CN107557468A - 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的癌‑睾丸基因遗传标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与原发性肺癌辅助诊断相关的癌‑睾丸基因SNP标志物及其应用。该标志物为rs12166583、rs12477419、rs75764106、rs74640907、rs74377505、rs1007089、rs1433646、rs6001675、rs11125117、rs3747093和rs793598的组合。该标志物可用于制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒，具有较好的临床应用前景。

Description

一种与原发性肺癌辅助诊断相关的癌-睾丸基因遗传标志物 及其应用

发明领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及原发性肺癌辅助诊断相关的癌-睾丸基因SNP标志物及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一。自2010年以来，恶性肿瘤已经超过心脑血管疾病成为中国第一大死因，也成为我国最主要的公共卫生问题。肺癌是全球受累人数最多的恶性肿瘤之一。据国际癌症研究署(IARC)估计，2012年肺癌新发病例182.5万人，死亡159.0万人，分别占全部癌症新发病例及死亡人数的13.0％和 19.4％。由于持续増长的烟草消费、环境污染化及生活方式的改变，我国肺癌的发病形势亦日趋严峻，发病率和死亡率呈显著上升趋势。据中国肿瘤登记中心最新数据 (2009-2011年)估计，2015年我国男性和女性的肺癌发病人数分别为50.9万和22.4 万，肺癌死亡人数分别为43.2万和17.8万，均高于世界平均水平。由此可见，肺癌已成为一个亟待解决的重大公共卫生问题，严整威胁全世界及我国人民的生命和健康。

肺癌家庭聚集性研究显示，遗传因素在肺癌的发生中同样扮演重要角色。尽管80％以上的肺癌可以归咎为烟草暴露，但仅有不到20％的吸烟者发生肺癌，说明在同等环境暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism，SNP)是指人群中出现频率大于1％的单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。近年来的研究表明人类基因组中可能每100-300个碱基对 (basepair，bp)就存在一个SNP，估计SNP总数在数百万个左右。正是这0.1％的遗传学差异决定着绝大多数性状的个体间差异，并且影响个体对疾病(包括肿瘤)的易感性、以及对药物的反应性等。因此，寻找影响肺癌遗传易感性的SNP，用于高危人群筛检，从而采取针对性的预防措施，是有效预防肺癌高发的策略之一。

在一些类比研究中，人们注意到精子发生和癌症形成具有很多的相似性：例如癌细胞无限增殖的能力与精原细胞持续优势分裂的能力相似；癌细胞染色体数目的异常与精母细胞减数分裂中染色体数目减半相似；癌细胞的转移与生精细胞的迁移相似等。精子发生的过程高效而有序，却与高度失控的细胞癌变过程存在诸多相似性。基于这些相似之处，一些学者提出：当癌基因和抑癌基因不存在明确驱动突变的情况下，一些本应沉默的生殖细胞(如精细胞、卵细胞等)相关基因重新激活，也可以驱动癌症的发生。

癌-睾丸基因(Cancer/testis genes,CT基因)是一类代表着精子发生和肿瘤形成相似性的基因，正常情况下它们只在睾丸组织中特异表达；而在肿瘤中却能够被异常激活，提示这类基因可能在细胞癌变和转移过程中发挥重要作用。因此，此类基因符合恶性肿瘤表观驱动基因的特征。1991年Van Der Bruggen等人采用自体分型 (autologous typing)技术，在一株黑色素细胞系中分离出首个CT抗原(MAGEA1)。 CT基因的研究成果有着很好的应用前景。首先，肿瘤组织中特异表达的CT抗原具有免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，从而控制肿瘤细胞的生长和增殖。肿瘤免疫治疗就是借助分子生物学技术和细胞工程技术，增强机体对抗癌症的免疫效应，控制癌症进展。

利用疾病易感的SNP谱预测疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，而且通过SNP预测谱的构建，还可以实现对疾病作出前瞻性的“基因诊断”。近年来，利用SNP预测疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病预测上的应用价值已初见端倪。然而，目前还没有将CT基因上的SNP应用于原发性肺癌诊断的报道，若能筛选出位于CT基因上的原发性肺癌易感SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国原发性肺癌的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与原发性肺癌辅助诊断相关的CT基因上的SNP标志物。

