MXPA05006978A

MXPA05006978A - Metodos para inducir y mantener la tolerancia inmune.

Info

Publication number: MXPA05006978A
Application number: MXPA05006978A
Authority: MX
Inventors: Jonathan Sedgwick
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2005-08-16
Also published as: EP1585545A4; CA2511513A1; US20040213783A1; US20070065438A1; AU2003299823A8; WO2004060295A3; WO2004060295A2; JP2006512396A; EP1585545A2; AU2003299823A1

Abstract

Se proporcionan metodos para mejorar y mantener la tolerancia inmune mediante la modulacion de la CD200 o el CD200R; se proporcionan antagonistas de los mismos, incluyendo anticuerpos.

Description

METODOS PARA INDUCIR Y MANTENER LA TOLERANCIA INMUNE CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con métodos para modular la fisiología de mamíferos, incluyendo la función del sistema inmune. En particular, proporciona métodos para inducir y mantener la tolerancia inmune utilizando moduladores de la CD200 o el CD200R.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La regulación de la respuesta inmune a la infección o a las lesiones, involucra señales de inicio, así como señales de terminación, que restablecen y mantienen la homeóstasis inmunológica. Estos procesos reguladores pueden involucrar familias de genes que codifican los receptores relacionados con las funciones opuestas que permiten la sintonización fina de la respuesta inmune al desafío del antígeno. Las células que presentan el antígeno (APC) del linaje mieloide, tales como los macrófagos y las células dendríticas (DC), son centrales para estos procesos reguladores. La importancia de esta modulación es demostrada por los trastornos autoinmunes y linfoproliferativos, algunas veces fatales, observados en ratones con una interrupción dirigida de los receptores inhibidores. Los ligandos B7.1 y B7.2 para CD28 y CTLA-4 representan un punto de control vital para los linfocltos T y en las células mieloides, las proteínas que regulan la señal SIRP y SIRP , se han identificado con papeles recíprocos en la función de las células mieloides. La CD200, también conocida como OX-2, se ha identificado como un posible regulador negativo tanto de las células mieloides que presentan el antígeno como de los linfocitos T activados. De manera alterna, se reporta que la CD200, que tiene una homología de la secuencia con las moléculas de B7.1 y B7.2, funciona como una molécula coestimuladora, que induce la proliferación de los linfocitos T, pero con patrones alterados de secreción de la citocina. Así, de manera similar a otros correceptores negativos descritos recientemente, la CD200 puede ejercer diferentes efectos en diferentes puntos en la respuesta inmune, aunque los mecanismos involucrados son desconocidos en la actualidad (véase, por ejemplo, Lanier (2001 ) Curr. Opin. Immunol. 13:326-331 ; Goerdt y Orfanos (1999) Immunity 10:137-142; Ravetch y Lanier (2000) Science 290:84-89; Tivol, et al. (1996) Curr. Opin. Immunol. 8:822-830; Cant y Ullrich (2001) Cell Mol. Life Sci. 58:117-124; Dietrich, et al. (2000) J. Immunol 164:9-12; Barclay y Ward. (1982) Eur. J. Biochem. 129:447-458; Hoek, et al. (2000) Science 290:1768-1771 ; Wright, et al. (2001) Immunology 102:173-179; Gorczynski, et al. (2000) J. Immunol. 165:4854-4860; Borriello, et al. (1997) J. Immunol. 158:4548-4554; y Borriello, et al. (1998) Mamm. Genome 9:114-118; Greenwald, et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14:391-396). La CD200 es una proteína unida a la membrana ampliamente distribuida que aparece en las células linfoides, incluyendo los linfocitos B recirculantes y los linfocitos T activados, pero no en reposo, neuronales, endoteliales y dendríticas. La CD200 humana se expresa similarmente, incluyendo las células normales del cerebro y por los linfocitos B. Este ligando unido a la membrana se distingue por su corto dominio citoplásmico (19 aminoácidos). La CD200 de una célula puede unirse al receptor de la CD200 (CD200R; OX2R) de una célula separada. En humanos, se han identificado dos subtipos de CD200R, hCD200Ra y hCD200Rb, mientras que los homólogos de ratón consisten de cuatro subtipos de receptores, CD200Ra, CD200Rb, CD200Rc y CD200Rd. El CD200Ra se expresa predominantemente en los macrófagos, microglia (macrófagos del cerebro), monocitos y granulocitos (véase, por ejemplo, Wright, et al., supra; Hoek, et al. (2000) Science 290:1768-1771 ; McCaughan, et al. (1987) Immunogenetics 25:329- 335). Los ratones deficientes en CD200 (también conocidos como CD200"'"; CD200 no activada; CD200KO) exhiben varios defectos mieloides. Estos efectos incluyen números elevados de macrófagos dentro de tejidos que expresan normalmente la CD200, y expresión incrementada de DAP- 2, particularmente en la zona marginal de los tejidos linfoides secundarios, indicando la activación de las células mieloides. Como una consecuencia de este fenotipo, los ratones que carecen de CD200 parecen tener una susceptibilidad incrementada a las enfermedades autoinmunes mediadas por los linfocitos T CD4+. En particular, la regulación de CD200/CD200R de la activación microglial tiene profundos efectos en los tejidos neuronales, acelerando el inicio de modelos experimentales de autoinmunidad que afecta el sistema nervioso central, incluyendo encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y uveorretinitis autoinmune experimental (EAU) (véase, por ejemplo, Hoek, et al., supra; Broderick, et al. (2002) Am. J. Pathol. 161 :1669-1677). La EAU es mediada por los linfocitos T CD4+ específicos del antígeno retinal y puede modularse utilizando varios enfoques terapéuticos dirigidos a la función de los linfocitos T helper, incluyendo la inducción de la tolerancia específica del antígeno vía la mucosa nasal. Los macrófagos activados se requieren para la expresión total de la enfermedad, pero igualmente, los macrófagos se requieren para la resolución de la inflamación. Por ejemplo, los macrófagos responden a señales tales como la IL-4 y la IL-10, y participan activamente en el proceso antiinflamatorio, apoyando el concepto de que los macrófagos activados de manera alterna tienen un papel en la curación y remodelación del tejido. Tales macrófagos activados de manera alterna se han descrito recientemente por nosotros en el modelo de rata para la EAU. Las APC mieloides también pueden tener un papel doble en la inducción de la tolerancia nasal en la EAE y la EAU, en donde debe ocurrir una señalización por la CD200 expresada neuralmente, durante el proceso inflamatorio. En estos modelos, la protección efectiva está asociada con un evento de preparación inicial accionado por el IFNgamma en los nodos linfáticos cervicales, seguido por la apoptosis de los linfocitos T y la desregulación de la capacidad de los linfocitos T específicos del antígeno para proliferar, en respuesta a la reestimulación (véase, por ejemplo, Dick (2000) Int. Ophthalmol. Clin. 40:1-18; Dick (1999) Dev. Ophthalmol. 30:187-202; Dick, et al. (1994) Immunology 82:625-631 ; Dick, et al. (2001 ) Br. J. Ophthalmol. 85:1001-1006; Jiang, et al. (2001 ) Br. J. Ophthalmol. 85:739-744; Burkhart, et al. (1999) Int. Immunol. 11 :1625-1634; Laliotou, et al. (1999) J. Autoimmun. 12: 145-155; Jiang, et al. (1999) Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 40:3177-3185; Dick, et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:1018-1025 y Liversidge, et al. (2002) Am. J. Path. 160:1-12; Stein, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:287-292; Stumpo, et al. (1999) Pathobiology 67:245-248 y Erwig, et al. (1998) J. Immunol. 161 :1983-1988). Los mecanismos subyacentes a la inducción y mantenimiento de la tolerancia son poco entendidos. La presente invención proporciona métodos para inducir y mantener la tolerancia a través de la modulación de la CD200 o el CD200R.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la tolerancia a un antígeno puede incrementarse mediante un antagonista de la CD200. La invención proporciona un método para modular la tolerancia a un antigeno en un sujeto con una condición o trastorno inflamatorio o inmune, que comprende tratarlo con un agonista o antagonista de la CD200. También se proporciona el método anterior, en donde la modulación incrementa o mantiene la tolerancia y el tratamiento comprende administrar un antagonista de la CD200; o incrementa la respuesta del tipo TH2; así como el método anterior, en donde el agonista o antagonista se deriva del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la CD200 o al CD200R; y el método en donde el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a la CD200 o al CD200R. En otro aspecto, la invención proporciona el método anterior, en donde ei agonista o antagonista comprende un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humanizado; un fragmento Fv, Fab o F(ab')2; un anticuerpo bloqueador o un péptido mimético de un anticuerpo; así como el método anterior, en donde el agonista o antagonista comprende un ácido nucleico que codifica una CD200 o un CD200R; o que se une específicamente a un polinucleótido que codifica una CD200 o un CD200R y el método anterior, en donde el ácido nucleico comprende un ácido nucleico antisentido; comprende un ácido nucleico de un ARN de interferencia o una mutación genética en el genoma del sujeto, que reduce la expresión de la CD200 o el CD200R, biológicamente activos. Otra modalidad de la invención proporciona un método para modular la tolerancia a un antígeno en un sujeto, con una condición o trastorno inflamatorio o inmune, que comprende tratarlo con un agonista o antagonista de la CD200; en donde la condición o trastorno comprende una condición o trastorno autoinmune; el método anterior, en donde la condición o trastorno comprende uveorretinitis; rechazo de injerto o transplante; diabetes mellitus; esclerosis múltiple; trastorno inflamatorio del intestino (IBD); artritis reumatoide o asma o alergia; así como el método anterior, en donde la tolerancia se induce intranasal; enteral; oral; parenteral; intravenosa o mucosalmente. Aún otra modalidad de la presente invención, proporciona el método anterior, en donde el incremento o mantenimiento comprende una mejora en la calificación histológica; y el método anterior, en donde la mejora comprende una reducción en infiltrado celular inflamatorio; o una reducción en el daño del tejido estructural; así como el método anterior, en donde el infiltrado celular está en la; o el daño del tejido es de una célula fotorreceptora y el método anterior, en donde el trastorno o condición resulta de una inmunización. Aún otro aspecto de la presente invención proporciona el método anterior, en donde la respuesta del tipo TH2 comprende un incremento detectable en la expresión o los niveles de una citocina, esto es, IL-4; IL-5; IL-10 o IL-13; así como el método anterior, en donde la expresión o los niveles de la citocina TH2 son al menos 2 veces mayores con el tratamiento con el antagonista de la CD200 que sin el tratamiento con el antagonista de la CD200 y el método anterior, en donde la condición o trastorno resulta de una inmunización y en donde la expresión o niveles al menos dos veces mayores, ocurren en o antes del día 21 después de la inmunización.

