CN116183470A - 一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于细胞流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，属于细胞检测技术领域，包括如下步骤：木质部细胞原生质体制备及AnnexinV、PI染色处理；对染色的木质部细胞原生质体进行成像流式检测处理；对染色的木质部细胞原生质体进行流式分群、分选；对分选后不同凋亡亚群细胞显微成像检测其形态；提取分选后不同凋亡亚群细胞的RNA，利用RT‑qPCR检测细胞程序性死亡及材性形成相关基因的表达量。本发明检测木本植物细胞程序性死亡的方法，通过流式细胞仪分群分析出不同凋亡阶段细胞个数，得出不同阶段凋亡率；又进一步通过流式细胞仪对不同凋亡亚群细胞进行分选，通过RT‑qPCR鉴定相关基因表达水平；该方法利用流式细胞仪分选木质部细胞程序性死亡不同阶段的特定细胞，具有定量可靠，分析准确，结果精度高等优点。

Description

一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法

技术领域

本发明涉及基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，属于细胞检测技术领域。

背景技术

木材是重要的可再生资源，也是建筑、家具生产以及造纸业的原材料。森林不仅是水库、钱库、粮库，还是碳库，对国家生态安全具有基础性、战略性作用。木材是木本植物维管形成层分化产生的次生木质部连年沉积、附加的结果。次生木质部的发育是一个连续的发育过程，包括维管形成层细胞的增殖，木质部细胞的分化和扩张，次生细胞壁的沉积和细胞程序性死亡(PCD)。最终成熟的木质部包括木质部薄壁细胞、木质纤维、导管和管状分子。

细胞程序性死亡是细胞在特定生理或病理条件下，为了维持内环境稳定，更好地适应生存环境而采取的一种由基因调控的细胞自主性死亡的生物学现象。细胞程序性死亡现象在植物生长发育过程中广泛存在，如在糊粉层发育中细胞退化胚的发育、根冠细胞的死亡、生物胁迫和环境胁迫、植物单性花的发育以及木质部细胞的发育等过程中都起着至关重要的作用。研究证明，木本植物木质部导管和纤维分子的发育过程是典型的细胞程序性死亡过程，但两种类型细胞又存在着不同的死亡方式。木质部导管死亡的过程为液泡裂解类型的死亡，从维管形成层分化出来后，几天内迅速死亡，属于快速死亡的过程；木质部纤维的死亡过程为非液泡裂解依赖类型的死亡，属于慢性死亡的过程，因此不同的细胞程序性死亡过程，可能具有不同的调控机制。

传统的细胞凋亡检测方法包括显微镜形态学观察、DNA凝胶电泳检测、TUNEL检测等方法。其中，显微镜检测，只能观测细胞形态变化；DNA凝胶电泳检测只能通过检测已降解的DNA判断细胞发生程序性死亡，但无法对不同细胞类型和细胞程序化死亡时期进行检测；TUNEL检测实验操作复杂，且在制作切片过程中可能存在DNA降解或机械损伤等，检测效率低；因此，木本植物细胞程序性死亡的研究缺乏高效准确的检测方法，严重阻碍了该领域的基础研究进展。

流式细胞技术是20世纪70年代发展起来的技术，通过测量单细胞或生物颗粒的散射光和荧光强度快速分析其物理或化学性质，可以高速分析单位体积内的上万个细胞，并同时从一个细胞中测得多个特征参数进行定性或定量分析，其主要特点是检测速度快、检测参数多、可对不同类型细胞进行准确分析和分选。该技术已经在倍性分析、核型分析、细胞计数、DNA和RNA含量检测、转基因检测以及次级代谢产物累计检测等方面广泛应用，为植物学的研究提供了重要信息。流式细胞仪也可应用于细胞凋亡检测。凋亡细胞一般都出现细胞膜皱缩、核解聚、凋亡小体形成、胞浆浓缩、体积减小等形态学上的特征，经过流式细胞仪的前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)分析后，即可区分出凋亡细胞和正常细胞，可以定量检测凋亡细胞数量。

