CN117210528B - 一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，属于细胞医学技术领域。本发明提供了一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，本发明综合五项指标(Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率、Treg增殖促进率、TNF‑α分泌抑制率和淋巴细胞增殖抑制率)的检测结果平均值对间充质干细胞的免疫调控功能进行全面系统的评价，并根据多批次的检测结果建立了一套评价标准。本发明提供的方法相比单一指标的评价方法，能够更全面可靠的评估MSC的免疫调控功能。
Description
技术领域
本发明属于细胞医学技术领域，具体涉及一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，可以在羊膜、脂肪和脐带等多种组织中分离。间充质干细胞还特有免疫调控功能，对B、T淋巴细胞等多种免疫细胞的活化、增殖与分化进行调控，并能提高调节性T(T regulatory，Treg)细胞的比例，维持体内免疫环境的稳定。目前间充质干细胞的免疫调控特性已被应用于移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮、1型糖尿病、类风湿性关节炎、细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome，CRS)等免疫异常和炎症相关疾病的临床研究中。
为了评估间充质干细胞在免疫调控功能方面的生物有效性，现有技术中的检测方法只能对单一检测结果进行评价，具有片面性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，本发明综合这五项指标(Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率、Treg增殖促进率、TNF-α分泌抑制率和淋巴细胞增殖抑制率)的检测结果平均值对间充质干细胞的免疫调控功能进行全面系统的评价，并根据多批次的检测结果建立了一套评价标准。
本发明提供了一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，包括以下步骤：
分别测定间充质干细胞的Th17、Th1、淋巴细胞增殖抑制情况和Treg增殖促进情况以及TNF-α分泌抑制情况，计算Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率、Treg增殖促进率、TNF-α分泌抑制率和淋巴细胞增殖抑制率的检测实验，得到各指标的检测结果；
根据各指标的检测结果计算平均值；
根据平均值判断间充质干细胞的免疫调控能力：
当平均值大于70％时，说明间充质干细胞具有较强的免疫调控能力；
当平均值在30％～70％范围内时，说明间充质干细胞具有中等免疫调控能力；
当平均值小于30％时，说明间充质干细胞具有较弱的免疫调控能力。
优选的，测定间充质干细胞的Th17、Th1、淋巴细胞增殖抑制情况和Treg增殖促进情况以及TNF-α分泌抑制情况的方法，按如下方法分为四组经细胞培养后进行流式检测、酶化学发光法检测和ELISA检测：PBMC组、PBMC+PHA组、PBMC+间充质干细胞+PHA组和PBMC+间充质干细胞组；其中，PBMC的接种密度为1.0～20×104/孔；PHA的终浓度为1μg/ml～1mg/ml；所述间充质干细胞的接种密度为1.0～10×104/孔。
优选的，在测定前，开展抑制间充质干细胞分裂的处理；
抑制间充质干细胞分裂的方法，将培养的间充质干细胞消化、洗涤，培养，用丝裂霉素C处理后，去除丝裂霉素C，得到间充质干细胞。
优选的，所述丝裂霉素C的处理浓度为1μg/ml～1mg/ml；
所述丝裂霉素C的处理时间为0.5～2h。
优选的，所述Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率或Treg增殖促进率计算公式见公式I；
抑制率或促进率＝1-[(PBMC+MSC+PHA)-(PBMC+MSC)]/[(PBMC+PHA)-(PBMC)] 公式I；
其中，(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞样品通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC+MSC)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC+PHA)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量。
优选的，淋巴细胞增殖抑制率计算公式见公式II：
淋巴细胞增殖抑制率＝1-[RLUs(PBMC+MSC+PHA)-RLUs(PBMC+MSC)]/[RLUs(PBMC+PHA)-RLUs(PBMC)] 公式II。
其中，RLUs(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞样品通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC+MSC)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC+PHA)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量。
优选的，TNF-α分泌抑制率计算公式见公式III：
TNF-α分泌抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)] 公式III
其中，OD(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，可以代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC+MSC)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，可以代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC+PHA)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，可以代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，可以代表该分组样品中TNF-α的相对浓度。
优选的，所述间充质干细胞包括以下至少一种间充质干细胞：羊膜来源的间充质干细胞、脐带来源的间充质干细胞和脂肪来源的间充质干细胞。
优选的，所述间充质干细胞包括间充干细胞P1～P5代细胞。
