNA的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及尿液ctDNA中PIK3CA基因突变位点的检测。
背景技术
循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是由肿瘤细胞释放到循环系统如血液中的基因组小片段，其来源于机体所有肿瘤部位，具有含量极低、个体间差异大、半衰期短、匀质性、携带有肿瘤特异性遗传学/表观遗传学变异等特点。这些来自肿瘤基因组的DNA片段会携带一定的特征，包括突变，缺少，插入，重排，拷贝数异常及甲基化等。
然而，目前对于ctDNA的获得方式及其应用仍有待开发。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种从尿液样本中分离ctDNA的方法、基于尿液样本构建测序文库的方法、测序文库、基于尿液样本进行核酸测序方法、用于从尿液样本中分离ctDNA的设备以及确定个体药物敏感性的系统。本发明能够从大量尿液样本中快速、大量地提取出ctDNA，并能够对其进行核酸测序，还可以确定个体药物敏感性，从而提高了尿液ctDNA的应用前景。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种从尿液样本中分离ctDNA的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向所述尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；将所述第一混合液进行离心处理，收集上清液；将所述上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；将所述浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将所述第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。发明人发现，采用离子交换层析方法能够快速、大量地分离得到尿液样本中的ctDNA。
根据本发明的实施例，上述从尿液样本中分离ctDNA的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述方法包括：向110毫升所述尿液样本中加入终浓度为10mmoL/L的EDTA，以便得到第一混合液；将所述第一混合液在18～23℃的温度、1800g的转速下离心10分钟，收集上清液；将所述上清液浓缩至4毫升，以便得到浓缩液；将所述浓缩液与750微升Q琼脂糖阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；将所述第二混合液进行色谱柱洗脱处理，以便得到洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。
发明人发现，离心处理条件、浓缩体积及其与阴离子交换树脂的用量比会影响提取效果。进而，发明人经过大量实验发现，将混合液在18～23℃的温度、1800g的转速下离心10分钟，能够有效地取出细胞碎片、杂质。接着，由于尿液样本中ctDNA含量相对较低，进而通过将含有ctDNA的上清液浓缩至4毫升，所得到的浓缩液中ctDNA含量较高，便于后续对ctDNA的利用。进一步地，发明人经过大量实验发现，采用Q琼脂糖阴离子交换树脂进行离子交换层析，能够有效地吸附ctDNA，从而提高ctDNA的提取率。另外，基于4毫升的浓缩液，阴离子交换树脂的用量为750微升，在这两者用量比的条件下，能够充分吸附ctDNA，若阴离子交换树脂的用量过少，会有少量ctDNA未被吸附、收集，若阴离子交换树脂的用量过多，提高分离成本。此外，EDTA的添加能够抑制核酸酶的活性，防止其将ctDNA降解。然而，其他离心处理条件、浓缩体积及其与树脂的用量比的效果不佳。由此，根据本发明实施例的从尿液样本中分离ctDNA的方法进一步快速、大量地分离得到尿液样本中的ctDNA。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种基于尿液样本构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：基于尿液样本，按照前面从尿液样本中分离ctDNA的方法分离ctDNA；对所述ctDNA进行扩增，以便获得扩增产物；以及在所述扩增产物的末端添加接头序列，以便获得连接产物，所述连接产物构成所述测序文库。发明人发现，利用前面从尿液样本中分离ctDNA的方法分离ctDNA，以ctDNA作为模板，构建测序文库，由此可以实现对ctDNA的分析。
根据本发明的实施例，采用特异性识别所述ctDNA突变位点的引物及探针进行所述扩增，所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：1～4所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：5～8所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQID NO：9～12所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：13～16所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：17～20所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：21～24所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：25～28所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ IDNO：29～32所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：33～36所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：37～40所示的核苷酸序列；或者所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：41～44所示的核苷酸序列。
PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，其定位于3q26.3，长34kb，包含21个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生一组长124kD的蛋白。PIK3CA基因可能通过参与PI3K/AKT细胞信号转导途径调节细胞的生长和凋亡。
发明人经过大量实验得到上述引物序列，该11对引物及探针分别针对PIK3CA基因(具体序列参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_006218.3)中的8个突变位点的目标区域设计的，能够特异性地结合到突变位点，以便对其进行扩增，便于后续检测、分析需要。
需要说明的是，可以根据实际需要选择任意一对引物及探针或者多对引物及探针进行扩增，例如针对单突变位点的研究，可以仅扩增所需突变位点的目标区域；针对多突变位点的研究，可以选择多对引物及探针，在一个或者多个扩增体系中实现目标区域的扩增。
表1引物及探针的核苷酸序列
根据本发明的实施例，采用数字PCR进行所述扩增，基于50微升的PCR反应体系，所述PCR反应体系包括：25μL的1×DNA聚合酶；2μL的1×油滴稳定剂；2μL的12.5μM的正向引物；2μL的12.5μM的反向引物；2μL的5μM的正向探针；2μL的5μM的反向探针；1～15μL的所述尿液ctDNA，所述尿液ctDNA预先用5ng/μL的carrier RNA进行稀释；以及剩余的双蒸水。
数字PCR一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。发明人以ctDNA为模板，将PCR反应体系利用RainDropSource(RainDance Technologies)系统将单个分子分散至油包水液滴中，制备好的油滴经第一步PCR扩增捕获目标区域，破坏油滴释放扩增子，再通过第二步PCR添加适用于illumina测序平台的接头序列，磁珠法纯化DNA。发明人经过大量实验得到较佳的PCR反应体系，由此，能够快速、准确地扩增捕获目标区域。其中，由于ctDNA含量较少，容易挂在反应管壁上，carry RNA能够增大体系中的核酸浓度，使得相同体积的挂壁液体中大部分是carry RNA，有利于ctDNA的富集反应，而且carry RNA不会对下一阶段反应产生影响。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对从尿液样本中分离ctDNA的方法所描述的特征和优点，同样适用于该基于尿液样本构建测序文库的方法，在此不再赘述。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库是通过前面基于尿液样本构建测序文库的方法获得的。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对基于尿液样本构建测序文库的方法所描述的特征和优点，同样适用于该测序文库，在此不再赘述。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种基于尿液样本进行核酸测序方法。所述方法包括：基于尿液样本，按照前面基于尿液样本构建测序文库的方法构建测序文库；以及对所述测序文库进行核酸测序。由此，根据本发明实施例的基于尿液样本进行核酸测序方法能够准确、快速地实现核酸测序。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对基于尿液样本构建测序文库的方法所描述的特征和优点，同样适用于该基于尿液样本进行核酸测序方法，在此不再赘述。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于从尿液样本中分离ctDNA的设备。根据本发明的实施例，所述设备包括：添加单元，适于向所述尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；离心单元，所述离心单元与所述添加单元相连，适于将所述第一混合液进行离心处理，收集上清液；浓缩单元，所述浓缩单元与所述离心单元相连，适于将所述上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；混合单元，所述混合单元与所述浓缩单元相连，适于将所述浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；色谱分离单元，所述色谱分离单元与所述混合单元相连，适于将所述第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及纯化单元，所述纯化单元与所述色谱分离单元相连，适于将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。由此，根据本发明实施例的用于从尿液样本中分离ctDNA的设备能够快速、大量地分离得到尿液样本中的ctDNA。
根据本发明的实施例，所述设备包括：添加单元，适于向110毫升所述尿液样本中加入终浓度为10mmoL/L的EDTA，以便得到第一混合液；离心单元，所述离心单元与所述添加单元相连，适于将所述第一混合液在18～23℃的温度、1800g的转速下离心10分钟，收集上清液；浓缩单元，所述浓缩单元与所述离心单元相连，适于将所述上清液浓缩至4毫升，以便得到浓缩液；混合单元，所述混合单元与所述浓缩单元相连，适于将所述浓缩液与750微升Q琼脂糖阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；色谱分离单元，所述色谱分离单元与所述混合单元相连，适于将所述第二混合液进行色谱柱洗脱处理，以便得到洗脱液；以及纯化单元，所述纯化单元与所述色谱分离单元相连，适于将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。由此，根据本发明实施例的用于从尿液样本中分离ctDNA的设备能够进一步快速、大量地分离得到尿液样本中的ctDNA。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种确定个体药物敏感性的系统。根据本发明的实施例，所述系统包括：核酸分离设备，所述核酸分离设备为前面所述的用于从尿液样本中分离ctDNA的设备；文库构建设备，所述文库构建设备与所述核酸分离设备相连，用于基于所述核酸分离设备中所获得的ctDNA构建测序文库；测序设备，所述测序设备与所述文库构建设备相连，所述测序设备用于对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及分析设备，所述分析设备与所述测序设备相连，所述分析设备基于所述测序结果确定所述ctDNA中是否携带预定的突变位点。