Además, se proporciona la invención anterior, en donde la proliferación de las células inmunes disminuye o se inhibe detectablemente en un sujeto con tolerancia, tratado con un antagonista de la CD200, con relación a un sujeto con tolerancia no tratado con un antagonista de la CD200; así como la invención anterior, en donde la proliferación de las células inmunes con el tratamiento con el antagonista de la CD200 es 75% o menos o 50% o menos, que la proliferación sin el tratamiento con el antagonista de la CD200 y además, el método anterior, en donde la célula inmune es un esplenocito. En otra modalidad, la Invención abarca el método anterior, en donde el tratamiento con el antagonista de la CD200 resulta en un incremento detectable en la expresión de la STAT6; o la activación de la STAT6, con el tratamiento con el antagonista de la CD200, en comparación con el tratamiento sin el antagonista de la CD200, el método anterior, en donde hay un incremento detectable en la actividad o el nivel de linfocitos T reguladores (Tregs) o las células que expresan la IL-10; con el tratamiento con el antagonista de la CD200, en comparación con el tratamiento sin el antagonista de la CD200; así como el método anterior, en donde los Tregs comprenden linfocitos T CD3+CD4+CD25+ o las células que expresan la IL-10 son CD11 b+, CD1 1 b", CD11 c /baj'a, CD3', B220", CD45RBintermedia o células dendríticas. La invención proporciona un método para modular la tolerancia a un antígeno en un sujeto con una condición o trastorno inflamatorio o inmune, que comprende tratarlo con un agonista o antagonista de la CD200; en donde la modulación es la disminución y el tratamiento comprende un agonista de la CD200; el método anterior, en donde la condición o trastorno inmune es una infección persistente o cáncer, así como el método anterior, en donde la modulación disminuye la respuesta TH2 o disminuye o inhibe la actividad o los niveles de linfocitos T reguladores (Tregs).

DESCRIPCION DETALLADA PE LA INVENCION Como se utilizan aquí, incluyendo en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de palabras tales como "un", "uno, una" y "el, la", incluyen sus referencias en plural correspondientes, a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Todas las referencias citadas aquí se incorporan en la presente como referencia, al mismo grado que si cada publicación, patente o solicitud de patente publicada, individual, se indicara específica e individualmente como que está incorporada como referencia. 1. Definiciones. Un "antagonista" o "inhibidor", o "agonista" o "activador", se refiere a moléculas inhibidoras o activadoras, respectivamente, puesto que pertenecen a la modulación de la actividad, de por ejemplo, un ligando, receptor, cofactor, un gen, célula, tejido u órgano. Un modulador de por ejemplo, un gen, receptor, ligando o célula, es una molécula que altera una actividad del gen, receptor, ligando o célula, en donde actividad puede ser activado, inhibido o alterado. El modulador puede actuar solo, o puede utilizar un cofactor, por ejemplo, una proteína, ion metálico o molécula pequeña. Los inhibidores son compuestos que disminuyen, bloquean, evitan, retardan la activación, inactivan, desensibilizan o desregulan, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Los activadores son compuestos que incrementan, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o sobrerregulan, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Un inhibidor también puede definirse como una composición que reduce, bloquea o inactiva una actividad constitutiva. Una "agonista" es un compuesto que interactúa con un objetivo para causar o fomentar un incremento en la activación del objetivo. Un "antagonista" es un compuesto que se oponen a las acciones de un agonista. Un antagonista evita, reduce, inhibe o neutraliza la actividad de un agonista. Un antagonista también puede evitar, inhibir o reducir la actividad constitutiva de un objetivo, por ejemplo, un receptor objetivo, Incluso cuando no hay un agonista identificado. Para examinar el grado de inhibición, por ejemplo, muestras o ensayos que comprende, por ejemplo una proteína, gen, célula u organismo dado, se tratan con un activador o inhibidor potencial y se comparan con muestras de control sin el inhibidor. A las muestras de control, es decir, no tratadas con el antagonista, se les asigna un valor de la actividad relativa de 100%. La inhibición se logra cuando el valor de la actividad, con relación al control es de aproximadamente 90% o menos, típicamente 85% o menos, más típicamente 80% o menos, aún más típicamente 75% o menos, generalmente 70% o menos, más generalmente 65% o menos, aún más generalmente 60% o menos, típicamente 55% o menos, usualmente 50% o menos, más usualmente 45% o menos, aún más usualmente 40% o menos, de manera preferida 35% o menos, de manera más preferida 30% o menos, aún de manera más preferida 25% o menos, y de manera todavía más preferida menor que 25%. La activación se logra cuando el valor de la actividad, con relación a un control es de aproximadamente 110%, generalmente al menos 120%, más generalmente al menos 140%, más generalmente al menos 160%, con frecuencia al menos 180%, con más frecuencia al menos 2 veces, con más frecuencia al menos 2.5 veces, usualmente al menos 5 veces, más usualmente al menos 10 veces, de manera preferida al menos 20 veces, de manera más preferida al menos 40 veces, y de manera aún más preferida más de 40 veces más alta que la del control. Los puntos finales en la activación o la inhibición pueden verificarse como sigue. La activación, inhibición y respuesta al tratamiento, por ejemplo, de una célula, fluido fisiológico, tejido, órgano y sujeto animal o humano, puede verificarse mediante un punto final. El punto final puede comprender una cantidad o porcentaje predeterminado de, por ejemplo, un indicio de inflamación, oncogenicidad o desgranulación o secreción celular, tal como la liberación de una citocina, oxígeno tóxico o una proteasa. El punto final puede comprender, por ejemplo, una cantidad predeterminada de un flujo o transporte iónico; migración celular; adhesión celular; proliferación celular; potencial para metástasis; diferenciación celular y cambio en el fenotipo, por ejemplo, cambio en la expresión de un gen que se relaciona con la inflamación, apoptosis, transformación, ciclo celular o metástasis (véase, por ejemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood y Cheresh (2002) Nature Rev. Cáncer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261 ; Robbins e Itzkowltz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady y Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001 ) Glia 36:235-243; Stanimirovic y Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126). Un punto final de la inhibición es generalmente 80% del control o menos, más generalmente 70% del control o menos, más generalmente 60% del control o menos, de manera preferida 50% del control o menos, de manera más preferida 40% del control o menos, y de manera más preferida 30% del control o menos, usualmente 20% del control o menos, más usualmente 10% del control o menos, y aún más usualmente 5% del control o menos. Generalmente, un punto final de una activación es al menos 150% el control, de manera preferida al menos dos veces el control, de manera más preferida al menos cuatro veces el control, y de manera más preferida al menos 10 veces el control. Como se utiliza aquí, el término "actividad biológica" se utiliza para describir, de manera no exclusiva, actividades metabólicas, de señalización, hormonales, de desarrollo, embriológicas, proliferativas, apoptóticas, secretoras, migratorias, adhesivas, neurológicas, patológicas, inflamatorias y cancerosas de una célula, tejido, órgano o animal, una célula o tejido cultivado, un tejido u órgano perfundido o un animal mantenido con apoyo vital. "Actividad biológica" también incluye la actividad catalítica de enzimas in vivo y enzimas en el estado purificado, así como cambios en la conformación en las enzimas y otras proteínas. "Compartimiento biológico" se refiere a un tejido, órgano, célula, organelo o componente de una célula, por ejemplo, un nodo linfático, una capa endotelial o epitelial o una región del bazo, por ejemplo, pulpa roja o pulpa blanca. "Compartimiento biológico" también se puede referir al fluido, coloide, gel o suspensión contenido dentro o derivado de un compartimiento dado, tal como un citosol, nucleosol, fluido cerebroespinal, plasma, suero, sangre completa, orina, bilis o linfa. "Condición inmune" o "trastorno inmune" abarca, por ejemplo, inflamación patológica, un trastorno inflamatorio y a un trastorno o enfermedad autoinmune. "Condición inmune" también se refiere a infecciones, infecciones persistentes y condiciones proliferativas, tales como cáncer, tumores y angiogénesis, incluyendo infecciones, tumores y cánceres que resisten la erradicación por el sistema inmune. "Condición proliferativa" abarca, por ejemplo, cáncer, células cancerosas, tumores, angiogénesis, condiciones precancerosas tales como displasia, así como condiciones mediante proliferación, por ejemplo, de bacterias, parásitos, organismos multicelulares extraños y virus.

