CN112391370B

CN112391370B - 一种制备油松针叶原生质体的方法

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Publication number: CN112391370B
Application number: CN201910743114.8A
Authority: CN
Inventors: 钮世辉; 余峰; 彭莉; 马晓涵; 郑嘉靖; 韩方旭
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2023-02-07
Anticipated expiration: 2039-08-13
Also published as: CN112391370A

Abstract

本发明公开了一种制备油松针叶原生质体的方法。本发明首先公开了用于制备油松针叶原生质体的组合物，包括纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶；所述组合物中，纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶的质量比为25∶4∶10。本发明进一步公开了包含上述组合物的酶解液和成套试剂及油松针叶原生质体的制备方法。本发明以油松幼嫩针叶作为材料，通过调节酶解体系和洗涤体系，建立油松原生质体制备体系。该体系制备得到的原生质体数量及活性都较好，为后期油松功能基因的亚细胞定位、蛋白质互作、下游靶基因筛选、单细胞测序、原生质体悬浮培养等研究提供了技术保障。

Description

一种制备油松针叶原生质体的方法

技术领域

本发明涉及植物细胞生物技术领域，具体涉及一种制备油松针叶原生质体的方法。

背景技术

植物原生质体是去掉细胞壁由质膜包被的仍然保持生活力的细胞团，与完整的植物细胞相比，植物原生质体较为脆弱，但其一样含有完整遗传物质，具有全能性，具有再生新植株的潜能。原生质体可以高效摄取微生物，细胞器和核酸等大分子物质，还可以与其不亲和植株的原生质体相互融合进而分化产生新植株。植物原生质体广泛用于细胞壁再生，细胞分化与分裂，胚胎形成，细胞器摄入，病毒侵染，生物与非生物胁迫，信号转导，细胞膜通透性及离子转运，蛋白亚细胞定位，基因功能验证等研究，是一种重要的基础理论研究的多用途细胞体系。

植物细胞壁的主要成分为纤维素，半纤维素和果胶。常用的原生质体制备方法为酶解法。酶解法制备原生质体，在被子植物上应用较多，在裸子植物上应用较少，目前，已经有多种被子植物实现了原生质体的分离条件的优化，如苹果(潘增光.苹果原生质体培养再生及融合研究[D].华中农业大学，1998.)，橡胶树((王凉洁.橡胶树叶肉细胞原生质体的制备及瞬时表达系统对植物免疫反应的检测[D].海南大学，2014.)，桑树(羿德磊，王海朋，崔为正，等.桑树原生质体分离条件的优化试验[J].蚕业科学，2012，38(02)：204-209.)等，此外，国内外已经开发出成熟的拟南芥原生质体制备体系(Yoo S D，Cho Y H，SheenJ.Arabidopsis mesophyll protoplasts：a versatile cell system for transientgene expression analysis[J].Nat Protoc，2007，2(7)：1565-1572.)。在针叶树中，国外对于火炬松(Pinustaeda L.)等研究基础较好的树种开发了原生质体制备体系(Wu F H，Shen S C，Lee LY，et al.Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsisprotoplast isolation method[J].Plant Methods，2009，5：16.；GOMEZ-MALDONADO J，CRESPILLO R，AVILA C，et al.Efficient Preparation of Maritime Pine(Pinuspinaster)Protoplasts Suitable for Transgene[J].Plant Molecular BiologyReporter，2001.；唐巍，欧阳藩，郭仲琛.影响火炬松胚性悬浮细胞原生质体的胚胎发生的因素(英文)[J].Developmental&Reproductive Biology，1997(02)：56-63.)，但这些体系分离效率低且分离后的原生质体状态差，难以进行后续实验。

油松是中国的特有乡土树种，主要分布于中国华北、西北及东北的14个省市自治区，生态适生区达300kM²。油松具有抗干旱、耐瘠薄、适生范围广、生长速度稳定等特点，是重要用材、生态和景观树种，具有重要的经济、生态和社会价值。作为针叶树的一种，油松是研究裸子植物的重要的材料。但是由于成年油松体细胞具有很低的再生能力，使得对于油松的生物学研究一直处于瓶颈期。

