WO2012132369A1 - 癌幹細胞を標的とするウイルスベクター - Google Patents

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宇清 王
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    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant adenovirus vector having a cancer stem cell-specific promoter.
  • the present invention relates to adenoviral vectors that can specifically replicate in cancer stem cells.
  • the present invention also relates to a method for identifying cancer stem cells, a method for diagnosing cancer, and a method for treatment using the vector.
  • the present invention relates to a diagnostic agent and a therapeutic agent for cancer containing an adenovirus vector as an active ingredient.
  • Cancer stem cells are defined as a small number of cancer cells constituting cancer that have the properties of stem cells and have the ability to form tumors. Cancer stem cells have the following characteristics: 1) low division, low proliferation rate, 2) high self-renewal repair ability, 3) maintenance of cancer stem cells by self-replication in cancer tissues, 4) Resistance to anti-cancer drugs and radiation therapy resistance (see Non-Patent Documents 4, 10 and 11). However, if it has stem-like properties, it is not essential to have all the characteristics of 1) to 4), and the main cause of cancer malignancy is an important point. Therefore, it is sometimes referred to as Tumor-Initiating Cell or Cancer Initiating Cell (cancer progenitor cell or tumor or cancer founding cell) (see Non-Patent Document 12).
  • cancer stem cells As an important target for cancer treatment, attention has been paid to cancer stem cells as a therapeutic target.
  • the cancer stem cell hypothesis has already been proposed in the 1970s, and it has recently been clarified that the presence of cancer stem cells is associated with resistance to cancer treatments, recurrence, and exacerbation.
  • the main body of cancer stem cells is also unknown, and research on biological analysis and treatment (especially cancer stem cell-specific treatment) targeting cancer stem cells has hardly progressed.
  • CD133 has been reported as a cancer stem cell marker expressed on the cell surface (see Non-Patent Documents 1 to 4).
  • Human CD133 was identified as an epitope expressed in CD34 + hematopoietic stem cells in 1997 (see Non-Patent Document 13).
  • CD133 is a five-transmembrane glycoprotein called prominin 1 (PROM1), and there are many spliced isoforms whose expression depends on the tissue. The CD133 ligand and downstream signal have not yet been reported, and the function was unknown.
  • PROM1 prominin 1
  • CD133 is a marker of hematopoietic progenitor cells and vascular endothelial progenitor cells, and at the same time, nervous system tumors (see Non-Patent Documents 1 to 4), prostate cancer (see Non-Patent Document 14), colon cancer (see Non-Patent Documents 5 to 9) ), Lung cancer (see Non-Patent Document 15), and liver cancer (see Non-Patent Documents 16 to 18).
  • CD133 has been reported to be expressed in a tissue-dependent manner by at least five types of promoters, but a reporter assay using a human colon cancer-derived cell line Caco-2 cell and a teratocarcinoma cell line NT-2 cell. The results show that promoters 1 and 2 are active, but promoters 3 to 5 were not particularly active (see Non-patent Document 19).
  • Caco-2 cell which is a human colon cancer-derived cell line
  • Fuji which is a human synovial sarcoma cell line
  • promoters 1 to 4 have almost no activity, and promoter 5 It has been reported that there is activity (Non-patent Document 20).
  • CD133 promoter activity is enhanced by the enhancer, but not so high promoter activity is recognized.
  • Caco-2 cells strongly express CD133, but it is known that the promoter activity of CD133 (particularly promoters 1 to 4) is not so high even when the cells and the pGL3 enhancer vector are used. It was.
  • CD133 promoter activity in cancer stem cells has not been known so far.
  • promoters specific to cells such as tissues and stem cells are known to have very weak activity compared to promoters used for forced expression such as RSV promoter, CMV promoter, CA promoter and the like.
  • promoters used for forced expression such as RSV promoter, CMV promoter, CA promoter and the like.
  • RSV promoter CMV promoter
  • CA promoter CA promoter
  • a virus vector that can be propagated specifically for cancer is known.
  • viral vectors include those in which the Rb binding region within the E1 region of adenovirus is deleted (E1A ⁇ 24) or the p53 binding region is deleted (E1B ⁇ 55), or the endogenous promoter of the E1 gene is cancer-specific. Those that are replaced with highly expressed promoters are known.
  • an adenoviral vector using a urokinase type plasminogen activation receptor promoter see Patent Document 2
  • an adenoviral vector using a PEG3 promoter see Patent Document 3
  • an adeno using a survivin promoter A viral vector see Patent Document 4.
  • An adenoviral vector capable of cancer-specific growth has oncolytic properties (see Non-Patent Document 22) and is therefore considered effective for cancer treatment.
  • the virus amplified in the cancer cells that have been infected / transfected at the time of administration destroys the surrounding cancer cells and further infects the surrounding or remote cancer cells to introduce the gene, the gene must be loaded into the CRA. Therefore, it is considered useful as a gene delivery tool.
  • treatment with a viral vector targeting cancer stem cells has also been reported (Non-patent Document 23).
  • an object of the present invention is to provide a novel and efficient cancer treatment method targeting cancer stem cells and a method for labeling cancer stem cells.
  • the present inventors have conducted intensive studies on promoters that are specifically active in cancer stem cells and can be used for therapeutic and diagnostic purposes. As a result, it is surprising that although the expression of CD133 is comparable or low compared to CaCo-2 cells, the promoter activity of CD133 is very strong in cancer stem cells and can be used for therapeutic and diagnostic purposes as it is. I found it.
  • the present inventors have made and examined a vector that grows specifically in cancer stem cells by applying the CD133 promoter to a growth type adenovirus vector (hereinafter referred to as “CRA”).
  • CRA growth type adenovirus vector
  • CD133-CRA CRA in which the CD133 promoter is operably linked to a nucleic acid encoding a protein essential for viral growth in the viral genome (for example, E1A and E1B) is referred to as a cancer stem cell. It was found to grow specifically. The present inventors have also found that a cancer stem cell-specific proliferation vector infects the cancer stem cell and grows inside the cancer stem cell.
  • the vector of the present invention specifically grows in cancer stem cells present in cancer tissue, it can be used to identify cancer stem cells in cancer tissue by inserting a foreign gene to be labeled into the same vector. Furthermore, since the vector of the present invention not only proliferates specifically for cancer stem cells but also maintains the ability to ultimately destroy cancer stem cells, it is useful for treatment targeting cancer stem cells.
  • the present invention relates to a promoter that is specifically activated in cancer stem cells and a viral vector having the promoter.
  • the present invention also relates to a viral vector that can specifically propagate in cancer stem cells.
  • the present invention provides a method for labeling cancer stem cells using the vector, and a method for diagnosing and treating cancer.
  • the present invention also provides a cancer stem cell labeling agent containing a vector capable of specifically growing in cancer stem cells as an active ingredient, a cancer diagnostic agent, a metastasis inhibitor, and a therapeutic agent.
  • the present invention provides CD133-CRA as a vector that can specifically propagate in cancer stem cells.
  • the cancer prevention method, metastasis suppression method, and treatment method are based on the suppression or killing of proliferation of cancer stem cells that are the cause of cancer development.
  • the present invention relates to the following inventions: (1) A viral vector having a CD133 promoter operably linked to a desired gene and capable of expressing the desired gene specifically in cancer stem cells. (2) The virus vector according to (1), wherein the desired gene is a gene encoding a protein essential for virus growth and can be propagated specifically in cancer stem cells. (3) The viral vector according to (2), which is oncolytic. (4) Adenovirus, herpes simplex virus, mixoma virus, reovirus, vesicular stoma tytis virus, Newcastle disease virus, vaccinia virus, RS virus, Sendai virus, measles virus, coxsackie virus, or Seneca valley virus The viral vector according to (2) or (3).
  • the viral vector according to (2) or (3) which is an adenovirus.
  • the adenovirus vector according to (5) wherein the desired gene is an adenovirus E1A or E1B gene.
  • E1A is E1A (E1A ⁇ 24) lacking an Rb binding region
  • E1B is E1B (E1B ⁇ 55) lacking a p53 binding region.
  • the adenovirus vector according to any one of (2) to (7) further comprising a marker gene or a cytotoxic gene.
  • the adenoviral vector according to (6) or (7) which is one adenoviral vector selected from the following (a) to (c):
  • Adenovirus herpes simplex virus, myxoma virus, reovirus, vesicular stoma tytis virus, Newcastle disease virus, vaccinia virus, RS virus, Sendai virus, measles virus, Coxsackie virus, or Seneca valley virus
  • the viral vector according to any one of (11) to (17).
  • a cancer therapeutic agent, metastasis inhibitor, prophylactic agent or diagnostic agent comprising the viral vector according to any one of (1) to (19).
  • a cancer stem cell labeling agent comprising the viral vector according to any one of (1) to (19).
  • a method for labeling cancer stem cells comprising a step of administering the viral vector according to any one of (1) to (19) to a patient in need thereof.
  • a method for diagnosing cancer comprising a step of administering the viral vector according to any one of (1) to (19) to a patient in need thereof.
  • a method for preventing cancer, a method for suppressing metastasis, or a method for treating cancer comprising a step of administering the virus vector according to any one of (1) to (20) to a patient in need thereof.
  • the gene according to any one of (23) to (28), wherein the desired gene is a gene encoding a protein essential for virus growth, and the virus vector can be propagated specifically in cancer stem cells. the method of.
  • the CD133 promoter that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a nucleic acid molecule having a sequence reported as the promoter of CD133 (sometimes called AC133 or PROM1).
  • CD133 sometimes called AC133 or PROM1
  • mouse, rat, and human CD133 have been reported.
  • Shmelkov SV, et al. Blood 2004; 103: 2055-61, and GenBank accession numbers AY275524, AY438641 and AY438640, and human CD133 promoters 1 to 5 can be mentioned.
  • the promoter of the present invention includes human CD133 promoter 1 (pr1; SEQ ID NO: 1), promoter 2 (pr2; SEQ ID NO: 2), promoter 3 (pr3; SEQ ID NO: 3), promoter 4 (pr4; sequence) No. 4) and promoter 5 (pr5; SEQ ID NO: 5) can be used.
  • CD133 promoters of other animal species for example, mouse Prominin-1 promoter 1 (SEQ ID NO: 6), promoter 2 (SEQ ID NO: 7), or promoter 3 (SEQ ID NO: 8)
  • mouse Prominin-1 promoter 1 SEQ ID NO: 6
  • promoter 2 SEQ ID NO: 7
  • promoter 3 SEQ ID NO: 8
  • Kemper K Tol MJPM, Medema JP (2010) Mouse Tissue Express Multiple Split Variants of Prominin-1.PloS ONE 5 (8): e12325
  • the “CD133 promoter” is a nucleotide sequence having 85%, 90%, 95%, or 98% homology with the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 in addition to the above-mentioned promoter.
  • a nucleic acid molecule having Sequence homology can be determined, for example, by using BLAST.
  • the “CD133 promoter” is a stringent condition with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 or a nucleic acid molecule having a complementary sequence thereto in addition to the above promoter. It may be a nucleic acid molecule that hybridizes with.
  • hybridizes under stringent conditions refers to Frederick M. et al. Hybridization is described by the method described in Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology” (2011). More specifically, the DNA immobilized on the nitrocellulose membrane is reacted at 65 ° C. in a solution of 0.5 M NaHPO 4 , 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 mM EDTA, and then 0.1 to 0 .5 ⁇ SSC (15-30 mM NaCl, 1.5-3 mM sodium citrate, pH 7.0), hybridizing by washing several times at 65-68 ° C. with 0.1% SDS.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the “CD133 promoter” is a nucleic acid in which a part of the nucleotide sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 7 is replaced, deleted, or described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 7. Includes nucleic acid molecules with additional nucleic acid added to or inserted into the nucleotide sequence. When a nucleic acid is deleted, added, or inserted, a number that does not change the reading frame of the subsequent gene is deleted, added, or inserted. The number of such substitutions, deletions, additions and insertions is 1 to 50 nucleotides, 1 to 20 nucleotides, 1 to 10 nucleotides and 1 to 3 nucleotides.
  • substitution, deletion, addition, and insertion Two or more types of mutations may be included among substitution, deletion, addition, and insertion.
  • substitution, deletion, addition, or insertion is performed at a position other than the transcription factor binding region.
  • the transcription factor binding region can be examined using, for example, a transcription factor binding site prediction program such as TFSEARCH and Aliba, and Shmelkov SV, et al. Blood 2004; 103: 2055-61 (FIG. 3 etc.).
  • a nucleic acid molecule in which a part of the nucleotide sequence is substituted, deleted, or an additional nucleic acid is added to or inserted into the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 7, is equivalent to CD133 It is desirable to have promoter activity.
  • promoter activity equivalent to CD133 means that promoter activity is high under conditions where the activity of the wild-type CD133 promoter is high and activity of the wild-type CD133 promoter is low. Means low.
  • the promoter activity equivalent to CD133 mainly means that the promoter activity is qualitatively equivalent to CD133, but the promoter activity equivalent to CD133 is quantitatively equivalent to or more than that of wild-type CD133. May be strong.
  • CD133 promoter includes a fragment of the promoter of CD133 as long as the promoter activity equivalent to that of CD133 is maintained.
  • the CD133 promoter fragment has at least one transcription factor binding site of the CD133 promoter, and preferably has all of the transcription factor binding sites of the CD133 promoter.
  • the transcription factor binding region can be determined by the method described above.
  • fragments of the CD133 promoter of the present invention include human CD133 promoter 1 (pr1; SEQ ID NO: 1), promoter 2 (pr2; SEQ ID NO: 2), promoter 3 (pr3; SEQ ID NO: 3), promoter 4 (pr4; SEQ ID NO: 4), and promoter 5 (pr5; SEQ ID NO: 5), and fragments of mouse CD133 promoter 1 (SEQ ID NO: 6), promoter 2 (SEQ ID NO: 7), and promoter 3 (SEQ ID NO: 8).
  • CD133 promoter is“ operably linked ”to a desired gene in the viral genome is positioned so that the CD133 promoter can regulate transcription of the gene upstream of the desired gene. Means.
  • a “viral vector” is a virus that can incorporate foreign DNA or RNA into a gene, and is not particularly limited as long as it is safe even if administered to a target animal (eg, human).
  • the viral vector of the present invention may be either a DNA virus or an RNA virus.
  • the viral vector of the present invention is a virus that does not infect cells other than cancer cells (preferably cancer stem cells) or cannot self-replicate in the cells.
  • the viral vector is a virus that has oncolytic properties or can acquire oncolytic properties by genetic recombination.
  • the viral vector of the present invention preferably has cytolytic properties.
  • cytolytic means the ability to lyse the cell and release the virus outside the cell when infected with a cell (for example, a cancer cell or a cancer stem cell) having the conditions for replication of the viral vector.
  • a cell for example, a cancer cell or a cancer stem cell
  • the virus of the present invention is preferably an oncolytic virus.
  • oncolytic virus refers to a virus having the ability to lyse tumor cells.
  • the oncolytic virus is toxic to human cancer cells but not normal human cells.
  • Viral tumor specificity may be based on any of the viral infection, amplification, and cytolytic properties.
  • an oncolytic virus is an animal virus that infects human cancer cells and shows toxicity but does not infect normal human cells and does not show toxicity; a tumor-specific gene whose viral gene promoter is activated only by cancer cells Mutant virus that replicates in cancer cells but does not replicate in normal cells because it is replaced by a promoter; suppresses the cell cycle to create an environment where the cell cycle essential for virus replication is rotating Viruses that inactivate genes (P53, Rb, etc.) are missing or have mutations, so the virus replicates in cancer cells that are rotating with abnormally updated cell cycles, regardless of these mutations.
  • the virus vector of the present invention includes herpes simplex virus, mixoma virus, reovirus, vesicular stoma tytis virus, Newcastle disease virus, RS virus, Sendai virus, measles virus, Coxsackie virus, Seneca valley virus.
  • herpes simplex virus mixoma virus
  • reovirus vesicular stoma tytis virus
  • Newcastle disease virus RS virus
  • Sendai virus measles virus
  • Coxsackie virus Seneca valley virus.
  • myxoma virus replicates and causes cell lysis in cancer cells, but does not infect normal human cells.
  • reovirus is oncolytic when isolated from nature, and infects both cancer cells and cancer stem cells.
  • Vesicular stomatitis virus does not infect normal cells due to an acute antiviral interferon response, but infects cancer cells in which the interferon response has been canceled. Mutant strains and recombinant strains having high oncolytic properties of vesicular stoma tytis virus have been obtained (Lichty, BD et al. (2004) Trends. Mol. Med. 10: 210-216).
  • adenovirus or “adenovirus vector” means a virus that belongs to the genus Mast adenovirus belonging to the family Adenoviridae and infects mammals. Preferably, it is a human adenovirus. Although human adenoviruses have sub-genus A to F and serotypes, adenoviruses in the present invention are not limited to specific subgeneras and serotypes.
  • the adenovirus may be an adenovirus having a mutation in E1A and / or E1B. Examples of the mutation of E1A protein include deletion of Rb binding region (E1A ⁇ 24). In addition, examples of the mutation of E1B protein include deletion of p53 binding region (E1B ⁇ 55K).
  • the “desired gene” is not particularly limited as long as it is a gene that can be used by being specifically expressed in cancer stem cells.
  • the desired gene can be a gene encoding a protein essential for virus growth or a cytotoxic gene.
  • the desired gene can be a marker gene.
  • the “protein essential for virus growth” is not particularly limited as long as it plays a role in virus growth.
  • E1A, E1B, E2, E4, L1, L2, L3, L4 and L5 can be mentioned, and E1A and E1B are preferred.
  • the protein essential for virus growth may be a wild type or a mutant type.
  • the mutant E1A protein includes E1A (E1A ⁇ 24) lacking the Rb binding region.
  • Examples of the mutant E1B protein include E1B lacking the p53 binding region (E1B ⁇ 55K).
  • the adenoviral vector of the present invention since the vector of the present invention enhances the proliferation of adenovirus in a cell in which the CD133 promoter is activated, the adenoviral vector of the present invention has an E1A ⁇ 24 and / or operably linked to the CD133 promoter. By having E1B ⁇ 55K, the specificity of the proliferation of adenovirus in cancer stem cells can be enhanced.
  • a viral vector of the present invention using the herpes simplex virus a protein essential for the growth of virus, ICP34.5 (HSV-1 RL1 gene) and ICP6 (U L 31 gene) can be mentioned .
  • Cytotoxic gene refers to a gene that encodes a substance that induces apoptosis or necrosis in the cell by being expressed in the cell, a gene that is phagocytosed by an immune cell by expression, or is expressed in the cell A gene that encodes a substance that stops cell growth.
  • the cytotoxic gene may encode a protein or non-coding RNA such as siRNA and miRNA.
  • the cytotoxic gene may be one in which the encoded substance itself directly inhibits cell survival or proliferation, or the encoded substance is used together with a prodrug, for example, to poison the prodrug and damage the cell. May be given.
  • the cytotoxic gene may be presented on the cell surface and targeted to immune cells such as cytotoxic T cells or antibodies to indirectly kill cells or inhibit proliferation.
  • Cytotoxic genes include, but are not limited to, mda-5, mda-7, BAX, PTEN, soluble FGFR, siRNA or antisense to ras, siRNA or antisense to mda-9; HSV-tk Genes that toxicize prodrugs such as (herpes simplex virus-thymidine kinase; ganciclovir is toxic), E.
  • coli cytosine deaminase CD; toxic 5-fluorocytosine
  • p53 adenovirus E3-11.6K (Ad2 and Ad5-derived), adenovirus E3-10.5K, adenovirus E4 gene, caspase and other pro-apoptotic genes
  • p21 retinoblastoma gene, cyclin-dependent kinase inhibitors (p16, p15, p18 and p19) )
  • Encoding genes cytostatic genes such as growth arrest-specific homeobox (GAX) genes; cytotoxic genes such as Pseudomonas exotoxins; TNF- ⁇ , p53, APC, DPC-4, BRCA-1, BRCA -2, WT-1, MMAC-1, etc.
  • GX growth arrest-specific homeobox
  • CEA tumor suppressor genes
  • p53 and other antigen genes that are recognized by the immune system on the cell surface
  • GM-CSF interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20 and other cytokine genes
  • Angiostatin, siRNA or anti-angiogenic genes such as VEGF be able to.
  • the cytotoxic gene may be a gene that enhances the responsiveness of radiation therapy, chemotherapy or immunotherapy, for example, EGF receptor (enhancing the therapeutic effect by an EGFR-specific tyrosine kinase inhibitor such as gefitinib), Her-2 receptor (enhancing the therapeutic effect of Herceptin in breast cancer patients) may also be used.