本发明提供了一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，通过相关性分析发现，MSC的Th17增殖抑制率和淋巴细胞增殖抑制率呈正相关(相关系数＝0.98)，淋巴细胞增殖抑制率和TNF-α分泌抑制率呈正相关(相关系数＝0.86)，Th1增殖抑制率和Treg增殖促进率呈正相关(相关系数＝0.81)。因此，本发明综合这五项指标(Th17增殖抑制率/Th1增殖抑制率/Treg增殖促进率/TNF-α分泌抑制率/淋巴细胞增殖抑制率)的检测结果平均值对间充质干细胞(羊膜MSC和脐带MSC)的免疫调控功能进行全面系统的评价，并根据多批次的检测结果建立了一套评价标准。根据若干次实验的检测结果，该平均值大于70％时表明MSC具有很强的免疫调控能力，在30％-70％之间表明MSC具有中等免疫调控能力，小于30％时具有较弱的免疫调控能力，有助于评估不同批次、不同来源的干细胞药物对免疫调控相关适应症的潜在疗效。
本发明进一步限定了测定间充质干细胞的Th17、Th1、淋巴细胞增殖抑制情况和Treg增殖促进情况以及TNF-α分泌抑制情况的方法，具体分为4个分组，分别为PBMC组、PBMC+PHA组、PBMC+MSC+PHA组、PBMC+MSC组，并且计算公式为1-[(PBMC+MSC+PHA)-(PBMC+MSC)]/[(PBMC+PHA)-(PBMC)]形式。与现有技术同类检测项目相比，本发明的实验分组和计算方法能够更加准确地评估间充质干细胞对PHA刺激后的淋巴细胞增殖进行抑制的能力，也即免疫调控能力。而现有技术的同类检测项目，只是简单对比了干细胞、淋巴细胞共培养组与单独淋巴细胞组的各个淋巴细胞亚群的增殖差异以及分泌TNF-α的高低，无法对间充质干细胞对于PHA刺激后的PBMC以及淋巴细胞亚群(Th17/Th1/Treg)进行准确的量化评估(增殖或抑制率)，因为现有技术的实验分组和本发明相比，少了一组④PBMC+MSC，从而无法在最终检测结果的数据分析中剔除MSC对非刺激状态下PBMC的免疫调控影响。
具体实施方式
本发明提供了一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，包括以下步骤：
分别测定间充质干细胞的Th17、Th1、淋巴细胞增殖抑制情况和Treg增殖促进情况以及TNF-α分泌抑制情况，计算Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率、Treg增殖促进率、TNF-α分泌抑制率和淋巴细胞增殖抑制率的检测实验，得到各指标的检测结果；
根据各指标的检测结果计算平均值；
根据平均值判断间充质干细胞的免疫调控能力：
当平均值大于70％时，说明间充质干细胞具有较强的免疫调控能力；
当平均值在30％～70％范围内时，说明间充质干细胞具有中等免疫调控能力；
当平均值小于30％时，说明间充质干细胞具有较弱的免疫调控能力。
本发明分别测定间充质干细胞的Th17、Th1、淋巴细胞增殖抑制情况和Treg增殖促进情况以及TNF-α分泌抑制情况，计算Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率、Treg增殖促进率、TNF-α分泌抑制率和淋巴细胞增殖抑制率的检测实验，得到各指标的检测结果。
在本发明中，测定间充质干细胞的Th17、Th1、淋巴细胞增殖抑制情况和Treg增殖促进情况以及TNF-α分泌抑制情况的方法，按如下方法分为四组经细胞培养后进行流式检测、酶化学发光法检测和ELISA检测：PBMC组、PBMC+PHA组、PBMC+间充质干细胞+PHA组和PBMC+间充质干细胞组；其中，PBMC的接种密度为1.0～20×104/孔；PHA的终浓度为1μg/ml～1mg/ml；所述间充质干细胞的接种密度为1.0～10×104/孔。
在本发明中，所述活化间充质干细胞的方法，优选将培养的间充质干细胞消化、洗涤，培养，用丝裂霉素C处理后，去除丝裂霉素C，得到间充质干细胞。所述丝裂霉素C的处理浓度优选为1μg/ml～1mg/ml；所述丝裂霉素C的处理时间为0.5～2h。所述去除丝裂霉素C的方法为吸出含丝裂霉素C的培养基，然后用洗涤液洗涤间充质干细胞两次。所述洗涤液优选为D-PBS溶液。
在本发明中，所述检测包括流式检测、板式发光检测和ELISA检测。所述Th17增殖抑制情况、Th1增殖抑制情况、Treg增殖促进优选采用流式检测。Th1增殖抑制情况检测结果为CD8/IFN-γ+(Th1)细胞百分含量。Th17增殖抑制情况检测结果为CD4/IL-17A+(Th17)细胞百分含量。Treg增殖促进情况检测结果为CD25/FOXP3+(Treg)细胞百分含量。所述淋巴细胞增殖抑制情况优选采用板式发光检测方法完成。所述TNF-α分泌抑制情况优选采用ELISA检测方法完成。所述Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率或Treg增殖促进率计算公式优选见公式I；
抑制率或促进率＝1-[(PBMC+MSC+PHA)-(PBMC+MSC)]/[(PBMC+PHA)-(PBMC)] 公式I；
其中，(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞样品通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC+MSC)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC+PHA)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量。
在本发明中，所述淋巴细胞增殖抑制率的计算公式见公式II：
淋巴细胞增殖抑制率＝1-[RLUs(PBMC+MSC+PHA)-RLUs(PBMC+MSC)]/[RLUs(PBMC+PHA)-RLUs(PBMC)] 公式II。
其中，RLUs(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞样品通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC+MSC)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC+PHA)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
在本发明中，所述TNF-α分泌抑制率的计算公式见公式III：
TNF-α分泌抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)] 公式III
其中，OD(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC+MSC)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC+PHA)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，代表该分组样品中TNF-α的相对浓度。