因此，高效制备油松原生质体不仅为油松的功能基因亚细胞定位、蛋白质互作、下游靶基因筛选、单细胞测序、原生质体悬浮培养等研究提供了技术保障，也为其他物种原生质体分离的研究提供了参考。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为如何高效的制备油松针叶的原生质体。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于制备油松针叶原生质体的组合物。

上述组合物包括纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶；所述组合物中，纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶的质量比为25∶4∶10。

上述用于制备油松针叶原生质体的组合物可只由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶组成；也还可包括甘露醇、KCl、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、RbCl和牛血清蛋白(BSA)。

所述纤维素酶由纤维素酶R10和纤维素酶RS组成，所述纤维素酶R10和纤维素酶RS的质量比为3∶2；所述果胶酶为果胶酶Y23。

上述组合物在制备油松针叶原生质体中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明进一步提供了一种用于制备油松针叶原生质体的酶解液。

上述酶解液包括纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶；所述纤维素酶在酶解液中的含量为25g/L；所述果胶酶在酶解液中的含量为4g/L；所述半纤维素酶在酶解液中的含量为10g/L。

上述酶解液的溶质可只由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶组成；也还可包括甘露醇、KCl、MES、RbCl和牛血清蛋白。

上述酶解液中，所述纤维素酶由纤维素酶R10和纤维素酶RS组成，所述纤维素酶R10和纤维素酶RS的含量(即质量含量)比为3∶2；所述果胶酶为果胶酶Y23。

上述酶解液中，还包括甘露醇；其中，所述甘露醇在酶解液中的含量为0.55～0.65mol/L。

上述酶解液中，还包括KCl、MES、RbCl、牛血清蛋白和溶剂；其中，所述KCl在酶解液中的含量为0.02mol/L；所述MES在酶解液中的含量为0.2mol/L；所述RbCl在酶解液中的含量为0.01mol/L；所述牛血清蛋白在酶解液中的含量为1g/L。

上述酶解液中所述溶剂为水。

上述酶解液中，所述MES以MES溶液的形式加入到酶解液中，所述MES溶液的pH值为5.7。

上述酶解液在制备油松针叶原生质体中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明进一步还提供了用于制备油松针叶原生质体的成套试剂。

上述成套试剂，含有A和B；

所述A为上述组合物或酶解液，所述B为W5′溶液；

其中，所述W5′溶液由RbCl、NaCl、KCl、MES和溶剂组成；其中，所述RbCl在所述W5′溶液的含量为0.125mol/L，所述NaCl在所述W5′溶液的含量为0.154mol/L，所述KCl在所述W5′溶液的含量为0.005mol/L，所述MES在所述W5′溶液的含量为0.02mol/L。

上述成套试剂中，所述溶剂为水。

上述成套试剂中，所述MES以MES溶液的形式加入到W5′溶液中，所述MES溶液的pH值为5.7。

上述成套试剂中，还包括甘露醇或甘露醇溶液。

上述成套试剂在制备油松针叶原生质体中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种油松针叶原生质体的制备方法，包括以下步骤：

1)将油松针叶在上述酶解液中进行酶解得到酶解后的针叶；

2)将酶解后的针叶转入上述W5′溶液进行处理，得到油松针叶原生质体。

上述制备方法中，还包括在步骤1)之前将针叶放入到0.6mol/L甘露醇溶液中浸泡1小时后再进行酶解。

上述制备方法中，还包括在步骤1)之前将针叶进行分割后再进行酶解或放入到0.6mol/L甘露醇溶液中浸泡。

上述制备方法中，所述油松针叶为幼嫩针叶。

上述制备方法中，每g的油松针叶至少加入40mL的酶解液。

上述制备方法中，所述酶解的条件为在20-25℃黑暗条件下静置8～12h。

上述制备方法中，所述步骤2)的处理条件为在20-25℃避光条件下反应30min。

本发明以油松幼嫩针叶作为材料，通过调节酶解体系和洗涤体系，建立油松原生质体制备体系。通过观察结果表明酶解液体系中纤维素酶R10、果胶酶Y23、纤维素酶RS、半纤维素酶时的酶解效果较好，W5溶液中的Ca²⁺全部替换成Rb⁺能够更好维持原生质体活性，酶解液采用0.6mol/L甘露醇溶液能较好维持原生质体渗透压稳定。通过在显微镜下制片观察，本发明通过油松原生质体制备体系制备得到的原生质体数量及活性都较好，为后期油松功能基因的亚细胞定位、蛋白质互作、下游靶基因筛选、单细胞测序、原生质体悬浮培养等研究提供了技术保障。

