CN104178567A - 一种与乳腺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，公开了一种与乳腺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140等32个SNP的组合。该标志物可用于制备乳腺癌辅助诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种乳腺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁女性健康。据统计，2012年全球有168万乳腺癌新发病例，约占女性所有恶性肿瘤新发病例的25.2％。我国乳腺癌的发病率虽低于西方发达国家，但近二十年来，其仍以每年3-5％的速度递增，远高于0.5％的世界平均增长水平。虽然乳腺癌的预后较好，但是由于其高发病率，仍然是女性恶性肿瘤死亡的首要原因。2012年，我国因乳腺癌死亡的女性达4.8万人。因此，乳腺癌已成为威胁我国女性健康的首要恶性肿瘤，是亟待解决的重大公共卫生问题。
目前，对乳腺癌的一级预防(病因预防)尚无明确、有效的预防措施，但是若能加强二级预防工作，如早期发现、早期诊断、早期治疗，预后一般较好，能降低乳腺癌死亡率，提高患者生活质量。因此，争取早期诊断是乳腺癌防治的一项基本策略。目前早期诊断乳腺癌的方式主要有乳腺增生患者的定期筛查、乳腺的自我检查、乳腺影像学检查(乳腺钼靶X线摄影、乳腺彩色多谱勒超声检查、CT和磁共振等)以及乳腺癌的病理检查(细胞学穿刺检查和组织学检查)。虽然乳腺癌的早期检测手段在不断进步发展，但是真正有较好应用前景的早期诊断方法尚有限，有些早期患者肿块较小、边界清楚且活动性好，不易与良性肿瘤相鉴别。一些年轻女性对乳腺检查不够重视并且存在一定的抗拒心理，也会阻碍乳腺癌的早期诊断。一旦延误病情，发展至晚期，其预后往往较差。因此，亟需寻找更加明确而有效的生物标志物用于乳腺癌的早期明确诊断，实现患者早期治疗，从而切实提高乳腺癌的预后。
研究表明，除了月经生育史以及一些其他环境暴露因素外，遗传因素是引发乳腺癌的主要原因。其中，单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)发挥了重要作用。SNP是指单个核苷酸的改变而引起的DNA序列的改变，它是人类最常见的可遗传变异，在人类基因组中广泛存在。SNP赋予个体对环境暴露、药物治疗等的不同反应，从而产生不同的表型，因此SNP可能是导致个体疾病发生发展差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱诊断疾病，具有快速、灵敏、准确等特点，因而应用前景广阔。近年来，利用SNP诊断疾病的发生发展已成为临床和科研工作者的研究热点。
然而，目前还没有将SNP应用于乳腺癌诊断的报道，若能筛选出乳腺癌易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，必将有力地推动我国乳腺癌早期诊断的现状，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与乳腺癌辅助诊断相关的SNP标志物。
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性扩增引物。
本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性延伸引物。
本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性扩增引物和特异性延伸引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第五个目的是提供乳腺癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康女性对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与乳腺癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的乳腺癌辅助诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与乳腺癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和rs9650315的组合。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物，这些引物为：
rs10152591的扩增引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs1037699的扩增引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；rs10487075的扩增引物序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs11645106的扩增引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11；rs11663688的扩增引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs11768670的扩增引物序列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；rs11910707的扩增引物序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs12972670的扩增引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23；rs13038095的扩增引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs142255517的扩增引物序列为SEQ ID No：28和SEQ ID No：29；rs142895740的扩增引物序列为SEQ IDNo：31和SEQ ID No：32；rs144600021的扩增引物序列为SEQ ID No：34和SEQ ID No：35；rs17128116的扩增引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs2053026的扩增引物序列为SEQ ID No：40和SEQ ID No：41；rs213212的扩增引物序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs2229300的扩增引物序列为SEQ ID No：46和SEQ ID No：47；rs2981582的扩增引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs35002951的扩增引物序列为SEQ ID No：52和SEQ ID No：53；rs3748140的扩增引物序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs3757318的扩增引物序列为SEQ ID No：58和SEQ ID No：59；rs498114的扩增引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs549652的扩增引物序列为SEQ ID No：64和SEQ ID No：65；rs6433379的扩增引物序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs6932260的扩增引物序列为SEQ ID No：70和SEQ ID No：71；rs7833986的扩增引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs8190955的扩增引物序列为SEQ ID No：76和SEQ ID No：77；rs871545的扩增引物序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs905799的扩增引物序列为SEQ ID No：82和SEQ ID No：83；rs925946的扩增引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs9397426的扩增引物序列为SEQID No：88和SEQ ID No：89；rs9469578的扩增引物序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；rs9650315的扩增引物序列为SEQ ID No：94和SEQ ID No：95。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物，这些引物为：
rs10152591的延伸引物序列为SEQ ID No：3；rs1037699的延伸引物序列为SEQ IDNo：6；rs10487075的延伸引物序列为SEQ ID No：9；rs11645106的延伸引物序列为SEQ ID No：12；rs11663688的延伸引物序列为SEQ ID No：15；rs11768670的延伸引物序列为SEQ ID No：18；rs11910707的延伸引物序列为SEQ ID No：21；rs12972670的延伸引物序列为SEQ ID No：24；rs13038095的延伸引物序列为SEQ ID No：27；rs142255517的延伸引物序列为SEQ ID No：30；rs142895740的延伸引物序列为SEQ IDNo：33；rs144600021的延伸引物序列为SEQ ID No：36；rs17128116的延伸引物序列为SEQ ID No：39；rs2053026的延伸引物序列为SEQ ID No：42；rs213212的延伸引物序列为SEQ ID No：45；rs2229300的延伸引物序列为SEQ ID No：48；rs2981582的延伸引物序列为SEQ ID No：51；rs35002951的延伸引物序列为SEQ ID No：54；rs3748140的延伸引物序列为SEQ ID No：57；rs3757318的延伸引物序列为SEQ ID No：60；rs498114的延伸引物序列为SEQ ID No：63；rs549652的延伸引物序列为SEQ ID No：66；rs6433379的延伸引物序列为SEQ ID No：69；rs6932260的延伸引物序列为SEQ ID No：72；rs7833986的延伸引物序列为SEQ ID No：75；rs8190955的延伸引物序列为SEQ ID No：78；rs871545的延伸引物序列为SEQ ID No：81；rs905799的延伸引物序列为SEQ ID No：84；rs925946的延伸引物序列为SEQ ID No：87；rs9397426的延伸引物序列为SEQ IDNo：90；rs9469578的延伸引物序列为SEQ ID No：93；rs9650315的延伸引物序列为SEQ ID No：96。
所述的SNP标志物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和rs9650315。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性扩增引物为：
rs10152591的扩增引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs1037699的扩增引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；rs10487075的扩增引物序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs11645106的扩增引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11；rs11663688的扩增引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs11768670的扩增引物序列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；rs11910707的扩增引物序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs12972670的扩增引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23；rs13038095的扩增引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs142255517的扩增引物序列为SEQ ID No：28和SEQ ID No：29；rs142895740的扩增引物序列为SEQ IDNo：31和SEQ ID No：32；rs144600021的扩增引物序列为SEQ ID No：34和SEQ ID No：35；rs17128116的扩增引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs2053026的扩增引物序列为SEQ ID No：40和SEQ ID No：41；rs213212的扩增引物序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs2229300的扩增引物序列为SEQ ID No：46和SEQ ID No：47；rs2981582的扩增引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs35002951的扩增引物序列为SEQ ID No：52和SEQ ID No：53；rs3748140的扩增引物序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs3757318的扩增引物序列为SEQ ID No：58和SEQ ID No：59；rs498114的扩增引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs549652的扩增引物序列为SEQ ID No：64和SEQ ID No：65；rs6433379的扩增引物序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs6932260的扩增引物序列为SEQ ID No：70和SEQ ID No：71；rs7833986的扩增引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs8190955的扩增引物序列为SEQ ID No：76和SEQ ID No：77；rs871545的扩增引物序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs905799的扩增引物序列为SEQ ID No：82和SEQ ID No：83；rs925946的扩增引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs9397426的扩增引物序列为SEQID No：88和SEQ ID No：89；rs9469578的扩增引物序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；rs9650315的扩增引物序列为SEQ ID No：94和SEQ ID No：95。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性延伸引物为：
