CN111893091B - 一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，包括以下步骤：（1）、通过流式细胞仪分选获得大鼠骨髓中CD45−Lin−CD106+细胞(极小胚胎干细胞)；（2）、5‑氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化；（3）、通过qRT‑PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5‑氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化过程。通过本发明，旨在从大鼠骨髓组织中分离培养出极小胚胎干细胞，并采用5‑氮杂胞苷诱导分化，观察其生物学特性及定向分化特征，以期为临床缓慢性心律失常的细胞移植治疗寻找一种方便、快速的途径。验证结果合理准确，实验过程严密周谨。

Description

一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，属于干细胞分化培养领域。
背景技术
缓慢型心律失常是包括病窦综合征、房室传导阻滞等一组威胁人们生命的疾病,其特征是心脏起搏或传导功能障碍。由体细胞基因转染、细胞融合或细胞移植构成的生物起搏器为治疗缓慢型心律失常提供了一种新的选择。单纯的基因生物起搏存在转染靶向及转染效率的不确定性，因此人们逐渐选择了细胞生物起搏治疗。虽然细胞生物起搏器拥有众多优势，但存在两个问题，1)种子细胞选择难，2)诱导方法难抉择。目前，多种干细胞(胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞)均在体外成功诱导为心肌细胞，但细胞来源不足、伦理，免疫排斥反应等问题限制了其在临床上的推广应用。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法。
本发明的目的是这样实现的，一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)、通过流式细胞仪分选获得大鼠骨髓中CD45-Lin-CD106+细胞(极小胚胎干细胞)；
(2)、5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化；
(3)、通过qRT-PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化过程。
步骤(1)中，具体方法为：
分离大鼠胫骨和股骨，并清除肌肉和结缔组织，PBS冲洗出骨髓，在冲出的骨髓中加入红细胞裂解液避光放置10分钟，离心后获得总单个核细胞(TNCs)，CD45、CD106、lin单抗(1:200)室温孵育30min，流式细胞仪分选获得CD45-Lin-CD106+细胞(极小胚胎干细胞)；
分选后的极小胚胎干细胞在含有10％胚牛血清的DMEM培养基中放入37℃、5％CO2培养箱培养；在极小胚胎干细胞增殖期间，每三天更换培养基，待细胞达到70％融合后进行传代培养。
步骤(2)中，具体方法为：
将极小胚胎干细胞加入到含有10μM的5-氮杂胞苷的培养基中，诱导极小胚胎干细胞分化，24小时后移去培养基，磷酸盐缓冲液漂洗细胞2遍，更换不含5-氮杂胞苷的完全培养基继续培养3周；用相差显微镜(TE2000尼康)观察细胞每日形态变化。
步骤(2)中，5-氮杂胞苷诱导后的细胞在第21天用一抗心肌特异性cTnT(Abcam)和α-actin(Abcam)(1:50稀释)4℃条件下孵育过夜，二抗(PE标记的羊抗兔IgG以1：200稀释)，湿盒内室温1小时；荧光显微镜下观察阳性细胞率。
步骤(3)中，具体方法为：
RT-qPCR检测全能极小胚胎干细胞以及诱导后的细胞全能干细胞基因和心肌蛋白基因，从分别于诱导前、诱导第7、14、21天细胞中提取总RNA，通过逆转录合成cDNA；荧光定量PCR检测Nanog、Oct-4、Sox2、cTnT、α-actin的基因表达；PCR扩增反应体积包括2μLcDNA、10μLSYBR Taq,0.8μL上游和下游引物,0.4μL RoxII和PBS来弥补体积20μL；每个样本设置3个复孔，分析各孔扩增循环数(cycle threshold，CT)，mRNA相对含量采用标化后的2－ΔΔCT值表示，计算基因初始拷贝数的相对量。
本发明方法先进科学，通过本发明，提供了一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，旨在从大鼠骨髓组织中分离培养出极小胚胎干细胞，并采用5-氮杂胞苷诱导分化，观察其生物学特性，以期为临床缓慢性心律失常的细胞移植治疗寻找一种方便、快速的途径。本方法采用5-氮杂胞苷诱导分化诱导极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，验证结果合理准确，实验过程严密周谨。
方法步骤为：(1)通过流式细胞仪分选获得大鼠骨髓中CD45-Lin-CD106+细胞(极小胚胎干细胞)。(2)5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化。(3)通过qRT-PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化过程。
本发明的优越性在于：
极小胚胎干细胞是一个独特的罕见的成体干细胞群，与胚胎干细胞具有相同的结构、遗传、生化和功能特性，并已证明存在于包括卵巢和睾丸在内的成体小鼠和人类组织中。相比较于其他的种子细胞，极小胚胎干细胞有以下几个主要优势，首先，考虑到极小胚胎干细胞的多能性和分化成心肌细胞和内皮细胞的能力。其次，极小胚胎干细胞中多种血管生成和保护因子的表达使其适合通过旁分泌作用进行心肌修复。第三，与目前可用的多能细胞(胚胎干细胞、诱导多能细胞)不同，极小胚胎干细胞在长时间的培养中不会形成肿瘤。最后，由于极小胚胎干细胞可以从成人组织中分离出来，使用自体极小胚胎干细胞不仅可以避免排斥反应和其他潜在的免疫风险，而且也避免了伦理问题。本发明可以证明5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化为心肌细胞。通过qRT-PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化过程。验证结果合理准确，实验过程严密周谨。
附图说明
图1为10μm 5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞在不同天数的生长情况；
图2为5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞后全能干细胞基因(Sox2、Oct-4,、Nanog)cTnT和α-actin的变化；
a:免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白(cTnT和α-actin)；b:RT-qPCR检测全能干细胞以及心肌蛋白相关基因(Sox2、Oct-4,、Nanog、cTnT和ɑ-actin)。
具体实施方式
下面结合附图以及附图说明，对本发明做进一步说明。
一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，具体方法包括：
(1)分离大鼠胫骨和股骨，并清除肌肉和结缔组织，PBS冲洗出骨髓，在冲出的骨髓中加入红细胞裂解液避光放置10分钟，离心后获得总单个核细胞(TNCs)，CD45、CD106、lin单抗(1:200)室温孵育30min，流式细胞仪分选获得CD45-Lin-CD106+细胞(极小胚胎干细胞)。分选后的极小胚胎干细胞在含有10％胚牛血清的DMEM培养基中放入37℃、5％CO2培养箱培养。在极小胚胎干细胞增殖期间，每三天更换培养基，待细胞达到70％融合后进行传代培养。
(2)将极小胚胎干细胞加入到含有10μM的5-氮杂胞苷的培养基中，诱导极小胚胎干细胞分化，24小时后移去培养基，磷酸盐缓冲液漂洗细胞2遍，更换不含5-氮杂胞苷的完全培养基继续培养3周。用相差显微镜(TE2000尼康)观察细胞每日形态变化(图1)。
(3)5-氮杂胞苷诱导后的的细胞在第14天用一抗心肌特异性cTnT(Abcam)；和α-actin(Abcam)(1:50稀释)4℃条件下孵育过夜，二抗(PE标记的羊抗兔IgG以1：200稀释)，湿盒内室温1小时。荧光显微镜观察结果如附图2的a处所示。
(4)RT-qPCR检测极小胚胎干细胞以及诱导后的细胞全能干细胞基因和心肌蛋白基因，从分别于诱导前、诱导第7、14、21天细胞中提取总RNA，通过逆转录合成cDNA。荧光定量PCR检测Nanog、Oct-4、Sox2、cTnT、α-actin的基因表达。PCR扩增反应体积包括2μLcDNA、10μLSYBR Taq,0.8μL上游和下游引物,0.4μL RoxII和PBS来弥补体积20μL。每个样本设置3个复孔，分析各孔扩增循环数(cycle threshold，CT)，mRNA相对含量采用标化后的2－ΔΔCT值表示，计算基因初始拷贝数的相对量。检测结果如附图2的b处所示。
相关器材：TRNZOL，扩增引物，反转录试剂盒，荧光定量试剂盒，荧光定量PCR仪，细胞培养箱，荧光显微镜，流式细胞仪，载玻片，显微镜，酶标仪。

