CN104263723A - 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 - Google Patents
一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。该标志物为rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138等35个遗传位点的组合。该标志物可用于制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。
背景技术
肺癌是目前全球受累人数最多的恶性肿瘤。据国际癌症研究署(IARC)估计，2012年肺癌新发病例182.5万人，死亡159.0万人，位居全球范围内肿瘤发病率和死亡率的首位。由于持续增长的烟草消费、环境污染以及生活方式的改变，近二十年来，我国肺癌发病和死亡一直呈上升趋势，仅2000年至2005年间，中国肺癌的发病人数和因肺癌死亡的人数分别增加了12万和10万，据估计，2012年我国男性肺癌发病率为52.8/10万，女性为20.4/10万，超过发达的工业化国家水平。英国著名肿瘤学家R.Peto预言：如果中国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌将超过100万，成为世界第一肺癌大国。由此可见，肺癌是威胁全球及我国居民生命和健康的重要疾病之一，是亟待解决的重大公共卫生问题。
目前，对肺癌的一级预防(病因预防)尚无明确、有效的预防措施，但如果能加强二级预防，做到早发现、早诊断和早治疗，则可以明显改善疾病预后，提高肺癌患者的5年生存率。因此，争取早期诊断是肺癌防治的重点。目前肺癌早期诊断的方法主要有影像学检查(胸部X线检查、胸部CT、核磁共振、正电子发射计算机体层扫描)、微创介入检查(支气管镜检、荧光纤维支气管镜检、超声纤维支气管镜检等)、痰液脱落细胞学检查、肿瘤生物标记等。但是现在临床常用的胸部X线、胸部CT和纤维支气管镜检存在一些弊端。胸部X线检查难以发现，或难以鉴定局部粘膜上较小的肿瘤；胸部CT不能确定病变的性质，可能存在假阳性或假阴性。纤维支气管镜检对肿瘤的浸润深度、有无转移了解不清。另外目前临床所用肺癌标志物的特异性不强，血清癌胚抗原(CEA)在肺癌早期多不增高，对诊断意义不大。病理活组织检查作为肺癌诊断的金标准，虽然在临床肺癌确诊中居于重要地位，但由于需要有创取活检组织，不适宜作为临床健康筛查的手段。
自20世纪60年代Doll和Hill通过病例-对照研究和队列研究首次发现吸烟与肺癌的关系以来，烟草暴露已经被认为是肺癌发生的最主要环境危险因素。研究表明，吸烟者发生肺癌的风险可比非吸烟者高出10倍。肺癌家庭聚集性的研究显示，遗传因素在肺癌的发生中同样扮演重要角色。双生子研究表明，肺癌是遗传与环境共同作用的结果。流行病学研究表明，80％以上的肺癌可以归咎为烟草暴露，但仅有不到20％的吸烟者发生肺癌，说明在同等环境暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。低频高外显性遗传标志物是指较小等位基因频率(MAF)小于0.05的遗传变异。遗传变异的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对环境暴露、药物治疗等因素的不同反应，因此可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。
通过疾病易感的遗传标志物来诊断疾病的发生，灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景。近年来，疾病遗传标志物已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病的应用价值已初见端倪。
然而，目前还没有将低频高外显性遗传标志物应用于肺癌诊断的报道，若能筛选出肺癌易感的低频高外显性遗传变异作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国肺癌诊断现状将会是个有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。
本发明的第二个目的是提供上述遗传标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述遗传标志物及其特异性引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供原发性肺癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究原发性肺癌患者及健康对照外周血DNA中的遗传多态性，寻找一组与原发性肺癌高度相关的高特异性和敏感性的低频高外显性遗传标志物，并研制出可便于临床应用的原发性肺癌辅助诊断试剂盒，为原发性肺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物，该标志物为rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138、rs188908188、rs190614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522和rs79472556的组合。
所述的遗传标志物的特异性扩增引物，该引物为：
rs1131897的引物序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2；
rs1133833的引物序列为SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；
rs115019901的引物序列为SEQ ID No：7、SEQ ID No：8；
rs117855259的引物序列为SEQ ID No：10、SEQ ID No：11；
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rs145529151的引物序列为SEQ ID No：25、SEQ ID No：26；
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rs79472556的引物序列为SEQ ID No：103、SEQ ID No：104。
所述的遗传标志物的特异性延伸引物，该引物为：