附图说明

图1为实施例1油松原生质体制备体系制备得到的油松针叶原生质体悬浮液和对比例1拟南芥原生质体制备体系制备得到的拟南芥叶片原生质体悬浮液和油松针叶原生质体悬浮液。

图2为实施例1得到的油松原生质体悬浮液在光学显微镜下的观察结果；图中，从左到右依次为依次明场图、叶绿体图和合成图。

图3为单个原生质体在激光共聚焦显微镜下的观察结果；图中A为实施例1制备得到的油松单个原生质体在激光共聚焦显微镜下的观察结果，从左到右逐次放大；B为对比例1制备得到的拟南芥单个原生质体在激光共聚焦显微镜下的观察结果，从左到右逐次放大。

图4为由实施例1中得到的原生质体经过DAPI染色后在荧光显微镜下的观察结果；A为合成图，B为核酸染色图，C为叶绿体图，D为明场图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例和对比例中的纤维素酶R-10为yakult公司货号为L0012的产品，其参数如下：最优的pH值为5.7，最优温度为26℃。

下述实施例和对比例中的果胶酶Y23为yakult公司货号为DEC002的产品，其参数如下：最优的pH值为5.7，最优温度为26℃。

下述实施例和对比例中的纤维素酶RS为yakult公司货号为L0011的产品，其参数如下：最优的pH值为5.7，最优温度为26℃。

下述实施例和对比例中的半纤维素酶为yakult公司货号为H2125的产品，其参数如下：最优的pH值为5.7，最优温度为26℃。

下述实施例和对比例中的甘露醇为sigema公司的产品。

下述实施例和对比例中的油松材料的获得：

选取来自同一株的油松种子600粒，放入清水浸泡的水苔中，放置于光照时间16h、黑暗时间8h的气候箱中进行萌发。2周后，选取生长状态的一致的480棵油松幼苗，用锋利的手术刀片去除根部，另外选择一些针叶分割成5cm长的小段，得到叶条，将叶条随机分为24份，每份0.5g。

实施例1油松针叶原生质体的制备

利用本发明油松原生质体制备体系制备油松针叶原生质体的具体方法包括如下步骤：

1、取一份油松叶条叶条置于0.6mol/L甘露醇溶液中浸泡1小时；

其中，所述甘露醇溶液为称取甘露醇，溶于纯水中，制得0.6mol/L的甘露醇溶液。

2、将浸泡的叶条，放入20mL酶解液中酶解10h(室温，黑暗，静置)，用镊子将叶条从酶解液中取出，得到酶解后的叶条；

其中，所述酶解液由纤维素酶R10、果胶酶Y23、纤维素酶RS、半纤维素酶、甘露醇、KCl、MES、RbCl、牛血清蛋白和ddH₂O组成；其中，纤维素酶R10在酶解液中的含量为15g/L、果胶酶Y23在酶解液中的含量为4g/L、纤维素酶RS在酶解液中的含量为10g/L、半纤维素酶在酶解液中的含量为10g/L、甘露醇在酶解液中的含量为0.6mol/L、KCl在酶解液中的含量为0.02mol/L；MES在酶解液中的含量为0.2mol/L、RbCl在酶解液中的含量为0.01mol/L、牛血清蛋白在酶解液中的含量为1g/L。

20mL酶解液的制备方法包括如下步骤：

依次向离心管中加入纤维素酶R10 0.3g、果胶酶Y23 0.08g、纤维素酶RS 0.2g、半纤维素酶0.2g、1M甘露醇溶液12ml、2M KCl溶液0.2ml、2M MES(pH＝5.7)溶液2ml混合得到溶液，将溶液在55℃水浴10min，冷却至室温，向冷却的溶液依次加入1M RbCl溶液0.2mL、牛血清蛋白溶液(10％BSA)0.2mL，再加入ddH₂O至酶解液总体积为20mL，得到酶解液。

