CN112111443A - 一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法 - Google Patents

一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112111443A
CN112111443A CN202011015336.7A CN202011015336A CN112111443A CN 112111443 A CN112111443 A CN 112111443A CN 202011015336 A CN202011015336 A CN 202011015336A CN 112111443 A CN112111443 A CN 112111443A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
protoplast
catalpa bungei
xylem
mmg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011015336.7A
Other languages
English (en)
Inventor
王军辉
樊二勤
王智
麻文俊
卢楠
付鹏跃
曲冠证
刘彩霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Original Assignee
Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry filed Critical Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority to CN202011015336.7A priority Critical patent/CN112111443A/zh
Publication of CN112111443A publication Critical patent/CN112111443A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法，其包括如下步骤：S1、选择温室内生长健康的楸树植株，将茎段去皮后，浸泡于酶解液中避光静置；S2、酶解结束后，将茎段转移到MMG溶液中，轻轻摇晃，以释放酶解完的原生质体细胞；随后进行过滤以去除杂质，并通过水平离心进行原生质体收集；最后加入适量MMG重悬细胞，获得原生质体溶液；S3、利用氯化铯梯度离心的方法进行高纯度质粒的提取；S4、利用PEG介导的方式进行原生质体高效转化。本发明提供的方法以楸树木质部为材料进行原生质体分离和转化，分离得到的原生质体具有杂质少，数量多的优点，可获得高质量的楸树原生质体，同时提供了系统高效的转化方法，为木本植物的分子生物学研究提供了重要工具。

Description

一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法。
背景技术
楸树(Catalpa bungei C.A.Mey.)为紫葳科梓属多年生木本植物，是我国特有的珍贵用材和观赏兼具的古老树种，在故宫，颐和园等皇家园林有广泛的种植。楸树分布广泛，在我国河北、河南、山东、山西、陕西、甘肃、江苏、浙江、湖南以及广西、贵州、云南等地均有栽培。楸树生长迅速，树干通直，材质致密，用途广泛，具有较高的经济价值，同时楸树树形挺拔优美，花色淡红素雅，开花时美丽壮观，具有较高的观赏价值，此外其茎皮，叶，种子，果实皆可入药，具有一定的药用价值。近年来，随着市场对楸树等珍贵树种需求的增加，以楸树为对象的遗传学、育种学、分子生物学等相关研究的报道逐渐增多。
原生质体是指植物细胞去除细胞壁后由细胞膜包围的“裸露细胞”。原生质体作为一种高效的瞬时表达系统，广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，如亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析以及双分子荧光互补(BiFC)等蛋白质相互作用验证，此外利用原生质体融合技术可加速植物多倍体育种进程。因此，建立成熟的原生质体分离和转化系统对于植物分子生物学和植物育种的相关研究都极为重要。然而，由于在细胞壁酶解和原生质体提取的过程中植物细胞对渗透压异常敏感，在整个原生质体的分离和转化过程中都需要防止细胞膜的破裂，这也使植物原生质体的分离和转化工作十分困难。
已有报道的原生质体材料多以幼嫩草本植物和作物为主，如拟南芥、烟草、水稻等。目前以草本模式植物(如烟草等)的原生质体为受体材料进行异源转化是目前植物分子生物学研究常用的方法，但是随着研究的不断深入，这一方法也逐渐暴露出一些严重的问题，如转化效率低，材料背景差异大等，这些问题在木本植物的相关研究中显得尤为突出，不仅制约了林木分子生物学研究的深入开展，而且严重降低了试验结果的可靠性，因此提供一种木本植物高效的原生质体分离和转化体系，不仅能够解决远源转化效率低等难题，而且在同源或近缘物种中的试验结果也极大的增加了数据的可靠性，对木本植物的分子生物学研究具有重要意义。