本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。

本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供原发性肺癌辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和原发性肺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与原发性肺癌高度相关的位于CT基因上的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的原发性肺癌辅助诊断试剂盒，为原发性肺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs12166583、rs12477419、rs75764106、rs74640907、rs74377505、rs1007089、rs1433646、rs6001675、rs11125117、rs3747093和rs793598的组合。

所述的SNP标志物的特异性扩增引物，这些引物为：

rs12166583的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs12477419的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs75764106的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs74640907的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs74377505的引物序列为SEQ IDNo:13和SEQ ID No:14；rs1007089的引物序列为SEQ ID No:16和 SEQ ID No:17；rs1433646的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs6001675 的引物序列为SEQ IDNo:22和SEQ ID No:23；rs11125117的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs3747093的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29； rs793598的引物序列为SEQ IDNo:31和SEQ ID No:32。

所述的SNP标志物的特异性延伸引物，该引物为：

rs12166583的引物序列为SEQ ID No:3；rs12477419的引物序列为SEQ ID No:6；rs75764106的引物序列为SEQ ID No:9；rs74640907的引物序列为SEQ ID No:12；rs74377505的引物序列为SEQ ID No:15；rs1007089的引物序列为SEQ ID No:18；rs1433646的引物序列为SEQ ID No:21；rs6001675的引物序列为SEQ ID No:24；rs11125117的引物序列为SEQ ID No:27；rs3747093的引物序列为SEQ ID No:30；rs793598的引物序列为SEQ ID No:33。

所述的SNP标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

一种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs12166583、rs12477419、rs75764106、rs74640907、rs74377505、rs1007089、rs1433646、 rs6001675、rs11125117、rs3747093和rs793598。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性扩增引物为：

rs12166583的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs12477419的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs75764106的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs74640907的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs74377505的引物序列为SEQ IDNo:13和SEQ ID No:14；rs1007089的引物序列为SEQ ID No:16和 SEQ ID No:17；rs1433646的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs6001675 的引物序列为SEQ IDNo:22和SEQ ID No:23；rs11125117的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs3747093的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29； rs793598的引物序列为SEQ IDNo:31和SEQ ID No:32。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性延伸引物为：

rs12166583的引物序列为SEQ ID No:3；rs12477419的引物序列为SEQ ID No:6；rs75764106的引物序列为SEQ ID No:9；rs74640907的引物序列为SEQ ID No:12；rs74377505的引物序列为SEQ ID No:15；rs1007089的引物序列为SEQ ID No:18；rs1433646的引物序列为SEQ ID No:21；rs6001675的引物序列为SEQ ID No:24；rs11125117的引物序列为SEQ ID No:27；rs3747093的引物序列为SEQ ID No:30；rs793598的引物序列为SEQ ID No:33。

所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、 dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择原发性肺癌病例、与原发性肺癌病例年龄、性别匹配的健康对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与原发性肺癌相关的位于CT 基因上的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步在另外的样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4)原发性肺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据原发性肺癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0(Affymetrix,Santa Clara,California,USA，下同)芯片进行全基因组扫描，SequenomMassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择

(1)临床确诊为原发性肺癌；

(2)与病例年龄、性别匹配的健康对照；

本研究共采用5408例符合标准的样本进行研究。

2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

3.Affymetrix 6.0芯片检测

(1)取受试者全基因组DNA样本；

(2)在Affymetrix 6.0芯片上进行全基因组扫描；

(3)检测并比较各基因型在原发性肺癌病例与健康对照中的分布差异。

4.单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型

(1)取受试者DNA样本；

(2)设计单个SNP的特异性引物；

(3)进行PCR反应；

(4)检测并比较原发性肺癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。

5.诊断试剂盒制备方法

Affymetrix 6.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定原发性肺癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为原发性肺癌诊断的指标。最后筛选出的与原发性肺癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒(rs12166583、 rs12477419、rs75764106、rs74640907、rs74377505、rs1007089、rs1433646、rs6001675、 rs11125117、rs3747093和rs793598)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。

6.统计分析方法

运用X²检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。

为了进一步研究这11个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与原发性肺癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.33×rs12166583的评分)+(-0.18×rs12477419的评分)+(0.36×rs75764106 的评分)+(-0.17×rs74640907的评分)+(-0.31×rs74377505的评分)+(0.18×rs1007089 的评分)+(0.16×rs1433646的评分)+(-0.21×rs6001675的评分)+(0.27×rs11125117 的评分)+(-0.12×rs3747093的评分)+(-0.15×rs793598的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的5408例样本中。(以rs12166583为例：0.33为rs12166583的回归系数(见表1)；rs12166583的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述2331例符合条件的原发性肺癌病例及3077例健康对照中，两组年龄均衡可比。我们将这两组人群使用Affymetrix 6.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。