目前，流式细胞技术在动物细胞凋亡检测过程发挥重要作用，草本植物研究中也有应用，但在木本植物中却没有报道。木本植物细胞程序性死亡不同于草本植物，是木材形成过程中的重要生物学过程，但是，受限于一系列的技术障碍，现有木本植物细胞凋亡的TUNEL检测技术操作步骤繁琐，重复性差，难以精准定量，且不能对细胞程序性死亡过程的相关基因进行转录水平的表达量分析，不能满足木本植物细胞程序性死亡的转录水平检测需要。

本发明以杨树为植物材料，利用原生质体分离技术结合不同荧光染料，通过流式分选以及标记基因表达分析等，建立木本植物细胞程序性死亡的检测方法，解决现有检测方法耗时长、重复性差、无法精准定量等缺点，可以快速准确观察和分析木质部不同细胞类型程序性死亡时期和统计细胞数量，同时可以分选不同凋亡类型或时期细胞进行组学研究及凋亡相关基因转录水平检测，对木本植物细胞程序化死亡研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种基于流式细胞分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，以杨树为植物材料，在原生质体分离、悬浮液制备、流式分析参数确定、流式分选以及分选鉴定等环节进行优化，探索木本植物细胞程序性死亡的检测方法。解决现有检测方法耗时长、重复性差、无法精准定量等缺点，同时解决现有检测方法无法对凋亡细胞取样及相关基因检测的技术问题。

为了实现所述发明目的，本发明提供了一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

1、将待检测木本植物茎段剥皮后，进行木质部细胞原生质体酶解，得到木质部原生质体细胞；

2、将步骤1中得到的木质部原生质体细胞进行离心悬浮处理，获得原生质体浓缩液；

3、向步骤2中得到的原生质体浓缩液中添加AnnexinV-FITC，孵育处理后，继续加入PI染色处理，获得荧光染料染色的木质部原生质体细胞液；

4、对步骤3中得到的木质部原生质体细胞液进行成像流式拍照检测，生成AnnexinV-FITC/PI散点图，并获得阴性细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞的染色及细胞形态成像图；

5、对步骤3中得到的木质部原生质体进行分选，并分别收集分选后细胞程序性死亡不同时期的亚群细胞；

6、对步骤5分选后的原生质体显微拍照，观察分选后细胞程序性死亡不同时期的亚群细胞形态；

7、利用RT-qPCR对步骤5分选后不同亚群细胞，进行细胞凋亡和木质部发育相关基因的表达量分析。

优选地，步骤1中所述木本植物为杨树。

优选地，步骤1中，酶解的具体步骤如下：

(1)温室培养2月龄银腺杨84K(P.alba X P.glandulosa)，分离表皮和树干；

(2)加入30ml酶解液：0.6M D-mannitol；20mM MES pH5.7；1.5％纤维素酶R-10；0.4％果胶酶Y-23；20mM KCL；10mM CaCl₂；0.1％ BSA，到50ml离心管中，将剥皮后的树干放进装有酶解液的离心管中，25℃避光酶解40min；

(3)将酶解后的树干取出来，放在30ml的W5溶液中：2mM pH5.7 MES、3M NaCl、1MCaCl₂、2M KCl；轻轻晃动树干，让酶解后的细胞落到W5溶液中；