发明内容
为了解决上述远源转化效率低，材料背景差异大技术问题，本发明提供了一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法，该方法的获得可为楸树及其他木本植物的相关领域研究提供重要的帮助。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法，其包括如下步骤：
S1、选择温室内生长健康的楸树植株，将茎段去皮后，浸泡于酶解液中避光静置；
S2、待酶解2-3h后，将茎段转移到MMG溶液中，轻轻摇晃，以释放酶解完的原生质体细胞；随后用200目尼龙膜进行过滤，去除杂质，并通过水平低速离心进行原生质体收集；弃上清液，加入1mL MMG重悬细胞，获得满足原生质体转化要求细胞数量的原生质体溶液；
S3、利用氯化铯梯度离心的方法进行质粒的提取；
S4、利用PEG介导的方式进行原生质体转化：取2mL离心管，向其中加入步骤S2所获得的原生质体溶液，步骤S3提取的待转化的质粒和PEG溶液，用枪头轻轻吸打混匀，室温静置；向其中加入WI缓冲液，轻轻混匀多次终止反应；室温下，水平离心，轻轻吸去部分上清以最终剩余50-70μL的溶液，并再次加入WI缓冲液重悬；用按w/v为0.1％的BSA充分润洗培养板，并吸出多余液体；将细胞立即转移到刚润洗过的培养板内，并做好标记，室温，过夜培养；次日，用枪轻轻吸打混匀，并润洗对应六孔板侧壁，将溶液收集到离心管中，室温下，水平离心，弃部分上清最终保留约50-100μL体积的溶液，用手轻弹离心管底部，使溶液混匀，吸取溶液制成临时装片，在激光共聚焦显微镜下观察到细胞内有明显的荧光信号，表明待转化质粒转化楸树木质部原生质体细胞获得成功。
如上所述的方法，优选地，在步骤S1中，所述酶解液的配制方法为：将按w/v为1.5％的Cellulase R-10和0.4％的Macerozyme R-10溶解于pH为5.7的20mmol/L MES、含0.3-0.6mol/L甘露醇和20mmol/L KCl溶液中，55℃恒温水浴10min，待溶液恢复到室温后加入10mmol/L CaCl2和按w/v为0.1％的BSA。
如上所述的方法，优选地，所述酶解液配制方法中MES母液的配制需首先利用KOH调节pH为5.7，定容后用0.45μm滤膜进行过滤，保存于4℃冰箱备用。
如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述MMG溶液为含0.3-0.6mol/L甘露醇，pH为5.7的4mmol/L MES和15mmol/L MgCl2的溶液。
如上所述的方法，优选地，所述酶解液配制方法中KCl、CaCl2、MgCl2和甘露醇母液配制完成后需经高压灭菌条件为0.15MPa，121℃下灭菌20min后使用。
如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述离心的速率为400g，离心时间为3min，MMG中甘露醇的浓度为0.5mol/L，所述避光酶解的时间为3h。
如上所述的方法，优选地，在步骤S4中，所述原生质体溶液与待转化的质粒和PEG溶液按体积比为100:10:110进行。
如上所述的方法，优选地，在步骤S4中，所述PEG溶液为含按w/v为40％的PEG4000，0.3-0.6mol/L甘露醇和100mmol/L CaCl2的溶液。
如上所述的方法，优选地，在步骤S4中，所述WI溶液为含0.4-0.6mol/L甘露醇，pH为5.7的4mmol/L MES和20mmol/L KCl的溶液。
如上所述的方法，优选地，在步骤S4中，所述过夜培养的时间为9-13h。
如上所述的方法，优选地，在步骤S4中，两次水平离心的速率均为300g，离心时间为3min。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法，以楸树木质部为材料进行原生质体分离，不同与以往研究中利用叶片等其他部位进行原生质体分离的方法，分离得到的原生质体具有杂质少，数量多的优点，本发明提供了一种木本植物高效的原生质体分离和转化体系，不仅能够解决远源转化效率低等难题，而且在同源或近缘物种中的试验结果也极大的增加了数据的可靠性，对木本植物的分子生物学研究及应用具有重要意义。
附图说明
图1为楸树木质部原生质体的显微观察；
图2为pUC19-35S::GFP转化楸树木质部原生质体。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
实施例1
在楸树木质部原生质体分离中，设置酶解时间分别为0.5h，1h，2h，3h，设置酶解液以及MMG溶液中的甘露醇浓度分别为0.3mol/L，0.4mol/L，0.5mol/L，0.6mol/L，其余实验步骤如下：
(1)楸树实生苗培养：将组织培养25-30d约5cm高的楸树生根组培苗移栽到含有草炭土、珍珠岩、蛭石体积比例为5:3:2的小号花盆中，充分浇水，待株高为70-80cm时，将其转移到含有草炭土、珍珠岩、蛭石体积比例为5:3:2的大号花盆中，培养至1.5m；
