CN111440759B - 同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法 - Google Patents
同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111440759B CN111440759B CN202010151105.2A CN202010151105A CN111440759B CN 111440759 B CN111440759 B CN 111440759B CN 202010151105 A CN202010151105 A CN 202010151105A CN 111440759 B CN111440759 B CN 111440759B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chloroplast
- separation
- nucleus
- separating
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 title claims description 21
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 title claims description 21
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 title claims description 21
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 title claims description 21
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims abstract 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 23
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 claims description 10
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 claims description 9
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 claims description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 5
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 abstract description 22
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 abstract description 20
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 13
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 11
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 235000004035 Cryptotaenia japonica Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007641 Trefoil Factors Human genes 0.000 description 1
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound CCS(O)(=O)=O.OCCN1CCNCC1 DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种同时分离提取细胞核和叶绿体的方法,旨在解决现有分离提取方法中无法同时分离出高活性细胞核和叶绿体技术问题,其主要步骤包括:(1)取植株幼苗或叶片,剪碎后加入破碎缓冲液,研磨破碎后过滤得匀浆液,再经离心分离,弃上清液得沉淀物;(2)向上步骤所得沉淀物中加入分离缓冲液混匀得到重悬液,再将所述重悬液加至Percoll密度梯度分离液的上面,进行梯度离心分离;(3)分别抽取分离液梯度交接面处的叶绿体和底部沉淀物,再分别加入纯化缓冲液进行离心纯化分离,去上清液得对应的叶绿体和细胞核。本发明利用不同缓冲液对细胞核和叶绿体的分离提纯,具有操作简便,所得到的纯化后细胞核提取率高达80%,叶绿体的提取率高达90%。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物化学技术领域,具体涉及一种同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法。
背景技术
细胞核含有几乎所有的遗传信息,对基因表达和调控极其重要。随着基因组测序的发展,DNA纤维荧光原位杂交及大片段基因组文库的构建,对植物全基因组测序具有重要推动作用。而提取纯化的细胞核是制作DNA纤维和构建大片段基因组文库的基础。