Se une "específicamente" o "selectivamente", cuando se refiere a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indica una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Así, bajo condiciones designadas, un ligando específico se une a un receptor particular y no se une en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. El anticuerpo o la composición de unión derivada del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, del método contemplado, se une a su antígeno, o una variante o muteína del mismo, con una afinidad que es al menos dos veces mayor, de manera preferida al menos diez veces mayor, de manera más preferida al menos 20 veces mayor y de manera más preferida al menos 100 veces mayor que la afinidad con cualquier otro anticuerpo o composición de unión derivada del mismo. En una modalidad preferida, el anticuerpo tendrá una afinidad que es mayor que aproximadamente O9 litros/mol, como se determina, por ejemplo, por el análisis Scatchard (Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239). Los "esplenocitos" son células recolectadas del bazo, que comprenden linfocitos T, linfocitos B, monocitos, células NK y/u otras (véase, por ejemplo, Metwali, et al. (2002) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283:G1 15-G121 ; Schaefer, et al. (2001 ) J. Immunol. 166:5859-5863; Hameg, et al. (1999) J. Immunol. 162:7067-7074). En los estudios de proliferación de los esplenocitos, generalmente los linfocitos T son las células más activas en la proliferación. La invención contempla un método de tratamiento con un antagonista de la CD200, en donde la proliferación de esplenocitos, linfocitos T, célula inmunes o células inmunes derivadas de la corriente sanguínea, por ejemplo, PBMC, disminuye generalmente 10% o más, más generalmente 20% o más , aún más generalmente 30% o más, típicamente 40% o más, más típicamente 50% o más, más típicamente 60% o más, usualmente 70% o más, más usualmente 80% o más, y aún más usualmente 90% o más. "Ligando" se refiere a una molécula pequeña, péptido, polipéptido o molécula asociada con la membrana y unida a la membrana, que actúa como un agonista, antagonista o agente de unión de un receptor. Ligando también abarca versiones solubles del ligando asociado con la membrana o el ligando unido a la membrana. En donde el ligando está unido a la membrana en una primera célula, el receptor usualmente aparece en una segunda célula. La segunda célula puede tener la misma o una identidad diferente de la primera célula. Los ligandos y receptores pueden ser totalmente intracelulares, esto es, pueden residir en el citosol, el núcleo o algún otro compartimiento intracelular. El complejo de un ligando y un receptor se denomina un "complejo ligando-receptor". En donde un ligando y un receptor están involucrados en una trayectoria de señalización, el ligando aparece en una posición corriente arriba y el receptor aparece en una posición corriente debajo de la trayectoria de señalización. Están disponibles métodos para determinar las constantes de unión y las propiedades cinéticas de un ligando al receptor (Karlsson, et al. (1991 ) J. Immunol. Methods 145: 229-240; Neri, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1271-1275; Jonsson, et al. (1991 ) Biotechniques 1 :620-627; Fn'guet, et al. (1985) J. Immunol. Methods 77:305-3 9; Hubble (1997) Immunol. Today 18: 305-306). "Acido nucleico" abarca polinucleótidos de una sola hebra, por ejemplo, ADNss, polinucleótidos de doble hebra, por ejemplo, ADNds, y polinucleótidos con múltiples hebras, así como sondas y cebadores. La invención también proporciona ácidos nucleicos modificados, por ejemplo, ácidos nucleicos biotilinados, balizas moleculares, ácidos nucleicos antisentido, composiciones para ARN de interferencia, y ácidos péptido-nucleicos (véase, por ejemplo, Arenz y Schepers (2003) Naturwissenschaften 90:345-359; Sazani y Kole (2003) J. Clin. Invest. 112:481-486; Pirollo, et al. (2003) Pharmacol. Therapeutics 99:55-77; Wang, et al. (2003) Antisense Nucí. Acid Drug Devel. 13: 169-189). "Cantidad terapéuticamente efectiva" de un agente terapéutico, se define como una cantidad de cada componente activo de la formulación farmacéutica que es suficiente para mostrar un beneficio significativo al paciente, es decir, causar una disminución en, o una aminoración de los síntomas de la condición siendo tratada. Cuando la formulación farmacéutica comprende un agente de diagnóstico, "una cantidad terapéuticamente efectiva" se define como una cantidad de cada componente activo de la formulación farmacéutica que es suficiente para producir una imagen u otro parámetro de diagnóstico en el sistema de diagnóstico empleado. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación de ingredientes activos, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos, que resultan en el efecto terapéutico, ya sea administrados en combinación, en serie o simultáneamente. Las cantidades efectivas de la formulación farmacéutica variarán de acuerdo con factores tales como el grado de susceptibilidad del individuo, la edad, sexo y peso del individuo y las respuestas idiosincrásicas del individuo (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,888,530). "Tolerancia" abarca incapacidad de respuesta inmune a por ejemplo, un cáncer o tumor, o a un aloantígeno, tal como un aloantígeno de injerto, a una molécula antigénica extraña, a un complejo molecular extraño o a un antígeno de un organismo o virus extraño. Tolerancia también abarca incapacidad de respuesta inmune o un incremento en la incapacidad de respuesta inmune, a un autoantígeno, por ejemplo, en donde el autoantígeno pertenece a un trastorno autoinmune. Adicionalmente, "tolerancia" abarca tolerancia natural y tolerancia inducida artificial o farmacológicamente. Además, tolerancia también se relaciona con la incapacidad de respuesta inmune a los mismos antígenos que son reconocidos por el mimetismo molecular (véase, por ejemplo, Liu (1997) J. Exp. Med. 186:625-629; Waldman y Cobbold (1998) Annu. Rev. Immunol. 16:619-644; Xiao y Link (1997) Clin. Immunol. Immunopathol. 85:119-128; Steinman, et al. (2003) Annu. Rev. Immunol. 21 :685-71 1 ; Olson, et al. (2002) J. Immunol. 169:2719-2726; Toussirot (2002) Curr. Drugs Targets Inflamm. Allergy 1 :45-52; Takahashi y Sakaguchi (2003) Int Rev Cytol. 225:1-32; Burt, et al. (2002) Int J Hematol. 76 (Suplemento 1 ): 226-47; Gery y Egwuagu (2002) Int. Rev. Immunol. 21 (2-3):89-100; Weiner (2001 ) Microbes Infect. 3:947-54). La reducción de la tolerancia, por ejemplo, administrando un agonista de la CD200, esto es, un agonista de la trayectoria de señalización de CD200/CD200R, es útil, por ejemplo, para reducir la respuesta ??2, por ejemplo, en el tratamiento de infecciones persistentes, tales como paludismo, o para el tratamiento de tumores, cánceres, neoplasmas y virus, incluyendo tumores, cánceres, neoplasmas y virus persistentes. Las infecciones persistentes de candidiasis están asociadas con la respuesta TH2 (véase, por ejemplo, Lilic, et al. (1996) Clin. Exp. Immunol. 105:205-212; Engelhard, et al. (2002) Immunol. Rev. 188:136-146; Good (1995) Parasite Immunol. 17:55-59; Liu, et al. (2002) Mol. Cáncer Ther. 1 : 1 147-1151 ; Sakaguchi, et al. (2001 ) Immunol. Rev. 182:18-32; Kakimi, et al. (2002) J. Virol 76: 8609-8620). La invención no está limitada por el mecanismo por el cual está mediada la tolerancia. Están abarcados método para modular la tolerancia, por ejemplo, modulando una actividad o propiedad de los linfocitos T reguladores (Tregs), tales como linfocitos T CD4+ CD25+, células Tr1 ; células Th3, linfocitos T CD8+ supresores o linfocitos T gamma delta; mediante las células que presentan el antígeno (APC), tales como células dendríticas; o mediante la anergia de los linfocitos T (véase, por ejemplo, Ohashi y DeFranco (2002) Curr. Opinión Immunol. 14:744-759; Kuwana (2002) Hum. Immunol. 63:1156-1163; Gilliet y Liu (2002) Hunt. Immunol. 63:1149-1155; Turley (2002) Cure. Opin. Immunol. 14:765-770; Ke, et al. (1997) J. ¡mmunol. 58:3610-3618). La invención contempla la modulación de la tolerancia modulando la respuesta TH1 , la respuesta TH2 o ambas respuestas TH1 y TH2. La modulación de la respuesta TH1 abarca cambiar la expresión de, por ejemplo, el interferón-gamma. La modulación de la respuesta TH2 abarca cambiar la expresión de, por ejemplo, cualquier combinación de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Típicamente, un incremento (disminución) en la respuesta TH2, comprenderá un incremento (disminución) en la expresión de al menos una de IL-4, IL-5, IL- 0 o IL-13; más típicamente, un incremento (disminución) en la respuesta TH2, comprenderá un incremento en la expresión de al menos dos de IL-4, IL-5, IL-10 o IL-13, más típicamente, un incremento (disminución) en la respuesta TH2 comprenderá un incremento en al menos tres de IL-4, IL-5, IL-10 o IL-13, mientras que idealmente, un incremento (disminución) en la respuesta TH2 comprenderá un incremento (disminución) en la expresión de todas de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. También está contemplada la modulación de la "tolerancia infecciosa" en donde la transferencia de los linfocitos T de un sujeto a otro transfiere la tolerancia (véase, por ejemplo, Unger, et al. (2003) Int. Immunol. 15:731-739; Iwashiro, et al. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 98:9226-9230). "Tratamiento", como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, se refiere a un tratamiento terapéutico, medidas profilácticas o preventivas, para aplicaciones de investigación y diagnóstico. "Tratamiento" como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, o célula, tejido u órgano, abarca el contacto de un agonista o antagonista de CD200 o CD200R a un sujeto humano o animal, una célula, tejido, compartimiento fisiológico o fluido fisiológico. "Tratamiento de una célula" también abarca situaciones en donde el agonista o antagonista de CD200 o CD200R entra en contacto con CD200 o CD200R, por ejemplo, en la fase fluida o la fase coloidal, y también situaciones en donde el agonista o antagonista administrado no ha demostrado tener contacto con la célula, la CD200 o el CD200R.

II. Generalidades. La inhibición de la respuesta inmune, como ocurre en la tolerancia, está mediada por las células mieloides, por ejemplo, DC y macrófagos, y las células linfoides, por ejemplo, linfocitos T reguladores (Tregs) tales como linfocitos T CD4+CD25+ y células Tr1. La activación alterna del macrófago y la expresión del receptor del depurador están entre los mecanismos de inhibición de la respuesta inmune. Las citocinas tales como IL-10 pueden modular la inhibición de la respuesta inmune, y la importancia de esta respuesta se demuestra por los trastornos autoinmunes y linfoproliferativos algunas veces fatales, observado en ratones con interrupción dirigida de los receptores inhibidores o la señalización de la IL-10 (véase, por ejemplo, Moore, et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19:683-765; McGuirk, et al. (2002) J. Exp. Med. 195:221-231 ; Kaya, et al. (2002) J.

Immunol. 168:1552-1556; Lanier (2001 ) Curr. Opin. Immunol. 13:326-331 ; Colonna (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:445-453; Goerdt y Orfanos (1999) Immunity 10:137-142; Kuhn, et al. (1993) Cell 75:263-274). La CD200, un regulador negativo de la función inmune, se expresa por una variedad de células, incluyendo neuronas, endotelio microvascular, linfocitos B recirculantes y linfocitos T activados, pero no en reposo, mientras que su receptor inhibidor relacionado estructu raímente (CD200R) está restringido a las células del linaje mieloide, incluyendo monocitos/macrófagos, DC y microglia y algunos linfocitos T. Dos miembros adicionales, de la familia del CD200R, mCD200RLa y mCD200Lb, aparecen en ratones. El mCD200RLa y el mCD200Lb no se unen a la CD200, pero tienen una potencial función de activación a través de la unión a la proteína adaptadora DAP-12. Así, en común con otros correceptores negativos descritos recientemente, la CD200 puede ejercer diferentes efectos a diferentes puntos en la respuesta inmune (véase, por ejemplo, Cant y Ullrich (2001 ) Cell Mol. Life Sci. 58:117-124; Dietrich, et al. (2000) J. Immunol. 164:9-12; Barclay y Ward (1982) Eur. J. Biochem. 129:447-458; Wright, et al. (2001 ) Immunology 102:173-179; Hoek, et al. (2000) Science 290:1768-1771 ; Gorczynski, et al. (2000) J. Immunol. 165:4854-4860; Gorczynski, et al. (2000) Clin. Immunol. 97:69-78; Presten, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918; Wright, et al. (2000) Immunity 13:233-242; Dick, et al. (2001 ) Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 42:170-176; Wright, et al. (2003) J. Immunol. 171 :3034-3046; Greenwald, et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391-396).