在本发明中，所述间充质干细胞优选包括以下至少一种间充质干细胞：羊膜来源的间充质干细胞、脐带来源的间充质干细胞和脂肪来源的间充质干细胞。所述间充质干细胞优选包括间充干细胞P1～P5代细胞。本发明对间充干细胞P1～P5代细胞的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制备方法即可。
在本发明中，基于多个样本的Pearson相关性分析结果表明，淋巴细胞增殖抑制率和淋巴细胞分泌TNF-α抑制率呈高度正相关(相关系数＝0.86)；淋巴细胞增殖抑制率和Th17细胞增殖抑制率呈高度正相关(相关系数＝0.98)；Th1增殖抑制率和Treg增殖促进率呈正相关(相关系数＝0.81)。而Th17和Treg也是彼此存在相互作用的，比如Treg细胞促进免疫耐受的形成，而Th17则会阻碍耐受的产生，基于以上原因，所以选取了这五种指标对间充质干细胞的免疫调控能力进行综合评价。
得到上述5个指标的检测结果后，本发明根据各指标的检测结果计算平均值。
本发明对5指标检测结果计算平均值的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的计算方法即可。
得到平均值后，本发明根据平均值判断间充质干细胞的免疫调控能力：
当平均值大于70％时，说明间充质干细胞具有较强的免疫调控能力；
当平均值在30％～70％范围内时，说明间充质干细胞具有中等免疫调控能力；
当平均值小于30％时，说明间充质干细胞具有较弱的免疫调控能力。
在本发明中，所述判断间充质干细胞的免疫调控能力强弱的标准是根据为若干次实验的检测结果得到。不同免疫调控能力的间充质干细胞根据不同的适应症进行治疗。所述适应症优选包括膝骨关节炎、新冠病毒感染和急性肺损伤。
下面结合实施例对本发明提供的一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
通过对生产的多批次间充质干细胞样本的Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率、Treg增殖促进率、TNF-α分泌抑制率和淋巴细胞增殖抑制率这五个检测项目结果进行Pearson相关性分析，具体采用EXCEL软件上的数据分析功能完成。
Pearson相关性分析是一种用于衡量两个变量之间的线性关系强度和方向。它基于协方差的概念，通过计算两个变量的协方差除以它们各自的标准差的乘积，得到一个范围在-1到1之间的相关系数。根据相关系数的绝对值，可以判断相关性的强度。一般而言，相关系数大于0.7或小于-0.7被认为是强相关，0.4到0.7或-0.4到-0.7之间被认为是中等相关，0到0.4或-0到-0.4之间被认为是弱相关。相关系数为正时，表示两个变量之间存在正相关关系，即一个变量增大，另一个变量也增大；相关系数为负时，表示两个变量之间存在负相关关系，即一个变量增大，另一个变量减小。
结果表明：淋巴细胞增殖抑制率和淋巴细胞分泌TNF-α抑制率呈高度正相关(相关系数＝0.86)；淋巴细胞增殖抑制率和Th17细胞增殖抑制率呈高度正相关(相关系数＝0.98)；Th1增殖抑制率和Treg增殖促进率呈正相关(相关系数＝0.81)。而Th17和Treg也是彼此存在相互作用的，比如Treg细胞促进免疫耐受的形成，而Th17则会阻碍耐受的产生，基于以上原因，所以选取了这五种指标对间充质干细胞的免疫调控能力进行综合评价。
实施例2
一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法
一、5种指标的检测实验
A.Th17和Th1增殖抑制和Treg增殖促进实验
检测方法：淋巴细胞共培养+流式细胞检测法
主要仪器：流式细胞仪、高速冷冻离心机、超净工作台、CO2培养箱。
主要试剂：RPMI-1640、PBMC、D-PBS、丝裂霉素C(MMC)、植物血球凝集素(PHA)、Human Th1/Th17检测试剂盒、Human Th17/Treg检测试剂盒、裂解液、染色缓冲液、佛波酯(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate,PMA)和离子霉素(ionomycin)的混合物、CD8抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD25抗体、同型对照抗体(PE Mouse IgG1,κIsotype control)、4％组织细胞固定液(PFA)，6孔板、流式管。
检测内容：
1.将培养的间充质干细胞消化、洗涤、计数后，用培养基调整细胞浓度为2×105/ml，接种于6孔培养板，每孔3ml，置入37℃5％CO2培养箱中。
2.间充质干细胞培养4h后，加入终浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理1h，然后移除含丝裂霉素C的培养基，用D-PBS以4mL/孔清洗2遍。
3.复苏人外周血单个核细胞(PBMC)，300g离心10min，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度为1×106/ml。
4.按照如下方法进行分组：
①PBMC
②PBMC+PHA
③PBMC+MSC+PHA
④PBMC+MSC
在各组加入1×106/ml单个核细胞悬液3ml，并在相应组加入终浓度10μg/ml的PHA。
5.将6孔板置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养72h。
6.72h后，收集共培养、单独培养的PBMC细胞培养上清，将加入PHA的细胞混悬液做Th1/Th17流式分析，未加刺激剂的细胞混悬液做Treg流式分析。
7.Th1/Th17所需PBMC细胞用Stain Buffer调节细胞浓度至1×106/ml，加入PMA/Ionomycin Mixture(每1mL的1×106/ml的细胞悬液加入2μl PMA)刺激过夜。
8.取刺激后的细胞加入BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor阻断胞内-胞外转运，300g离心5min，用Stain buffer重悬细胞，计数后调整细胞浓度为1×106/100μl，分装至流式管中，每管100μl。每管加入CD3和CD8抗体各5μl，涡旋混匀，室温避光孵育20min。每管加2ml的Stain buffer，250g离心10min，去上清。每管加入0.5ml的FixationBuffer固定细胞，涡旋混匀，室温避光反应10min后500g离心5min，去上清。每管加入2ml的Stain buffer洗一次，500g离心5min，去上清。每管加0.5ml的Perm/Wash buffer进行细胞破膜处理，涡旋混匀，室温避光反应15min。每管加2ml的Stain buffer，500g离心5min，去上清。Stain buffer重悬细胞，取单独培养PBMC和与MSC共培养的PBMC各1管，均加入HumanTh1/Th17 Phenotyping Cocktail 20μl，涡旋混匀，室温避光孵育30min。每管加入2ml的Stain buffer洗一次，500g离心5min，去上清。每管加入500μl的1％PFA重悬细胞4℃保存备用。