(2)取健康楸树茎段并去皮，浸泡在含有40mL不同甘露醇浓度的酶解液的50mL离心管中，分别避光酶解0.5h，1h，2h，3h，该过程中要静置。其中，不同甘露醇浓度的酶解液的配制方法为将1.5％(w/v(按g/mL，需要注意的是后面没有特别说明的w/v均按g/mL进行))Cellulase R-10和0.4％(w/v)Macerozyme R-10溶解于20mmol/L MES(pH 5.7)、甘露醇浓度分别为0.3mol/L，0.4mol/L，0.5mol/L，0.6mol/L和20mmol/L KCl的混合溶液中，55℃恒温水浴10min，待溶液恢复到室温后加入10mmol/L CaCl2和0.1％(w/v)的BSA；
(3)将茎段转移到含有4mmol/LMES(pH 5.7)、15mmol/L MgCl2和甘露醇浓度分别为0.3mol/L，0.4mol/L，0.5mol/L，0.6mol/L的30mL MMG的50mL离心管中，轻轻摇晃30s；
(4)用200目尼龙膜过滤，去除杂质；
(5)室温下，400g水平离心3min；
(6)弃上清，再次加入约1mL MMG溶液重悬原生质体，获得原生质体细胞悬液。
利用光学显微镜观察原生质体细胞状态(如图1)，当甘露醇浓度为0.5mol/L，酶解时间为3h，水平离心为3min时，原生质体细胞个数可达1×106/mL，用台盼蓝染色观察原生质体存活率为98％。当甘露醇浓度小于或大于0.5mol/L，酶解时间大于3h都会造成原生质体破碎；当酶解时间不足3h时，酶解不充分，原生质体得量少；离心时间小于3min时，无法沉淀原生质体。
实施例2
利用氯化铯梯度离心法提取pUC19-35S::GFP载体质粒，该方法比以往研究中利用质粒提取试剂盒提取得到的质粒浓度和纯度都要更高，保证了原生质体转化的质粒要求。
(1)取pUC19-35S::GFP载体菌种10μL，接种于含有100mg/L氨苄霉素的5mL LB培养基中，220rpm，37℃，过夜培养；
(2)取500μL过夜培养的菌液，接种于含有100mg/L氨苄霉素的250mL菌体培养基中，220rpm，37℃，过夜培养；
(3)4℃，4500g离心10min收集菌体于250mL离心瓶中；
(4)向离心瓶中加入20mL SolutionⅠ溶液，重悬菌体；
(5)加入40mL SolutionⅡ溶液，轻柔混匀，静置5min；
(6)加入15mL SolutionⅢ溶液，温和混匀，冰上静置10min；
(7)4℃，3000g离心10min，沉淀蛋白杂质；
(8)将上清液用2层纤维膜过滤到含有50mL异丙醇的250mL玻璃三角瓶中，摇匀，静置10min；
(9)4500g离心10min，将质粒沉淀收集于50mL离心管中，反复离心，直至将所有质粒沉淀收集完成；
(10)加入10mL 95％乙醇，轻轻清洗离心管侧壁，倒掉乙醇，晾干5min；
(11)加入3.6mL SolutionⅠ溶液，充分溶解质粒沉淀；
(12)称取4.85g氯化铯加入到离心管中；
(13)手持离心管，使氯化铯充分溶解；
(14)加入260μL EB，充分混匀；
(15)室温，4000g离心5min，沉淀杂质；
(16)取4.8mL上清加入到5mL指封管中，注意两两配平，需精确到万分之一；
(17)110000rpm，离心10-12h；
(18)用5mL一次性医用针管吸取DNA质粒层于15mL离心管中；
(19)加无菌水补充体积至3mL；
(20)加3mL正丁醇，充分混匀，1000g离心1min，去上层有机相；
(21)重复上述操作4-6次至溶液颜色澄清；
(22)加入9mL无水乙醇，沉淀质粒DNA；
(23)4000g离心5min，收集质粒DNA；
(24)用75％的乙醇清洗质粒沉淀2次；
(25)室温晾干酒精，加入适量的无菌水溶解DNA，并用NanoDrop 2000C测定质粒浓度，质粒浓度可达10μg/μL，并将其稀释至2μg/μL进行原生质体转化。
实施例3楸树木质部原生质体的转化
本实施例以携带CaMV 35S驱动的GFP标签的pUC19载体为目的质粒进行原生质体转化：
(1)向2mL离心管中加入100μL实施例1中制备的原生质体悬液，10μL实施例2获得高纯度的pUC19-35S::GFP质粒和110μL PEG溶液，用枪头轻轻吸打混匀；其中，PEG溶液为40％(w/v)PEG4000，0.5mol/L甘露醇和100mmol/L CaCl2；
(2)室温静置10min；
(3)向其中加入440μL WI缓冲液，轻轻混匀7次终止反应；其中，WI溶液为0.5mol/L甘露醇，4mmol/L MES(pH 5.7)和20mmol/L KCl；
(4)室温下，300g水平离心3min；
(5)弃部分上清，并再次加入1mL WI缓冲液重悬；
(6)用0.1％(w/v)的BSA充分润洗六孔板；
(7)将细胞悬液转移到润洗过的六孔板内，并做好标记；
(8)室温下，避光培养8-12h；
(9)将细胞收集到2mL离心管中，室温下，300g水平离心3min，弃部分上清；
(10)在激光共聚焦显微镜下对转化后的原生质体细胞进行观察。