Los ratones CD200KO exhiben varios defectos mieloides, por ejemplo, números elevados de macrófagos dentro de tejidos que expresan normalmente la CD200, y expresión incrementada de la DAP-12, particularmente en ia zona marginal de los tejidos linfoides secundarios, indicando la activación de la célula mieloide. Los ratones CD200KO parecen tener una susceptibilidad incrementada a las enfermedades autoinmunes mediadas por los linfocitos T CD4+. En particular, la regulación mediada por CD200 y CD200R de la activación microglial, tiene marcados efectos en los tejidos neuronales, acelerando el inicio de modelos experimentales de autoinmunidad, que afectan el sistema nervioso central, por ejemplo, encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y uveorretinitis autoinmune experimental (EAU) (véase, por ejemplo, Broderick, et al. (2002) Am. J. Pathol. 161 :1669-1677). La EAU está mediada por los linfocitos T CD4+ específicos del antígeno retinal, en donde la EAU puede modularse utilizando enfoques terapéuticos dirigidos a la función de los linfocitos T helper, por ejemplo, inducción de tolerancia específica del antígeno vía la mucosa nasal. Los macrófagos activados se requieren para la expresión completa de la enfermedad, pero igualmente, los macrófagos se requieren para la resolución de la inflamación. En la resolución de la inflamación, los macrófagos responden a las señales tales como IL-4 e IL- 0. Las APC mieloides también pueden tener un papel doble en la inducción de la tolerancia nasal en la EAE y la EAU. En estos modelos, la protección está asociada con un evento de preparación inicial accionado por el IFNgamma en los nodos linfáticos cervicales, seguido por la apoptosis de los linfocitos T y la desregulación de la capacidad de los linfocitos T específicos del antígeno para proliferar en respuesta a la reestimulación. El estudio de la presente invención utiliza un modelo de tolerancia, en donde la tolerancia es inducida por la exposición respiratoria al antígeno, y en donde la señalización mediada por CD200/CD200R demuestra modular la inflamación y la tolerancia. Se utilizó el modelo de EAU en ratón C57B1/6 susceptible moderadamente, debido a que los linfocitos T uveitogénicos solos, son insuficientes para causar daño al órgano objetivo. Los macrófagos del monocito también son necesarios y prominentes en los infiltrados inflamatorios iniciales en la retina y además, se requiere la expresión del monocito de NOS2 para la expresión completa de la enfermedad. Las células dendríticas del tracto respiratorio (RTDC) y los macrófagos alveolares median la tolerancia inducida por la exposición respiratoria al antígeno. En el estudio de la presente invención, se siguió la activación y la proliferación de los linfocitos T en la linfa cervical que se drena, mediante la generación sistémica de las células reguladoras en el bazo (véase, por ejemplo, Dick, et al. (2000) Int. Ophthalmol. Clin. 40:1-18; Dick, et al. (1999) Dev. Ophthalmol. 30:187-202; Dick, et al. (2001 ) Br. J. Opthalmol. 85:1001-1006; Jiang, et al. (2001) Br. J. Ophthalmol. 85:739-744; Jiang, et al. (1999) Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 40:3177-3185; Dick (1996) Eur. J. Immunol. 26:1018-1025; Liversidge, et al. (2002) Am. J. Path. 160:1-12; Steln, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:287-292; Stumpo, et al. (1999) Pathobiology 67:245-248; Erwig, et al. (1998) J. Immunol 161 :1983-1988; Robertson, et al. (2002) Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 43:2250-2257; Burkhart, et al. (1999) Int. Immunol. 11 :1625-1634; Laliotou, et al. (1999) J. Autoimmun. 12:145-155; Avichezer, et al. (2000) Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 41 :127-131 ; Forrester, et al. (1998) Curr. Eye Res. 17:426-437; Dick, et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:1018-1025; Hoey, et al. (1997) J. Immunol 159:5132-5142; Akbari, et al. (2001) Nat. Immunol. 2:725-731 ; Prakken, et al. (2002) Arthritis Rheum. 46:1937-1946; Dick, et al. (1994) Eye 8 (Pt 1 ):52-59; Massey, et al. (2002) Vet. Immunol. Immupathol. 87:357-372; Akbari, et al. (2001) Nat Immunol. 2:725-731 ; Stumbles, et al. (1998) J. Exp. Med. 188:2019-2031 ). En el estudio de la presente invención, a pesar del acelerado inicio de la enfermedad, la incidencia general y la severidad de la enfermedad se redujo con el tiempo en los ratones CD200KO, en donde la reducción en los síntomas de la enfermedad se correlaciona con números elevados de linfocitos T reguladores y la presencia de altas células mieloides esplénicas que secretan IL-10, posteriormente en el proceso de la enfermedad. La CD200KO mejoró la tolerancia al antígeno retinal. Este resultado de la CD200KO puede relacionarse con el fenotipo alterado de las APC en el tracto respiratorio, en comparación con el tipo silvestre y un cambio Th2 mejorado en los ratones CD200KO con tolerancia. La inducción de la tolerancia en el ratón CD200KO fue eficiente, con hasta 50% de los ojos protegidos todavía de la enfermedad 28 días postinmunización (véase, por ejemplo, Murphy y Reiner (2002) Nat. Rev. Immunol. 2:933-944; Suri-Payer, et al. (1998) J. Immunol. 160:1212-1218; Thornton y Shevach (2000) J. Immunol. 164:183-190; Roncarolo, et al. (2001 ) Immunol. Rev. 182:68-79; Peiser y Gordon (2001) Microbes Infect. 3:149-159; Gordon (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:23-35). En los estudios de la presente invención, hubo un claro incremento en las células CD b"IL10alta en los bazos de los ratones CD200KO con tolerancia simulada y con tolerancia en el día 28. Estas células fueron distintas de poblaciones mayores de CD1 1 b+IL10baia presentes en todos los grupos experimentales desde el día 21. El alto nivel de 1L-10 detectado fue endógeno, puesto que las células se analizaron directamente ex vivo sin ningún estímulo activante adicional o secuestramiento artificial de la citocina mediante brefeldin A u otros inhibidores de Golgi. Los análisis adicionales de estas células indicaron que eran CD11c"/baja, CD45RBinterniedia y B220" y tenían una morfología DC plasmocitoide. Las DC plasmocitoides tolerogénicas con un fenotipo similar, pero CD45RBalta pueden generarse mediante un cultivo in vitro con IL-10, pueden aislarse de los bazos de ratones C57B1/6 normales y son elevadas en ratones transgénicos IL10. Las células toman 3 semanas para diferenciarse in vitro, y en los estudios de la presente invención, aparecen en los bazos CD200KO 3-4 semanas después del inicio de la enfermedad, sugiriendo que una estimulación prolongada y/o varias rondas de división celular están involucradas. Las células plasmocitoides derivadas de médula ósea también fueron tolerogénicas y capaces de generar Tregs que secretan IL-10 específica para el antígeno, in vivo. No se encontraron números significativos de células CD3+CD4+IL-10+ en este estudio, pero se encontró una tendencia hacia números incrementados de CD3+CD4+CD25+ en ratones CD200KO y esto fue significativo en grupos con tolerancia en todo momento. Los Tregs pueden tener un efecto inmunosupresor, por ejemplo, inhibiendo la expresión de la IL-2 o la IL-10. La inducción de la IL-10 y la supresión de la IL-2 en todos los grupos en el día 28 del estudio de la presente invención, es consistente con la inducción de los linfocitos T reguladores durante el proceso de la enfermedad, y con los hallazgos que relacionan la administración nasal del antígeno con la reducción de Tr1 (véase, por ejemplo, Shevach (2002) Nal Rev. Immunol. 2:389-400; McGuirk y Mills (2002) Trends Immunol. 23:450-455; Herrath y Harrison (2003) Nal Rev. Immunol. 3:223-232; Bluestone y Abbas (2003) Nal Rev. Immunol. 3:253-257; Thornton y Shevach (1998) J. Exp. Med. 88:287-296; Jonuleit, et al. (2000) J. Exp. Med 192:1213-1222; Wakkach, et al. (2003) Immunity 18:605-617). Las DC pulmonares median la respuesta inmune al antígeno inhalado, induciendo la hiposensibilidad de los linfocitos T a antígenos inocuos o la activación y expansión preferencial de las respuestas desviadas hacia Th2. Esto se ha atribuido al mícroambiente de la mucosa y al fenotipo inmaduro de estas células. La IL-10 tiene el papel de inducir la tolerancia nasal y de limitar la inflamación posteriormente en la enfermedad. La IL-10 derivada de Th2 tendría entonces, el efecto de aumentar la tolerancia de una manera específica del antígeno, puesto que una sola exposición a la IL-10 puede convertir las DC a un fenotipo tolerogénico (véase, por ejemplo, Enk, et al. (1993) J. Immunol. 151 :2390-2398; De Smedt, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1229-1235; Mitchison, et al. (1999) Springer Semin. Immunopathol. 21 :199-210).

III. Purificación v Modificación de los Polipéptidos v los Acidos Nucleicos. El polipéptido y el ácido nucleico para el diagnóstico y terapia de la invención pueden prepararse mediante métodos establecidos en la técnica. La purificación puede involucrar cromatografía de intercambio iónico, inmunoprecipitación, marcas de epitopos, cromatografía por afinidad, cromatografía líquida a alta presión y el uso de agentes estabilizantes, detergentes o emulsificantes (Dennison y Lovrien (1997) Protein Expression Purif. 11 :149-161 ; urby, et al. (1996) Protein Expression Puríf. 7:129-136; Ausubel, et al. (2001 ) Curr. Protocols Mol. Biol., Vol. 3, John Wiley and Sons, New York, NY, pp. 17.0.1-17.23. 8; Rajan, et al. (1998) Protein Expression Purif. 13:67-72; Amersham-Pharmacia (2001) Catálogo, Amersham-Pharmacia Biotech, Inc., pp. 543-567, 605-654; Gooding y Regnier (2002) HPLC oí Biological Molecules, 2a Edición, Marcel Dekker, NY). Las modificaciones de las proteínas, péptidos y ácidos nucleicos, abarcan marcas con epitopos, proteínas de fusión, grupos fluorescentes o radiactivos, monosacáridos u oligosacáridos, grupos sulfato o fosfato, amidas C terminales, grupos amino N terminales modificados, por ejemplo, mediante acetilación o acilación grasa, enlaces péptido escindidos intracadena y productos de la desamidación (Johnson, et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:14262-14271 ; Young, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:37161-37 65). La glucosilación depende de la naturaleza del organismo hospedero recombinante empleado o el estado fisiológico (Jefferis (2001) BioPharm 14:19-27; Mimura, et al. (2001 ) J. Biol. Chem. 276:45539-45547; Axford (1999) Biochim. Biophys. Acta 1 :219-229; Malhotra, et al. (1995) Nature Medicine 1:237-243; Ausubel, et al. (2001) Current Protocois in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001 ) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001 ) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391).

IV. Composiciones de Unión. Agonistas. Antagonistas v Muteínas. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, policlonales y humanizados (véase, por ejemplo, Sheperd y Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann y Dubel (eds.) (2001 ) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow y Lañe (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205-6213; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029-1035; Tang, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; U, et al. (2002) Immunol. Revs. 190:53-68; Sato, et al. (1994) Mol. Immunol. 31 :371-381 ; Morea, et al. (2000) Methods 20:267-279). Un anticuerpo humanizado contiene las secuencias de aminoácidos de seis regiones que determinan la complementariedad (CDR) del anticuerpo original del ratón, que se injertan en una estructura de un anticuerpo humano. Las alternativas a la humanización incluyen el uso de anticuerpos completamente humanos, así como bibliotecas de anticuerpos humanos mostradas en un fago o bibliotecas de anticuerpos humanos contenidas en ratones transgénicos (véase, por ejemplo, Vaughan, et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Med. 1:837-839; de Haard, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18218-18230; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Méndez, et al. (1997) Nature Genet. 5:146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21 :371-377; Barbas, et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay, et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin, et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:397- 399). Se describen los anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos biespecíficos y péptidos miméticos de anticuerpos (véase, por ejemplo, Maynard y Georgiou (2000) Annu. Rev. Blomed. Eng. 2:339-376; Malecki, et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 99:213-218; Conrath, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter, et al. (2001 ) J. Biol. Chem. 276:26285-26290, Kostelney, et al. (1992) New Engl. J. Med. 148:1547-1553; Casset, et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307: 98-205; Patentes de E.U.A. Nos. 5,932,448; 5,532,210; 6,129,914; 6,133,426; 4,946,778). La purificación del antígeno no es necesaria para la generación de los anticuerpos. La inmunización puede realizarse mediante una inmunización con un vector de ADN, véase, por ejemplo, Wang, et al. (1997) Virology 228:278-284. De manera alterna, los animales pueden inmunizarse con células que porten el antígeno de interés, seguido por la producción del hibridoma, véase, por ejemplo, Meyaard, et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright, et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston, et al. (1997) Eur. J.