rs10152591的延伸引物序列为SEQ ID No：3；rs1037699的延伸引物序列为SEQ IDNo：6；rs10487075的延伸引物序列为SEQ ID No：9；rs11645106的延伸引物序列为SEQ ID No：12；rs11663688的延伸引物序列为SEQ ID No：15；rs11768670的延伸引物序列为SEQ ID No：18；rs11910707的延伸引物序列为SEQ ID No：21；rs12972670的延伸引物序列为SEQ ID No：24；rs13038095的延伸引物序列为SEQ ID No：27；rs142255517的延伸引物序列为SEQ ID No：30；rs142895740的延伸引物序列为SEQ IDNo：33；rs144600021的延伸引物序列为SEQ ID No：36；rs17128116的延伸引物序列为SEQ ID No：39；rs2053026的延伸引物序列为SEQ ID No：42；rs213212的延伸引物序列为SEQ ID No：45；rs2229300的延伸引物序列为SEQ ID No：48；rs2981582的延伸引物序列为SEQ ID No：51；rs35002951的延伸引物序列为SEQ ID No：54；rs3748140的延伸引物序列为SEQ ID No：57；rs3757318的延伸引物序列为SEQ ID No：60；rs498114的延伸引物序列为SEQ ID No：63；rs549652的延伸引物序列为SEQ ID No：66；rs6433379的延伸引物序列为SEQ ID No：69；rs6932260的延伸引物序列为SEQ ID No：72；rs7833986的延伸引物序列为SEQ ID No：75；rs8190955的延伸引物序列为SEQ ID No：78；rs871545的延伸引物序列为SEQ ID No：81；rs905799的延伸引物序列为SEQ ID No：84；rs925946的延伸引物序列为SEQ ID No：87；rs9397426的延伸引物序列为SEQ IDNo：90；rs9469578的延伸引物序列为SEQ ID No：93；rs9650315的延伸引物序列为SEQ ID No：96。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择乳腺癌病例、与乳腺癌病例年龄匹配的健康女性对照，利用高密度SNP芯片，找出与乳腺癌相关的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平台进行检测，验证其应用于临床诊断的可重复性。(4)乳腺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据乳腺癌病例和健康女性对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了IlluminaHuman Exome BeadChip进行扫描，Sequenom MassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)经病理学明确诊断的乳腺癌病例；
(2)采血前未接受过放疗或化疗、无既往肿瘤病史；
(3)与病例年龄匹配的健康女性对照
本研究共采用2137例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外2600D：2800D)在1.6-2.0。
3.全外显子芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在全外显子芯片(Illumina公司，下同)上进行扫描；
(3)检测并比较各基因型在乳腺癌病例与健康女性对照中的分别差异。
4.单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计单个SNP的特异性扩增引物和特异性延伸引物；
(3)进行PCR反应；
(4)检测并比较乳腺癌病例与健康女性对照中不同基因型的分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
全外显子芯片进行扫描和单个SNP检测后确定乳腺癌病例与健康女性对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为乳腺癌诊断的指标。筛选出的与乳腺癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒(rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和rs9650315)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性扩增引物和特异性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这32个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与乳腺癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.63×rs10152591的评分)+(0.62×rs1037699的评分)+(0.55×rs10487075的评分)+(-0.34×rs11645106的评分)+(0.45×rs11663688的评分)+(0.5×rs11768670的评分)+(0.36×rs11910707的评分)+(-0.38×rs12972670的评分)+(0.63×rs13038095的评分)+(-0.67×rs142255517的评分)+(0.53×rs142895740的评分)+(0.59×rs144600021的评分)+(0.39×rs17128116的评分)+(0.65×rs2053026的评分)+(0.61×rs213212的评分)+(-0.49×rs2229300的评分)+(0.27×rs2981582的评分)+(0.52×rs35002951的评分)+(-0.43×rs3748140的评分)+(0.28×rs3757318的评分)+(0.51×rs498114的评分)+(0.59×rs549652的评分)+(0.63×rs6433379的评分)+(0.29×rs6932260的评分)+(0.48×rs7833986的评分)+(0.43×rs8190955的评分)+(0.43×rs871545的评分)+(0.3×rs905799)+(0.44×rs925946的评分)+(-0.3×rs9397426的评分)+(0.47×rs9469578的评分)+(0.49×rs9650315的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于关联研究的2137例样本中。(以rs10152591为例：0.63为rs10152591的回归系数(见表1)；rs10152591的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些个SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
