CN102229910B - 一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法 - Google Patents

一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法。该方法的步骤是恒温4℃条件下进行，经肝素盐水抗凝的10mL人骨髓，加入占其3倍体积量的红细胞裂解液30mL，混匀，离心分离10分钟，弃上清液，在沉淀物中加入占其2倍体积量的红细胞裂解液20mL，混匀，离心分离10分钟，再弃上清液，得二次沉淀物，4℃条件下用EDTA缓冲液洗涤，得细胞悬浊液；将细胞悬浊液用30μM网孔滤过，将过滤液在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至300μL～310μL得重悬细胞液；再经阴选和阳选步骤。本发明能保持极小胚胎样干细胞的完好性，方法简单实用，简化分选流程，缩短分选时间，提取成本低，能获得较高的回收率的优点。

Description

一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法
技术领域
本发明属于一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法。
背景技术
干细胞的研究为人体脏器再生、为器官衰竭治疗带来希望，“极小胚胎样干细胞”(very small embryonic-like stem cells，VSELs)是近几年在小鼠和人的骨髓、脐血中发现的成体干细胞，在其他物种尚未鉴定。VSELs直径小(＜10μM)；标志物在小鼠为Sca-1(+)/Lin(-)/CD45(-)/CXCR4(+)，在人为Oct-4(+)CXCR4(+)CD133(+)Lin(-)CD45(-)；VSELs表达胚胎干细胞的多能性标记蛋白：Oct4、Nanog、SSEA等；电镜下可见典型的胚胎干细胞形态特征；VSELs培养可见典型拟胚体，适当促分化条件下能分化为三个胚层来源的细胞。是目前最有希望应用的干细胞“种子”之一。
然而，由于其数量少，仅占骨髓单个核细胞的数万分之一，分离后体外存活增殖能力有限，相关技术目前尚不成熟，直接从骨髓取材临床应用的VSELs移植仍不可能。
在实验室研究阶段，已有报道采用流式细胞仪分选VSELs。众所周知，流式分选虽然理论上能逐一收获细胞，但过程中的机械剪切力、高能激光和超声振荡可能造成致命的细胞损伤及影响其生物学特性。其它的分选方法如免疫磁珠分选系统常应用于造血干细胞的分选，最多的只能进行CD34+细胞分选，对VSELs的分选尚无报道。VSELs的分选的落后，严重地制约了干细胞的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法，能保持极小胚胎样干细胞的完好性，具有方法简单实用，简化分选流程，缩短分选时间，提取成本低，能获得较高的回收率的优点。
为此，本发明的方法的步骤是恒温4℃条件下进行，步骤在如下：
(1)经肝素盐水抗凝的10mL人骨髓，加入占其3倍体积量的红细胞裂解液30mL，混匀，4℃条件下裂解，离心分离10分钟，弃上清液，在沉淀物中加入占其2倍体积量的红细胞裂解液20mL，混匀，4℃条件下裂解，离心分离10分钟，再弃上清液，得二次沉淀物，4℃条件下用EDTA缓冲液洗涤，得细胞悬浊液；
(2)将细胞悬浊液用30μM网孔滤过，将过滤液在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至300μL～310μL得重悬细胞液；
(3)阴选，取重悬细胞液300μL，加入100μL美天旎130-092-211液，充分混匀，4℃放置10分钟，再加入5mL EDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液500～550μL，加入美天旎130-092-211液200μL及美天旎130-045-801液200μL，混匀，4℃放置15分钟；以10mL EDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至500μL，选用美天旎磁珠分选器，LS分选柱，按该美天旎磁珠分选器说明进行分选，收集通过分选柱的细胞，计数为105106个，4℃条件下离心收集沉淀物；
(4)阳选：取25～27μL的EDTA缓冲液加入步骤(3)最终收集的沉淀物中，得重悬细胞液，再加10μL美天旎130-059-901液及10μL美天旎130-050-801液，混匀，4℃避光放置30分钟；以1mLEDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至500μL，选用美天旎磁珠分选器，LS分选柱，按该美天旎磁珠分选器说明进行分选，收集吸附在分选柱上的细胞，计数1×104个，离心收集细胞，得人骨髓极小胚胎样干细胞。
本发明的优点是工艺简单实用，提取成本低、速度快，提取率高。本发明的提取成本低，仅是传统方法成本的10-20％，能保持VSELs的完好性，有良好的应用前景。
本发明的方法能有效避免人骨髓极小胚胎样干细胞在提取过程中的损失和破坏，将本发明收集的人骨髓极小胚胎样干细胞经流式细胞仪检测和免疫荧光染色鉴定并初步进行了培养，步骤如下：
1，流式细胞仪检测：将本发明的人骨髓极小胚胎样干细胞10μL，加15μL抗体混合液[CD133/2(293C3)-APC(美天旎，130-090-854)抗体5μL；CXCR4-PE(eBioscience，12-9999)抗体9μL；Oct4-FITC(CST，5263)抗体1μL]4℃避光放置30分钟；以1mL缓冲液洗涤，弃上清，重悬于350μL2％多聚甲醛备检测。检测时加入3_μM的微球以确定细胞直径，结果：分选前VSELs约占骨髓单个核细胞的约0.01％，分选后1×104个细胞中约有30％符合直径小于10μM/Oct-4(+)/CXCR4/(+)/CD133(+)，推算回收率约为30％。人骨髓极小胚胎样干细胞完好。
2，免疫荧光染色：将本发明的人骨髓极小胚胎样干细胞加VSELs分离培养液)1～2mL；
分离培养液为：
Figure GSB00001083437800031
使用Shandon
Figure GSB00001083437800032
4离心机离心涂片，常规免疫荧光染色[CD45-PE(美天旎，130-091-610，1：10)；Nanog(Santa Cruz，sc-30328，1：100，二抗为抗羊TRITC)；DAPI]，以荧光显微镜观察结果(SSEA有1，3，4等多型，无法一一标记，故未染)。结果：直径小于10μM的VSELs细胞Nanog(+)CD45(-)。人骨髓极小胚胎样干细胞完好。
3，培养：将本发明的人骨髓极小胚胎样干细胞加上述的VSELs分离培养液400μL，置于12孔细胞培养板，37℃5％CO2条件下培养40小时(每日换液1/2，即除掉200μL陈旧培养液，加入200μL新鲜培养液)，可见拟胚体形成。
以上结果证明本发明能保持极小胚胎样干细胞的完好性，具有方法简单实用，简化分选流程，缩短分选时间，提取成本低，能获得较高的回收率的优点。
具体实施方式
该方法的步骤是恒温4℃条件下进行，步骤在如下：
(1)经肝素盐水抗凝的10mL人骨髓，加入占其3倍体积量的红细胞裂解液30mL，混匀，4℃条件下裂解，离心分离10分钟，弃上清液，在沉淀物中加入占其2倍体积量的红细胞裂解液20mL，混匀，4℃条件下裂解，离心分离10分钟，再弃上清液，得二次沉淀物，4℃条件下用EDTA缓冲液洗涤，得细胞悬浊液；
(2)将细胞悬浊液用30μM网孔滤过，将过滤液在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至300μL～310μL得重悬细胞液；
(3)阴选，取重悬细胞液300μL，加入100μL美天旎130-092-211液，充分混匀，4℃放置10分钟，再加入5mL EDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液500～550μL，加入美天旎130-092-211液200μL及美天旎130-045-801液200μL，混匀，4℃放置15分钟；以10mL EDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至500μL，选用美天旎磁珠分选器，LS分选柱，按该美天旎磁珠分选器说明进行分选，收集通过分选柱的细胞，计数为105-106个，4℃条件下离心收集沉淀物；
(4)阳选：取25～27μL的EDTA缓冲液加入步骤(3)最终收集的沉淀物中，得重悬细胞液，再加10μL美天旎130-059-901液及10μL美天旎130-050-801液，混匀，4℃避光放置30分钟；以1mLEDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至500μL，选用美天旎磁珠分选器，LS分选柱，按该美天旎磁珠分选器说明进行分选，收集吸附在分选柱上的细胞，计数1×104个，离心收集细胞，得人骨髓极小胚胎样干细胞。
将本发明收集的人骨髓极小胚胎样干细胞经流式细胞仪检测并初步进行了培养，用流式细胞仪检测：结论1×104个细胞中约有30％符合直径小于10μM/Oct-4(+)/CXCR4/(+)/CD133(+)，推算回收率约为30％。人骨髓极小胚胎样干细胞完好。将本发明的人骨髓极小胚胎样干细胞加上述的VSELs分离培养液400μL，置于12孔细胞培养板，37℃5％CO2条件下培养40小时(每日换液1/2，即除掉200μL陈旧培养液，加入200μL新鲜培养液)，可见拟胚体形成。
总之，本发明能保持极小胚胎样干细胞的完好性，方法简单实用，简化分选流程，缩短分选时间，提取成本低，能获得较高的回收率的优点。可推广使用。

