JP6890138B2 - Ｍｓｃ成長予測因子アッセイ - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年７月２１日に提出された米国仮特許出願第６２／３６５，３１３号の利益を主張する。米国仮特許出願第６２／３６５，３１３号の全開示（本文、図、写真）は、あらゆる目的のために、本明細書において参照によって援用される。
連邦政府の支援に関する記載
該当せず。
分野
本開示は、幹細胞の分野、幹細胞の増殖のための方法、及び骨髄から得られる幹細胞の様々なバッチの増殖能力を決定するための方法に関する。
背景
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、接着クローン線維芽細胞コロニーを形成し、２０回を超える集団倍加を受けることができた細胞として骨髄（ＢＭ）培養物において最初に検出され、よって、それらは、コロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−ｆ）と命名された。Friedenstein et al. (1970) Cell Tissue Kinet 3:393-403；Friedenstein et al. (1976) Exp. Hematol. 5:267-274。培養によって増やされたこれらの細胞が、骨、軟骨、細網組織、及び脂肪組織に分化する並びに造血微小環境を変える（Friedenstein et al. (1974) Exp. Hematol. 2:83-92；Owen & Friedenstein (1988) Ciba Found. Symp. 136:42-60)能力は、それらの有力なセクレトーム（たとえばPaul & Anisimov (2013) Biochimie 95:2246-2256）及び免疫調節特性（たとえばMenard & Tarte (2013) Stem Cell Res. Ther. 4:64-69）と共に、これらの細胞を細胞治療事業の最前線に立たせた。３５０を超える臨床試験が、現在、骨髄又は他の供給源から増やした間葉系間質細胞を様々な骨格障害、変性障害、及び免疫障害の有望な治療として使用している。
同種異系ＭＳＣの大量の細胞ロットを、多くの患者に「既製品として」使用するために製造することができる。しかしながら、大量のＢＭ ＭＳＣロットの製造は、様々なＢＭドナーに由来するＭＳＣの成長性におけるばらつきが激しいために、時に、困難になり得る。Zhukareva et al. (2010) Cytokine 50:317-321；Wegmeyer et al. (2013) Stem Cells Dev. 22:2606-2618；DiGirolamo et al. (1999) Br. J. Haematol. 107:275-281。そのため、ＭＳＣ培養結果を予測し、それによって、製造業者が製造プロセスの初期に失敗のロットを終了させるのを可能にする方法を有することは有利であろう。
ＢＭ ＭＳＣを特徴付けるための基本的なアッセイは、ＣＦＵｆアッセイであり、これは、ＢＭ調製物内のクローン化可能接着細胞（ＣＦＵｆ）の数を決定する。低ＢＭ細胞平板培養密度では、それは、平板培養された細胞及び結果として生じるコロニーの数の間の線形性を確実にするが、コロニー形成効率（ＣＦＥ；たとえば、１０５平板培養細胞当たりのコロニーの数）は、ドナー、ＢＭ試料を回収する方法、細胞単離ステップ（たとえば洗浄）、及び培養プロトコールに依存する。Kuznetsov et al. (1997) Br. J. Haematol. 97:561-570；Latsinik et al. (1990) Biull. Eksp. Biol. Med. 110:519-522；Mannello & Tonti (2007) Stem Cells 25:1603-1609。平板培養の７〜１０日後、培養物は、サイズが非常に異なるコロニーを含有する。ＣＦＵｆは、幹細胞、中間前駆細胞、及びコミット前駆細胞の混合物に相当し、細胞は、１、２、又は３系譜間葉系分化を受けるそれらのコロニーの潜在能力に基づいて典型的に区別される。一般に、培養中、幹細胞は、中間前駆細胞及びコミット前駆細胞の両方よりも豊富であるが、コミット前駆細胞よりもＢＭ外移植後の遅延期間（それらが分裂し始める前の）が長いと考えられている。Cordeiro-Spinetti et al. (2014) Front. Cell Dev. Biol. 2:7-15。分裂が始まる平板培養後の時間及び分裂の速度（ともに最終的な増殖力を決定する）の間の、幹細胞及びより分化した細胞の間のこれらの差異を考慮して、多くのアッセイが、ＭＳＣ成長性の予測因子として提唱されてきた。これらには、コロニーの３系譜分化能（すなわち軟骨細胞、脂肪細胞、及び骨細胞への）（Russell et al. (2011) Biotechnol. Bioeng. 108:2716-2726；Bertolo et al. (2016) J. Tissue Eng. Regen. Med. 10:149-161）；第１の継代後のコロニー形成効率（DiGirolamo et al. (1999)前掲）、初期の継代での増殖及び生存率の度合い（Deskins et al. (2013) Stem Cells Transl. Med. 2:151-158）；並びに多分化能（幹）細胞のマーカーとしての細胞運動性（Bertolo et al. (2015) Stem Cells Transl. Med. 4:84-90）を含む。しかしながら、これらのアプローチは、複数回の継代のためにＭＳＣを培養することを必要とし、骨が折れ、これにより、アプローチを、細胞製造のための迅速で単純な成長予測因子として実用的ではないものにしてしまう。
概要
間葉系間質細胞の産生プロセスの初期に（すなわちコロニー形成段階で）間葉系間質細胞の成長性（すなわち増殖力）を予測するための迅速で信頼できる方法が本明細書において開示される。方法は、軽く固定され且つ、透過処理された細胞における、同じ細胞コロニーにおける、分化及び細胞数のアッセイを利用する。ある実施形態では、アルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）のレベルは、分化の程度についての測定値を提供し、より低いα−ＳＭＡレベルは、それほど分化していない細胞型と相関する。ある実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性は、細胞数についての測定値を提供し、より高いＬＤＨ活性は、より高い細胞数と相関する。
ＭＳＣが多くの治療用細胞型の製造において使用されており、ＭＳＣの成長がロット毎に様々なので、本明細書において提供される方法は、細胞療法で使用するためのＭＳＣの治療用誘導体の製造に最も適したＭＳＣロットの好都合な選択を可能にする。さらなる利点は、細胞の初めの培養の直後に選択をし、それによって、ロットが製造目的に適しているかどうかを決定するのに必要とされる時間を低下させることができるということである。
したがって、骨髄懸濁液の複数のロットの中から、高い増殖力（又は高い成長性）を有する間葉系間質細胞（ＭＳＣ）のロットを選択するための方法であって、（ａ）低密度で、骨髄懸濁液のそれぞれのロット由来の細胞のサンプルを別々に平板培養すること；（ｂ）単一コロニーを形成させるために、別々に平板培養された細胞を培養すること；（ｃ）培養ＭＳＣのそれぞれのロットについて、（ｉ）コロニーにおける細胞の分化の程度及び（ｉｉ）それぞれの培養物中の大きなコロニーのパーセンテージを測定すること；並びに（ｄ）培養物が（ｉ）他のロットと比較して低い程度の分化及び（ｉｉ）他のロットと比較して高いパーセンテージの大きなコロニーを表すロットを選択することを含み、培養物が、試験されている他のロットと比較して、低い程度の分化及び高いパーセンテージの大きなコロニーを有する前記ロットは、高い増殖力又は高い成長性を有する、方法が、本明細書において提供される。
骨髄細胞のロットを試験するために、骨髄ロット由来の細胞は、プレート中のすべてのウェルがコロニーを含有しているとは限らないほどの十分に低い密度で培養され（たとえばマイクロタイタープレートにおいて）、コロニーを含有するどのウェルも単一のコロニーしか含有しない可能性を強める。次いで、ウェルの内容物は、細胞分化の程度及びコロニーサイズの両方についてアッセイされる。コロニーを含有していないウェルは、バックグラウンド決定のためにソートされる。コロニーサイズについての所定の閾値（本明細書において別記される）を使用して、培養物中の大きなコロニーの数が決定される。培養物中の細胞の分化の平均の程度についての値及び培養物中の大きなコロニーのパーセンテージは、次いで、最も高い増殖力又は成長性を有するロットを選択するために使用される。
ある実施形態では、測定される分化の程度は、筋線維芽細胞分化の程度である。
さらなる実施形態では、分化の程度は、アルファ−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａドメインのレベルを測定することによって決定され、より低いαＳＭＡ、ＴＧＦ−β、及び／又はＥＤ−Ａドメインのレベルは、より低い程度の分化と正相関する。
一実施形態では、分化の程度は、アルファ−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）のレベルを測定することによって決定される。αＳＭＡレベルは、コロニーを抗αＳＭＡ抗体と接触させ、抗体によりコロニーの免疫活性を測定することによって決定することができ、αＳＭＡレベルは、たとえば、反応を示す抗αＳＭＡ抗体の濃度（たとえばｎｇ／ｍｌでの）として表現することができる。ある実施形態では、コロニーにおけるαＳＭＡのレベルは、コロニーにおける細胞の数に対して標準化される。