而叶绿体是质体的一种,其是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器;双层膜结构使其与胞质分开,因其含叶绿素,故名为叶绿体,对叶绿体进行研究将有助于我们揭示其次生代谢物的合成机理,并进一步从分子水平对其叶绿体进行遗传改良以提高其次生代谢物的产量提供基础。
目前细胞核提取方法多数采用研磨植物组织或是先通过酶解法提取原生质体,然后再经绸布过滤、离心分离而获得细胞核。而目前植物叶绿体提取的方法也多是用离心分离的方法,但是不同来源的植物材料所需要的离心条件和提取介质则各不相同。
本发明人在长期的实践研究中发现,现有的玉米细胞核和叶绿体分离方法是两套互不兼容的分离体系,并且多采用蔗糖密度梯度离心,其主要缺陷为成本高、操作时间长,而残留的蔗糖成分会严重干扰到下游核酸、蛋白等相关的提取实验,而且纯化得到的是质量不佳的细胞核或叶绿体,特别是针对特殊且罕见的植株突变体,无法同时获得大量高纯度且有活性的细胞核和叶绿体,造成研究材料的极大的浪费。
因此,研究开发出一种可以兼顾提取分离细胞核和叶绿体,以提高分离细胞核和叶绿体的工作效率是十分必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,以解决当前无法同时获得大量高纯度、且可保持活性的细胞核和叶绿体的技术难题。
本发明创新了破碎工艺,采用对细胞无毒害作用的Percoll溶液构作为离介质,并建立了与之相匹配的可同时高效分离提取玉米细胞核和叶绿体的缓冲分离体系,不仅解决了分离所得细胞核和叶绿体相互污染的技术问题,而且可以显著提高分离效率和保持细胞器的完整性。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
设计一种同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,包括如下步骤:
(1)取玉米植株幼苗或叶片,剪碎后加入破碎缓冲液,研磨破碎后过滤得匀浆液,再经离心分离,弃上清液得沉淀物;
(2)向步骤(1)所得沉淀物中加入分离缓冲液混匀得到重悬液,再将所述重悬液加至Percoll密度梯度分离液的上面,进行梯度离心分离;
(3)分别抽取分离液梯度交界面处的叶绿体和底部沉淀物,再分别加入纯化缓冲液进行离心纯化分离,去上清液得对应的叶绿体和细胞核。
优选的,在所述步骤(1)中,以重量份计,所述破碎缓冲液的配制试剂包括:
MOPS 40~45份、NaCl 28~30份、KCl 55~65份、EDTA 6~8份、山梨醇180~185份。
所述破碎缓冲液还包括:在即将使用时加入的精胺0.3~0.5份、亚精胺0.6~0.8份和蔗糖850~860份。
优选的,在所述步骤(1)中,每研磨破碎3~5s后停顿5~10s,重复3~5次。
优选的,在所述步骤(2)中,以重量份计,所述分离缓冲液的配制试剂包括:
Hepes 115~120份、NaCl 20~25份、KCl 55~65份、EDTA 6~8份,抗坏血酸8~10份、精胺 0.3~0.5份、亚精胺0.6~0.8份。
优选的,在所述步骤(2)中,所述Percoll密度梯度分离液包括:
位于底层的体积分数35%的Percoll分离液和位于上层的体积分数20%的Percoll分离液,所述Percoll分离液是由对应体积比的Percoll和分离缓冲液配制而成。
优选的,在所述步骤(2)或/和步骤(3)中,离心分离的条件为:0~4℃,2000~3000g,离心6~10分钟。
优选的,在所述步骤(3)中,以重量份计,所述纯化缓冲液的配制试剂:
MOPS 40~45份、NaCl 26~30份、KCl 55~65份、EDTA 6~8份。
优选的,所述破碎缓冲液、分离缓冲液、Percoll密度梯度分离液以及纯化缓冲液使用前均在冰上预冷。
优选的,在所述步骤(1)中,研磨破碎采用榨汁机于0~4℃下间隔研磨破碎。
与现有技术相比,本发明的主要有益技术效果包括:
1.本发明综合考虑了细胞核和叶绿体在密度沉降、速率及大小上的差异,通过合理设置不同密度梯度Percoll缓冲分离体系,将置于介质顶部的细胞匀浆液分层,使不同的细胞器停留在不同的密度,从而实现细胞核和叶绿体的分离;相比于传统的蔗糖密度梯度,本发明Percoll密度梯度分离体系具有渗透性低、不穿透细胞、粘度低、密度高和无毒害等优点。
2.本发明所采用的研磨缓冲液能使研磨过程中的细胞器(叶绿体、细胞核)保持稳定,保护其不被破坏,可以同时得到活性高的细胞核和叶绿体,纯化后的细胞核提取率≥80%,叶绿体的提取率≥90%。
3.本发明通过合理设置相匹配的研磨缓冲体系、分离缓冲体系及纯化缓冲体系,以协同接续提高分离效率和保持细胞器的完整性;比如,研磨缓冲液中的亚精胺、精胺以及蔗糖成分协同作用可以稳定细胞核,而山梨醇可以调节研磨缓冲液的渗透势,稳定叶绿体结构;研磨缓冲液能保证在研磨过程中细胞器稳定,不被破坏;纯化缓冲液和Percoll密度梯度分离液兼容性良好,同时保证纯化提取过程中的细胞器稳定,而且纯化缓冲液在保证细胞器稳定的同时不会干扰下游实验,能最大限度的保留细胞核和叶绿体的生物活性。
4.本发明方法尤其适用于有限样品量(如一些特殊少见的玉米突变体等)的细胞器提取试验,其可有效提高细胞核和叶绿体的提取数量,为科研提供相当数量的高质量的科研用细胞器,并节省植物材料,简化后续试验操作。
附图说明
图1为本发明的工艺流程示意图。