9.取未刺激的细胞300g离心5min，用Stain buffer重悬细胞，计数后调整细胞浓度为1×106/100μl，分装至流式管中，每管100μl。每管加入CD4和CD25抗体各5μl，涡旋混匀，室温避光孵育30min。每管加2ml的Stain buffer，250g离心10min，去上清。每管加入0.5ml的Lysing Buffer固定细胞，涡旋混匀，室温避光反应10min。每管加2ml的HumanFOXP3 Buffer A，涡旋混匀，室温避光反应10min后500g离心5min，去上清。每管加入2ml的Stain buffer洗一次，500g离心5min，去上清。每管加0.5ml的Human FOXP3 Buffer C,涡旋混匀，室温避光反应30min。每管加2ml的Stain buffer，500g离心5min，去上清。Stainbuffer重悬细胞，取单独培养PBMC其中1管加入5μl PE Mouse IgG1,κIsotype Control,另1管加入20μl Human Th17/Treg Phenotyping Cocktail，与MSC共培养的PBMC 1管加入20μl Human Th17/Treg Phenotyping Cocktail,涡旋混匀，室温避光孵育40min。每管加入2ml的Stain buffer洗一次，500g离心5min，去上清。每管加入500μl的1％PFA重悬细胞4℃保存备用。
10.流式细胞仪上机检测：Th1检测得出CD8/IFN-γ+(Th1)细胞百分含量。Th17检测得出CD4/IL-17A+(Th17)细胞百分含量。Treg检测得出CD25/FOXP3+(Treg)细胞百分含量。
11.计算：
Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率或Treg增殖促进率＝1-[(PBMC+MSC+PHA)-(PBMC+MSC)]/[(PBMC+PHA)-(PBMC)] 公式I
其中：(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞样品通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC+MSC)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC+PHA)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC)表示该分组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量。
B、淋巴细胞增殖抑制：
检测方法：淋巴细胞共培养+酶化学发光法
主要仪器：酶化学发光仪、高速冷冻离心机、超净工作台、CO2培养箱。
主要试剂：RPMI-1640、PBMC、D-PBS、丝裂霉素C(MMC)、植物血球凝集素(PHA)、
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability。
检测内容：
1.将培养的间充质干细胞消化、洗涤、计数后，用培养基调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔培养板，每孔100μl，置入37℃、5％CO2培养箱中。
2.间充质干细胞培养4h后，加入终浓度为10μg/mL的丝裂霉素C处理1h，然后移除含丝裂霉素C的培养基，用D-PBS以200μl/孔清洗2遍。
3.复苏人外周血单个核细胞(PBMC)，300g离心10min，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度为4×105/ml。
4.在各组加入4×105/ml单个核细胞悬液100μl，并在相应组加入终浓度10μg/mL的PHA。
分组如下：
①PBMC
②PBMC+PHA
③PBMC+MSC+PHA
④PBMC+MSC
5.将96孔板置于37℃5％CO2培养箱中继续培养72h。
6.72h后，向96孔板中加入Cell Viability Assay试剂100μL/孔，放入板式发光检测仪中，震荡混匀2min，继续孵育10min，检测发光读数RLUs。
7.计算：淋巴细胞增殖抑制率＝1-[RLUs(PBMC+MSC+PHA)-RLUs(PBMC+MSC)]/[RLUs(PBMC+PHA)-RLUs(PBMC)] 公式II。
其中，RLUs(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞样品通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC+MSC)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC+PHA)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC)表示该分组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表该分组细胞的相对数量。
C、TNF-α分泌抑制实验
检测方法：酶联免疫法
主要仪器：多功能酶标仪、高速冷冻离心机、超净工作台、CO2培养箱。
主要试剂：RPMI-1640、PBMC、D-PBS、丝裂霉素C(MMC)、植物血球凝集素(PHA)、
人TNF-αELISA检测试剂盒。
检测内容：
1.将培养的间充质干细胞消化、洗涤、计数后，用培养基调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔培养板，每孔100μl，置入37℃、5％CO2培养箱中。
2.间充质干细胞培养4h后，加入终浓度为10μg/mL的丝裂霉素C处理1h，然后移除含丝裂霉素C的培养基，用D-PBS以200μl/孔清洗2遍。
3.复苏人外周血单个核细胞(PBMC)，300g离心10min，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度为4×105/ml。
4.按照以下方法进行分组：
①PBMC
②PBMC+PHA
③PBMC+MSC+PHA
④PBMC+MSC
在各组加入4×105/ml单个核细胞悬液100μl，并在相应组加入终浓度10μg/mL的PHA。
5.将6孔板置于37℃5％CO2培养箱中继续培养72h。
6.96孔板置于37℃5％CO2培养箱中继续培养72h后将各组上清收集至EP管中，1500rpm离心5min，以离心后的上清作为检测样本。
7.试剂准备：使用前应将试剂盒的所有组分和待检样本温度恢复到室温，待测标本1000g室温离心20分钟。
8.洗涤缓冲液的配制：将浓缩洗涤缓冲液平衡到室温，如有结晶需待结晶完全溶解后方可使用，混匀后取20×浓缩洗涤缓冲液与超纯水按照1:19的比例混合，充分混匀后备用。
9.稀释缓冲液的配制：将浓缩稀释缓冲液平衡到室温至结晶完全溶解，如有结晶需待结晶完全溶解后方可使用，混匀后取20×浓缩稀释缓冲液与超纯水按照1:19的比例混合，充分混匀后备用。
10.洗板：每孔加入300μl洗涤缓冲液洗板3次，拍干酶标板。