rs1131897的引物序列为SEQ ID NO：3；rs1133833的引物序列为SEQ ID NO：6；rs115019901的引物序列为SEQ ID NO：9；rs117855259的引物序列为SEQ ID NO：12；rs118154190的引物序列为SEQ ID NO：15；rs141059768的引物序列为SEQ ID NO：18；rs141350740的引物序列为SEQ ID NO：21；rs142881943的引物序列为SEQ ID NO：24；rs145529151的引物序列为SEQ ID NO：27；rs145638335的引物序列为SEQ ID NO：30；rs145940981的引物序列为SEQ ID NO：33；rs150279473的引物序列为SEQ ID NO：36；rs150695913的引物序列为SEQ ID NO：39；rs151223396的引物序列为SEQ ID NO：42；rs185832840的引物序列为SEQ ID NO：45；rs188159138的引物序列为SEQ ID NO：48；rs188908188的引物序列为SEQ ID NO：51；rs190614894的引物序列为SEQ ID NO：54；rs200170353的引物序列为SEQ ID NO：57；rs200660845的引物序列为SEQ ID NO：60；rs200847762的引物序列为SEQ ID NO：63；rs201210090的引物序列为SEQ ID NO：66；rs201308754的引物序列为SEQ ID NO：69；rs202173016的引物序列为SEQ ID NO：72；rs34687332的引物序列为SEQ ID NO：75；rs3733782的引物序列为SEQ ID NO：78；rs3827760的引物序列为SEQ ID NO：81；rs45442501的引物序列为SEQ ID NO：84；rs6141383的引物序列为SEQ ID NO：87；rs61737776的引物序列为SEQ ID NO：90；rs62176112的引物序列为SEQ ID NO：93；rs6756629的引物序列为SEQ ID NO：96；rs73016227的引物序列为SEQ ID NO：99；rs7703522的引物序列为SEQ ID NO：102；rs79472556的引物序列为SEQ ID NO：105。
所述的遗传标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的遗传标志物的特异性扩增引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的遗传标志物的特异性延伸引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138、rs188908188、rs190614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522和rs79472556。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择原发性肺癌病例和健康对照，利用高密度低频高外显性遗传标志物芯片，在全外显子组范围内找出与原发性肺癌相关的遗传标志物。(3)对筛选出的阳性关联标志物，进一步在另外的样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4)原发性肺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据原发性肺癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗传标志物开发辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了IlluminaHuman Exome BeadChip(IlluminaInc.，San Diego，CA)芯片进行全外显子组扫描，Sequenom MassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为原发性肺癌；
(2)健康对照；
本研究共采用4336例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.IlluminaRHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片上进行全外显子组扫描；
(3)检测并比较各基因型在原发性肺癌病例与健康对照中的分别差异。
4.单个遗传标志物的Sequenom MassARRAY基因分型
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计单个遗传标志物的特异性引物；
(3)进行PCR反应；
(4)检测并比较原发性肺癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片进行全外显子组扫描和单个遗传标志物检测后确定原发性肺癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗传标志物，作为原发性肺癌诊断的指标。最后筛选出的与原发性肺癌发病有关的遗传标志物组成辅助诊断试剂盒(rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138、rs188908188、rs190614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522和rs79472556)。