图2为本发明分离提取到的玉米细胞核和叶绿体后的照片;其中,a为常规的蔗糖密度梯度法分离所得叶绿体镜检照片,b为本发明所得叶绿体镜检照片,c为本发明所得细胞核经DAPI染色的镜检照片,d为本发明中经Percoll密度梯度分离体系进行梯度离心分层后的照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式,但以下实施例只是用来详细说明本发明,并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明,均为常规仪器设备;所涉及的原料和试剂,如无特别说明,均为市售常规原料和试剂;所涉及的检测、测试、制备方法等,如无特别说明,均为常规方法。
实施例1
同时分离提取玉米叶片细胞核和叶绿体的方法,参见图1,包括如下步骤:
(1)取在16h光/8h暗,28℃/25℃(光/暗)及相对湿度60%的条件下水培至三叶期的玉米幼苗叶片,取4g玉米幼苗顶部4cm,将玉米幼苗叶片粗剪成5×5 mm的小块,放入榨汁机中,加入75mL破碎缓冲液,置冰箱中4℃下间隔研磨破碎,每5s停顿6s,重复4次,再用300目的筛网过滤匀浆液于150 mL锥形瓶中,置低温离心机中于4℃、1000g下离心5分钟,弃上清,所得沉淀物为含叶绿体和细胞核的粗提取物;
(2)向步骤(1)中所得沉淀物中加入0.5 mL分离缓冲液得到重悬液,再将其加至Percoll密度梯度分离液(上层为2mL的20%的Percoll分离液,下层为2mL的35%的Percoll分离液)上面,在4℃、2000g条件下离心分离10分钟,使其分层(参见图2中d);
(3)用胶头吸管从Percoll密度梯度分离液上、下层交界部位收集叶绿体,加入0.5mL纯化缓冲液稀释,于4℃,3000g条件下离心10 分钟,弃上清,所得沉淀即为纯化后的叶绿体,显微镜下观察形态及纯度(参见图2中b);用胶头吸管将离心管底部沉淀物吸取,加入0.5 mL纯化缓冲液,轻弹离心管使沉淀松散后,4℃,3000 g离心10 分钟,弃上清,沉淀即为纯化后的细胞核,DAPI染色观察后,显微镜下观察形态及纯度(参见图2中c)。
所述破碎缓冲液是由MOPS、NaCl、KCl、EDTA、山梨醇及使用前即时加入的精胺、亚精胺和蔗糖溶于水配制而成,且溶液中的各组分的终浓度分别为:20 mM MOPS、50 mMNaCl、80 mM KCl、2.5 mM EDTA、100mM山梨醇、0.2mM精胺和0.5mM亚精胺,缓冲液终pH值为7.5。
所述分离缓冲液是由Hepes、NaCl、KCl、EDTA,抗坏血酸、精胺、亚精胺溶于水配制而成,各成分的终浓度为:50 mM Hepes、40 mM NaCl、80 mM KCl、2.5 mM EDTA,5 mM抗坏血酸、0.2mM精胺、0.5mM亚精胺,缓冲液终pH值为7.5。
所述纯化缓冲液是由MOPS、NaCl、KCl、EDTA溶于水配制而成,各成分的终浓度为:20mM MOPS、50mM NaCl、80mM KCl、2.5mM EDTA,缓冲液终pH值为7.5。
在配制以上各缓冲溶液时,可先将需要用到MOPS(3-吗啉丙磺酸)配制成相应的母溶液,再用稀NaOH调节MOPS溶液pH值至7.5,以使MOPS能充分溶解,再与其它试剂混配;同样的,将EDTA(乙二胺四乙酸)配制成相应的母溶液,再用稀NaOH调节EDTA溶液pH值至8.0,以使EDTA能充分溶解,方便使用;而同样的,取Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)配制成相应的母溶液,再用稀NaOH调节Hepes溶液pH值至8.0,以使其充分溶解,方便添加使用。
20%的Percoll分离液:由0.4 mL的Percoll与1.6 mL的分离缓冲液混合制成;
35%的Percoll分离液:由0.7 mL的Percoll与1.3 mL的分离缓冲液混合制成。
以上破碎缓冲液、分离缓冲液、Percoll分离液以及纯化缓冲液使用前均在冰上预冷;离心机使用前预冷至4℃左右。
对比例
在实施实施例1中所述操作的同时,设置对照试验1(常规细胞核提取)和对照试验2(常规叶绿体提取法),其中对照试验1和对照试验2在提取纯化过程中仅采用了下表1中的缓冲液。纯化的细胞核先经过DAPI染色后,转移至细胞计数板上并在荧光显微镜下,并统计细胞计数板上5个固定面积区域中形态完整的细胞核数目与总细胞核数目的比值,随后求这5个比值的平均值评估提取完成细胞核的百分比;纯化后的叶绿体直接转移至细胞计数板上并在显微镜下,统计计数板上5个固定面积的区域中形态完整、大小适中的叶绿体与总叶绿体数目的比值,随后求求这5个比值的平均值评估提取完成叶绿体的效率;其它主要操作顺序步骤与实施例1基本相同。相关的试验统计结果参见表1。
从附图2a中可以看出,传统方法提取的叶绿体中混杂有细胞核,且叶绿体破碎者居多,完整性差;从附图2b中可以看出,本实施例所提取到的叶绿体分布稠密,个体形态完整且少有杂质;从附图2c中可以看出,本实施例所提取到的细胞核分布稠密,个体形态完整且少有杂质;从附图2d中可以看出,本实例的密度体系分层清晰明确。
结合表1中所得到的数据指标可知,本发明所建立的研磨-分离-纯化体系可以同时有效的分离出高纯度的细胞核和叶绿体,且分离得到的细胞器完整性好,生物活性好。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明,但是,所属技术领域的技术人员能够理解,在不脱离本发明宗旨的前提下,还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更,或者是步骤方法的等同替代,从而形成多个具体的实施例,均为本发明的常见变化范围,在此不再一一详述。
Claims (7)
1.一种同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)取玉米幼苗或叶片,剪碎后加入破碎缓冲液,研磨破碎后过滤得匀浆液,再经离心分离,弃上清液得沉淀物;