(4)将W5溶液用70μm细胞筛过滤，200g离心5min；

(5)去掉上清液，W5溶液重悬细胞，200g离心5min；

(6)W5溶液重悬细胞，调整细胞浓度约10⁶cells/ml，得到木质部原生质体细胞浓缩液。

优选地，步骤3中用AnnexinV-FITC和PI进行染色的具体步骤如下：

(1)上述木质部原生质体细胞浓缩液中，按100μl细胞液加入5μlAnnexinV-FITC的比例，冰上避光孵育20min；

(2)200g离心5min，加入相同体积WI(0.6M D-mannitol；20mM MES；20mM KCL；0.1％ BSA)溶液；

(3)向上述(2)所得浓缩液中，继续加入PI染色，按100μl细胞液加入1μlPI的比例，冰上避光孵育5min。

优选地，步骤5中分选的具体步骤如下：

(1)上CS&T beads，完成流式细胞分选仪的质控操作，保证不同时间实验数据的一致性，调试好细胞分选的各项参数，100μm喷嘴，4way分选，4way purity模式，调节偏转电压，使液流直接进入到收集管中央；

(2)新建实验模板Experiment，参数包括FSC、SSC、FITC和PI；先上样阴性对照样本，然后上样待测样本，各保存10000个细胞，根据阴性对照和阳性待测样本，划出荧光信号门；将对应荧光信号的门分别选入对应分选Way，上样后开始分选，根据需要选择分选结束方式。

有益效果：

与现有技术相比，本发明利用AnnexinV-FITC、PI对木质部原生质体进行染色，根据不同荧光染料染色原理，通过流式细胞仪有效区分AnnexinV-FITC荧光和PI荧光，可以检测和分析木质部发育过程中处于程序化死亡不同阶段的细胞数量和比例，进一步利用流式细胞分选技术获得处于细胞程序性死亡不同阶段的细胞，并进一步通过组学或RT-qPCR方法鉴定相关基因表达，从而建立基于流式细胞术的木本植物细胞程序性死亡的高效、可重复的新检测方法。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1-1为本发明实施例1中2月龄银腺杨84K；

图1-2为本发明实施例1中酶解前茎横切显微观察图；

图1-3为本发明实施例1中酶解后茎横切显微观察图；

图2-1为本发明实施例2中成像流式分析分群图；

图2-2为本发明实施例2中AnnexinV-FITC和PI均未染色的健康细胞(阴性细胞)；

图2-3为本发明实施例2中AnnexinV-FITC阳性、PI阴性的早期凋亡细胞；

图2-4为本发明实施例2中AnnexinV-FITC、PI双阳性的晚期凋亡细胞；

图3-1为本发明实施例3中流式分析分群图；

图3-2为本发明实施例3中不同亚群细胞前向角FSC、侧向角SSC平均值；

图4-1为本发明实施例1中分选前细胞显微成像图；

图4-2为本发明实施例3中健康细胞群显微成像图；

图4-3为本发明实施例3中早期凋亡阶段细胞显微成像图；

图4-4为本发明实施例3中晚期凋亡阶段细胞显微成像图；

图5为本发明实施例3中不同细胞程序性死亡阶段细胞凋亡、材性发育相关基因的表达量分析。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中所涉及的试剂均为市场上可购的常规试剂，所用的方法均为本技术领域常用的方法。

本发明实施例中，对以下名词做出如下说明：

AnnexinV：是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧；AnnexinV作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合；将AnnexinV进行荧光素(FITC)标记，以标记了的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞调亡的发生；Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

PI(碘化丙啶)：是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染，因此，本发明将AnnexinV-FITC与PI匹配使用，可以将凋亡早、晚期的细胞区分开来。

一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，包括如下步骤：

实施例1：杨树木质部细胞原生质体制备及染色

1.原生质体分离纯化

(1)温室培养2月龄银腺杨84K(P.alba X P.glandulosa)(如图1-1所示)，分离表皮和树干；

(2)将30ml酶解液(0.6M D-mannitol；20mM MES pH5.7；1.5％纤维素酶R-10；0.4％果胶酶Y-23；20mM KCL；10mM CaCl₂；0.1％ BSA)加入到50ml离心管中，剥皮后的树干放进离心管中，25℃避光酶解40min；

