CN112698037B - 一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的抗体组合物及其试剂盒和应用 - Google Patents
一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的抗体组合物及其试剂盒和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的抗体组合物及其试剂盒和应用，本发明提供的抗体组合方案包含了既往从未被临床用于外周血肿瘤浆细胞检测的流式抗体组合，并且规定了检测的细胞数量，规范的操作步骤，明确了敏感度需要达到的程度。采用外周血替代骨髓标本，可以大大减轻患者接受骨髓穿刺的痛苦，并且外周血浆细胞检测可以重复操作，灵活方便，大大减轻了临床医生的工作负担，提高了效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的抗体组合物及其试剂盒和应用。
背景技术
多发性骨髓瘤是一种恶性血液系统肿瘤，患者无法治愈，需要持续化疗至少2年甚至长期持续治疗。接受化疗的患者需要每两个月进行一次骨髓穿刺，以便结合其他指标，综合评估治疗效果。目前，国际公认的评估疗效的指标包括血液免疫球蛋白定量、尿液轻链定量、骨髓穿刺浆细胞比例、以及影像学检查。其中，骨髓穿刺是一种有创伤性的检查，需要在麻醉状态下进行操作，患者具有一定痛苦，并且每次进行骨髓操作，需要消耗高值耗材一套，整个骨髓穿刺从准备到操作完成及整理医疗垃圾，需要耗费大约半小时，既耗费医疗资源，又使患者倍感痛苦。
近年来，无创伤性循环血肿瘤细胞检测技术已经用于实体瘤患者，在减少患者痛苦、节约耗材费用、提高医师工作效率各方面均较传统的肿块穿刺技术显示出优势，在实体瘤患者治疗后的随访阶段，该检测技术发挥了重大作用，给医患双方均带来极大益处。但至今多发性骨髓瘤患者循环血肿瘤细胞检测仍处于科研阶段，并未用于临床。
多发性骨髓瘤患者循环血肿瘤细胞检测仍处于科研起步阶段，且由于不同研究中收获的细胞数不同，采用的抗体组合方案不同，以及对敏感度的定义不同等多种因素的干扰，使得至今为止未见到任何关于该检测技术替代骨髓穿刺用于多发性骨髓瘤治疗效果的评价的任何相关报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的抗体组合物及其试剂盒和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的抗体组合物，包括两组抗体，其中：
第一组抗体由抗体CD138、抗体CD38、抗体CD45、抗体CD269和抗体CD27组成，用于确定浆细胞比例；
第二组抗体由抗体CD138、抗体CD38、抗体CD45、抗体CD56、抗体CD19、抗体ckappa和抗体clamda组成，用于确定浆细胞性质。
本发明还公开了上述的抗体组合物在制备检测多发性骨髓瘤治疗效果的诊断试剂中的应用。
优选地，所述的抗体组合物能够从106个细胞中快速捕捉到外周血中的肿瘤细胞，敏感度达到0.01%。
本发明还公开了上述的抗体组合物在制备多发性骨髓瘤预后监测的免疫组化试剂中的应用。
本发明还公开了上述的利用上述的抗体组合物为抗原制备的用于检测多发性骨髓瘤治疗效果的单克隆抗体组合物，由两组单克隆抗体组合物组合而成，其中：
第一组单克隆抗体组合物由抗CD138的单克隆抗体、抗CD38的单克隆抗体、抗CD45的单克隆抗体、抗CD269的单克隆抗体和抗CD27的单克隆抗体组成；
第二组单克隆抗体组合物由抗CD138的单克隆抗体、抗CD38的单克隆抗体、抗CD45的单克隆抗体、抗CD56的单克隆抗体、抗CD19的单克隆抗体、抗ckappa的单克隆抗体和抗clamda的单克隆抗体组成。