发明人发现，利用该系统能够准确、快速地确定ctDNA中是否携带预定的突变位点，具有较大的科研或者临床诊断、治疗的应用前景。例如可以以该突变位点作为靶向用药位点，通过确定ctDNA中是否携带预定的突变位点，以便于指导用药。具体地，若ctDNA中携带预定的突变位点，是个体药物对该突变位点具有敏感性的指示，该突变位点可以视作靶向用药位点；若ctDNA中不携带预定的突变位点，是个体药物对该突变位点不具有敏感性的指示。由此，利用根据本发明实施例的确定个体药物敏感性的系统能够快速、准确地确定ctDNA中是否携带预定的突变位点，从而确定个体药物敏感性。
另外，文库构建设备之所以选择以尿液样本中的ctDNA构建文库，主要具有如下原因：
现有技术通常采用静脉采血，用于提取核酸样本进行检测。但是，静脉采血会带来的临床和运输上的诸多麻烦，例如由于静脉管壁脆弱、狭小或者难以定位所造成的采血上的不便，且目前采血需要在特定科室和临床人员配合下才能进行，做不到真正意义上的便捷无创。另外，以ctDNA检测作为临床诊断辅助指标也有自身的局限性，它通常高度片段化，在整个血液循环系统的游离核酸中所占比例及其微少，因此需要大量采集血液样本，才能充分反映肿瘤DNA的变异情况。然而肿瘤晚期患者健康状况差，大量采血对病人身体仍会造成一定的创伤，样本过少会导致DNA含量不足不能够用于分子检测，且对于晚期转移的肿瘤患者，由于肿瘤异质性的特点，DNA数量过少会导致分析结果无法反应病人的全面情况。
进而，发明人发现，以尿液样本作为ctDNA来源，尿液样本的收集较为便捷，且收集量大，便于后续检测。
根据本发明的实施例，所述个体药物用于治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌或者卵巢癌。发明人发现，预先确定ctDNA中是否携带预定的突变位点，若携带预定的突变位点，可以对其施加用于治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌或者卵巢癌的药物，该药物可以作用于该突变位点，实现治疗目的。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对用于从尿液样本中分离ctDNA的设备所描述的特征和优点，同样适用于该确定个体药物敏感性的系统，在此不再赘述。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法确定尿液样本中ctDNA中是否携带预定的突变位点：
1、尿液ctDNA的分离
对肺癌患者用药(吉非替尼)，对尿液样本连续采样，在用药前和用药后每21天进行采样，采集患者空腹晨尿。用120ml收集杯收集110ml尿液，加入EDTA使其终浓度为10mmol/L，用来抑制核酸酶的活性。将混合液于1800g的转速及18℃～23℃的温度下离心10min，收集上清，上清经超滤管浓缩至4mL，将浓缩后的样本与750μl的Q Sepharose阴离子交换树脂混合，置于旋转仪上室温孵育，将收集的沉淀利用Micro Bio-SpinTM(BioRad)色谱柱清洗后洗脱，洗脱后的DNA用QiaQuick columns(Qiagen)进一步纯化。
2、构建测序文库
用Covaris破碎仪将尿液ctDNA随机打断成长度为200bp大小的片段，分别作为模板配制第一步PCR体系，将PCR反应体系利用RainDrop Source(RainDance Technologies)系统将单个分子分散至油包水液滴中，制备好的油滴经第一步PCR扩增捕获目标区域，破坏油滴释放扩增子，再通过第二步PCR添加适用于illumina测序平台的接头序列，磁珠法纯化DNA，对完整的DNA文库用Agilent 2100检测仪检测片段大小，利用文库定量试剂盒精确定量DNA浓度，质检合格的文库进行后续实验。
其中，PCR反应体系如下：
25μL的1×DNA聚合酶；
2μL的1×油滴稳定剂；
2μL的12.5μM的正向引物；
2μL的12.5μM的反向引物；
2μL的5μM的正向探针；
2μL的5μM的反向探针；
10μL的所述尿液ctDNA，尿液ctDNA预先用5ng/μL的carrier RNA进行稀释；以及剩余的双蒸水。
具体引物及探针序列如下表所示。
3、高通量测序
对于游离DNA中含量极低的循环肿瘤DNA片段，目标测序深度为20000×，根据捕获区间大小计算文库输入量。我们目标捕获区域片段长度主要集中在160-200bp之间，选择PE100测序策略通illumina公司的HiSeq X Ten测序仪进行高通量测序，下机数据Q30在85％以上的进行后续生信分析。
4、生物信息学分析
对获得的下机数据按index进行拆分，得到原始测序序列(Raw Reads)。对RawReads的数据量、碱基含量、碱基质量等结果进行统计，过滤不合格的数据，得到CleanReads。在有参考序列或参考基因组(hg19)的情况下，将Clean Data按分段比对的方式比对到参考基因组上。修正后的比对结果将作为输入文件进行突变检测、注释和统计。在体细胞SNV、Indel的检测过程中，对正常样本(normal)和肿瘤样本(tumor)进行成对分析，以检测出体细胞内与肿瘤发生相关的突变；在突变注释结果中，选取SIFT scores和PolyPhen2HDIV scores对得到的非同义突变进行保守性预测和致病性分析。
其中，ctDNA拷贝数大于6，是患者具有突变位点的指示，ctDNA拷贝数小于等于6，是患者不具有突变位点的指示。