3、酶解后的叶条放到15mLW5′溶液中，避光，以40rpm的转速在室温条件下反应30min，使得原生质体释放出来，获得上清液和叶条；

其中，所述W5′溶液由RbCl、NaCl、KCl、MES和ddH₂O组成；其中，所述RbCl在所述W5′溶液的含量为0.125mol/L，所述NaCl在所述W5′溶液的含量为0.154mol/L，所述KCl在所述W5′溶液的含量为0.005mol/L，所述MES在所述W5′溶液的含量为0.02mol/L。

100mLW5′溶液的制备方法包括如下步骤：

依次向试剂瓶中加入1M RbCl溶液12.5mL、1.54M NaCl溶液10mL、2M KCl溶液0.25mL、2M MES(pH＝5.7)溶液lmL，再加入ddH₂O至W5′溶液总体积为100mL。

4、在叶条中加入5mLW5′溶液，来回颠倒10-20次清洗叶条，吸取上清液，与步骤3得到的上清液混合得到混合溶液。重复该步骤7次(以提高原生质体产量)。用75μm的尼龙网过滤上述混合溶液，并将滤液放在冰上放置30min后去除上清液，加入预冷的10mLW5′溶液中重悬原生质体，在冰上放置30min后去除上清液，再加入预冷的10mLW5′溶液中重悬原生质体，得到如图1所述的油松针叶原生质体悬浮液。从图中可以看出，油松原生质体悬浮液呈现草绿色，说明得到了数量较多的原生质体，是由于原生质体内的叶绿体的绿色使得悬浮液呈现草绿色。

5、从油松针叶原生质体悬浮液取20uL滴在血球计数板上计数，在光学显微镜下观察，如图2所示，为40*10倍镜下，可以看到视野中有数量可观的，形态良好，结构完整无破损的油松原生质体。通过统计油松针叶原生质体悬浮液含约3×10⁵个油松针叶原生质体。将油松针叶原生质体悬浮液放置在20h后，在光学显微镜下观察，可以看出损失了10％。

在激光共聚焦显微镜下的观察油松单个原生质体，如图3所示，油松原生质体形态良好，结构完整，叶绿体含量多。

将油松原生质体进行DAPI染色，观察在荧光显微镜下单个原生质体的形态，如图4所示，在荧光显微镜下，经过DAPI染色后，单个原生质体的形态保持完整，无破损，同时细胞核内的物质呈现蓝色，叶绿体也呈现绿色，说明本发明方法油松原生质体制备体系制备得到的油松原生质体活性较好。

对比例1拟南芥叶片原生质体和油松针叶原生质体的制备

拟南芥原生质体制备体系制备油松针叶原生质体的具体方法包括如下步骤：

1、取一份油松叶条置于0.4mol/L甘露醇溶液中浸泡1小时；

其中，所述甘露醇溶液为称取甘露醇，溶于纯水中，制得0.4mol/L的甘露醇溶液。

2、将浸泡的叶条，放入20mL酶解液中酶解3h(室温，黑暗，静置)，用镊子将叶条从酶解液中取出，得到酶解后的叶条；

其中，所述酶解液由纤维素酶R10、浸解酶R10、甘露醇、KCl、MES、CaCl₂、牛血清蛋白和ddH₂O组成；其中，纤维素酶R10在酶解液中的含量为15g/L、浸解酶R10在酶解液中的含量为4g/L、甘露醇在酶解液中的含量为0.4mol/L、KCl在酶解液中的含量为0.02mol/L；MES在酶解液中的含量为0.2mol/L、CaCl₂在酶解液中的含量为0.01mol/L、牛血清蛋白在酶解液中的含量为1g/L。