本发明还公开了一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的流式检测试剂盒，试剂盒中包含权上述的单克隆抗体组合物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的无创伤性的可替代骨髓穿刺的用于骨髓瘤患者治疗效果评价的新型流式抗体组合抗体，以两组抗体（CD138/CD38/CD45/CD269/CD27，用来确定浆细胞比例）和（CD138/CD38/CD45/CD56/CD19/ckappa/clamda，用来确定浆细胞是否为肿瘤性质）进行组合，形成两组抗体组合物的固定组合；实验通过292例次多发性骨髓瘤患者外周血流式检测的验证，表明发明公开的上述流式组合抗体可以从106个细胞中快速捕捉到患者外周血中的肿瘤细胞，敏感度可达到0.01%(10-4)，使用本发明的流式组合抗体进行检测和目前临床常规应用的骨髓穿刺涂片法相比，具有高度的敏感性(骨髓涂片敏感度只有10-2)，并且结果客观准确，操作方便，快速省时，无创伤性，优势非常显著。因此，本发明可替代有创伤性的骨髓穿刺，用于多发性骨髓瘤患者治疗后临床疗效的评价，不但大大减轻患者的痛苦，提高了医师的工作效率，还能节约耗材，减轻医疗负担，值得推广。
附图说明
图1为流式检测不同化疗效果患者外周血浆细胞比例；
图2为不同化疗效果患者骨髓涂片浆细胞比例；
图3a为NDMM患者外周血流式检测浆细胞比例的图示；
图3b为CR患者外周血流式检测浆细胞比例的图示；
图3c为VGPR患者外周血流式检测浆细胞比例的图示；
图3d为PR患者外周血流式检测浆细胞比例的图示；
图3e为RRMM患者外周血流式检测浆细胞比例的图示。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
1、实验所需耗材：流式管、10*PBS、去离子水、10*溶血素、含0.5% BSA的PBS；Tips：10*浓缩液使用时要用去离子水稀释为1*工作液后使用。
2、实验方案
本发明所用到的抗体及其克隆号和荧光素标记如下表1所示：
表1抗体及克隆号和荧光素标记
3、实验操作
1）细胞表面染色
①按实验方案标记流式管
②在流式管中加入第一组抗体组合物
（CD138-APC/CD38-APC-A700/CD45-PerCP/CD269-PE/CD27-FITC）；然后加入外周血样本 200ul，混匀避光15min；
③加入2 ml配置好的溶血素工作液，混匀避光10 min；
④1500 rpm离心5min，弃上清；
⑤加入2ml PBS，混匀1500 rpm离心5 min，弃上清；
⑥加入200 ul PBS，混匀上机检测。
2）表面染色加胞内染色
①按实验方案标记流式管；
②在流试管中加入第二组抗体组合物如下：
（CD138-APC/CD38-APC-A700/CD45-PerCP/CD56-APC-CY7/CD19-ECD/ckappa-FITC/clamda-PE）；然后加入血样本 200 ul，混匀避光15 min；
③加入100 ul A液（固定液）混匀5 min；
④加入2 ml配置好的溶血素工作液，混匀避光10 min，1500 rpm离心5 min，弃上清；
⑤加入50ulB液（破膜剂）混匀避光15min；
⑥加入2ml的PBS，混匀1500 rpm离心5 min，弃上清；
⑦加入200 ul PBS，混匀上机检测。
新诊断的多发性骨髓瘤患者（NDMM组）经过化疗后治疗效果按照国际骨髓瘤工作组的疗效标准分为：完全缓解组(CR)、非常好的部分缓解组（VGPR）、部分缓解组（PR），这三组均为治疗有效。治疗后无效主要是指疾病进展或者复发（统称为RRMM）。
表2流式检测不同化疗效果患者外周血浆细胞比例
如表2所示，NDMM患者循环外周血中可以检测到少量浆细胞（中位数0.05%，范围0.00%-52.86%），这些浆细胞正是从骨髓释放出来的肿瘤细胞。治疗有效的患者不论是达到CR、VGPR还是PR, 外周血中肿瘤负荷均较新诊断时明显降低：其中疗效达到CR的患者外周血浆细胞完全消失（中位数0.00%，范围0.00%-0.00%）；疗效达到VGPR的患者外周血浆细胞虽然未能完全消失，但比例显著降低（中位数0.00%，范围0.00%-0.74%）；疗效达到PR的患者外周血浆细胞负荷也有明显下降（中位数0.01%，范围0.00%-4.52%）。治疗无效的RRMM组患者则可检测到外周血中肿瘤负荷显著增高，明显超过诊断时（浆细胞中位数0.16% vs0.05%）。图1则可以更加直观的显示外周血肿瘤细胞比例与患者的治疗效果明显相关，疗效越好，外周血浆细胞比例越低，甚至为零。
表3不同化疗效果患者骨髓涂片中浆细胞比例