Immunol. 27:191 1-1918; Kaithamana, et al. (1999) New Engl. J. Med. 163:5157-5164. Los anticuerpos biespecíficos también están contemplados (véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,932,448 expedidas a Tso, et al., 5,532,210 expedida a Paulus y 6,129,914 expedida a Weiner, et al.). Las propiedades de unión del anticuerpo/antígeno pueden medirse, por ejemplo, mediante resonancia del plasmón superficial o mediante un ensayo inmunosorbente enlazada a la enzima (ELISA) (Neri, et al. (1997) Nal Biotechnol. 15:1271-1275; Jonsson, et al. (1991) Biotechniques 11 :620- 627; Hubble (1997) Immunol. Today 18:305-306). Los anticuerpos de esta invención pueden utilizarse para la cromatografía por afinidad para aislar el antígeno objetivo del anticuerpo y las proteínas unidas asociadas (Wilchek, et al. (1984) Meth. Enzymol. 104:3-55). Pueden prepararse y utilizarse los receptores solubles de acuerdo con los métodos estándar (véase, por ejemplo, Jones, et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta 592:251-263; Prudhomme, et al. (2001 ) Expert Opinión Biol. Ther. 1:359-373; Fernandez-Botran (1999) Crít. Rev. Clin. Lab Sci. 36:165-224). La conjugación del anticuerpo, el receptor soluble y otras composiciones de unión al polietilenglicol (PEG) pueden resultar en una prolongación del tiempo de circulación y una reducción de la antigenicidad (Solorzano, et al. (1998) J. Appl. Physiol. 84:1 119-1130; Rosenberg, et al. (2001) J. Appl. Physiol. 91 :2213-2223; Bendele, et al. (2000) Arthrítis Rheum. 43:2648-2659; Trakas y Tzartos (2001 ) J. Neurochem. 120:42-49). La conjutación con PEG puede ser especialmente útil para los fragmentos terapéuticos del anticuerpo, tales como Fab\ Fv, F(ab')2 y Fv de cadena corta, que tienden a tener vidas relativamente cortas in vivo (Chapman, et al. (1999) Nature Biotechnology 17:780-783).

V. Usos Terapéuticos y de Diagnóstico. La presente invención contempla el uso de agonistas o antagonistas de la CD200 o el CD200R para inducir o mantener la tolerancia en varios trastornos inmunes o inflamatorios. La mejora o el mantenimiento de la tolerancia es útil en el tratamiento de por ejemplo, rechazo de injerto o transplante; enfermedad de injerto versus hospedero (GVHD); choque séptico; asma; alergia y trastornos autoinmunes específicos del órgano, tales como esclerosis múltiple, trastorno inflamatorio del intestino (BD), encefalitis autoinmune experimental (EAE), artritis reumatoide, artritis inducida por el colágeno (CIA), esclerosis múltiple, miocarditis autoinmune, nefritis, uveorretinitis, miastenia gravis, diabetes mellitus y tiroiditis. La IBD incluye la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y enfermedad celíaca. El aumento de la tolerancia también es útil para prevenir reacciones a fármacos, por ejemplo, penicilina, anticuerpos recombinantes y terapia génica para una proteína faltante; y para fomentar la tolerancia materna al embrión o al feto (véase, por ejemplo, Whitacre, et al. (1996) Clin. Immunol. Immunopathol. 80:(3 Pt. 2):S31-S39; Murphy y Blazar (1999) Curr. Opin. Immunol. 11 :509-515; Efrat (2002) Trends Mol. Med. 8:334-339; Kohrn, et al. (2002) J. Immunol. 169: 4712-4716; Thurau y Wildner (2002) Prog. Retín. Eye Res. 21 :577-589; Weiner, et al. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12:809-837). Los agonistas o antagonistas de la presente invención pueden utilizarse para tratar trastornos inmunes asociados con los linfocitos T, linfocitos B, mastocitos, eosinófilos, células NK, células NKT, células que presentan el antígeno (APC), tales como células dendríticas, monocitos/macrófagos, células endoteliales, células epiteliales, parches de Peyer o la mucosa del intestino o el sistema nervioso central. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y citocinas pueden proporcionarse mediante infusión continua o mediante dosis a intervalos de por ejemplo, un día, una semana o 1-7 veces a la semana. Las dosis pueden proporcionarse en forma intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral o mediante inhalación. Un protocolo de dosis preferido es uno que involucra la dosis máxima o la frecuencia de la dosis que evite los efectos laterales indeseables significativos. Una dosis semanal total es generalmente al menos 0.05, µg/l g de peso corporal, más generalmente al menos 0.2 µg/kg, aún más generalmente al menos 0.5 µg/kg, típicamente al menos Vg/kg, más típicamente al menos 10 µg/kg, aún más típicamente al menos 100 µg/kg, de manera preferida al menos 0.2 mg/kg, de manera más preferida al menos 1.0 mg/kg, aún de manera más preferida al menos 2.0 mg/kg, de manera óptima al menos 10 mg/kg, de manera más óptima al menos 25 mg/kg, y de manera aún más óptima al menos 50 mg/kg, véase, por ejemplo, Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:133-144. La dosis deseada de un compuesto terapéutico de molécula pequeña, por ejemplo, un péptido mimético, producto natural o compuesto químico orgánico, es aproximadamente la misma que para un anticuerpo o polipéptido, en una base de moles/kg de peso corporal. Las formulaciones de los agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden prepararse para el almacenamiento mezclando con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables, en la forma de por ejemplo, polvos liofilizados, pastas aguadas, soluciones o suspensiones acuosas (véase, por ejemplo, Hardman, et al. (2001 ) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lipplncott, Williams y Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY). La determinación de la dosis apropiada se hace por el clínico, por ejemplo, utilizando parámetros o factores conocidos o que se sospecha en la técnica que afectan el tratamiento o que se ha predicho que afectan el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y se incrementa posteriormente pequeñas cantidades hasta que se alcanza el efecto deseado u óptimo, con relación a cualesquier efectos laterales negativos. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen aquéllas de los síntomas de por ejemplo, la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas. De manera preferida, un compuesto biológico que se utilizará, se deriva de la misma especie que el animal seleccionado para el tratamiento, reduciendo por lo tanto al mínimo, la respuesta humoral al reactivo. Una cantidad efectiva para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la condición siendo tratada, la salud general del paciente, la ruta y la dosis de administración y la severidad de los efectos laterales. Está disponible una guía para los métodos de tratamiento y diagnosis (Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practlce, Interphárm Press, Boca Ratón, FL; Dent (2001 ) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, RU). La invención también proporciona un equipo que comprende una célula y un compartimiento, un equipo que comprende una célula y un reactivo, un equipo que comprende un reactivo, un equipo que comprende una célula e instrucciones para su uso o desecho, así como un equipo que comprende una célula, un compartimiento y un reactivo. Además, la invención también proporciona un equipo que comprende una célula y un compartimiento e instrucciones, un equipo que comprende una célula y un reactivo e instrucciones, un equipo que comprende un reactivo e instrucciones, un equipo que comprende una célula e instrucciones, así como un equipo que comprende una célula, un compartimiento y un reactivo e instrucciones. Las instrucciones pueden comprender instrucciones para el uso, para el desecho de los reactivos o para el uso y el desecho. El amplio alcance de esta invención se entiende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, lo cuales no pretenden limitar las invenciones a las modalidades específicas.

EJEMPLOS I. Métodos Generales. Algunos de los métodos estándar se describen o refieren, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2a ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987) Current Protocole in Molecular Biology y suplementos, Greene/Wiley, New York. Los métodos para la purificación de la proteína incluyen, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, inmunoprecipitación y clonación y expresión mediante vectores y células, véase, por ejemplo, Amersham Pharmacia Biotech (2003) Catálogo, Piscataway, NJ; Invitrogen (2003) Catálogo, Carlsbad, CA; Sigma-Aldrich (2003) Catálogo, St. Louis, MO. Están disponibles métodos para la citometría de flujo, incluyendo la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), véase, por ejemplo, Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principies for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. El conteo celular puede lograrse con la ayuda de perlas o microesferas, por ejemplo, perlas de conteo Caltag® (Caltag Labs, Burlingame, CA) y Perfectcount® (Exalpha Biologicals, Watertown, A). Están disponibles reactivos fluorescentes, adecuados para modificar los ácidos nucleicos, incluyendo los cebadores y sondas de ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos, para utilizarse, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico (Molecular Probes (2003) Catálogo, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catálogo, St. Louis, MO). Se describen los métodos de histología del sistema inmune, véase, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams y Wiikins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY. Están disponibles métodos para utilizarse en modelos animales, por ejemplo, ratones inactivos, y ensayos basados en las células para probar, evaluar y seleccionar los agentes de diagnóstico, terapéuticos y farmacéuticos, véase, por ejemplo, Car y Eng (2001 ) Vet. Pathol. 38:20-30; Kenyon, et al. (2003) Toxicol. Appl. Pharmacol. 186:90-100; Deurloo, et al. (2001) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25:751-760; Zuberi, et al. (2000) J. Immunol. 164:2667-2673; Temelkovski, et al. (1998) Thorax 53:849-856; Horrocks, et al. (2003) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:570-575; Johnston, et al. (2002) Drug Discov. Today 7:353-363. Se describen métodos para el diagnóstico y tratamiento de condiciones inflamatorias en animales y en humanos (Ackerman (1997) Histológica! Diagnosis of Inflammatory Skin Disease, 2a ed., Lippincott, Williams y Wiikins, New York, NY; Gallin, et al. (1999) Inflammation: Basic Principies and Clinical Correlates, 3a e<±, Lippincott, Williams y Wilkins, New York, NY; Benezra (1999) Ocular Inflammation: Basic and Clinical Concepts, Blackwell Science, Ltd., Oxford, RU; Geppetti y Holzer (1996) Neurogenic Inflammation, CRC Press, Boca Ratón, FL; Nelson, et al. (2000) Cytokines in Pulmonary Disease: infection and Inflammation, Marcel Dekker, Inc., New York, NY; O'Byrne (1990) Asthma as an Infiammatory Disease, Marcel Dekker, Inc., New York, NY., Pamham, et al. (1991 ) Drugs in Inflammation (Agents and Actions Supl. Vol. 32), Springer Verlag, Inc., New York, NY). Están disponibles paquetes de programas para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias de señalización y líderes, plegamiento de la proteína y dominios funcionales, véase, por ejemplo, Vector NTI® Suite (Informax, Inc., Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA) y DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16:741-742. También se utilizaron bases de datos de secuencias, públicas, por ejemplo, de GenBank y otros.