(3)将酶解后的树干取出来，放在30ml的W5溶液中(2mM pH5.7 MES；3M NaCl；1MCaCl₂；2M KCl)，轻轻晃动树干，酶解后的细胞落到W5溶液中；

(4)将W5溶液用70μm细胞筛过滤，200g离心5min；

(5)去掉上清液，W5溶液重悬细胞，200g离心5min；

(6)W5溶液重悬细胞，调整细胞浓度约10⁶cells/ml，得到木质部原生质体细胞浓缩液。

2.原生质体染色

(1)上述木质部原生质体细胞浓缩液中，按100μl细胞液加入5μlAnnexinV-FITC的比例，冰上避光孵育20min；

(2)200g离心5min，加入相同体积WI(0.6M D-mannitol；20mM MES；20mM KCL；0.1％ BSA)溶液，得浓缩液；

(3)向上述(2)所得浓缩液中，继续加入PI染色，按100μl细胞液加入1μl的比例加入PI，冰上避光孵育5min。

3.酶解前后木质部细胞比较

分别用震荡切片机横切酶解前后茎段，切片厚度为50μM，0.05％甲苯胺蓝染色1分钟后观察，如图1-2所示，为酶解前显微观察木质部细胞，如图1-3所示，为酶解后显微观察木质部细胞，显微观察可见：大约10层木质部细胞被解离，其中包括导管、纤维、射线等不同类型细胞。

实施例2：成像流式分析木质部不同细胞程序性死亡阶段细胞

1.数据采集

(1)打开ImageStreamxMark II主机和两个电脑电源，双击ISX软件图标，检查鞘液、清洗液等是否足够，将废液桶清空，单击软件界面右下方“Start up”，自动冲洗管路、装鞘液约需13min；

(2)点击“Load”，在1.5mL离心管中加入1mL样品；

(3)打开本次实验所需激发光，明场(ch1和ch9)，AnnexinV-FITC(488nm激光)，PI(561nm激光)；

(4)488激光器功率调整为200mW，561激光器调整为200mW，在“Plot”界面中生成细胞散点图，横坐标为Area，纵坐标为Aspect Ratio；

(5)每个样品获得5000个单细胞，依次保存所有样品的数据，用IDEAS软件进行数据处理。

2.数据分析

(1)在不同激光器激发下，木质部原生质体细胞内的不同染料会发出不同颜色的荧光，Annexin V-FITC会发出绿色荧光，PI发出红色荧光，明场通道检测细胞数目；

(2)利用IDEAS软件对获得的细胞群体进行分析，以Annexin V-FITC为纵坐标，PI为横坐标，通过FCS、SSC显示图圈选画门(图2-1)，Annexin V-FITC/PI显示体系中健康细胞设为R5门、早期凋亡细胞设为R3门、晚期凋亡细胞设为R4门；

(3)将荧光显微图像显示技术与传统流式细胞结合，对单个细胞进行拍照成像，图像中包含荧光信号、细胞大小、折射率等信息。

本发明基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，首次将成像流式应用于木本植物木质部原生质体的研究中，结合Annexin V/PI染色标记，成像流式拍照观察凋亡诱导后处于不同状态的细胞，成像流式细胞仪的检测结果主要分为三个亚群：第一个亚群为FITC和PI均未染色的健康细胞群(阴性细胞群)，此亚群细胞大小约2-4μm、细胞膜完整、细胞活性好，如图2-2所示；第二个亚群为FITC绿色阳性信号、PI阴性的早期凋亡阶段细胞，此亚群细胞大小约4-6μm，细胞膜有破损，如图2-3所示；第三个亚群为FITC、PI双阳性的晚期凋亡阶段细胞，此亚群细胞大小约6-10μm、细胞膜有破损、细胞膜有绿色FITC荧光信号、细胞核有红色PI荧光信号，如图2-4所示；将成像流式技术应用于木本植物细胞程序性死亡研究中，不仅能够获得大量细胞群体分析数据，还能实时收集每一个细胞的图像，得到不同凋亡时期细胞形态图，其结果更加高效、精准。