根据Affymetrix 6.0芯片检测，本发明人检测到在“原发性肺癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs12166583、rs12477419、 rs75764106、rs74640907、rs74377505、rs1007089、rs1433646、rs6001675、rs11125117、 rs3747093和rs793598。(相关SNP对应位置见表3)

根据上述检测结果，我们将这11个与原发性肺癌发病相关的SNP在另外1500 例原发性肺癌病例和与其年龄、性别匹配的3000例健康对照中进行了单个SNP的检测，结果与芯片检测一致。

单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这11个SNP与原发性肺癌的发病存在着显著关联。

进一步分析这11个SNP的组合用于原发性肺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于原发性肺癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物和其他检测试剂。

具体而言，这11个SNP的组合，或者这11个SNP的特异性引物构成的相关诊断试剂盒有助于原发性肺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明有益效果：

本发明提供的SNP标志物作为原发性肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：

(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为原发性肺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于原发性肺癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的位于CT基因上的SNP谱，并应用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄、性别等对疾病发展的影响因素，研究位于CT基因上的SNP在原发性肺癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于原发性肺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了原发性肺癌发病相关位于CT基因上的SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得原发性肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。

显示原发性肺癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2005月4月开始至2011年1月从南京医科大学附属肿瘤医院和南京医科大学第一附属医院收集了大量的原发性肺癌血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择5408例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：

1.研究样本的选择

(1)临床确诊为原发性肺癌；

(2)与病例年龄、性别匹配的健康对照；

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描

在上述符合条件的2331例原发性肺癌患者和3077例健康对照中，两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Affymetrix 6.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用 TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心 10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm 离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10 分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液 (氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值) 在1.6-2.0。

8、进行全基因组扫描：在Affymetrix 6.0芯片上进行全基因组扫描。

9、数据分析与处理：在“原发性肺癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。

表1病例组与对照组全基因组关联分析结果

实施例3单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型

将上述全基因组扫描发现与原发性肺癌发病有关的SNP在另外1500例原发性肺癌病例和3000健康对照中进行检测，具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心 10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm 离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀， 37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10 分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液 (氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、进行Sequenom MassARRAY基因分型。对全基因组扫描发现的11个阳性关联的SNP设计特异性扩增引物和特异性延伸引物(表2)。扩增反应的体系包括： 0.1μl dNTP mix(25mM)，0.4μl MgCl₂(25mM)，0.1μl HotStar Taq(5U/μl)，每对正向和反向扩增引物的混合物1μl(1pmol/μl)和1.9μl双蒸水，加入1μl的DNA样本进行 PCR扩增反应。延伸反应的体系包括：EXTEND Mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)。加入SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理后的PCR产物7μl进行单碱基延伸反应。使用的仪器为ABI 9700型PCR仪。纯化的产物4,000rpm离心4分钟，沉淀树脂后使用 MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪转移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDL-TOF质谱分析。

9、基因型判读：采用TYPER 4.0软件(sequenom)进行。

10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的addtive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组合对照组中分布频率的差异，结果与全基因组扫描类似不再列出。

实施例4利用危险度评分方法进一步分析SNP与原发性肺癌发病

根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“原发性肺癌病例组”和“健康对照组”基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个 SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些SNP对原发性肺癌发病的判断能力。对11个SNP标志物的联合分析发现，这11个SNP以55.9％的AUC将健康对照组和原发性肺癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为62.5％，特异度：45.8％(图1)。

因此，本发明人证明了采用rs12166583、rs12477419、rs75764106、rs74640907、rs74377505、rs1007089、rs1433646、rs6001675、rs11125117、rs3747093和rs793598的组合能够很好地将健康对照和原发性肺癌患者区分。