实施例2
在该实施例中，验证以尿液ctDNA作为检测对象的准确性。
具体地，分别设置三个对照组：
对照组1：对肺癌患者用药(吉非替尼)，在用药前和用药后每21天收集组织活检样本，将收集的样本进行石蜡包埋，通过苏木素伊红染色后预估肿瘤细胞含量，包含肿瘤组织的样本可用于后续分析,使用商业化试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen)提取癌组织DNA。
对照组2：对肺癌患者用药(吉非替尼)，在用药前和用药后每21天进行采样，采集病人当天空腹静脉外周血。用streck公司EDTA抗凝的真空采血管采集血液样本，采血后30min内分离血浆(1800g，10min，18℃-23℃)，将分离的血浆低于-70℃保存。分离的血细胞用商业化试剂盒AllPrep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen)提取基因组DNA。
对照组3：将对照组2所得到的血浆采用QIAamp游离核酸提取试剂盒(Qiagen)按照操作说明提取1.5-4.0ml血浆中的ctDNA用于后续分析。
分别将对照组1～3所得到的癌组织DNA、血细胞DNA以及血浆ctDNA作为模板，依次进行步骤2～4的操作。
结果表明，尿液ctDNA与癌组织DNA、血细胞DNA以及血浆ctDNA的突变信息一致，说明尿液ctDNA能够准确地确定是否存在突变位点，对指导用药具有重要意义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 索真（北京）医学科技有限公司
<120> 尿液ctDNA中PIK3CA基因突变位点的检测
<130> PIDC3171002
<160> 44
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cggttgccta ctggttcaat 20
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 3
cgctcttccg atctctggca agaaaatacc ccctcca 37
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 4
tgctcttccg atctgaccgg ttgcctactg gttcaat 37
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 5
caagacgact ttgtgacctt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 引物
<400> 6
ttacgaaggt attggtttag aca 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 7
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<211> 40
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<223> 探针
<400> 8
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<210> 9
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<220>
<223> 引物
<400> 9
catttccaca gctacaccat 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 10
agcatcagca tttgacttta c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 11
cgctcttccg atctctgcat ttccacagct acaccat 37
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
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tgctcttccg atctgacagc atcagcattt gactttac 38
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 13
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 14
tcaatcagcg gtataatcag g 21
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
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<220>
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<210> 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 16
tgctcttccg atctgactca atcagcggta taatcagg 38
<210> 17
<211> 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 17
ttgttgaatt ttccttttgg gga 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 18
tgaggtactg gccaaagatt ca 22
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
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cgctcttccg atctctgttg ttgaattttc cttttgggga 40
<210> 20
<211> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 20