实施例3：木质部不同程序化死亡阶段细胞流式分选

1、上CS&T beads，完成流式细胞分选仪的质控操作，保证不同时间实验数据的一致性，调试好细胞分选的各项参数，100μm喷嘴，4way分选，4way purity模式，调节偏转电压，使液流直接进入到收集中央；

2、新建实验模板Experiment，参数包括FSC、SSC、Annexin V-FITC和PI；先上样阴性对照样本，然后上样待测样本，各保存10000个细胞，根据阴性对照和阳性待测样本，划出荧光信号门；将对应荧光信号的门分别选入对应分选Way，上样后开始分选，根据需要选择分选结束方式；

3、在生成的所述AnnexinV-FITC/PI细胞散点图，以Annexin V-FITC为横坐标，PI为纵坐标，通过FCS、SSC显示图圈选画门(如图3-1所示)，杨树木质部原生质体能够分成3个明显的细胞亚群Q2、Q3、Q4，且群体大小各不相同，其中，Q4亚群位于左下方，是最小细胞的集合，占总细胞数的43.8％，推测其为健康细胞亚群(阴性细胞群)；Q2亚群在大小和复杂度方面均是最大，依据其荧光信号推测其为晚期阶段凋亡细胞，凋亡率为32.7％；Q3亚群位于Q2亚群下方，在大小和复杂度方面比Q2小，依据其细胞大小和荧光信号推测其为早期阶段凋亡细胞亚群，凋亡率为22.6％。以上三个亚群与实施例2中成像流式分群基本相符。

流式光学系统除了收集荧光信号、同时采集散射光信号，荧光信号的强弱代表了待测样品内含有相关的荧光信号的物质浓度，散射光信号主要分为前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)，FSC反应了待测单细胞或者生物颗粒的大小，SSC反应了细胞内部复杂程度，如图3-2所示，不同亚群FSC、SSC值，健康细胞最小、晚凋细胞最大，说明凋亡细胞的大小和内部复杂程度均大于健康细胞。

实施例4：显微成像分析分选前、后及不同阶段细胞形态

1、分选前及分选后不同亚群细胞Q2、Q3、Q4，分别200g离心5min，去除上清液，取10μl，均匀涂布于载玻片上；

2、奥林巴斯(OLYMPUS IX73)显微镜20倍物镜拍摄。木质部原生质体细胞分选前，细胞形态完整、大小差别较大(如图4-1所示)，经流式分选后的木质部原生质体细胞，不同类型亚群之间形态差异较大：阴性群细胞小而圆，细胞完整，状态良好(如图4-2所示)；早凋亚群细胞略大，细胞膜有破损，细胞有变形现象(图4-3)；晚凋亚群细胞最大，细胞膜破损严重(如图4-4所示)，与实施例2中成像流式拍照结果基本一致。

实施例5：不同凋亡阶段亚群细胞相关基因表达量分析

1.RNA的提取与反转录cDNA

分选后，不同亚群细胞Q2、Q3、Q4，分别提取RNA，参照Qiagen公司痕量样品RNA提取试剂盒RNeasy Plant Kit说明(货号：74004)，用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagentKit with gDNA Eraser试剂盒(货号：RR047A)反转录成cDNA，保存于-20℃备用；

2.RT-qPCR基因表达分析

分别选取杨树细胞程序性死亡相关基因(PtrZEN1、PtrBFN1、PtrPOD、PtrCDD)、木材形成过程中导管(PtrXCP1、PtrMC9、PtrEXP6、PtrLAC17)、纤维(PtrSND1、PtrCAld5H2、PtrMYB010、PtrCCoAOMT3)、射线(PtrCP26、PtrCAD7)、形成层发育(PtrWOX4a、PtrHB15)等相关基因，验证其在分选后不同亚群细胞的表达，使用Primer Premier 5，在待扩基因核苷酸序列的非保守区设计RT-qPCR引物(表1)，生工生物公司合成，RT-qPCR根据TaKaRa公司TB

