CN108398361B - 利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 - Google Patents
利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108398361B CN108398361B CN201810516900.XA CN201810516900A CN108398361B CN 108398361 B CN108398361 B CN 108398361B CN 201810516900 A CN201810516900 A CN 201810516900A CN 108398361 B CN108398361 B CN 108398361B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- staining
- marker
- control group
- blood
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 title abstract description 28
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 title abstract description 28
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 title abstract description 24
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 title abstract description 21
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 title abstract description 17
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 30
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 24
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 23
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 claims description 13
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 claims description 13
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 8
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 7
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 6
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 5
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 claims description 4
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 8
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 7
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 3
- 210000004103 basophilic normoblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 3
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091060290 Chromatid Proteins 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 1
- 101710098610 Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108700012214 MAE protocol Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000037048 Prodromal Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- BKZJXSDQOIUIIG-UHFFFAOYSA-N argon mercury Chemical compound [Ar].[Hg] BKZJXSDQOIUIIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGJPLFUDZQEBFH-UHFFFAOYSA-N argon xenon Chemical compound [Ar].[Xe] DGJPLFUDZQEBFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004756 chromatid Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009033 hematopoietic malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004005 intermediate erythroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001527 leucocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000000468 rubriblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 229920005992 thermoplastic resin Polymers 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 101150060219 tsp-1 gene Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
- G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
-
- G01N2015/011—
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
Abstract
本发明公开一利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法，包括以下步骤:S1:准备血样本：S2:准备对照组和实验组：S3：染色第二实验组以及重悬第二对照组：S4：处理染色实验组：S5：核酸染色；S6：流式方法检测所述检测实验组；以及S7：分析所述分析结果，通过快速判断早期受损的红细胞中的DNA损伤信号的方式预测血液病的转归情况，具有特异性强以及灵敏度高的优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法及其应用，在临床医学上有着广泛的应用。
背景技术
血液病，又可称之为造血系统疾病，指的是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变的疾病，其中造血系统包括血液、骨髓单核、巨噬细胞系统和淋巴组织。概言之，凡是涉及到造血系统病理、生理，并以其为主要表现的疾病，都属于血液病的范畴。在临床上，血液病又可分为红细胞疾病、白细胞疾病、出血和血栓性疾病，具体来讲，常见的有白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症、血小板减少症、多发性骨髓瘤、淋巴瘤以及血友病等。然而，血液系统疾病的诱发因素极多又多半是难治性疾病。
以急性白血病为例，急性白血病(acute leukemia，AL)是造血干细胞的恶性克隆性疾病，发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞(白血病细胞)大量增殖，蓄积于骨髓并抑制正常造血，广泛浸润肝、脾、淋巴结等髓外脏器。表现为贫血、出血、感染和浸润等征象。根据受累的细胞类型，AL通常可以分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblasticleukemia，ALL)和急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)两大类。我国AML的发病率约为1.62/10万，而ALL则约为0.69/10万。成人以AML多见，儿童以ALL多见。急性白血病若不经特殊治疗，平均生存期仅3个月左右，短者甚至在诊断数天后即死亡。
目前针对急性白血病的诊断就是尽可能多地消灭白血病细胞群体和控制白血病细胞的大量增生，解除因白血病浸润而引起的各种临床表现，以期获得完全缓解，随着医疗水平的进步，急性白血病的诊断治疗方法也日益发展完善，而针对急性白血病的诊断和危险分层主要依据细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子学分型的检测结果来确定，但由于检测费用昂贵，不少患者只进行简单的形态学检查，这对于患者诊疗和远期预后的改善是不利的。当然目前市面上还有通过酶反应速率法、反射免疫法检测乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)及血清铁蛋白(serum ferritin,SF)水平预测急性白血病患者病情发展及预后的方法以及通过RT-PCR方法监测血细胞磷酸酶(SHP-1)基因和原癌基因c-kit的表达来作为白血病转归的指标，但是这些转化预测方法的特异性差，灵敏度低，步骤繁琐，检测周期长，依旧无法很好地被适用于临床的治疗和诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供一利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法及其应用，通过快速判断早期受损的红细胞中的DNA损伤信号的方式预测血液病的转归情况，具有特异性强以及灵敏度高的优势。
本发明的目的在于提供一利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法及其应用，通过筛选特定红细胞并进行特定红细胞损伤信号检测的方式，预测血液病的转归，具有步骤方法简单，检测周期短的优势。
本发明的目的在于提供一利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法及其应用，检测血样本取自患者的外周血，检测过程对患者伤害小，且可实现微量检测，以在提高检测效率的同时减少病患的痛苦。
本发明的目的在于提供一利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法及其应用，该方法特别适用于急性白血病的转归预测，在临床上有着广泛的应用。