  • EGF receptor enhancing the therapeutic effect by an EGFR-specific tyrosine kinase inhibitor such as gefitinib
  • Her-2 receptor enhancing the therapeutic effect of Herceptin in breast cancer patients
  • the toxic gene is a substance that toxicizes a prodrug, for example, thymidine kinase gene (used in combination with gancyclovir or acyclovir), cytosine deaminase gene (used in combination with 5-fluorocytosine), E. coli-derived upp gene and S. cerevisiae.
  • cerevisiae-derived fur gene used in combination with 5-fluorouracil
  • thymidine kinase gene or thymidine kinase-thymidylate kinase fusion gene used in combination with azidothymidine
  • the “marker gene” refers to a gene that encodes a substance capable of labeling cells into which the gene has been introduced.
  • a marker gene capable of labeling cancer stem cells green fluorescent protein (GFP)
  • GFP green fluorescent protein
  • a gene encoding a fluorescent protein such as EGFP (enhanced GFP), ⁇ -glucuronidase, ⁇ -galactosidase, luciferase, and dihydrofolate reductase.
  • GFP green fluorescent protein
  • EGFP enhanced GFP
  • ⁇ -glucuronidase ⁇ -glucuronidase
  • ⁇ -galactosidase ⁇ -galactosidase
  • luciferase luciferase
  • dihydrofolate reductase dihydrofolate reductase.
  • it may be a marker gene that enables image diagnosis, such as a fetishrin gene.
  • labeling a cancer stem cell is used to identify the presence or position of a cancer stem cell or a tissue containing a cancer stem cell temporarily or for a long period of time depending on the purpose of use. It means distinguishing from other cells and tissues.
  • identifying a cancer stem cell in the present specification means identifying the presence or position of a cancer stem cell or a tissue containing a cancer stem cell temporarily or in the long term, and “identifying” It means that cancer stem cells or tissues containing cancer stem cells are temporarily or long-term distinguished from other cells or tissues.
  • the label in this specification is particularly limited as long as it can identify the presence or position of cancer stem cells or tissues containing cancer stem cells, or can distinguish cancer stem cells or tissues containing cancer stem cells from other cells or tissues. It is not required that cells other than cancer stem cells are not stained at all. For example, when the presence of cancer stem cells in a cancer tissue is identified by directly injecting the vector of the present invention into a cancer tissue and staining, the cancer stem cells are distinguished from cancer cells that are not cancer stem cells in the cancer tissue. It only needs to be stained as much as possible, and cancer cells or other cells may be (weakly) stained.
  • the viral vector of the present invention has a promoter whose activity is specifically enhanced in cancer cells. It may have a transcription unit (hereinafter referred to as “cancer-specific transcription unit”) operably linked to a different or identical desired gene downstream (hereinafter referred to as “cancer-specific promoter”).
  • cancer-specific transcription unit a transcription unit operably linked to a different or identical desired gene downstream
  • a function of enhancing the specificity of the toxicity of a virus vector to cancer stem cells by providing a combination of a CD133 promoter transcription unit and a cancer-specific transcription unit, and / or identifying or identifying the toxicity to cancer stem cells and cancer stem cells in one virus vector Can have both.
  • a cancer-specific promoter a promoter whose activity is increased in common with many cancers may be used, or a promoter whose expression is specifically increased in the cancer according to the type of target cancer. It may be used.
  • the cancer-specific promoter may be a promoter whose activity is enhanced in cancer stem cells.
  • cancer-specific promoters include nestin promoter, cyclooxygenase-2 (Cox-2) promoter, multidrug resistance (mdr) protein promoter, telomerase promoter, prostate-specific antigen gene Promoter, kallikrein 2 gene promoter, human ⁇ -fetoprotein gene promoter, melanoma differentiation marker tyrosinase promoter, tyrosinase promoter, c-erbB-2 gene promoter, human carcinoembryonic antigen (CEA) gene promoter, gastrin releasing peptide gene promoter, human telomerase Reverse transcriptase gene promoter, hexokinase II gene promoter, L-plastin gene promoter Motor neuron specific enolase gene promoter, may be mentioned midkine promoter, human mucin genes MUC1 promoter, survivin promoter, Aurora kinase promoter, and the human mucin genes MUC4 promoter.
  • nestin promoter cyclooxy
  • the virus vector of the present invention may further have an additional transcription unit (hereinafter referred to as “additional transcription unit”) for expressing a desired gene.
  • additional transcription unit the promoter controlling the additional transcription unit is not particularly limited as long as it is a promoter active in eukaryotic cells (hereinafter referred to as “eukaryotic cell promoter”).
  • eukaryotic cell promoter examples include cytomegalovirus promoter (eg, cytomegalovirus immediate early promoter), Rous sarcoma virus terminal repeat promoter, human elongation factor 1 ⁇ promoter, human ubiquitin c promoter, and PEG-3 promoter. Can be used.
  • an inducible promoter such as a mouse breast cancer virus promoter (inducible by dexamethasone), tetracycline-responsive or ecdysone-inducible promoter may be used.
  • the aforementioned cancer cell-specific active promoter can also be used.
  • a CD133 promoter may be used as a promoter that controls the additional transcription unit.
  • the cancer-specific transcription unit and / or the additional transcription unit is a nucleic acid that encodes a protein whose CD133 promoter is essential for viral growth in the viral genome. It may be inserted into the adenovirus E1 region together with a transcription unit operably linked to the adenovirus, or may be inserted into another region of the adenovirus (for example, the E3 region).
  • the vector of the present invention has a cancer-specific transcription unit and / or an additional transcription unit, a gene encoding a protein essential for virus growth, a marker gene, or a cytotoxic gene can be used as the desired gene.
  • the vector of the present invention may be a multifactor cancer-specific growth control type recombinant adenovirus system (m-CRA; JP 2005-046101 A and International Publication No. WO 2005/012536).
  • m-CRA cancer-specific growth control type recombinant adenovirus system
  • adenoviral vectors can be cited as examples of adenoviral vectors of the present invention:
  • A Adenovirus vector with the following transcription units: (A1) CD133 transcription unit consisting of E133A gene or E1A ⁇ 24 gene operably linked to the CD133 promoter and its downstream (a2) Eukaryotic cell promoter, cancer-specific promoter or CD133 promoter and operably linked to its downstream A transcription unit consisting of an E1B gene or E1B ⁇ 55K gene, or a transcription unit consisting of an E1B ⁇ 19K gene operably linked downstream of a cancer-specific promoter (a3) optionally, a eukaryotic cell promoter, a cancer-specific promoter or a CD133 promoter and An additional transcription unit consisting of a marker gene or cytotoxic gene operably linked downstream thereof;
  • B Adenovirus vector with the following transcription units: (B1) a transcription unit consisting of a eukaryotic cell promoter, a cancer-specific promoter or a CD133
  • CD133-CRA is a propagating adenoviral vector (CRA) in which the CD133 promoter is operably linked to a nucleic acid encoding a protein essential for viral growth in the viral genome (eg, E1A and E1B), It is synonymous with the adenovirus vector described in the above (a) or (b).
  • CRA a propagating adenoviral vector
  • virus vector of the present invention may have enhanced specificity for infection to cancer stem cells by modification or substitution of viral fibers or hexons.
  • a ligand for a cancer stem cell surface protein may be included in a capsid such as a HI loop of a viral fiber or a hexon protein.
  • the vector of the present invention can be specifically labeled or damaged by cancer stem cells, it can be used for the diagnosis, prevention, treatment and cancer metastasis of cancer, or the cancer stem cells can be labeled or damaged. And can be used as a pharmaceutical composition for killing.
  • cancers that can be diagnosed, prevented, treated or suppressed in metastasis by the vector of the present invention or a pharmaceutical composition containing the vectors include brain tumors, glioblastomas, head and neck cancers, stomach cancers, lung cancers, breast cancers, uterine cancers, Ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, pharyngeal cancer, esophageal cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, colon cancer, osteosarcoma, skin cancer, melanoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, ureteral cancer, Examples include cervical cancer and hematopoietic or blood malignant tumors (eg, leukemia, malignant lymphoma, etc.).
  • a cancer in which the presence of cancer stem cells is confirmed, for example, brain tumor, glioblastoma, head and neck cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, liver cancer, bladder cancer, colon cancer, melanoma, pancreatic cancer, prostate cancer, Ovarian cancer (S. Bomken et al., British Journal of cancer (2010) 103: 439-445; Nathasha Y. Frank et al., The Journal of Clinical Investigation (2010) 120: 41-50).
  • cancers in which the expression of CD133 is confirmed in cancer stem cells, and examples include brain tumors, breast cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer, melanoma, prostate cancer (Tabu et al.
  • the vector of the present invention or a pharmaceutical composition containing the vector may be used as an agent for identifying, identifying, labeling, injuring or killing cancer stem cells in the cancer.
  • “damaging” a cancer stem cell means that the cancer stem cell is unable to exert its function. Specifically, the cancer stem cell self-proliferates and / or differentiates into a cancer cell. It means to make it impossible. “Damage specifically to cancer stem cells” means to give such damage more strongly to cancer stem cells compared to normal cells, and to normal cells or cancer cells other than cancer stem cells. It does not mean that there is no toxicity. Further, “damaging” means that cancer stem cells (including metastatic cancer stem cells) are destroyed by apoptosis or necrosis, cancer stem cells are destroyed by the immune system within the subject, and cancer stem cells Inhibiting proliferation and / or inhibiting differentiation.
  • damage to cancer stem cells is caused by the fact that the virus vector of the present invention that can replicate specifically in cancer stem cells and has cytolytic properties (or oncolytic properties) lyses cells (particularly cancer stem cells) after replication in the cells. May be given by Alternatively, the damage to cancer stem cells is caused by the expression of a cytotoxic gene in the cell to induce apoptosis or necrosis in the cell, toxicize the prodrug used together, or presented on the cell surface as an immune cell or antibody It may be given as a target.
  • the “injury agent” means an agent that causes such damage to cancer stem cells.
  • the present invention includes a cancer stem cell damaging agent containing the viral vector of the present invention as an active ingredient.
  • cancer stem cell means a cell that generates a large number of surrounding cancer cells by differentiation while maintaining the cancer stem cell by self-replication in a cancer tissue. Since a small number of cancer stem cells become a large number of cancer cells that form cancer tissue by differentiation, they are sometimes called cancer progenitor cells or tumor or cancer founder cells. As used herein, “cancer stem cell” refers to a cell within a tumor that has the ability to self-renew and provide a heterogeneous lineage of cancer cells, including a tumor (Clark MF et al., Cancer Res. (2006) 66: 9339). -9344).
  • cancer stem cells have both the ability to produce daughter cells having the same properties as self and the ability to differentiate into cells that form cancer tissue (particularly malignant tumors). However, this means that it has a stem-like nature to some extent, and it is not necessary to have a strict stem cell characteristic like a normal stem cell (it is not limited to the conditions) Rather, it is important as the main cause of cancer malignancy. Since a small number of cancer stem cells become a large number of cancer cells that form cancer tissues by differentiation, they are sometimes called Tumor-Initiating Cells or Cancer Initiating Cells (cancer progenitor cells or tumor or cancer founding cells).
  • the cancer stem cell in the present invention includes these cancer progenitor cells or tumor or cancer founder cells (Neuzil J, et al.
  • cancer stem cells may be cells capable of forming cancer when several to tens of thousands (preferably tens to thousands) of cells are transplanted into immunodeficient mice.
  • the cancer stem cell in this specification is not limited to this, it is known that the cancer stem cell in solid cancer expresses markers, such as CD24, CD44, CD90, CD133, ABCB5.
  • the cancer stem cells of the present invention are brain tumor, glioblastoma, head and neck cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, pharyngeal cancer, esophageal cancer, bladder cancer, Solid cancers and sarcomas such as pancreatic cancer, prostate cancer, colon cancer, osteosarcoma, skin cancer, melanoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, ureteral cancer, cervical cancer, and malignant tumors of hematopoietic organs and blood (eg acute Cancer stem cells of leukemia such as lymphocytic leukemia, malignant lymphoma).
  • the cancer stem cells are brain tumor stem cells or glioblastoma stem cells.
  • the virus vector of the present invention can express a desired gene specifically for cancer stem cells. Moreover, the therapeutic effect of tumor (cancer stem cell) solubility can be obtained by using the virus vector of the present invention as a proliferating virus that induces cancer growth specific to cancer stem cells. Furthermore, by mounting a marker gene or a therapeutic gene on the viral vector of the present invention, cancer stem cells can be visualized or the therapeutic effect can be induced or enhanced after viral infection. Therefore, by mounting a marker gene or a therapeutic gene on the oncolytic virus vector of the present invention, when cancer stem cells that cause treatment resistance are targeted, the oncolytic effect of the virus or damage is caused by the therapeutic gene. At the same time, the presence of cancer stem cells can be visualized.
  • cancer stem cells can be targeted and treated with the viral vector of the present invention itself.
  • the virus vector of the present invention capable of selectively identifying cancer stem cells.
  • the viral vector of the present invention can visualize, visualize, and identify cancer stem cells that cause malignant transformation with high invasion / metastasis in cancer patients at the time of diagnosis or treatment of cancer patients, and the proportion and location of cancer stem cells.
  • Cancer stem cells are resistant to existing treatments such as anticancer drugs and radiation, and the remaining cancer stem cells after treatment lead to cancer recurrence, which is considered to be the main cause of determining poor prognosis and lethality of patients. ing. Therefore, by using the viral vector of the present invention and identifying, visualizing, and detecting cancer stem cells in the body of cancer patients after treatment, a ground-breaking evaluation technique for the effectiveness of treatment methods for cancer patients, It will be possible to establish a revolutionary diagnosis and treatment method that can respond to cancer recurrence after treatment, and to monitor the remaining cancer stem cells after treatment.
  • the viral vector of the present invention capable of selectively diagnosing and treating cancer stem cells enables diagnosis of malignant cancer and treatment of the causative cells of malignant malignancy, thereby making a completely new diagnosis and treatment for cancer patients as described above. Many technologies will be produced, and the diagnosis and treatment of cancer will be greatly improved. Therefore, the viral vector of the present invention can be used for diagnosis and treatment targeting various cancer stem cells, and can achieve the cure of clinically refractory cancer and the prevention of recurrence.
  • the numerical value (%) in the left figure shows the ratio of the number of cells contained in the elliptical middle cell population indicated by R1 to the total number of cells.
  • the right figure shows the CD133 (+) cell content in the R1 cell population.
  • the horizontal axis (PE Log) indicates the CD133 (+) cell content
  • the vertical axis (FITC Log) has no particular meaning.
  • the numerical value in the right figure (CD133 (+) 20.18%) indicates the ratio of CD133 (+) cells to the R1 cell population.
  • the upper row shows the results using IgG antibody as a negative control, and the lower row shows results using anti-CD133 antibody.
  • the vertical axis shows data by side scattered light, and reflects cell morphology, cell internal structures such as nuclei and granules.
  • the numerical value (%) in the figure indicates the ratio of the number of cells contained in the cell population surrounded by the square to the total number of cells.
  • the photograph shows the result of electrophoresis after performing the RT-PCR method, and the graph shows the result of quantitative RT-PCR.
  • HPRT indicates the housekeeping gene HPRT used as a control gene.
  • the vertical axis of the graph represents the ratio of the expression level of CD133 mRNA to the expression level of HPRT mRNA.
  • CD133-expressing positive and negative cells were separated from X01GBS cells, which are enriched fractions of human neuronal cancer stem cells, and the CD133 mRNA expression level in each fraction was determined by RT-PCR and quantitative RT-PCR. The results of the investigation are shown.
  • the upper left figure shows the fractions sorted by the cell sorter.
  • CD133 ( ⁇ ) represents a fraction of CD133 expression negative cells
  • CD133 (+) represents a fraction of CD133 expression positive cells.
  • the lower left photograph shows the result of electrophoresis after the RT-PCR method.
  • the lower right graph shows the results of quantitative RT-PCR.
  • HPRT indicates the housekeeping gene HPRT used as a control gene.
  • the vertical axis of the graph represents the ratio of the expression level of CD133 mRNA to the expression level of HPRT mRNA.
  • a schematic diagram and names of reporter assay adenovirus vectors for measuring the activity of each promoter of CD133 are shown. LacZ was ligated downstream of each promoter of CD133 and incorporated into an adenovirus vector (pAdHM4) lacking the E1 region ( ⁇ E1). The activity of each promoter of CD133 in human neuronal cancer stem cell X01GBS is shown.
  • the vertical axis represents ⁇ -galactosidase activity (promoter activity), and the horizontal axis represents the type of adenovirus incorporating each promoter used for LacZ expression.
  • pr1, pr2, pr3, pr4, and pr5 indicate CD133 promoter 1, promoter 2, promoter 3, promoter 4, and promoter 5 in this order (the same applies to the following figures).
  • the activity of each promoter of CD133 in human neuronal cancer stem cell X01GBS cell is shown.
  • the vertical axis represents ⁇ -galactosidase activity (promoter activity)
  • the horizontal axis represents the type of adenovirus incorporating each promoter used for LacZ expression.
  • the activity of each promoter of CD133 is shown in X01GBD cells of a fraction enriched with cancer cells differentiated from human neuronal cancer stem cells.
  • the vertical axis represents ⁇ -galactosidase activity (promoter activity), and the horizontal axis represents the type of adenovirus incorporating each promoter used for LacZ expression.
  • promoter activity promoter activity
  • the horizontal axis represents LacZ activity (CD133 promoter activity)
  • the vertical axis represents CD133 (+) cells with anti-CD133 antibody labeled with PE.
  • the numerical value (%) shown in FIG. 6 indicates the proportion of cells correlated in the upper right region R7.
  • the figure which compared each promoter activity of CD133 and the activity of the non-specific RSV promoter for control in human neuronal cancer stem cell X01GBS cell is shown.
  • the horizontal axis represents LacZ activity (CD133 promoter activity), and the vertical axis represents side scattered light (Side Scatter: SS).
  • the numerical value (%) shown in FIG. 12 indicates the ratio of LacZ-expressing cells included in the area surrounded by the square to the total number of cells.
  • the figure which compared each promoter activity of CD133 in the X01GBD cell of the fraction which concentrated the human neuronal cancer stem cell X01GBS cell and the cancer cell differentiated from the human neuronal cancer stem cell is shown.
  • the horizontal axis represents LacZ activity (CD133 promoter activity), and the vertical axis represents side scattered light (Side Scatter: SS).
  • the numerical value (%) shown in FIG. 13 shows the ratio of LacZ-expressing cells contained in the area surrounded by a square to the total number of cells.
  • the structure of a proliferation type adenovirus vector specific for cancer stem cells (represented by CD133-reactive m-CRA “Ad.hCD133pr5-m-CRA”, the same applies hereinafter) is shown.
  • CD133pr1-5 means any one of CD133 promoters 1-5.
  • transduction efficiency in a human neuronal cancer stem cell X01GBS cell is shown.
  • FIG. 16 A photograph 24 hours after the infection of X01GBS cells with a non-proliferating adenovirus vector (Ad.CA-EGFP) is shown.
  • EGFP is a photograph in which the expression of EGFP is detected
  • Phase is a micrograph
  • Merge is a photograph in which the above two types of photographs are synthesized and shows the intracellular expression of EGFP ( The same applies to FIG. 16).
  • the numerical value of the upper part of a figure shows the observed magnification.
  • the cell killing effect of hCD133pr5-m-CRA on human neural cancer stem cells X01GBS cells is shown in cell morphology.
  • Ad FIG.
  • FIG. 2 shows the results of hCD133pr5-m-CRA infection with X01GBS at MOI 1 and observation with a 200-fold microscope 1, 2, 3, 4 and 5 days after infection.
  • the numerical value (Day) at the top of the figure indicates the number of days that have passed since infection.
  • CPE at the bottom of the figure indicates a cytopathic effect
  • Sphere means the degree of cell mass formation.
  • Ad In human neuronal cancer stem cells X01GBS cells. 2 is a graph showing the cell killing effect of hCD133pr5-m-CRA in terms of the number of viable cells.
  • the results of measurement of the number of viable cells on day 5 after infection of RSV-dE1.3 with human neuronal cancer stem cells X01GBS at MOIs 1, 3, and 10 are shown.
  • the vertical axis represents the ratio (%) of the number of viable cells compared to the untreated group, and the horizontal axis represents the virus infection condition (MOI).