ある実施形態では、コロニーの細胞の数は、コロニーにおけるＬＤＨ活性のレベルに相当する。０．４ｍＵ／ｍｌを超えるＬＤＨ活性のレベルを有するコロニーは、本開示の目的のために、大きなコロニーと考えられる。
ある実施形態では、培養物中の大きなコロニーのパーセンテージは、培養物中に存在するコロニーにおける乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量を測定することによって決定され、０．４ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌを超えるＬＤＨレベルを有するコロニーは、大きなコロニーと考えられる。さらなる実施形態では、培養物中の大きなコロニーのパーセンテージは、培養物中に存在するコロニーにおける細胞の数を数えることによって決定され、１，０００又はそれ以上の細胞を有するコロニーは、大きなコロニーと考えられる。
ある実施形態では、大きなコロニーだけが、分析に選択される。これらの実施形態では、大きな（すなわち＞０．４ｍＵ／ｍｌのＬＤＨ活性レベルを有するコロニー）が同定され、大きなコロニーにおけるαＳＭＡレベルが決定される。大きなコロニーにおける平均αＳＭＡレベル（たとえば、反応を示す抗体のｎｇ／ｍｌとして表現される）は、大きなコロニーにおける平均ＬＤＨ活性レベル（１ｍｌ当たりのｍＵ ＬＤＨ活性として表現される）に対して標準化され、この値（Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ）は、培養物中の大きなコロニーのパーセンテージの関数として表現される。低いＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値（たとえば＜１００ｎｇ／ｍｌの反応を示す抗体）及び高いパーセンテージの大きなコロニー（たとえば≧４０％）の組み合わせを有する培養物は、高い増殖力を有する細胞サンプルに由来するとして同定される。
ある実施形態では、コロニーの分化の程度及び大きなコロニーのパーセンテージの測定は、細胞の平板培養の１０日後に行われる。
前に述べられるように、ＭＳＣは、多くの異なる治療用細胞型の製造において使用される。したがって、ある実施形態では、高い増殖力又は高い成長性について選択された骨髄細胞（たとえばＭＳＣ）のロットは、ＭＳＣの治療用誘導体を製造するためのプロセスにおいて使用される。ある製造プロセスは、大量の細胞を必要とする。したがって、ある実施形態では、高い増殖力を有するＭＳＣを含有する、骨髄の選択されたロット由来の細胞は、大量培養で成長させる。
さらなる実施形態では、大量培養で成長している、選択されたロット由来の細胞は、外因性の核酸によりトランスフェクトされる。ある実施形態では、外因性の核酸は、Notch細胞内ドメインをコードする配列を含むポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドは、完全長Notchタンパク質をコードしない。
高い増殖力を有する間葉系間質細胞（ＭＳＣ）のロットを同定するための方法であって、（ａ）低密度でＭＳＣのサンプルを平板培養すること；（ｂ）単一のコロニーが形成されるようにＭＳＣを培養すること；（ｃ）それぞれのコロニーにおけるαＳＭＡレベルを測定すること；（ｄ）それぞれのコロニーにおけるＬＤＨ活性を測定すること；（ｅ）培養物中の大きなコロニーの数を決定すること；（ｆ）大きなコロニーについての平均αＳＭＡ／ＬＤＨ値を得るために、大きなコロニーにおいてＬＤＨ活性のレベルに対してαＳＭＡのレベルを標準化すること；並びに（ｇ）培養物中の大きなコロニーのパーセンテージの関数として、大きなコロニーについての平均αＳＭＡ／ＬＤＨ値を表現することを含み、低い平均αＳＭＡ／ＬＤＨ値（たとえば＜１００ｎｇ／ｍｌの反応を示す抗体）及び高いパーセンテージの大きなコロニー（たとえば≧４０％）によって特徴付けられる培養物を提供するＭＳＣのロットは、高い増殖力を有するロットである、方法も又、本明細書において提供される。
細胞数及び細胞マーカーのレベルについての、細胞の集団における同時のアッセイのための方法であって、（ａ）細胞を固定すること；（ｂ）固定細胞を透過処理すること；（ｃ）固定細胞中のＬＤＨ活性のレベルを検出すること；及び（ｄ）固定細胞中のマーカーのレベルを検出することを含む方法も又、本明細書において提供される。
ある実施形態では、細胞は、パラホルムアルデヒドにより固定される。さらなる実施形態では、パラホルムアルデヒドによる固定は、２０分間行われる。
ある実施形態では、細胞は、Triton-X100により透過処理される。さらなる実施形態では、透過処理は、２０分間行われる。
本明細書において開示されるアッセイのいくつかにおいて、ＬＤＨレベルは、細胞数についての代用マーカーとして使用される。いくつかの実施形態では、ＬＤＨ活性は、乳酸のピルビン酸への変換から結果として生じるＮＡＤＨの形成によって測定される。ある実施形態では、ＮＡＤＨの形成は、テトラゾリウム化合物のホルマザン化合物への変換につながる。テトラゾリウム化合物は、たとえば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＩＮＴ）とすることができる。
細胞マーカーは、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、タンパク質、リン脂質、糖タンパク質などを含むが、これらに限定されない任意の分子とすることができる。ある実施形態では、マーカーは、タンパク質であり、さらなる実施形態では、タンパク質は、アルファ−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）である。マーカーの検出は、当技術分野において知られている任意の方法、たとえば、核酸に対するハイブリダイゼーション；タンパク質、リン脂質、糖タンパク質についての免疫学的検出などによるものとすることができる。ある実施形態では、マーカーは、ポリペプチド又はタンパク質（たとえばαＳＭＡ）であり、マーカーのレベルは、免疫学的に検出される。本明細書において記載されるアッセイのいくつかの実施形態では、抗体は、免疫学的検出に使用される。さらなる実施形態では、抗体は、検出成分にコンジュゲートされる。ある実施形態では、検出成分は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＨＲＰコンジュゲート抗体が免疫学的検出に使用される実施形態では、ＨＲＰは、ＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出することができる。
図面の簡単な説明
図１Ａは、培養骨髄細胞の２つのロット（ＡＣ１２及びＡＣ１３）における最も高い（黒色のバー）及び最も低い（灰色のバー）パーセンテージのＥＤＵ陽性細胞を含有するＭＳＣコロニーにおけるα−ＳＭＡ免疫活性のレベル（平均蛍光強度として示す）を示す図である。エラーバーは、グループ当たりの３〜４コロニーの間の標準偏差を示す。 図１Ｂは、様々なレベルのα−ＳＭＡ発現を表すコロニーの２つの領域において、ＥＤＵについて強く染色された核のパーセンテージを示す図であり、一方の領域は、α−ＳＭＡが高く（αＳＭＡ＋エリア、黒色のバー）、一方の領域は、α−ＳＭＡが低い（αＳＭＡ−エリア、灰色のバー）。エラーバーは、２つの領域について得られた値の間の標準偏差を示す。 図２Ａは、２０分間（点描されたバー）又は４０分間（白色のバー）、ホルマリンにより固定し、次いで、２０分間、Triton X-100により透過処理した、３つの異なる密度（０．４、１．３、及び４．０×１０３細胞／ウェル）で平板培養した培養ＭＳＣにおけるＬＤＨ活性のレベルを示す図である。 図２Ｂは、２０分間、ホルマリンにより固定し、次いで、透過処理せずに（たたき塗りされたバー）又は２０分間（網かけのバー）若しくは４０分間（白色のバー）、Triton X-100により透過処理してアッセイした、３つの異なる密度（０．４、１．３、及び４．０×１０３細胞／ウェル）で平板培養した培養ＭＳＣにおけるＬＤＨ活性のレベルを示す図である。 図２Ｃは、２０分間の固定及び２０分間の透過処理後の異なる濃度の培養ＭＳＣについてのαＳＭＡ免疫活性（ＨＲＰ活性）のレベルを示す図である。線は、データを線形回帰フィットしたものに相当する。 図２Ｄは、２０分間の固定、２０分間の透過処理、及びＨＲＰコンジュゲート抗αＳＭＡとの１時間のインキュベーション後の異なる濃度の培養ＭＳＣについてのＬＤＨ活性のレベルを示す図である。線は、データを線形回帰フィットしたものに相当する。 図２Ｅは、様々な濃度の培養ＭＳＣについての、ＬＤＨ活性値（図２Ｄから得た）に対して標準化したαＳＭＡ発現値（図２Ｃから得た）を示す図である。線は、ウェル当たり２５０を超える細胞を有するウェルについてのデータを線形回帰フィットしたものに相当する。 図２Ｆは、１０日目のＣＦＵ−ｆコロニーにおける、細胞密度（ＬＤＨ活性に相当する）及び核の観察数（Hoechst染色によって検出される）の間の関係を示す図である。＜０．５ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌ（黒色の丸）及び＞０．５ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌ（白色の正方形）のＬＤＨ活性を有するコロニーについての値を強調する。 図３Ａは、２人の異なるドナーから得た細胞：ＡＣ１２（点線で囲われた丸）及びＤ１２７（閉じた丸）によって生成された個々のコロニーについて、コロニーのサイズ（ＬＤＨ活性に相当する）に対してプロットした標準化αＳＭＡ値（αＳＭＡ／ＬＤＨ）を示す図である。