在上述1064例符合条件的乳腺癌病例及1073例健康女性对照中，两组年龄均衡可比。我们将这两组人群经全外显子芯片进行扫描获得相关结果。
根据全外显子芯片检测，本发明人检测到在“乳腺癌病例”组合“健康女性对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和rs9650315。
根据上述检测结果，我们将这32个与乳腺癌发病相关的SNP采用SequenomMassARRAY基因分型平台进行了单个SNP的检测，结果与芯片检测一致。
单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这32个SNP与乳腺癌的发病存在着显著关联，其中26个SNP为危险因素，变异等位基因可增加乳腺癌的发病风险，6个为保护因素，变异等位基因可降低乳腺癌的发病风险。
进一步分析这32个SNP的组合用于乳腺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于乳腺癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性扩增引物、特异性延伸引物和其他检测试剂。
具体而言，这32个SNP的组合，或者这32个SNP的特异性扩增引物及特异性延伸引物的组合构成的相关诊断试剂盒有助于乳腺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的SNP标志物作为乳腺癌辅助诊断的标志物的优越性在于：
(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为乳腺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于乳腺癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的评价体系，本发明人初期采用全外显子芯片扫描获取了疾病相关的SNP谱，并采用Sequenom MassARRAY基因分型平台进行验证；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究SNP在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了乳腺癌发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示乳腺癌病例组对健康女性对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2004年1月至2010年4月在江苏地区医院收集了大量的新发乳腺癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了2137例符合下列标准的样本全外显子芯片扫描和单个SNP Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：
1、经病理学明确诊断的乳腺癌病例；
2、采血前未接受过放疗或化疗、无既往肿瘤病史；
3、与病例年龄匹配的健康女性对照
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中SNP的全外显子组检测
在上述符合条件的1064例乳腺癌患者和1073例健康女性对照中，两组年龄均衡可比。将这两组人群经全外显子芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24:1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外2600D：2800D)在1.6-2.0。
8、在全外显子芯片(Illumina公司，下同)上进行扫描。
9、数据分析与处理：在“乳腺癌病例”组和“健康女性对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1病例组与对照组外显子关联分析结果
实施例3单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
将上述全外显子扫描发现与乳腺癌显著相关的SNP在Sequenom MassARRAY基因分型平台上进行检测，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外2600D：2800D)在1.6-2.0。
8、进行Sequenom MassARRAY基因分型。对全外显子组扫描发现的与乳腺癌有关的32个SNP设计特异性扩增引物和特异性延伸引物(表2)；扩增反应的体系包括：0.1μldNTP mix(25mM)，0.4μl MgCl2(25mM)，0.1μl HotStar Taq(5U/μl)，每对正向和反向扩增引物的混合物1μl(1pmol/μl)和1.9μl双蒸水，加入1μl的DNA样本进行PCR扩增反应。延伸反应的体系包括：EXTEND Mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)。加入SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理后的PCR产物7μl进行单碱基延伸反应。使用的仪器为ABI9700型PCR仪。纯化的产物4,000rpm离心4分钟，沉淀树脂后使用MassARRAY NanodispenserRS1000点样仪转移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF质谱分析。
9、基因型判读：采用TYPER4.0软件(sequenom)进行。
10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，结果与全外显子扫描类似不再列出。
实施例4利用危险度评分方法进一步分析SNP与乳腺癌的发病风险
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“乳腺癌病例组”和“健康女性对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全外显子扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评价诊断的灵敏性和特异性，进而诊断这些SNP对乳腺癌发病的判断能力。对32个SNP标志物的联合分析发现，这32个SNP以70.5％的AUC将健康女性对照组和乳腺癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为61.09％，特异度为70.83％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和rs9650315的组合能够很好地将健康女性对照和乳腺癌患者区分。