Claims (1)

1.一种分选人骨髓极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于该方法的步骤是恒温4℃条件下进行，步骤在如下：
(1)经肝素盐水抗凝的10mL人骨髓，加入占其3倍体积量的红细胞裂解液30mL，混匀，4℃条件下裂解，离心分离10分钟，弃上清液，在沉淀物中加入占其2倍体积量的红细胞裂解液20mL，混匀，4℃条件下裂解，离心分离10分钟，再弃上清液，得二次沉淀物，4℃条件下用EDTA缓冲液洗涤，得细胞悬浊液；
(2)将细胞悬浊液用30μM网孔滤过，将过滤液在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至300μL～310μL得重悬细胞液；
(3)阴选，取重悬细胞液300μL，加入100μL美天旎130-092-211液，充分混匀，4℃放置10分钟，再加入5mL EDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液500～550μL，加入美天旎130-092-211液200μL及美天旎130-045-801液200μL，混匀，4℃放置15分钟；以10mL EDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至500μL，选用美天旎磁珠分选器，LS分选柱，按该美天旎磁珠分选器说明进行分选，收集通过分选柱的细胞，计数为105-106个，4℃条件下离心收集沉淀物；
(4)阳选：取25～27μL的EDTA缓冲液加入步骤(3)最终收集的沉淀物中，得重悬细胞液，再加10μL美天旎130-059-901液及10μL美天旎130-050-801液，混匀，4℃避光放置30分钟；以1mLEDTA缓冲液洗涤，在4℃条件下离心分离5分钟，弃上清液，将沉淀物中加入EDTA缓冲液至500μL，选用美天旎磁珠分选器，LS分选柱，按该美天旎磁珠分选器说明进行分选，收集吸附在分选柱上的细胞，计数1×104个，离心收集细胞，得人骨髓极小胚胎样干细胞。
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小鼠视网膜多潜能干细胞的分离培养和小鼠胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化的研究;肖庆;《中南大学博士学位论文》;20101115;第1.1部分第5. *
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