それぞれの丸は、個々のコロニーに相当する。点線は、ドナーＡＣ１２から得た細胞によって生成されたコロニーについて線形回帰フィットしたものに相当する。実線は、ドナーＤ１２７から得た細胞によって生成されたコロニーについて線形回帰フィットしたものに相当する。破線の垂直線は、０．４ｍＵ／ｍｌ ＬＤＨ活性の大きなコロニーについての任意選択閾値に相当する。 図３Ｂは、２人のドナー（ＡＣ１２及びＤ１２７）から得たＭＳＣコロニーについてのＬＤＨ値の箱ひげ図を示す図である。両方のロットについてのすべてのコロニー（Ａｌｌ）及び＞０．４ｍＵ／ｍｌを有するコロニー（Ｌａｒｇｅ）についての値を提供する。 図３Ｃは、２人のドナー（ＡＣ１２及びＤ１２７）から得たＭＳＣコロニーについてのαＳＭＡ／ＬＤＨ値の箱ひげ図を示す図である。両方のロットについてのすべてのコロニー（Ａｌｌ）及び＞０．４ｍＵ／ｍｌ ＬＤＨを有するコロニー（Ｌａｒｇｅ）についての値を提供する。 図４は、培養骨髄細胞の１０ロットについてのコロニー形成効率（ＣＦＵｆ頻度）を示す図である。ＣＦＥは、６．６×１０４細胞／ｍｌの濃度で平板培養した１０５白血球等価物当たりのコロニーの数として表現される。 図５は、培養骨髄細胞の１０ロットについての大きなコロニー（すなわち、ＬＤＨレベル≧０．４ｍＵ／ｍｌを有するコロニー）のパーセンテージを示す図である。 図６は、培養骨髄細胞の１０ロットについてのＬＤＨレベル（細胞サイズについての代用マーカー）を箱ひげ図で示す図である。 図７は、培養骨髄細胞の１０ロットについてのαＳＭＡ／ＬＤＨ値を箱ひげ図で示す図である。 図８Ａは、３つの継代（継代Ｍ１、継代Ｍ２、及び継代Ｍ３）で判断した、培養ＭＳＣの１０ロットについての成長速度（実施例６において記載されるように計算）を示す図である。 図８Ｂは、成長が遅い培養物（ＧＲ≦１、左のバー）及び成長が速い培養物（ＧＲ＞１、右のバー）についての第３の継代（Ｍ３）での成長速度の比較を示す図である。 図８Ｃは、平板培養の１０日後の、成長が遅い培養物（ＧＲ≦１、左のバー）及び成長が速い培養物（ＧＲ＞１、右のバー）についての標準化αＳＭＡ値（すなわちＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ）を示す図である。 図９Ａは、培養骨髄細胞の１０の異なるロットについての大きなコロニーのパーセンテージの関数としての大きなコロニーにおける標準化αＳＭＡ値（すなわちαＳＭＡ／ＬＤＨ）を示す図である。 図９Ｂは、３つの継代（Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３）で判断した、図９Ａに示す同じ１０の細胞培養物についての倍加時間を示す図である。
詳細な説明
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、細胞生物学、毒性学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、腫瘍学、組換えＤＮＡの分野、及び関係する分野における標準的な方法及び従来の技術を用いる。そのような技術は、文献において記載されており、それによって、当業者らに入手可能である。たとえばAlberts, B. et al., “Molecular Biology of the Cell,” 5th edition, Garland Science, New York, NY, 2008；Voet, D. et al. “Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level,” 3rd edition, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2008；Sambrook, J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001；Ausubel, F. et al., “Current Protocols in Molecular Biology,” John Wiley & Sons, New York, 1987及び定期的な最新情報；Freshney, R.I., “Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,” 4th edition, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000；及びthe series “Methods in Enzymology,” Academic Press, San Diego, CAを参照。
本開示の目的のために、用語：「成長性」及び「増殖力」は、細胞（たとえばＭＳＣ）の特定のロットに起源を持つ培養物における細胞成長の予測速度を指すために区別なく使用される。高い成長性又は高い増殖力を有するロットでは、細胞は、短い倍加時間で、速やかに成長する。低い成長性又は低い増殖力を有するロットでは、細胞は、より長い倍加時間で、よりゆっくりと成長する。
したがって、高い増殖力を有する細胞は、たとえば、４日間、３．５日間、３日間、２．５日間、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、６時間、又はその間の任意の値の倍加時間を有することができる。
用語「標準化αＳＭＡ」は、コロニーのＬＤＨレベル（細胞数についての代用物）で割った細胞コロニーにおけるαＳＭＡの量を指し、αＳＭＡの量は、イムノアッセイにおいてコロニーに結合する抗αＳＭＡ抗体のｎｇ／ｍｌとして表現され、ＬＤＨレベルは、LDH Cytotoxicity Detectionアッセイ（Clontech Laboratories、Mountain View、CA）において定義されるようにｍＵｎｉｔｓ／ｍｌとして表現される。標準化αＳＭＡ値は、所定のコロニーについての細胞当たりの平均αＳＭＡレベルの代用物である。
用語「Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ」は、ＭＳＣの培養物において大きなコロニー（ＬＤＨ＞０．４ｍＵ／ｍｌ）について得られた標準化αＳＭＡ値の平均（すなわち平均αＳＭＡ／ＬＤＨ）を指す。
本開示の目的のために、「大きなコロニー」は、コロニーにおける細胞のすべてを細胞内ＬＤＨ活性についてアッセイした場合に、コロニーにおける細胞の細胞内ＬＤＨ活性値の合計が、LDH Cytotoxicity Detectionキット（Clontech Laboratories、Mountain View、CA）によって定義されるように１ミリリッター当たり０．４ｍｉｌｌｉＵｎｉｔｓを超える細胞コロニーである。
培養物中の大きなコロニーのパーセンテージは、０．４ｍｉｌｌｉＵｎｉｔｓ／ｍｌを超えるＬＤＨ活性値を有するコロニーのパーセンテージである。
「間葉系間質細胞」（「ＭＳＣ」）は、骨髄から得られた接着非造血多能性細胞を指す。これらの細胞は、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、骨髄接着間質細胞、骨髄接着幹細胞、及び骨髄間質細胞として様々に知られている。ＭＳＣは又、たとえば臍帯血、脂肪組織、歯髄、ホウォートンゼリー、及び様々なタイプの結合組織から得ることもできる。
ＭＳＣの例示的な開示は、米国特許出願公開第２００３／０００３０９０号；Prockop (1997) Science 276:71-74、及びJiang (2002) Nature 418:41-49において提供される。ＭＳＣの単離及び精製のための方法は、たとえば米国特許第５，４８６，３５９号；Pittenger et al. (1999) Science 284:143-147、及びDezawa et al. (2001) Eur. J. Neurosci. 14:1771-1776において見つけることができる。ヒトＭＳＣは、市販で入手可能である（たとえばBioWhittaker、Walkersville、MD）又はたとえば骨髄吸引、その後に続く接着骨髄細胞の選択によってドナーから得ることができる。たとえば国際公開第２００５／１００５５２号を参照。
ＭＳＣは又、臍帯血から単離することもできる。たとえばCampagnoli et al. (2001) Blood 98:2396-2402；Erices et al. (2000) Br. J. Haematol. 109:235-242、及びHou et al. (2003) Int. J. Hematol. 78:256-261を参照。ＭＳＣのさらなる供給源は、たとえば経血及び胎盤を含む。
細胞培養及びトランスフェクション
細胞培養のための標準的な方法は、当技術分野において知られている。たとえばR. I. Freshney “Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,” Fifth Edition, Wiley, New York, 2005を参照。
細胞の中への外因性のＤＮＡの導入のための方法（すなわちトランスフェクション）及び外因性のＤＮＡを含む細胞の選択のための方法も又、当技術分野においてよく知られている。たとえばSambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001；Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology,”John Wiley & Sons, New York, 1987、及び定期的な最新情報を参照。
