CN106947729A - 一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，其步骤是：A.叶片组织加入CIB缓冲液，研磨后依次通过70 μm、35 μm和15 μm滤网过滤，过滤液200×g离心5min，去除组织残渣、细胞碎片；B.将上述滤液1000×g离心10min，收集富含叶绿体的沉淀；C.收集步骤B离心后的上清液，5μm滤网过滤，过滤液经2000×g离心10min，弃沉淀，上清液17000×g离心10min，收集富含线粒体沉淀；D.上述沉淀分别用洗涤缓冲液洗涤，并用DNase I消化以去除背景基因组的污染；E.叶绿体沉淀1000×g离心10 min后弃上清，线粒体沉淀17000×g离心10 min后弃上清，沉淀用洗涤缓冲液洗涤。

Description

一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学和分子生物学技术领域，具体涉及一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法。

背景技术

叶绿体(chloroplast)和线粒体(mitochondrion)的研究在系统进化、物种鉴定、核质互作、基因工程等领域具有举足轻重的作用。分离高纯度的叶绿体和线粒体细胞器是开展相关研究的关键。密度梯度离心是目前分离这两种细胞器最为常用的方法，它是用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆或混悬液至于介质的顶部，通过重心或离心场力的作用使细胞分层和分离。密度梯度离心介质包括蔗糖(Sucrose)、血清白蛋白(Serum albumin,ALB)、聚蔗糖(Ficoll)、氯化铯(CsCl)和Percoll等。密度梯度离心方法存在一些不足：1)血清白蛋白、聚蔗糖、氯化铯和Percoll等介质的价格昂贵；2)价格相对低廉的蔗糖在高浓度时又会对线粒体和叶绿体活性造成不利影响，特别是线粒体对介质的渗透压十分敏感，高浓度会导致其变形或破裂；3)配置惰性梯度介质溶液步骤繁琐且耗时；4)配置的分离液无法重复使用；5)离心时间较长；6)操作严格，不易掌握。尽管商业化的试剂盒(如Invent biotechnologies公司开发的Minute^TM ChloroplastIsolation Kit、SIGMA公司开发的Chloroplast Isolation Kit和ThermoFisher公司研发的Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells)操作简便，分离效果可靠，但其价格昂贵，使用次数有限无法大批量使用，且不能同时分离两种细胞器。

实际上，植物的叶绿体、线粒体以及叶肉细胞在形态、大小存在较大的差异。高等植物叶绿体呈双凸或平凸透镜状，长径5-10μm，短径2-4μm，厚2-3μm；线粒体是一些大小不一的球状、棒状或细丝状颗粒，一般为0.5-1.0μm，长1-2μm；叶肉细胞的大小为30-50μm。此外它们在沉降系数上也存在差异，因此利用物理分筛和差速离心从叶片匀浆中同步分离高纯度的叶绿体和线粒体理论上是可的。

具有活性的完整叶绿体在488nm激发光和650～750nm吸收光下产生红色自发荧光；而线粒体可借助于线粒体特异染料(Red CMXRos)染色，在激发光和吸收光分别为579nm和599nm条件下观察染料荧光。因此，利用荧光显微技术(fluorescencemicroscopy)可有效地跟踪检测叶绿体和线粒体细胞器，提供了可视化鉴定分离的叶绿体和线粒体纯度的方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，材料易得，方法简单，该方法可广泛应用于各种植物叶绿体和线粒体细胞器的同步分离以及高纯度叶绿体和线粒体基因组提取。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，其步骤是：

1、植物叶片组织冲洗干净并剪碎，按照1:15(m:v)加入CIB缓冲液，研磨后依次通过70μm、35μm和15μm滤网过滤，过滤液200×g离心5min，去除组织残渣、细胞碎片；