诊断试剂可以包括这些遗传标志物的特异性引物对，以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这35个低频高外显性遗传标志物构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个遗传标志物与原发性肺癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个遗传标志物的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个遗传标志物分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个遗传标志物的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.65×rs1131897的评分)+(1.97×rs1133833的评分)+(0.57×rs115019901的评分)+(0.57×rs117855259的评分)+(1.04×rs118154190的评分)+(0.92×rs141059768的评分)+(0.92×rs141350740的评分)+(0.42×rs142881943的评分)+(0.79×rs145529151的评分)+(0.96×rs145638335的评分)+(1.97×rs145940981的评分)+(2.84×rs150279473的评分)+(-0.67×rs150695913的评分)+(0.86×rs151223396的评分)+(1.79×rs185832840的评分)+(-0.62×rs188159138的评分)+(1.77×rs188908188的评分)+(0.82×rs190614894的评分)+(1.40×rs200170353的评分)+(0.73×rs200660845的评分)+(-1.41×rs200847762的评分)+(1.31×rs201210090的评分)+(1.03×rs201308754的评分)+(0.65×rs202173016的评分)+(1.86×rs34687332的评分)+(-0.81×rs3733782的评分)+(0.35×rs3827760的评分)+(1.86×rs45442501的评分)+(0.56×rs6141383的评分)+(-1.22×rs61737776的评分)+(1.59×rs62176112的评分)+(0.73×rs6756629的评分)+(2.15×rs73016227的评分)+(2.64×rs7703522的评分)+(0.85×rs79472556的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全外显子组关联研究的4336例样本中。(以rs1131897为例：0.65为rs1131897的回归系数(见表1)；rs1131897的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNV的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些个SNV分别评分的总和，单个SNV的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
上述共有1386例符合条件的原发性肺癌病例及2950例健康对照。我们将这两组人群经IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片进行全外显子组扫描获得相关结果。
根据IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片检测，本发明人检测到在“原发性肺癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的遗传标志物包括：rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138、rs188908188、rs190614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522和rs79472556。
根据上述检测结果，我们将这35个与原发性肺癌发病相关的遗传标志物在另外1500例原发性肺癌病例和3000例健康对照中进行了单个遗传标志物的检测，结果与芯片检测一致。
单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这35个遗传标志物与原发性肺癌的发病存在着显著关联。
进一步分析这35个遗传标志物的组合用于原发性肺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于原发性肺癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述遗传标志物的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言，这35个遗传标志物的组合，或者这35个遗传标志物的特异性引物构成的相关诊断试剂盒有助于原发性肺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的遗传标志物作为原发性肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)低频高外显性遗传标志物是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为原发性肺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)遗传标志物试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于原发性肺癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全外显子组芯片扫描以获取疾病相关的低频高外显性遗传标志物，并应用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了低频高外显性遗传生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过病例对照研究，发掘低频高外显性遗传标志物在原发性肺癌辅助诊断的应用前景，阐述遗传标志物对于原发性肺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了原发性肺癌发病相关遗传标志物；通过遗传生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得原发性肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全外显子组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
显示原发性肺癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2005月4月开始至2011年12月从南京医科大学第一附属医院和江苏省肿瘤医院收集了大量的原发性肺癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了4336例符合下列标准的样本全外显子组芯片扫描和单个遗传标志物Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：