本開示のある実施形態では、本明細書において開示される方法によって同定される高い増殖力を有する細胞のロットは、たとえばＭＳＣの治療用誘導体の製造において、大量培養で培養される。ある実施形態では、本明細書において開示される高い成長性について選択された大量培養中の細胞は、外因性のＤＮＡによりトランスフェクトされる。ある実施態様では、培養において成長している高い増殖力を有する細胞は、たとえば米国特許第７，６８２，８２５号（その中で「神経前駆体細胞」を指す細胞の調製のための）；米国特許第８，９４５，９１９号（その中で「神経再生細胞」を指す細胞の調製のための）；米国特許出願公開第２０１０／０３１０５２９号（その中で「分化制限細胞」を指す細胞の調製のための）；及び国際公開第２０１６／１６１２９０号（その中で「ＮＩＣＤ一時的トランスフェクトＭＳＣの子孫」又は「ＤＮＴＴ−ＭＳＣ」を指す細胞の調製のための）において開示されるように、Notch細胞内ドメインをコードする（完全長Notchタンパク質をコードしない）配列によりトランスフェクトされる。
分化マーカー
本発明者らは、より低い程度の分化を有するＭＳＣ培養物が、より高い増殖力を有し、そのため、ＭＳＣの培養物中の細胞の分化の程度を、培養物が由来する細胞ロットの増殖力を予測するために使用することができることを見出した。したがって、本明細書において開示される方法の一部として、ＭＳＣの培養物中の細胞の分化の程度が、決定される。ＭＳＣ分化の任意のマーカーを、当技術分野において知られているように、使用することができる。ある実施形態では、筋線維芽細胞分化のマーカーを、使用することができる。たとえば、アルファ−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａドメインを、分化マーカーとして使用することができ、より低いαＳＭＡ、ＴＧＦ−β、及び／又はＥＤ−Ａドメインのレベルは、より低い程度の分化と正相関する。
ある実施形態では、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）は、ＭＳＣ分化マーカーとして使用される。αＳＭＡは、収縮性アクチンアイソフォームであり、組織傷害及び修復に応じて多くの間葉細胞型から分化する血管平滑筋細胞及び筋線維芽細胞の特徴である。Hinz (2007) J. Investig. Dermatol. 127:526-537。創傷において、筋線維芽細胞は、細胞外マトリックスを産生し、このマトリックスを再編成し、収縮し、硬化し、これは、次に、さらなるαＳＭＡ発現を誘発する。したがって、αＳＭＡ発現は、筋線維芽細胞が成長している土台の硬さの増加によって刺激される。培養ＭＳＣにおいて、αＳＭＡは、培養の間にこれらの細胞において典型的に生じるストレスファイバーと共存する。Charbord et al. (1990) Exp. Hematol. 18:276-282。
細胞サイズ（小さな及び大きな細胞集団）によって継代ＭＳＣをソートすることにより、同時に、αＳＭＡの発現（それに応じて低い及び高い）によって並びにクローン能及び分化能（それに応じて高い及び低い）によって、それらをソートする。さらに、αＳＭＡ発現のノックダウン又は柔軟な表面上への細胞の平板培養は、クローン形成能及び分化能を回復させる。Talele et al. (2015) Stem Cell Reports 4:1016-1030。したがって、ある程度まで、初期ＭＳＣ培養物中のαＳＭＡ発現は、硬いプラスチック表面上でのこれらの機械感受性細胞の培養の結果と見なすことができる。Hinz (2010) J. Biomech. 43:146-55。
当技術分野において知られている任意の方法は、培養中のＭＳＣのコロニーにおけるαＳＭＡの（又は任意の他のＭＳＣ分化マーカーの）レベルを測定するために使用することができる。たとえば、αＳＭＡ ｍＲＮＡのレベルは、ハイブリダイゼーション又はＰＣＲベースの方法によって決定することができる。αＳＭＡポリペプチドのレベルは、免疫学的に決定することができる。免疫学的タンパク質検出方法は、当技術分野においてよく知られている。ある実施形態では、αＳＭＡタンパク質のレベルは、検出成分にコンジュゲートされた抗αＳＭＡ抗体を使用して、単離されたコロニーにおいてその場で検出される。検出成分は、当技術分野において知られているように、放射性、比色定量、蛍光などであってもよい。その代わりに、たとえばビオチンなどのようなリガンドを、検出成分として使用することができる。
ある実施形態では、αＳＭＡレベルは、抗αＳＭＡ抗体を使用して、ＭＳＣコロニーにおいてその場で検出される。ある実施形態では、αＳＭＡレベルは、検出成分にコンジュゲートされた抗αＳＭＡ抗体を使用して、ＭＳＣコロニーにおいてその場で検出される。免疫組織化学的手順で使用するための検出成分は、当技術分野において知られている。ある実施形態では、αＳＭＡレベルは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた抗αＳＭＡ抗体を使用して、ＭＳＣコロニーにおいてその場で検出される。ＨＲＰによって有色産物に変換される様々なＨＲＰ基質は、当技術分野において知られている。ある実施形態では、αＳＭＡ免疫活性は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出され、これは、ＨＲＰによって青色の産物に変換される。
αＳＭＡ又は任意の他の検出マーカーのレベルは、たとえば、コロニーにおける細胞と反応する抗体の濃度などのような任意の好都合な単位で表現することができる。ある実施形態では、αＳＭＡレベルは、反応を示す抗体のｎｇ／ｍｌとして表現される。
任意の他の分化マーカーは、たとえば、当技術分野において知られている任意の検出成分に任意選択でコンジュゲートされた、その分化マーカーに特異的な抗体を使用して、検出し、定量化することができることは明らかである。
細胞数及び大きなコロニーのパーセンテージの決定
本明細書において開示される方法において、ＭＳＣの培養物中の大きなコロニーの数は、培養物が得られた細胞ロットの成長性（すなわち増殖力）を決定するために使用される因子のうちの１つである。したがって、本開示は、細胞数を決定し、細胞ロットの成長性を予測するプロセスにおいて前記決定を使用するための方法を提供する。
細胞数を決定するための当技術分野において知られている任意の方法を、本明細書において記載される方法において使用することができる。例示的な方法は、たとえば、位相差顕微鏡又は核に特異的な色素（たとえばHoechst 33342）を使用することによって、コロニーにおける細胞の数を数えること及びコロニーにおける又は培養物中の核の数を数えることを含む。
ある実施形態では、細胞内乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性は、細胞数の指標として使用される。細胞内ＬＤＨを決定する方法は、当技術分野において知られており、たとえば、LDH Cytotoxicity Detectionキット（Clontech Laboratories、Mountain View、CA）を使用することができる。発明者らは、０．４ｍＵ／ｍｌの値の細胞内ＬＤＨ活性を有するコロニーがおよそ１，０００個の細胞を含有することを決定し、本明細書において記載される方法において使用するための「大きなコロニー」として細胞コロニーを特徴付けるための閾値として、これらの値（０．４ｍＵ／ｍｌ細胞内ＬＤＨ活性又は１×１０３細胞）を選択した。特に、培養物中の大きなコロニーのパーセンテージが、決定され、大きなコロニーにおける標準化αＳＭＡレベルが、ＭＳＣのロットの成長性を予測するための方法の一部として計算される。
αＳＭＡレベルの標準化
本明細書において記載される方法の予測値を向上させるために、コロニーにおけるαＳＭＡレベルは、細胞当たりのαＳＭＡレベルについての代用値を提供するために、そのコロニーにおける細胞内ＬＤＨ活性の値に対して標準化した。細胞当たりのこの標準化αＳＭＡ値を得るための一実施形態では、αＳＭＡレベルは、コロニーに結合した抗αＳＭＡ抗体のｎｇ／ｍｌとして表現され、ＬＤＨレベルは、ｍＵ／ｍｌ ＬＤＨ活性として表現される（Ｕｎｉｔｓは、LDH Cytotoxicity Detectionキット（Clontech Laboratories、Mountain View、CA）によって定義される）。
ある実施形態では、この標準化αＳＭＡ／ＬＤＨ値は、Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値を提供するために、培養物中の大きなコロニー（本明細書において記載されるように定義される）についてのみ得られる。このＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値は、次いで、培養物中の大きなコロニーのパーセンテージの関数として表現される。大きなコロニーの高いパーセンテージ及び低Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値を有する培養物は、培養物が由来した細胞ロットが高い増殖力又は成長性を有することを示す。たとえば、高い増殖力を有する細胞ロットは、５０％又はそれ以上の大きなコロニーを有する培養物を生成するであろう。ある実施形態では、高い増殖力を有する細胞ロットは、５５％若しくはそれ以上、６０％若しくはそれ以上、６５％若しくはそれ以上、７０％若しくはそれ以上、７５％若しくはそれ以上、８０％若しくはそれ以上、８５％若しくはそれ以上、９０％若しくはそれ以上、９５％若しくはそれ以上、又は９８％若しくはそれ以上の大きなコロニーを有する培養物を生成するであろう。