为了实现以上任一发明目的，本发明提供一利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法，包括以下步骤:
S1:准备血样本：获取血液疾病患者的抗凝血样本，按照1％体积比将所述抗凝血样本在室温环境下固定于1％-4％的多聚甲醛溶液当中，固定10-20分钟后，形成含有血样本的固定液；
S2:准备对照组和实验组：分别取用相同体积的固定液设置为第一对照组和第一实验组，所述第一对照组和所述第一实验组均在室温环境下300-400g离心,弃上清液，随后用1*PBS重悬清洗2-3次，得到处理过后的第二对照组和处理过后的第二实验组；
S3：染色第二实验组：取所述第二实验组加入Human FcR Binding，在4摄氏度下孵育15-20分钟，随后使用染色缓冲剂在室温避光环境下染色所述第二实验组，得到第三实验组，其中所述染色缓冲剂为含RNase的染色试剂以及核酸染色剂的组合，染色15-30分钟，其中所述含RNase的染色试剂为含第一标记物标记的CD235a以及第二标记物标记的CD47，所述核酸染色剂为含Hoechst33342和Thiazole orange的1×PBS，其中所述第一标记物不同于所述第二标记物；
S4：重悬第二对照组：使用1*PBS重悬所述第二对照组，得到第三对照组；
S5：流式方法检测所述第三实验组以及所述第三对照组：将所述第三实验组和所述第三对照组放置于流式细胞仪中检测，得到分析结果；以及
S6：分析所述分析结果。
在一些实施例中，所述步骤S6进一步包括；
S61：选择含有所述CD235a的阳性细胞群体；
S62：在步骤S62的基础上选择CD47表达量处于TOP5％细胞群体；以及
S63：在步骤S62的基础上选择Hoechst33342和Thiazole orange双阳性的细胞群体，记录CD47表达量为TOP5％的细胞群体中Thiazole orange和Hoechst33342双阳的群体百分比，得到损伤信号。
在一些实施例中，对应1ul的血样本使用0.1-0.15μg所述第一标记物标记的CD235a、0.03-0.1μg所述第二标记物标记的CD47、0.014-0.08nmol Hoechst33342和0.04-0.2μg Thiazole orange的1×PBS。
在一些实施例中，包括步骤S7:快速有效的对比患者自身DNA损伤信号比例的变化。
在一些实施例中，所述步骤S3中，所述第一标记物为APC，所述第二标记物为PE。
在一些实施例中，所述流式细胞仪的记录个数为100000个、记录时间120s、样本流速30微升/分钟。
在一些实施例中，所述血样本为骨髓或者外周血，所述血样本的体积为1-3ul，所述低温环境为4℃。
在一些实施例中，所述步骤S2和所述步骤4中，离心时间为4-6分钟。
根据本发明的另一方面，本发明提供一利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的应用，其特征在于，采用权利要求1到5任一所述的用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法，被应用于预测急性白血病的转归情况。
附图说明
图1到图4是根据本发明的利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法的实验过程示意图。
图5到图10是根据本发明的所述利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法产生的流式分析图的示意图。
图11是根据本发明的所述利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归方法在应用中的实验数据图。
其中，附图5到图10中阅读顺序为从左上图以“Z”字方式到右下图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
在介绍本发明的具体实施内容之前，先对该实施内容中涉及到的名词进行简要的说明介绍：
转归：是指疾病的转移和发展的意思。一般而言，疾病的发展过程常可分为四期：潜伏期、前驱期、症状明显期、转归期，而疾病的转归又可分为痊愈、死亡、缠绵、后遗以及复发。或者可以说，疾病的转归有完全恢复健康，不完全恢复健康以及死亡三种情况。
红细胞DNA损伤信号：成熟的红细胞是没有细胞核的，如果在红细胞发育成熟的前期，染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失整个染色体，在细胞分裂后期，部分DNA核酸片段仍然遗留在细胞质中，也就是说，这些残留的DNA信号会在成熟的红细胞胞质内单独形成一个或几个规则的次核，这些次核即为残留的DNA损伤信号。
CD235a：血型糖蛋白A，是一种单跨膜糖蛋白，表达于成熟红细胞和红系前体细胞，为红细胞表面特殊的标记蛋白。
CD47：也叫做整合素相关蛋白(integrin associated protein，IAP)，是免疫球蛋白超家族成员，CD47广泛地表达于细胞的表面，可与信号调节蛋白α(Signal regulatoryproteinα,SIRPα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1,TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，介导凋亡、增殖、免疫等一系列的反应，研究表明，白血病细胞比起正常细胞来，会生成更多的CD47蛋白，CD47蛋白与红细胞生存周期有关。
PBS：磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)的缩写,一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。
