CN112574965A - 靶向癌胚抗原及携带Smad4基因的溶瘤腺病毒构建和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向癌胚抗原的携带Smad4基因的溶瘤腺病毒CD55‑Smad4的构建方法：制备携带Smad4基因的pCD55‑Smad4质粒；制备获得CEA启动子代替E1A内源启动子并调控E1A表达及缺失E1B 55kDa和E3区、携带Smad4基因表达框的重组腺病毒质粒pAd‑CD55‑Smad4；将重组鉴定正确的质粒pAd‑CD55‑Smad4用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到目的溶瘤腺病毒CD55‑Smad4。本发明还同时公开了上述溶瘤腺病毒CD55‑Smad4在制备治疗CEA阳性的结肠癌药物中的应用。

Description

靶向癌胚抗原及携带Smad4基因的溶瘤腺病毒构建和应用
技术领域
本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体涉及癌胚抗原(CEA)启动子调控和携带Smad4基因的溶瘤腺病毒CD55-Smad4的构建和应用。
背景技术
基因疗法的概念最初由美国科学家迈克尔.布莱泽首次提出，它是通过基因工程手段将外源基因导入靶细胞，以此来治疗因基因缺陷或异常引起的疾病。21世纪初“病毒治疗”(Virotherapy)策略逐渐成熟，人们希望通过对病毒致病基因的改造，在对机体无威胁情况下，使病毒靶向肿瘤细胞，并能导致肿瘤细胞的裂解，这种病毒被称为溶瘤病毒。该病毒在进入非肿瘤细胞后，会触发其抗病毒机制，导致病毒无法增殖，而肿瘤细胞由于缺乏凋亡机制，使得病毒中能在其中大量增殖。由于病毒治疗拥有宿主范围广、复制增殖能力强、基因组易改造等优点，因而受到科学界的广泛关注。
近年来，将溶瘤病毒作为基因治疗载体的策略逐渐兴起，该疗法意在一方面利用外源抗癌基因对癌细胞的抑制作用，另一方面利用溶瘤病毒在癌细胞中选择性增殖、裂解的作用，有效控制肿瘤。由于该疗法把野生型溶瘤病毒基因组改造成含有外源治疗基因的基因组，所以外源基因在溶瘤腺病毒的帮助下，在癌细胞中其拷贝数可随着病毒的复制而大量增多，即可弥补致癌通路中的缺失蛋白的表达，进一步发挥其抑癌作用。近年来，基于溶瘤病毒治疗和基因治疗联合的问题靶向基因-病毒治疗策略发展迅速，已有许多科学家们做了尝试并取得了可观的抗肿瘤效果，如应用VEGI、TRAIL、IL-24和ST13等作为抗癌基因，结果皆证明，溶瘤腺病毒携带外源基因的效果要比单独使用基因疗法或病毒疗法好，这种策略能达到溶瘤病毒和治疗基因协同杀伤肿瘤的目的，实现“1+1>2”的可喜效果，为肿瘤治疗开辟了新的途径，提供了新的思路。
CEA是最早被分离鉴定的肿瘤相关抗原之一，在非肿瘤患者血清中含量极低，但在大部分肿瘤中，如胰腺癌、肝癌、结直肠癌(CRC)等表达量极高。在CRC中，CEA的阳性率可高达80％，且在CRC肝转移及复发病例中更高，故CEA与CRC的发生发展，治疗预后有着极为密切的关系。Schrewe H等1990年克隆了CEA基因的编码区，并对启动子序列进行了研究分析，发现相对于CEA含量低的肿瘤细胞，CEA含量高的肿瘤细胞中CEA启动子转录活性更高。Sagawa T等将溶瘤腺病毒(OAds)的E1A区Survivin启动子替换为CEA启动子，构建得到Ad-CEAp/Rep可以有效地抑制CRC的肝转移。因此，CEA启动子被更多地应用于肿瘤的靶向治疗中，以启动病毒基因的转录或治疗基因的表达，以此提高病毒治疗的特异性与靶向性。鉴于CRC中高表达CEA，我们有理由相信CEA启动子驱动的OAds在CRC中有很好的特异性复制能力，并对癌旁组织无毒副作用。
CRC的发生发展与自身遗传因素息息相关，在众多遗传因素中，染色体不稳定是促进CRC进展的主要通路之一。其中包括P53、APC和DCC/Smad4等的突变，而DCC/Smad4的突变则最为重要，所以探索该基因的作用机理并以此作为CRC治疗的靶点来开发药物具有重要研究价值。
TGF-β密切参与各种生理活动，包括血管生成，细胞分裂分化，免疫调节，组织间质形成等。SMADs作为TGF-β通路下游关键蛋白，在信号传导入核过程起到核心作用，入核后，SMAD4复合物即可与其他转录因子合作共同调节TGF-β应答基因的转录，抑制肿瘤的发生。但是，SMAD4基因在肿瘤中往往会发生突变，SMAD4蛋白表达量也会显著下调，导致TGF-β通路失调，促进肿瘤进展。