ある実施形態では、Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値は、大きなコロニーにおける反応を示す抗αＳＭＡ抗体ｎｇ／ｍｌを同じ大きなコロニーにおける細胞内ＬＤＨ活性ｍＵ／ｍｌによって割り、培養物中のすべての大きなコロニーについてのその商の平均を得ることによって得られる任意の数量である。これらの実施形態では、高い増殖力（又は高い成長性）を有する細胞ロットは、１２５又はそれ以下のＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値を有する。さらなる実施形態では、高い増殖力（又は高い成長性）を有する細胞ロットは、１２０若しくはそれ以下、１１０若しくはそれ以下、１００若しくはそれ以下、９０若しくはそれ以下、８０若しくはそれ以下、７０若しくはそれ以下、６０若しくはそれ以下、又は５０若しくはそれ以下のＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値を有する。
ある実施形態では、２つのパラメーター（Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値又は大きなコロニーのパーセンテージ）のうちの１つだけが、細胞ロットの増殖力を予測するために使用される。しかしながら、最適の予測値は、両方のパラメーターが使用される場合に得られる。
同じコロニーにおける細胞数及び分化マーカーのアッセイ（「ＡＬＣ」アッセイ）
高い増殖力（又は高い成長性）を有する細胞ロットを同定するために、本開示は、細胞培養物中の細胞数及びマーカーのレベルの両方をアッセイするための方法を提供する。特に、分散した単一コロニーが平板培養細胞から成長するように、培養物は、低密度で平板培養される（たとえば培養皿において又はマイクロタイタープレートのウェルにおいて）。任意の個々のコロニーについて、本明細書において開示されるアッセイは、コロニーにおける細胞の数及びコロニーにおけるマーカー分子のレベルの両方を測定することができる。
マーカー分子は、細胞中に存在する又は特定の細胞型の特徴である任意の分子とすることができ、たとえば、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又はポリペプチド（すなわちタンパク質）とすることができる。ある実施形態では、マーカーは、細胞の分化の程度を示す（すなわち分化マーカー）。マーカーは、当技術分野において知られている任意の方法、たとえば、核酸の検出のためのハイブリダイゼーション又はＰＣＲベースの方法及びタンパク質の検出のための免疫学的方法によって検出することができる。本明細書において開示される方法のある実施形態では、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）は、ＭＳＣの分化の程度についてのマーカーとして使用され、より高いαＳＭＡレベルは、より高度に分化した細胞を示す。
細胞数を決定する方法は、当技術分野において知られており、たとえば、単純な細胞のカウント、核のカウント、フローサイトメトリー、ＤＮＡ濃度の測定、及び代謝活性の測定を含む。ある実施形態では、コロニーにおける乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性のレベルは、コロニーにおける細胞の数の代用物として使用される。ＬＤＨ活性の測定のための方法は、当技術分野において知られている。ある実施形態では、ＬＤＨ活性は、乳酸のピルビン酸への変換から結果として生じるＮＡＤＨの形成によって測定され、ＮＡＤＨの形成は、第１の無色の化合物の、測光法で又は蛍光定量的に検出することができる化合物への変換につながる。ある実施形態では、第１の化合物は、テトラゾリウム化合物である。ある実施形態では、テトラゾリウム化合物は、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＩＮＴ）である。
細胞数及びマーカー分子のレベルの両方について、同じコロニーの細胞において決定するための方法が、本明細書において提供される。方法は、分散した単一コロニーが生成されるように、低密度で細胞を培養すること、培養細胞を固定すること、固定細胞を透過処理すること、細胞数を測定すること（又はコロニーにおける細胞の細胞内ＬＤＨ活性などのような、細胞数についての代用物を測定すること）、及びマーカー分子のレベルを検出することを含む。
同じコロニーにおける細胞数及びマーカー分子のレベルの両方の決定を可能にするために、固定及び透過処理についてのパラメーターが、本明細書において提供される。ある実施形態では、細胞は、パラホルムアルデヒドにより固定される。固定のために使用されるパラホルムアルデヒドの濃度は、たとえば、細胞型及び培養条件に依存して、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、又はその間の任意の値であり得る。ある実施形態では、細胞は、Triton-X100により透過処理される。透過処理のために使用されるTriton-X100の濃度は、たとえば、細胞型及び培養条件に依存して、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、又はその間の任意の値であり得る。
ある実施形態では、細胞は、室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドにより固定され、続いて、室温で２０分間、０．２％ Triton-X100により透過処理される。固定液及び／又は透過処理剤の濃度並びに固定及び透過処理の時間は、細胞型及び他の適切な考慮に依存して、必要に応じて変動させることができる。たとえば、細胞は、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、又は６０分間、固定することができ、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、又は６０分間、透過処理することができる。パラホルムアルデヒド以外の固定液（当技術分野において知られている）及びTriton以外の透過処理剤（当技術分野において知られている）は、本明細書において開示される方法において使用することができる。他の固定液及び透過処理剤についての適切な固定及び透過処理の時間を定義することは、当技術分野の技術の範囲内にある。
細胞のコロニーにおける細胞数及び分化マーカーのレベルの測定は、コロニーを生じた細胞の平板培養後にいつでも行うことができる。たとえば、測定は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、５日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、２０日、２５日、３０日、又はその間の任意の期間で行うことができる。ある実施形態では、細胞のコロニーにおける細胞数及び分化マーカーのレベルの測定は、細胞が平板培養された１０日後に行われる。
製造プロセス
本明細書において開示される方法の目的のうちの１つは、骨髄細胞を培養するプロセスの初期に、ＭＳＣの治療用誘導体の製造のために、高い成長性及び／又は高い増殖力を有する骨髄細胞のロットの選択を可能にすることである。１つのそのような治療用誘導体は、Notch細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする核酸により培養ＭＳＣをトランスフェクトすることによって製造される。たとえば米国特許第７，６８２，８２５号（その中で「神経前駆体細胞」を指す細胞の調製のための）；米国特許第８，９４５，９１９号（その中で「神経再生細胞」を指す細胞の調製のための）；米国特許出願公開第２０１０／０３１０５２９号（その中で「分化制限細胞」を指す細胞の調製のための）；及び国際公開第２０１６／１６１２９０号（その中で「ＮＩＣＤ一時的トランスフェクトＭＳＣの子孫」又は「ＤＮＴＴ−ＭＳＣ」を指す細胞の調製のための）を参照されたい。これらの開示は、細胞療法で使用するためのＮＩＣＤトランスフェクトＭＳＣを製造するためのプロセスを説明する目的のために本明細書において参照によって援用される。
したがって、ある実施形態では、高い増殖力を有するＭＳＣを含有する選択された骨髄のロット由来の細胞は、大量培養物中で成長させ、外因性の核酸によりトランスフェクトされる。ある実施形態では、外因性の核酸は、Notch細胞内ドメインをコードする配列を含むポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドは、完全長Notchタンパク質をコードしない。
実施例
実施例１：骨髄間質細胞の調製及び培養
健康なヒトドナー由来の骨髄穿刺液を、Lonza（Allendale、NJ）又はAllCells（Alameda、CA）から購入し、冷たい容器で夜のうちに配達してもらった。穿刺液サンプル（１〜３ｍｌ）を、１０％ウシ胎児血清（HyClone、Logan、UT、ＭＳＣ成長のために選択したロット）、GlutaMAX（Invitrogen、Carlsbad、CA）、及びペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＭＳＣ成長培地（アルファ最小必須培地（αMEM、Mediatech、Tewksbury、MA））において３倍に希釈し、８分間１２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を、注意深く除去し、ペレットを、遠心分離前の容量と等しい容量で再懸濁した。一定分量を取り出し、白血球（ＷＢＣ）カウントのためにErythrocyte Lysis Reagent（Sigma、St.Louis、MO）中に希釈した。これらの洗浄した骨髄細胞を、マイクロタイターアッセイにおいて使用するために（実施例４及び５）並びに大量培養物を生成するために培養した（実施例６）。