1、病理组织学确诊的原发性肺癌患者；
2、健康对照；
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中遗传标志物的全外显子组扫描
上述共有1386例符合条件的原发性肺癌患者和2950例健康对照。将这两组人群经IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行全外显子组扫描：在IlluminaHuman Exome BeadChip(IlluminaInc.，San Diego，CA)芯片上进行全外显子组扫描；
9、数据分析与处理：在“原发性肺癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的低频高外显性遗传标志物在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1 病例组与对照组全外显子组关联分析结果
实施例3单个遗传标志物的Sequenom MassARRAY基因分型
将上述全外显子组扫描发现与原发性肺癌发病有关的遗传标志物在另外1500原发性肺癌病例和3000健康对照通过Sequenom MassARRAY基因分型平台上进行检测，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外2600D：2800D)在1.6-2.0。
8、进行Sequenom MassARRAY基因分型。对全外显子组扫描发现的与原发性肺癌有关的35个SNV设计特异性扩增引物和特异性延伸引物(表2)；扩增反应的体系包括：0.1μl dNTP mix(25mM)，0.4μl MgCl2(25mM)，0.1μl HotStar Taq(5U/μl)，每对正向和反向扩增引物的混合物1μl(1pmol/μl)和1.9μl双蒸水，加入1μl的DNA样本进行PCR扩增反应。延伸反应的体系包括：EXTEND Mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)。加入SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理后的PCR产物7μl进行单碱基延伸反应。使用的仪器为ABI 9700型PCR仪。纯化的产物4,000rpm离心4分钟，沉淀树脂后使用MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪转移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF质谱分析。
9、基因型判读：采用TYPER 4.0软件(sequenom)进行。
10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较每个SNV的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，结果与全外显子扫描类似不再列出。
实施例4利用危险度评分方法进一步分析遗传标志物与原发性肺癌发病
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“原发性肺癌病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的遗传标志物，以全外显子组扫描样本中单个遗传标志物回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些遗传标志物对原发性肺癌发病的判断能力。对35个遗传标志物的联合分析发现，这35个遗传标志物以67.6％的AUC将健康对照组和原发性肺癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为55.6％，特异度：70.4％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138、rs188908188、rs190614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522和rs79472556的组合能够很好地将健康对照和原发性肺癌患者区分。
实施例5用于原发性肺癌辅助诊断遗传标志物试剂盒的制作
低频高外显性遗传标志物试剂盒的制作和操作流程是基于IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片检测和SequenomMassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批遗传标志物特异性扩增引物(包括下列引物：rs1131897的引物序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2；rs1133833的引物序列为SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；rs115019901的引物序列为SEQ ID No：7、SEQ ID No：8；rs117855259的引物序列为SEQ ID No：10、SEQ ID No：11；rs118154190的引物序列为SEQ ID No：13、SEQ ID No：14；rs141059768的引物序列为SEQ ID No：16、SEQID No：17；rs141350740的引物序列为SEQ ID No：19、SEQ ID No：20；rs142881943的引物序列为SEQ ID No：22、SEQ ID No：23；rs145529151的引物序列为SEQ ID No：25、SEQ ID No：26；rs145638335的引物序列为SEQ ID No：28、SEQ ID No：29；rs145940981的引物序列为SEQ ID No：31、SEQ ID No：32；rs150279473的引物序列为SEQ ID No：34、SEQ ID No：35；rs150695913的引物序列为SEQ ID No：37、SEQID No：38；rs151223396的引物序列为SEQ ID No：40、SEQ ID No：41；rs185832840的引物序列为SEQ ID