tgctcttccg atctgactga ggtactggcc aaagattca 39
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 21
ccattggcat ggggaaatat aa 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 22
gagagaaggt ttgactgcca 20
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 23
cgctcttccg atctctgcca ttggcatggg gaaatataa 39
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 24
tgctcttccg atctgacgag agaaggtttg actgcca 37
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 25
caaagaacag ctcaaagcaa 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 26
gctgagatca gccaaattca 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 27
cgctcttccg atctctgcaa agaacagctc aaagcaa 37
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
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<220>
<223> 探针
<400> 28
tgctcttccg atctgacgct gagatcagcc aaattca 37
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 29
cctgcttttg gagtcctatt 20
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 30
cacaaactag agtcacacac c 21
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 31
cgctcttccg atctctgcct gcttttggag tcctatt 37
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 32
tgctcttccg atctgaccac aaactagagt cacacacc 38
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 33
aaatggaaac ttgcaccctg 20
<210> 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 34
tgacgatctc caattcccaa 20
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 35
cgctcttccg atctctgaaa tggaaacttg caccctg 37
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 36
tgctcttccg atctgactga cgatctccaa ttcccaa 37
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 37
atgatgcttg gctctggaat 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 38
tcagttcaat gcatgctgtt t 21
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 39
cgctcttccg atctctgatg atgcttggct ctggaat 37
<210> 40
<211> 38
<212> DNA
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<220>
<223> 探针
<400> 40
tgctcttccg atctgactca gttcaatgca tgctgttt 38
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 41
cattcgaaag accctagcct 20
<210> 42
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 42
taacagtgca gtgtggaatc 20
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 43
cgctcttccg atctctgcat tcgaaagacc ctagcct 37
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针
<400> 44
tgctcttccg atctgactaa cagtgcagtg tggaatc 37
Claims (10)
1.一种从尿液样本中分离ctDNA的方法，其特征在于，包括：
向所述尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；
将所述第一混合液进行离心处理，收集上清液；
将所述上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；
将所述浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；
将所述第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及
