JP2019516997A - 多発性骨髄腫における残存疾患の検出 - Google Patents
多発性骨髄腫における残存疾患の検出 Download PDFInfo
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Abstract
Description
− ジストロフィー(dystrophy)形質細胞(正常な細胞質であるが、細胞学的な核の異常 (多核細胞、複数の又は異形の有糸分裂))の存在;及び
− 形質細胞増殖症、即ち、10%超か若しくはそれと同等である形質細胞増殖症の存在(深刻でない基準)、又はある症例においては、30%超の形質細胞増殖症の存在(深刻である基準、重度の病的状態)
を示す骨髄像の使用が挙げられる。
腫瘍性及び正常な形質細胞マーカーの特定の組合せの使用によって、本発明による方法は、先行技術において既に公知である検出方法を使用して取得したものと少なくとも同等である、正常な及び腫瘍性形質細胞の検出の結果を取得することを可能にする。
a) 前記細胞試料を以下:
− κ鎖マーカー、λ鎖マーカー及び以下:CD38マーカーとCD138マーカーとから選択されるマーカー(3つのマーカーの各々が異なるシグナルを発する、以下においては、「先の3つのシグナル」)、並びに
− 先の3つのシグナルとは異なる、1つ以上の腫瘍性形質細胞マーカー(複数可)(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する、以下においては、「第4の」シグナル)、並びに
− 先の4つのシグナルとは異なる、1つ以上の正常な形質細胞マーカー(複数可)(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する、以下においては、「第5のシグナル」)
と接触させること、
b) 以下:
− CD38マーカー又はCD138マーカーについての陽性シグナル、特に強い陽性シグナル、及び
− κ鎖マーカー又はλ鎖マーカーについての陽性シグナル、特に強い陽性シグナル
によって特徴づけられる形質細胞を検出すること、
c) 工程b)において検出された形質細胞から、以下の基準:
− 腫瘍性形質細胞に特異的な少なくとも1つのマーカーについての陽性シグナル、及び/又は
− 正常な形質細胞の少なくとも1つのマーカーについての陰性か若しくは有意に低下したシグナル
の少なくとも1つを有する、腫瘍性形質細胞を検出すること(他の形質細胞が正常とみなされる)、並びに
d) 工程b)及びc)の間に取得した結果を分析し、正常な形質細胞と腫瘍性形質細胞とを定量すること
を含む、方法である。
従って、例えば、κ鎖マーカー、λ鎖マーカー及びCD229マーカーを使用し得る。
− CD19、CD27、CD45、CD52及びCD81の中で少なくとも1つのCDの消失、
− CD20、CD28、CD56、CD117、CD200及びCD229の中で少なくとも1つのCDの獲得、
− 腫瘍性形質細胞中で過少に発現するCD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99、CD138及びCD163、腫瘍性形質細胞中で過剰に発現するCD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD138、CD300a及びCD320の中で少なくとも1つのCDの発現レベルの変更、並びに/又は
− カッパ/ラムダ比 (単クローン性)の改変
を有する、形質(plasma)細胞、形質(plasmatic)細胞又は形質細胞(plasmatocytes)を意味することが意図される。
102未満:陰性シグナル、又は「−」;
102〜103:low若しくはdim陽性シグナル、又は「+/-」;
103〜104:mid若しくはintermediate陽性シグナル、又は「+」;
104超:high若しくはbright陽性シグナル、又は「++」。
− κ鎖マーカー、λ鎖マーカー、及びCD38又はCD138、選択的には、CD38マーカー(3つのマーカーの各々が異なるシグナルを発する)、並びに
− CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される、正常な形質細胞の1つ以上のマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)、並びに
− CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される、腫瘍性形質細胞の1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)
と接触させる。
(i)10個未満のマーカー、特に9つ以下のマーカー、又は更に8つ以下のマーカー、又は更に7つ以下のマーカー、又は更に6つ以下のマーカーのマーカー数で、以下:
・κ鎖マーカーと、λ鎖マーカーと、CD38又はCD138マーカーとを有する総形質細胞の少なくとも3つのマーカー、及び
・正常な形質細胞の少なくとも1つのマーカー、及び
・腫瘍性形質細胞の少なくとも1つのマーカー、及び
・任意選択で、少なくとも1つの細胞増殖マーカー、
を含み、並びに
(ii)8つ未満の蛍光色素、又は7つ以下の蛍光色素、又は更に6つ以下の蛍光色素、又は更に5つ以下の蛍光色素の数で、以下:
・総形質細胞のマーカーの3つの蛍光色素、及び