APC：别藻蓝蛋白(Allophycocyanin)，是一种蓝绿色水藻中分离出来的藻胆(色素)蛋白。与其它藻胆蛋白一样，APC具有荧光性，伴随着非常高的光吸收和高量子效率。
PE：聚乙烯(polyethylene，简称PE)是乙烯经聚合制得的一种热塑性树脂。
Hoechs33342：可在350nm左右的紫外光激发，都在461nm处发出蓝靛色荧光，未被结合的染料最大发射光在510到540nm之间，可被氙-氩灯或水银-氩灯或紫外激光激发，激发光和发射光之间的斯托克斯位移巨大，故可用于多染料多颜色荧光染色。
Thiazole orange：噻唑橙是一种化学物质，化学式是C26H24N2O3S2。
Human FcR Binding：或者称作Human Fc Block，可以有效阻止细胞表面Fc受体的非特异结合，降低背景干扰获得更准确的结果。
由于成熟的红细胞是无核的，这就意味着成人外周血中出现有核红细胞均属病理现象，如果成人外周血内出现大量的晚幼红细胞或中幼红细胞，意味着骨髓中红细胞系增生明显活跃，则有可能是增生性贫血，而如果成人外周血中出现大量的原红细胞、早幼红细胞的话，意味着骨髓中幼稚红细胞异常增生并释放入血，则有可能是红血病或者红白血病，如果成人外周血中各个发育阶段的红细胞都可以见到，并且可以见到幼稚粒细胞及巨核细胞，则有可能是髓外造血。特别地，针对造血系统恶性疾病来说，骨髓充满大量白血病细胞使幼红细胞提前释放，有核红细胞以中幼晚幼为主。
本发明提供的利用红细胞DNA损伤信号预测血液病转归的方法，基于CD235a和CD47标记蛋白组合，通过流式方法筛选出特定红细胞，使用核酸染料分析所述特定红细胞内的核酸信号，即为红细胞的DNA损伤信号，通过快速有效的对比患者自身DNA损伤信号比例的变化，建立高效、快速、高敏感的RBCs损伤检测体系，进而预测血液病患者的转归情况。
具体而言，所述利用红细胞DNA损伤信号预测血液转归的方法，以下简称为转归预测方法，包括以下步骤：
S1：准备血样本：获取血液疾病患者的抗凝血样本，按照1％体积比将所述抗凝血样本在室温环境下固定于1％-4％的多聚甲醛溶液当中，固定10-20分钟后，形成含有血样本的固定液，放置于低温环境下长期保存。
S2：准备对照组和实验组：分别取用一定体积的固定液设置为第一对照组和第一实验组，所述第一对照组和所述第一实验组均在室温环境下300-400g离心5min，弃上清液，随后用1*PBS重悬清洗2-3次，得到处理过后的第二对照组和处理过后的第二实验组。
S3：染色第二实验组：取所述第二实验组加入Human FcR Binding，在4摄氏度下孵育15-20分钟，随后使用染色缓冲剂在室温避光环境下染色所述第二实验组，得到第三实验组，其中所述染色缓冲剂为含RNase的染色试剂以及核酸染色剂的组合，染色15-30分钟，其中所述含RNase的染色试剂为含第一标记物标记的CD235a以及第二标记物标记的CD47，所述核酸染色剂为含Hoechst33342和Thiazoleorange的1×PBS。
S4：重悬第二对照组：使用1*PBS重悬所述第二对照组，得到第三对照组。
S5：流式方法检测所述第三实验组以及所述第三对照组：将所述第三实验组和所述第三对照组放置于流式细胞仪中检测，得到分析结果。
S6：分析所述分析结果:
S61：选择含有所述CD235a的阳性细胞群体；
S62：在步骤S61的基础上选择CD47表达量处于TOP5％细胞群体；以及
S63：在步骤S62的基础上选择Hoechst33342和Thiazole orange双阳性的细胞群体，记录CD47表达量为TOP5％的细胞群体中Hoechst33342和Thiazole orange双阳的群体百分比，得到损伤信号。
值得一提的是，在本发明的实施例中，选择CD235是因为其是红细胞表面特有的标记物，从而筛选出血样本中的红细胞，然后在红细胞里选择处于CD47表达量为TOP 5％的细胞群体，即选择了血液中较为新鲜的红细胞。
具体而言，在所述步骤S1当中，其中所述抗凝血样本为骨髓或者外周血，并且所述低温环境优选为4℃，此温度保存效果最佳，另外，本发明只需要获取微量的血样本即可，极大程度地提高测试效率以及减轻病患的痛苦，一般而言，只需要1-3ul的微量血样本。
在所述步骤S2当中，准备所述对照组以及所述实验组的可变因素应控制为一致，也就是说，所述对照组以及所述实验组应该在同样的环境下进行实验准备，以此方式确保不必要的干扰因素的干扰。
在所述步骤S3当中，按照2μl-15μL/test的标准加入Human FcR Binding，所述染色缓冲剂中所述第一标记物不同于所述第二标记物，以在检测时区别所述CD235a以及所述CD47，值得一提的是，对应不同标记物在检测时以不同的波长范围为准，在本发明的实施例中，选用APC标记的CD235a以及PE标记的CD47，其标记物的类型不受影响。
在所述步骤S5当中，选用流式细胞仪的型号为Beckman Coulter的CytoFLEX LX流式细胞仪，当然可以不只是用这特定类型的流式分析仪。在本发明的实施例中，所述流式分析仪的相关参数如下：
采集参数：记录个数100000个、记录时间120s、样本流速30微升/分钟；
通道选择：CD235a-APC为Red 660/10、CD47-PE为Yellow 585/42、Hoechst33342为UV 450/45、Thiazole orange为Blue 525/40。
在所述步骤S5当中，所述流式分析仪分析得到的结果如图6所示，在分析图中可以清楚地看到被所述第一标记物标记的CD235a，并得到CD235a阳性细胞群体内CD47表达量处于TOP5％细胞群体，在该CD47表达量处于TOP5％细胞群体又得到Hoechst33342和Thiazoleorange双阳性的细胞群体，最终计算得到DNA的损伤信号。
在所述步骤S6之后，在获取到损伤信号后，医用人员可快速有效的对比患者自身DNA损伤信号比例的变化，进而预判患者血液疾病的转归情况。