将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：
向110毫升所述尿液样本中加入终浓度为10mmoL/L的EDTA，以便得到第一混合液；
将所述第一混合液在18～23℃的温度、1800g的转速下离心10分钟，收集上清液；
将所述上清液浓缩至4毫升，以便得到浓缩液；
将所述浓缩液与750微升Q琼脂糖阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；
将所述第二混合液进行色谱柱洗脱处理，以便得到洗脱液；以及
将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。
3.一种基于尿液样本构建测序文库的方法，包括：
基于尿液样本，按照权利要求1或2所述的方法分离ctDNA；
对所述ctDNA进行扩增，以便获得扩增产物；以及
在所述扩增产物的末端添加接头序列，以便获得连接产物，所述连接产物构成所述测序文库。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用特异性识别所述ctDNA突变位点的引物及探针进行所述扩增，
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：1～4所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：5～8所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：9～12所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：13～16所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：17～20所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：21～24所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：25～28所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：29～32所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：33～36所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：37～40所示的核苷酸序列；或者
所述引物和探针分别具有如SEQ ID NO：41～44所示的核苷酸序列，
任选地，采用数字PCR进行所述扩增，
基于50微升的PCR反应体系，所述PCR反应体系包括：
25μL的1×DNA聚合酶；
2μL的1×油滴稳定剂；
2μL的12.5μM的正向引物；
2μL的12.5μM的反向引物；
2μL的5μM的正向探针；
2μL的5μM的反向探针；
1～15μL的所述尿液ctDNA，所述尿液ctDNA预先用5ng/μL的carrier RNA进行稀释；以及
剩余的双蒸水。
5.一种测序文库，其特征在于，所述测序文库是通过权利要求3或4所述的方法获得的。
6.一种基于尿液样本进行核酸测序方法，其特征在于，包括：
基于尿液样本，按照权利要求3或4所述的方法构建测序文库；以及
对所述测序文库进行核酸测序。
7.一种用于从尿液样本中分离ctDNA的设备，其特征在于，包括：
添加单元，适于向所述尿液样本中加入EDTA，以便得到第一混合液；
离心单元，所述离心单元与所述添加单元相连，适于将所述第一混合液进行离心处理，收集上清液；
浓缩单元，所述浓缩单元与所述离心单元相连，适于将所述上清液进行浓缩处理，以便得到浓缩液；
混合单元，所述混合单元与所述浓缩单元相连，适于将所述浓缩液与阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；
色谱分离单元，所述色谱分离单元与所述混合单元相连，适于将所述第二混合液进行色谱分离处理，以便得到洗脱液；以及
纯化单元，所述纯化单元与所述色谱分离单元相连，适于将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。
8.根据权利要求7所述的设备，其特征在于，包括：
添加单元，适于向110毫升所述尿液样本中加入终浓度为10mmoL/L的EDTA，以便得到第一混合液；
离心单元，所述离心单元与所述添加单元相连，适于将所述第一混合液在18～23℃的温度、1800g的转速下离心10分钟，收集上清液；
浓缩单元，所述浓缩单元与所述离心单元相连，适于将所述上清液浓缩至4毫升，以便得到浓缩液；
混合单元，所述混合单元与所述浓缩单元相连，适于将所述浓缩液与750微升Q琼脂糖阴离子交换树脂进行混合处理，以便得到第二混合液；
色谱分离单元，所述色谱分离单元与所述混合单元相连，适于将所述第二混合液进行色谱柱洗脱处理，以便得到洗脱液；以及
纯化单元，所述纯化单元与所述色谱分离单元相连，适于将所述洗脱液进行纯化处理，以便得到所述ctDNA。
9.一种确定个体药物敏感性的系统，其特征在于，包括：
核酸分离设备，所述核酸分离设备为权利要求7或8所述的用于从尿液样本中分离ctDNA的设备；
文库构建设备，所述文库构建设备与所述核酸分离设备相连，用于基于所述核酸分离设备中所获得的ctDNA构建测序文库；
测序设备，所述测序设备与所述文库构建设备相连，所述测序设备用于对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
分析设备，所述分析设备与所述测序设备相连，所述分析设备基于所述测序结果确定所述ctDNA中是否携带预定的突变位点。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述个体药物用于治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌或者卵巢癌。
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