II. Animales e Inducción de la Uveorretinitis Autoinmune Experimental (EAU). Se generaron ratones deficientes en CD200 (CD200"A) en una base C57BL/6 y el aislador se crió en una colonia de crianza libre del patógeno específico (SPF) establecida dentro de la Unidad de servicios biológicos de la Universidad de Aberdeen, RU (Hoek, et al. (2000) Science 290:1768-1771). El tipo silvestre de C57BL/6 SPF (CD200+'+) se compró de Harían Olac, RU. Se utilizaron grupos de 3-6 ratones, como se detalla en el texto para cada experimento. Para la inmunización, se utilizaron grupos de ratones de sexo y edad correspondientes, a las 6-8 semanas de edad. Los ratones se inmunizaron con una inyección s. c. de 0.5 mg de péptido 1-20 de IRBP (Genosys, Sigma, RU) en adyuvante completo de Freund (FCA, 2.5mg/ml de M. tuberculosis) y se les dio una inyección de toxina de Bordatella pertussis (PTX) (i. p.) como un adyuvante adicional (Avichezer, et al. (2000) Invest. Ophthalmol. Sci. 41 :127-131 ). En tiempos especificados, los animales se sacrificaron mediante asfixia con CO2 y los ojos se enuclearon para la histología en resina (tinción con hematoxilina y eosina para el sistema de calificación histológico) o para la inmunocitoquímica. También se tomaron muestras del tejido linfoide para determinar las respuestas proliferativas y de la citocina específicas del péptido. La severidad de la enfermedad se valoró utilizando una versión modificada del sistema de graduación histológica para la EAU en rata. Se calificaron al menos tres secciones de cada ojo de una manera enmascarada, utilizando un sistema de calificación semicuantitativo que combina el grado del infiltrado inflamatorio y el daño del tejido en la cámara posterior (Dick, et al. ( 994) Eye 8 (pt. 1 ):52-59).

III. Inducción de la tolerancia nasal Cincuenta microgramos de péptido en 5 microlitros de PBS o 5 microlitros de PBS solo, se administraron intranasalmente. Este régimen, administrado 10 días antes de la inmunización, es efectivo para modular la EAU (Jiang, et al. (2001 ) Br. J. Ophthalmol. 85:739-744). En algunos experimentos, los ratones se sacrificaron a intervalos durante las siguientes 48 horas para examinar los efectos del péptido intranasal (i. n.) en las células en los nodos linfáticos cervicales drenantes y los esplenocitos, o en el control de los nodos linfáticos submandibulares y mesentéricos. En otros experimentos, los animales se inmunizaron 10 días más tarde con el péptido o con PBS en FCA con PTX.

IV. Ensayos de proliferación y del perfil de la citocina Las respuestas de proliferación de los linfocitos para anular el antígeno se midieron utilizando un equipo de flujo de bromodesoxiuridina (BrDU) (BD Biosciences, Oxford, RU). Esta prueba permite la detección de la BrDU que marcan las células en la fase S, junto con la medición del contenido total de ADN de la población celular, como un todo. Se obtuvieron suspensiones con una sola célula de bazos individuales, prensando el tejido a través de un tamiz metálico de 0.25 mm y las células mononucleares se purificaron mediante centrifugación con gradiente de densidad Percoll. Los eritrocitos se eliminaron mediante lisis hipotónica. Los cultivos se ajustaron a una densidad de 1 X 106 células por mi con 10 microgramos/ml de péptido 1-20 durante 96 horas. Este punto de medición se estableció como el óptimo, recompilando los datos de incubaciones de 48-120 horas. Cada pozo se sometió a impulsos con 10 microlitros de bromodesoxiuridina (BrDU) 1 mM durante 45 minutos, se recolectaron las células permeabilizadas con Cytofix Cytoperm® (BD Biosciences), y se congelaron a -80°C en FCS con DIVISO al 0% antes de la tinción y el análisis. Se utilizó un anticuerpo anti-BrDU marcado con FITC para identificar el grado de incorporación de la BrDU y se utilizó la tinción del ADN con 7-amino-actinomicina D (7-AAD) para cuantificar el contenido total de ADN. Las mediciones se hicieron mediante citometría de flujo de 2 colores utilizando un BD FACS Calibur® o un BD FACS LSR®. Los datos se obtuvieron de al menos tres animales individuales en cada punto de medición. Para los análisis del perfil de la citocina de los cultivos correspondientes, se ajustaron cultivos paralelos de 1 mi con 4 x 106 células y 0microgramos/ml de péptido. Después de 72 horas, los sobrenadantes se recolectaron, se clarificaron mediante centrifugación y se congelaron a -30° hasta el ensayo. Los cultivos de control negativos contenían PBS en lugar del péptido. Se agregó concanavalina A a 2.5 microgramos/ml a los cultivos de control positivos para demostrar las condiciones de crecimiento óptimo y ia viabilidad de la célula durante los ensayos.

V. Mediciones de la Citocina La IL-10 y la IL-12 se midieron utilizando equipos optEUSA® de BD Pharmingen, Oxford, RU. Se utilizó el arreglo de perlas de citocina de ratón (equipo CBA, BD Pharmingen) para medir otras citocinas Th1/Th2. brevemente, el ensayo BBA para Th1/Th2 utiliza cinco poblaciones de perlas con diferentes intensidades de fluorescencia y recubiertas con anticuerpos de captura específicos para la IL-2, IL-4, IL-5, IFNgamma o TNFalpha murinos. Las perlas de captura se mezclaron con anticuerpos de detección conjugados con PE y se incubaron con estándares recombinantes o con muestras de prueba para formar complejos emparedados. Las cinco poblaciones de perlas se mezclaron juntas y se resolvieron en el canal FL3 del citómetro de flujo BD FACsCalibur®.

VI. Determinación del Isotipo del Anticuerpo del Suero. Se obtuvo suero de los ratones al quitar la punta de la cola o mediante punción cardiaca y se almacenó a -30°C hasta el ensayo. Las respuestas anti-IRBP y del péptido 1-20 se titularon mediante ELISA. Placas de noventa y seis pozos se recubrieron durante la noche con 1 microgramo/ml de péptido 1-20 en amortiguador de Ca2C03 (pH 9.6). A continuación, los pozos se lavaron con Tween/PBS al 0.5% y se bloquearon con BSA PBS al 1 %. El suero se diluyó serialmente en BSA al %/Tween al 0.5% en PBS y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Después del lavado, el anticuerpo unido se detectó utilizando inmunoglobulina anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa (Dako, Estocolmo, Suecia), se utilizó O-fenilendiamina (Sigma; 0.4mg/ml en amortiguado de citrato/acetato 0.1 M pH 6.0), como un sustito para la reacción de la peroxidasa. La densidad óptica (OD) se determinó a 490nm en un analizador de placas de microtitulación. Los títulos se expresaron como el recíproco de la última dilución mayor que la OD del suero preinmunizado.

VIL Inmunocitoquímica. Los ojos o el tejido linfoide de ratones inmunizados se disecaron, se congelaron rápidamente en OCT y cortes de secciones en serie de 7 micrómetros, se secaron al aire y se fijaron en acetona fría al 100% para la inmunocitoquímica, utilizando la técnica de fosfatasa alcalina antifosfatasa alcalina (APAAP). Después de la rehidratación en suero fisiológico amortiguado con TRIS (TBS), las secciones se bloquearon con suero de conejo normal en TBS al 1% y a continuación una solución de bloqueo de avidina D (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para la tinción con anti-STAT 4 (C20; Santa Cruz Biotechnology, CA, E.U.A.)) y STAT 6 (M20; Santa Cruz), policlonal de conejo, utilizando controles apropiados y péptidos de bloqueo como los controles negativos. Otras secciones se tiñeron utilizando anticuerpos monoclonales de ratón a CD3 y al antígeno F4/80 de los marcadores de las células mieloides (CI:A3-1), MOMA-1 y MOMA-2, de Serotec (Kidlington, Oxford, RU). Los marcadores de activación incluyen NOS2 (clona 6; Transduction Laboratories, KY, E.U.A.) y CD86 (GL-1) y MHC clase II (l-Ab) (P7.7), ambos de BD Pharmingen (Coley, Oxford, RU). La tinción positiva se detectó mediante el conjugado de Ig-Ap anti-conejo biotilinado o lg-?? anti-ratón biotilinado absorbidos por el ratón, seguido por el complejo de estrepavidina:ABC AP y un sustrato rojo rápido (Dako, Estocolmo, Suecia) ligeramente contrateñido con hematoxilina. Las secciones para el análisis de las imágenes se tiñeron en lotes para asegurar condiciones de marcado uniforme para cada anticuerpo. Las secciones se analizaron a continuación utilizando el programa para análisis de imágenes Aphelion ActiveX® de ADCIS (ADCIS SA, Herouville-SaintClair, Francia). El programa se adaptó utilizando Visual Basic® (Microsoft, Redmond, WA) para permitir el análisis de inmunotinción en las regiones definidas por el usuario de la imagen. Un valor promedio (por ciento de tejido teñido de manera positiva por x 20 campos) para cada sección, se obtuvo de 4-6 campos.

VIII. Citometría de Flujo. Se utilizó un FACS Calibur® de Becton Dickinson (BD) para la adquisición de datos y un programa Cell Queso® (BD) para el análisis de datos. Las células que presentan el antígeno y los linfocitos aislados de los nodos linfáticos y los bazos se evaluaron mediante tinción con inmunofluorescencia doble o triple con mAbs a los siguientes marcadores de la superficie celular: CD11b (M1/70), CD11 c (HL3), CD4 (RM4-4) CD45RB (16A), CD45R (RA3-6B2), CD40 (3/23), CD86 (GL-1 ), CD 52 (BN13), MHC clase II (l-Ab) (AF6-120.1 ), CD25 (PC61 ), CD38 (92), CD8a (53-6B2), CD62L (MEL-14) y CD3epsi!on (145-2C11 ), fueron todos de BD Pharnningen (Coley, Oxford, RU). Para la detección intracelular de CTLA-4 y IL- 0, se realizó una tinción cuádruple. Las células se trataron con Cytofix-Cytoperm y se tiñeron con CD152 (UC10-4F10-1 1 ) conjugada con ficoeritrina (PE) y anti-IL-10 (JES5-16E3) conjugada con PE o FITO, siguiendo las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen). El anti-CD204 (2F8), F4/80 (CI:A3-1 ), los macrófagos metalofílicos (MOMA-1 ) y CD80 (RMMP-1 ) fueron de Serotec (Kidlington, Oxford, RU). Estos se conjugaron a FITO, PE, APC, PerCP o biotina conforme se requirió. Los anticuerpos marcados con biotina se detectaron por la adición de SA-APC (1 :400) (BD Pharmingen). Se realizaron controles negativos del isotipo y controles positivos únicos, para permitir una compensación importante exacta. Para examinar la morfología, las poblaciones celulares se clasificaron utilizando un FACS DIVA de Becton Dickinson, de acuerdo a las compuertas definidas por la tinción fluorescente del anticuerpo para 1L-10, CD1 1 cbaja, CD1 1 b" altas.