通过以上转化实例，在激光共聚焦显微镜下可观察到细胞内明显的绿色荧光信号(如图2所示，其中，GFP表示绿色荧光蛋白发出的绿色荧光信号，Bright field表示明场下的细胞状态，Merged表示不同荧光的叠加信号)，表明pUC19-35S::GFP转化楸树木质部原生质体细胞获得成功。
实施例4
一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法，具体步骤如下：
(1)选择生长健康的楸树生根组培苗，移栽到温室中进行培养，待植株长到1.5-2m左右，选取生长状态良好的楸树，用枝剪截取距离地上30cm以上的茎干，以每10cm为一小段并去皮，浸泡于含有40mL酶解液的50mL离心管中静置；
(2)避光酶解3h后，酶解过程中，全程静置，避光；将茎段转移到30mL MMG中，轻轻摇晃30s，以释放酶解完的原生质体细胞；随后用200目尼龙膜进行过滤，去除杂质，并以400g水平低速离心3min进行原生质体收集；弃上清液，加入MMG重悬细胞，并用光学显微镜观察原生质体细胞状态，用血球计数板统计原生质体细胞个数，使其达到1×106个/mL。
上述以楸树木质部为材料进行原生质体分离，不同与以往研究中利用叶片等其他部位进行分离的方法，分离得到的原生质体具有杂质少，数量多的优点。
其中，上述所用的酶解液配制方法为：将1.5％(w/v)Cellulase R-10和0.4％(w/v)Macerozyme R-10溶解于20mmol/L MES(pH 5.7)、0.5mol/L甘露醇和20mmol/L KCl溶液中，55℃恒温水浴10min，待溶液恢复到室温后加入10mmol/L CaCl2和0.1％(w/v)BSA。
注：酶解液可反复使用，长期保存于-20℃冰箱中；
MES母液的配制需首先利用KOH调节pH为5.7，定容后用0.45μm滤膜进行过滤，保存于4℃冰箱备用；
MMG溶液为含0.5mol/L甘露醇，4mmol/L MES(pH 5.7)和15mmol/L MgCl2。
(3)利用氯化铯梯度离心的方法对进行亚细胞定位和BiFC实验的相关质粒进行提取，具体步骤详见实施例2；提取的质粒，经NanoDrop 2000C超微量分光光度计进行检测，浓度可达10μg/μL以上；
(4)利用PEG介导的方式进行原生质体转化：取2mL离心管，向其中加入100μL原生质体溶液，10μL质粒和110μL PEG溶液(PEG溶液含40％(w/v)PEG4000，0.5mol/L甘露醇和100mmol/L CaCl2)；用枪头轻轻混匀，室温静置10min；向其中加入440μL WI缓冲液，轻轻混匀7次终止反应；室温下，300g水平离心3min，轻轻吸去部分上清以最终剩余50μL左右的溶液为宜，并再次加入1mL WI缓冲液重悬(WI溶液含0.5mol/L甘露醇，4mmol/L MES(pH 5.7)和20mmol/L KCl)；用0.1％(w/v)的BSA充分润洗六孔板，并吸出多余液体；将细胞立即转移到刚润洗过的六孔板内，并做好标记，室温，过夜培养9-13h；次日，用枪轻轻吸打混匀，并润洗对应六孔板侧壁，将溶液收集到2mL离心管中，室温下，300g水平离心3min，弃部分上清最终保留50μL体积的溶液，用手轻弹离心管底部，使溶液混匀，吸取10μL放置于载玻片上，在激光共聚焦显微镜下进行观察，可观察到细胞内明显的荧光信号，表明质粒转化楸树木质部原生质体细胞获得成功。

Claims (10)

1.一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、选择温室内生长健康的楸树植株，将茎段去皮后，浸泡于酶解液中避光静置；
S2、酶解2-3h后，将茎段转移到MMG溶液中，轻轻摇晃，以释放酶解完的原生质体细胞；随后用200目尼龙膜进行过滤，去除杂质，并通过水平低速离心进行原生质体收集；弃上清液，加入1mLMMG重悬细胞，获得原生质体溶液；
S3、利用氯化铯梯度离心的方法进行质粒提取；
S4、利用PEG介导的方式进行原生质体转化：取2mL离心管，向其中加入步骤S2获得的原生质体溶液，步骤S3提取的待转化的质粒和PEG溶液，用枪头轻轻混匀，室温静置；向其中加入WI缓冲液，轻轻混匀多次以终止反应；室温下，水平离心，轻轻吸去部分上清以最终剩余50-70μL的溶液，并再次加入WI缓冲液重悬；用按w/v为0.1％的BSA充分润洗培养板，并吸出多余液体；将细胞立即转移到刚润洗过的培养板内，并做好标记，室温，过夜培养；次日，用枪轻轻吸打混匀，并润洗对应培养板侧壁，将溶液收集到离心管中，室温下，水平离心，弃部分上清最终保留50-100μL体积的溶液，用手轻弹离心管底部，使溶液混匀，吸取溶液制成临时装片，在激光共聚焦显微镜下进行观察，观察到细胞内明显的荧光信号，表明待转化质粒转化楸树木质部原生质体细胞获得成功。