20mL酶解液的制备方法包括如下步骤：

依次向离心管中加入纤维素酶R10 0.3g、浸解酶R10 0.08g、1M甘露醇溶液8ml、2MKCl溶液0.2ml、2M MES(pH＝5.7)溶液2ml混合得到溶液，将溶液在55℃水浴10min，冷却至室温，向冷却的溶液依次加入1M CaCl₂溶液0.2mL、牛血清蛋白溶液(10％BSA)0.2mL，再加入ddH₂O至酶解液总体积为20mL，得到酶解液。

3、酶解后的叶条用75μm的尼龙网过滤酶解之后的溶液，并将滤液放在冰上，滤液4℃140g离心2min。

4、用剪过的枪头吸去上清液，用W5溶液温和重悬，重悬溶液4℃150g离心2min。该步骤重复一次。

其中，所述W5溶液由CaCl₂、NaCl、KCl、MES和ddH₂O组成；其中，所述CaCl₂在所述W5溶液的含量为0.156mol/L，所述NaCl在所述W5溶液的含量为0.0154mol/L，所述KCl在所述W5溶液的含量为0.0125mmol/L，所述MES在所述W5溶液的含量为0.02mmol/L。

100mL W5溶液的制备方法包括如下步骤：

依次向试剂瓶中加入12.5mMCaCl₂溶液12.5mL、154mMNaCl溶液10mL、5mMKCl溶液0.25mL、2mM MES(pH＝5.7)溶液1mL，再加入ddH₂O至W5溶液总体积为100mL。

5、用剪过的枪头吸去上清液，用10mLW5溶液温和重悬，得到的悬浮液在冰上放置30min得到如图1所示的油松针叶原生质体悬浮液。从图中可以看出，油松原生质体悬浮液呈现很淡的绿色，说明得到的油松原生质体不多，该体系无法获得质量较好的油松原生质体。

从油松针叶原生质体悬浮液取20uL滴在血球计数板上计数，在光学显微镜下观察，视野中观察不到明显的油松原生质体。

拟南芥原生质体制备体系制备拟南芥叶片原生质体的具体方法包括如下步骤：

1、将拟南芥叶片切成5mm宽的叶条0.5g，置于0.4mol/L的甘露醇溶液中浸泡1小时；

2、将浸泡的叶条，放入20mL酶解液中酶解3h(室温，黑暗，50rpm)，用镊子将叶条从酶解液中取出，得到酶解后的叶条；

其中，所述酶解液由纤维素酶R10、浸解酶R10、甘露醇、KCl、MES、CaCl₂、牛血清蛋白和ddH₂O组成；其中，纤维素酶R10在酶解液中的含量为15g/L、浸解酶R10在酶解液中的含量为4g/L、甘露醇在酶解液中的含量为0.4mol/L、所述KCl在酶解液中的含量为0.02mol/L；所述MES在酶解液中的含量为0.2mol/L、所述CaCl₂在酶解液中的含量为0.01mol/L、所述牛血清蛋白在酶解液中的含量为1g/L。

20mL酶解液的制备方法包括如下步骤：

其中，所述W5溶液由CaCl₂、NaCl、KCl、MES和ddH2O组成；其中，所述CaCl₂在所述W5溶液的含量为0.156mol/L，所述NaCl在所述W5溶液的含量为0.0154mol/L，所述KCl在所述W5溶液的含量为0.0125mmol/L，所述MES在所述W5溶液的含量为0.02mmol/L。

100mL W5溶液的制备方法包括如下步骤：

5、用剪过的枪头吸去上清液，用10mL W5反应液温和重悬，得到的悬浮液在冰上放置30min得到如图1所示的拟南芥叶片原生质体悬浮液。从图中可以看出，该悬浮液同样呈现草绿色，说明得到了数量较多的拟南芥原生质体。

将得到的拟南芥叶片原生质体置于在光学显微镜下观察，观察到良好状态和可观数量的拟南芥叶片原生质体，通过统计拟南芥叶片原生质体悬浮液含约2×10⁵个拟南芥叶片原生质体。