Premix EX Taq^TMⅡ(货号：RR820A)和Roche480实时荧光定量PCR仪的使用说明进行操作；反应体系为：/>

Premix EX Taq^TMⅡ5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 1μL，超纯水3μL；PCR反应程序为：预变性95℃，30秒，PCR反应95℃，3秒，60℃，30秒(45个循环)，绘制溶解曲线；选取杨树基因PtrActin作为内参基因；每个cDNA模板设置4个重复，所有实验重复3次，采用2-Δct计算方法进行数据分析。

细胞程序性死亡的概念引入植物发育生物学后，许多研究都已证明植物管状分子的分化过程是一种典型的细胞程序性死亡过程；本发明选取不同类型细胞代表基因，分别对凋亡不同亚群细胞进行基因表达定量分析，结果如图5所示；细胞程序性死亡相关基因(PtrZEN1、PtrBFN1、PtrPOD、PtrCDD)，在健康亚群细胞表达最低，在晚期凋亡亚群细胞表达最高；木材形成过程中导管发育相关基因(PtrXCP1、PtrMC9、PtrEXP6、PtrLAC17)也是随着细胞程序性死亡的进一步发生，表达量随之升高；纤维发育相关基因(PtrSND1、PtrCAld5H2、PtrMYB010、PtrCCoAOMT3)在健康细胞中表达量高，其原因可能是木质部纤维的死亡过程是非液泡裂解依赖类型的慢性死亡过程，在AnnexinV-FITC/PI染色快速模拟细胞凋亡过程中，此类基因表达量上调不明显，但该类基因的表达在晚凋细胞中的表达量要高于早凋细胞，且该类基因的表达趋势是一致的；射线发育相关基因(PtrCP26、PtrCAD7)在晚期凋亡阶段的表达量高于早凋阶段，说明射线细胞也伴有程序化死亡发生；形成层发育相关基因(PtrWOX4a、PtrHB15)在健康细胞中表达量最高，说明剥皮后的茎段中也有少量形成层细胞。

结合基因表达定量分析，并依据细胞形态、大小、凋亡状态等推测阴性细胞亚群(Q4)细胞最小、少有破损、无荧光信号、活性好，推测其可能包含未成熟纤维细胞、射线细胞和少量的形成层细胞；早期凋亡细胞亚群(Q3)，该群细胞体积相对较大、细胞膜有破损、有AnnexinV-FITC绿色荧光信号，推测其可能多为纤维细胞；晚期凋亡亚群(Q2)细胞体积最大，破损严重，既有AnnexinV-FITC绿色荧光信号又有PI红色荧光信号，推测其多为导管细胞。

本发明的基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，能够有效区分AnnexinV-FITC荧光、PI荧光从而直接定量测出木质部原生质体中发生早期凋亡、晚期凋亡的细胞个数，从而得出凋亡率，进一步对不同凋亡阶段进行分选，通过RT-qPCR验证不同阶段亚群细胞相关基因表达量，弥补了现有技术无法在转录水平检测细胞凋亡的不足，从而建立基于流式细胞术的木本植物细胞程序性死亡的定量可靠、结果精度高的新检测方法。

本发明的基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，不仅限于杨树，其它木本植物材料也同样适用。另外，随着木本植物基因功能的深入研究，大量与材性发育、细胞程序性死亡相关基因的转基因材料的获得，也可应用本发明提供的方法进行细胞程序性死亡相关检测。

表1实时荧光定量PCR所用引物序列Table 1The primer pair sequences usedfor quantitative real-time PCR