ＣＦＵｆコロニーの分析のために、洗浄した骨髄細胞（前の段落に記載されるように得られた）を、６．６×１０４ＷＢＣ／ｍｌの濃度で再懸濁し、透明な底を有する９６ウェル黒色マイクロプレート（Costar（登録商標））の中に平板培養し（ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液）、２列を、標準物質及びコントロール用に空にしておいた。この細胞濃度での平板培養は、ウェルの３０％未満においてコロニーの成長をもたらし、したがって、ウェル当たり１つを超えるコロニーを有する可能性が低いことを確実にした。平板培養後１０日目に、ＡＬＣアッセイを、９６ウェルマイクロプレート中で成長させた細胞に対して行った。
大量培養物を生成するために、上に記載されるように得、且つ処理した骨髄細胞を、再懸濁し、Ｔ７５フラスコの中におよそ２〜４×１０５ＷＢＣｓ／ｃｍ２で平板培養した。平板培養後第３日目に、培地を交換し、大部分の非接着細胞を除去した。その後、培地を、２〜３日毎に交換し、細胞を、継代前の１０〜１４日間、培養した。継代のために、細胞を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで剥がし、トリパンブルーを使用して数え、約０．５〜１×１０４細胞／ｃｍ２で再度平板培養した。その後の継代（３回まで）は、培養物が７０〜８０％コンフルエンスに達したら実行し、７０〜８０％コンフルエンスは、再度平板培養した後の４〜７日以内に起こった。
実施例２：ＭＳＣ培養物におけるアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現及び細胞増殖の間の相関性
αＳＭＡ発現及びコロニー成長の間の関係を解明し、それによって、α−ＳＭＡレベルの測定を、増殖力を予測するための方法の一部として使用することができるかどうかを決定するために、細胞増殖速度及びα−ＳＭＡレベルを、平板培養の１０日後に骨髄細胞のコロニーにおいて測定した。
細胞増殖アッセイは、メーカーのプロトコールに従って、Click-iT（登録商標）Plus EDU Alexa Fluor 594 Imagingキット（Life Technologies、Carlsbad、CA）を使用し、コロニーに対して行った。細胞は、５時間、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥＤＵ）により標識した。ＥＤＵ検出後、コロニーを、０．３％Normal Donkey血清によりブロックし、１時間、ＦＩＴＣコンジュゲート抗αＳＭＡモノクローナル抗体（Sigma、St.Louis、MO）によりプローブし、その後、洗浄した。核は、Hoechst 33342を使用して対比染色した。
ＥＤＵ陽性の核のパーセンテージを定量化するために、コロニーの画像を、１．２５×倍率でCytation 5プレート読み取り装置を使用して取得し、Gen5ソフトウェア（BioTek Instruments、Winooski、VT）を使用して分析した。次いで、コロニーについてのデータをExcelでソートした。最も高い及び最も低いＥＤＵの組み込みを表すコロニー（３〜４コロニー／グループ）を、ImageJを使用して視覚化し、且つ対応するバックグラウンドを引き算した平均グレー値（mean gray value）としてαＳＭＡ平均蛍光強度を定量化するために、４×倍率下で選択し、取得した。単一コロニーにおけるαＳＭＡ及びＥＤＵの分布の分析のために、コロニーの画像を、デジタル技術で拡大し、αＳＭＡ陽性のエリアを選択し、次いで、等しいサイズのエリアを、コロニーのαＳＭＡ陰性の領域において選択した。全部の核及びＥＤＵ陽性の核を、これらのエリアにおいて手作業で数えた。
コロニーの間で様々なαＳＭＡ発現によって特徴付けられた細胞ロットを評価した。顕微鏡観察は、非常に増殖性のコロニー（すなわち、高いパーセンテージのＥＤＵ陽性の核を有するコロニー）が、より低いパーセンテージのＥＤＵ陽性の核を有するコロニーよりも低いレベルのαＳＭＡ発現を表したことを示した。２ロットの細胞（ＡＣ１２及びＡＣ１３）において、最も高いパーセンテージのＥＤＵ陽性の核（ＡＣ１２については＞３９％及びＡＣ１３については＞２８％）並びに最も低いパーセンテージのＥＤＵ陽性の核（ＡＣ１２については＜１８％及びＡＣ１３については＜１５％）を有するコロニーは、αＳＭＡについて、それに応じて低い及び高い平均蛍光強度を表した（図１Ａ）。さらに、様々なレベルのαＳＭＡ発現を有したコロニー内で、αＳＭＡ発現のレベル及び明るいＥＤＵ染色を有する核のパーセントの間に負の相関があった（図１Ｂ）。αＳＭＡ陰性ではなく、αＳＭＡ陽性のエリアは又、明るく染色された核に加えて、ＥＤＵのレベルが非常に低い核を含有した。まとめると、これらの観察は、ＥＤＵの組み込みのプロセスが、αＳＭＡ陽性の細胞においてより遅いことを示した。したがって、αＳＭＡ発現は、コロニーの全体的な増殖速度及びコロニー内の増殖ステータスの両方と負に相関する。
実施例３：ＬＤＨ活性の検出に対する固定及び透過処理の影響
ＭＳＣコロニーにおけるαＳＭＡ発現がロット成長性に関係するかどうかを決定するために、コロニーにおけるαＳＭＡを測定し、コロニーにおける細胞の数に対してその発現を標準化するロバスト性のある（robust）アッセイを、継代ＭＳＣを使用して開発した。細胞内ＬＤＨ活性についての比色定量アッセイを、細胞数についての代用物として選んだ。先の観察は、ホルマリンにより軽く固定された細胞が、実質的な割合の細胞内ＬＤＨ活性を保持することを示唆した。Baba et al. (1971) J. Cell. Biol. 51:621-635も又参照されたい。したがって、ＬＤＨ検出に対する固定及び透過処理の条件の影響を、継代２及び４の間で継代ＭＳＣにおいて検査した。これらの研究のために、ＭＳＣを数え、４、１．３、及び０．４×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートの中に平板培養した。翌日、培養物を２０又は４０分間固定し、次いで、２０分間、透過処理し、洗浄した。実験の別のセットにおいて、細胞は、２０分間固定し、２０、４０、又は６０分間、透過処理し、次いで、洗浄した。残存ＬＤＨ活性は、下記に記載されるように決定した。細胞数は、培養物のトリパンブルー染色を使用して決定した。
これらの実験の結果は、標準的な２０分間の固定で、ＬＤＨ活性が細胞数に比例したことを示し、さらに、４０分間まで固定時間を増加させても、ＬＤＨ活性に対する有意な有害な影響はなかった（図２Ａ）。２０分間ホルマリン中で固定した細胞を、様々な時間、Triton-X100によりさらに透過処理した場合、透過処理後に検出されたＬＤＨ活性は、透過処理期間の長さに依存して、わずかに低下し、０〜４０分間の透過処理の２０分毎に、およそ１０〜１５％低下した（図２Ｂ）。
実施例４：同じコロニーにおけるＬＤＨ活性及びαＳＭＡレベルの検出並びに細胞数との相関性
固定後にＬＤＨ活性の保持が観察されたことに基づいて（実施例３）、選択した固定及び透過処理の時間を使用して、αＳＭＡの細胞内免疫細胞化学的検出のために細胞を処理し、その後、同じ細胞においてＬＤＨ活性を検出することが可能であると考えられた。この考えを確認するために、継代２〜４のＭＳＣを、様々な細胞密度で９６ウェルマイクロタイタープレート中で平板培養した。１日後、細胞を２０分間固定し、２０分間、透過処理し、１時間、ＨＲＰコンジュゲート抗αＳＭＡ抗体と反応させた。抗体が結合した後、細胞内ＬＤＨ活性を検出し、その後、ＨＲＰ活性の比色定量検出を続けた。これらの条件下で、ＬＤＨ及びαＳＭＡの値は、平板培養細胞数に比例した（図２Ｃ及び２Ｄ）。次いで、αＳＭＡ発現値は、「αＳＭＡ／細胞」値を得るために対応するＬＤＨ活性値に対して標準化した。細胞濃度＞２５０細胞／ウェルについては、標準化は、予想通り、ある一定の値を提供し、２５０細胞／ウェルの濃度以下では、標準化は、様々な結果をもたらした（図２Ｅ）。
上記に記載される、継代ＭＳＣを使用する初めのアッセイ開発の後に、アッセイを、ＣＦＵｆコロニーにおいてさらに特徴付けた。骨髄細胞の平板培養後１０日目に、コロニーにおけるＬＤＨ活性を測定し、コロニー当たりの核の数は、４倍の倍率のCytation 5マルチモードプレート読み取り装置（BioTek、Winooski、VT）及びGen5ソフトウェア（BioTek）を使用して、Hoechst 33342（Molecular Probes、Eugene、OR）により染色したコロニーの画像解析によって定量化した。
２５００までの核を含有するコロニーについては、ＬＤＨ値及び核の数の間の線形の関係が観察された。しかしながら、２５００（約０．５ｍＵ／ｍｌ ＬＤＨに対応する）又はそれ以上の核を含有するコロニーについては、いくつかのコロニーは、線形回帰に基づいて予想されるよりも少ない核を有するように思われた（図２Ｆ）。顕微鏡検査は、＞２５００細胞を有するコロニーが、顕微鏡視野の死角（マイクロタイターウェルの約２０％）に部分的に位置する確率が高いことを示した。したがって、核について観察された数は、おそらく、大きなコロニーにおける細胞の数を少なく見積もっており、ＬＤＨ活性は、細胞数について、より正確な指標となるように思われた。図２Ｆ中に示すデータに基づくと、０．４ｍＵ／ｍｌのＬＤＨ活性は、約１，０００細胞のコロニーに相当した。この値を、大きなコロニーについての任意の閾値として選んだ。
実施例５：αＳＭＡ及びＬＤＨについての複数のコロニーのアッセイ（ＡＬＣアッセイ）
方法