IX. Expresión y Activación de la STAT6. La expresión y activación de la STAT6 se determinó mediante ¡nmunotransferencia de los inmunoprecipitados preparados de los extractos citosólicos y nucleares (Dick, et al. (2001 ) Br. J. Ophthalmol. 85:1001-1006). La STAT6 se detectó utilizando el anticuerpo anti-STAT6 (M20, Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA) y perlas de Proteína A-Sepharose para recolectar las proteínas STAT6, seguido por la separación mediante transferencia con SDS-PAGE en una membrana Hybond PVDF (Amersham-Pharmacia) y el análisis de las transferencias, sondeando con el anticuerpo anti-STAT6. La STAT6 fosforilada se detectó utilizando el anticuerpo anti-fosfotirosina (mAb4G110, Upstate Biotechnol., Charlottesville, VA).

X. La CD20Q Inactivada Mejora la Tolerancia, como se Determina por la Calificación de la Histología y la Proliferación de los Esplenocitos. Los ratones se inmunizaron mediante inyección (s.c.) con 0.5 mg de IRBP péptido 1-20, en donde la inmunización fue precedida, por diez días, por péptido intranasal (grupo con tolerancia) o PBS de control (tolerancia simulada). La uveítis autoinmune (EAU) se verificó en el día 16, el día 21 y el día 28 postinmunización. Los ojos se examinaron mediante histología con resina o inmunoquímica, en donde la calificación de la histología fue un compuesto de dos indicios, es decir, el infiltrado celular inflamatorio y el daño estructural del tejido. El inicio de la enfermedad se aceleró en los ratones CD200KO con tolerancia simulada, con la expresión de la óxido nítrico sintasa del tipo 2 (NOS2) en las células del cuerpo ciliar, endotelio vascular retinal y la capa plexiforme interna de la retina, con los signos más tempranos de la enfermedad que aparecen en el día 10. Pero a momentos posteriores, el daño del tejido fue más severo en el tipo silvestre que en el ratón CD200KO (véase, Broderick, et al. (2000) Am. J. Pathol. 161 :1669-1677). El protocolo de la tolerancia resultó en una mejora en la calificación de la histología en los ratones silvestres y en los ratones CD200KO, en los días 16, 21 y 28, en donde esta mejora fue mayor en los ratones CD200KO (calificación 1.7) que en los ratones silvestres (calificación 2.9) en el día 28. A todos los puntos de medición, la tolerancia protegió al ratón silvestre y al CD200KO, en donde el ratón más altamente protegido se encontró en el día 28 en el ratón CD200KO con tolerancia (Cuadro 1 ).

CUADRO 1 Calificación de la Histología en ratones silvestres inmunizados y en ratones CD200KO inmunizados. PBS Silvestre Silvestre con PBS CD200KO CD200KO con tolerancia tolerancia Día 16 1.2 0.5 2.5 1.2 Día 21 4.3 2.0 2.8 2.0 Día 28 4.8 2.9 3.3 1.7 La inducción de la tolerancia en los grupos silvestres y CD200KO resultó en incrementos en el título del anticuerpo lgG1 , con relación a los ratones sin tolerancia. En el día 28, el título del anticuerpo lgG1 fue aproximadamente 6800 en los ratones silvestres con tolerancia, y aproximadamente 7200 en los ratones CD200KO con tolerancia, mientras que el título del lgG1 en todos los ratones sin tolerancia fue de aproximadamente 1800-2000. El incremento en el lgG1 inducido por la tolerancia indicó un cambio de la respuesta TH1 a la respuesta TH2. Las respuestas de la proliferación de los esplenocitos al péptido 1-20 mostraron respuestas equivalentes en los ratones del tipo silvestre y CD200KO (Broderick, et al., supra). En el presente estudio de la tolerancia, la proliferación del esplenocito se valoró en los cuatro grupos de ratones, en donde la valoración fue midiendo la marca con bromodesoxiuridilato de las células en la fase S con la medición del contenido total de ADN de la población como un todo (Cuadro 2). En el presente estudio de la tolerancia, la exposición intranasal al antígeno no tuvo un efecto inhibidor en la proliferación máxima de los esplenocitos en los días 16 ó 21, a pesar de la reducción de la enfermedad en los animales con tolerancia en estos dos días. Para el día 28, el número de células en la fase S se redujo tanto en los ratones del tipo silvestre con tolerancia como en los ratones CD200KO con tolerancia, en donde esta reducción fue mayor en los ratones CD200KO (1.0) que en los ratones del tipo silvestre (9.5) (Cuadro 2). En otras palabras, para el día 28, el número de células en la fase S se redujo en ambos grupos con tolerancia, pero más en el grupo CD200KO con tolerancia. Así, la CD200KO mejora la tolerancia.

CUADRO 2 Por ciento de células en la fase S en ratones del tipo silvestre inmunizados y en ratones CD20QKO inmunizados.

XI. La CD2Q0 Inactivada Mejora la Respuesta del Tipo TH2 pero no la Respuesta TH1. Los cultivos de esplenocitos se ajustaron en paralelo con los ensayos de proliferación para la valoración de la expresión de la citocina, en donde la expresión de la citocina se midió después de la reestimulación con el péptido (Cuadros 3-5). En los días 21 y 28, la expresión de la IL-4, lL-5 e IL-10 fue mayor en los ratones CD200KO con tolerancia, cuando se comparan con los ratones del tipo silvestre con tolerancia simulada, los ratones CD200KO con tolerancia simulada y los ratones del tipo silvestre con tolerancia, demostrando que la CD200KO mejora la respuesta TH2 (Cuadros 3-5). La interleucina-2 y el TNFalpha estaban elevados en los ratones del tipo silvestre con tolerancia simulada en el día 16, en comparación con los niveles en los otros tres grupos de ratones. La IL-2 y el TNFalpha también estaban elevados en los ratones del tipo silvestre con tolerancia simulada en el día 21 , en comparación con los niveles en los otros tres grupos de ratones. En el día 28, los niveles de IL-2 fueron similares en todos los cuatro grupos, mientras que en el día 28, los niveles de TNFalpha también fueron similares en todos los cuatro grupos. La IL-12 fue baja en todos los cultivos examinados, es decir, aproximadamente 50 pg/ml o menos. También se expresaron grandes cantidades de IFNgamma (5-15 ng/ml) en todos los cultivos examinados, pero no se observaron diferencias significativas entre los grupos.

CUADRO 3 Expresión de la IL-4 en los esplenocitos cultivados, dependencia de la PBS Silvestre Silvestre con PBS CD200KO CD200KO con tolerancia tolerancia Día 16 35 20 25 80 Día 21 80 110 115 240 Día 28 30 30 30 50 CUADRO 4 Expresión de la IL-5 en los esplenocitos cultivados, dependencia de la tolerancia y CD200KO, PBS Silvestre Silvestre con PBS CD200KO CD200KO con tolerancia tolerancia Día 16 165 20 60 90 Día 21 130 60 110 260 Día 28 130 60 65 90 CUADRO 5 Expresión de la IL-10 en los esplenocitos cultivados, dependencia de la tolerancia y CD200KO.

La STAT6 controla la trayectoria de diferenciación Th2. En contraste, la STAT4 es activada después de la señalización de la IL-12 para accionar las respuestas del tipo TH1 (véase, por ejemplo, Takeda, et al. (1996) Nature 380:627-630; Kaplan, et al. (1996) Immunity 4:313-319; Kapian, et al. (1996) Nature 382:174-177; Thierfelder, et al. (1996) Nature 382:171-174). A varios intervalos de tiempo (0, 12, 24 y 48 horas) después de la tolerancia nasal, los nodos linfáticos cervicales que drenan la mucosa nasal, las áreas linfoides del bazo (pulpa blanca), y las áreas del macrófago del bazo (pulpa roja), se examinaron para la expresión y activación de la STAT6. Los nodos linfáticos submandibulares se analizaron en paralelo para servir como un tejido de control (Cuadro 6). La señalización celular del tipo TH2, aumentada tanto por la tolerancia como por la inactivación de la CD200, se demostró por incrementos en la expresión de la STAT6 en la pulpa blanca del bazo y en el nodo linfoide cervical, como se muestra en t = 24 o a 48 horas (Cuadro 6). El efecto fue transitorio en los nodos cervicales, pero sostenido en las áreas linfoides y del macrófago del bazo.

La STAT4 se incrementó de manera transitoria en los nodos linfáticos drenantes y en el bazo de ratones CD200KO 24 horas postratamiento. Esto es consistente con la preparación inicial de TH1 observado en un modelo de tolerancia en rata, y se correlaciona con una expresión incrementada de CD86 en los nodos linfáticos cervicales. No se encontró incremento en la expresión de la STAT4 en los ratones del tipo silvestre, durante el periodo de toma de muestras (Cuadro 6) (Dick, et al. (2001) Br. J. Ophthalmol. 85:1001-1006).

CUADRO 6 Curso del tiempo de la respuesta a la tolerancia en ratones del tipo silvestre inmunizados y en ratones CD200KO inmunizados.

Nodo linfático submandibular (tejido de control) STAT6 9.7 7.6 1.0 1.0 4.0 18.8 8.4 12.4 STAT4 4.6 1.0 0.1 0.03 0.4 0.5 1.9 0.8 CD86 8.7 6.0 3.5 10.3 1.5 5.4 1.8 6.5 La inmunotinción de las secciones histológicas mostró un incremento en la expresión de la STAT6 en los ratones CD200KO, demostrando el fenómeno de la expresión de la STAT6 dependiente de la CD200KO (Cuadro 7). Los estudios relacionados de los nodos linfáticos cervicales demostraron que la STAT6 estaba traslocada del citosol a los núcleos en los ratones CD200KO, pero no en los ratones del tipo silvestre, y que la fosforilación de la STAT6 fue mayor en los ratones CD200KO que en los ratones del tipo silvestre.

CUADRO 7 Porcentaje de la sección histológica del tejido que expresa la STAT6, a 24 horas o 48 horas después de la tolerancia.

Se encontraron pequeños incrementos en la STAT6 con la tolerancia en los nodos linfáticos submandibulares de los ratones CD200KO. Estos pequeños incrementos pueden haberse producido por la ingestión de pequeñas cantidades de antígeno durante la administración intranasal, a efectos sistémicos de los cambios en el bazo, o a los efectos del antígeno diseminado (Dick, et al., supra).