所述破碎缓冲液包括:20 mM MOPS、50 mM NaCl、80 mM KCl、2.5 mM EDTA、100mM山梨醇、0.2mM精胺、0.5mM亚精胺和蔗糖;
(2)向步骤(1)所得沉淀物中加入分离缓冲液混匀得到重悬液,再将所述重悬液加至Percoll密度梯度分离液的上面,进行梯度离心分离;
所述分离缓冲液包括:50 mM Hepes、40 mM NaCl、80 mM KCl、2.5 mM EDTA,5 mM抗坏血酸、0.2mM精胺、0.5mM亚精胺;
(3)分别抽取分离液梯度交界面处的叶绿体和底部沉淀物,再分别加入纯化缓冲液进行离心纯化分离,去上清液得对应的叶绿体和细胞核。
2.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,其特征在于,在所述步骤(1)中,每研磨破碎3~5s后停顿5~10s,重复3~5次。
3.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,其特征在于,在所述步骤(2)中,所述Percoll密度梯度分离液包括:
底层为体积分数35%的Percoll分离液和上层为体积分数20%的Percoll分离液;所述Percoll分离液是由Percoll和分离缓冲液按对应的体积比配制而成。
4.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,其特征在于,在所述步骤(2)或/和步骤(3)中,离心分离的条件为:0~4℃,2000~3000g,离心6~10分钟。
5.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,其特征在于,在所述步骤(3)中,所述纯化缓冲液包括:20mM MOPS、50mM NaCl、80mM KCl、2.5mM EDTA。
6.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,其特征在于,所述破碎缓冲液、分离缓冲液、Percoll密度梯度分离液或/和纯化缓冲液使用前在冰上预冷。
7.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法,其特征在于,在所述步骤(1)中,研磨破碎采用榨汁机于0~4℃下间隔研磨破碎。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010151105.2A CN111440759B (zh) | 2020-03-06 | 2020-03-06 | 同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010151105.2A CN111440759B (zh) | 2020-03-06 | 2020-03-06 | 同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111440759A CN111440759A (zh) | 2020-07-24 |
CN111440759B true CN111440759B (zh) | 2021-01-15 |
Family
ID=71627323
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010151105.2A Expired - Fee Related CN111440759B (zh) | 2020-03-06 | 2020-03-06 | 同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111440759B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114136930B (zh) * | 2021-01-14 | 2024-08-13 | 北京林业大学 | 一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法 |
CN113061567A (zh) * | 2021-04-06 | 2021-07-02 | 石河子大学 | 一种橡胶草叶绿体提取方法 |
CN114277094B (zh) * | 2021-12-24 | 2024-02-27 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 提取植物细胞核的裂解液 |
CN114277093B (zh) * | 2021-12-24 | 2024-02-27 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种提取植物细胞核的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109187401A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-11 | 南京大学 | 测定石墨烯在水稻体内亚细胞分布的方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104277974B (zh) * | 2013-07-03 | 2017-09-15 | 中国科学院植物研究所 | 一种分离产氢衣藻叶绿体的方法 |