・正常な形質細胞のマーカー(複数可)の前記蛍光色素とは異なる蛍光色素、及び
・腫瘍性形質細胞のマーカー(複数可)の蛍光色素、及び
・任意選択で、細胞増殖マーカー(複数可)の蛍光色素
を含むマーカー、
と接触させる。
− κ鎖マーカー、λ鎖マーカー及びCD38マーカー(3つのマーカーの各々が異なるシグナルを発する)、並びに
− CD19マーカー及びCD27マーカー(前記先の3つのシグナルとは異なる、シグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)、並びに
− CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカー(先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)
と接触させる。
A.前記細胞試料を、使用した他のマーカーとは異なるシグナルを発する、1つ以上の細胞増殖マーカー(複数可)、選択的には、2つの細胞増殖マーカーと接触させること;
B.前記マーカー(複数可)により発せられたシグナルの分析によって、増殖している腫瘍性形質細胞を検出すること;
C.S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞のパーセンテージを決定すること;
D.任意選択で、前記細胞増殖マーカー(複数可)の少なくとも1つがDNAマーカーである場合、2倍性 (G0/G1又はG2/M)を決定すること
を含む、腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定することも含む。
− S期の細胞を特定することを可能にする増殖マーカー、例えばBrdU又はEdUのタイプの塩基類似体等
− G0期の細胞 (静止細胞)又はG1/S/G2/M期の細胞 (非静止細胞)を特定することを可能にする増殖マーカー、例、例えばKi67等のタンパク質のマーカー(Dako)
− G0/G1期又はG2/M期の細胞を特定することを可能にする増殖マーカー、例、例えばアクリジンオレンジ、DAPI、ヨウ化プロピジウム (PI)、又はHoechst色素 (33342若しくは33258)等のデオキシリボ核酸 (DNA)マーカー
から選択される。
− アロフィコシアニン(APC)にコンジュゲートした抗BrdU抗体によって認識される、BrdUのタイプの塩基類似体、若しくは蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor(登録商標)647に結合したアジドによって認識されるエチニルデオキシウリジン(EdU);及び/又は
− 活発な細胞周期において存在するタンパク質、例えば、蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor 647にコンジュゲートした抗Ki67抗体によって認識されるKi67;及び/又は
− 例えば、DAPI、PI、Hoechst色素 (33342若しくは33258)等のデオキシリボ核酸 (DNA)マーカー等
から選択される。
A1.ブロモデオキシウリジン (BrdU)を細胞試料と接触させること (供給者の推奨に従って;BrdU FlowKit;BD Pharmingen;カタログ:557892);
B1.デオキシリボヌクレアーゼ (DNase、BrdU FlowKit;BD Pharmingen;カタログ:557892)の作用によって、DNAを変性させること;
C1.使用した他のマーカーのシグナルとは異なるシグナルを発する蛍光色素にコンジュゲートした抗BrdU抗体を用いて、DNAに取り込まれたBrdUを標識すること(選択的には、前記蛍光色素はAPCである);
D1.フローサイトメトリーによって、前記BrdUを用いて標識した前記細胞を検出すること;
E1.S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞のパーセンテージを決定すること
を含む。
A2.エチニルデオキシウリジン (EdU)を細胞試料と接触させること (供給者の推奨に従って;Click-it(登録商標)Plus EdU Alexa Fluor(登録商標)647フローサイトメトリーアッセイキット、Life Technologies、カタログ:C10635);
B2.使用した他のマーカーのシグナルとは異なるシグナルを発する蛍光色素を用いて、EdUを標識すること(選択的には、前記蛍光色素はAlexa Fluor(登録商標)647である);
C2.フローサイトメトリーによって、前記EdUを用いて標識した前記細胞を検出すること;
D2.S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞のパーセンテージを決定すること
を含む。
A3.ブロモデオキシウリジン (BrdU)を細胞試料と接触させること (供給者の推奨に従って;BrdU FlowKit;BD Pharmingen;カタログ:557892);
B3.デオキシリボヌクレアーゼ (DNase、BrdU FlowKit;BD Pharmingen;カタログ:557892)の作用によって、DNAを変性させること;
C3.使用した他のマーカーのシグナルとは異なるシグナルを発する蛍光色素にコンジュゲートした抗BrdU抗体を結合させることによって、DNAに取り込まれたBrdUを標識すること(選択的には、前記蛍光色素はAPCである);