在激光共聚焦显微镜下的观察拟南芥叶片单个原生质体，如图3所示，拟南芥原生质体制备体系制备得到的拟南芥原生质体形态良好，结构完整，叶绿体含量多。

对比例1和实施例1的结果说明，现有的拟南芥原生质体制备体系虽然能制备质量较好的拟南芥原生质体，但该方法在油松上不适用，而本发明提供的油松原生质体制备体系制备得到的油松原生质体与现存拟南芥原生质体制备体系制备得到的拟南芥原生质体的效果一样，即本发明提供的油松原生质体制备体系能制备得到质量较好的油松针叶原生质体。

对比例2油松针叶原生质体的制备

1、取八份油松叶条分别置于0.6mol/L甘露醇溶液中浸泡1小时；

2、将浸泡的8份叶条，分别放入20mL8份不同的酶解液中酶解10h(室温，黑暗，静置)，用镊子将叶条从酶解液中取出，得到酶解后的叶条；

所述酶解液中酶可以为纤维素酶R10、果胶酶Y23、纤维素酶RS、半纤维素酶、浸解酶R10中一种或多种，具体见表1，所述酶解液中其余组分及其含量均为甘露醇在酶解液中的含量为0.6mol/L、KCl在酶解液中的含量为0.02mol/L；MES在酶解液中的含量为0.2mol/L、RbCl在酶解液中的含量为0.01mol/L、牛血清蛋白在酶解液中的含量为1g/L。

表1酶解液中酶的含量

酶解液组别	1	2	3	4	5	6	7	8
									纤维素酶R10	15g/L	15g/L	15g/L	25g/L	20g/L	15g/L	25g/L	15g/L
纤维素酶RS	-	-	-	-	-	10g/L	10g/L	10g/L
									半纤维素酶	-	-	-	-	-	-	-	10g/L
浸解酶R10	4g/L	-	4g/L	4g/L	4g/L	-	-	-
									果胶酶Y23	-	4g/L	4g/L	6g/L	2.5g/L	4g/L	4g/L	4g/L

注：“-”表示不含有该组分

20mL酶解液的制备方法包括如下步骤：

按照表1中酶解液中各酶的含量分别向8个离心管中依次加入各酶(纤维素酶R10和/或果胶酶Y23和/或纤维素酶RS和/或半纤维素酶和/或浸解酶R10)和1M甘露醇溶液12ml和2M KCl溶液0.2ml和2M MES(pH＝5.7)溶液2ml混合得到溶液，将溶液在55℃水浴10min，冷却至室温，向冷却的溶液依次加入1M RbCl溶液0.2mL和牛血清蛋白溶液(10％BSA)0.2mL，再加入ddH₂O至酶解液总体积为20mL，得到酶解液1-8。

3、8份酶解后的叶条分别放到8份15mL W5′溶液中，避光，以40rpm的转速在室温条件下反应30min，使得原生质体释放出来，获得8份上清液和8份叶条；

100mLW5′溶液的制备方法包括如下步骤：

依次向试剂瓶中加入1M RbCl溶液12.5mL、1.54M NaCl溶液10mL、2M KCl溶液0.25mL、2M MES(pH＝5.7)溶液1mL，再加入ddH₂O至W5′溶液总体积为100mL。

4、在8份叶条中分别加入5mLW5′溶液，来回颠倒10-20次清洗叶条，吸取上清液，与步骤3得到的相应的上清液混合得到混合溶液。重复该步骤7次(以提高原生质体产量)。用75μm的尼龙网过滤上述混合溶液，并将滤液放在冰上放置30min后去除上清液，加入预冷的10mL W5′溶液中重悬原生质体，在冰上放置30min后去除上清液，该步骤重复一次，得到8种油松针叶原生质体悬浮液。

5、将得到的油松针叶原生质体置于在光学显微镜下观察，经过统计8种20mL酶解液分别得到约0、500、500、1000、500、10⁴、10⁴、3×10⁵个油松针叶原生质体。通过对比可以得到最佳的酶解液体系为第8组酶解液体系，20ml酶解液能得到约10⁵个油松原生质体。