No：43、SEQ ID No：44；rs188159138的引物序列为SEQ ID No：46、SEQ ID No：47；rs188908188的引物序列为SEQ ID No：49、SEQ ID No：50；rs190614894的引物序列为SEQ ID No：52、SEQ ID No：53；rs200170353的引物序列为SEQ ID No：55、SEQ ID No：56；rs200660845的引物序列为SEQ ID No：58、SEQID No：59；rs200847762的引物序列为SEQ ID No：61、SEQ ID No：62；rs201210090的引物序列为SEQ ID No：64、SEQ ID No：65；rs201308754的引物序列为SEQ ID No：67、SEQ ID No：68；rs202173016的引物序列为SEQ ID No：70、SEQ ID No：71；rs34687332的引物序列为SEQ ID No：73、SEQ ID No：74；rs3733782的引物序列为SEQ ID No：76、SEQ ID No：77；rs3827760的引物序列为SEQ ID No：79、SEQ ID No：80；rs45442501的引物序列为SEQ ID No：82、SEQ ID No：83；rs6141383的引物序列为SEQ ID No：85、SEQ ID No：86；rs61737776的引物序列为SEQ ID No：88、SEQ ID No：89；rs62176112的引物序列为SEQ ID No：91、SEQ ID No：92；rs6756629的引物序列为SEQ ID No：94、SEQ ID No：95；rs73016227的引物序列为SEQ ID No：97、SEQ ID No：98；rs7703522的引物序列为SEQ ID No：100、SEQ ID No：101；rs79472556的引物序列为SEQ ID No：103、SEQ ID No：104)，和/或特异性延伸引物(包括下列引物：rs1131897的引物序列为SEQ ID NO：3；rs1133833的引物序列为SEQ ID NO：6；rs115019901的引物序列为SEQ ID NO：9；rs117855259的引物序列为SEQ ID NO：12；rs118154190的引物序列为SEQ ID NO：15；rs141059768的引物序列为SEQ ID NO：18；rs141350740的引物序列为SEQ ID NO：21；rs142881943的引物序列为SEQ ID NO：24；rs145529151的引物序列为SEQ ID NO：27；rs145638335的引物序列为SEQ ID NO：30；rs145940981的引物序列为SEQ ID NO：33；rs150279473的引物序列为SEQ ID NO：36；rs150695913的引物序列为SEQ ID NO：39；rs151223396的引物序列为SEQ ID NO：42；rs185832840的引物序列为SEQ ID NO：45；rs188159138的引物序列为SEQ ID NO：48；rs188908188的引物序列为SEQ ID NO：51；rs190614894的引物序列为SEQ ID NO：54；rs200170353的引物序列为SEQ ID NO：57；rs200660845的引物序列为SEQ ID NO：60；rs200847762的引物序列为SEQ ID NO：63；rs201210090的引物序列为SEQ ID NO：66；rs201308754的引物序列为SEQ ID NO：69；rs202173016的引物序列为SEQ ID NO：72；rs34687332的引物序列为SEQ ID NO：75；rs3733782的引物序列为SEQ ID NO：78；rs3827760的引物序列为SEQ ID NO：81；rs45442501的引物序列为SEQ ID NO：84；rs6141383的引物序列为SEQ ID NO：87；rs61737776的引物序列为SEQ ID NO：90；rs62176112的引物序列为SEQ ID NO：93；rs6756629的引物序列为SEQ ID NO：96；rs73016227的引物序列为SEQ ID NO：99；rs7703522的引物序列为SEQ ID NO：102；rs79472556的引物序列为SEQ ID NO：105)；还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测遗传标志物，再通过遗传标志物辅助判断原发性肺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关低频高外显性遗传标志物的引物
F：Forward Primer，上游引物；R：Reverse Primer，下游引物；E：Extended Primer，延伸引物。
Claims (9)
1.一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物，其特征在于该标志物为rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138、rs188908188、rs190614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522和rs79472556的组合。
2.权利要求1所述的遗传标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为：
rs1131897的引物序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2；
rs1133833的引物序列为SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；
rs115019901的引物序列为SEQ ID No：7、SEQ ID No：8；
rs117855259的引物序列为SEQ ID No：10、SEQ ID No：11；
rs118154190的引物序列为SEQ ID No：13、SEQ ID No：14；
rs141059768的引物序列为SEQ ID No：16、SEQ ID No：17；
rs141350740的引物序列为SEQ ID No：19、SEQ ID No：20；
rs142881943的引物序列为SEQ ID No：22、SEQ ID No：23；