D3.DAPIを細胞試料と接触させること;
E3.フローサイトメトリーによって、前記BrdU及びDAPIを用いて標識した前記細胞を検出すること;
F3.S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞の2倍性及びパーセンテージを決定すること
を含む。
A4.エチニルデオキシウリジン (EdU)を細胞試料と接触させること (供給者の推奨に従って;Click-it(登録商標)Plus EdU Alexa Fluor(登録商標)647フローサイトメトリーアッセイキット、Life Technologies、カタログ:C10635);
B4.使用した他のマーカーのシグナルとは異なるシグナルを発する蛍光色素を用いて、EdUを標識すること(選択的には、前記蛍光色素はAlexa Fluor(登録商標)647である);
C4.DAPIを細胞試料と接触させること;
D4.フローサイトメトリーによって、前記EdU及びDAPIを用いて標識した前記細胞を検出すること;
E4.腫瘍細胞及び正常な形質細胞の2倍性を決定すること
を含む。
− 単位体積毎に、細胞集団の量又は細胞集団のグループを、決定又は受容する工程;
− 定量された集団又は集団のグループに対する、形質細胞集団の割合を決定すること;
− 単位体積毎に、形質細胞集団を定量すること
を含む。
1)本発明による方法を実行すること、並びに
2)以下:
a)本発明による方法の工程d)の分析の結果に従って、総白血球細胞中の腫瘍性形質細胞の割合が、所定の閾値を超える場合;及び/又は
b)単位体積毎の腫瘍性形質細胞数が所定の閾値を超える場合
の単クローン性ガンマグロブリン血症を発症するリスクを実証すること
を含む、方法である。
i)患者に由来する第一の細胞試料において、本発明による検出方法を実行すること、
ii)患者に由来する第二の細胞試料において、本発明による検出方法を実行すること(前記第一の試料を取得した後に、前記第二の試料が取得されている)、並びに
iii)第一及び第二の試料を用いて取得した、工程d)の結果の分析を比較すること、並びに
iv)工程iii)の分析結果に従って、前記患者の前記単クローン性ガンマグロブリン血症の進行 (腫瘍量、増殖、単クローン性等)をモニターすること
を含む、方法である。
− 異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー、並びに
− 以下:CD38マーカー又はCD138マーカーから選択されるマーカー(前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する)、並びに
− CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される、正常な形質細胞に特異的である、1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する))、並びに
− CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される、腫瘍性形質細胞に特異的である、1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)
を含む、組成物にも関する。
− 異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー;並びに
− 以下:CD38マーカー及びCD138マーカーから選択されるマーカー(前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する);並びに
− CD19マーカー及びCD27マーカー(前記マーカーが、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する);並びに
− CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカー(前記マーカーが、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)
を含む。
− 異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー;並びに
− 以下:CD38マーカー及びCD138マーカーから選択されるマーカー(前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する);並びに
− CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される、正常な形質細胞についての1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する);並びに
− CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞についての1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)
を含む、本発明による方法を実施するための組成物の使用である。
− 異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー;並びに