实施例5用于原发性肺癌辅助诊断SNP试剂盒的制作

SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和SequenomMassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物(包括下列引物：rs12166583的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs12477419的引物序列为SEQ ID No:4和SEQID No:5；rs75764106的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs74640907的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs74377505的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；rs1007089的引物序列为SEQ ID No:16和 SEQ ID No:17；rs1433646的引物序列为SEQ IDNo:19和SEQ ID No:20；rs6001675 的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；rs11125117的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs3747093的引物序列为SEQ IDNo:28和SEQ ID No:29； rs793598的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32)，和/或特异性延伸引物(包括下列引物：rs12166583的引物序列为SEQ ID No:3；rs12477419的引物序列为SEQ ID No:6；rs75764106的引物序列为SEQ ID No:9；rs74640907的引物序列为SEQID No:12；rs74377505的引物序列为SEQ ID No:15；rs1007089的引物序列为SEQ ID No:18；rs1433646的引物序列为SEQ ID No:21；rs6001675的引物序列为SEQ ID No:24；rs11125117的引物序列为SEQ ID No:27；rs3747093的引物序列为SEQ ID No:30；rs793598的引物序列为SEQ ID No:33)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl₂，双蒸水，荧光探针，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱辅助判断原发性肺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

表2.相关SNP引物

表3.相关SNP对应位置

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的癌-睾丸基因遗传标志物及其应用

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg tactgctggt tatttctctc 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg cgtgtgtata cacatataca g 31

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggttattt ctctctctct ct 22

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg ccatgttaat caggctggtc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttggatg ttttccacag gtgggcacag 30

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggtgatcca cccgc 15

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgttggatg gcaacatttg ctcataagct c 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgttggatg tccagggctg tgaatattat 30

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcataagctc ataatagtta gca 23

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgttggatg ccacgatgtg cttatttcgc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgttggatg gtgccatcta ccacagtatg 30

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcattgcat cacaac 16

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgttggatg cagcacaagt gggttattgg 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgttggatg gaagacaccc ctcctctttg 30

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggctcacctg tgattttcat 20

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgttggatg tgttggtctc cccgtatttg 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgttggatg aagacagtct agcacaaacc 30

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccgtatttg tattcctctt 20

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgttggatg gcaagctagc aaattggctg 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acgttggatg gctcgtctgc caacaataac 30

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gttgaggttt ctcaatactc 20

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgttggatg cacaccggtg tatgtacaat 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgttggatg acactgtgaa atcgaactgg 30

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgaaatcgaa ctggtaactt a 21

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acgttggatg caacattggt ctacaggttc 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgttggatg aacaggtttg cttctacccc 30

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcgtatatga ccccctt 17

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

acgttggatg aggggagtgg gccggacag 29

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acgttggatg agaacaaagg cgaagtgcag 30

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggaccccgga cgctgccc 18

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acgttggatg acaggagatt gaattcgcac 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acgttggatg ggaaccagga aagtctttcg 30

<210> 33

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cttgagtcag cccac 15

Claims (9)

1.一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs12166583、rs12477419、rs75764106、rs74640907、rs74377505、rs1007089、rs1433646、rs6001675、rs11125117、rs3747093和rs793598的组合。

2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为：

rs12166583的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs12477419的引物序列为SEQID No:4和SEQ ID No:5；rs75764106的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs74640907的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs74377505的引物序列为SEQ IDNo:13和SEQ ID No:14；rs1007089的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs1433646的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs6001675的引物序列为SEQ ID No:22和SEQID No:23；rs11125117的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs3747093的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；rs793598的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32。

3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为：

rs12166583的引物序列为SEQ ID No:3；rs12477419的引物序列为SEQ ID No:6；rs75764106的引物序列为SEQ ID No:9；rs74640907的引物序列为SEQ ID No:12；rs74377505的引物序列为SEQ ID No:15；rs1007089的引物序列为SEQ ID No:18；rs1433646的引物序列为SEQ ID No:21；rs6001675的引物序列为SEQ ID No:24；rs11125117的引物序列为SEQ ID No:27；rs3747093的引物序列为SEQ ID No:30；rs793598的引物序列为SEQ ID No:33。

4.权利要求1所述的SNP标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

5.权利要求2所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

6.权利要求3所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

7.一种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs12166583、rs12477419、rs75764106、rs74640907、rs74377505、rs1007089、rs1433646、rs6001675、rs11125117、rs3747093和rs793598。

8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述SNP标志物的特异性扩增引物和/或权利要求3所述SNP标志物的特异性延伸引物。

9.根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。