CN108179131A (zh) * | 2016-12-08 | 2018-06-19 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种旱柳叶片完整叶绿体的制备方法 |
CN106967714B (zh) * | 2017-06-07 | 2019-09-13 | 唐山师范学院 | 条形叶植物叶绿体dna的高纯度高质量提取方法 |
US10828262B2 (en) * | 2017-07-19 | 2020-11-10 | Hangzhou UMotor Biotech Co., LTD. | Biomembrane, closed structure with biomembrane characteristics or cellular compartment derived from natural sources and/or self-assembly techniques, preparation method and applications thereof |
-
2020
- 2020-03-06 CN CN202010151105.2A patent/CN111440759B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109187401A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-11 | 南京大学 | 测定石墨烯在水稻体内亚细胞分布的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111440759A (zh) | 2020-07-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111440759B (zh) | 同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法 | |
CN109112093B (zh) | 一种青蒿原生质体高效分离及瞬时转化的方法 | |
CN105316275B (zh) | 盐生草叶片细胞液泡的提取方法 | |
CN102533737B (zh) | 一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法 | |
CN102443564B (zh) | 一种提取梨花粉管细胞核的方法 | |
CN100587062C (zh) | 一种从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法 | |
CN114058564B (zh) | 一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用 | |
CN106167787B (zh) | 一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法 | |
CN113444678A (zh) | 制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒 | |
CN102250825A (zh) | 一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法 | |
CN113462633A (zh) | 甘蔗幼叶不同发育时期原生质体分离及提取方法 | |
CN104388380B (zh) | 一种提取梨花粉管液泡的方法 | |
WO2020103182A1 (zh) | 一种利用分级孔筛富集植物线粒体的方法 | |
CN114807008B (zh) | 一种番茄叶片原生质体单细胞悬液的制备方法及应用 | |
GB2614770A (en) | Enzymolysis solution for preparing protoplast of lonicera caerulea L. preparation method and use thereof | |
CN113249296B (zh) | 一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法 | |
CN110438062A (zh) | 一种毛竹笋高活性线粒体的提取纯化及鉴定方法 | |
CN211190237U (zh) | 一种圆台形钢丝网研钵 | |
CS244812B2 (en) | Production method of propiferating plant cell agglomerates | |
CN113325201A (zh) | 一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法 | |
CN111647549B (zh) | 一种动植物中单细胞的分离方法 | |
CN218404176U (zh) | 一种精子优选装置-ⅱ型 | |
CN113637628B (zh) | 一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法 | |
CN110846269B (zh) | 一种提取梨花粉管质膜的方法 | |
CN112391370B (zh) | 一种制备油松针叶原生质体的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210115 |