  • Ad In X01GBD of a fraction enriched with human neuronal cancer stem cells X01GBS cells and cancer cells differentiated from human neuronal cancer stem cells. 2 is a graph showing the cell killing effect of hCD133pr5-m-CRA in terms of the number of viable cells.
  • the vertical axis represents the ratio (%) of the number of viable cells compared to the untreated group
  • the horizontal axis represents the virus infection condition (MOI).
  • 1 ⁇ 10 6 and 1 ⁇ 10 5 X01GBS cells were transplanted subcutaneously in 4 locations of NOD / SCID immunodeficient mice and 1 ⁇ 10 6 differentiated X01GBD cells were subcutaneously transplanted in 3 locations of NOD / SCID immunodeficient mice, 10 weeks later
  • the results of evaluating the rate of formation of tumor nodules that can be visually recognized are shown.
  • the vertical axis of the graph indicates tumor volume (mm 3 ), and the horizontal axis indicates the type and number of transplanted cells.
  • the three types of photographs all show the results of NOD / SCID immunodeficient mice transplanted with 1 ⁇ 10 6 cells (right) and 1 ⁇ 10 5 cells (left) of X01GBS cells.
  • the bottom photo is a tumor mass collected from each mouse.
  • the viral vector of the present invention can be produced by appropriately adopting a viral vector production method known to those skilled in the art.
  • a viral vector can be prepared by recombination of a viral backbone plasmid having an almost complete copy of the viral genome and a shuttle vector plasmid having a CD133 transcription unit using genetic recombination techniques. Genetic recombination uses homologous recombination, recombination using restriction enzyme sites (preferably, special restriction enzyme sites such as l-CeuI and Pl-SceI), or recombination reaction (for example, Cre-LoxP). It can also be done by recombination.
  • the viral vector of the present invention is an adenovirus
  • it is prepared by recombining an adenovirus backbone plasmid having an almost complete copy of the adenovirus genome and lacking the E1 gene, and a shuttle vector plasmid having a CD133 transcription unit. be able to.
  • the viral vector of the present invention has a cancer-specific transcription unit and / or an additional transcription unit
  • the viral vector is a single shuttle vector plasmid having a CD133 transcription unit, a cancer-specific transcription unit and / or an additional transcription unit.
  • Each plasmid can be prepared individually by using a shuttle vector plasmid having a CD133 transcription unit and a different cancer-specific transcription unit and / or an additional transcription unit. Alternatively, or simultaneously, it may be prepared by recombination with an adenovirus backbone plasmid.
  • a shuttle vector plasmid different from the shuttle vector plasmid having the CD133 transcription unit is used. It is desirable to perform the recombination separately from the shuttle vector plasmid having the E1 region of the adenovirus (such as the E3 region).
  • the modified and substituted vector can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • the viral vector of the present invention is an adenovirus
  • such viral vectors include Krasnykh et al., Cancer Res (2000) 60 (24): 6784-6787, Ruigork et al. Mol. Biol. (1990) 215: 589-596, Krasnyk et al., J. MoI. Virol. (1996) 70: 6839-6846, Henry et al., J. MoI. Virol. (1994) 68 (6): 5239-6846, and can be prepared according to the method described in International Publication No. WO00 / 67576.
  • the present invention comprises a viral vector having a CD133 promoter operably linked to a gene encoding a protein essential for viral growth of the viral vector of the present invention and / or a cancer vector capable of specifically growing, and / or
  • the present invention relates to a method for treating cancer, a method for preventing cancer, and a method for suppressing metastasis, including administering a viral vector having a cytotoxic gene (hereinafter collectively referred to as “therapeutic viral vector”) to a patient in need thereof. Since the therapeutic viral vector of the present invention can damage cancer stem cells from which cancer cells are generated, by administering such viral vectors to cancer patients or patients who are expected to become cancerous. Cancer can be treated or prevented, or cancer metastasis can be suppressed.
  • an example of the present invention includes administering a therapeutic viral vector to a patient in need thereof, thereby propagating the viral vector in the patient's cancer stem cells or expressing a cytotoxic gene. It is a cancer treatment method, prevention method, or metastasis suppression method.
  • Administration of the therapeutic viral vector of the present invention can be appropriately selected depending on the vector to be used, the disease to be treated, age, sex, route of administration, purpose of use, etc.
  • 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 12 pfu Can be administered.
  • the administration method includes intratumoral instillation, intravascular (intravenous, intraarterial) injection, intrameningeal injection, intramuscular injection, intradermal injection, subcutaneous injection, transmucosal administration (such as lung), nasal administration, etc. can do.
  • the vector of the present invention can be administered 1 ⁇ 10 10 pfu once every 2 days for 5 days.
  • the therapeutic viral vector of the present invention may be used in combination with other anticancer treatments. Since the therapeutic viral vector of the present invention treats cancer stem cells as a target, such anti-cancer treatment includes chemotherapy, radiotherapy, immunotherapy, surgical treatment and the like. Examples of the anticancer agent for combined treatment include taxol derivatives such as cisplatin, adriamycin, doxorubicin, and paclitaxel. When the therapeutic viral vector of the present invention has a cytotoxic gene that toxicizes the prodrug, an appropriate prodrug is used in combination.
  • prodrugs examples include gancyclovir or acyclovir (thymidine kinase gene), 5-fluorocytosine (cytosine deaminase gene), 5-fluorouracil (upper gene derived from E. coli and fur gene derived from S. cerevisiae), and azidothymidine (thymidine kinase) Gene or a fusion gene of thymidine kinase and thymidylate kinase) (in the parentheses indicate the cytotoxic genes to be combined).
  • gancyclovir or acyclovir thymidine kinase gene
  • 5-fluorocytosine cytosine deaminase gene
  • 5-fluorouracil upper gene derived from E. coli and fur gene derived from S. cerevisiae
  • azidothymidine thymidine kinase
  • the present invention includes a method for damaging cancer stem cells comprising the step of administering a therapeutic viral vector to a subject in need thereof.
  • An example of the present invention is a cancer comprising administering a therapeutic viral vector to a patient in need thereof, thereby propagating the viral vector in the patient's cancer stem cells or expressing a cytotoxic gene. This is a method for damaging stem cells.
  • the cancer stem cell injury method of the present invention can be carried out in accordance with the aforementioned method for treating and / or preventing cancer of the present invention.
  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer, comprising administering to a subject patient a virus vector having a marker gene (hereinafter referred to as “labeling virus vector”) among the virus vectors of the present invention, or
  • labeling virus vector a virus vector having a marker gene (hereinafter referred to as “labeling virus vector”) among the virus vectors of the present invention, or
  • the present invention relates to a method for labeling cancer stem cells. Since the labeling virus vector of the present invention can specifically express a marker gene in cancer stem cells, cancer stem cells are administered by administering such virus vectors to cancer patients or patients who are expected to become cancerous. Can be identified or identified. Since cancer stem cells are known to be present in several to several tens of percent in cancer cells, cancer can be diagnosed using the presence of cancer stem cells as an indicator.
  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer or a method for labeling cancer stem cells, which comprises administering a virus vector for labeling to a target patient and detecting an expression product of the marker gene.
  • the detection of the expression product of the marker gene can be appropriately selected depending on the type and purpose of the marker gene to be used. For example, the dye or fluorescent dye may be visually confirmed during surgery, or detected by image diagnosis. May be.
  • the diagnosis of cancer or the labeling of cancer stem cells may be performed by visualizing the cancer stem cells, or may be performed by a technique that can be detected by means other than vision.
  • the method for diagnosing cancer or the method for labeling cancer stem cells of the present invention may be a method for visualizing cancer stem cells, comprising administering a virus vector for labeling to a target patient.
  • the administration can be performed by administering the viral vector for labeling of the present invention, or administering the viral vector of the present invention to a patient according to the method for treating or preventing cancer of the present invention described above.
  • compositions comprising the viral vector of the present invention as an active ingredient is an active ingredient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be any generally known carrier that can be sterilized and administered to humans, and examples thereof include physiological saline. Sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and combinations thereof.
  • the pharmaceutical composition may further contain an antioxidant, a buffering agent and a bacteriostatic agent.
  • the pharmaceutical composition may be an injectable preparation that can be adjusted.
  • the pharmaceutical composition (pharmaceutical composition kit) may contain a diluent, a dispersant, a surfactant, a binder, and a lubricant.
  • Example 1 Confirmation of Cancer Stem Cellity of Human Neuronal Cancer Stem Cells and Expression of Cancer Stem Cell Surface Marker CD133 by Cellular Immunostaining
  • Cells As human neurocancer stem cells, Soeda A, et al. Human glioblastoma stem cells described in J Biol Chem 2008; 283; 10958-66 were used.
  • X01GBS cells are cancer stem cell fractions of X01GB cells, and are a group of cells in which the cancer stem cell fraction has been “enriched” using an undifferentiated medium and a Sphere culture method. Therefore, unless otherwise specified, human neural cancer stem cell X01GBS is hereinafter referred to as Soeda A, et al.
  • Neuronal cancer stem cells X01GBS were B-27 (Invitrogen), recombinante human FGF-2 (20 ng / ml; R & D Systems, Minneapolis, MN) and recombinant human EGF (20 ng / ml); The cells were cultured in a Dulbecco's modified Eagle's medium / F-12 (D6421, Sigma) medium containing FBS, penicillin G, and streptomycin sulphate at 37 ° C. with 5% CO 2 .
  • Dulbecco's modified Eagle's medium / F-12 D6421, Sigma
  • X01GBS cell culture was performed under the same conditions.
  • X01GBD cells were established from the X01GBS cells, which are a group of cells enriched with these human neuronal cancer stem cells (glioblastoma-derived cancer stem cells; human glioblastoma stem cells) by the following method. “Neuronal cancer cells” (differentiated glioblastomas) were produced as enriched cells.
  • X01GBD cells were obtained from Inagaki A, et al. It was established and maintained according to the establishment method described in Biochem Biopys Res Commun 2007; 361; 586-592 and the maintenance culture method in a differentiated state.
  • X01GBS cells were added to 10% fetal bovine serum Fetal bovine serum and Dulbecco's modified Eagle's medium / F-12 medium in which FGF-2 was removed. By culturing and maintaining this for a long time (over 50 passages or more), the cancer stem cell fraction was dramatically reduced, and most of the differentiated cancer cell fractions were replaced with X01GBD cells. .
  • the properties of X01GBD cells are described in Inagaki A, et al. Biochem Biopys Res Commun 2007; 361; 586-592.
  • the X01GBS cell group of the cancer stem cell fraction with high malignancy and high undifferentiation and the differentiated X01GBD cell group with low malignancy were established from human cranial nerve malignant tumor which is the same tissue of the same patient.
  • Anti-nestin rabbit polyclonal antibody (Chemicon, Temecula, CA) Anti-Vimentin rabbit polyclonal antibody (Ab45939, Abcam, UK) Anti-CD133 rabbit polyclonal antibody (Ab19988, Abcam, UK) Anti- ⁇ III tubulin (Tuj1) mouse monoclonal antibody TU20 (Ab7751, Abcam, UK)
  • Second antibody The following antibody conjugated with a green fluorescent dye having a wavelength of 488 nm was used as the second antibody: Alexa fluorophore-conjugated 488 (mouse / rabbit, Molecular Probes, Invitrogen)
  • the fixed cells were washed with 1 ⁇ PBS, and the first antibody was added to the cells and allowed to react at room temperature for 1 hour. After the reaction, the plate was washed with 1 ⁇ PBS, the second antibody was added so as to have the above-mentioned dilution ratio, reacted at room temperature for 30 minutes, and then washed with PBS.
  • DAPI staining When one drop of Mounting Medium with DAPI (H-1500, Vector laboratories, Inc., USA) was added to cells that had been subjected to cell immunostaining at room temperature, cell nuclei were immediately stained.
  • Mounting Medium with DAPI H-1500, Vector laboratories, Inc., USA
  • Stained cell fluorescence images were obtained from an inverted fluorescence microscope Axio Observer. With a filter set suitable for FITC or DAPI detection. Taken on A1 (Carl Zeiss). The observation results are shown in FIG.
  • the upper right figure is a photograph in which protein expression of each cancer stem cell and neuronal marker (name is shown in the figure) is detected by FITC
  • the upper left figure is a photograph in which the nucleus is detected by DAPI
  • the lower left figure Is a photograph of a phase difference image (without fluorescence)
  • the lower right is a photograph of an image obtained by superimposing these three kinds of photographs.
  • Nestin is an intermediate filament of class VI and is one of the important markers of neural stem cells that have been reported to be strongly expressed in neural stem cells in the midbrain. Vimentin is a mesenchymal cell marker that has been reported to be expressed only during development. ⁇ III tubulin (Tuj1) has been reported to be a protein that forms the framework of nerve cells, and is used as a marker for nerve cells because gene expression is mainly observed in nerve cells. DAPI is a fluorescent dye that stains nuclei blue. As shown in FIG. 1, the human neural cancer stem cell X01GBS used in this experiment is stained with antibodies against the neural stem cell markers nestin and vimentin, but not with an antibody against ⁇ III tubulin, which is a mature neural cell marker. From this, it was shown that it has stem cell nature. Moreover, since the human neuronal cancer stem cell X01GBS used in this experiment was stained with an antibody against CD133, it was confirmed that CD133 was expressed.
  • Example 2 Confirmation of expression of cancer stem cell surface marker CD133 of human neuronal cancer stem cell X01GBS by Western blotting.
  • Cells Human neural cancer stem cells X01GBS, colon cancer cells (Caco-2) and human iPS cells (201B7, purchased from RIKEN) were used as positive controls.
  • a 10% polyacrylamide gel (196-12921, Wako), and electrophoresis was performed.
  • the membrane was removed from the transfer device, immersed in a blocking buffer (5% non-fat dry milk, 10 mM Tris (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20), and blocked by shaking at room temperature for 1 hour. After removing the blocking buffer, a primary antibody reaction solution diluted 1: 1000 with the blocking buffer was added, and the membrane was reacted by shaking at room temperature for 1 hour.
  • a blocking buffer 5% non-fat dry milk, 10 mM Tris (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20
  • wash buffer (10 mM Tris (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) was added, and the membrane was washed three times for 15 minutes at room temperature while shaking the membrane.
  • the wash buffer was removed, a secondary antibody reaction solution diluted 2000 times was added, and the mixture was allowed to react at room temperature for 1 hour while shaking the membrane.
  • the secondary antibody reaction solution was removed, wash buffer was added, and the membrane was washed 3 times for 15 minutes at room temperature while shaking the membrane.
  • 0.125 mL / cm 2 of chemiluminescence reaction solution Chemi-Lumi One (05027-20, Wako) was added to the membrane, allowed to react for 1 minute, and then exposed to detect protein expression.
  • Figure 3 shows typical results of the experiments conducted.
  • the horizontal axis (PE Log) indicates CD133 (+) cells as logarithmic values
  • the vertical axis (FITC Log) has no particular meaning.
  • the ratio of CD133 (+) cells to the total number of X01GBS cells was about 10 to 20.18%. This indicates that about 10-20% of human neuronal cancer stem cells X01GBS express CD133 on the cell surface.
  • Example 4 Analysis of CD133 expression in X01GBS cells and X01GBD cells by flow cytometry X01GBS cells, which are enriched fractions of human neuronal cancer stem cells, and X01GBD cells, which are fractions enriched from differentiated cancer cells, show CD133 expression. Flow cytometry was performed simultaneously with a positive cell line Caco-2 cell (colon cancer) and a CD133 negative cell normal WI-38 cell (fibroblast).
  • Figure 4 shows typical results of the experiments conducted.
  • the upper graph shows the results of flow cytometry performed using an anti-CD133 antibody, using the IgG antibody as a negative control of the experiment for evaluating the characteristics of the antibody.
  • Only 0.5% of CD01GBD cells were positive for CD133 as compared to 4.2% of CD01GBS cells showing CD133 positive, so it became clear that CD133 cell positive cells were enriched in X01GBS cells.
  • the ratio of CD133 positive cells in X01GBS cells is slightly different from that in FIG. 3 because the experimental conditions (how to correct fluorescence between target cells in the flow cytometer, the difference in the vertical axis / side population in FIG. This was thought to be due to slight differences between the settings and the like in each experiment.
  • Example 5 Analysis of CD133 mRNA expression in X01GBS cells and X01GBD cells X01GBS cells that are enriched fractions of human neural cancer stem cells, X01GBD cells that are fractionated from differentiated cancer cells, and WI-38 that are normal cells The expression level of CD133 mRNA in the cells was examined by electrophoresis after RT-PCR and quantitative RT-PCR. The housekeeping gene HPRT was used as a control gene for RT-PCR.
  • Figure 5 shows the experimental results.
  • X01GBS cells show significant CD133 mRNA expression in RT-PCR electrophoresis photographs, as opposed to normal WI-38 cells and X01GBD cells. No expression could be detected in the cells.
  • quantitative RT-PCR high levels of CD133 mRNA expression were observed in X01GBS cells, whereas CD133 mRNA expression levels in X01GBD cells were extremely low, with statistically significant differences (P ⁇ 0. 0005) was confirmed.
  • Example 6 CD133 mRNA expression analysis in X01GBS cells and X01GBD cells Further, X01GBS cells, which are enriched fractions of human neuronal cancer stem cells, were separated into positive and negative cells of CD133 expression using a cell sorter. In the same manner, CD133 mRNA expression level was similarly examined by RT-PCR and quantitative RT-PCR.
  • Figure 6 shows typical results.
  • the upper left figure shows the fractions sorted by the cell sorter.
  • the lower left figure shows the results of RT-PCR, and the lower right figure shows the results of quantitative RT-PCR.
  • CD133 mRNA is highly expressed with a statistically significant difference (P ⁇ 0.005) in the fraction obtained by sorting CD133-positive cells. Was confirmed.
  • Example 7 Measurement of CD133 Promoter Activity in Human Neuronal Cancer Stem Cell X01GBS ( ⁇ -gal Assay)
  • Construction of adenovirus vector for CD133 promoter activity analysis As for human CD133, five types of promoters are known, and promoter 1 (pr1; SEQ ID NO: 1) and promoter 2 (pr2; SEQ ID NO: 2), respectively. , Promoter 3 (pr3; SEQ ID NO: 3), promoter 4 (pr4; SEQ ID NO: 4), and promoter 5 (pr5; SEQ ID NO: 5) (Sergey V. Shemelkov et al., BLOOD, 15 MARCH 2004, Vol. 103, No. 6).
  • LacZ was linked downstream of five human CD133 promoters and incorporated into a non-proliferating adenovirus vector lacking the E1 region.
  • An adenovirus vector was constructed.
  • a vector in which LacZ is ligated downstream of pr1 and incorporated into an adenoviral vector is referred to as “Ad.hCD133pr1-LacZ”.
  • a product in which LacZ is ligated downstream of pr2 to pr5 is added to ⁇ E1 of the adenoviral vector.
  • the incorporated vectors are referred to as “Ad.hCD133pr2-LacZ”, “Ad.hCD133pr3-LacZ”, “Ad.hCD133pr4-LacZ”, and “Ad.hCD133pr5-LacZ”, respectively. These vectors are collectively referred to as “Ad.hCD133pr1-5-LacZ”.
  • the vector construction method is described in Chen SH, et al. (1995) PNAS 92 (7): Constructed with reference to the method described in 2577-2581.
  • adenoviral vector Ad.hCD133pr1-5-LacZ constructed as described above was infected with the number of viruses MOI (multiplicity of infection) per cell.
  • MOI multiplicity of infection
  • Human neuronal cancer stem cells X01GBS were infected with MOI 30.
  • the activity of each promoter of human CD133 was measured using a beta-galactosidase enzyme assay system (Promega, USA) according to the manufacturer's attached protocol.
  • promoters 1, 2, 4, and 5 are high in activity, and among them, promoter 5 is the most in human neuronal cancer stem cell X01GBS. It was shown to have high transcription activity.
  • FIG. 9 The average values and standard errors of the experimental results are shown in FIG. 9 (X01GBS cells) and FIG. 10 (X01GBD cells).
  • X01GBS cells various activities were observed in all promoters in X01GBS cells, which is a concentrated fraction of human neuronal cancer stem cells.
  • Promoter 1, 2 and 4 had the next activity intensity, and Promoter 3 had low activity.
  • FIG. 10 although the activity of Promoter 5 is slightly observed in the differentiated cancer cell fraction X01GBD cells, the activities of other Promoters 1, 2, 3, and 4 are detected with sensitivity (cut-off). Value) or less.