− 以下:CD38マーカー及びCD138マーカーから選択されるマーカー(前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する);並びに
− CD19マーカー及びCD27マーカー(前記マーカーが、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する);並びに
− CD56マーカー、CD117マーカー、CD200マーカー(前記マーカーが、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)
を含む;本発明による方法を実施するための、組成物の使用である。
− 異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー;並びに
− 先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する、CD38マーカー又はCD138マーカー;並びに
− CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される正常な形質細胞についての、1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカーの各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する);並びに
− CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞についての、1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカーの各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する);
を含む、本発明による方法を実行するためのキットである。
− 異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー;並びに
− 先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する、CD38マーカー又はCD138マーカー;並びに
− CD19マーカー及びCD27マーカー(先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する);並びに
− D56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカー(先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル(別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる)を発する)
を含む。
− BrdUのタイプの塩基類似体、及びAPCにコンジュゲートした抗BrdU抗体、若しくは、EdU、及び蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor(登録商標)647に結合したアジド;並びに/又は
− 活発な細胞周期中に存在するタンパク質、例えば、蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor 647にコンジュゲートした抗Ki67抗体によって認識されるKi67についてのマーカー;並びに/又は
− 例えば、DAPI、PI、Hoechst色素 (33342若しくは33258)等のデオキシリボ核酸 (DNA)マーカー
から選択される、少なくとも1つの細胞増殖マーカーを含み、
前記細胞増殖マーカー(複数可)の各々が、前記キット中に存在する他のマーカーによって発せられるシグナルとは異なる、特に先の5つのシグナルとは異なるシグナルを発する。
− ブロモデオキシウリジン (BrdU)塩基類似体;
− デオキシリボヌクレアーゼ (DNase、BrdU FlowKit;BD Pharmingen;カタログ:557892);
− 蛍光色素にコンジュゲートした抗BrdU抗体を含むマーカー(前記キット中に存在するマーカーによって発せられる他のシグナルとは異なるシグナルを発する);
− 任意選択で、DAPI(前記キット中に存在する他のマーカーの各々のシグナルとは異なるシグナルを発する)
から選択される少なくとも1つの細胞増殖マーカーを含むという点において特徴づけられる(前記細胞増殖マーカー(複数可)の各々が、前記キット中に存在するマーカーの各々のシグナルとは異なるシグナルを発する)。
− エチニルデオキシウリジン (EdU)塩基類似体;
− 蛍光色素に結合したアジド(前記キット中に存在するマーカーによって発せられる他のシグナルの各々とは異なるシグナルを発する);
− 任意選択で、DAPI(前記キット中に存在するマーカーの各々のシグナルとは異なるシグナルを発する)
から選択される少なくとも1つの細胞増殖マーカーを含むという点において特徴づけられる。
本ストラテジーの原理は、それらのサイズ、それらの構造の複雑性及び細胞マーカーの存在、又は蛍光色素に結合した抗体によって認識される抗原によって、目的の細胞を識別することである。形質細胞には特徴的な8つの抗原(CD38、κ、λ、CD19、CD27、CD56、CD117及びCD200)が存在し、それらに特異的な抗体は単一のチューブ中で5つの異なる蛍光色素に結合される (CD38/PeCy5.5、κ/PECF594、λ/FITC、(CD19、CD27)/PeCy7、(CD56、CD117、CD200)/PE)。本ストラテジーは、半日で実施することが出来る。