对比例3油松针叶原生质体的制备

1、取一份油松叶条置于0.6mol/L甘露醇溶液中浸泡1小时；

其中，所述酶解液由纤维素酶R10、果胶酶Y23、纤维素酶RS、半纤维素酶、甘露醇、KCl、MES、RbCl、牛血清蛋白和ddH₂O组成；其中，纤维素酶R10在酶解液中的含量为15g/L、果胶酶Y23在酶解液中的含量为4g/L、纤维素酶RS在酶解液中的含量为10g/L、半纤维素酶在酶解液中的含量为10g/L、甘露醇在酶解液中的含量为0.6mol/L、所述KCl在酶解液中的含量为0.02mol/L；所述MES在酶解液中的含量为0.2mol/L、所述RbCl在酶解液中的含量为0.01mol/L、所述牛血清蛋白在酶解液中的含量为1g/L。

20mL酶解液的制备方法包括如下步骤：

3、酶解后的叶条放到15mL W5溶液中，避光，以40rpm的转速在室温条件下反应30min，使得原生质体释放出来，获得上清液和叶条；

其中，所述W5溶液由CaCl₂、NaCl、KCl、MES和ddH₂O组成；其中，所述CaCl₂在所述W5溶液的含量为0.125mol/L，所述NaCl在所述W5溶液的含量为0.154mol/L，所述KCl在所述W5溶液的含量为0.005mol/L，所述MES在所述W5溶液的含量为0.02mol/L。

100mLW5溶液的制备方法包括如下步骤：

依次向试剂瓶中加入1M CaCl₂溶液12.5mL、1.54M NaCl溶液10mL、2M KCl溶液0.25mL、2M MES(pH＝5.7)溶液1mL，再加入ddH₂O至W5溶液总体积为100mL。

4、在叶条中加入5mLW5溶液，来回颠倒10-20次清洗叶条，吸取上清液，与步骤3得到的上清液混合得到混合溶液。重复该步骤7次(以提高原生质体产量)。用75μm的尼龙网过滤上述混合溶液，并将滤液放在冰上放置30min后去除上清液，加入预冷的10mL W5溶液中重悬原生质体，在冰上放置30min后去除上清液，再加入预冷的10mLW5溶液中重悬原生质体，同样能得到与实施例1颜色相似的油松针叶原生质体悬浮液，将得到的油松针叶原生质体悬浮液放置20h后在光学显微镜下观察，原生质体损失了50％左右。

本对比例将实施例1中铷离子替换为钙离子后，虽然也能维持细胞状态的稳定，使得细胞不破损，但在20h后，原生质体会损失50％左右，明显高于实施例1损失率。

对比例4油松针叶原生质体的制备

1、取13份油松叶条置于0.6mol/L甘露醇溶液中浸泡1小时；

2、将浸泡后的13份叶条，分别放入20mL酶解液1-13中酶解10h(室温，黑暗，静置)，用镊子将叶条从酶解液中取出，得到酶解后的叶条；

其中，所述酶解液1-13由纤维素酶R10、果胶酶Y23、纤维素酶RS、半纤维素酶、甘露醇、KCl、MES、RbCl、牛血清蛋白和ddH₂O组成；其中，纤维素酶R10在酶解液1-13中的含量均为15g/L、果胶酶Y23在酶解液1-13中的含量均为4g/L、纤维素酶RS在酶解液1-13中的含量均为10g/L、半纤维素酶在酶解液1-13中的含量均为10g/L、KCl在酶解液1-13中的含量均为0.02mol/L、MES在酶解液1-13中的含量均为0.2mol/L、RbCl在酶解液1-13中的含量均为0.01mol/L、牛血清蛋白在酶解液1-13中的含量均为1g/L、甘露醇在酶解液在酶解液1-13中的含量分别为0.4mol/L，0.5mol/L，0.525mol/L，0.55mol/L，0.575mol/L，0.6mol/L，0.625mol/L，0.65mol/L，0.675mol/L，0.7mol/L，0.8mol/L，0.9mol/L，1mol/L。