2、根据叶绿体和线粒体不同的沉降系数，将步骤1获得的滤液1000×g离心10min，收集富含叶绿体的沉淀，

3、收集步骤2离心后的上清液，选用5μm的滤网过滤，过滤液经2000×g离心10min，弃沉淀，上清液17000×g离心10min，收集富含线粒体的沉淀；

4、收集得到的叶绿体和线粒体沉淀分别用洗涤缓冲液洗涤，并用DNase I消化，去除核基因组的污染；

5、叶绿体沉淀的消化液1000×g离心10min之后弃上清，沉淀用洗涤缓冲液洗涤，得到的即为叶绿体；线粒体沉淀的消化液17000×g离心10min之后弃上清，沉淀用洗涤缓冲液洗涤，得到的即为线粒体。

作为优选，上述步骤均在冰上或4℃离心机中进行，以避免细胞器的裂解。

作为优选，选取的叶片组织为植物的新鲜幼嫩叶片。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1)经济：密度梯度离心分离法中所用的大部分介质价格昂贵；商业化试剂盒价格更高，且使用次数有限。该方法所用试剂耗材简单、廉价，且不同孔径滤网可反复使用，可进行大批量样本的分离。

2)省时、省力、操作简单：密度梯度离心分离法中梯度介质溶液配置比较繁琐耗时，且后续操作严格，不易掌握。商业化试剂盒一般只针对单一细胞器(叶绿体或线粒体)进行分离。此外，常规技术在线粒体分离时需要大量种子进行黑暗萌发及生长形成黄化苗，从而抑制叶绿体的形成。本发明省时、省力、操作简单；无需黄花苗处理，可从叶片匀浆中同步分离高纯度叶绿体和线粒体两种细胞器。

3)无毒害：密度梯度离心方法中所用的蔗糖，可因高浓度导致高渗透压最终造成分离的细胞器变形或破裂；而介质氯化铯等化学试剂可对分离的细胞器造成永久毒害，影响后续叶绿体或线粒体体外生化实验结果。本发明利用优化后的物理分筛(非化学方法)及常规差速离心来分离高纯度叶绿体和线粒体，不会造成化学毒害，充分保证分离细胞器的活性，为后续体外生化实验提供了保障。

附图说明

图1叶片组织处理及研磨流程图

图2叶绿体分离纯化流程图

图3线粒体分离纯化流程图

图4叶绿体和线粒体分离纯化结果

其中图A为叶绿体分离纯化结果，图B为线粒体分离纯化结果；1：明场；2：叶绿体自发荧光；3：线粒体特异染色荧光；4：叠加结果。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1

本发明实施例以油菜叶片组织为例，该方法同样适用于拟南芥、烟草、水稻、小麦等植物的叶绿体和线粒体的同步分离。

一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，其步骤是：

1、叶片组织处理及研磨

在植物生理生长期，选择油菜幼嫩的叶片组织作为分离纯化叶绿体和线粒体的材料。剪取叶片组织后置于冰上暂时保存，用清水冲洗几遍，将叶片上的泥土等杂质清洗干净。之后用吸水纸将叶片上的残存的水珠吸干，再用灭菌后的手术剪刀将非叶脉部位剪碎，称取5g置于灭菌好的研钵内，加入提前预冷的CIB缓冲液(0.33M sorbitol,50mM Tricine,2mM EDTA,2mM MgCl2,1mM DTT,0.1％BSA,pH 7.8)10mL，在冰上研磨充分，再次加入适量CIB缓冲液，通过70μm滤网过滤，在过滤过程中为加速过滤速度，可以用移液枪缓慢轻轻吹打，残渣倒回研钵继续研磨并加入适量CIB缓冲液，同样经70μm滤网过滤。过滤液再依次通过35μm、15μm滤网过滤(注：70μm、35μm和15μm的分级过滤是为了依次去除大残渣、中等残渣和较小残渣，并且防止直接用较小孔径滤网过滤导致的滤网堵塞而致使无法过滤或过滤速度慢)，弃残渣并收集过滤液，过滤液再200×g，4℃，离心5min，以去除组织残渣、细胞碎片等的污染。

2、叶绿体的纯化

将上清液转移至新的离心管内，采用1000×g，4℃离心10min，转移上清于新的离心管内，并用15mL CIB缓冲液重悬沉淀，加入5UμL^-1的DNase I 5μL，4℃，消化核基因组1h。1000×g，4℃离心10min之后弃上清，沉淀用洗涤缓冲液(0.33M sorbitol,50mM Tricine,2mM MgCl₂,1mM DTT,PH 7.8)洗涤两次，得到的即为叶绿体。以上所述的方法，整个操作过程在冰上进行，时间尽量缩短，以避免细胞器的裂解。

3、线粒体的纯化

收集步骤2中离心后的上清液，所得上清液分别选用10μm、5μm、1μm的滤网再次过滤进行线粒体的纯化筛选(注：叶绿体和线粒体因为大小上的差异，在此次过滤中分开)，并采用叶绿体自发荧光和线粒体特异染料镜检过滤液(具体方法见实施例3)，通过镜检发现10μm的过滤液含有叶绿体的污染较多，5μm滤网过滤液中叶绿体数量明显减少，而1μm的过滤液中线粒体损失严重，且由于过滤时间较长影响了线粒体活性，故而在后续实施方案中均采用5μm的滤网以达到筛选纯化的目的。过滤液经2000×g，4℃离心10min，以排除未沉淀的少许叶绿体及其他非线粒体的污染，上清液17000×g高速离心10min，4℃，收集线粒体沉淀。收集得到的线粒体经15mL CIB缓冲液重悬，加入5UμL^-1的DNase I 5μL，4℃，消化核基因组1h。17000×g，4℃离心10min之后弃上清，并用洗涤缓冲液洗涤两次，得到的即为线粒体。以上所述的方法，整个操作过程在冰上进行，时间尽量缩短，以避免细胞器的裂解。

实施例2：叶绿体和线粒体的观察

将实施例1中分离得到的叶绿体和线粒体，分出100μL，加入10μLRedCMXRos，室温避光孵育10min，之后用洗涤缓冲液洗涤两次，制片于激光共聚焦显微镜下观察。观察结果表明，使用本发明分离的油菜叶片叶绿体纯度较高(图4A)，仅有极少量线粒体污染(图4A-3和图4A-4)，且叶绿体形态完整且具有活性(图4A-1，图4A-2和图4A-4)；同步分离的线粒体纯度极高，无叶绿体污染，且具有活性(图4B-3和图4B-4)。

Claims (3)

1.一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，其步骤是：

A.植物叶片组织冲洗干净并剪碎，按照1:15(m:v)加入CIB缓冲液，研磨后依次通过70μm、35μm和15μm滤网过滤，过滤液200×g离心5min，去除组织残渣、细胞碎片；

B.根据叶绿体和线粒体不同的沉降系数，将步骤A获得的滤液1000×g离心10min，收集富含叶绿体的沉淀；

C.收集步骤B离心后的上清液，用5μm的滤网过滤，过滤液经2000×g离心10min，弃沉淀，上清液17000×g离心10min，收集富含线粒体沉淀；

D.收集得到的叶绿体和线粒体沉淀分别用洗涤缓冲液洗涤，并用DNase I消化以去除核基因组的污染；

E.叶绿体沉淀的消化液1000×g离心10min之后弃上清，沉淀用洗涤缓冲液洗涤，得到的即为叶绿体；线粒体沉淀的消化液17000×g离心10min之后弃上清，沉淀用洗涤缓冲液洗涤，得到的即为线粒体。

2.根据权利要求1所述的同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，其特征在于，所述的步骤均在冰上或4℃离心机中进行，以避免细胞器的裂解。

3.根据权利要求1所述的同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，其特征在于，选取的叶片组织为植物的新鲜幼嫩叶片。