上記に記載される結果に基づいて、２つの比色定量アッセイプロトコール−残存ＬＤＨ活性及びαＳＭＡタンパク質発現検出−を、同じマイクロタイタープレート上で成長している複数のコロニーをアッセイするために使用する単一のプロトコールの中に組み込んだ。これらの実験のために、洗浄した骨髄細胞（実施例１において記載されるように得た）を、６．６×１０４ＷＢＣｓ／ｍｌの濃度で再懸濁し、透明な底を有する９６ウェル黒色マイクロプレート（Costar（登録商標））の中に平板培養した（ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液）。α−ＳＭＡ標準物質及びＬＤＨ標準物質用に並びにホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コントロール用に指定したウェルは、下記のプロトコールに示されるまで未使用のままにした。この密度での平板培養は、ウェルの３０％未満においてコロニーの成長をもたらし、したがって、ウェル当たり１つを超えるコロニーを有する可能性が低いことを確実にした。
平板培養の９日後、マイクロタイタープレートは、位相差を使用して、顕微鏡で検査し、コロニーを有するウェルにマークした。１０日目に、プレートをＰＢＳにより洗浄し、２０分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により固定し、次いで、固定液をＰＢＳと取り替えた。一方、代用αＳＭＡ標準物質は、ＰＢＳにおいてAffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG（Jackson Immunoresearch、West Grove、PA）を段階希釈し、１時間、指定のウェルにこの溶液を吸着させることによって調製し、次いで、これらのウェルをＭＳＣ成長培地によりブロックした。すべてのウェル（ＬＤＨ標準物質及びαＳＭＡ標準物質並びにＨＲＰコントロールに指定したウェルを除いて）を、次いで、ＰＢＳにより１回洗浄し、２０分間、ＰＢＳにおいて０．２％Triton X-100と共にインキュベートし、その後、３０分間０．５％Normal Donkey Serum（Jackson Immunoresearch、West Grove、PA）においてブロックした。ウェル（ＬＤＨ標準物質及びＨＲＰコントロールに指定したウェルを除いて）は、次いで、１時間、ＨＲＰコンジュゲートモノクローナル抗αＳＭＡ抗体（１／１０００希釈液；Abcam、Cambridge、MA）と共にインキュベートし、ＰＢＳにより３回洗浄した。
次いで、ＬＤＨアッセイを実行した。最初に、ＬＤＨ標準物質を、ウシＬＤＨ（Sigma）を段階希釈することによって、指定のウェルにおいて調製した。次いで、LDH Cytotoxicity Detectionキット（Clontech Laboratories、Mountain View、CA）のCatalyst/Dye（０．２５ｍｌ／１１ｍｌ）混合物を、細胞を平板培養したすべてのウェル及びＬＤＨ標準物質を含有するウェルに追加した。プレートを、７〜１０分間、室温でインキュベートした。シグナルは、６５０ｎｍでの補正と共に４９０ｎｍで読み取り、測光値は、SoftMAXProソフトウェアを使用して、１ｍｌ当たりのＬＤＨ活性ｍｉｌｌｉＵｎｉｔｓに変換した。
ＬＤＨ検出後、プレートは、ＰＢＳにより１回洗浄し、ＨＲＰ検出のために調製した。すべてのプレートに対する読み取りが、異なる実験の間で比較可能となることを確実にするために、非常に安定化されたＨＲＰ（Sigma）から調製したＨＲＰコントロールを、それぞれのプレートに対して使用した。細胞を平板培養したウェル、代用αＳＭＡ標準物質及びＨＲＰコントロールを含有するウェルに、ＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（TMB、eBioscience）を充填した。吸光度を、４９２ｎｍでの補正と共に３７０ｎｍで測定し、測光値を、結合抗体のｎｇ／ｍｌに変換した。ＬＤＨシグナル及びＨＲＰシグナルの両方は、SoftMax Pro（Molecular Devices、Sunnyvale、CA）で生成した検量線を使用して定量化した。ＬＤＨ活性をｍＵ／ｍｌで表現した。αＳＭＡ発現は、抗αＳＭＡ抗体の対応する濃度としてｎｇ／ｍｌで表現した。
データ処理
ＡＬＣアッセイデータの処理は、プログラムしたExcelテンプレートを使用して行った。ＨＲＰコントロールデータは、必要であれば、異なるプレート及び実験の間で調整するために使用した。次いで、それぞれのプレートについて、両方の測定パラメーターについてのバックグラウンド値：ＬＤＨについては、コロニーなしのすべてのウェルの平均＋１標準偏差（ＳＤ）、ＨＲＰについては、コロニーなしのすべてのウェルの平均として計算した。次いで、バックグラウンドを、対応するデータセットから引き算した。この方法は、さらなる計算から、５０個未満の細胞を有するウェルの排除を可能にし、同時に、ＨＲＰシグナルについてそれほどストリンジェントではない条件は、非常に低いレベルのαＳＭＡ発現を有するコロニーの排除を予防した。次いで、αＳＭＡ発現は、同じウェルからの対応するＬＤＨシグナルに対して標準化した（αＳＭＡ／細胞についての代用物）。コロニーデータはすべて、高い〜低いＬＤＨレベルにソートし、ＬＤＨ≧０．４ｍＵ／ｍｌを有するコロニー（「大きなコロニー」）のパーセンテージを決定した。この閾値は、典型的に、ＢＭロットにおける大きなコロニーとして１５％以上のコロニーを分類した。これらの大きなコロニーにおいて、標準化αＳＭＡ発現を平均した。したがって、それぞれのＢＭロットは、大きなコロニーの細胞における平均αＳＭＡレベル（本明細書でＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣとして称される）及び大きなコロニーのパーセンテージによって特徴付けられた。
統計
統計分析（対応又は独立ｔ検定及び線形回帰分析）並びに図示は、Prism 6ソフトウェア（GraphPad、San Diego、CA）を使用して行った。ｐ＜０．０５は、統計的に有意と見なした。
結果
ロット当たり３４〜８９コロニー（中央値５２）を産生する１０のＢＭ ＭＳＣロットを、平板培養の１０日間後（１０日目）に分析した。１０のロットのうちの９つのロットについて、それぞれのコロニーについてのＬＤＨ値（細胞数についての代用物）をその対応する標準化αＳＭＡ／ＬＤＨ値（細胞当たりのαＳＭＡの平均量についての代用物）に対してプロットすることにより、それぞれのコロニーのサイズ及びそのαＳＭＡ／細胞の間に負の相関がもたらされた（ｐ＜０．０５）。さらに、ＬＤＨ対αＳＭＡ／ＬＤＨ値の分布は、細胞のそれぞれのロットについて特徴的であり、したがって、この分布は、異なるロットを区別するために使用することができる。細胞の２つのロット（ドナーＡＣ１２及びＤ１２７から得た）からの例示的なデータを、図３Ａに示す。
細胞成長の指数関数的な性質により、たとえすべてのコロニーが同じ速度で成長していたとしても、大量培養物中の細胞数への大きなコロニーの寄与は、実質的により大きく、小さなコロニーの寄与は、本質的にごくわずかである。そのため、本発明は、大きなコロニーを、１０日目にＬＤＨ値≧０．４ｍＵ／ｍｌを有するものとして定義する（すなわち、およそ１，０００個の細胞を含有し、それらのＣＦＵｆ前駆細胞が、１０日間で約１０回の細胞倍加を受けたことを意味するコロニー）。
細胞の２つのロット（ＡＣ１２及びＤ１２７）についてのＬＤＨ値及びαＳＭＡ／ＬＤＨ値の分析を、図３Ｂ及び３Ｃに示す。値は、すべてのコロニーについて及び上記に定義されるような大きなコロニーについてのみ得た。予想通り、大きなコロニーは、平均して、細胞集団全体よりも高いＬＤＨレベルを含有する（図３Ｂ）。そのうえ、大きなコロニーについてのαＳＭＡ／ＬＤＨ値は、培養物全体についての値よりも分布が狭く、２人のドナー由来の培養物を区別するのを可能にする（図３Ｃ）。
実施例６：１０日目のＡＬＣアッセイ結果と大量細胞培養物の成長性との相関性
ＭＳＣの１０のロットを、３継代、大量培養で成長させた。これらのロットのそれぞれについて、ＣＦＵｆコロニー形成率（図４）、大きなコロニーのパーセント（ＬＤＨ＞０．４ｍＵ／ｍｌを有するものとして定義される、図５）、サイズによる大きなコロニーの分布（ＬＤＨ、図６）、及びそれぞれのコロニーにおける標準化αＳＭＡ（αＳＭＡ／ＬＤＨ、図７）を決定した。
１０のロットのそれぞれにおける細胞の成長速度（ＧＲ）も又、下記の計算を使用して決定した：
ＧＲｎ＝ｄＨ０／ｄＷＢＣ×ｄＨ１／ｄＰ１×．．．×ｄＨｎ／ｄＰｎ
ここで、ｄＨｎは、継代ｎの収集時の細胞密度であり、ｄＰｎは、継代ｎの平板培養時の細胞密度であり、ｄＷＢＣは、初めのＢＭ平板培養時の細胞密度である。成長速度の分析は、ＭＳＣロットを、継代３でのその累積的な成長速度（ＧＲ）に基づいて、成長が遅い（ＧＲ≦１）又は成長が速い（ＧＲ＞１）と分類することができたことを明らかにした。図８Ａを参照。
第３の継代時の成長速度の分析は、成長が速い培養物についての閾値として＞１の成長速度を使用すると、成長が遅い及び成長が速い培養物の間の成長速度における差異が、統計的に有意であったことを明らかにした（図８Ｂ）。ＭＳＣ成長データを、ＣＦＥ、又は大きな（ＬＤＨ≧０．４ｍＵ／ｍｌ）コロニーのパーセント、及びＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣと比較した。相関性は、ＣＦＥ又は大きなコロニーのパーセンテージ及び大量培養成長の間で検出されなかった。しかしながら、成長が遅いロット（ＧＲ＜１）は、成長が速いロットよりも、有意に高いＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣを有した（図８Ｃ）。大きなコロニーをＬＤＨ≧０．４を有するものとして定義する場合、成長が遅いロット及び成長が速いロットの間のＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値における統計的な差異は、ｐ＜０．００５及びＲ２＝０．７１であった。