抗CD38抗体、抗カッパ抗体及び抗ラムダ抗体は、他の白血球から総形質細胞を識別するために使用され、抗体の2つのグループによって腫瘍細胞を特定することが可能となる。陰性群は抗CD19抗体及び抗CD27抗体を含み、陽性群は抗CD56抗体、抗CD117抗体及び抗CD200抗体を含む。図1は、形質細胞を特定するために行われた、様々なウィンドウ(windowing)操作を表す。第一の工程は、FSC及びSSCチャンネル上でのパルス形状の分析によって、多重項(multiplets)を除去することからなる。次いで、FSC/SSCマトリクス上のデブリ(debris)を除去する。次いで、CD38/κ又はCD38/λマトリクス上で、それぞれCD38及びκ、又はCD38及びλのいずれかを強く発現している細胞を選択する。κ/λマトリクス上の対角の事象を除去する。形質細胞集団を識別した後、陽性群及び陰性群によって腫瘍細胞を特定する。
骨髄試料の採取に続いて、前記骨髄は、あらゆる骨のデブリを除去するために、濾過しなければならない。次いで、赤血球細胞を、NH4Cl溶解液を用いて (1/4比)溶解し、これに由来するデブリは遠心分離によって大部分が除去される。それぞれの蛍光色素CD56-PE (Beckman Coulter;カタログ:A07788)、CD117-PE (Beckman Coulter;カタログ:IM2732)、CD200-PE (BD Pharmingen;カタログ:552475) (陽性群)、CD19-PeCy7 (Beckman Coulter;カタログ:IM3628)、CD27-PeCy7 (Beckman Coulter;カタログ:A54823) (陰性群)、CD38-PeCy5.5 (Beckman Coulter;カタログ:A70205)に結合した膜の抗体は、製造者の推奨に従って、細胞調製物中に直接、配置される。4℃で20分間インキュベーションした後に、PBSで洗浄し、細胞を固定する (Intraprep キット;Beckman Coulter;カタログ:A07803)。次いで、固定溶液を全て除去するために、PBSで前記細胞を洗浄する。最後に、製造者の推奨に従って、細胞を、透過させ (Intraprep キット;Beckman Coulter;カタログ:A07803)、κ-PE-CF594 (BD Pharmingen;カタログ:562620)及びλ-FITC (BD Pharmingen;カタログ:555796)の細胞質内抗体/蛍光色素からなるペアを用いて標識する。4℃で20分間インキュベーションした後に、PBSで洗浄し、フローサイトメトリー装置 (BD LSRFORTESSA X-20、BD Biosciences)を用いて試料を分析する。
多重項の除去
最初に、同時に測定ウィンドウを通過した細胞を、細胞のサイズ及び構造の複雑性にそれぞれ対応するFSC及びSSCパラメーターを使用して、除去する。これらの2つのパラメーターについて、測定ピークの高さ及び面積のマトリクスを使用し、このマトリクスの対角から外れる事象を除去する。これは高さの値及び面積値が比例しており、この比例の欠如(対角線の外側の点)が二重項又は更に多重項の存在を反映するためである。
次いで、溶解によって生じた細胞デブリ、主に赤血球細胞のデブリを除去する。白血球の全てを選択するため、及びサイズが小さく非常に複雑でない構造を有する細胞デブリを除去するために、FSC/SSCマトリクスを使用する。
3つのマーカーによって、総形質細胞の選択を実行し、それによって、CD38並びに2つの細胞質内タンパク質κ及びλを検出することが可能となる。形質細胞は、それらの膜表面上にCD38マーカーを強く発現している細胞である。これらの細胞は、(κ又はλ)軽鎖及び重鎖からなる抗体を産生することができる。各形質細胞は、1つのタイプの軽鎖のみを産生でき、「カッパ」又は「ラムダ」形質細胞と呼ばれる形質細胞の割合はそれぞれ2/3及び1/3である。多発性骨髄腫を患っている患者においては、κ又はλクローンの増殖によってκ/λ比の不均衡が誘発されるであろう。形質細胞は、CD38/κ及びCD38/λマトリクス上で独立して選択される。
κ及びλの次元(dimension)の対角線上にある事象が除去される。実際、形質細胞は、それらの寿命の間ずっとκ軽鎖又はλ軽鎖で分泌し得るが、両方を分泌することはない。
一度、総形質細胞が選択されると、腫瘍性形質細胞は、PEチャンネル上で測定された陽性群のマーカー(CD56/CD117/CD200)を発現している、及び/又はPE-Cy7チャンネル上で測定された陰性群のマーカー(CD19/CD27)の1つの発現を欠いている細胞を選択することによって、正常な形質細胞に関して、識別されなければならない。
「Suivi des therapie innovant」[「革新的治療モニタリング」]研究室によって開発され、実行され、先行技術 (Carauxら;2012)に記載されたストラテジーは、「STIストラテジー」として本明細書で言及され、4本の独立のチューブに分配された7個の異なる蛍光色素に結合した、形質細胞の特徴的な抗原(CD38、CD45、CD19、CD20、κ、λ、CD27、CD56、CD117及びCD200)に対する10個の抗体を必要とする。