20mL酶解液1-13的制备方法包括如下步骤：

依次向13个离心管中均加入纤维素酶R10 0.3g、果胶酶Y23 0.08g、纤维素酶RS0.2g、半纤维素酶0.2g、2M KCl溶液0.2ml、2M MES(pH＝5.7)溶液2ml、1M甘露醇溶液分别加入8ml、10ml、10.5ml、11ml、11.5ml、12ml、12.5ml、13ml、13.5ml、14ml、16ml、18ml、20ml混合得到溶液1-13，将溶液1-13在55℃水浴10min，冷却至室温，向冷却的溶液1-13分别依次加入1M RbCl溶液0.2mL、牛血清蛋白溶液(10％BSA)0.2mL，再加入ddH₂O至酶解液1-13总体积为20mL，得到酶解液1-13。

3、13份酶解后的叶条分别放到13份15mL W5′溶液中，避光，以40rpm的转速在室温条件下反应30min，使得原生质体释放出来，获得13份上清液和13份叶条；

其中，所述W5′溶液由RbCl、NaCl、KCl、MES和ddH₂O组成；其中，所述RbCl在所述W5′溶液的含量为0.125mol/L，所述NaCl在所述W5′溶液的含量为0.154mol/L，所述KCl在所述W5′溶液的含量为0.05mol/L，所述MES在所述W5′溶液的含量为0.02mol/L。

100mLW5′溶液的制备方法包括如下步骤：

依次向试剂瓶中加入1M RbCl溶液12.5mL、1.54MNaCl溶液10mL、2MKCl溶液0.25mL、2M MES(pH＝5.7)溶液1mL，再加入ddH₂O至W5′溶液总体积为100mL。

4、在13份叶条中分别加入5mLW5′溶液，来回颠倒10-20次清洗叶条，吸取上清液，与步骤3得到的相应的上清液混合得到混合溶液。重复该步骤7次(以提高原生质体产量)。用75μm的尼龙网过滤上述混合溶液，并将滤液放在冰上放置30min后去除上清液，加入预冷的10mL W5′溶液中重悬原生质体，在冰上放置30min后去除上清液，再加入预冷的10mLW5′溶液中重悬原生质体，得到13份油松针叶原生质体悬浮液。每份约10mL。

5、将13份油松针叶原生质体悬浮液分别取出10ul滴在血球计数板上在光学显微镜下计数。在视野中13份油松针叶原生质体悬浮液，分别得到平均每10uL悬浮液含100、200、200、200、250、270、250、220、200、200、150、100、100个原生质体。由此可得在油松针叶原生质体的制备过程中酶解液中的适宜甘露醇含量为0.55～0.65mol/L，最适甘露醇含量为0.6mol/L。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.用于制备油松针叶原生质体的成套试剂，其特征在于：含有A和B；

所述A为酶解液，所述B为W5′溶液；

其中，所述酶解液包括纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、甘露醇、KCl、MES、RbCl、牛血清蛋白和溶剂；所述纤维素酶在酶解液中的含量为25g/L，所述纤维素酶由纤维素酶R10和纤维素酶RS组成，所述纤维素酶R10和纤维素酶RS的含量比为3:2；所述果胶酶在酶解液中的含量为4g/L，所述果胶酶为果胶酶Y23；所述半纤维素酶在酶解液中的含量为10g/L；所述甘露醇在酶解液的含量为0.55~0.65mol/L；所述KCl在酶解液中的含量为0.02 mol/L；所述MES在酶解液中的含量为0. 2mol/L；所述RbCl在酶解液中的含量为0.01 mol/L；所述牛血清蛋白在酶解液中的含量为1g/L；

所述W5′溶液由RbCl、NaCl、KCl、MES和溶剂组成；所述RbCl在所述W5′溶液的含量为0.125mol/L，所述NaCl在所述W5′溶液的含量为0.154 mol/L，所述KCl在所述W5′溶液的含量为0.005 mol/L，所述MES在所述W5′溶液的含量为0.02mol/L。

2.权利要求1所述的成套试剂在制备油松针叶原生质体中的应用。

3.一种油松针叶原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将油松针叶在权利要求1中所述的酶解液中进行酶解得到酶解后的针叶；

2）将酶解后的针叶转入权利要求1中所述的W5′溶液进行处理，得到油松针叶原生质体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述每g的油松针叶至少加入40mL的酶解液。