另外，以下将以详细的实验数据作为该转归预测方法的实验支持，但熟悉该技术的人应该明白，所述实验数据只是作为一个具体实施例存在，所述实验数据可以比例的方式进行类推。
在该实验例中，选用10ul的患者抗凝血样本，按照1％的体积比固定于1％-4％的多聚甲醛溶液中，即所述多聚甲醛溶液的体积为1000ul，室温固定10-20min后可于4℃长期保存。随后从中取出含1ul血样本的固定液，对应1ul血样本采用200ul的1*PBS重悬对照组样本，200ul的染色缓冲剂重悬所述实验组样本，并且所述实验组样本中包括0.1-0.15μgAPC标记的CD235a、0.03-0.1μg PE标记的CD47、0.014-0.08nmol Hoechst33342和0.04-0.2μg Thiazole orange的1×PBS。
也就是说，抗凝血样本以体积比1：100的比例添加至多聚甲醛溶液中,得到含有血样本的固定液。取出含有一定体积的血样本的固定液，进行后续染色标记操作，其中所述血样本和所述染色缓冲剂的体积比控制为1:200，对应1ul血样本的染色缓冲剂中含有0.1-0.15μg APC标记的CD235a、0.03-0.1μg PE标记的CD47、0.014-0.08nmol Hoechst33342和0.04-0.2μg Thiazole orange的1×PBS。
特别值得一提的是，本发明提供的所述转归预测方法在每次测量时只要使用1ul的微量血样本，并且抗体孵育的时间为20-30分钟，单个样本检测时间在1分钟左右。然而血常规需要血样本5ml，并且其检测速度大概在1个小时，相较于传统的血常规检测方法，所述转归预测方法微量检测，检测效果高，特异性佳，灵敏度高，在临床中有着非常重要的实际意义。
另外，本发明提供的所述利用红细胞DNA损伤信号预测血液转归的方法特别适用于预测急性白血病的转归，已有具体的临床数据作为支持，说明如下：
以上表格为一ALL患者采用不同治疗方案治疗检测得到的数据图，如图所示，在2017年11月24日，该ALL患者采用达沙替尼进行治疗，并且诊断该ALL患者为中枢复发ALL(Ph阳性)，抽取该患者的外周血通过所述转归预测方法进行检测，得到该患者的红细胞DNA损伤高达90.03％。
在2017年12月25日，当该患者采用MAE方案化疗后19天后，诊断为ALL复发，抽取该患者的骨髓，用上述方法检测其红细胞DNA损伤信号为3.06％。
在2018年2月11日，当该患者诊断为骨髓缓解状态，但bcb/abl仍阳性，PH+，复发，T315I突变阳性，中枢累及时，检测得到其红细胞损伤信号为2.44％。
从表格的数据可以看到，随着治疗的推进，该患者的红细胞损伤信号从最初的90.03％到后面维持在3％以下的数值。
通过数据分析，医用人员可以根据患者的红细胞DNA损伤信号预判血液病的转归情况，特别是急性白血病的转归。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.含RNase的染色试剂和核酸染色剂的组合在制备用于进行一种利用红细胞损伤信号预测血液病转归的方法的制剂中的用途，其中所述含RNase的染色试剂为含第一标记物标记的CD235a以及第二标记物标记的CD47，其中所述第一标记物不同于所述第二标记物，所述核酸染色剂为含Hoechst33342和Thiazole orange的1×PBS，并且所述方法包括以下步骤：
S1：准备血样本：获取抗凝血样本，按照1%体积比将所述抗凝血样本在室温环境下固定于1%-4%的多聚甲醛溶液当中，固定10-20分钟后，形成含有血样本的固定液；
S2：准备对照组和实验组：分别取用相同体积的固定液设置为第一对照组和第一实验组，所述第一对照组和所述第一实验组均在室温环境下300-400g离心，弃上清液，随后用1*PBS重悬清洗2-3次，得到处理过后的第二对照组和处理过后的第二实验组；
S3：染色第二实验组：取所述第二实验组加入Human FcR Binding，在4摄氏度下孵育15-20分钟，随后使用染色缓冲剂在室温避光环境下染色所述第二实验组，得到第三实验组，其中所述染色缓冲剂为所述含RNase的染色试剂以及核酸染色剂的组合，染色15-30分钟；
S4：重悬第二对照组：使用1*PBS重悬所述第二对照组，得到第三对照组；
S5：流式方法检测所述第三实验组以及所述第三对照组：将所述第三实验组和所述第三对照组放置于流式细胞仪中检测，得到分析结果；以及
S6：分析所述分析结果，其中
所述步骤S6进一步包括：
S61：选择含有所述CD235a的阳性细胞群体；
S62：在步骤S61的基础上选择CD47表达量处于TOP5%细胞群体；以及
S63：在步骤S62的基础上选择Hoechst33342和Thiazole orange双阳性的细胞群体，记录CD47表达量为TOP5%的细胞群体中Thiazole orange和Hoechst33342呈现双阳的细胞群体百分比，得到损伤信号。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，对应1ul的血样本使用0.1-0.15μg所述第一标记物标记的CD235a、0.03-0.1μg所述第二标记物标记的CD47、0.014-0.08 nmolHoechst33342和0.04-0.2μgThiazole orange的1×PBS。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述步骤S3中，所述第一标记物为APC，所述第二标记物为PE。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述血样本为骨髓或者外周血，所述血样本的体积为1-3ul。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述流式细胞仪的记录个数为100000个、记录时间120s、样本流速30微升/分钟。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述步骤S2中，离心时间为4-6分钟。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810516900.XA CN108398361B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 |