实施例5用于乳腺癌辅助诊断SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于IlluminaHuman Exome BeadChip检测和Sequenom MassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物(包括下列扩增引物：rs10152591的扩增引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs1037699的扩增引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；rs10487075的扩增引物序列为SEQID No：7和SEQ ID No：8；rs11645106的扩增引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11；rs11663688的扩增引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs11768670的扩增引物序列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；rs11910707的扩增引物序列为SEQ IDNo：19和SEQ ID No：20；rs12972670的扩增引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23；rs13038095的扩增引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs142255517的扩增引物序列为SEQ ID No：28和SEQ ID No：29；rs142895740的扩增引物序列为SEQID No：31和SEQ ID No：32；rs144600021的扩增引物序列为SEQ ID No：34和SEQ IDNo：35；rs17128116的扩增引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs2053026的扩增引物序列为SEQ ID No：40和SEQ ID No：41；rs213212的扩增引物序列为SEQID No：43和SEQ ID No：44；rs2229300的扩增引物序列为SEQ ID No：46和SEQ ID No：47；rs2981582的扩增引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs35002951的扩增引物序列为SEQ ID No：52和SEQ ID No：53；rs3748140的扩增引物序列为SEQ IDNo：55和SEQ ID No：56；rs3757318的扩增引物序列为SEQ ID No：58和SEQ ID No：59；rs498114的扩增引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs549652的扩增引物序列为SEQ ID No：64和SEQ ID No：65；rs6433379的扩增引物序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs6932260的扩增引物序列为SEQ ID No：70和SEQ ID No：71；rs7833986的扩增引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs8190955的扩增引物序列为SEQ ID No：76和SEQ ID No：77；rs871545的扩增引物序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs905799的扩增引物序列为SEQ ID No：82和SEQ ID No：83；rs925946的扩增引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs9397426的扩增引物序列为SEQID No：88和SEQ ID No：89；rs9469578的扩增引物序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；rs9650315的扩增引物序列为SEQ ID No：94和SEQ ID No：95)、和/或特异性延伸引物(包括下列延伸引物：rs10152591的延伸引物序列为SEQ ID No：3；rs1037699的延伸引物序列为SEQ ID No：6；rs10487075的延伸引物序列为SEQ ID No：9；rs11645106的延伸引物序列为SEQ ID No：12；rs11663688的延伸引物序列为SEQ ID No：15；rs11768670的延伸引物序列为SEQ ID No：18；rs11910707的延伸引物序列为SEQID No：21；rs12972670的延伸引物序列为SEQ ID No：24；rs13038095的延伸引物序列为SEQ ID No：27；rs142255517的延伸引物序列为SEQ ID No：30；rs142895740的延伸引物序列为SEQ ID No：33；rs144600021的延伸引物序列为SEQ ID No：36；rs17128116的延伸引物序列为SEQ ID No：39；rs2053026的延伸引物序列为SEQ ID No：42；rs213212的延伸引物序列为SEQ ID No：45；rs2229300的延伸引物序列为SEQ IDNo：48；rs2981582的延伸引物序列为SEQ ID No：51；rs35002951的延伸引物序列为SEQ ID No：54；rs3748140的延伸引物序列为SEQ ID No：57；rs3757318的延伸引物序列为SEQ ID No：60；rs498114的延伸引物序列为SEQ ID No：63；rs549652的延伸引物序列为SEQ ID No：66；rs6433379的延伸引物序列为SEQ ID No：69；rs6932260的延伸引物序列为SEQ ID No：72；rs7833986的延伸引物序列为SEQ ID No：75；rs8190955的延伸引物序列为SEQ ID No：78；rs871545的延伸引物序列为SEQ ID No：81；rs905799的延伸引物序列为SEQ ID No：84；rs925946的延伸引物序列为SEQ ID No：87；rs9397426的延伸引物序列为SEQ ID No：90；rs9469578的延伸引物序列为SEQ IDNo：93；rs9650315的延伸引物序列为SEQ ID No：96)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样品，通过最精简和特异的引物及荧光探针对检测SNP，再通过SNP谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关SNP引物信息
F：Forward Primer，上游引物；R：Reverse Primer，下游引物；E：ExtendedPrimer，延伸引物。
Claims (9)
1.一种与乳腺癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和rs9650315的组合。
2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为：
rs10152591的扩增引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