11.加样孵育：样本孔中加100μl待测样本，每组样本加2孔，用封板膜封板后室温孵育2h。
12.洗板：撕去封板膜，弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，每孔加入300μl洗涤缓冲液静置1分钟，甩干液体并拍干，重复洗涤3次。
13.酶标检测抗体孵育：用1×稀释缓冲液将酶标检测抗体0.2mg/ml稀释至工作浓度0.5μg/ml，每孔加入100μl，封板膜封板后室温孵育1h。
14.洗板：撕去封板膜，弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，每孔加入300μl洗涤缓冲液静置1分钟，甩干液体并拍干，重复洗涤3次。
15.显色：将显色A液、显色B液等体积混合，每孔加入200μl，封板膜封板后置于酶室温避光孵育15分钟。
16.终止、读值：每孔加入50μl终止，轻轻震动酶标板至显色均匀，20分钟内读取450nm处的光吸收值。
17.计算：TNF-α分抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)] 公式III。
其中，OD(PBMC+MSC+PHA)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC+MSC)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC+PHA)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，代表该分组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC)表示该分组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的OD值(光吸收值)，代表该分组样品中TNF-α的相对浓度。
二、计算平均值
将上述计算得到的Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率、Treg增殖促进率、TNF-α分泌抑制率和淋巴细胞增殖抑制率进行加和，然后计算平均值，得到一个综合评估免疫调控能力的指标。
三、MSC的免疫调控能力的划分
基于若干批次的羊膜和脐带种子库细胞和制剂细胞对这五个检测指标检测结果求均值，再进行排序，如下表所示，因此本发明制定关于免疫调控能力评价的判定标准为：该平均值大于70％时表明MSC具有很强的免疫调控能力，在30％-70％之间表明MSC具有中等免疫调控能力，小于30％时具有较弱的免疫调控能力。
结果见表1。
表1为多批次羊膜和脐带MSC样本的检测结果
实施例2
一种羊膜MSC P1代细胞的免疫调控能力的评价方法
1.羊膜来源的间充质干细胞的分离和培养
1)羊膜组织采集、运输和保存：羊膜采集前进行供者筛选，整个采集过程严格执行无菌操作，样本采集后放入专用运输箱中，运送至实验室进行接收和质量检测；
2)原代细胞培养：将上步骤得到的合格的采集物传入细胞制备区内，并放置于超净工作台上；将胎儿面的羊膜组织剥离下来，清洗干净羊膜组织后并剪成1×1cm2的组织块转移至离心管中；用胰酶代替物TrypLE消化；清洗后再用胶原酶NB6至约95％羊膜组织消化完全为止；消化结束后两次重悬离心后取上清液送检，倒去剩余上清，重悬细胞，接种细胞至T225培养瓶(以下简称培养瓶)，加入MSC-T4完全培养基，将培养瓶转至CO2培养箱内；
3)原代细胞换液：将培养3天后的原代细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，培养瓶添加35mL MSC-T4完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
4)原代细胞传代：原代细胞培养5-7天后，取出培养瓶用0.9wt％氯化钠注射液润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE使液体铺满培养瓶细胞贴附面，放入消化，消化结束后向培养瓶内添加MSC-T4完全培养基，离心后倒去上清，吸取MSC-T4完全培养基至离心管中重悬细胞，将细胞悬液接种至T225cm2培养瓶内，加入35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
5)种子细胞库建立：从CO2培养箱中取出培养瓶，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE至培养瓶内，消化后吸取MSC-T4完全培养基，终止消化，将细胞悬液转入离心管中，并吸取0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶，转入上述离心管中，离心两次后；按照5×106个/mL/管的细胞冻存密度加入细胞悬液中吹打混匀后转移至冻存盒中；按照冻存程序进行降温，降温结束后将冻存盒转入待检罐中暂存，于检测合格后再将冻存盒中的冻存细胞转入液氮罐中；
6)种子细胞复苏：从种子细胞库液氮罐中取出种子细胞，迅速置于37℃恒温水浴锅内轻轻摇晃至无明显冰晶为止，按照0.89×104cell/cm2的接种密度将细胞悬液加入培养瓶内，根据培养瓶每瓶补分别加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内，得到第一代(P1)细胞。
2.按照实施例2记载的方法对羊膜MSC P1代细胞进行检测5个指标的抑制率或促进率，计算平均值，结果见表2。
表2羊膜MSC P1代细胞的5指标检测结果及均值结果
由表2可知，采用上述方法制备的羊膜来源的MSC的P1细胞的均值为86.7％，大于70％，说明羊膜来源的MSC的P1细胞具有较强的免疫调控能力。
实施例3
一种羊膜MSC P5代细胞的免疫调控能力的评价方法
1.羊膜MSC P5代细胞的制备方法
1)第一代(P1)传第二代(P2)细胞换液：将培养1天后的种子细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，加入新的完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
2)次代细胞传代培养：将培养3d后的细胞从取出，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取5mL TrypLE至培养瓶内，消化，吸取MSC-T4完全培养基，终止消化再吸取10mL 0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶转入离心管；离心后倒去上清并重悬细胞，将细胞悬液接种至培养瓶内，每瓶补加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
3)细胞原液制备：将培养3天后的第五代(P5)细胞取出，倒掉细胞培养室内培养基，并摇晃润洗培养瓶，然后加入5mL已预热的TrypLE至培养瓶内，消化之后添加MSC-T4完全培养基终止，并用吸取10mL 0.9％氯化钠注射液润洗细胞培养室，再将润洗后的细胞悬液转入离心管中；离心后倒去上清，剩下的细胞沉淀即为P5代羊膜间充质干细胞。