如表3所示，多发性患者骨髓中浆细胞的比例和外周血浆细胞比例具有同样的规律，二者均与疗效明显相关。NDMM组骨髓中浆细胞比例的中位数为10.66%（范围0.00%-41.66%），治疗后达到不同疗效的患者骨髓中浆细胞比例分别为CR组0.00%（范围0.00%-0.76%），VGPR组0.39%（范围0.00%-1.43%），PR组1.26%（范围0.00%-21.52%），RRMM组11.99%（范围0.00%-67.72%）。图2则可以更加直观的显示骨髓中浆细胞比例与患者的治疗效果明显相关，疗效越好，骨髓中浆细胞比例越低，甚至为零。
由上述图1和图2比较可发现，流式检测的外周血浆细胞比例可以替代骨髓穿刺涂片形态学的结果，很好的反应多发性骨髓患者的治疗效果。
参见不同患者的外周血流式检测浆细胞瘤的图示：
如图3a所示，NDMM代表一例新诊断患者，CD38+CD138+浆细胞比例比例为7.12%，表达ckappa，不表达CD19，CD56和clamda，为肿瘤浆细胞。
如图3b所示，CR代表一例治疗后疗效达到完全缓解的患者，CD38+CD138+浆细胞比例比例为0.00%，未见肿瘤浆细胞。
如图3c所示，VGPR代表一例治疗后疗效达到非常好的部分缓解的患者，CD38+CD138+浆细胞比例比例为0.05%，表达cLamda，不表达CD19，CD56和cKappa，为肿瘤浆细胞。
如图3d所示，PR代表一例治疗后疗效达到部分缓解的患者，CD38+CD138+浆细胞比例比例为0.18%，表达cKappa，不表达CD19，CD56和cLamda，为肿瘤浆细胞。
如图3e所示，RRMM代表一例治疗无效疾病进展的患者，CD38+CD138+浆细胞比例比例为13.52%，表达cLamda，不表达CD19，CD56和cKappa，为肿瘤浆细胞。
从以上反馈的结果可以看出，外周血浆细胞比例和患者的治疗效果密切相关，疗效越好，外周血中肿瘤细胞越少，完全缓解的患者检测不到肿瘤细胞。
综上所述，本发明公开了一种用于多发性骨髓瘤治疗后疗效评价的无创伤性外周血流式检测方案，本发明提供的抗体组合方案包含了既往从未被临床用于外周血肿瘤浆细胞检测的流式抗体组合，并且规定了检测的细胞数量，规范的操作步骤，明确了敏感度需要达到的程度。采用外周血替代骨髓标本，可以大大减轻患者接受骨髓穿刺的痛苦，并且外周血浆细胞检测可以重复操作，灵活方便，大大减轻了临床医生的工作负担，提高了效率。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种抗体组合物在制备检测多发性骨髓瘤治疗效果的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的抗体组合物包括两组抗体，其中：第一组抗体由抗体CD138、抗体CD38、抗体CD45、抗体CD269和抗体CD27组成，用于确定浆细胞比例；
第二组抗体由抗体CD138、抗体CD38、抗体CD45、抗体CD56、抗体CD19、抗体ckappa和抗体clamda组成，用于确定浆细胞性质。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗体组合物能够从106个细胞中快速捕捉到外周血中的肿瘤细胞，敏感度达到0.01%。
3.一种抗体组合物在制备多发性骨髓瘤预后监测的免疫组化试剂中的应用，其特征在于，所述的抗体组合物包括两组抗体，其中：第一组抗体由抗体CD138、抗体CD38、抗体CD45、抗体CD269和抗体CD27组成，用于确定浆细胞比例；
第二组抗体由抗体CD138、抗体CD38、抗体CD45、抗体CD56、抗体CD19、抗体ckappa和抗体clamda组成，用于确定浆细胞性质。
4.利用一种抗体组合物为抗原制备的用于检测多发性骨髓瘤治疗效果的单克隆抗体组合物，其特征在于，由两组单克隆抗体组合物组合而成，其中：
第一组单克隆抗体组合物由抗CD138的单克隆抗体、抗CD38的单克隆抗体、抗CD45的单克隆抗体、抗CD269的单克隆抗体和抗CD27的单克隆抗体组成；
第二组单克隆抗体组合物由抗CD138的单克隆抗体、抗CD38的单克隆抗体、抗CD45的单克隆抗体、抗CD56的单克隆抗体、抗CD19的单克隆抗体、抗ckappa的单克隆抗体和抗clamda的单克隆抗体组成。
5.一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的流式检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求4所述的单克隆抗体组合物。
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