図2は、STIストラテジーは連続的なウィンドウ操作を表す。第一の工程は、FSC及びSSCの次元によって、(幾つかの細胞が同時に検出ウィンドウを通過する)多重項を除去することからなる。次いで、非常に小さいサイズ(FSC)及び顆粒性(granulosities)(SSC)のデブリを、FSC/SSCマトリクス上で除去する。次いで、例えば形質細胞等の、CD38を強く発現している全ての細胞をCD38/CD45サイトグラム上で選択する。次いで、サイトグラムの対角にあるκ/λ事象を除去する。これは、形質細胞がκ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかを分泌するためである。4本のチューブの各々における総形質細胞の集団を特定した後で、マーカーによって腫瘍細胞を正常な形質細胞から識別する。それによって、最初の1つの発現及び/又は後の物の発現の喪失によって、CD27、CD56、CD117及びCD200を保護することが可能となる。従って、この先行技術の方法は、7色、同数の検出器、2つのレーザー及び4〜5本のチューブを使用し、それゆえ多くの高額な装置及び試薬を使用する。更に、そのような方法の使用は、データの準備、取得、コンペンセーション及び分析のためのサイトメトリーの専門家のノウハウを必要とする。比べて、本発明による方法 (実施例1)は実行することがより簡易であり、より経済的である:それは、5個の検出器、単一のレーザー及び単一のチューブを用いて実行でき、結果の解釈のためにサイトメトリーの専門家の介在を必要としない。
BrdU分析によって、S期 (合成期)の腫瘍細胞のパーセンテージを決定することが可能となる。DNA (2N/4N)を定量するために、DAPI (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール)、DNAのアデニン (A)塩基及びチミジン (T)塩基に強く結合することが出来る蛍光分子)が使用される。
細胞の増殖をモニターするために、供給者の推奨に従って、APC BrdU Flow Kit (BD Pharmingen、カタログ:557892)を使用した。
実施例1に記載したプロトコールに続いて、細胞溶液に350μlのDAPI/PermWash混合液を、2μl/mlで添加し、次いで、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞溶液をPBSで洗浄し、次いで、PBS中に懸濁した(taken up)後、フローサイトメトリー (CyAnTM ADPサイトメーター−Beckman Coulter)によって分析した。
S期の形質細胞が正常なレベル(0.60%)である、多発性骨髄腫を患っている患者 (図4)。
S期の形質細胞が高レベル(4.89%)である、多発性骨髄腫を患っている患者 (図5)。
Ki67によって、細胞周期にある細胞(静止していない細胞)のパーセンテージを定量することが可能となる。DNA (2N/4N)を定量するために、DAPI (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール、DNAのアデニン (A)塩基及びチミジン (T)塩基に強く結合することが出来る蛍光分子)が使用される。
2本のチューブ、表面を抗体で標識するときに細胞溶液に添加したAPCアイソタイプ(Beckman Coulter、Ref:IM2475U)を含む陰性対照、細胞質内を抗体で標識するときに細胞溶液に添加したAlexa Fluor 647に結合した抗Ki67 (BD Pharmingen、カタログ:558615)を含むKi67のチューブ(陽性)を使用する。
前記プロトコールに続いて、350μlのDAPI/PermWash混合液を、2μl/mlで細胞溶液に添加し、次いで、4℃で20分間インキュベートした。次いで、PBSで細胞溶液を洗浄し、次いで、PBS中に懸濁した(taken up)後、フローサイトメトリー (CyAnTM ADPサイトメーター−Beckman Coulter)によって分析する。
細胞周期にある細胞(静止していない細胞)をあるレベル(21%)で有する、多発性骨髄腫を患っている患者 (図4)。
細胞周期にある細胞(静止していない細胞)をあるレベル(39.5%)で有する、多発性骨髄腫を患っている患者 (図5)。
材料及び方法
細胞の増殖をモニターするために、供給者の推奨に従って、Click it(登録商標)Plus EdU Alexa Fluor(登録商標)647フローサイトメトリーアッセイキット (Life Technologies、カタログ:C10635)を使用した。
前記プロトコールに続いて、350μlのDAPI/PermWash混合液を2μl/mlで、細胞溶液に添加し、次いで、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞溶液をPBSで洗浄し、次いで、PBS中に懸濁した(taken up)後、フローサイトメトリー (BD LSRFortessaTM X-20サイトメーター−BD Biosciences)によって分析する。
形質細胞の増殖のモニタリングは、二次元 (DAPI対EdU)又は一次元(EdUヒストグラム)で実行することが出来る。