| PCT/CN2019/078279 WO2019223406A1 (zh) | 2018-05-25 | 2019-03-15 | 利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810516900.XA CN108398361B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108398361A CN108398361A (zh) | 2018-08-14 |
| CN108398361B true CN108398361B (zh) | 2020-07-24 |
Family
ID=63101200
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810516900.XA Active CN108398361B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108398361B (zh) |
| WO (1) | WO2019223406A1 (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108398361B (zh) * | 2018-05-25 | 2020-07-24 | 西湖大学 | 利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 |
| CN111154719B (zh) * | 2019-02-28 | 2024-03-01 | 西湖生物医药科技(杭州)有限公司 | 利用外周血体外制备成熟红细胞的方法及制剂 |
| CN110108888B (zh) * | 2019-05-08 | 2020-06-09 | 杭州太铭生物科技有限公司 | 检测红细胞dna损伤信号的方法及其在淋巴瘤预后中的应用 |
| CN114746545A (zh) * | 2019-10-18 | 2022-07-12 | 西湖生物医药科技(杭州)有限公司 | 应用人工mhc呈递特异性癌症新抗原的工程化红细胞 |
| CN111157433A (zh) * | 2020-01-06 | 2020-05-15 | 中国科学院生态环境研究中心 | 用于红细胞的单个细胞标记的试剂盒及其检测方法 |
| CN113978674B (zh) * | 2021-12-08 | 2023-03-17 | 西湖大学 | 一种水下航行器 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000002709A (ja) * | 1998-06-13 | 2000-01-07 | Bml:Kk | 白血病の検出方法及び検出キット |
| WO2010045651A1 (en) * | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Nodality, Inc. | Methods for analyzing drug response |
| CN101886115A (zh) * | 2009-05-11 | 2010-11-17 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 三个microRNA在人急性髓系白血病诊断和治疗中的应用 |
| WO2016127220A1 (en) * | 2015-02-13 | 2016-08-18 | The University Of Queensland | Methods for classifying tumors and uses therefor |
| US10830777B2 (en) * | 2015-09-18 | 2020-11-10 | Bloodworks | Biochemical predictors of red blood cell quality |
| CN106701905A (zh) * | 2015-11-17 | 2017-05-24 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种用于急性髓细胞白血病预后分层的试剂盒 |
| CN107475398A (zh) * | 2017-09-06 | 2017-12-15 | 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 | 检测ikzf1基因突变分型的引物和方法 |
| CN108398361B (zh) * | 2018-05-25 | 2020-07-24 | 西湖大学 | 利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 |
-
2018
- 2018-05-25 CN CN201810516900.XA patent/CN108398361B/zh active Active
-
2019
- 2019-03-15 WO PCT/CN2019/078279 patent/WO2019223406A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108398361A (zh) | 2018-08-14 |