rs145529151的引物序列为SEQ ID No：25、SEQ ID No：26；
rs145638335的引物序列为SEQ ID No：28、SEQ ID No：29；
rs145940981的引物序列为SEQ ID No：31、SEQ ID No：32；
rs150279473的引物序列为SEQ ID No：34、SEQ ID No：35；
rs150695913的引物序列为SEQ ID No：37、SEQ ID No：38；
rs151223396的引物序列为SEQ ID No：40、SEQ ID No：41；
rs185832840的引物序列为SEQ ID No：43、SEQ ID No：44；
rs188159138的引物序列为SEQ ID No：46、SEQ ID No：47；
rs188908188的引物序列为SEQ ID No：49、SEQ ID No：50；
rs190614894的引物序列为SEQ ID No：52、SEQ ID No：53；
rs200170353的引物序列为SEQ ID No：55、SEQ ID No：56；
rs200660845的引物序列为SEQ ID No：58、SEQ ID No：59；
rs200847762的引物序列为SEQ ID No：61、SEQ ID No：62；
rs201210090的引物序列为SEQ ID No：64、SEQ ID No：65；
rs201308754的引物序列为SEQ ID No：67、SEQ ID No：68；
rs202173016的引物序列为SEQ ID No：70、SEQ ID No：71；
rs34687332的引物序列为SEQ ID No：73、SEQ ID No：74；
rs3733782的引物序列为SEQ ID No：76、SEQ ID No：77；
rs3827760的引物序列为SEQ ID No：79、SEQ ID No：80；
rs45442501的引物序列为SEQ ID No：82、SEQ ID No：83；
rs6141383的引物序列为SEQ ID No：85、SEQ ID No：86；
rs61737776的引物序列为SEQ ID No：88、SEQ ID No：89；
rs62176112的引物序列为SEQ ID No：91、SEQ ID No：92；
rs6756629的引物序列为SEQ ID No：94、SEQ ID No：95；
rs73016227的引物序列为SEQ ID No：97、SEQ ID No：98；
rs7703522的引物序列为SEQ ID No：100、SEQ ID No：101；
rs79472556的引物序列为SEQ ID No：103、SEQ ID No：104。
3.权利要求1所述的遗传标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为：
rs1131897的引物序列为SEQ ID NO：3；rs1133833的引物序列为SEQ ID NO：6；rs115019901的引物序列为SEQ ID NO：9；rs117855259的引物序列为SEQ ID NO：12；rs118154190的引物序列为SEQ ID NO：15；rs141059768的引物序列为SEQ ID NO：18；rs141350740的引物序列为SEQ ID NO：21；rs142881943的引物序列为SEQ ID NO：24；rs145529151的引物序列为SEQ ID NO：27；rs145638335的引物序列为SEQ ID NO：30；rs145940981的引物序列为SEQ ID NO：33；rs150279473的引物序列为SEQ ID NO：36；rs150695913的引物序列为SEQ ID NO：39；rs151223396的引物序列为SEQ ID NO：42；rs185832840的引物序列为SEQ ID NO：45；rs188159138的引物序列为SEQ ID NO：48；rs188908188的引物序列为SEQ ID NO：51；rs190614894的引物序列为SEQ ID NO：54；rs200170353的引物序列为SEQ ID NO：57；rs200660845的引物序列为SEQ ID NO：60；rs200847762的引物序列为SEQ ID NO：63；rs201210090的引物序列为SEQ ID NO：66；rs201308754的引物序列为SEQ ID NO：69；rs202173016的引物序列为SEQ ID NO：72；rs34687332的引物序列为SEQ ID NO：75；rs3733782的引物序列为SEQ ID NO：78；rs3827760的引物序列为SEQ ID NO：81；rs45442501的引物序列为SEQ ID NO：84；rs6141383的引物序列为SEQ ID NO：87；rs61737776的引物序列为SEQ ID NO：90；rs62176112的引物序列为SEQ ID NO：93；rs6756629的引物序列为SEQ ID NO：96；rs73016227的引物序列为SEQ ID NO：99；rs7703522的引物序列为SEQ ID NO：102；rs79472556的引物序列为SEQ ID NO：105。
4.权利要求1所述的遗传标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的遗传标志物的特异性扩增引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的遗传标志物的特异性延伸引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
7.一种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138、rs188908188、rs190614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522和rs79472556。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的特异性扩增引物和/或权利要求3所述的特异性延伸引物。
9.根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
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