  • the activity of Promoter 5 is almost insignificantly lower than the value in X01GBS cells shown in FIG. 9, and in comparison with the control RSV promoter, CD133 promoter is a fraction enriched in cancer cells. It was revealed that specific activity was observed in the X01GBD cells.
  • Example 9 Measurement of CD133 promoter activity in human neuronal cancer stem cell X01GBS (from flow cytometry)
  • An adenovirus vector for CD133 promoter activity analysis was constructed in the same manner as in Example 4 and introduced into human neuronal cancer stem cell X01GBS. Two days after the infection, the activity of the CD133 promoter was measured by detecting the expression of LacZ by flow cytometry using the FluoReporter lacZ Flow Cytometry Kit (Molecular Probes, Inc.) according to the manufacturer's attached protocol. Further, CD133 (+) cells were labeled with an anti-CD133 antibody (mouse anti-human CD133 / 2 (293C3) -PE (Miltenyi Biotec)) and measured.
  • an anti-CD133 antibody mouse anti-human CD133 / 2 (293C3) -PE (Miltenyi Biotec)
  • FIG. 11 shows the correlation between each promoter activity of CD133 in human neuronal cancer stem cell X01GBS and the expression level of CD133 on the cell surface.
  • the horizontal axis represents LacZ activity (CD133 promoter activity), and the vertical axis represents anti-CD133 antibody labeled with PE (expression level of CD133 on the cell surface).
  • the numerical value (%) shown in FIG. 11 indicates the proportion of cells distributed in the upper right region R7. As shown in FIG. 11, it was revealed that the activity of each promoter of CD133 is correlated with the expression level of CD133.
  • FIG. 12 shows a comparison of promoter activity of CD133 in X01GBS cells.
  • the horizontal axis represents LacZ activity (CD133 promoter activity)
  • the vertical axis represents side scattered light (Side Scatter: SS).
  • the numerical value (%) shown in FIG. 12 indicates the proportion of cells distributed in the region R6 surrounded by a square. From these results, among CD133 promoters, promoter 2 and promoter 5 showed particularly high activity.
  • each promoter activity of CD133 was confirmed by flow cytometry in X01GBS enriched fraction of human neuronal cancer stem cells and X01GBD fraction enriched in differentiated cancer cells.
  • the horizontal axis reflects LacZ activity (CD133 promoter activity)
  • the vertical axis reflects the cell morphology and cell internal structures such as nuclei and granules by side scattered light (Side Scatter: SS).
  • the numerical value (%) shown in FIG. 13 indicates the promoter activity (rate of LacZ positive) of CD133.
  • the proportion of cells exhibiting CD133 promoter activity was higher in the cancer stem cell enriched fraction than in X01GBD.
  • Example 11 Construction of a cancer stem cell-specific growth type adenovirus vector
  • Construction of a cancer stem cell-specific growth type adenovirus vector As shown in FIG. 14 according to the method described in International Publication No. WO2005 / 012536. Incorporation of five CD133 promoters in front of the E1A region, which is an early gene essential for adenovirus growth, allows a cancer cell-specific growth-regulated adenovirus vector that can specifically kill CD133-expressing tumors ( CD133 reactive m-CRA) was constructed.
  • CD133-reactive m-CRA incorporating CD133 promoter 1 is referred to as “hCD133pr1-m-CRA”.
  • the names of promoters 2 to 5 are the same.
  • CD133-reactive m-CRA incorporating five types of CD133 promoters is collectively referred to as “hCD133pr1-5-m-CRA”.
  • Example 2 Measurement of efficiency of introduction of adenovirus vector into human neuronal cancer stem cells
  • the culture conditions of neuronal cancer stem cells X01GBS cells were the same as in Example 1 (1).
  • the virus infection method was performed in the same manner as in Example 4 (2).
  • the vector construction method is described in Chen SH, et al. (1995) PNAS 92 (7): Constructed with reference to the method described in 2577-2581.
  • Non-proliferating adenoviral vector (Ad.CA-EGFP) constructed as described above was used to infect human neural cancer stem cells X01GBS at MOI 30. 24 hours after infection, Ad.
  • Ad Non-proliferating adenoviral vector constructed as described above was used to infect human neural cancer stem cells X01GBS at MOI 30. 24 hours after infection, Ad.
  • the introduction efficiency of CA-EGFP into human neuronal cancer stem cell X01GBS was measured. Specifically, Ad. In CA-EGFP, an EGFP fluorescent protein
  • FIG. 15 shows the results of measuring the efficiency of introducing a non-proliferating adenovirus vector into human neuronal cancer stem cells. Since expression of EGFP was confirmed in most X01GBS cells 24 hours after infection, it was confirmed that an adenoviral vector (Ad.CA-EGFP) was efficiently introduced into neuronal cancer stem cells.
  • Example 3 Measurement of X01GBS cell killing effect by hCD133pr5-m-CRA
  • the culture conditions of neuronal cancer stem cell X01GBS cells were the same as in Example 1 (1).
  • the virus infection method was the same as in Example 4 (2).
  • HCD133pr5-m-CRA constructed as described above was infected with MOI 3 to human neural cancer stem cells X01GBS.
  • Human neuronal cancer stem cells X01GBS into which hCD133pr5-m-CRA had been introduced 1, 2, 3, 4 and 5 days after the infection were observed with a microscope.
  • CD133pr5-m-CRA can kill X01GBS cells.
  • hCD133pr5-m-CRA causes CPE by X01GBS cells and destroys the cell sphere structure of cancer stem cells. It was confirmed that Further, 5 days after the infection, the cells infected with hCD133pr5-m-CRA were almost dead. This indicates that CD133pr5-mCRA has the ability to kill human neuronal cancer stem cells X01GBS cells.
  • Example 4 The culture conditions of neuronal cancer stem cell X01GBS cells are the same as in Example 1 (1).
  • the virus infection method is the same as in Example 4 (2).
  • RSV-dE1.3 was infected with human neuronal cancer stem cells X01GBS at MOI 1, 3 and 10.
  • Non-propagating adenoviral vector (Ad.RSV-dE1.3) is a vector in which the RSV promoter is incorporated into a non-propagating adenoviral vector lacking E1 and E3 regions. Used to evaluate toxicity (different from therapeutic effect). Five days after infection, the number of viable cells was measured using WST-8 cell propagation assay kit (Nakarai).
  • Results are shown in FIG. hCD133pr5-m-CRA has been shown to kill X01GBS cells, especially at MOI3 and MOI5.
  • Ad CA-EGFP and Ad. Such an effect was not confirmed for RSV-dE1.3.
  • Results are shown in FIG.
  • the left figure shows hCD133pr5-m-CRA, Ad. CMV-EGFP and Ad. It is the result of measuring the number of viable cells on the third day after infecting RSV-dE1.3 with MOI3 to human neuronal cancer stem cell X01GBS.
  • the right figure shows hCD133pr5-m-CRA, Ad. CMV-EGFP and Ad.
  • the results of measuring the number of viable cells on day 5 after infection of RSV-dE1.3 with human neuronal cancer stem cells X01GBD differentiated with MOI1 and 3 are shown.
  • the vertical axis indicates the ratio (%) of the number of viable cells when compared with the untreated group, and the horizontal axis indicates the virus infection condition (MOI).
  • hCD133pr5-m-CRA As shown in FIG. 18, only the hCD133pr5-m-CRA showed a significant cytotoxic effect in the X01GBS enriched fraction of human neuronal stem cells, whereas hCD133pr5-m-CRA is a fraction of the fraction enriched in differentiated cancer cells. Little effect on X01GBD was seen. In other words, hCD133pr5-m-CRA was found to exhibit specific virus growth and cell killing effects in cancer stem cells.
  • Example 13 Confirmation of tumorigenic ability of X01GBS
  • X01GBS of a fraction enriched with human neuronal cancer stem cells and X01GBD of a fraction enriched with differentiated cancer cells have the same characteristics.
  • the transplantation experiment of each fractionated cell to a NOD / SCID immunodeficient mouse was performed, and tumorigenicity was investigated.
  • 1 ⁇ 10 6 and 1 ⁇ 10 5 X01GBS cells were transplanted subcutaneously in 4 locations of NOD / SCID immunodeficient mice, and 1 ⁇ 10 6 differentiated X01GBD cells were subcutaneously transplanted in 3 locations of NOD / SCID immunodeficient mice.
  • the rate of formation of tumor nodules that could be visually recognized was evaluated.
  • mice transplanted with X01GBS cells tumor formation was observed in all mice when any number of cells were transplanted, whereas when X01GBD was transplanted, all cells transplanted with 10 times the amount of cells (1 ⁇ 10 6 ) were transplanted. Tumor formation was not observed in mice. This confirmed the tumor-forming ability of undifferentiated cells X01GBS.
  • the skin was incised and the tumor nodules formed subcutaneously were taken out and observed to confirm that the tumor was definitely formed (not a reaction such as inflammation).
  • hCD133pr5-m-CRA can be visualized because it proliferates in cancer stem cells and expresses the EGFP gene mounted downstream of the CMV promoter.
  • hCD133pr5-m-CRA can be used for, for example, evaluation of therapeutic effects because it enables confirmation of the location of cancer stem cells and measurement of their abundance.
  • hCD133pr5-m-CRA was shown to have a therapeutic effect since it has the ability to kill cancer stem cells as well as visualization of cancer stem cells.
  • the newly developed growth-regulated adenovirus vector CD133-reactive m-CRA targeting cancer stem cells can be infected and killed by neuronal cancer stem cell X01GBS.
  • a treatment visualization effect after virus infection was also obtained.
  • the adenovirus vector targeting the cancer stem cells of the present invention cures refractory cancer and promotes recurrence prevention (clinical practical application).
  • the viral vector of the present invention can be used for cancer treatment, prevention, metastasis suppression, and diagnosis targeting cancer stem cells, it can be used in the field of therapeutic agents and diagnostic agents.

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Abstract

【課題】癌幹細胞を標識及び傷害することができる新規でかつ効率的な癌幹細胞を標的とした癌の治療方法、予防方法、及び転移抑制方法、並びに癌幹細胞の傷害方法、識別方法を提供する。 【解決手段】　本発明は、癌幹細胞において特異的に発現し、かつ治療や診断に利用可能なプロモーターを備えるウイルスベクターを提供する。また、本発明は該ウイルスベクターを利用した癌の治療方法、予防方法、及び転移抑制方法、並びに癌幹細胞の傷害方法、識別方法を提供する。また、本発明は、該ベクターを有効成分として含有する癌幹細胞の標識剤及び殺傷剤、並びに癌の診断薬、治療薬及び転移抑制剤を提供する。

Description

癌幹細胞を標的とするウイルスベクター
　本発明は、癌幹細胞特異的プロモーターを備える組換アデノウイルスベクターに関する。特に、本発明は癌幹細胞で特異的に複製可能なアデノウイルスベクターに関する。また、本発明は、該ベクターを利用した癌幹細胞の同定方法、癌の診断方法及び治療方法に関する。本発明は、アデノウイルスベクターを有効成分として含有する癌の診断薬及び治療薬に関する。
　近年、癌幹細胞の存在が脳腫瘍（非特許文献１～４参照）、大腸癌（非特許文献５～９）など幾つかの癌で報告されている。癌幹細胞は、癌を構成する癌細胞のうち、幹細胞の性質を持ち、腫瘍を形成する能力がある少数の細胞と定義されている。癌幹細胞は以下の特徴を持っている：１）低分裂、低増殖率、２）高自己複製修復能、３）がん組織中で自己複製により癌幹細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出すもととなる、４）抗癌剤耐性と放射線療法耐性（非特許文献４、１０及び１１参照）。但し、幹細胞様（Ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ）の性質を持っていれば１）～４）の全ての特性を兼ね備えることは必ずしも必須ではなく、癌の悪性化の主原因という点が重要な点であり、よってＴｕｍｏｒ－Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ又はＣａｎｃｅｒ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ（癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞）と呼称されることもある（非特許文献１２参照）。
　癌治療の重要な標的として、癌幹細胞を治療ターゲットとすることが注目されている。癌幹細胞仮説は既に１９７０年代に提唱されており、近年、癌幹細胞の存在が癌の各治療法への耐性、再発、及び悪化と関連することも明らかにされている。しかし、癌幹細胞の本体はまた不明であり、癌幹細胞を標的とした生物学的解析、及び治療（特に癌幹細胞特異的な治療）についての研究はほとんど進んでいないのが現状である。
　固形癌、特に脳腫瘍においては、細胞表面に発現する癌幹細胞マーカーとしてＣＤ１３３が報告されている（非特許文献１～４参照）。ヒトＣＤ１３３は、１９９７年にＣＤ３４＋造血幹細胞に発現したエピトープとして確認された（非特許文献１３参照）。ＣＤ１３３はプロミニン１（ＰＲＯＭ１）とも呼ばれる５回膜貫通型の膜糖タンパク質で、多くのｓｐｌｉｃｅｄ　ｉｓｏｆｏｒｍが存在し、その発現は組織に依存する。ＣＤ１３３のリガンド及び下流のシグナルについてはまだ報告されておらず、機能に関しては未知であった。ＣＤ１３３は造血前駆細胞、血管内皮前駆細胞のマーカーであると同時に、神経系腫瘍（非特許文献１～４参照）、前立腺癌（非特許文献１４参照）、大腸癌（非特許文献５～９参照）、肺癌（非特許文献１５参照）、及び肝癌（非特許文献１６～１８参照）の癌幹細胞マーカーの一つであることが報告されている。
　ＣＤ１３３は少なくとも５種類のプロモーターにより組織依存的に発現することが報告されているが、ヒト結腸癌由来細胞株であるＣａｃｏ－２細胞、奇形癌細胞株であるＮＴ－２細胞を用いたレポータアッセイの結果ではプロモーター１及び２は活性があるものの、プロモーター３～５は特に活性は高くなかったことが示されている（非特許文献１９参照）。一方で、ヒト結腸癌由来細胞株であるＣａｃｏ－２細胞、及びヒト滑膜肉腫細胞株であるＦｕｊｉにおけるＣＤ１３３のプロモーター活性を解析した結果ではプロモーター１～４にはほとんど活性が無く、プロモーター５に活性があることが報告されている（非特許文献２０）。これらの報告で採用した方法ではいずれもｐＧＬ３エンハンサーベクターを用いていることから、ＣＤ１３３プロモーターの活性をエンハンサーにより増強しているがそれほど高いプロモーター活性は認められていない。特に、Ｃａｃｏ－２細胞はＣＤ１３３を強く発現することが知られているが、当該細胞とｐＧＬ３エンハンサーベクターを用いた場合でもＣＤ１３３のプロモーター活性（特にプロモーター１～４）はそれほど高くないことが知られていた。また、癌幹細胞におけるＣＤ１３３のプロモーター活性についてはこれまで知られていなかった。
　一般的に組織や幹細胞などの細胞に特異的なプロモーターは、ＲＳＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡプロモーター等の強制発現に利用されるプロモーターと比較するとその活性が非常に弱いことが知られている。このような組織・細胞特異的なプロモーターを利用して治療したり診断したりする場合、目的細胞でのプロモーター活性が低いことが原因でそのままでは治療や診断には用いることができないことが多く、プロモーター活性を高める工夫が必要であることが知られていた（特許文献１、非特許文献２１参照）。
　癌特異的に増殖可能なウイルスベクター（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ：ＣＲＡ）が知られている。このようなウイルスベクターとしては、アデノウイルスのＥ１領域内のＲｂ結合領域を欠損（Ｅ１ＡΔ２４）させ、又はｐ５３結合領域を欠損（Ｅ１ＢΔ５５）させたものや、Ｅ１遺伝子の内因性プロモーターを癌特異的に高発現するプロモーターと置換したものが知られている。例えば、後者の例としてウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性化受容体プロモーターを用いたアデノウイルスベクター（特許文献２参照）、ＰＥＧ３プロモーターを用いたアデノウイルスベクター（特許文献３参照）、サバイビンプロモーターを用いたアデノウイルスベクター（特許文献４参照）が報告されている。癌特異的に増殖可能なアデノウイルスベクターは、腫瘍溶解性を有する（非特許文献２２参照）ため、癌の治療に有効であると考えられている。また投与時に感染・遺伝子導入された癌細胞で増幅したウイルスが、周囲の癌細胞を壊してさらに周囲や遠隔部の癌細胞に感染して遺伝子導入していくため、ＣＲＡに遺伝子を搭載することにより遺伝子デリバリーのツールとしても有用であると考えている。更に、癌幹細胞を標的としたウイルスベクターによる治療も報告されている（非特許文献２３）。
国際公開第ＷＯ２０１０／０９７４１９号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００６／０７６４０８号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００５／１１５４７６号パンフレット 特許第４６２４１００号