2.按照实施例2记载的方法对羊膜MSC P5代细胞进行检测5个指标的抑制率或促进率，计算平均值，结果见表3。
表3羊膜MSC P5代细胞的5指标检测结果及均值结果
由表3可知，采用上述方法制备的羊膜来源的MSC的P1细胞的均值为60.92％，在30％～70％之间，说明羊膜来源的MSC的P1细胞具有中等的免疫调控能力。
实施例4
一种脐带MSC P1代细胞的免疫调控能力的评价方法
1.脐带MSC P1代细胞的制备方法
1)脐带组织采集、运输和保存：脐带采集前进行供者筛选，整个采集过程严格执行无菌操作，样本采集后放入专用运输箱中，运送至实验室进行接收和质量检测；
2)原代细胞培养：将脐带组织转移至15cm培养皿中，用眼科剪将脐带组织两端依次剪断，挤出残留血液，并转移至新的15cm培养皿中。将脐带剪成2-3cm的小段，沿静脉将脐带撕开，剔除脐静脉、脐动脉，剥离华通胶，置于10cm培养皿中。将华通胶剪成0.2～0.4cm2的小组织块，转移至T75细胞培养瓶中，每瓶约40块小组织，标记“细胞编号、细胞代数、操作时日期、操作人首字母”。将培养瓶转移至CO2培养箱中静置1h，使组织粘附在培养瓶底。缓慢加入5ml MSC-T4完全培养基，使完全培养基刚好浸透组织，于CO2培养箱中继续培养；
3)原代细胞换液：将培养3天后的原代细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，培养瓶添加35mL MSC-T4完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
4)原代细胞传代：原代细胞培养5-7天后，取出培养瓶用0.9wt％氯化钠注射液润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE使液体铺满培养瓶细胞贴附面，放入消化，消化结束后向培养瓶内添加MSC-T4完全培养基，离心后倒去上清，吸取MSC-T4完全培养基至离心管中重悬细胞，将细胞悬液接种至T225cm2培养瓶内，加入35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
5)种子细胞库建立：从CO2培养箱中取出培养瓶，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取预热的TrypLE至培养瓶内，消化后吸取MSC-T4完全培养基，终止消化，将细胞悬液转入离心管中，并吸取0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶，转入上述离心管中，离心两次后；按照5×106个/mL/管的细胞冻存密度加入细胞悬液中吹打混匀后转移至冻存盒中；按照冻存程序进行降温，降温结束后将冻存盒转入待检罐中暂存，于检测合格后再将冻存盒中的冻存细胞转入液氮罐中；
6)种子细胞复苏：从种子细胞库液氮罐中取出种子细胞，迅速置于37℃恒温水浴锅内轻轻摇晃至无明显冰晶为止，按照0.89×104cell/cm2的接种密度将细胞悬液加入培养瓶内，根据培养瓶每瓶补分别加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内，得到P1代细胞。
2.按照实施例2记载的方法对脐带MSC P1细胞进行检测5个指标的抑制率或促进率，计算平均值，结果见表4。
表4脐带MSC P1代细胞的5指标检测结果及均值结果
| 脐带MSC P1代细胞 | 抑制率 |
| 淋巴细胞增殖抑制 | 76.42％ |
| Th1 | 50.12％ |
| Th17 | 74.28％ |
| Treg | 56.28％ |
| TNF-α | 45.83％ |
| 平均值 | 60.59％ |
由表4可知，采用上述方法制备的脐带来源的MSC的P1细胞的均值为60.59％，在30％～70％之间，说明羊膜来源的MSC的P1细胞具有中等的免疫调控能力。
实施例5
一种脐带MSC P5代细胞的免疫调控能力的评价方法
1.脐带MSC制剂细胞的制备方法
1)第一代(P1)传第二代(P2)细胞换液：将培养1天后的种子细胞从CO2培养箱内取出，倒掉培养瓶内培养基，加入新的完全培养基，将培养瓶转移至CO2培养箱内；
2)次代细胞传代培养：将培养3d后的细胞从取出，倒掉培养瓶内培养基，晃润洗培养瓶，然后吸取5mL TrypLE至培养瓶内，消化，吸取MSC-T4完全培养基，终止消化再吸取10mL 0.9wt％氯化钠注射液依次润洗培养瓶转入离心管；离心后倒去上清并重悬细胞，将细胞悬液接种至培养瓶内，每瓶补加35mL MSC-T4完全培养基，摇匀后将细胞转至CO2培养箱内；
3)细胞原液制备：将培养3天后的第五代(P5)细胞取出，倒掉细胞培养室内培养基，并摇晃润洗培养瓶，然后加入5mL已预热的TrypLE至培养瓶内，消化之后添加MSC-T4完全培养基终止，并用吸取10mL 0.9％氯化钠注射液润洗细胞培养室，再将润洗后的细胞悬液转入离心管中；离心后倒去上清，剩下的细胞沉淀即为P5代脐带间充质干细胞。
2.按照实施例2记载的方法对脐带MSC P5代细胞进行检测5个指标的抑制率或促进率，计算平均值，结果见表5。
表5脐带MSC P5代细胞的5指标检测结果及均值结果
| 脐带MSC制剂细胞 | 抑制率 |
| 淋巴细胞增殖抑制 | 33.65％ |
| Th1 | 58.39％ |
| Th17 | 62.96％ |
| Treg | 56.13％ |
| TNF-α | 27.98％ |
| 平均值 | 47.82％ |
由表5可知，采用上述方法制备的脐带来源的MSC的P1细胞的均值为47.82％，在30％～70％之间，说明羊膜来源的MSC的P1细胞具有中等的免疫调控能力。
对比例1
IDO的mRNA表达水平也是可作为一种指标用于评估间充质干细胞免疫调控能力，方法如下：
1检测方法：实时荧光定量PCR法
2主要仪器见表6。
表6仪器来源
| 仪器 | 品牌 | 型号 |
| 高速冷冻离心机 | 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 | Heraeus Fresco17 |
| 微量分光光度计 | 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 | Nanodrop one |
| 实时荧光定量PCR仪 | 豪夫迈·罗氏公司 | LightCycler 480II |
| 涡旋混合器 | 大龙兴创实验仪器(北京)股份公司 | MX-F |
3主要试剂见表7。
表7试剂来源说明
4引物信息
#1IDO
F:5’-CATCTGCAAATCGTGACTAA-3’(SEQ ID NO:1)；
R:5’-CAGTCGACACATTAACCTTCCTC-3’(SEQ ID NO:2)；
β-actin
F:5’-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’(SEQ ID NO:3)；