本发明的基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，通过流式分群分析出不同凋亡阶段细胞个数，得出不同阶段凋亡率；又进一步通过流式，对不同凋亡阶段细胞进行分选，通过RT-qPCR鉴定相关基因表达水平，该方法利用流式细胞仪分选木质部细胞程序性死亡不同阶段的特定细胞，具有定量可靠，分析准确，结果精度高等优点，为木本植物细胞程序性死亡提供新的研究方法。

虽然以上对本发明目的构思和实施例作了详尽说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明做出各种改进和变换，而这种改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，包括如下步骤：

(1)将待检测木本植物茎段剥皮后，进行木质部细胞原生质体酶解，得到原生质体酶解细胞；

(2)将步骤(1)中得到的原生质体酶解细胞进行离心悬浮处理，获得原生质体浓缩液；

(3)向步骤(2)中得到的原生质体浓缩液中添加AnnexinV-FITC，孵育处理后，继续加入PI染色处理，获得木质部原生质体染色液；

(4)对步骤(3)中得到的木质部原生质体染色液进行流式拍照检测，生成AnnexinV-FITC/PI散点图，并获得阴性细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞的染色及细胞形态成像图；

(5)对步骤(3)中得到的木质部原生质体染色液中的细胞进行分选，并分别收集不同时期细胞程序性死亡的亚群细胞；

(6)显微拍照，分别观察对步骤(2)、步骤(3)分选前和分选后不同细胞程序性死亡时期的亚群细胞形态；

(7)RT-qPCR分析步骤(3)中分选后不同亚群细胞，细胞凋亡和材性发育相关基因的表达量。

2.如权利要求1所述基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述木本植物为杨树。

3.如权利要求2所述基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，其特征在于：步骤(1)中，酶解的具体步骤如下：

1)温室培养2月龄银腺杨84K，分离表皮和树干；

2)加入30ml酶解液：0.6M D-mannitol；20mM MES pH5.7；1.5％纤维素酶R-10；0.4％果胶酶Y-23；20mM KCL；10mM CaCl₂；0.1％BSA，到50ml离心管中，将剥皮后的树干放进离心管中，25℃避光放置，酶解40min；

3)将酶解后的树干取出来，放在30ml的W5溶液：2mM pH5.7 MES、3MNaCl、1M CaCl₂、2MKCl；轻轻晃动树干，让酶解后的细胞落到W5溶液中；

4)将W5溶液用70μm细胞筛过滤，200g离心5min；

5)去掉上清液，W5溶液重悬细胞，200g离心5min；

6)W5溶液重悬细胞，调整细胞浓度约10⁶cells/ml，得到木质部原生质体细胞浓缩液。

4.如权利要求3所述基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，其特征在于：步骤(3)中用AnnexinV-FITC和PI进行处理的具体步骤如下：

1)上述木质部原生质体细胞浓缩液中，按100μl细胞液加入5μl的比例，加入AnnexinV-FITC，冰上避光孵育20min；

2)200g离心5min，加入相同体积WI溶液：0.6M D-mannitol、20mM MES、20mM KCL、0.1％BSA；得浓缩液；

3)向上述2)所得浓缩液中，继续加入PI染色，按100μl细胞液加入1μl的比例加入PI，冰上避光孵育5min。

5.如权利要求3所述基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，其特征在于：步骤(5)中分选的具体步骤如下：

1)上CS&T beads，完成流式细胞分选仪的质控操作，保证不同时间实验数据的一致性，调试好细胞分选的各项参数，100μm喷嘴，4way分选，4way purity模式，调节偏转电压，使液流直接进入到收集中央；

2)新建实验模板Experiment，参数包括FSC,SSC,FITC和PI；先上样阴性对照样本，然后，上样待测样本，各保存10000个细胞，根据阴性对照和阳性待测样本，划出荧光信号门；将对应荧光信号的门分别选入对应分选Way，上样后开始分选，根据需要选择分选结束方式。

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