XII. La CD2QQK0 induce incrementos en los Treqs y se incrementa en las células positivas a 1L-10 de las células dendríticas del tracto respiratorio. Las células dendríticas del tracto respiratorio (DC) están implicadas en la tolerancia a los antígenos administrados nasalmente, y estimulan de manera preferencial la respuesta del tipo TH2 (Akbari, et al. (2001 ) Nal Immunol. 2:725-731 ; Stumbles, et al. (1998) J. Exp. Med. 188:2019-2031 ). Las células CD45+ de los tractos respiratorios de ratones del tipo silvestre y CD200KO se aislaron. En los ratones del tipo silvestre, la población principal fue DC CD1 1c÷ (más del 80%), con pocas células CD11 b+ (10-15%). En los ratones CD200KO, la población principal fue de células CD 1 b+ (más del 40%), con menos DC CD1 c+ (35-40%). Las células de los ratones del tipo silvestre y CD200KO mostraron niveles bajos de los marcadores de activación, como se espera para las APC del tracto respiratorio. Tanto las células CD11b+ como CD1 c+ del tracto respiratorio CD200KO expresaron niveles menores de antígeno MHC de clase II que las células correspondientes de los ratones del tipo silvestre. Se encontró F4/80 en aproximadamente 25-28% de las células CD45+ tanto en los ratones del tipo silvestre como en los CD200KO, mientras que se encontró CD204 en aproximadamente 5% de las células CD45+ de los ratones del tipo silvestre y aproximadamente 5% de células CD45+ de los ratones CD200KO. La respuesta del tipo TH2 puede provocar un incremento en los linfocitos T reguladores (Tregs), mientras que la tolerancia puede depender de la IL-10 y de los Tregs (véase, por ejemplo, Kaya, et al. (2002) J. Immunol. 168:1552-1556; Massey, et al. (2002) Vet. Immunol. Immunopathol. 87:357-372; Akbari, et al. (2001 ) Nal Immunol. 2:725-731 ; Kohm, et al. (2002) J. Immunol. 169:4712-47 6). Las medidas de fluorescencia en las células del bazo no permeabilizadas en ratones de control y ratones CD200KO, demostraron incrementos moderados en los Tregs CD4+CD25÷, dentro de la población de linfocitos T CD3+, en donde estos incrementos fueron provocados por la CD200KO inactivada (Cuadro 8). En todos los tres puntos de medición, los ratones CD200KO con tolerancia tuvieron un porcentaje mayor de Tregs CD4+CD25+ que los ratones del tipo silvestre, con tolerancia, demostrando la dependencia de la CD200 para la respuesta de los linfocitos T reguladores (Cuadro 8). El porcentaje de células CD3+ que son células CD4+CD25+ en ratones normales, del tipo silvestre (no inmunizados, sin tolerancia) fue de aproximadamente 8.7%, y en los ratones CD200KO (no inmunizados, sin tolerancia) fue de aproximadamente 9.2% (datos no mostrados).

CUADRO 8 Influencia de la tolerancia y la CD200KO en el porcentaje de células CD3* que son células CD4*CD25+, con análisis de los esplenocitos.

Las células que producen interleucina-10 se encontraron en la población de células mieloides del bazo. Se encontraron dos poblaciones principales del día 21 en adelante, es decir, células IL-10bajaCD11b+ e IL-10aifaCD11 b'. El porcentaje de células IL-10bajaCD11 b+ varió de 2-8%, con una tendencia a porcentajes más altos en el día 28, mientras que la población de células IL-10altaCD11 b" fue más pequeña, aproximadamente 2% en el día 21 y 4% en el día 28. El análisis mediante el índice de la fluorescencia geométrica demostró que las células de los ratones CD200KO con tolerancia simulada y los ratones CD200KO con tolerancia, produjeron niveles más altos de IL-10 que los ratones del tipo silvestre con tolerancia simulada y los del tipo silvestre con tolerancia. El análisis de las células IL-10altaCD 1 b" en el día 28 demostraron que la mayoría de estas células fueron CD1 c"/ aJa, CD3", B220" y CD45Rbintermedia, y mostraron una morfología DC plasmocitoide clásica. Este fenotipo es similar al subconjunto CD11cbajaCD45RBalta de DC plasmocitoides, generado in vitro, que puede inducir la tolerancia y la diferenciación de las células Tr1 in vivo (Wakkach, et al. (2003) Immunity 18:605-617).

XIII. Expresión del CD200R Determinada mediante PCR en Tiempo Real. La expresión del CD200R se determinó mediante análisis de PCR en tiempo real, mediante ensayos Taiman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), en donde los resultados son con relación a la expresión de la ubiquitina (Cuadro 9). Los incrementos en la expresión del CD200R, encontrados en las células TH2 indican que estas células pueden modularse mediante el tratamiento con un agonista o antagonista de la trayectoria de señalización de CD200/CD200R. Los antagonistas de la trayectoria CD200/CD200R, tales como un anticuerpo anti-CD200 o un CD200R inactivado, provocan incrementos en la respuesta TH2.

CUADRO 9 Expresión del CD200R mediante análisis con Taiman®: con relación a la ubiquitina = 1. 0.

Colección de el 14+ polarizado IFNg/IL-12/anti-IL-4 activado por TH1 de 22 linfocitos T de Ratón BALB/c Colección de Mel 14+ polarizado IL-4/antl-IFNg activado por TH2 de linfocitos T 62 de Ratón BALB/c Colección Mel 14 br CD4+ 1 semana, polarizado aCD3 activado por TH1 de 50 linfocitos T de Ratón BALB/c Colección Mel 14 br CD4+ 1 semana, polarizado aCD3 activado por TH2 de 387 linfocitos T de Ratón BALB/c TH1 fresco 3 semanas, polarizado linfocitos T de Ratón BALB/c 37 TH2 fresco 3 semanas, polarizado linfocitos T de Ratón BALB/c 392 Células polarizadas 3X PMA/ionomicina activadas por TH1 de linfocitos T de 23 Ratón BALB/c Células polarizadas 3X PMA/ionomicina activadas por TH2 de linfocitos T de 301 Ratón BALB/c Polarizado 3 semanas PMA/ionomicina activado por TH1 de linfocitos T de 23 Ratón C57BL/6 Polarizado 3 semanas PMA/ionomicina activado por TH2 de linfocitos T de 735 Ratón C57BL/6 Muchas modificaciones y variaciones de esta invención, como será evidente para alguien con experiencia en la técnica, pueden hacerse para adaptarse a una situación, material, composición de interés, procedimiento, paso o pasos del procedimiento, particulares, para preservar el objetivo, espíritu y alcance de la invención. Todas de tales modificaciones pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas en la presente, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Las modalidades específicas descritas en la presente, se ofrecen a manera de ejemplo únicamente, y la invención estará limitada en términos de las reivindicaciones anexas, junto con todo el alcance de los equivalentes a las cuales las reivindicaciones tienen derecho y la invención no será limitada por las modalidades específicas que se han presentado aquí, a manera de ejemplo.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- El uso de un agonista o antagonista de la CD200, para preparar un medicamento para modular la tolerancia a un antígeno en un sujeto con una condición o trastorno inflamatorio o inmune.

2. - El uso que se reclama en la reivindicación 1, en donde la modulación incrementa o mantiene la tolerancia, y el medicamento: a) comprende un antagonista de la CD200; o b) incrementa la respuesta del tipo TH2.

3. - El uso que se reclama en la reivindicación 1, en donde el agonista o antagonista se deriva del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la CD200 o al CD200R.

4.- El uso que se reclama en la reivindicación 3, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a: a) CD200; o b) CD200R.

5. - El uso que se reclama en la reivindicación 3, en donde el agonista o antagonista comprende: a) un anticuerpo policlonal; b) un anticuerpo monoclonal; c) un anticuerpo humanizado; d) un fragmento Fv, Fab o F(ab')2 o e) un péptido mimético de un anticuerpo.

6. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el agonista o antagonista comprende una ácido nucleico que: a) codifica una CD200 o un CD200R; o b) se une específicamente a un polinucleótido que codifica una CD200 o un CD200R.

7. - El uso que se reclama en la reivindicación 6, en donde el ácido nucleico comprende: a) un ácido nucleico antisentido; b) un ácido nucleico de un ARN de interferencia o c) una mutación genética en el genoma del sujeto, que reduce la expresión de la CD200 o el CD200R biológicamente activos.

8. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la condición o trastorno comprende una condición o trastorno autoinmune.

9.- El uso que se reclama en la reivindicación 1, en donde la condición o trastorno comprende: a) uveorretinitis; b) rechazo de injerto o transplante; c) diabetes mellitus; d) esclerosis múltiple; e) trastorno inflamatorio del intestino (IBD); f) artritis reumatoide o g) asma o alergia.

10. - El uso que se reclama en la reivindicación 1, en donde la tolerancia es inducible: a) intranasalmente; b) enteralmente; c) oralmente; d) parenteralmente; e) intravenosamente o f) mucosalmente.

11. - El uso que se reclama en la reivindicación 2, en donde el incremento o mantenimiento comprende una mejora en una calificación histológica.

12.- El uso que se reclama en la reivindicación 11 , en donde la mejora comprende una reducción en: a) infiltrado celular inflamatorio o b) daño estructural del tejido.

13. - El uso que se reclama en la reivindicación 12, en donde: a) el infiltrado celular es en la retina o b) el daño del tejido es de una célula fotorreceptora.

14. - El uso que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el trastorno o condición resulta de una inmunización.

15. - El uso que se reclama en la reivindicación 2, en donde la respuesta del tipo TH2 comprende un incremento detectable en la expresión o los niveles de una citocina que es: a) IL-4; b) IL-5; c) IL-10 o d) IL-13.

16. - El uso que se reclama en la reivindicación 15, en donde la expresión o los niveles de la citocina TH2 son al menos 2 veces mayores con el antagonista de la CD200 que sin el antagonista de la CD200.

17. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la proliferación de las células inmunes disminuye o se inhibe detectablemente en un sujeto con tolerancia tratado con un antagonista de la CD200, con relación a un sujeto con tolerancia no tratado con un antagonista de la CD200.

18. - El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde la proliferación de las células inmunes con el antagonista de la CD200 es: a) 75% o menos o b) 50% o menos, que la proliferación sin el antagonista de la CD200.

19.- El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde la célula inmune es un esplenocito.

20.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el antagonista de la CD200 resulta en un incremento detectable en la expresión o activación de la STAT6 con el antagonista de la CD200, en comparación sin el antagonista de la CD200.

21. - El uso que se reclama en la reivindicación 1, en donde hay un incremento detectable en la actividad o niveles de: a) linfocitos T reguladores (Tregs) o b) células que expresan la IL-10; con el antagonista de la CD200, en comparación sin el antagonista de la CD200.

22. - El uso que se reclama en la reivindicación 21, en donde: a) los Tregs comprenden linfocitos T CD3+CD4+CD25+ o b) las células que expresan la IL-10 son: i) CDHb'; ii) CD1 1 b', CD11c';baja, CD3", B220", CD45RBintermedia o iii) células dendríticas plasmocitoides.

23. - El uso que se reclama en la reivindicación 1, en donde la modulación es la disminución y el medicamento comprende un agonista de la CD200.

24. - El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde la condición o trastorno inmune es: a) infección persistente; b) o cáncer.

25. - El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde la modulación: a) disminuye la respuesta TH2 o b) disminuye o inhibe la actividad o los niveles de los linfocitos T reguladores (Tregs).