R:5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT-3’(SEQ ID NO:4)；
#2IDO：
F:5-AGACTGCTGGTGGAGGACATG-3’(SEQ ID NO:5)；
R:5’-AAAGGACAAACTCACGGACTG-3(SEQ ID NO:6)。
5.检测方法内容：
将人羊膜间充质干细胞用完全培养基调整活细胞浓度为1.2×106/ml，设置刺激组和对照组，每组平行接种3孔，每孔1.2×106个细胞。每孔再加入2ml MSC-T4完全培养基，置入37℃、5％CO2培养箱中进行培养。培养24小时后更换新鲜的完全培养基，同时在刺激组中加入终浓度为20ng/ml的IFN-γ，置入37℃、5％CO2培养箱中进行培养，培养48小时后弃掉上清，用D-PBS清洗两次后，以1ml/孔加入0.25％胰蛋白酶，置于CO2培养箱消化3min后，再加1ml完全培养基终止消化，将终止消化的细胞转移到15ml离心管内，以400g离心3min后去除上清，用1ml MSC-T4完全培养基重悬，按YR-QC-SOP-23《活细胞计数、活率与直径检测标准操作规程》进行细胞计数，备用。取1×106细胞样品于1.5ml RNase free EP管，1500rpm，离心5min，去上清。动物组织/细胞总RNA提取试剂盒准备：漂洗液RW瓶中加入48ml无水乙醇。按以下步骤提取RNA：①加入350μl裂解液RLA和10μl蛋白酶K，旋涡震荡，12,000rpm离心4min，取上清。②将得到的上清加入基因组DNA去除柱中，12,000rpm离心30sec，保留滤液。③向上述滤液中缓慢加入1倍上清体积的70％乙醇，混匀转入RNase-Free吸附柱CR4中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。④向RNase-Free吸附柱CR4中加入700μl去蛋白液RW3，12,000rpm离心30sec，弃废液。⑤向RNase-Free吸附柱CR4中加入500μl已加乙醇的漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心50sec，弃废液。⑥向RNase-Free吸附柱CR4中加入500μl已加乙醇的漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心50sec，弃废液。⑦12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将RNase-Free吸附柱CR4置于室温放置2min。⑧将RNase-Free吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加180μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。使用微量分光光度计测定待测样品RNA浓度，取1μg RNA进行后续检测。
4)RNA逆转录：①从逆转录试剂盒中取出gDNA remover、10x gDNA removerBuffer、RNase-free water，置于冰上融化，瞬时离心数秒后使用。取qPCR八连管，按下表8配制逆转录反应体系：
表8逆转录反应体系
| 组分 | RNA模板 | gDNA remover | 10×gDNA remover Buffer | RNase-free water |
| 用量 | 1μL | 1μL | 1μL | 补充至10μL |
②用枪头轻轻混匀，短暂离心，42℃孵育2min，随后60℃孵育5min。
③混合物迅速置于冰上冷却，短暂离心后加入以表9所示组分。
表9反转录反应体系
④用枪头轻轻混匀，短暂离心，按表10反应条件进行反转录反应。
表10反应条件
| 条件 | 时间 |
| 25℃ | 10min |
| 55℃ | 15min |
| 85℃ | 5min |
5)qPCR扩增：
①按所需数量取荧光八联管，将RNA反转录获得的cDNA按下表11配制qPCR反应体系，分别做IDO和ACTIN组处理。
表11 qPCR反应体系
②去除气泡后盖上管盖，瞬时离心，进行PCR扩增反应。
③PCR扩增(LightCycler480)(SYBR Green I通道)，反应程序见表12。
表12反应程序
根据ACTIN和IDO组CT值代入公式： 得出处理组IDO mRNA相对表达量。
样品1和2为不同批次的羊膜MSC P1代细胞
同时针对相同批次培养的MSC采用实施例2的方法进行5指标评估。
结果见表13。
表13两种方法检测相同样本的结果比较
| 羊膜MSC P1代细胞 | 样品1 | 样品2 |
| 淋巴细胞增殖抑制率 | 57.45％ | 63.36％ |
| Th1增殖抑制率 | 52.20％ | 54.91％ |
| Th17增殖抑制率 | 69.47％ | 70.25％ |
| Treg增殖促进率 | 81.10％ | 85.24％ |
| TNF-α | 25.34％ | 13.34％ |
| 平均值 | 57.11％ | 57.42％ |
| IDO的mRNA相对表达量 | 50 | 121 |
由表6数据可知，如果只看IDO检测结果，免疫调控能力是样品1弱于样品2，但是综合评价显示，这两个样品的免疫调控能力应该是同等水平。同样的，如果只看TNF-α抑制率的结果，样品1的调控能力大于2，但是五项指标均值显示，这两个样品的免疫调控能力是同等水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：分别测定间充质干细胞的Th17、Th1、淋巴细胞的增殖抑制情况和Treg增殖促进情况以及TNF-α分泌抑制情况，计算Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率、Treg增殖促进率、TNF-α分泌抑制率和淋巴细胞增殖抑制率，得到各指标的检测结果；
测定间充质干细胞的Th17、Th1、淋巴细胞的增殖抑制情况和Treg增殖促进情况以及TNF-α分泌抑制情况的方法包括如下步骤：细胞分为四组，所述四组分别为PBMC组、PBMC+PHA组、PBMC+MSC+PHA组和PBMC+MSC组；四组细胞经细胞培养后进行流式检测、酶化学发光法检测和ELISA检测；其中，PBMC的接种密度为（1.0～20）×104/孔；PHA的终浓度为1μg/ml～1mg/ml；所述间充质干细胞的接种密度为（1.0～10.0）×104/孔；
所述Th17增殖抑制率、Th1增殖抑制率或Treg增殖促进率的计算公式见公式I：
抑制率或促进率＝1-[(PBMC+MSC+PHA)-(PBMC+MSC)]/[(PBMC+
PHA)-(PBMC)]；
其中，(PBMC+MSC+PHA)表示PBMC+MSC+PHA组的细胞样品通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC+MSC)表示PBMC+MSC组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC+PHA)表示PBMC+PHA组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