Claims (4)

1.一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)、通过流式细胞仪分选获得大鼠骨髓中CD45-Lin-CD106+细胞；
(2)、5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞细胞分化；
(3)、通过qRT-PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞细胞分化过程；
步骤(1)中，具体方法为：
分离大鼠胫骨和股骨，并清除肌肉和结缔组织，PBS冲洗出骨髓，在冲出的骨髓中加入红细胞裂解液避光放置10分钟，离心后获得总单个核细胞(TNCs)，CD45、CD106、lin单抗(1:200)室温孵育30min，流式细胞仪分选获得CD45-Lin-CD106+细胞，此为大鼠极小胚胎干细胞的表面标记。
2.根据权利要求1所述的一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，步骤(2)中，具体方法为：
将极小胚胎干细胞加入到含有10μM的5-氮杂胞苷的培养基中，诱导极小胚胎干细胞细胞分化，24小时后移去培养基，磷酸盐缓冲液漂洗细胞2遍，更换不含5-氮杂胞苷的完全培养基继续培养3周；用相差显微镜观察细胞每日形态变化。
3.根据权利要求2所述的一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，步骤(2)中，5-氮杂胞苷诱导后的细胞在第21天用一抗心肌特异性cTnT和α-actin以1:50稀释后，4℃条件下孵育过夜，二抗为PE标记的羊抗兔IgG以1：200稀释，湿盒内室温1小时；荧光显微镜下观察阳性细胞率。
4.根据权利要求3所述的一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，步骤(3)中，具体方法为：
RT-qPCR检测极小胚胎干细胞以及诱导后的细胞全能干细胞基因和心肌蛋白基因，从分别于诱导前、诱导第7、14、21天细胞中提取总RNA，通过逆转录合成cDNA；荧光定量PCR检测Nanog、Oct-4、Sox2、cTnT、α-actin的基因表达；PCR扩增反应体积包括2μLcDNA、10μLSYBRTaq,0.8μL上游和下游引物,0.4μL RoxII和PBS来弥补体积20μL；在不同天数提取的RNA设置3个复孔，分析各孔扩增循环数(cycle threshold，CT)，mRNA相对含量采用标化后的2－ΔΔCT值表示，计算基因初始拷贝数的相对量。
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CN105441386A (zh) * 2015-12-25 2016-03-30 江苏省苏北人民医院 一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法
CN108588009A (zh) * 2018-05-10 2018-09-28 广州四叶草健康科技有限公司 一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法

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