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述酶解液的配制方法为：将按w/v为1.5％的Cellulase R-10和0.4％的Macerozyme R-10溶解于pH为5.7的20mmol/LMES、含0.3-0.6mol/L甘露醇和20mmol/L KCl溶液中，55℃恒温水浴10min，待溶液恢复到室温后加入10mmol/L CaCl2和按w/v为0.1％的BSA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶解液配制方法中MES母液的配制需首先利用KOH调节pH为5.7，定容后用0.45μm滤膜进行过滤，保存于4℃冰箱备用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述MMG溶液为含0.3-0.6mol/L甘露醇，pH为5.7的4mmol/L MES和15mmol/L MgCl2的溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述离心的速率为400g，离心时间为3min，离心过程要求为水平转子，MMG中甘露醇的浓度为0.5mol/L，所述避光酶解的时间为3h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述原生质体溶液与待转化的质粒和PEG溶液按体积比为100:10:110进行。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述PEG溶液为含按w/v为40％的PEG4000，0.3-0.6mol/L甘露醇和100mmol/L CaCl2的溶液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述WI溶液为含0.4-0.6mol/L甘露醇，pH为5.7的4mmol/L MES和20mmol/L KCl的溶液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述过夜培养的时间为9-13h。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，两次水平离心的速率均为300g，离心时间为3min。
CN202011015336.7A 2020-09-24 2020-09-24 一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法 Pending CN112111443A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011015336.7A CN112111443A (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011015336.7A CN112111443A (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112111443A true CN112111443A (zh) 2020-12-22

Family

ID=73800604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011015336.7A Pending CN112111443A (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112111443A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774347A (zh) * 2022-03-14 2022-07-22 南京农业大学 一种梨茎原生质体的分离方法
CN116183470A (zh) * 2022-12-22 2023-05-30 中国林业科学研究院林业研究所 一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105505980A (zh) * 2015-12-19 2016-04-20 西北农林科技大学 一种荧光标记载体瞬时转化柳枝稷原生质体的方法
CN106167787A (zh) * 2016-08-23 2016-11-30 浙江农林大学 一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法
CN106399223A (zh) * 2016-11-25 2017-02-15 首都医科大学 一种雷公藤原生质体的分离及瞬时转化方法
CN106754632A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 中国林业科学研究院林业研究所 一种灰楸叶片原生质的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105505980A (zh) * 2015-12-19 2016-04-20 西北农林科技大学 一种荧光标记载体瞬时转化柳枝稷原生质体的方法
CN106167787A (zh) * 2016-08-23 2016-11-30 浙江农林大学 一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法
CN106399223A (zh) * 2016-11-25 2017-02-15 首都医科大学 一种雷公藤原生质体的分离及瞬时转化方法