(PBMC)表示PBMC组的细胞样本通过流式细胞仪检测得到的Th1或Th17或Treg细胞百分含量；
所述淋巴细胞增殖抑制率的计算公式见公式II：
淋巴细胞增殖抑制率＝1-[RLUs(PBMC+MSC+PHA)-RLUs(PBMC+
MSC)]/[RLUs(PBMC+PHA)-RLUs(PBMC)]；
其中，RLUs(PBMC+MSC+PHA)表示PBMC+MSC+PHA组的细胞样品通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表PBMC+MSC+PHA组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC+MSC)表示PBMC+MSC组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表PBMC+MSC组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC+MSC)表示PBMC+MSC组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表PBMC+MSC组细胞的相对数量；
RLUs(PBMC)表示PBMC组的细胞样本通过板式发光仪检测得到的荧光强度数值，代表PBMC组细胞的相对数量；
所述TNF-α分泌抑制率计算公式见公式III：
TNF-α分泌抑制率＝1-[OD(PBMC+MSC+PHA)-OD(PBMC+MSC)]/
[OD(PBMC+PHA)-OD(PBMC)]；
其中，OD(PBMC+MSC+PHA)表示PBMC+MSC+PHA组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的光吸收值，代表PBMC+MSC+PHA组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC+MSC)表示PBMC+MSC组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的光吸收值，代表PBMC+MSC组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC+PHA)表示PBMC+PHA组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的光吸收值，代表PBMC+PHA组样品中TNF-α的相对浓度；
OD(PBMC)表示PBMC组的细胞培养基上清液样品通过ELISA方法检测得到的光吸收值，代表PBMC组样品中TNF-α的相对浓度；
根据各指标的检测结果计算平均值；
根据平均值判断间充质干细胞的免疫调控能力：
当平均值大于70％时，说明间充质干细胞具有较强的免疫调控能力；
当平均值在30％～70％范围内时，说明间充质干细胞具有中等免疫调控能力；
当平均值小于30％时，说明间充质干细胞具有较弱的免疫调控能力；
所述间充质干细胞选自羊膜来源的间充质干细胞或脐带来源的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，其特征在于，在测定前，开展抑制间充质干细胞分裂的处理；
抑制间充质干细胞分裂的方法，将培养的间充质干细胞消化、洗涤，培养，用丝裂霉素C处理，去除丝裂霉素C，得到间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，其特征在于，所述丝裂霉素C的处理浓度为1μg/ml～1mg/ml；
所述丝裂霉素C的处理时间为0.5～2h。
4.根据权利要求1所述的综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括间充干细胞P1～P5代细胞。
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|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109609584A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-04-12 | 天津长和生物技术有限公司 | 间充质干细胞免疫调节能力的检测方法 |
| CN113005078A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-06-22 | 南京鼓楼医院 | 一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230059838A (ko) * | 2011-11-30 | 2023-05-03 | 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 | 중간엽 간질 세포 및 이에 관련된 용도 |
| TWI630271B (zh) * | 2014-12-05 | 2018-07-21 | 宣捷生物科技股份有限公司 | 區別間質幹細胞的方法 |
| CN111154828A (zh) * | 2020-02-17 | 2020-05-15 | 深圳市芙丽嘉生物科技有限公司 | 间充质干细胞免疫功能检测方法 |
| CN112748080A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-05-04 | 北京泽辉辰星生物科技有限公司 | 满足产品放行要求的免疫调节干细胞ido1活性检测方法 |
| CN114561344A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-05-31 | 中国人民解放军空军军医大学 | 可提高干细胞免疫调控能力的无血清培养基及制备方法和应用 |
| CN114395609A (zh) * | 2022-02-09 | 2022-04-26 | 湖南源品细胞生物科技有限公司 | 一种具有高免疫调节潜力的人间充质干细胞的筛选方法 |
| CN114990058A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-09-02 | 厦门大学 | 一种脐带间充质干细胞功能亚群及其应用 |
-
2023
- 2023-09-12 CN CN202311174352.4A patent/CN117210528B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109609584A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-04-12 | 天津长和生物技术有限公司 | 间充质干细胞免疫调节能力的检测方法 |
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