Ｓｉｎｇｈ　ＳＫ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　２００４；４３２：３９６－４０１ Ｓｉｎｇｈ　ＳＫ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２００３；６３：５８２１－８ Ｙｕａｎ　Ｘ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　２００４；２３：９３９２－４００ Ｌｉｕ　Ｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　２００６；５：６７ Ｄａｌｅｒｂａ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　２００７；１０４：１０１５８－６３ Ｒｉｃｃｉ－Ｖｉｔｉａｎｉ　Ｌ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　２００７；４４５：１１１－５ Ｐｕｇｌｉｓｉ　ＭＡ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｕｒ　Ｒｅｖ　Ｍｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓｃｉ　２００９；１３　Ｓｕｐｐｌ　１：５５－６２ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ　ＣＡ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　２００７；４４５：１０６－１０ Ｉｅｔａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｎ　Ｓｕｒｇ　Ｏｎｃｏｌ　２００８；１５：６３８－４８ Ｂａｏ　ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　２００６；４４４：７５６－６０ Ｌｉ　Ｘ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ　２００８；１００：６７２－９ Ｎｅｕｚｉｌ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ．　３５５：　８５５－８５９，２００７ Ｂｏｎｎｅｔ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔ　Ｍｅｄ　１９９７；３：７３０－７ Ｃｏｌｌｉｎｓ　ＡＴ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２００５；６５：１０９４６－５１ Ａ　Ｅｒａｍｏ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００８）；１５：５０４－５１４ Ｗ　Ｓｏｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００８）６２（８）：１２１２－１２１８ Ａｔｓｕｓｈｉ　Ｓｕｅｔｓｕｇｕ，ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００６）３５１：８２０－８２４ Ｓｈｅｎｇｙｏｎｇ　Ｙｉｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ（２００７）１２０：１４４４－１４５０ Ｓｈｍｅｌｋｏｖ　ＳＶ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｌｏｏｄ　２００４；１０３：２０５５－６１ Ｋｏｕｉｃｈｉ　Ｔａｂｕ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃａｎｃｅｒ　２０１０；９：３９ Ｔｏｍｏｋｏｙｕｋｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２００６；１４（５）：６７３－６８３ Ｔｏｔｈ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．　２００３；１０：１５－２３ Ｔｉｍｏｔｈｙ　Ｐ　Ｃｒｉｐｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（１０）：１６７７－１６８２
　癌幹細胞を標的とした効率的な治療方法等は未だ報告されていない。また、抗体等を用いた癌幹細胞を特異的に同定する方法においては、細胞表面への抗体の接触が求められることから、癌組織内部に存在する癌幹細胞を標識することができず、癌組織内部についても同定可能なより効果的な標識方法が求められていた。
　よって、本発明は、新規でかつ効率的な癌幹細胞を標的とした癌の治療方法及び癌幹細胞の標識方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、癌幹細胞で特異的に活性が高く、治療目的や診断目的で利用可能なプロモーターについて鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことにＣａＣｏ－２細胞と比較してＣＤ１３３の発現が同程度か低いにもかかわらず、癌幹細胞ではＣＤ１３３のプロモーター活性が非常に強くそのままで十分治療及び診断目的に利用できることを見出した。また、本発明者らはＣＤ１３３プロモーターを増殖型アデノウイルスベクター（以下、「ＣＲＡ」という）に応用することにより、癌幹細胞特異的に増殖するベクターの作製及び検討を行った。その結果、ＣＤ１３３プロモーターをウイルスゲノムにおけるウイルスの増殖に必須のタンパク質（例えば、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）をコードする核酸に作動可能に連結させたＣＲＡ（以下、「ＣＤ１３３－ＣＲＡ」という。）が、癌幹細胞特異的に増殖することを見出した。また、本発明者らは、癌幹細胞特異的に増殖するベクターが当該癌幹細胞に感染し、当該癌幹細胞の内部で増殖することを見出した。
　本発明のベクターは、癌組織内に存在する癌幹細胞において特異的に増殖することから、同一ベクターに標識となる外来遺伝子を挿入することにより癌組織内における癌幹細胞を同定することに利用できる。更に、本発明のベクターは、癌幹細胞特異的に増殖するのみならず、最終的には癌幹細胞を破壊する能力を維持することから、癌幹細胞を標的とした治療に有用である。
　よって、本発明は、癌幹細胞において特異的に活性化するプロモーター及び当該プロモーターを有するウイルスベクターに関する。また、本発明は癌幹細胞において特異的に増殖可能なウイルスベクターに関する。更に本発明は、当該ベクターを利用した癌幹細胞の標識方法、及び癌の診断方法及び治療方法を提供するものである。また、本発明は、癌幹細胞において特異的に増殖可能なベクターを有効成分として含有する癌幹細胞の標識剤、並びに癌の診断薬、転移抑制薬、及び治療薬を提供する。具体的には、本発明は、癌幹細胞において特異的に増殖可能なベクターとしてＣＤ１３３－ＣＲＡを提供する。本発明において癌の予防方法、転移抑制方法及び治療方法は、癌発生の元となる癌幹細胞の増殖の抑制又は殺傷に基づくものである。
　具体的には、本発明は、以下の発明に関する：
（１）　所望の遺伝子に作動可能に連結させたＣＤ１３３プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に当該所望の遺伝子を発現可能なウイルスベクター。
（２）　前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、癌幹細胞特異的に増殖可能である（１）に記載のウイルスベクター。
（３）　腫瘍溶解性である（２）に記載のウイルスベクター。
（４）　アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである（２）又は（３）に記載のウイルスベクター。
（５）　アデノウイルスである（２）又は（３）に記載のウイルスベクター。
（６）　前記所望の遺伝子がアデノウイルスのＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子である、（５）に記載のアデノウイルスベクター。
（７）　Ｅ１Ａが、Ｒｂ結合領域が欠損したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）である、又は、Ｅ１Ｂが、ｐ５３結合領域が欠損したＥ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５）である、（６）に記載のアデノウイルスベクター。
（８）　更に、標識遺伝子、又は細胞毒性遺伝子を備える（２）～（７）のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
（９）　更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える（２）～（８）のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
（１０）　以下の（ａ）～（ｃ）から選択される１のアデノウイルスベクターである、（６）又は（７）に記載のアデノウイルスベクター：
（ａ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ａ１）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット
（ａ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたＥ１ＢΔ１９Ｋ遺伝子からなる転写ユニット
（ａ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｂ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｂ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｂ２）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット、
（ｂ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｃ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｃ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ３）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット。
（１１）　前記所望の遺伝子が標識遺伝子である（１）に記載のウイルスベクター。
（１２）　更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える（１１）に記載のウイルスベクター。
（１３）　更に、細胞毒性遺伝子を備える（１１）又は（１２）に記載のウイルスベクター。
（１４）　前記所望の遺伝子が、細胞毒性遺伝子である請求項１に記載のウイルスベクター。
（１５）　更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える（１４）に記載のウイルスベクター。
（１６）　更に、標識遺伝子を備える（１４）又は（１５）のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
（１７）　腫瘍溶解性ウイルスである（１１）～（１６）のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
（１８）　アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである（１１）～（１７）のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
（１９）　ＣＤ１３３プロモーターが、以下の（ｉ）～（ｉｖ）から選択されるいずれか１項に記載の核酸分子である、（１）～（１８）のいずれか１項に記載のウイルスベクター：
（ｉ）配列番号１～５のいずれか１つの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉ）配列番号１～５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉｉ）配列番号１～５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
（ｉｖ）配列番号１～５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１～５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子。
（２０）　（１）～（１９）のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌の治療薬、転移抑制剤、若しくは予防薬又は診断薬。
（２１）　（１）～（１９）のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌幹細胞の標識剤。
（２２）　更に、同時に、連続的に又は時間をおいて別々に投与される以下の（ｉ）～（ｉｉ）から選択される１以上の薬剤を含有する（２０）に記載の治療薬若しくは予防薬又は診断薬：
　（ｉ）抗ウイルス作用を低下させる薬剤、
　（ｉｉ）抗癌剤。
（２３）　（１）～（１９）のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌幹細胞の標識方法。
（２４）　（１）～（１９）のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の診断方法。
（２５）　ウイルスベクターが標識遺伝子を有する、（２３）又は（２４）に記載の方法。
（２６）　（１）～（２０）のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
（２７）　更に、前記ウイルスベクターを患者の癌幹細胞に感染させるステップを備える（２６）に記載の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
（２８）　ウイルスベクターが細胞毒性遺伝子を有する、（２６）又は（２７）に記載の方法。
（２９）　前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、前記ウイルスベクターが癌幹細胞特異的に増殖可能である（２３）～（２８）のいずれか１項に記載の方法。
　本発明で使用できるＣＤ１３３プロモーターとしては、ＣＤ１３３（ＡＣ１３３、ＰＲＯＭ１と呼ばれることもある）のプロモーターとして報告された配列を有する核酸分子であれば特に制限されない。例えば、マウス、ラット、及びヒトのＣＤ１３３が報告されている。限定されない例として、Ｓｈｍｅｌｋｏｖ　ＳＶ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｌｏｏｄ　２００４；１０３：２０５５－６１、並びにＧｅｎＢａｎｋ　アクセッション番号　ＡＹ２７５５２４、ＡＹ４３８６４１及びＡＹ４３８６４０に開示されたヒトＣＤ１３３プロモーター１～５を挙げることができる。本発明のプロモーターとしては、具体的には、ヒトＣＤ１３３プロモーター１（ｐｒ１；配列番号１）、プロモーター２（ｐｒ２；配列番号２）、プロモーター３（ｐｒ３；配列番号３）、プロモーター４（ｐｒ４；配列番号４）、及びプロモーター５（ｐｒ５；配列番号５）を用いることができる。また、他の動物種のＣＤ１３３プロモーター（例えばマウスのＰｒｏｍｉｎｉｎ－１のプロモーター１（配列番号６）、プロモーター２（配列番号７）、又はプロモーター３（配列番号８））（Ｋｅｍｐｅｒ　Ｋ，Ｔｏｌ　ＭＪＰＭ，Ｍｅｄｅｍａ　ＪＰ（２０１０）Ｍｏｕｓｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｓｐｌｉｃｅ　Ｖａｒｉａｎｔｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｍｉｎｉｎ－１．ＰｌｏＳ　ＯＮＥ　５（８）：ｅ１２３２５）を用いてもよい。
　また、「ＣＤ１３３プロモーター」は、上述のプロモーターに加え、配列番号１～７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％、９０％、９５％、又は９８％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子であってもよい。配列の相同性は、例えばＢＬＡＳＴを用いることにより決定することができる。更に、「ＣＤ１３３プロモーター」は、上述のプロモーターに加え、配列番号１～７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（２０１１）に記載された方法によってハイブリダイズすることを言う。より具体的には、ニトロセルロース膜上に固定したＤＮＡと、０．５Ｍ　ＮａＨＰＯ４、７％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液中、６５℃で反応させ、その後、０．１～０．５×ＳＳＣ（１５～３０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５～３ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％　ＳＤＳで６５～６８℃で数回洗浄することによりハイブリダイズすることを言う。「ＣＤ１３３プロモーター」は、配列番号１～７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１～７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子を含む。核酸が欠失、付加、挿入される場合には、その後に続く遺伝子の読み枠が変化しない数が欠失、付加又は挿入される。このような置換、欠失、付加、挿入の数としては、１～５０ヌクレオチド、１～２０ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、１～３ヌクレオチドである。また、置換、欠失、付加、挿入のうち、２種類以上の変異が含まれていてもよい。好ましくは、転写因子結合領域以外の位置において置換、欠失、付加、挿入される。転写因子結合領域は、例えば、ＴＦＳＥＡＲＣＨ及びＡｌｉｂａｂａ等の転写因子の結合部位予測プログラムを用いて調べることもできるし、Ｓｈｍｅｌｋｏｖ　ＳＶ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｌｏｏｄ　２００４；１０３：２０５５－６１の記載（図３等）から知ることができる。
　配列番号１～７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％、９０％、９５％、又は９８％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、配列番号１～７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、及び、配列番号１～７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１～７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子は、ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性を有することが望ましい。本明細書において、「ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性」とは、野生型のＣＤ１３３プロモーターの活性が高い条件下でプロモーター活性が高く、野生型のＣＤ１３３プロモーターの活性が低い条件下で同様にプロモーター活性が低いことを意味する。ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性とは、主には質的にＣＤ１３３と同等のプロモーター活性を有することを意味するが、ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性は、量的に野生型のＣＤ１３３と同程度かそれよりも強いことであってもよい。
　更に、本明細書において、「ＣＤ１３３プロモーター」の語は、ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性を維持する限り、前記ＣＤ１３３のプロモーターの断片も含む。ＣＤ１３３のプロモーターの断片はＣＤ１３３プロモーターの転写因子の結合部位の少なくとも１つを有し、好ましくは、ＣＤ１３３プロモーターの転写因子結合部位の全てを有する。転写因子結合領域は、上述の方法により決定することができる。例えば、本発明のＣＤ１３３プロモーターの断片は、ヒトＣＤ１３３プロモーター１（ｐｒ１；配列番号１）、プロモーター２（ｐｒ２；配列番号２）、プロモーター３（ｐｒ３；配列番号３）、プロモーター４（ｐｒ４；配列番号４）、及びプロモーター５（ｐｒ５；配列番号５）、並びにマウスＣＤ１３３プロモーター１（配列番号６）、プロモーター２（配列番号７）、プロモーター３（配列番号８）の断片であってもよい。
　本明細書において、ＣＤ１３３プロモーターがウイルスゲノムにおける所望の遺伝子に「作動可能に連結する」とは、ＣＤ１３３プロモーターが前記所望の遺伝子の上流に当該遺伝子の転写を調整することができるように位置することを意味する。
　本明細書において、「ウイルスベクター」は、外来性のＤＮＡ又はＲＮＡを遺伝子に組み込むことができるウイルスであって、対象動物（例えば、ヒト）に投与されても安全なウイルスであれば特に制限されない。本発明のウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスのいずれであってもよい。好ましくは、本発明のウイルスベクターは癌細胞（好ましくは、癌幹細胞）以外の細胞には感染しないか、当該細胞内では自己複製できないウイルスである。また、好ましくは、ウイルスベクターは、腫瘍溶解性を有するか遺伝子組み換えにより腫瘍溶解性を獲得可能なウイルスである。本発明のウイルスベクターを治療目的で使用する場合、好ましくは本発明のウイルスベクターは細胞溶解性を備える。ここで、「細胞溶解性」とは、ウイルスベクターが複製する条件を備える細胞（例えば、癌細胞、癌幹細胞）に感染した場合に、当該細胞を溶解して細胞外にウイルスを放出する能力を意味する。本発明のウイルスとして好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスである。
　本明細書において、「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍細胞を溶解する能力を有するウイルスのことである。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、ヒト癌細胞には毒性を示すが正常なヒト細胞には毒性を示さない。ウイルスの腫瘍特異性は、ウイルスの感染特性、増幅特性、細胞溶解特性のいずれの特性に基づいていてもよい。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、ヒト癌細胞には感染し毒性を示すが正常なヒト細胞には感染せず毒性を示さない動物ウイルス；ウイルス遺伝子のプロモーターが癌細胞のみで活性化する腫瘍特異的プロモーターに置換されているため、癌細胞内ではウイルスは複製するが正常細胞では複製しない変異型ウイルス；ウイルス複製に必須の細胞周期が回転しているという環境をもたらすために、細胞周期を抑制する遺伝子（Ｐ５３やＲｂなど）を不活化するウイルス遺伝子が欠損しているか変異が入っているため、細胞周期が異常更新して回転している癌細胞内ではこれら変異に関係なくウイルスは複製するが、正常細胞では細胞周期回転を誘導できないためウイルスは複製しない変異型動物ウイルス；細胞溶解に重要な遺伝子に変異が入っているため、癌細胞は溶解するが正常細胞は溶解しない変異型動物ウイルス；及び、ウイルスワクチンのように連続継代培養により弱毒化した動物ウイルスを含む。
　例えば、本発明のウイルスベクターとしては、ヘルペス単純ウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティス・ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、セネカ・ヴァレイ・ウイルスを挙げることができる（Ｔｉｍｏｔｈｙ　Ｐ　Ｃｒｉｐｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（１０）：１６７７－１６８２）。例えば、ミキソーマウイルスは癌細胞では複製し細胞溶解を起こすが、ヒトの正常細胞には感染しない。また、レオウイルスは自然から単離された状態で腫瘍溶解性があり、癌細胞及び癌幹細胞の両方に感染する。ベジキュラー・ストマタイティス・ウイルスは、通常の細胞では急性期の抗ウイルスインターフェロン応答により感染しないが、インターフェロン応答が解除されている癌細胞には感染する。ベジキュラー・ストマタイティス・ウイルスの腫瘍溶解性が高い変異株や組換株が得られている（Ｌｉｃｈｔｙ，ＢＤら，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：２１０－２１６）。
　本明細書において、「アデノウイルス」又は「アデノウイルスベクター」とは、アデノウイルス科マストアデノウイルス属に属する、哺乳動物に感染するウイルスを意味する。好ましくは、ヒトアデノウイルスである。ヒトアデノウイルスはＡ～Ｆの亜属とセロタイプが存在するが、本発明におけるアデノウイルスは特定の亜属及びセロタイプに限定されるものではない。例えば、アデノウイルスは、Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂに変異が入ったアデノウイルスでもよい。Ｅ１Ａタンパク質の変異としては、Ｒｂ結合領域の欠損（Ｅ１ＡΔ２４）を挙げることができる。また、Ｅ１Ｂタンパク質の変異としては、ｐ５３結合領域の欠損（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）を挙げることができる。
　本明細書において「所望の遺伝子」とは、癌幹細胞において特異的に発現させることにより利用可能な遺伝子であれば特に限定されない。例えば、本発明のウイルスベクターを治療目的で使用する場合、所望の遺伝子は、ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子、又は細胞毒性遺伝子とすることができる。また、本発明のウイルスベクターを診断又は同定目的で使用する場合、所望の遺伝子は標識遺伝子とすることができる。
　本明細書において、「ウイルスの増殖に必須のタンパク質」とは、ウイルスの増殖において役割を果たすタンパク質であれば特に限定されない。例えば、本発明のウイルスベクターとして、アデノウイルスを用いる場合、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５を挙げることができ、好ましくはＥ１Ａ及びＥ１Ｂである。ここで、ウイルスの増殖に必須のタンパク質は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。例えば、変異型のＥ１Ａタンパク質としては、Ｒｂ結合領域が欠損したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）を挙げることができる。また、変異型Ｅ１Ｂタンパク質としては、ｐ５３結合領域が欠損したＥ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）を挙げることができる。特に、本発明のベクターは、ＣＤ１３３プロモーターが活性化されている細胞内においてアデノウイルスの増殖が亢進されることから、本発明のアデノウイルスベクターは、ＣＤ１３３プロモーターと作動可能に連結したＥ１ＡΔ２４及び／又はＥ１ＢΔ５５Ｋを有することよりアデノウイルスの癌幹細胞内での増殖の特異性を高めることができる。
　また、例えば、本発明のウイルスベクターとしてヘルペス単純ウイルスを用いる場合、ウイルスの増殖に必須のタンパク質は、ＩＣＰ３４．５（ＨＳＶ－１　ＲＬ１遺伝子）、及びＩＣＰ６（ＵＬ３１遺伝子）を挙げることができる。
　「細胞毒性遺伝子」とは、細胞内で発現することにより当該細胞にアポトーシス若しくはネクローシスを誘導する物質をコードする遺伝子、発現することにより免疫細胞により貪食される遺伝子、又は細胞内で発現することにより細胞増殖を停止させる物質をコードする遺伝子のことである。細胞毒性遺伝子は、タンパク質をコードしていてもよいし、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡをコードしていてもよい。また、細胞毒性遺伝子は、コードする物質そのものが細胞の生存又は増殖を直接阻害するものであってもよいし、コードする物質が例えばプロドラッグと共に用いられて該プロドラッグを毒性化して細胞に障害を与えてもよい。あるいは、細胞毒性遺伝子は、細胞表面に提示されて細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫細胞や抗体の標的となって間接的に細胞を殺傷し又は増殖を阻害するものであってもよい。細胞毒性遺伝子としては、これに限定されるものではないが、ｍｄａ－５、ｍｄａ－７、ＢＡＸ、ＰＴＥＮ、可溶性ＦＧＦＲ、ｒａｓに対するｓｉＲＮＡ又はアンチセンス、ｍｄａ－９に対するｓｉＲＮＡ又はアンチセンス；ＨＳＶ－ｔｋ（ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ；ガンシクロビルを毒性化）、大腸菌シトシンデアミナーゼ（ＣＤ；５－フルオロシトシンを毒性化）等のプロドラッグを毒性化する遺伝子；ｐ５３、アデノウイルスＥ３－１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５由来）、アデノウイルスＥ３－１０．５Ｋ、アデノウイルスＥ４遺伝子、カスパーゼ等のアポトーシス促進遺伝子；ｐ２１、網膜芽腫遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９等）をコードする遺伝子、増殖停止特異的ホメオボックス（ＧＡＸ）遺伝子等の細胞増殖抑制性遺伝子；シュードモナス外毒素等の細胞毒性遺伝子；ＴＮＦ－α、ｐ５３、ＡＰＣ、ＤＰＣ－４、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＣＡ－２、ＷＴ－１、ＭＭＡＣ－１等の腫瘍抑制性遺伝子；ＣＥＡ、ｐ５３等の免疫システムに認識される抗原を細胞表面に提示させる抗原遺伝子；ＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０等のサイトカイン遺伝子；アンジオスタチン、ＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡ又はアンチセンス等の血管新生抑制遺伝子を挙げることができる。また、細胞毒性遺伝子は、放射線療法、化学療法又は免疫療法の反応性を高める遺伝子であってもよく、例えば、ＥＧＦ受容体（ゲフィチニブ等のＥＧＦＲ特異的チロシンキナーゼ阻害剤による治療効果を高める）、Ｈｅｒ－２受容体（乳癌患者におけるハーセプチンによる治療効果を高める）であってもよい。毒性遺伝子がプロドラッグを毒性化する物質の場合、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ガンシクロビル又はアシクロビルと組み合わせて使用）、シトシンデアミナーゼ遺伝子（５－フルオロシトシンと組み合わせて使用）、大腸菌由来ｕｐｐ遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｆｕｒ遺伝子（５－フルオロウラシルと組み合わせて使用）、及びチミジンキナーゼ遺伝子又はチミジンキナーゼとチミジル酸キナーゼの融合遺伝子（アジドチミジンと組み合わせて使用）を挙げることができる。
　本明細書において、「標識遺伝子」とは、当該遺伝子が導入された細胞を標識可能な物質をコードする遺伝子のことであり、癌幹細胞を標識可能な標識遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質、β－グルクロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。また、例えば、フェチリン遺伝子など、画像診断を可能とする標識遺伝子であってもよい。本明細書において、癌幹細胞を「標識する」とは、その利用目的に応じて、一時的に又は長期間、癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織の存在又はその位置を同定し、あるいは癌幹細胞を他の細胞や組織から識別することを意味する。また、本明細書において癌幹細胞の「同定する」とは、一時的又は長期的に癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織の存在又はその位置を特定することを意味し、「識別する」とは、一時的又は長期的に癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織を他の細胞や組織から区別することを意味する。よって、本明細書における標識は、癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織の存在又はその位置を特定し、あるいは、癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織を他の細胞や組織から区別することができれば特に制限されず、癌幹細胞以外の細胞が全く染色等されないことを要するものではない。例えば、癌組織内における癌幹細胞の存在を、本発明のベクターの癌組織への直接注入して染色することにより識別する場合、癌組織内の癌幹細胞でない癌細胞と比較して癌幹細胞が区別可能な程度に染色されていればよく、癌細胞又は他の細胞が（弱く）染色されていてもよい。
　本発明のウイルスベクターは、ＣＤ１３３プロモーターの下流に所望の遺伝子を作動可能に連結した転写ユニット（以下、「ＣＤ１３３転写ユニット」という）に加えて、癌細胞において特異的に活性が高められているプロモーター（以下、「癌特異的プロモーター」という）の下流に異なる又は同一の所望の遺伝子を作動可能に連結した転写ユニット（以下、「癌特異的転写ユニット」という）を有していてもよい。ＣＤ１３３プロモーター転写ユニットと癌特異的転写ユニットを組み合わせて備えることにより、ウイルスベクターの癌幹細胞に対する毒性の特異性高め、及び／又は一つのウイルスベクターに癌幹細胞に対する毒性と癌幹細胞を識別又は同定する機能の両方を持たせることができる。癌特異的プロモーターとしては、多くの癌に共通して活性が高められているプロモーターを用いてもよいし、標的の癌の種類に応じて当該癌において特異的に発現が高められているプロモーターを用いてもよい。また、癌特異的プロモーターは、癌幹細胞において活性が高められているプロモーターであってもよい。これに限定されるものではないが、癌特異的プロモーターとしては、ネスチンプロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２（Ｃｏｘ－２）プロモーター、複数医薬耐性（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｍｄｒ）タンパク質プロモーター、テロメラーゼプロモーター、前立腺特異的抗原遺伝子プロモーター、カリクレイン２遺伝子プロモーター、ヒトαフェトタンパク質遺伝子プロモーター、メラノーマ分化マーカーチロシナーゼプロモーター、チロシナーゼプロモーター、ｃ－ｅｒｂＢ－２遺伝子プロモーター、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子プロモーター、ガストリン放出ペプチド遺伝子プロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子プロモーター、ヘキソキナーゼＩＩ遺伝子プロモーター、Ｌ－プラスチン遺伝子プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター、ミッドカイン遺伝子プロモーター、ヒトムチン遺伝子ＭＵＣ１プロモーター、サバイビンプロモーター、オーロラキナーゼプロモーター、及びヒトムチン遺伝子ＭＵＣ４プロモーター等を挙げることができる。
　本発明のウイルスベクターは、更に所望の遺伝子を発現させるための追加の転写ユニット（以下、「追加転写ユニット」という）を有していてもよい。本発明のウイルスベクターが追加転写ユニットを有する場合、当該追加転写ユニットを制御するプロモーターは、真核細胞で活性のあるプロモーター（以下、「真核細胞プロモーター」という）であれば特に制限されない。追加転写ユニットにおけるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス前初期プロモーター）、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、ヒトエロンゲーションファクター１αプロモーター、ヒトユビキチンｃプロモーター、ＰＥＧ－３プロモーターを用いることができる。また、マウス乳癌ウイルスプロモーター（デキサメタゾンにより誘導可能）、テトラサイクリン反応性又はエクジソン誘導性プロモーター等の誘導可能なプロモーターを用いてもよい。また、前述の癌細胞特異的に活性のあるプロモーターを用いることもできる。また、追加転写ユニットを制御するプロモーターとして、ＣＤ１３３プロモーターを用いてもよい。
　本発明のベクターが癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有する場合、癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットは、ＣＤ１３３プロモーターがウイルスゲノムにおけるウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結した転写ユニットと共にアデノウイルスＥ１領域に挿入されていてもよいし、アデノウイルスの他の領域（例えば、Ｅ３領域）に挿入されてもよい。
　本発明のベクターが癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有する場合、所望の遺伝子としては、ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子、標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子を用いることができる。
　また、本発明のベクターは、多因子がん特異的増殖制御型組換えアデノウイルス系（ｍ－ＣＲＡ；特開２００５－０４６１０１号及び国際公開第ＷＯ２００５／０１２５３６号）であってもよい。
　例えば、本発明のアデノウイルスベクターの例として以下のアデノウイルスベクターを挙げることができる：
（ａ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ａ１）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット
（ａ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたＥ１ＢΔ１９Ｋ遺伝子からなる転写ユニット
（ａ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｂ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｂ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｂ２）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット、
（ｂ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｃ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｃ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ３）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット。
　ＣＤ１３３－ＣＲＡとは、ＣＤ１３３プロモーターをウイルスゲノムにおけるウイルスの増殖に必須のタンパク質（例えば、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）をコードする核酸に作動可能に連結させた増殖型アデノウイルスベクター（ＣＲＡ）のことであり、上述の（ａ）又は（ｂ）に記載のアデノウイルスベクターと同義である。
　また、本発明のウイルスベクターは、ウイルスのファイバーやヘキソンが修飾又は置換されることにより、癌幹細胞への感染特異性が高められていてもよい。例えば、癌幹細胞の表面タンパク質に対するリガンドを、ウイルスファイバーのＨＩループやヘキソンタンパク質等のキャプシド内に含んでいてもよい。
　本発明のベクターは、癌幹細胞特異的に標識し、又は傷害を与えることができるので、癌の診断、予防、治療及び癌の転移を阻害するための医薬組成物、あるいは癌幹細胞を標識、傷害及び殺傷するための医薬組成物として使用することができる。本発明のベクター又は該ベクターを含有する医薬組成物によって、診断、予防、治療又は転移の抑制が可能な癌としては、脳腫瘍、グリア芽腫、頭頚部癌、胃癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、膀胱がん、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、骨肉腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、子宮頸癌と、造血器や血液の悪性腫瘍（例えば、白血病、悪性リンパ腫等）を挙げることができる。好ましくは、癌幹細胞の存在が確認されている癌であり、例えば、脳腫瘍、グリア芽腫、頭頚部癌、胃癌、肺癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、大腸癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌（Ｓ．Ｂｏｍｋｅｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ（２０１０）１０３：４３９－４４５；Ｎａｔａｓｈａ　Ｙ．Ｆｒａｎｋら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１０）１２０：４１－５０）を挙げることができる。特に好ましくは、癌幹細胞においてＣＤ１３３の発現が確認されている癌であり、例えば、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、肝癌、大腸癌、メラノーマ、前立腺癌を挙げることができる（Ｔａｂｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃａｎｃｅｒ（２０１０）９：３９；阿部ら、細胞工学（２００８）２７（１０）１０３６－１０４１）。本発明のベクター又は該ベクターを含有する医薬組成物は、前記癌における癌幹細胞の同定剤、識別剤、標識剤、傷害剤又は殺傷剤としてもよい。
　本明細書において、癌幹細胞に「傷害を与える」とは、癌幹細胞がその機能を発揮できない状態にすることを意味し、具体的には、癌幹細胞が自己増殖及び／又は癌細胞への分化ができない状態にすることを指す。「癌幹細胞特異的に傷害を与える」とは、正常な細胞との比較において癌幹細胞に対してそのような傷害をより強く与えることを意味し、正常な細胞又は癌幹細胞以外の癌細胞への毒性が全くないことを意味するものではない。また、「傷害を与える」とは、癌幹細胞（転移性癌幹細胞を含む）をアポトーシス又はネクローシスにより破壊することの他、癌幹細胞が対象内の免疫システムによって破壊されること、並びに、癌幹細胞の増殖を阻害し、及び／又は分化を阻害することを含む。また、癌幹細胞への傷害は、癌幹細胞特異的に複製可能で細胞溶解性（又は腫瘍溶解性）を有する本発明のウイルスベクターが細胞内で複製後に細胞（特には癌幹細胞）を溶解することにより与えられてもよい。あるいは、癌幹細胞への障害は、細胞毒性遺伝子が細胞内で発現することにより当該細胞にアポトーシス若しくはネクローシスを誘導し、共に用いられるプロドラッグを毒性化し、又は細胞表面に提示されて免疫細胞又は抗体の標的となって与えられるものであってもよい。また、本明細書において、「傷害剤」とは、癌幹細胞にこのような傷害を与える薬剤を意味する。本発明は、本発明のウイルスベクターを有効成分として含有する癌幹細胞の傷害剤を含む。
　本明細書において、「癌幹細胞」とは、がん組織中で自己複製により癌幹細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出すもととなる細胞を意味する。少数の癌幹細胞が、分化により癌組織を形成する多数の癌細胞となることから、癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞と呼ばれることもある。
　本明細書において「癌幹細胞」とは、腫瘍内の細胞であって自己複製能力及び腫瘍を含む癌細胞の異種系列をもたらす能力を有する細胞（Ｃｌａｒｋｅ　ＭＦら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．（２００６）６６：９３３９－９３４４）を意味する。即ち、癌幹細胞は、自己と同一の性質を有する娘細胞を産生する能力と癌組織を形成する細胞（特に悪性腫瘍）への分化能の両方を有する。但し、これは幹細胞様（Ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ）の性質をある程度持っているという意味であり、正常の幹細胞のような厳密な幹細胞の性格を持つ必要はなく（その条件に限定されるものではなく）、むしろ癌の悪性化の主原因という点が重要である。少数の癌幹細胞が、分化により癌組織を形成する多数の癌細胞となることから、Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ又はＣａｎｃｅｒ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ（癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞）と呼ばれることもある。本発明における癌幹細胞は、これらの癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞をも含むものである（Ｎｅｕｚｉｌ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ．３５５；８５５－８５９，２００７）。例えば、癌幹細胞は、数個～数万個（好ましくは数十個～数千個）の細胞を免疫不全マウスに移植した場合に癌を形成することができる細胞であってもよい。また、本明細書における癌幹細胞がこれに限定されるものではないが、固形癌における癌幹細胞は、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＡＢＣＢ５等のマーカーを発現することが知られている。例えば、本発明の癌幹細胞は、脳腫瘍、グリア芽腫、頭頚部癌、胃癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、膀胱がん、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、骨肉腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、子宮頸癌等の固形癌及び肉腫、並びに造血器や血液の悪性腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病等の白血病、悪性リンパ腫）の癌幹細胞を含む。好ましくは、癌幹細胞は脳腫瘍幹細胞又はグリア芽腫幹細胞である。
　本発明のウイルスベクターは癌幹細胞に特異的に、所望の遺伝子を発現することができる。また、本発明のウイルスベクターを癌幹細胞特異的なウイルス増殖を誘導する増殖型ウイルスとすることによって、腫瘍（癌幹細胞）溶解性の治療効果を獲得できる。更に、本発明のウイルスベクターに標識遺伝子あるいは治療遺伝子を搭載することによって、ウイルス感染後に癌幹細胞を可視化あるいは治療効果を誘導あるいは増強することができる。よって、本発明の腫瘍溶解性ウイルスベクターに標識遺伝子あるいは治療遺伝子を搭載することによって、治療抵抗性の原因となる癌幹細胞を標的としてウイルスの腫瘍溶解性効果あるいはまた治療遺伝子にて傷害を与えると同時に、癌幹細胞の存在を可視化することができる。このことから、癌幹細胞の存在を指標とした癌治療効果の評価に利用できる他、癌幹細胞を外科的に切除する際の指標とすることができる。また本発明のウイルスベクター自身によって癌幹細胞を標的して治療することができる。これまで、癌幹細胞を特異的に同定したり、あるいは癌幹細胞を特異的に治療する技術は、ウイルスベクターに限らず存在しない。よって癌幹細胞を選択的に同定することができる本発明のウイルスベクターによって、癌幹細胞に対する効果的な治療薬、治療技術を、効率よく開発することができる。また本発明のウイルスベクターによって、癌患者の診断時あるいは治療前に、浸潤・転移能が高い悪性化原因の癌幹細胞を癌患者の体内で描出・可視化・同定でき、癌幹細胞の割合や存在場所がわかれば、画期的な癌患者の予後判定法、治療部位や治療法に関する画期的な選択法などができることになる。また癌幹細胞は、抗癌剤や放射線という既存の治療法には抵抗性であり、治療後の癌幹細胞の残存が癌の再発に繋がり、患者さんの予後不良と致死性を決定する主要原因と考えられている。よって本発明のウイルスベクターを用い、治療後に癌患者さんの体内の癌幹細胞を体内で同定・可視化・検出することによって、癌の患者さんの治療法の有効性に関する画期的な評価技術、また治療後の癌再発へ対応できる画期的な診断・治療法の確立、また治療後の癌幹細胞の残存のモニターができることになる。よって癌幹細胞を選択的に診断・治療できる本発明のウイルスベクターは癌の悪性化の診断と悪性化の原因細胞を治療可能とすることで、上記のような癌患者への全く新しい診断、治療技術が多数産出し、癌の診断、治療が大きく向上することになる。よって、本発明のウイルスベクターは、様々な癌幹細胞を標的とした診断と治療に利用することができ、臨床における治療難治性の癌の根治と、再発予防を実現することができる。
ヒト神経癌幹細胞（ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：以下同じ）Ｘ０１ＧＢＳにおけるネスチン、ビメンチン、ＣＤ１３３、及びβＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）の発現を細胞免疫染色により確認した結果を示す。図中の各写真において、左上はＤＡＰＩを示す青色色素を示し、右上はそれぞれネスチン、ビメンチン、ＣＤ１３３、及びβＩＩＩチューブリンの存在を示す緑色色素を示す。また、左下は顕微鏡観察写真を示し、右下は他の３枚の写真の全てを合成した写真を示す。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ、大腸癌細胞（Ｃａｃｏ－２）及びヒトｉＰＳ細胞におけるＣＤ１３３の発現をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す。「１２０ｋＤａ　ＣＤ１３３」はＣＤ１３３を示し、「４２ｋＤａ　β－ａｃｔｉｎ」はコントロールとしてのβ－アクチンを示す。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３（＋）細胞含量をフローサイトメトリにより測定した結果を示す。左図はフローサイトメトリに流す全細胞集団を示し、同図において、横軸（ＦＳ　Ｌｉｎ）は、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳ）で細胞の大きさを反映し、縦軸（ＳＳ　Ｌｉｎ）は側方散乱光（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）で細胞の形態や核、顆粒などの細胞内部構造を反映する。また、左図中の数値（％）は、Ｒ１で示す楕円中細胞集団に含まれる細胞数の全細胞数に対する割合を示す。また、右図はＲ１細胞集団にＣＤ１３３（＋）細胞含量を示す。同図において、横軸（ＰＥ　Ｌｏｇ）はＣＤ１３３（＋）細胞含量を示し、縦軸（ＦＩＴＣ　Ｌｏｇ）は、特に意味なし。右図中の数値（ＣＤ１３３（＋）　２０．１８％）は、Ｒ１細胞集団にＣＤ１３３（＋）細胞の割合を示す。 ＣＤ１３３陰性の細胞である正常細胞のＷＩ－３８（線維芽細胞）、ＣＤ１３３発現の陽性細胞株であるＣａｃｏ－２（大腸がん）、Ｘ０１ＧＢＳ、Ｘ０１ＧＢＤにおけるＣＤ１３３の発現をフローサイトメトリで測定した結果を示す。上段は、陰性コントロールとしてＩｇＧ抗体を用いた結果を示し、下段は抗ＣＤ１３３抗体を用いた結果を示す。縦軸（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ）は、側方散乱光によるデータを示し、細胞の形態や核、顆粒などの細胞内部構造を反映するものである。図中の数値（％）は、四角で囲まれた細胞集団に含まれる細胞数の全細胞数に対する割合を示す。 ＣＤ１３３陰性の細胞である正常細胞のＷＩ－３８（線維芽細胞）、ＣＤ１３３発現の陽性細胞株であるＣａｃｏ－２（大腸がん）、Ｘ０１ＧＢＳ、Ｘ０１ＧＢＤにおけるＣＤ１３３のｍＲＮＡの発現レベルを示す。写真は、ＲＴ－ＰＣＲ法を行った後に電気泳動の結果を示し、グラフは定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。「ＨＰＲＴ」は、コントロール遺伝子として用いたハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴを示す。グラフの縦軸は、ＨＰＲＴのｍＲＮＡの発現量に対するＣＤ１３３のｍＲＮＡの発現量の比を示す。 ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞からセルソーターにてＣＤ１３３発現の陽性細胞と陰性細胞を分取し、それぞれの分画においてＣＤ１３３　ｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ－ＰＣＲならびに定量的ＲＴ－ＰＣＲ法で調べた結果を示す。左上図は、セルソーターでの分取したそれぞれの分画を示す。「ＣＤ１３３（－）」はＣＤ１３３発現陰性細胞の分画を示し、「ＣＤ１３３（＋）」はＣＤ１３３発現陽性細胞の分画を示す。左下写真は、ＲＴ－ＰＣＲ法を行った後に電気泳動の結果を示す。右下のグラフは定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。「ＨＰＲＴ」は、コントロール遺伝子として用いたハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴを示す。グラフの縦軸は、ＨＰＲＴのｍＲＮＡの発現量に対するＣＤ１３３のｍＲＮＡの発現量の比を示す。 ＣＤ１３３の各プロモーターの活性を測定するためのレポータアッセイ用アデノウイルスベクターの概略図と名称を示す。ＣＤ１３３の各プロモーターの下流にＬａｃＺを連結し、Ｅ１領域欠損する（ΔＥ１）アデノウイルスベクター（ｐＡｄＨＭ４）に組み込んだ。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおける、ＣＤ１３３の各プロモーターの活性を示す。図中の縦軸はβ－ガラクトシダーゼ活性（プロモータ活性）を示し、横軸は、ＬａｃＺの発現に使用した各プロモーターを組み込んだアデノウイルスの種類を示す。横軸において、ｐｒ１、ｐｒ２、ｐｒ３、ｐｒ４及びｐｒ５は、それぞれ順にＣＤ１３３プロモーター１、プロモーター２、プロモーター３、プロモーター４、及びプロモーター５を示す（以下の図において同じ）。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞における、ＣＤ１３３の各プロモーターの活性を示す。図中の縦軸はβ－ガラクトシダーゼ活性（プロモータ活性）を示し、横軸は、ＬａｃＺの発現に使用した各プロモーターを組み込んだアデノウイルスの種類を示す。 ヒト神経癌幹細胞から分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞における、ＣＤ１３３の各プロモーターの活性を示す。図中の縦軸はβ－ガラクトシダーゼ活性（プロモータ活性）を示し、横軸は、ＬａｃＺの発現に使用した各プロモーターを組み込んだアデノウイルスの種類を示す。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３の各プロモーターと対照用非特異的ＲＳＶプロモーターの活性とＣＤ１３３（＋）細胞との相関をフローサイトメトリで確認した結果を示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３各プロモーター活性）を、縦軸はＰＥで標識した抗ＣＤ１３３抗体でＣＤ１３３（＋）細胞を示す。図６に示す数値（％）は、右上の領域Ｒ７内に相関する細胞の割合を示す。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞におけるＣＤ１３３の各プロモーター活性と対照用非特異的ＲＳＶプロモーターの活性を比較した図を示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３プロモータ活性）を、縦軸は側方散乱光（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）を示す。図１２に示す数値（％）は、四角で囲った領域に含まれるＬａｃＺ発現細胞の全細胞数に対する割合を示す。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞、及びヒト神経癌幹細胞から分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞におけるＣＤ１３３の各プロモーター活性を比較した図を示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３プロモータ活性）を、縦軸は側方散乱光（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）を示す。図１３に示す数値（％）は、四角で囲った領域に含まれるＬａｃＺ発現細胞の全細胞数に対する割合を示す。 癌幹細胞に特異的増殖型アデノウイルスベクター（ＣＤ１３３反応性ｍ－ＣＲＡ「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡ」で表記、以下においても同じ）の構造を示す。図中、ＣＤ１３３ｐｒ１～５は、ＣＤ１３３プロモーター１～５のいずれかを意味する。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞におけるアデノウイルスの導入効率を示す。非増殖型アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰ）をＸ０１ＧＢＳ細胞へ感染してから２４時間後の写真で示す。図中、上から順に「ＥＧＦＰ」はＥＧＦＰの発現を検出した写真を、「Ｐｈａｓｅ」は顕微鏡写真を、「Ｍｅｒｇｅ」は先の２種類の写真を合成した写真でＥＧＦＰの細胞内発現を示す（図１６においても同じ）。また、図の上部の数値は観察した倍率を示す。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞におけるｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡの細胞殺傷効果を細胞形態で示す。Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡをＭＯＩ　１でＸ０１ＧＢＳに感染させ、感染から１，２，３，４及び５日後に２００倍の顕微鏡で観察した結果を示す。図の上部の数値（Ｄａｙ）は感染からの経過日数を示す。図の下部の「ＣＰＥ」は細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）を示し、「Ｓｐｈｅｒｅ」は細胞塊形成の程度を意味する。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞におけるＡｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡの細胞殺傷効果を生存細胞数で示すグラフである。Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡ、Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ－ｄＥ１．３をＭＯＩ　１、３、及び１０でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染後、５日目に生存細胞数を測定した結果を示す。図中縦軸は非処理群と比較した場合の生細胞数の割合（％）を示し、横軸はウイルスの感染条件（ＭＯＩ）を示す。 ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞、及びヒト神経癌幹細胞から分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤにおけるＡｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡの細胞殺傷効果を生存細胞数で示すグラフである。図中縦軸は非処理群と比較した場合の生細胞数の割合（％）を示し、横軸はウイルスの感染条件（ＭＯＩ）を示す。 １×１０６と１×１０５のＸ０１ＧＢＳ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの４ヶ所に、１×１０６の分化Ｘ０１ＧＢＤ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの３ヶ所に皮下移植し、１０週間後、肉眼的に認識できる腫瘍結節の形成の割合を評価した結果を示す。グラフの縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、横軸は移植した細胞の種類及び数を示す。３種類の写真は、いずれも１×１０６細胞（右）と１×１０５細胞（左）のＸ０１ＧＢＳ細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの結果を示す。下の写真は各マウスから採取された腫瘍塊である。
１．ウイルスベクターの製造方法
　本発明のウイルスベクターは、当業者に知られたウイルスベクター作製方法を適宜採用して作製することができる。例えば、ウイルスベクターは、ほぼ完全なウイルスゲノムのコピーを有するウイルスバックボーンプラスミドとＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドを遺伝子組み換えの技術を利用して組替えることにより作製することができる。遺伝子組み換えは、相同的組換、制限酵素サイト（好ましくは、ｌ－ＣｅｕＩ及びＰｌ－ＳｃｅＩ等の特殊制限酵素サイト）を利用した組換、又は、リコンビネーション反応（例えば、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ）を利用した組換により行うこともできる。
　本発明のウイルスベクターがアデノウイルスの場合、例えば、ほぼ完全なアデノウイルスゲノムのコピーを有しＥ１遺伝子が欠損したアデノウイルスバックボーンプラスミドと、ＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドを組替えることにより作製することができる。
　本発明のウイルスベクターが癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有する場合、ウイルスベクターは、ＣＤ１３３転写ユニット、癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有する単一のシャトルベクタープラスミドをウイルスバックボーンプラスミドと組み替えて作製してもよいし、ＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドと、それとは異なる癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドを用いて、それぞれのプラスミドを個別に又は同時にアデノウイルスバックボーンプラスミドと組み替えて作製してもよい。癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットをアデノウイルスのＥ１領域以外（Ｅ３領域等）に組み込む場合には、ＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドとは異なるシャトルベクタープラスミドを用いて、ＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドとは別に組換を行うことが望ましい。
　本発明のウイルスベクターが、ウイルスのファイバーやヘキソンの修飾又は置換を有する場合、当該修飾及び置換されたベクターは当業者周知の方法により作製することができる。例えば、本発明のウイルスベクターがアデノウイルスの場合、そのようなウイルスベクターは、Ｋｒａｓｎｙｋｈら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ（２０００）６０（２４）：６７８４－６７８７、Ｒｕｉｇｏｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　（１９９０）２１５：５８９－５９６、Ｋｒａｓｎｙｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：６８３９－６８４６、Ｈｅｎｒｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８（６）：５２３９－６８４６、国際公開公報ＷＯ００／６７５７６号記載の方法に準じて作製ことができる。
２．治療方法
　本発明は、本発明のウイルスベクターのうち、ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結させたＣＤ１３３プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に増殖可能なウイルスベクター及び／又は細胞毒性遺伝子を有するウイルスベクター（以下、総称して「治療用ウイルスベクター」という）を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法、予防方法、転移抑制方法に関する。本発明の治療用ウイルスベクターは、癌細胞を生み出す元である癌幹細胞に傷害を与えることができるため、そのようなウイルスベクターを癌患者又は癌になることが予想される患者に投与することにより癌を治療し又は予防し、あるいは癌の転移を抑制することができる。よって、本発明の一例は、治療用ウイルスベクターを、それを必要とする患者に投与し、それにより該患者の癌幹細胞内において該ウイルスベクターを増殖させ、又は細胞毒性遺伝子を発現させることを含む、癌の治療方法、予防方法、又は転移抑制方法である。
　本発明の治療用ウイルスベクターの投与は、使用するベクター、治療対象疾患、年齢、性別、投与経路、使用する目的等により適宜選択することができ、例えば、１×１０５～１×１０１２ｐｆｕの力価で投与することができる。投与方法は、腫瘍内点滴、血管内（静脈内、動脈内）注射、髄膜内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、（肺などの）経粘膜投与、経鼻投与等を使用することができる。例えば、本発明のベクターは、１×１０１０ｐｆｕを２日おきに１回、５日間投与することができる
　また、本発明の治療用ウイルスベクターは、他の抗癌治療と併用して用いられてもよい。本発明の治療用ウイルスベクターは、癌幹細胞を標的として治療するものであるから、このような抗癌治療は、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的治療等を含む。併用治療する場合の抗癌剤としては、シスプラチン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、パクリタキセル等のタキソール誘導体を挙げることができる。また、本発明の治療用ウイルスベクターがプロドラッグを毒性化する細胞毒性遺伝子を有する場合、適切なプロドラッグが併用される。このようなプロドラッグとしては、ガンシクロビル又はアシクロビル（チミジンキナーゼ遺伝子）、５－フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼ遺伝子）、５－フルオロウラシル（大腸菌由来ｕｐｐ遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｆｕｒ遺伝子）、及びアジドチミジン（チミジンキナーゼ遺伝子又はチミジンキナーゼとチミジル酸キナーゼの融合遺伝子）を挙げることができる（括弧内は組み合わせる細胞毒性遺伝子を示す）。
　また、治療用ウイルスベクターは、癌幹細胞に特異的に傷害を与えることができることから、癌幹細胞の傷害方法に用いることができる。よって、本発明は、治療用ウイルスベクターをそれを必要とする対象に投与するステップを含む、癌幹細胞の傷害方法を含む。本発明の一例は、治療用ウイルスベクターを、それを必要とする患者に投与し、それにより該患者の癌幹細胞内において該ウイルスベクターを増殖させ、又は細胞毒性遺伝子を発現させることを含む、癌幹細胞の傷害方法である。本発明の癌幹細胞の傷害方法は、具体的には前述の本発明の癌の治療方法及び／又は予防方法に準じて行うことができる。
３．診断・標識方法
　本発明は、本発明のウイルスベクターのうち、標識遺伝子を有するウイルスベクター（以下、「標識用ウイルスベクター」という）を、対象患者に投与することを含む、癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法に関する。本発明の標識用ウイルスベクターは、癌幹細胞で特異的に標識遺伝子を発現することができるため、そのようなウイルスベクターを癌患者又は癌になることが予想される患者に投与することにより癌幹細胞を同定又は識別することができる。癌幹細胞は癌細胞内に数～十数％存在することが知られていることから、癌幹細胞の存在を指標に癌を診断することができる。また、癌の切除等の場面においては癌の増殖の根源である癌幹細胞の除去が重要であると考えられており、癌幹細胞を特異的に標識して可視化することにより、癌幹細胞の確実な切除を助けて手術の成功率を高め、手術後の患者の予後を改善することができる。具体的には、本発明は、標識用ウイルスベクターを対象患者に投与し、標識遺伝子の発現産物を検出することを含む、癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法に関する。標識遺伝子の発現産物の検出は、使用する標識遺伝子の種類と使用目的により適宜選択することができ、例えば、外科手術中に色素又は蛍光色素を目視で確認してもよいし、画像診断により検出してもよい。また、癌の診断又は癌幹細胞の標識は、癌幹細胞を可視化することにより行ってもよいし、視覚以外の手段で検知可能な手法により行ってもよい。例えば、本発明の癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法は、標識用ウイルスベクターを、対象患者に投与することを含む、癌幹細胞の可視化方法であってもよい。
　本発明の標識用ウイルスベクターの投与、上述の本発明の癌の治療方法又は予防方法に準じて本発明のウイルスベクターを患者に投与することにより行うことができる。
４．医薬組成物
　本発明のウイルスベクターを有効成分として包含する医薬組成物（癌の治療薬、予防薬、転移抑制剤及び診断薬、並びに癌幹細胞の標識剤、及び傷害剤を含む）は、有効成分に加えて１以上の薬学的に許容可能な担体を含む組成物であってもよい。医薬組成物が溶液製剤の場合、このような薬学的に許容可能な担体は、滅菌可能でヒトに投与可能な一般的に知られている担体であればよく、限定されない例として、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。また、必要に応じて、医薬組成物は、更に抗酸化剤、緩衝剤及び静菌剤を含有していてもよい。また、医薬組成物は用事調整可能な注射用製剤としてもよい。この場合、医薬組成物（医薬組成物キット）は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を含んでいてもよい。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
（実施例１）ヒト神経癌幹細胞の癌幹細胞性と癌幹細胞表面マーカーＣＤ１３３発現の細胞免疫染色による確認
（１）細胞
　ヒト神経癌幹細胞として、Ｓｏｅｄａ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２００８；２８３；１０９５８－６６に記載されたヒト神経癌幹細胞（ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）を使用した。Ｘ０１ＧＢＳ細胞は、Ｘ０１ＧＢ細胞の癌幹細胞分画であり、未分化条件の培地とＳｐｈｅｒｅ培養法で癌幹細胞分画を「濃縮」した細胞群である。よって、以下、特に明記が無い限りにおいて、ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳとはＳｏｅｄａ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２００８；２８３；１０９５８－６６に記載されたヒト神経癌幹細胞（ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）（又はＸ０１ＧＢ－ＣＳＣ）を意味するものとする。培養条件：神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳをＢ－２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅ　ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－２（２０　ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，　ＭＮ）とｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＥＧＦ　（２０　ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）添加した１０％ＦＢＳとｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ，　ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｉｎｓｕｌｆａｔｅを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ－１２（Ｄ６４２１，Ｓｉｇｍａ）培地で５％ＣＯ２、３７℃で培養した。以下の実験に特に説明しなければ同じ条件でＸ０１ＧＢＳ細胞培養を行った。
　また、Ｘ０１ＧＢＤ細胞は、このヒト神経癌幹細胞（神経膠芽腫由来の癌幹細胞；ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）が濃縮された細胞群であるＸ０１ＧＢＳ細胞から、以下の方法で樹立された、「分化したヒト神経癌細胞」（分化した神経膠芽腫（ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ））が濃縮した細胞群として作製した。Ｘ０１ＧＢＤ細胞は、Ｉｎａｇａｋｉ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２００７；３６１；５８６－５９２に記載された樹立法及び分化した状態での維持培養法に従って樹立、維持された。つまり、Ｘ０１ＧＢＳ細胞を１０％のウシ胎児血清Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍを加えてＦＧＦ－２を除いたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ－１２培地中、通常の接着可能な培養ディッシュで接着単層培養し、これを長期（５０継代以上繰り返し）培養し維持することで、癌幹細胞分画が劇的に減少し、ほとんどが分化した癌細胞分画に置き換わった細胞群であるＸ０１ＧＢＤ細胞を得た。Ｘ０１ＧＢＤ細胞の特性は、Ｉｎａｇａｋｉ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２００７；３６１；５８６－５９２に記載された通りであった。
　つまり同一患者の同一組織であるヒト脳神経悪性腫瘍から、悪性度の強い未分化性が高い癌幹細胞分画のＸ０１ＧＢＳ細胞群と、分化した悪性度の低いＸ０１ＧＢＤ細胞群が樹立された。
（２）第一抗体
　第一抗体として、以下の抗体を使用した：
　　抗ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）ウサギポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）
　　抗ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）ウサギポリクローナル抗体（Ａｂ４５９３９、Ａｂｃａｍ，ＵＫ）
　　抗ＣＤ１３３ウサギポリクローナル抗体（Ａｂ１９８９８，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）
　　抗βＩＩＩチューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）（Ｔｕｊ１）マウスモノクローナル抗体ＴＵ２０（Ａｂ７７５１、Ａｂｃａｍ，ＵＫ）
（３）第二抗体
　第二抗体として、波長４８８ｎｍの緑色蛍光色素と結合した以下の抗体を使用した：
　　Ａｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　４８８（ｍｏｕｓｅ／ｒａｂｂｉｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
（４）細胞免疫染色
　ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳの細胞塊（ｓｐｈｅｒｅｓ）を、０．１％ゼラチンコートしたカバーガラス上に播種し、Ｂ－２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅ　ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－２（２０　ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，　ＭＮ）とｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＥＧＦ　（２０　ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）添加した１０％ＦＢＳとｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ，　ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｉｎｓｕｌｆａｔｅを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ－１２（Ｄ６４２１，Ｓｉｇｍａ）培地に５％ＣＯ２、３７℃で４時間培養した。その後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４００μＬの４％ＰＦＡ／ＰＢＳで、室温に１５分間固定した。固定後の細胞を１×ＰＢＳで洗浄後、第一抗体を細胞に添加し室温に１時間で反応をさせた。反応後１×ＰＢＳで洗浄し、第二抗体を上述の希釈率となるように添加し、室温で３０分間反応後、ＰＢＳで洗浄した。
（５）ＤＡＰＩ染色
　室温で細胞免疫染色を行った細胞にＭｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ（Ｈ－１５００，　Ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．，　ＵＳＡ）１滴を添加すると、細胞核をすぐ染色された。
　染色後の細胞蛍光画像は、ＦＩＴＣ又はＤＡＰＩの検出に適したフィルターセットを有する倒立蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ　Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ａ１（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）上で撮影された。観察した結果を図１に示す。図は、右上図は各癌幹細胞と神経細胞マーカー（名前は図上に記載）の蛋白発現をＦＩＴＣで検出している写真であり、左上図は核をＤＡＰＩで検出した写真であり、左下図は位相差像（蛍光なし）の写真であり、右下はこれら三種類の写真を重ね合わせた（ｍｅｒｇｅ）像の写真である。ネスチンはｃｌａｓｓ　ＶＩの中間径フィラメントであり、中脳の神経系幹細胞に強く発現していることが報告されている神経系幹細胞の重要なマーカーの１つである。ビメンチンは発生時のみに発現することが報告されている間葉系細胞のマーカーである。βＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）は神経細胞の骨組みを作るタンパク質であることが報告されており、主に神経細胞で遺伝子発現が見られることから、神経細胞のマーカーとして用いられる。また、ＤＡＰＩは、核を青色に染色する蛍光色素である。図１に示す通り、本実験に用いたヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳは、神経幹細胞マーカーであるネスチン、及びビメンチンに対する抗体で染色される一方、成熟した神経細胞マーカーであるβＩＩＩチューブリンに対する抗体では染色されないことから、幹細胞性を有することが示された。また、本実験に用いたヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳは、ＣＤ１３３に対する抗体で染色されることから、ＣＤ１３３を発現していることが確認された。
（実施例２）ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳの癌幹細胞表面マーカーＣＤ１３３発現のウエスタンブロッティングによる確認。
（１）細胞
　ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ、陽性コントロールとして大腸癌細胞（Ｃａｃｏ－２）及びヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７，理化学研究所より購入）を使用した。
（２）抗体
　第一抗体として、抗ＣＤ１３３ウサギポリクローナル抗体（Ａｂ１９８９８，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）（希釈率１：１０００）を使用し、第二抗体として、ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体ＩｇＧ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）（希釈率１：２０００）を使用した。
（３）ウエスタンブロッティング
　培養した細胞を含む１０ｃｍディッシュの培養液を捨てて、ＰＢＳで洗浄後、たんぱく質保護剤０．５ｍＭ　ＰＭＳＦとＰｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（直前に加える）含む可溶化ＲＩＰＡバッファー（０．５％　ＮＰ４０，０．１％　ＳＤＳ，０．５％　Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌと５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））を１ｍＬ加え細胞を溶解させた。細胞可溶化溶液と等量の２×サンプルバッファー（４％　ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０６％　β－メルカプトエタノール、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．１％　ブロモフェノブルー）を加え、９５℃で５分煮沸した。１０％ポリアクリルアミドゲル（１９６－１２９２１、Ｗａｋｏ）にサンプルを２０μｇアプライして、電気泳動を行った。メンブレンを転写装置から取り除き、ブロッキングバッファー（５％　ｎｏｎ－ｆａｔ　ｄｒｙ　ｍｉｌｋ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）に浸して、室温で１時間振とうしてブロッキングした。ブロッキングバッファーを除去後、ブロッキングバッファーで１：１０００に希釈した一次抗体反応液を加え、メンブレンを室温で１時間振とうで反応させた。その後、一次抗体液を除去し、ウォッシュバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて、メンブレンを振とうしながら、室温で１５分間、３回洗浄した。ウォッシュバッファーを除去し、２０００倍に希釈した二次抗体反応液を加え、メンブレンを振とうしながら、室温で１時間反応させた。二次抗体反応液を除去して、ウォッシュバッファーを添加し、メンブレンを振とうしながら、室温で１５分間３回洗浄した。ウォッシュバッファーを除去後、０．１２５ｍＬ／ｃｍ２の化学発光反応液Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ　Ｏｎｅ（０５０２７－２０，Ｗａｋｏ）をメンブレンに加えて１分間反応させてから、露光してタンパク質の発現を検出した。
　結果を図２に示す。ウエスタンブロッティングにより、陽性コントロールであるＣａｃｏ－２細胞とヒトｉＰＳ細胞においてＣＤ１３３の発現が認められた。また、本実験において用いたＸ０１ＧＢＳ細胞についてもＣＤ１３３の発現がウエスタンブロッティングにより確認された。
（実施例３）フローサイトメトリ（ＦＣＭ）による、ＣＤ１３３（＋）細胞数の確認
（１）ＦＣＭ（１回目）
ＦＣＭ解析は使用する抗体の製造者Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社の添付のプロトコールに従って行った。ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳを使用際にＣＤ１３３（＋）細胞含量を確認した。
　図中、楕円で囲んだ範囲に含まれる細胞を全細胞として解析を行った。
（２）ＦＣＭ（２回目）
　一回目と同様にＦＡＣＳを行った。抗体として、マウス抗ヒトＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３）－ＰＥ、及び、マウスＩｇＧ－ＰＥ（共にＭｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用した。ＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ　ＩＩ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて検出した。
　複数行った実験のうち代表的な結果を図３に示す。図中、横軸（ＰＥ　Ｌｏｇ）はＣＤ１３３（＋）細胞を対数値で示し、縦軸（ＦＩＴＣ　Ｌｏｇ）は特に意味がない。フローサイトメトリによる解析の結果、ＣＤ１３３（＋）細胞がＸ０１ＧＢＳの全細胞数に対する割合は約１０～２０．１８％であった。このことから、ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳの約１０～２０％がＣＤ１３３を細胞表面に発現していることが示された。
（実施例４）フローサイトメトリによるＸ０１ＧＢＳ細胞、Ｘ０１ＧＢＤ細胞におけるＣＤ１３３発現解析
　ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞と、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞において、ＣＤ１３３発現の陽性細胞株であるＣａｃｏ－２細胞（大腸がん）とＣＤ１３３陰性の細胞である正常細胞のＷＩ－３８細胞（線維芽細胞）とともに、同時にフローサイトメトリを行った。
　複数行った実験のうち代表的な結果を図４に示す。この上段のグラフは、抗体の特性を評価するための実験の陰性コントロールとしてＩｇＧ抗体を用いたものであり、下段のグラフが抗ＣＤ１３３抗体を用いて行ったフローサイトメトリの結果である。４．２％がＣＤ１３３陽性を示すＸ０１ＧＢＳ細胞に比べ、Ｘ０１ＧＢＤ細胞では僅か０．５％がＣＤ１３３陽性に過ぎないことから、Ｘ０１ＧＢＳ細胞でＣＤ１３３細胞陽性細胞が濃縮されていることが明確となった。またＸ０１ＧＢＳ細胞でのＣＤ１３３陽性細胞の割合が図３と若干違うのは、実験の条件（フローサイトメーターでの対象の細胞間での蛍光補正のやり方、縦軸の違い／図４ではｓｉｄｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを設定、等）と細胞状態の実験毎の若干の違い等によるものであると考えられた。
　（実施例５）Ｘ０１ＧＢＳ細胞、Ｘ０１ＧＢＤ細胞におけるＣＤ１３３　ｍＲＮＡ発現解析
　ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞、及び正常細胞であるＷＩ－３８細胞におけるＣＤ１３３のｍＲＮＡの発現レベルを、ＲＴ－ＰＣＲ法後の電気泳動、ならびに定量的ＲＴ－ＰＣＲ法で調べた。ハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴを、ＲＴ－ＰＣＲのコントロール遺伝子として用いた。
　図５に実験結果を示す。ＲＴ－ＰＣＲによる電気泳動写真で、陽性コントロール細胞のＣａｃｏ－２細胞と同様に、Ｘ０１ＧＢＳ細胞で著明なＣＤ１３３　ｍＲＮＡの発現がみられるのとは対称的に、正常細胞のＷＩ－３８細胞ならびにＸ０１ＧＢＤ細胞では発現は検出できなかった。さらに、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、Ｘ０１ＧＢＳ細胞では高レベルのＣＤ１３３　ｍＲＮＡ発現がみられるのに対し、Ｘ０１ＧＢＤ細胞でのＣＤ１３３　ｍＲＮＡ発現レベルは極めて低いレベルであり、統計的有為差（Ｐ＜０．０００５）が確認できた。
　（実施例６）Ｘ０１ＧＢＳ細胞、Ｘ０１ＧＢＤ細胞におけるＣＤ１３３　ｍＲＮＡ発現解析
　さらにヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞をセルソーターにてＣＤ１３３発現の陽性細胞と陰性細胞に分けて分取し、それぞれの分画において、同様にＣＤ１３３　ｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ－ＰＣＲならびに定量的ＲＴ－ＰＣＲ法で調べた。
　図６に代表的な結果を示す。左上図は、セルソーターでの分取したそれぞれの分画を示している。左下図はＲＴ－ＰＣＲ、右下図は定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果である。分取されたＣＤ１３３陽性細胞を分取した分画で、ＣＤ１３３陰性細胞を分取した分画より、統計的有為差（Ｐ＜０．００５）を持ってＣＤ１３３　ｍＲＮＡが高発現していることが確認できた。
（実施例７）ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３プロモーター活性測定（β－ｇａｌアッセイ）
（１）ＣＤ１３３プロモーター活性解析用のアデノウイルスベクターの構築
　ヒトＣＤ１３３については、５種類のプロモーターが知られており、それぞれ、プロモーター１（ｐｒ１；配列番号１）、プロモーター２（ｐｒ２；配列番号２）、プロモーター３（ｐｒ３；配列番号３）、プロモーター４（ｐｒ４；配列番号４）、及びプロモーター５（ｐｒ５；配列番号５）と呼ばれている（Ｓｅｒｇｅｙ　Ｖ．Ｓｈｍｅｌｋｏｖら，ＢＬＯＯＤ，１５　ＭＡＲＣＨ　２００４，Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．６）。ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおける各プロモーター活性を測定するため、図７に示すように、５つのヒトＣＤ１３３プロモーターの下流にＬａｃＺを連結して、Ｅ１領域欠損する非増殖型アデノウイルスベクターに組み込み、レポータアッセイ用アデノウイルスベクターを構築した。以下、ｐｒ１の下流にＬａｃＺを連結したものをアデノウイルスベクターに組み込んだベクターを「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ１－ＬａｃＺ」といい、同様にｐｒ２～ｐｒ５の下流にＬａｃＺを連結したものをアデノウイルスベクターのΔＥ１に組み込んだベクターを、それぞれ「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ２－ＬａｃＺ」、「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ３－ＬａｃＺ」、「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ４－ＬａｃＺ」、「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ＬａｃＺ」という。また、これらのベクターを総称して「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ１－５－ＬａｃＺ」という。
　ベクターの構築方法はＣｈｅｎ　ＳＨ，　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ　９２　（７）：２５７７－２５８１記載の方法に参考して構築した。
（２）ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３プロモーター活性測定
　神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞の培養条件が実施例１の（１）と同じ。ウイルスの感染方法は感染する予定の細胞を１．５ｍｌチューブに集めて、一回遠心してから、上清を除いて、ウイルス入りの培養液で細胞ｐｐｔに加え、１時間、３７℃でウイルス感染を行った。感染途中、１５分毎にｔａｐｐｉｎｇかｐｉｐｅｔｔｉｎｇを行って、ウイルスと細胞の接触回数を増やし感染効率を上げるようにした。
　上述の通り構築したレポータアッセイ用アデノウイルスベクター（Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ１－５－ＬａｃＺ）を細胞１個に対するウイルスの数ＭＯＩ　（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｒｃｔｉｏｎ）数で感染を行った。ＭＯＩ　３０でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染させた。感染二日後にＢｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、製造者添付のプロトコールに従って、ヒトＣＤ１３３の各プロモーターの活性を測定した。
　結果を図８に示す。β－ｇａｌアッセイによりプロモーター活性を解析した結果、ヒトＣＤ１３３の発現を制御する５つのプロモーターのうち、プロモーター１、２、４、５は活性が高く、その中でもプロモーター５がヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおいて最も高い転写活性を有することが示された。
（実施例８）
　さらに、ＣＤ１３３プロモーターの特性をより詳細に調べるため、ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞と、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞において、同様のＣＤ１３３プロモーターアッセイの実験を行った。各グループはＮ＝３で行った。陽性コントロールとしてＲＳＶプロモーターを、陰性コントロールとしてはプロモーターの挿入されていないアデノウイルス（ΔＰｒ）、ならびにアデノウイルスを加えていない細胞（ＮＣ）を用いた。活性の感度を上げて詳細に比較できるように、アデノウイルスの感染方法やβ－ｇａｌａ　ａｃｔｉｖｉｔｙの活性測定の感度が上昇できるような各実験ステップでの小さな工夫を除いては、基本的な実験方法は実施例７と同一であった。
　実験結果の平均値と標準誤差を図９（Ｘ０１ＧＢＳ細胞）と図１０（Ｘ０１ＧＢＤ細胞）に示した。図９に示した様に、ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞では、全てのプロモーターで様々な活性がみられたが、図８の傾向と同様に、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　５で最も活性が強く、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　１，　２，　４の活性強度がその次であり、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　３の活性は低かった。一方、図１０に示した様に、分化した癌細胞分画のＸ０１ＧＢＤ細胞においてはＰｒｏｍｏｔｅｒ　５で僅かに活性がみられるものの、その他のＰｒｏｍｏｔｅｒ　１，２，３，４の活性は検出感度（カットオフ値）以下であった。またＰｒｏｍｏｔｅｒ　５の活性も、図９で示したＸ０１ＧＢＳ細胞での値と比べると桁違いに低くほぼ検出限界であり、またコントロールのＲＳＶプロモーターとの比較においても、ＣＤ１３３プロモーターは癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞で特異的な活性がみられることが明らかとなった。
（実施例９）ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３プロモーター活性測定（フローサイトメトリより）
　ＣＤ１３３プロモーター活性解析用のアデノウイルスベクターは、実施例４と同様の方法により構築し、ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに導入した。感染二日後にフローサイトメトリにより、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ　ｌａｃＺ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，　Ｉｎｃ．）を用いて、製造者添付のプロトコールに従いＬａｃＺの発現を検出することで、ＣＤ１３３プロモーターの活性を測定した。また、抗ＣＤ１３３抗体（マウス抗ヒトＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社））を用いてＣＤ１３３（＋）細胞を標識して、測定した。
　ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３の各プロモーター活性と細胞表面のＣＤ１３３の発現量との相関を図１１に示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３プロモータ活性）を、縦軸はＰＥで標識した抗ＣＤ１３３抗体（細胞表面のＣＤ１３３の発現量）を示す。図１１に示す数値（％）は、右上の領域Ｒ７内に分布する細胞の割合を示す。図１１に示される通り、ＣＤ１３３の各プロモーターの活性は、ＣＤ１３３の発現量と相関性があることが明らかとなった。これに対し、コントロールとして恒常的（ユビキタス）強発現を示すプロモーターとしては代表的なＲＳＶプロモーターを用いて同様の実験をおこなったところ、内因性のＣＤ１３３の発現と相関することなしに、つまりＣＤ１３３非特異的にＲＳＶプロモーターの活性が見られた。よって、ＣＤ１３３プロモーター１－５は、内因性のＣＤ１３３の発現に相関して、つまりＣＤ１３３発現特異的に活性化するということが分かった。また、図１２にＸ０１ＧＢＳ細胞におけるＣＤ１３３の各プロモーター活性を比較した図を示す。図１２において、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３プロモーター活性）を、縦軸は側方散乱光（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）を示す。図１２に示す数値（％）は、四角で囲った領域Ｒ６内に分布する細胞の割合を示す。これらの結果から、ＣＤ１３３プロモーターの中でも、特にプロモーター２とプロモーター５が高い活性を示した。
（実施例１０）
　さらにヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のＸ０１ＧＢＳと、分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤにおいて、ＣＤ１３３の各プロモーター活性をフローサイトメトリで確認した。
　結果を図１３に示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３各プロモーター活性）を、縦軸（ＳＳ　Ｌｉｎ）は側方散乱光（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）で細胞の形態や核、顆粒などの細胞内部構造を反映する。図１３に示す数値（％）は、ＣＤ１３３の各プロモーター活性（ＬａｃＺ陽性の割合）を示している。このように、ＣＤ１３３のＰｒｏｍｏｔｅｒ　１から５のいずれにおいても、ＣＤ１３３プロモーター活性を示す細胞の割合が癌幹細胞濃縮分画のＸ０１ＧＢＳの方がＸ０１ＧＢＤよりも多かった。またＸ０１ＧＢＳでＣＤ１３３の各プロモーターで活性を示す細胞の割合は、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　５が最多で、次にＰｒｏｍｏｔｅｒ　１，２，４がほぼ同程度（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　２がその中でも少し強い）で多く、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　３の活性を示す細胞は一番割合が少なかった。この傾向は、図８、図９に示した各プロモーターの活性の強さとよく相関していた。
（実施例１１）癌幹細胞特異的増殖型アデノウイルスベクターの構築
（１）癌幹細胞特異的増殖型アデノウイルスベクターの構築
　国際公開第ＷＯ２００５／０１２５３６号パンフレット記載の方法に準じて、図１４に示すように５つのＣＤ１３３プロモーターをアデノウイルスの増殖に必須な初期遺伝子であるＥ１Ａ領域の前に組み込むことにより、ＣＤ１３３発現腫瘍に特異的に殺傷することのできる癌幹細胞特異的な増殖制御型アデノウイルスベクター（ＣＤ１３３反応性ｍ－ＣＲＡ）を構築した。以下、ＣＤ１３３プロモーター１を組み込んだＣＤ１３３反応性ｍ－ＣＲＡを「ｈＣＤ１３３ｐｒ１－ｍ－ＣＲＡ」という。プロモーター２～５についても同様に命名する。また、５種類のＣＤ１３３プロモーターを組み込んだＣＤ１３３反応性ｍ－ＣＲＡを総称して「ｈＣＤ１３３ｐｒ１－５－ｍ－ＣＲＡ」という。
（２）アデノウイルスベクターのヒト神経癌幹細胞への導入効率測定
　神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞の培養条件は実施例１の（１）と同じとした。またウイルスの感染方法は実施例４の（２）と同様に行った。
　ベクターの構築方法はＣｈｅｎ　ＳＨ，　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ　９２　（７）：２５７７－２５８１記載の方法に参考して構築した。
　上述の通り構築した非増殖型アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰ）を用いて、ＭＯＩ　３０でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染させた。感染から２４時間後にＡｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰのヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳへの導入効率を測定した。具体的には、Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰは、ＣＡプロモーターの下流にＥＧＦＰ蛍光たんぱく質遺伝子が導入している。ことから、Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰの感染によりＥＧＦＰの発現が確認できた。
　非増殖型アデノウイルスベクターのヒト神経癌幹細胞への導入効率を測定した結果を図１５に示す。感染の２４時間後では、ほとんどのＸ０１ＧＢＳ細胞においてＥＧＦＰの発現が確認されたことから、アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰ）が効率よく神経癌幹細胞に導入されることが確認された。
（３）ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡによるＸ０１ＧＢＳ細胞殺傷効果の測定
　神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞の培養条件が実施例１の（１）と同じとした。ウイルスの感染方法は実施例４の（２）と同様に行った。
　上述の通り構築したｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡをＭＯＩ　３でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染させた。感染から１，２，３，４及び５日後にｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡを導入したヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳを顕微鏡で観察した。
　図１６に示す通り、ＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡは、Ｘ０１ＧＢＳ細胞を殺傷できることが明らかとなった。アデノウイルスＡｄ．ＲＳＶ－ｄＥ１．３、Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰを感染させた場合（結果は非図示）と比較して、感染２日後において、ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡはＸ０１ＧＢＳ細胞によりＣＰＥを引き起こさせ、癌幹細胞の細胞塊（Ｓｐｈｅｒｅ）構造を破壊していることが確認された。また、感染５日後においては、ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡを感染させた細胞はほとんど死んでいる状態となった。このことから、ＣＤ１３３ｐｒ５－ｍＣＲＡはヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞を殺傷する能力があることが示された。
（４）ウイルス感染後Ｘ０１ＧＢＳ細胞の生存細胞数測定（ＷＳＴ　ａｓｓａｙ）
　神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞の培養条件が実施例１の（１）と同じ。ウイルスの感染方法は実施例４の（２）と同じ。
　上述の通り構築したｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡ、並びにネガティブコントロールとして、Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ－ｄＥ１．３をＭＯＩ　１、３、及び１０でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染させた。非増殖型アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＲＳＶ－ｄＥ１．３）はＲＳＶプロモーターをＥ１とＥ３領域欠損する非増殖型アデノウイルスベクターに組み込んだベクターで、アデノウイルスの感染実験にウイルスの感染によるウイルス自身の毒性（治療効果と違い）を評価するため使う。感染から５日後にＷＳＴ－８　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｎａｋａｒａｉ社）を用いて、生存細胞数を測定した。
　結果を図１７に示す。ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡは、特にＭＯＩ３及びＭＯＩ５において、Ｘ０１ＧＢＳ細胞を殺傷することが示された。一方、Ａｄ．ＣＡ－ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ－ｄＥ１．３にはこのような効果は確認されなかった。
（実施例１２）Ｘ０１ＧＢＳ及びＸ０１ＧＢＤに対するｈＣＤ１３３ｐｒ－ｍ－ＣＲＡの細胞障害活性
　さらにｈＣＤ１３３ｐｒ－ｍ－ＣＲＡの殺傷治療効果が、癌幹細胞特異的であることを示すため、同様の実験をヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のＸ０１ＧＢＳだけでなく、分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤでも行い、比較した。
　結果を図１８に示す。左図はｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡ、Ａｄ．ＣＭＶ－ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ－ｄＥ１．３をＭＯＩ３でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染後、３日目に生存細胞数を測定した結果である。右図はｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡ、Ａｄ．ＣＭＶ－ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ－ｄＥ１．３をＭＯＩ１と３で分化したヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＤに感染後、５日目に生存細胞数を測定した結果を示している。図中縦軸は非処理群と比較した場合の生細胞数の割合（％）を示し、横軸はウイルスの感染条件（ＭＯＩ）を示す。図１８のように、ヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のＸ０１ＧＢＳではｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡのみが有意な細胞障害効果を示した一方、ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡは分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤに対する効果はほとんどみられなかった。つまりｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡは、癌幹細胞で特異的なウイルス増殖と細胞殺傷効果を示すことがわかった。
（実施例１３）Ｘ０１ＧＢＳの腫瘍形成能の確認
　またヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のＸ０１ＧＢＳと、分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤが、その通りの特性を持つことを確証するため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスへのそれぞれの分画細胞の移植実験を行い、腫瘍形成能を調べた。１×１０６と１×１０５のＸ０１ＧＢＳ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの４ヶ所に、１×１０６の分化Ｘ０１ＧＢＤ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの３ヶ所に皮下移植した。その１０週間後、肉眼的に認識できる腫瘍結節の形成の割合を評価した。
　結果を、図１９に示す。Ｘ０１ＧＢＳ細胞を移植したマウスでは、いずれの細胞数を移植した場合でも全てのマウスに腫瘍形成がみられた一方、Ｘ０１ＧＢＤを移植した場合は１０倍多い細胞量（１×１０６）を移植した全マウスでも腫瘍形成が認められなかった。これにより未分化細胞Ｘ０１ＧＢＳの腫瘍形成能が確認された。またマウスは安楽死後に皮膚切開して皮下に形成された腫瘍結節を取り出し観察することで、間違いなく腫瘍が形成されていること（炎症などの反応ではないこと）も確認した。
　以上の結果から、ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡは、癌幹細胞で増殖し、ＣＭＶプロモーターの下流に搭載したＥＧＦＰ遺伝子を発現していることから、癌幹細胞を可視化することができることが明らかとなった。これによりｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡは、癌幹細胞の存在位置の確認や存在量を測定することを可能とすることから、例えば治療効果の評価に利用できる。また、ｈＣＤ１３３ｐｒ５－ｍ－ＣＲＡは、癌幹細胞の可視化のみならず癌幹細胞を殺傷する能力を有することから、治療効果をも有することが示された。
　以上の結果から、新たに開発した癌幹細胞を標的する増殖制御型アデノウイルスベクターＣＤ１３３反応性ｍ－ＣＲＡは神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染し、殺傷できることが示された。また、増殖制御型アデノウイルスベクターＣＤ１３３反応性ｍ－ＣＲＡにＥＧＦＰ遺伝子を搭載することによって、ウイルス感染後の治療可視化効果も得た。本発明の癌幹細胞を標的するアデノウイルスベクターは難治性の癌を根治し再発予防（臨床実用化）を現実に進めるものである。
　本発明のウイルスベクターは、癌幹細胞を標的とした癌の治療、予防、転移抑制、及び診断に用いることができることから、治療薬、診断薬の分野で利用可能である。

Claims (27)

  1. 所望の遺伝子に作動可能に連結させたＣＤ１３３プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に当該所望の遺伝子を発現可能なウイルスベクター。
  2. 前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、癌幹細胞特異的に増殖可能である、請求項１に記載のウイルスベクター。
  3. 腫瘍溶解性である、請求項２に記載のウイルスベクター。
  4. アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項２又は請求項３に記載のウイルスベクター。
  5. アデノウイルスである、請求項２又は請求項３に記載のウイルスベクター。
  6. 前記所望の遺伝子がアデノウイルスのＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子である、請求項５に記載のアデノウイルスベクター。
  7. Ｅ１Ａが、Ｒｂ結合領域が欠損したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）である、又は、Ｅ１Ｂが、ｐ５３結合領域が欠損したＥ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）である、請求項６に記載のアデノウイルスベクター。
  8. 更に、標識遺伝子、又は細胞毒性遺伝子を備える、請求項２～請求項７のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
  9. 更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項２～請求項８のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
  10. 以下の（ａ）～（ｃ）から選択される１のアデノウイルスベクターである、請求項６又は請求項７に記載のアデノウイルスベクター：
    （ａ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
    （ａ１）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット
    （ａ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたＥ１ＢΔ１９Ｋ遺伝子からなる転写ユニット
    （ａ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
    （ｂ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
    （ｂ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
    （ｂ２）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット、
    （ｂ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
    （ｃ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
    （ｃ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
    （ｃ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、
    （ｃ３）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット。
  11. 前記所望の遺伝子が標識遺伝子である、請求項１に記載のウイルスベクター。
  12. 更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項１１に記載のウイルスベクター。
  13. 更に、細胞毒性遺伝子を備える、請求項１１又は請求項１２に記載のウイルスベクター。
  14. 前記所望の遺伝子が、細胞毒性遺伝子である請求項１に記載のウイルスベクター。
  15. 更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項１４に記載のウイルスベクター。
  16. 更に、標識遺伝子を備える、請求項１４又は請求項１５のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
  17. 腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１１～請求項１６のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
  18. アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項１１～請求項１７のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
  19. ＣＤ１３３プロモーターが、以下の（ｉ）～（ｉｖ）から選択されるいずれか１項に記載の核酸分子である、請求項１～請求項１８のいずれか１項に記載のウイルスベクター：
    （ｉ）配列番号１～５のいずれか１つの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子、
    （ｉｉ）配列番号１～５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、
    （ｉｉｉ）配列番号１～５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
    （ｉｖ）配列番号１～５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１～５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子。
  20. ＣＤ１３３プロモーターが、ＣＤ１３３のプロモータ５である、請求項１～請求項１９のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
  21. 請求項１～請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌の治療薬、転移抑制剤、若しくは予防薬又は診断薬。
  22. 請求項１～請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌幹細胞の標識剤。
  23. 更に、同時に、連続的に又は時間をおいて別々に投与される以下の（ｉ）～（ｉｉ）から選択される１以上の薬剤を含有する、請求項２１に記載の治療薬若しくは予防薬又は診断薬：
    　（ｉ）抗ウイルス作用を低下させる薬剤、
    　（ｉｉ）抗癌剤。
  24. 請求項１～請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌幹細胞の標識方法。
  25. 請求項１～請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の診断方法。
  26. 請求項１～請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
  27. 更に、前記ウイルスベクターを患者の癌幹細胞に感染させるステップを備える、請求項２６に記載の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
     
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