CN106754632A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 中国林业科学研究院林业研究所 一种灰楸叶片原生质的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUILI SHI等: "Physiological and transcriptional responses of Catalpa bungei to drought stress under sufficient- and deficient-nitrogen conditions", 《TREE PHYSIOL》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774347A (zh) * 2022-03-14 2022-07-22 南京农业大学 一种梨茎原生质体的分离方法
CN116183470A (zh) * 2022-12-22 2023-05-30 中国林业科学研究院林业研究所 一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法
CN116183470B (zh) * 2022-12-22 2024-04-05 中国林业科学研究院林业研究所 一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bonga Clonal propagation of mature trees: problems and possible solutions
Olsen Isolation and cultivation of embryogenic microspores from barley (Hordeum vulgare L.)
CN109136167B (zh) 百合叶肉原生质体的制备方法
CN112111443A (zh) 一种楸树木质部原生质体分离和转化的方法
CN103352023B (zh) 大麦原生质体制备及peg介导转化方法
CN104745523B (zh) 一种用于油菜原生质体的分离、转化和再生的体系
CN101513167A (zh) 一种获得栽培菊花与近缘属间远缘杂种的方法
CN115247145A (zh) 一种油茶花瓣原生质体的分离及瞬时转化体系构建方法
CN113080055B (zh) 一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法
CN114214264A (zh) 一种草莓原生质体分离纯化及基因瞬时表达的方法
CN111979173B (zh) 一种高粱原生质体的制备方法及瞬时表达转化的方法
CN110468093B (zh) 一种大白菜的原生质体制备及遗传转化方法
CN109880788A (zh) 不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系
CN104263752A (zh) 一种柑桔成年态茎段的转基因方法
CN101401550B (zh) 诱导茄子小孢子形成胚状体的方法及其专用培养基
US5508189A (en) Regeneration of plants from cultured guard cell protoplasts
CN113249296B (zh) 一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法
CN108034681B (zh) 利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法
CN112126616B (zh) 落叶松原生质体分离纯化及瞬时表达方法
CN112063652A (zh) 一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法及其应用
CN111937742A (zh) 芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂种创制方法
CN104212878B (zh) 一种早期筛选柑橘胞质杂种的方法
CN101810139B (zh) 一种制备石竹高频再生植株的方法
CN110669718A (zh) 一种落羽杉根，茎，叶原生质体分离、纯化及瞬时高效转化的方法
Peng et al. Development of a microspore culture method to produce haploid and doubled-haploid asparagus (Asparagus officinalis L.) plants

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201222

RJ01 Rejection of invention patent application after publication