rs1037699的扩增引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；
rs10487075的扩增引物序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
rs11645106的扩增引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11；
rs11663688的扩增引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
rs11768670的扩增引物序列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；
rs11910707的扩增引物序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
rs12972670的扩增引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23；
rs13038095的扩增引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
rs142255517的扩增引物序列为SEQ ID No：28和SEQ ID No：29；
rs142895740的扩增引物序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
rs144600021的扩增引物序列为SEQ ID No：34和SEQ ID No：35；
rs17128116的扩增引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
rs2053026的扩增引物序列为SEQ ID No：40和SEQ ID No：41；
rs213212的扩增引物序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
rs2229300的扩增引物序列为SEQ ID No：46和SEQ ID No：47；
rs2981582的扩增引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
rs35002951的扩增引物序列为SEQ ID No：52和SEQ ID No：53；
rs3748140的扩增引物序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
rs3757318的扩增引物序列为SEQ ID No：58和SEQ ID No：59；
rs498114的扩增引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
rs549652的扩增引物序列为SEQ ID No：64和SEQ ID No：65；
rs6433379的扩增引物序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
rs6932260的扩增引物序列为SEQ ID No：70和SEQ ID No：71；
rs7833986的扩增引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；
rs8190955的扩增引物序列为SEQ ID No：76和SEQ ID No：77；
rs871545的扩增引物序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；
rs905799的扩增引物序列为SEQ ID No：82和SEQ ID No：83；
rs925946的扩增引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；
rs9397426的扩增引物序列为SEQ ID No：88和SEQ ID No：89；
rs9469578的扩增引物序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；
rs9650315的扩增引物序列为SEQ ID No：94和SEQ ID No：95。
3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为：
rs10152591的延伸引物序列为SEQ ID No：3；
rs1037699的延伸引物序列为SEQ ID No：6；
rs10487075的延伸引物序列为SEQ ID No：9；
rs11645106的延伸引物序列为SEQ ID No：12；
rs11663688的延伸引物序列为SEQ ID No：15；
rs11768670的延伸引物序列为SEQ ID No：18；
rs11910707的延伸引物序列为SEQ ID No：21；
rs12972670的延伸引物序列为SEQ ID No：24；
rs13038095的延伸引物序列为SEQ ID No：27；
rs142255517的延伸引物序列为SEQ ID No：30；
rs142895740的延伸引物序列为SEQ ID No：33；
rs144600021的延伸引物序列为SEQ ID No：36；
rs17128116的延伸引物序列为SEQ ID No：39；
rs2053026的延伸引物序列为SEQ ID No：42；
rs213212的延伸引物序列为SEQ ID No：45；
rs2229300的延伸引物序列为SEQ ID No：48；
rs2981582的延伸引物序列为SEQ ID No：51；
rs35002951的延伸引物序列为SEQ ID No：54；
rs3748140的延伸引物序列为SEQ ID No：57；
rs3757318的延伸引物序列为SEQ ID No：60；
rs498114的延伸引物序列为SEQ ID No：63；
rs549652的延伸引物序列为SEQ ID No：66；
rs6433379的延伸引物序列为SEQ ID No：69；
rs6932260的延伸引物序列为SEQ ID No：72；
rs7833986的延伸引物序列为SEQ ID No：75；
rs8190955的延伸引物序列为SEQ ID No：78；
rs871545的延伸引物序列为SEQ ID No：81；
rs905799的延伸引物序列为SEQ ID No：84；
rs925946的延伸引物序列为SEQ ID No：87；
rs9397426的延伸引物序列为SEQ ID No：90；
rs9469578的延伸引物序列为SEQ ID No：93；
rs9650315的延伸引物序列为SEQ ID No：96。
4.权利要求1所述的SNP标志物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
7.一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和rs9650315。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述SNP标志物的特异性扩增引物和/或权利要求3所述SNP标志物的特异性延伸引物。
9.根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
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