図5に表示された結果は、一次元又は二次元を使用して、多発性骨髄腫を有すると診断された患者において、EdUの存在下で、それぞれ2.89%及び2.80%のS期の形質細胞 (陽性チューブ)を特定することが出来ることを示している。
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Claims (13)
- 患者に由来する細胞試料中の正常な形質細胞及び腫瘍性形質細胞の存在を、フローサイトメトリーによって、検出する方法であって、前記方法が以下の工程:
a)前記細胞試料を以下:
− κ鎖マーカー、λ鎖マーカー、及び以下:CD38マーカーとCD138マーカーとから選択されるマーカーであり、3つのマーカーの各々が異なるシグナルを発するマーカー、並びに
− 1つ以上の腫瘍性形質細胞マーカー(複数可)であり、これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が前記先の3つのシグナルとは異なるシグナルを発するマーカー、並びに
− 1つ以上の正常な形質細胞 CDマーカー(複数可)であり、これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナルを発するマーカー
と接触させること、
b)以下:
− CD38マーカー又はCD138マーカーについての陽性シグナル、及び
− κ鎖マーカー又はλ鎖マーカーについての陽性シグナル
によって特徴づけられる形質細胞を検出すること、
c) 工程b)において検出された形質細胞の中から、以下の基準:
− 腫瘍性形質細胞に特異的な少なくとも1つのマーカーについての陽性シグナル、及び/又は
− 正常な形質細胞の少なくとも1つのマーカーについて、陰性若しくは有意に低下したシグナル
の少なくとも1つを有する、腫瘍性形質細胞を検出すること、
d) 工程b)及びc)において取得した結果を分析し、正常な形質細胞及び腫瘍性形質細胞の存在を決定すること
を含む、方法。 - 以下:
− 本発明による方法の正常な形質細胞に特異的なCDが、以下:CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81、より選択的には、CD19、CD27から選択され、並びに
− 本発明による方法の腫瘍性形質細胞についての特異的なCDが、以下:CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28、より選択的には、CD56、CD117、CD200から選択されること
において特徴づけられる、請求項1に記載の方法。 - 前記CD38マーカー又はCD138マーカーがそれぞれ、PE-Cy5.5蛍光色素にコンジュゲートした抗CD38抗体又は抗CD138抗体であり、前記κ鎖マーカーがPE-CF594蛍光色素にコンジュゲートした抗κ鎖抗体であり、前記λ鎖マーカーがFITC蛍光色素にコンジュゲートした抗λ鎖抗体である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- CD19及びCD27マーカーがPE-Cy7蛍光色素にコンジュゲートした抗CD19抗体及び抗CD27抗体であり、CD56、CD117及びCD200マーカーがPE蛍光色素にコンジュゲートした抗CD56抗体、抗CD117抗体及び抗CD200抗体である、請求項2に記載の方法。
- 以下の工程:
A.前記細胞試料を、使用した他のマーカーとは異なるシグナルを発する、1つ以上の細胞増殖マーカー(複数可)、選択的には、2つの細胞増殖マーカーと接触させること;
B.前記マーカー(複数可)により発せられたシグナルの分析によって、増殖している腫瘍性形質細胞を検出すること;
C.S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞のパーセンテージを決定すること;
D.任意選択で、前記細胞増殖マーカー(複数可)の少なくとも1つがDNAマーカーである場合、2倍性 (G0/G1又はG2/M)を決定すること
を含み、腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定することも含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞試料が、骨髄、血液、血清、血液抽出液、PBMC、脳脊髄液、胸膜液及びリンパ節、選択的には、患者の骨髄の細胞から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者が単クローン性ガンマグロブリン血症を患っている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 患者に由来する細胞試料を使用して、in vitroで単クローン性ガンマグロブリン血症を診断する又はモニターする方法であって、以下の工程:
1)請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法を実行すること、並びに
2)以下:
a)本発明の請求項に記載の方法の工程d)の分析の結果に従って、総白血球細胞中の腫瘍性形質細胞の割合が、健常な対照被験者において本発明の請求項に記載の方法によって取得した結果に基づく所定の閾値を超えている場合、及び/又は
b)単位体積毎の腫瘍性形質細胞数が所定の閾値を超えている場合
の単クローン性ガンマグロブリン血症を発症するリスクを実証すること