| WO2019223406A1 (zh) | 2019-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108398361B (zh) | 利用红细胞dna损伤信号预测血液病转归的方法及其应用 | |
| EP2267453B1 (en) | Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential | |
| Bain et al. | Basic haematological techniques | |
| Campana et al. | Advances in the immunological monitoring of childhood acute lymphoblastic leukaemia | |
| JP3783808B2 (ja) | 白血球分類計数用試薬 | |
| EP0179107B1 (en) | Metachromatic dye sorption means for differential determination of sub-populations of lymphocytes | |
| Sutherland et al. | High‐sensitivity detection of pnh red blood cells, red cell precursors, and white blood cells | |
| JPH0379666B2 (zh) | ||
| JP4435948B2 (ja) | 白血球の分類計数方法 | |
| CN107209101B (zh) | 用于诊断原发性免疫缺陷的试剂、方法和试剂盒 | |
| CN103842813B (zh) | 用于对样品中的稀少目标细胞进行细胞计数检测的方法和组合物 | |
| JP2008175807A (ja) | 血球分析装置および血球分析方法 | |
| Tung et al. | Identification of B-cell subsets: an exposition of 11-color (Hi-D) FACS methods | |
| CA2321203A1 (en) | Selective cell analysis | |
| Borowitz et al. | Measurable Residual Disease Detection in B‐Acute Lymphoblastic Leukemia: The Children's Oncology Group (COG) Method | |
| WO2009152428A1 (en) | Quantitative analysis of in vivo mutation at the pig-a locus | |
| Hübl et al. | Measurement of absolute concentration and viability of CD34+ cells in cord blood and cord blood products using fluorescent beads and cyanine nucleic acid dyes | |
| Gilman-Sachs | Flow cytometry | |
| CN108982839A (zh) | 基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法 | |
| Galvin et al. | Cell cycle analysis of hematopoietic stem and progenitor cells by multicolor flow cytometry | |
| JP2019516997A (ja) | 多発性骨髄腫における残存疾患の検出 | |
| Davis | Enumeration of Fetal Red Blood Cells, Hemoglobin‐Specific RBC Cells, and F Reticulocytes in Human Blood | |
| CN110108888B (zh) | 检测红细胞dna损伤信号的方法及其在淋巴瘤预后中的应用 | |
| CN109060640B (zh) | 用于检测b淋巴细胞的cd系列细胞检测玻片 | |
| Paietta | How to optimize multiparameter flow cytometry for leukaemia/lymphoma diagnosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220329 Address after: Room C1307, 198 Kaidi Road, Xiaoshan Economic and Technological Development Zone, Xiaoshan District, Hangzhou City, Zhejiang Province Patentee after: Hangzhou Taiming Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No.18, Shilongshan street, Zhuantang street, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province, 310024 Patentee before: WESTLAKE University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |