CN111500632B - 表达st13和trail的溶瘤腺病毒构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒的构建方法，包括如下步骤：(1)构建pXC2‑CEA质粒；(2)构建pSD55‑CEA‑ST13‑IETD‑TRAIL质粒；(3)利用Pme I内切酶线性化pSD55‑CEA‑ST13‑IETD‑TRAIL质粒并将其转化至含Adeasy‑1腺病毒骨架系统的BJ5183大肠杆菌中同源重组，产生由CEA启动子控制E1A区同时缺失E1B 55 KDa基因的腺病毒质粒；(4)通过脂质体转染步骤(3)所得的重组腺病毒质粒至HEK293细胞，得到溶瘤腺病毒CD55‑ST13‑TRAIL。其能用于治疗消化道恶性肿瘤疾病。

Description

表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒构建及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体涉及表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒及其构建和应用。
背景技术
胰腺导管腺癌是所有癌症中最致命的恶性肿瘤之一，5年内患者的总体生存率低于5％。手术切除和放化疗法等多模式治疗仍是目前临床上广泛用于胰腺导管腺癌治疗的主要手段，但大多胰腺导管腺癌具有隐匿性和侵袭转移性，使患者预后不佳且复发性较高。因此，研发安全高效的治疗方法以期改善胰腺导管腺癌患者的生存期，将成为本领域技术人员亟待解决的问题。
溶瘤病毒疗法作为一种新型癌症治疗策略，在肿瘤治疗方面取得一些令人鼓舞的成果，目前已有一些溶瘤病毒正在进行I期和II期临床试验。近年来，溶瘤腺病毒已成为溶瘤病毒疗法中一种有效的抗肿瘤药物，因其在恶性肿瘤中具有选择性复制能力，能靶向裂解肿瘤细胞，而对正常细胞不会引起明显的杀伤作用。作为最具特征性的基因治疗载体，腺病毒载体可通过基因修饰表现出选择性的肿瘤趋向性。腺病毒在肿瘤治疗中相对稳定，安全性较好且与人类肿瘤的发生无直接关系，容易将外源基因直接传递至靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白，发挥相应作用。
应用肿瘤特异性启动子控制腺病毒治疗基因的表达，同时通过腺病毒增殖实现治疗基因在肿瘤的靶向性，而在正常细胞中不表达，从而确保溶瘤病毒疗法的安全性和有效性。近年研究表明，CEA与胰腺导管腺癌关系密切。Manen等通过收集胰腺导管腺癌病例，观察患者CEA和CA199血清学变化，发现CEA和CA199分别诊断胰腺导管腺癌的特异度分别达到了83.3％和73.6％；以及两者作为晚期胰腺导管腺癌的独立预测因子时，CEA比值为4.21，而CA199比值为2.58；由此，相比于CA199，CEA被认为可能是用于诊断胰腺导管腺癌更为特异的标志物。因此，利用CEA作为胰腺导管腺癌的特异性启动子调控基因表达，对于实现基因在胰腺导管腺癌中表达具有重要意义。
2001年，刘新垣院士首次提出了癌症靶向基因病毒治疗(Cancer targeted gene-virus therapy,CTGVT)策略，在溶瘤腺病毒的DNA上插入抑癌基因，利用溶瘤腺病毒的复制性实现了抑癌基因在癌症治疗中的稳定表达。TRAIL属于TNF超家族，可以激活肿瘤细胞的外在凋亡途径，同时保留其周围的正常细胞。TRAIL作为配体通过与跨膜死亡受体结合而诱导细胞凋亡或坏死，从而促进死亡信号的形成和诱导Caspase途径的激活，导致肿瘤细胞发生凋亡性死亡。然而，研究人员发现某些恶性肿瘤细胞对TRAIL单一疗法会产生耐药性。因此，必须寻找有效的治疗方法与TRAIL结合以改善靶向治疗疗效。
最近针对癌症的靶向双基因病毒治疗再次成为有前景的抗肿瘤治疗策略。因此，将双重治疗基因的选择性重组对于实现癌症靶向基因病毒治疗至关重要。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒的构建方法及其应用。本发明能用于解决现有的用于治疗胰腺导管腺癌的药物疗效欠佳的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建pXC2-CEA质粒(携带CEA启动子的pXC2-CEA质粒)；
(2)构建pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒；
(3)利用Pme I内切酶线性化pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒并将其转化至含Adeasy-1腺病毒骨架系统的BJ5183大肠杆菌中同源重组，产生由CEA启动子控制E1A区同时缺失E1B 55KDa基因的腺病毒质粒；
(4)通过脂质体转染步骤(3)所得的重组腺病毒质粒(为鉴定正确的重组腺病毒质粒)至HEK293细胞，得到溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL。
作为本发明的表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒的构建方法的改进，包括如下步骤：
(1)构建pXC2-CEA质粒：
将CEA质粒插入到Xho I和SnaB I双酶切的pXC2质粒中，并取代pXC2上E1A区的野生型启动子，得到携带CEA启动子的pXC2-CEA质粒；
CEA引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
(2)构建pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒：
首先利用Xho I和Xba I分别对pXC2-CEA和pSD55进行双酶切，并将双酶切后的两个大小片段相连，得到pSD55-CEA；
通过PCR获得目的基因，插入目的基因至pCA13载体上Hind III和EcoR V位点，得到pCA13-TRAIL-IETD-ST13；
然后用Bgl II分别酶切pSD55-CEA和pCA13-TRAIL-IETD-ST13，连接经酶切后的两个大小片段，得到pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒；
ST13和TRAIL的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
(3)腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL的构建：
利用Pme I酶切线性化pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒并将其转化至含Adeasy-1腺病毒骨架系统的BJ5183大肠杆菌中进行同源重组，产生由CEA启动子控制E1A区同时缺失E1B 55KDa基因的腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL；
(4)溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的构建：
利用Mlu I酶切鉴定腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL是否正确；将鉴定正确的腺病毒质粒用Pac I酶切线性化后转染至HEK293细胞中，待细胞基本病变，得到溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL。
作为本发明的表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒的构建方法的进一步改进，溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的鉴定：对构建的溶瘤腺病毒进行Western blot鉴定，检测腺病毒感染肿瘤细胞是否表达治疗基因ST13和TRAIL，最终得到鉴定正确的新型溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL。
在本发明中，
溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的扩增与保存：利用HEK293细胞扩增溶瘤腺病毒，CsCl梯度离心法纯化溶瘤腺病毒，TCID50法测定纯化腺病毒滴度，最后分装纯化病毒并保存于-80℃冰箱。
培养基例如可为含2％的胎牛血清。
本发明还同时提供了利用上述方法构建所得的溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的应用：用于制备治疗消化道恶性肿瘤疾病的药物。
作为本发明应用的改进：所述消化道恶心肿瘤疾病为胰腺导管腺癌。
作为本发明应用的进一步改进：抑制胰腺导管腺癌移植瘤生长。
本发明还同时提供一了种抑制胰腺导管腺癌细胞增殖的药物，以上述的溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL为原料制成。
ST13作为一种新型人类基因，常在肿瘤组织中表达下调。此外，ST13被鉴定为编码Hsp70相互作用蛋白的辅因子，促进Hsp70的伴侣功能，参与肿瘤细胞凋亡过程以及具有免疫协同作用。ST13的表达能提高Hsp70在体内的表达水平，增强了肿瘤细胞的免疫原性，从而诱导免疫细胞反应同时对肿瘤细胞具有杀伤作用。值得注意的是过表达的Hsp70不仅不影响TRAIL诱导的细胞凋亡，同时在配体结合过程中增加了TRAIL-R1和TRAIL-R2的稳定性，从而导致TRAIL介导外源性凋亡信号传导的增强。由此可见，所有研究均证实ST13和TRAIL可能是肿瘤靶向双基因病毒治疗中合适的双重治疗基因。
本发明前期证实ST13在胰腺导管腺癌中呈低表达且与胰腺导管腺癌患者预后不良相关。通过构建新型溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL治疗胰腺导管腺癌效果佳。而按照公开发表于《中华肿瘤杂志》的肿瘤靶向双基因-病毒治疗策略所述，并不是同时表达两种目的基因一定会产生好的效果。因此，本发明获得了意想不到的效果。且，本发明的新型溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL还能显著抑制胰腺导管腺癌移植瘤生长并延长了裸鼠的生存期。。
本发明具有如下的技术优势：
(1)本发明采用肿瘤靶向治疗策略，提高了腺病毒载体的靶向性和安全性，实现了有效地靶向治疗胰腺导管腺癌；
(2)本发明采用腺病毒相关基因缺失的方式，确保腺病毒的肿瘤内特异性复制，大大增强溶瘤腺病毒消灭肿瘤的效果；
(3)本发明将基因治疗和病毒治疗相结合，制备了可高效表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒，相比于单一的基因疗法或病毒疗法，显著增强了杀瘤效果；
(4)本发明成功构建了表达ST13和TRAIL的新型溶瘤腺病毒，在抗胰腺导管腺癌治疗中发挥了较好的抑瘤效果。完成了新型溶瘤腺病毒治疗胰腺导管腺癌的临床前研究，实现了其对实体肿瘤的靶向性和抗肿瘤作用；完善了病毒扩增和病毒滴度控制体系，为进一步的产业化奠定基础，使本发明具有良好的产业化前景。
综上所述，本发明提供了新型溶瘤腺病毒的构建方法及其在制备治疗胰腺导管腺癌药物中的应用，利用ST13和TRAIL双重治疗基因改造腺病毒，实现了基因治疗和病毒治疗相结合的目的，将显著提高溶瘤腺病毒抗胰腺导管腺癌的疗效。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为检测ST13在胰腺导管腺癌及正常胰腺组织中的表达情况(右图在彩色图中呈现棕色)。
图2为ST13在胰腺导管腺癌中的表达水平与患者预后的关系。
图3为新型溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL构建的结构示意图。
图4为Western blot法对溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL鉴定图。
图5为MTS法检测胰腺导管腺癌细胞PANC-1存活率分析图。
图6为MTS法检测胰腺导管腺癌细胞SW1990存活率分析图。
图7为MTS法检测胰腺导管腺癌细胞Bxpc-3存活率分析图。
图8为检测新型溶瘤腺病毒对胰腺导管腺癌细胞的协同抑制作用分析图；
A为MTS检测检测胰腺导管腺癌细胞存活率分析图；B为检测协同指数分析图。
图9为MTS法检测正常胰腺细胞存活率分析图。
图10为克隆形成实验检测胰腺导管腺癌细胞增殖分析图；
A为检测SW1990细胞增殖分析图；B为检测PANC-1细胞增殖分析图。
图11为流式细胞术检测胰腺导管腺癌细胞凋亡分析图。
图12为Hoechst33342染色检测胰腺导管腺癌细胞凋亡分析图；
a1-a4为检测胰腺导管腺癌细胞凋亡分析图；b1-b4为检测正常胰腺细胞凋亡分析图；其中a1，b1为control；a2，b2为CD55-ST13处理组；a3，b3为CD55-TRAIL处理组；a4，b4为CD55-ST13-TRAIL处理组。
图13为溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL在裸鼠体内治疗胰腺导管腺癌细胞移植瘤的结果分析图；
A为裸鼠肿瘤体积变化曲线；B为裸鼠生存时间变化曲线。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或技术特征的组合不应当被认为是孤立的，他们可以被相互结合从而达到更好的技术效果。
本文中的CD55-ST13指代仅携带ST13基因的溶瘤腺病毒组，CD55-TRAIL指代仅携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒组，CD55-ST13-TRAIL指代携带ST13和TRAIL双重基因的新型溶瘤腺病毒组。
实施例1、ST13在胰腺导管腺癌组织中的表达情况：
实验所需的组织芯片包含了202位胰腺导管腺癌患者的胰腺癌组织样本和癌旁组织样本，且此样本经由病理科诊断并对其进行分组后所提供。患者的手术时间为2011年3月至2017年8月，而患者生存时间是从手术日期到随访截止日期或死亡日期计算所得。本研究通过浙江省人民医院伦理委员会审核和批准。实验所需的组织芯片通过收集胰腺导管胰腺患者的临床病理组织样本后，将组织样本送至上海芯超生物科技公司合成。通过免疫组织化学染色检测ST13在胰腺导管腺癌组织芯片中的表达，具体步骤详见中杉金桥SP9000试剂盒。
免疫组织化学结果的判读标准为细胞质中出现棕色颗粒的被认为是阳性细胞。根据染色切片的阳性比例和染色强度，对细胞的染色比例评分如下：阳性比例<5％表示为0分；阳性比例是6～25％表示为1分；阳性比例是26～50％表示为2分；阳性比例>51％表示为3分。将染色强度分级如下：0分代表阴性；1分代表弱阳性；2分代表阳性；3分代表强阳性。最后将染色阳性比例与染色强度的分级相乘计算评分，并根据评分结果判断ST13在癌及癌旁组织中的表达水平，其中评分≤3被认为低表达，而≥4则认为是高表达。评分结果是由三位病理学医师进行判读所得。随后应用SPSS软件对评分结果进行统计学分析。并用Kaplan-meier法对胰腺导管腺癌患者进行生存预后分析，其中若P<0.05被认为具有统计学意义。
结果如图1-2所示，ST13主要表达于正常胰腺组织的细胞质上，而胰腺导管腺癌细胞的细胞质上仅存在少量表达，同时ST13在胰腺导管腺癌旁组织中的表达水平显著高于癌组织。此外，低表达的ST13与胰腺导管腺癌患者的预后不良显著相关，P<0.05。
实施例2、一种表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建pXC2-CEA质粒：
利用CEA启动子两端特异性引物(Xho I和SnaB I)，以人胰腺导管腺癌细胞PANC-1的总DNA基因组为模板，通过PCR方法扩增出CEA启动子，PCR体系为：
PCR条件为：94℃×45s，58℃×30s，72℃×2min。用限制性内切酶Xho I和SnaB I双酶切的PCR产物和pXC2质粒，然后进行连接，并取代pXC2上E1A区的野生型启动子，得到携带CEA启动子的pXC2-CEA质粒。
所述CEA引物的核苷酸序列为：上游引物(Xho I)：5’-ccgctcgagccagagccctggagagc-3’，如SEQ ID NO.1所述；下游引物(SnaB I)：5’-tacgtaccatggtctctgctgtctgc-3’，如SEQ ID NO.2所述。
(2)构建pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒：
首先利用Xho I和Xba I分别对pXC2-CEA和pSD55进行双酶切，并将双酶切后的两个大小片段进行连接，连接体系为：
16℃连接过夜，将连接产物经转化后，挑取单克隆至含Amp的LB培养基，37℃，220rpm摇床培养过夜，提取质粒并酶切鉴定，得到正确的pSD55-CEA。
在构建的pSD55-CEA基础上，通过PCR获得治疗基因(治疗基因为ST13、TRAIL)，插入治疗基因至pCA13载体上Hind III和EcoR V位点，得到pCA13-TRAIL和pCA13-ST13；利用IETD连接子并通过融合PCR的方法构建得到pCA13-TRAIL-IETD-ST13；然后用Bgl II分别酶切pSD55-CEA和pCA13-TRAIL-IETD-ST13，得到含CMV启动子控制外源基因表达框，将表达框插入pSD55-CEA质粒，得到pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒；
ST13的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；TRAIL的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
说明：pCA13载体购自加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)。
(3)腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL的构建：
利用Pme I酶切线性化pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒并将其转化至含Adeasy-1腺病毒骨架系统的BJ5183大肠杆菌中进行同源重组，产生由CEA启动子控制E1A区同时缺失E1B 55KDa基因的腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL。
说明：2007年发表于Nature Protocols上的《Aprotocol for rapid generationof recombinant adenovirus using the AdEasy system》已经详细叙述了上述含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183。
(4)溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的构建：
利用Mlu I酶切鉴定腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL是否正确。当酶切结果出现5条目的条带，且条带大小大约为1200bp、2000bp、4800bp、7000bp和20000bp时，鉴定结果判定为正确。
将鉴定正确的腺病毒质粒用Pac I酶切线性化后转染至HEK293细胞中，待细胞基本病变(当细胞间出现大量空隙且呈半贴壁状态时，属于细胞基本病变)，得到溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL；
(5)溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的鉴定：
对构建的溶瘤腺病毒进行Western blot鉴定，检测腺病毒感染肿瘤细胞是否表达治疗基因ST13和TRAIL，最终得到鉴定正确的新型溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL。所得结果如图4所述。
(6)溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的扩增与保存：
取状态良好的HEK293细胞大量传代培养，向2×106/ml细胞中加入50μl溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL，放入37℃培养箱持续培养24h，收集病变细胞至离心管，将其反复冻融3次，目的使病毒颗粒完全释放；CsCl梯度离心法纯化溶瘤腺病毒；TCID50法测定纯化腺病毒滴度，所得测定结果为2×1010pfu；最后分装纯化病毒并保存于-80℃冰箱。
按照上述制备方法得到新型溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL，所述新型溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL是以CEA为启动子，向腺病毒载体插入ST13和TRAIL双重治疗基因，如图3所示，其表达框为ST13-IETD-TRAIL-ployA，ployA表示为多聚腺苷酸尾。
实施例3、新型溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL对胰腺导管腺癌细胞PANC-1、SW1990、Bxpc-3生长的影响
胰腺导管腺癌细胞PANC-1、SW1990、Bxpc-3(购自中国科学院上海细胞所)在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养(37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱)，取对数生长期的细胞3×104/ml铺于96孔板；设定实验组为加入表达ST13和TRAIL的新型溶瘤腺病毒(CD55-ST13-TRAIL)，对照组为加入表达ST13的溶瘤腺病毒(CD55-ST13)和表达TRAIL的溶瘤腺病毒(CD55-TRAIL)以及空白对照组为仅加入完全培养基，每组均设置3个复孔；待细胞贴壁，分别加入CD55-ST13(0.1MOI、5MOI、10MOI、15MOI)，CD55-TRAIL(0.1MOI、5MOI、10MOI、15MOI)和CD55-ST13-TRAIL(0.1MOI、5MOI、10MOI、15MOI)持续48小时后，向96孔板中加入20μl含有PMSF的MTS溶液，37℃细胞培养箱继续培养4小时；将已加MTS的96孔板置于酶标仪中，测定490nm波长处的吸光度值(OD值)，上述实验重复3次。根据各孔的吸光度值求得实验组细胞的存活率，计算公式为：细胞存活率(％)＝实验组OD值/对照组OD值×100％。所得结果如图5-图7所述。
如上述检测方法所述，在PANC-1细胞中检测细胞活力。分别设定实验组为CD55-ST13(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)，CD55-TRAIL(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)和CD55-ST13+CD55-TRAIL(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)。使用Calcusyn软件分析ST13基因和TRAIL基因在PANC-1细胞中的CI值，其中通过以下公式计算CI值：CI＝(D)S/(Dx)S+(D)T/(Dx)T+(D)S(D)T/(Dx)S(Dx)T。(D)S和(D)T是抑制细胞生长的药物S或T的组合浓度，(Dx)S和(Dx)T是抑制细胞生长的单一药物S或T的浓度。当CI值<1，则药物具有协同作用；或者当CI>1，则药物的相互作用是拮抗的。所得结果如图8所述。
随着感染剂量的增加，CD55-ST13、CD55-TRAIL和CD55-ST13-TRAIL对胰腺导管腺癌细胞PANC-1、SW1990、Bxpc-3生长抑制效应愈加显著，同时CD55-ST13-TRAIL对胰腺导管腺癌细胞生长的协同抑制效应显著强于CD55-ST13或CD55-TRAIL单一疗法。
实施例4、新型溶瘤腺病毒对正常胰腺细胞生长的影响
正常胰腺细胞hTERT-HPNE(购自中国科学院上海细胞所)在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养(37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱)，取对数生长期的细胞3×103个/ml铺于96孔板；设定实验组为加入表达ST13和TRAIL的新型溶瘤腺病毒(CD55-ST13-TRAIL)，对照组为加入表达ST13的溶瘤腺病毒(CD55-ST13)和表达TRAIL的溶瘤腺病毒(CD55-TRAIL)以及对照组为仅加入完全培养基，每组均设置3个复孔；待细胞贴壁，分别加入CD55-ST13(0.1MOI、5MOI、10MOI、15MOI)，CD55-TRAIL(0.1MOI、5MOI、10MOI、15MOI)和CD55-ST13-TRAIL(0.1MOI、5MOI、10MOI、15MOI)持续48小时后，向96孔板中加入20μl含有PMSF的MTS溶液，37℃细胞培养箱继续培养4小时；将已加MTS的96孔板置于酶标仪中，测定490nm波长处的吸光度值(OD值)，上述实验重复3次。根据各孔的吸光度值求得实验组细胞的存活率，计算公式为：细胞存活率(％)＝实验组OD值/对照组OD值×100％。
结果如图9所示，随着感染剂量的增加，CD55-ST13、CD55-TRAIL和CD55-ST13-TRAIL对正常胰腺细胞生长几乎无明显抑制效应。
实施例5、新型溶瘤腺病毒对胰腺导管腺癌细胞增殖的影响
取对数生长期的PANC-1细胞以200个/ml细胞数加入6cm细胞培养皿中，每皿含有3ml完全培养基，将培养皿置于37℃细胞培养箱培养过夜；次日加入5MOI溶瘤腺病毒CD55-ST13、CD55-TRAIL和CD55-ST13-TRAIL，持续培养和观察2周至肉眼可见的单克隆细胞形成；弃细胞培养皿中的培养基，加入PBS洗2次细胞，之后加无水乙醇固定细胞10分钟，每皿加入结晶紫染液至覆盖整个培养皿，室温染色20分钟；弃细胞培养皿中的结晶紫，用自来水洗去残留的结晶紫染液，自然晾干，拍照并对利用Image J软件对细胞克隆形成数进行计数。
结果如图10所示，与CD55-ST13单一疗法、CD55-TRAIL单一疗法相比，CD55-ST13-TRAIL更能显著地抑制胰腺导管腺癌细胞增殖。
实施例6、新型溶瘤腺病毒对胰腺导管腺癌细胞凋亡的影响
取对数生长期的PANC-1细胞和SW1990细胞以4×105个/ml的细胞数铺于6孔板中，37℃细胞培养箱中培养过夜，待细胞完全贴壁；利用完全培养基将溶瘤腺病毒稀释成5MOI加至6孔板中，之后将6孔板重新放回37℃细胞培养箱培养48小时；用1ml的移液枪吸取6孔板中的上清至15ml离心管中，PBS洗2次细胞，加入胰腺消化贴壁细胞，并收集消化完的细胞至15ml离心管，1000rpm/min离心3分钟；弃上清，用预冷的PBS洗2次细胞，并将细胞转移至1.5ml Ep管中。向Ep管中加入1×Binding buffer重悬细胞沉淀；加入FITC Annexin V溶液和PI染色液至Ep管中，轻吹混匀混合溶液，同时避光放置15分钟；最后加入400μl1×Binding buffer至Ep管中，充分混匀，在流式细胞仪中检测细胞凋亡情况，同时未检测样本应尽可能地做到避光。
取一定数量的细胞爬片用75％的酒精浸泡10分钟后，用PBS和新鲜的细胞培养基润洗后，将细胞爬片置于24孔板中；取对数生长期的PANC-1细胞以2×104个/ml的细胞数铺于24孔板中的细胞爬片上，37℃细胞培养箱中培养过夜；待细胞完全贴于爬片上时，加入5MOI的溶瘤腺病毒感染24孔板中细胞，之后将24孔板重新放回37℃细胞培养箱感染48小时；弃24孔板中的培养基，PBS轻洗2次细胞，加入固定液静置5分钟以固定爬片上的细胞；弃固定液，PBS轻洗2次细胞，向24孔板中加入Hoechst33342染液，避光室温染色10分钟；弃Hoechst33342染液，PBS轻洗2次细胞，滴加含有DAPI的封片剂于载玻片上，随后放上细胞爬片进行封片操作；待玻片稍微晾干数小时后，在正置荧光显微镜下观察凋亡小体的形成。
结果如图11-12所示，与CD55-ST13单一疗法或CD55-TRAIL单一疗法相比，CD55-ST13-TRAIL更能显著地促进胰腺导管腺癌细胞凋亡。
实施例7、新型溶瘤腺病毒在裸鼠体内治疗胰腺导管腺癌细胞移植瘤
取40只3-5周的裸鼠皮下种植PANC-1细胞，其种植的细胞数为5×106个/ml，随时观察裸鼠的生长状态以及裸鼠的成瘤情况。自肿瘤形成开始，利用游标卡尺测定并记录肿瘤大小，以便于肿瘤体积的计算。连续测定2周后，肿瘤体积已生长至一定大小，将已成瘤的40只裸鼠随机分成四组，瘤内分别注射PBS、溶瘤腺病毒CD55-ST13、溶瘤腺病毒CD55-TRAIL和溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL，每只裸鼠注射100μl，隔天注射一次，分3次注射，其中3次注射溶瘤腺病毒需要注射的总病毒量为2×109pfu。瘤内注射后，同样随时观察裸鼠的生长状态以及裸鼠的成瘤情况，并利用游标卡尺测定并记录肿瘤大小。最后计算所得的肿瘤体积变化以及观察记录所得的裸鼠生长情况，应用GraphPad Prism软件绘制裸鼠肿瘤体积变化曲线和生存曲线。
结果如图13所示，新型溶瘤腺病毒能够显著抑制肿瘤生长，并延长了荷瘤裸鼠生存时间。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司
浙江理工大学
<120> 表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒构建及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgctcgagc cagagccctg gagagc 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacgtaccat ggtctctgct gtctgc 26
<210> 3
<211> 1110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaccccc gcaaagtgaa cgagcttcgg gcctttgtga aaatgtgtaa gcaggatccg 60
agcgttctgc acaccgagga aatgcgcttc ctgagggagt gggtggagag catgggtggt 120
aaagtaccac ctgctactca gaaagctaaa tcagaagaaa ataccaagga agaaaaacct 180
gatagtaaga aggtggagga agacttaaag gcagacgaac catcaagtga ggaaagtgat 240
ctagaaattg ataaagaagg tgtgattgaa ccagacactg atgctcctca agaaatggga 300
gatgaaaatg cggagataac ggaggagatg atggatcagg caaatgataa aaaagtggct 360
gctattgaag ccctaaatga tggtgaactc cagaaagcca ttgacttatt cacagatgcc 420
atcaagctga atcctcgctt ggccattttg tatgccaaga gggccagtgt cttcgtcaaa 480
ttacagaagc caaatgctgc catccgagac tgtgacagag ccattgaaat aaatcctgat 540
tcagctcagc cttacaagtg gcgggggaaa gcacacagac ttctaggcca ctgggaagaa 600
gcagcccatg atcttgccct tgcctgtaaa ttggattatg atgaagatgc tagtgcaatg 660
ctgaaagaag ttcaacctag ggcacagaaa attgcagaac atcggagaaa gtatgagcga 720
aaacgtgaag agcgagagat caaagaaaga atagaacgag ttaagaaggc tcgagaagag 780
catgagagag cccagaggga ggaagaagcc agacgacagt caggagctca gtatggctct 840
tttccaggtg gctttcctgg gggaatgcct ggtaattttc ccggaggaat gcctggaatg 900
ggagggggca tgcctggaat ggctggaatg cctggactca atgaaattct tagtgatcca 960
gaggttcttg cagccatgca ggatccagaa gttatggtgg ctttccagga tgtggctcag 1020
aacccagcaa atatgtcaaa ataccagagc aacccaaagg ttatgaatct catcagtaaa 1080
ttgtcagcca aatttggagg tcaagcgtaa 1110
<210> 4
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggctatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 60
atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac 120
gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa 180
gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc 240
aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt 300
tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtcctcag 360
agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac 420
tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg 480
cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg 540
ttttactaca tctattccca aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca 600
aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 660
ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata tggactctat 720
tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta 780
acaaatgagc acttgataga catggaccat gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt 840
ggctaa 846

Claims (4)

1.溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的应用，其特征在于：用于制备治疗消化道恶性肿瘤疾病的药物；所述消化道恶性肿瘤疾病为胰腺导管腺癌；
表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建pXC2-CEA质粒；
(2)构建pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒；
(3)利用Pme I内切酶线性化pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒并将其转化至含Adeasy-1腺病毒骨架系统的BJ5183大肠杆菌中同源重组，产生由CEA启动子控制E1A区同时缺失E1B 55KDa基因的腺病毒质粒；
(4)通过脂质体转染步骤(3)所得的重组腺病毒质粒至HEK293细胞，得到溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制胰腺导管腺癌移植瘤生长。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的制备包括以下步骤：
(1)构建pXC2-CEA质粒：
将CEA质粒插入到Xho I和SnaB I双酶切的pXC2质粒中，并取代pXC2上E1A区的野生型启动子，得到携带CEA启动子的pXC2-CEA质粒；
(2)构建pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒：
首先利用Xho I和Xba I分别对pXC2-CEA和pSD55进行双酶切，并将双酶切后的两个大小片段相连，得到pSD55-CEA；
通过PCR获得目的基因，插入目的基因至pCA13载体上Hind III和EcoR V位点，得到pCA13-TRAIL-IETD-ST13；
然后用Bgl II分别酶切pSD55-CEA和pCA13-TRAIL-IETD-ST13，连接经酶切后的两个大小片段，得到pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒；
(3)腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL的构建：
利用Pme I酶切线性化pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒并将其转化至含Adeasy-1腺病毒骨架系统的BJ5183大肠杆菌中进行同源重组，产生由CEA启动子控制E1A区同时缺失E1B 55KDa基因的腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL；
(4)溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的构建：
利用Mlu I酶切鉴定腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL是否正确；将鉴定正确的腺病毒质粒用Pac I酶切线性化后转染至HEK293细胞中，待细胞基本病变，得到溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的鉴定为：对构建的溶瘤腺病毒进行Western blot鉴定，检测腺病毒感染肿瘤细胞是否表达治疗基因ST13和TRAIL。
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