を含む、方法。 - 患者に由来する第一及び第二の細胞試料を使用して、in vitroで単クローン性ガンマグロブリン血症を患っている患者の疾患の進行をモニターする方法であって、以下の工程:
i)患者に由来する第一の細胞試料において、請求項1〜7のいずれか一項に記載の検出方法を実行すること、
ii)前記第一の試料を取得した後に、前記第二の試料を取得し、患者に由来する第二の細胞試料中において、請求項1〜7のいずれか一項に記載の検出方法を実行すること、並びに
iii)第一及び第二の試料を用いて取得した工程d)の分析の結果を比較すること、並びに
iv)工程iii)の分析結果に従って、前記患者の前記単クローン性ガンマグロブリン血症の進行をモニターすること
を含む、方法。 - 少なくとも以下:
− 各々異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー、並びに
− 以下:CD38マーカー又はCD138マーカーから選択されるマーカー(前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する)、並びに
− CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される正常な形質細胞について特異的な1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナルを発する)、並びに
− CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞について特異的な1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナルを発する)
を含む、組成物。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法を実行するための組成物の使用であって、少なくとも以下:
− 異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー、並びに
− 以下:CD38マーカー及びCD138マーカーから選択されるマーカー(前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する)、並びに
− CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される正常な形質細胞についての1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナルを発する)、並びに
− CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞についての1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナルを発する)
を含む、組成物の使用。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキットであって、少なくとも以下:
− 各々異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー、並びに
− 先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する、CD38マーカー又はCD138マーカー;並びに
− CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される正常な形質細胞についての1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナルを発する)、並びに
− CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞についての1つ以上のCDマーカー(複数可)、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー(これらの1つ以上のマーカー(複数可)の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナルを発する)
を含む、キット。 - 以下:
− BrdUのタイプの塩基類似体、及びAPCにコンジュゲートした抗BrdU抗体、若しくは、EdU、及び蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor(登録商標)647に結合したアジド;並びに/又は
− 活発な細胞周期のタンパク質についてのマーカー、例えば、蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor(登録商標)647にコンジュゲートした抗Ki67抗体;並びに/又は
− デオキシリボ核酸 (DNA)マーカー、例えば、DAPI、PI若しくはHoechst色素(33342若しくは33258)等
から選択される、少なくとも1つの細胞増殖マーカーを含むことにおいて特徴づけられるキットであって、
前記細胞増殖マーカー(複数可)の各々が、前記キット中に存在する他のマーカーによって発せられるシグナルとは異なる、特に先の5つのシグナルとは異なる、シグナルを発する、
請求項12に記載のキット。
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