CN109321512A - 一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法，该方法主要是基于植物细胞器及分级孔筛的特性，利用不同孔径的孔筛进行组合，选择性的对植物细胞器进行分级过滤，从而富集提取植物线粒体。该方法对线粒体富集有较强的选择性，针对性和专一性，富集过程中，线粒体处于等渗状态，不进行剧烈的离心操作和振荡。提取过程温和，有效减少线粒体的丢失，提高了线粒体在提取过程中的回收率和完整性。

Description

一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法

技术领域

本发明涉及一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法，属于生物技术领域。

背景技术

植物线粒体是半自主遗传特性的细胞器，呈现棒状，直径在1-10微米之间，远小于细胞核和叶绿体的尺寸，是植物进行呼吸代谢、负责ATP产生、为生命活动提供能量的重要细胞器。此外植物很多重要的遗传特性(如雄性不育)也与线粒体相关，是研究母系遗传的重要材料。植物线粒体基因组为环状分子，其基因组大小随物种的不同而有所变化，介于200～2500kb之间。细胞器基因组在遗传方式、基因组大小与结构、基因编码容量、基因表达与调控等方面均不同于核基因组。

在线粒体内膜外膜及基质内均分布有大量的与植物呼吸与能量代谢相关的酶系统或电子传递系统，具有重要的植物生理学研究意义。通过提取完整线粒体，才能准确有针对性的测定线粒体上的相关结构特性和酶活性，从而有利于开展植物呼吸，能量代谢和植物衰老相关研究。另一方面，提取完整的植物线粒体进而可以提取植物线粒体全基因组DNA，进行基因组组装，可以研究植物进化、分类、遗传多样性等方面；通过对基因组进行基因注释，有利于深入开展植物光合作用机理、植物能量代谢、植物抗氧化及次生代谢的研究；植物线粒体提取也可为揭示植物雄性不育的不育机理研究提供基础。

目前，常见的植物线粒体提取方法有以下三种：密度梯度离心纯化法，细胞器电泳分离法，流式细胞分选法。密度梯度离心纯化法是根据线粒体与其它细胞器具有不同的沉降系数和密度通过离心而将线粒体和其他细胞组分分开，离心法在分离中较为常见，但是由于微量组织和细胞中所含的线粒体很少并且离心体积过小，导致介质几乎无法形成稳定的梯度，线粒体在离心处理的过程中容易丢失，回收率较低，因此，离线粒体离心法并不适合小规模提取线粒体；细胞器电泳分离法是根据不同细胞器表面的负电荷密度各不相同，继而在电场中的电泳迁移率不同而达到线粒体的分离目的，自由流电泳技术已成功应用于酵母和拟南芥线粒体的分离，但是对于过氧物酶体、晚期胞内体而言，线粒体电迁移能力较差，在电泳的过程中容易产生沉淀，并且由于电泳本身固有的影响因素(焦耳热，电动力学变形)外，还有层流(流体力学变形)以及一些综合因素的影响(电流体力学变形等)，而且这些因素又常常相互关联，使整个过程变得极为复杂，导致在电泳后有条带扩散现象和稀释效应，因此，目前自由流电泳一般也只用于大规模样品的分离；流式细胞分选法是利用荧光染料标记线粒体并使被标记的线粒体携带电荷，通过高压偏转从而进行分离。已有人使用流式细胞法分离过大鼠肝脏和脾脏的线粒体。但由于线粒体远比细胞小，线粒体上带上的荧光染料也较少，使得分选时的信号较弱，回收率低，分离效果差。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，本发明提供一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法，该方法主要是基于植物细胞器及分级孔筛的特性，利用不同孔径的孔筛进行组合，选择性的对植物细胞器进行分级过滤，从而富集提取植物线粒体。

一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法，包括以下步骤：

1)材料制备：选取植物嫩叶样品制备叶肉细胞质悬浊液，将叶肉细胞质悬浊液稀释；

2)确定样品线粒体直径范围：利用光学显微镜观察步骤1)中所获得的稀释后叶肉细胞质悬浊液，计算其中线粒体的最大直径和最小直径；

3)分级孔筛选择：根据步骤2)中获得的线粒体的最大直径和最小直径选择孔筛板孔径，将选择的孔筛板组合并置于离心管内，获得置有分级孔筛板的离心管；

4)线粒体富集提取：取步骤1)中获得的稀释后的叶肉细胞质悬浊液加入步骤3)中制得的置有孔筛板的离心管中，经三次震荡、离心，收集两级孔筛板间的沉淀，沉淀稀释后可获得富集的线粒体悬浊液。

进一步的，上述步骤1)中所述的材料制备包括如下步骤：

a)选取新鲜的植物嫩叶组织样品并称重，以1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液浸泡，再置入组织匀浆机中匀浆，获得组织匀浆液；

b)将步骤a)中获得的组织匀浆液用纱布过滤，获得组织滤液；

c)取步骤b)中获得组织滤液进行离心，弃上清液，取沉淀即是萝卜叶肉细胞质悬浊液；

d)向步骤c)中获得的萝卜叶肉细胞质悬浊液中1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液，获得稀释的萝卜叶肉细胞质悬浊液。

进一步的，上述步骤3)中所述孔筛板为两块，一块孔筛板的孔径为线粒体的最大直径，另一款孔筛板孔径为线粒体的最小孔径。

进一步的，上述的两块孔筛板组合放入离心管中，孔径大的孔筛板置于孔径小的孔筛板的上方。

进一步的，上述步骤4)中所述的线粒体富集提取包括如下步骤：

S1取步骤d)中获得稀释后的萝卜叶肉细胞质悬浊液加入步骤3)中制得的置有孔筛板的离心管中，100rpm振荡后，在800-1000rmp转速下离心5-8min保留两级孔筛板间的沉淀；

S2将步骤S1中获得沉淀以1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液，置于新的置有孔筛的离心管中，100rpm振荡后，在800-1000rmp转速下离心5-8min保留两级孔筛板间的沉淀；

S3将步骤S2中获得沉淀以1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液，置于新的置有孔筛的离心管中，100rpm振荡后，在800-1000rmp转速下离心5-8min保留两级孔筛板间的沉淀；用1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液稀释，而获得富集的植物线粒体悬浊液。

本发明的有益效果：

本发明提供一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法，该方法利用简单的离心和筛孔过滤，操作简单且成本低。富集之前先对样品的线粒体进行显微镜镜检，来确定适合提取的筛孔直径。从而使得线粒体富集有较强的选择性，针对性和专一性。富集过程中，线粒体处于等渗状态，不进行剧烈的离心操作和振荡。提取过程温和，有效减少线粒体的丢失，提高了线粒体在提取过程中的回收率和完整性。

附图说明

图1萝卜叶片线粒体悬液的光学显微镜镜检效果(比例尺为5μm)。

具体实施方式

1、材料制备

1)选取新鲜的萝卜嫩叶并称重30g，置于150ml，0.35mol/L的NaCl等渗溶液内浸泡，再置入组织匀浆机，500rpm转速匀桨，获得萝卜嫩叶匀浆液。

2)将萝卜嫩叶匀浆液用3层100目纱布过滤，得到滤液。

3)取20ml滤液放入离心管中，离心机在500rpm转速下离心10分钟。

4)弃上清液，沉淀即是萝卜叶肉细胞质悬液(此步骤已去除大部分细胞核，所获得的萝卜叶肉细胞质悬液主要包含叶绿体、线粒体及其他细胞质碎片)。

5)向沉淀加入100ml，0.35mol/L NaCl等渗溶液，得到稀释的萝卜叶肉细胞质悬浮液，置于4℃下低温贮藏，备用。

2、确定样品线粒体直径范围

1)取步骤1中所得到的萝卜叶肉细胞质悬浮液一滴50μl，滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。

2)利用带有显微测微尺的暗视野光学显微镜，在40倍物镜×10倍目镜的放大倍数下，选择适当视野，统计20个线粒体的直径并逐一记录。

3)如步骤2)中方法统计随机分布的10个视野，合计记录200个线粒体，计算得到萝卜线粒体最大直径5μm和线粒体最小直径2μm。

3、分级孔筛选择

根据上一步的结果，选择两种尺寸分别为5μm和2μm的孔筛板。并将两种孔筛板组合，按照5μm孔筛板在上，2μm孔筛板在下的规则制备萝卜线粒体专用组合孔筛，并将组合孔筛置于等直径的50ml离心管内，制备3个这样的离心管备用分别标号为TUBE1、TUBE2及TUBE3。

4、线粒体富集提取

1)取步骤1中所得到的萝卜叶肉细胞质悬浮液30ml，加入离心管TUBE1内。先在低速振荡器内以100rpm震荡1min，再置入低温离心机内，1000rmp转速下低速离心5min。分拆离心管内的组合孔筛，去除5μm孔筛板之上的沉淀及2μm孔筛板之下的滤液。仅保留2μm孔筛板之上的沉淀。

2)把以上步骤得到的附着物用30ml 0.35mol/L NaCl等渗溶液稀释并置于离心管TUBE2内。先在低速振荡器内以100rpm震荡1min。再置入低温离心机内，1000rmp转速下低速离心5min。分拆离心管内的组合孔筛，去除5μm孔筛板之上的沉淀及2μm孔筛板之下的滤液。仅保留2μm孔筛板之上的沉淀。

3)再把以上步骤得到的二次下沉悬浮液用30ml 0.35mol/L NaCl等渗溶液稀释并置于离心管TUBE3内。先在低速振荡器内以100rpm震荡1min，再置入低温离心机内，1000rmp转速下低速离心5min。分拆离心管内的组合孔筛，去除5μm孔筛板之上的沉淀及2μm孔筛板之下的滤液。仅保留2μm孔筛板之上的沉淀。用30ml 0.35mol/L NaCl等渗溶液稀释从而得到萝卜线粒体悬液。

5、实验结果

(1)筛孔选择

富集之前先对样品的线粒体悬液进行显微镜镜检，结果见图1，图中所示箭头示例五个典型的线粒体，直径为3-5μm不等，从而来确定分别为5μm和2μm的孔筛板作为适合提取的筛孔板，使得线粒体富集有较强的选择性，针对性和专一性。

(2)提取效果对比

分别采用三种提取方法对萝卜的线粒体进行提取，即全部叶片提取法、经典的离心法和本专利的两级筛板法，通过对各自悬液中核基因组、叶绿体基因组、线粒体基因组的各自DNA的提取，经由二代测序数据后，分别在比对率和测序覆盖度上做映射对比，从而说明对线粒体的回收效果，结果如表1所示。

表1三种线粒体提取方法下萝卜各组分DNA比对情况的比较

本发明提供一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法，该方法利用简单的离心和筛孔过滤，操作简单且成本低。富集过程中，线粒体处于等渗状态，不进行剧烈的离心操作和振荡。提取过程温和，有效减少线粒体的丢失。由表1可知，从比对率上看，线粒体基因组在全部组分中所占比例越来越高，并且线粒体的测序覆盖度呈现数量级的增长。间接证明了该线粒体提取方法的高回收率和完整性。

Claims (5)

1.一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)材料制备：选取植物嫩叶样品制备叶肉细胞质悬浊液，将叶肉细胞质悬浊液稀释；

2)确定样品线粒体直径范围：利用光学显微镜观察步骤1)中所获得的稀释后叶肉细胞质悬浊液，计算其中线粒体的最大直径和最小直径；

3)分级孔筛选择：根据步骤2)中获得的线粒体的最大直径和最小直径选择孔筛板孔径，将选择的孔筛板组合并置于离心管内，获得置有分级孔筛板的离心管；

4)线粒体富集提取：取步骤1)中获得的稀释后的叶肉细胞质悬浊液加入步骤3)中制得的置有孔筛板的离心管中，经三次震荡、离心，收集两级孔筛板间的沉淀，沉淀稀释后可获得富集的线粒体悬浊液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的材料制备包括如下步骤：

a)选取新鲜的植物嫩叶组织样品并称重，以1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液浸泡，再置入组织匀浆机中匀浆，获得组织匀浆液；

b)将步骤a)中获得的组织匀浆液用纱布过滤，获得组织滤液；

c)取步骤b)中获得组织滤液进行离心，弃上清液，取沉淀即是萝卜叶肉细胞质悬浊液；

d)向步骤c)中获得的萝卜叶肉细胞质悬浊液中1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液，获得稀释的萝卜叶肉细胞质悬浊液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述孔筛板为两块，一块孔筛板的孔径为线粒体的最大直径，另一款孔筛板孔径为线粒体的最小孔径。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，两块孔筛板组合放入离心管中，孔径大的孔筛板置于孔径小的孔筛板的上方。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的线粒体富集提取包括如下步骤：

S1取步骤d)中获得稀释后的萝卜叶肉细胞质悬浊液加入步骤3)中制得的置有孔筛板的离心管中，100rpm振荡后，在800-1000rmp转速下离心5-8min保留两级孔筛板间的沉淀；

S2将步骤S1中获得沉淀以1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液，置于新的置有孔筛的离心管中，100rpm振荡后，在800-1000rmp转速下离心5-8min保留两级孔筛板间的沉淀；

S3将步骤S2中获得沉淀以1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液，置于新的置有孔筛的离心管中，100rpm振荡后，在800-1000rmp转速下离心5-8min保留两级孔筛板间的沉淀；用1:5～1:10质量体积比例加入NaCl等渗溶液稀释，而获得富集的植物线粒体悬浊液。