大量培養物の成長速度をそれらのＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値に対してプロットした場合、有意な線形相関が、観察された（ｐ＜０．０２で傾き０以外、Ｒ２＝０．５１４）。大きなコロニーのパーセンテージをＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣに対してプロットした場合、データポイントはすべて、２つのグループに分かれ、一方は、すべて遅い成長を表した細胞の４つのロットからなり、他方は、５つの成長が速いロットをすべて含有した（及びおそらく２継代目に偶然成長し過ぎた、成長が遅いロット）。これらの初めのデータは、Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値＞１００が、１００％陽性的中率及び８０％陰性的中率で且つ１００％特異度及び８３％感度で、大量培養物のその後の遅い成長を予測することを示唆した。
上記に記載される結果に基づいて、ＭＳＣの所定のロットについてのＡＬＣデータ及び成長性の間の最も有効な相関性を提供するために、それぞれのロット由来のコロニーについて得たＡＬＣデータを、２つの代表的な機能的パラメーターに整理した：（１）大きなコロニーのパーセンテージ及び（２）これらの大きなコロニーの平均αＳＭＡ／ＬＤＨ値。データ整理のためにこの方法を使用して、１０のロット由来のコロニーデータをプロットし、培養物中の大きなコロニーのパーセンテージの関数として、大きなコロニーにおけるＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ（すなわち平均標準化αＳＭＡ）値を示す「Predictor Plot」上で比較した（図９Ａ）。より高い成長性を有する細胞ロットは、大きなコロニーの高いパーセンテージ及び低いαＳＭＡ／ＬＤＨ値を有することが予想され、したがって、Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣが大きなコロニーのパーセンテージに対してプロットされる場合、値は、Predictor Plotの右下の領域にクラスター形成することが予想される。反対に、初期の成長が減速傾向にあるロットは、プロットの左上のエリアに位置する値を有することが予想される。
Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣの予測値対大きなコロニーのパーセンテージのプロットについて試験するために、ＭＳＣの１０のロットを３継代目まで大量培養で成長させ、αＳＭＡ、ＬＤＨ、及び大きなコロニー（つまり、ＬＤＨ値≧０．４ｍＵ／ｍｌを有するコロニー）のパーセンテージを、それぞれのロットについて得た。次いで、Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ値を、ロットのそれぞれについてＬＤＨ値に対してプロットした（図９Ａ）。倍加時間を、１０の大量培養物のそれぞれについて計算し、これらを図９Ｂに示す。
それぞれのロットについてのＡｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ対大きなコロニーのパーセンテージ値を、その成長速度と比較した場合、結果は、Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ対大きなコロニーのパーセンテージ値が、ＭＳＣ細胞ロットの成長性を予測することを示した。たとえば、Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ対大きなコロニーのパーセンテージ値が、図９Ａにおけるプロットの左上の領域の最も近くにクラスター形成したＭＳＣの３つのロット（ロットＡＣ１３、ＡＣ１４、及びＤ１２２）は、最長の倍加時間を有するロットの中に入っていた（＞４日間、図９Ｂ）。反対に、Ａｖ（αＳＭＡ／ＬＤＨ）ＬＣ対大きなコロニーのパーセンテージ値が、図９Ａにおけるプロットの右下の領域にクラスター形成したロットＤ１２１、Ｄ１２３、Ｄ１２７、及びＤ１２８は、最短の倍加時間を有するロットの中に入っていた（図９Ｂ）。

Claims (13)

  1. 骨髄懸濁液の複数のロットの中から、高い増殖力を有する間葉系間質細胞（ＭＳＣ）のロットを選択するための方法であって、
    （Ａ）低密度で、骨髄懸濁液のそれぞれのロット由来の細胞のサンプルを別々に平板培養すること；
    （Ｂ）単一コロニーを形成させるために、前記別々に平板培養された細胞を培養すること；
    （Ｃ）ＭＳＣのそれぞれのロットについて、
    （ｉ）アルファ−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）のレベル；及び
    （ｉｉ）それぞれの培養物中の大きなコロニーのパーセンテージ；ここで、前記大きなコロニーは：
    （ａ）４．０ｍｉｌｌｉＵｎｉｔｓ／ｍｌ又はそれ以上のＬＤＨ活性のレベル有するか、又は
    （ｂ）少なくとも１，０００個の細胞を含有する、
    コロニーである；
    を測定すること；並びに
    （Ｄ）培養物が
    （ｉ）他のロットと比較して低いレベルのαＳＭＡ及び
    （ｉｉ）他のロットと比較して高いパーセンテージの大きなコロニー
    を表す１又は複数のロットを選択すること、
    を含み、
    培養物が、試験されている他のロットと比較して、低いレベルのαＳＭＡ及び高いパーセンテージの大きなコロニーを有する前記１又は複数のロットは、高い増殖力を有する、方法。
  2. αＳＭＡレベルは、コロニーを抗αＳＭＡ抗体と接触させ、前記抗体により前記コロニーの免疫活性を測定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
  3. αＳＭＡレベルは、反応を示す抗αＳＭＡ抗体のｎｇ／ｍｌとして表現される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. コロニーにおけるαＳＭＡのレベルを前記コロニーの細胞の数に対して標準化することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記コロニーにおける細胞の数は、前記コロニーのＬＤＨ活性のレベルに相当する、請 求項４に記載の方法。
  6. αＳＭＡのレベルが大きなコロニーにおいて測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記大きなコロニーについての標準化αＳＭＡ／ＬＤＨ値は、前記培養物中の大きなコロニーのパーセンテージの関数として表現される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. １００未満である大きなコロニーについての標準化αＳＭＡ／ＬＤＨ値及び４０％を超える大きなコロニーのパーセンテージを有する培養物は、高い増殖力を有するＭＳＣのロットに相当する、請求項７に記載の方法。
  9. ステップ（Ｃ）の測定は、ステップ（Ａ）において前記細胞を平板培養した１０日後に行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 高い増殖力を有する前記１又は複数のロットは、ＭＳＣの治療用誘導体を製造するためのプロセスにおいて使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 大量培養で高い増殖力を有する細胞を成長させることをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. Notch細胞内ドメインをコードする配列を含むポリヌクレオチドにより大量培養中の前記ＭＳＣをトランスフェクトすることをさらに含み、前記ポリヌクレオチドは、完全長Notchタンパク質をコードしない、請求項１１に記載の方法。
  13. 高い増殖力を有する間葉系間質細胞（ＭＳＣ）のロットを同定するための方法であって、
    （ａ）低密度でＭＳＣのサンプルを平板培養すること；
    （ｂ）単一のコロニーが形成されるようにＭＳＣを培養すること；
    （ｃ）それぞれのコロニーにおけるαＳＭＡレベルを測定すること；
    （ｄ）それぞれのコロニーにおけるＬＤＨ活性を測定すること；
    （ｅ）大きなコロニーの数を決定すること；ここで、前記大きなコロニーは：
    （ａ）４．０ｍｉｌｌｉＵｎｉｔｓ／ｍｌ又はそれ以上のＬＤＨ活性のレベル有するか、又は
    （ｂ）少なくとも１，０００個の細胞を含有する、
    コロニーである；
    （ｆ）前記大きなコロニーについての平均αＳＭＡ／ＬＤＨ値を得るために、前記大きなコロニーにおいてＬＤＨ活性のレベルに対してαＳＭＡのレベルを標準化すること；及び
    （ｇ）培養物中の大きなコロニーのパーセンテージの関数として、前記大きなコロニーについての平均αＳＭＡ／ＬＤＨ値を表現することを含み、 低い平均αＳＭＡ／ＬＤＨ値及び高いパーセンテージの大きなコロニーによって特徴付けられる培養物を提供するＭＳＣのロットは、高い増殖力を有するロットである、方法。
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