在CRC中，Smad4作为TGF-β通路中的重要转录因子同样也起着抑癌作用，并且也往往会发生突变，比如染色体片段丢失，基因表达异常或基因突变。有研究证明，Smad4基因的突变可通过使糖原合成酶激酶-3的磷酸化可逆地失活TGF-β通路，从而使细胞往肿瘤方向变化，Smad4作为结肠癌的抑癌基因。另有研究表明，Smad4缺失会使CRC细胞主动分泌CCL15，招募具有CCL15受体(CCR1+)的细胞，这些细胞主要为骨髓来源的抑制细胞，他们能有效地促进CRC转移与侵袭。另外，Smad4对淋巴管生成有潜在的抑制作用，并与VEGF分泌抑制密切相关，这也是Smad4作为抑癌基因的一个表现。总之，Smad4缺失是CRC得以快速发展的关键原因。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种靶向癌胚抗原(CEA)及携带Smad4基因的溶瘤腺病毒构建和应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种靶向CEA阳性的溶瘤腺病毒CD55-Smad4的构建方法，包括如下步骤：
1)、制备携带Smad4基因的pCD55-Smad4质粒；
设计Smad4基因引物(上下游分别带有EcoR I与BamH I酶切位点)，利用KOD高保真PCR聚合酶扩增出Smad4基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定；
将Smad4基因通过EcoR I与BamH I双酶切位点连入pCA13质粒载体，获得pCA13-Smad4；利用Bgl II限制性内切酶分别酶切pCA13-Smad4和pCD55载体，将切割回收的CMV-Smad4-PA表达框连入酶切后的质粒pCD55，得到pCD55-Smad4；
2)、将步骤1)所得的pCD55-Smad4质粒用Pme I线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pAdeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，最后转入DH5α感受态细胞，得到CEA启动子代替E1A内源启动子并调控E1A表达及缺失E1B 55kDa和E3区、携带Smad4基因表达框的重组腺病毒质粒pAd-CD55-Smad4；
3)、将重组鉴定正确的质粒pAd-CD55-Smad4用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到目的溶瘤腺病毒CD55-Smad4。
即，具体为：
1)、Smad4基因的获取：将用Trizol试剂盒提取肝正常细胞L02总mRNA，逆转录成cDNA，设计Smad4基因引物(上下游分别带有EcoR I与BamH I酶切位点)，利用KOD高保真PCR聚合酶扩增出Smad4基因片段。
2)、将Smad4基因通过EcoR I与BamH I双酶切位点后连入同样EcoR I与BamH I双酶切的pCA13质粒载体，获得pCA13-Smad4；利用Bgl II限制性内切酶分别酶切pCA13-Smad4和pCD55载体，将切割回收的CMV-Smad4-PA表达框连入酶切后的质粒pCD55，得到pCD55-Smad4；
3)、将pCD55-Smad4转入全序列腺病毒骨架DNA质粒Adeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行重组，最后转入DH5α感受态细胞，产生CEA启动子代替E1A内源启动子并调控E1A表达及缺失E1B 55kDa和E3区、携带Smad4基因的重组腺病毒基因组载体pAd-CD55-Smad4；
4)、将重组鉴定正确的基因组载体用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到目的溶瘤腺病毒CD55-Smad4。
本发明还同时提供了上述溶瘤腺病毒CD55-Smad4在制备治疗结肠癌药物中的应用。
本发明的溶瘤腺病毒CD55-Smad4在用于治疗结肠癌时，可采用瘤内注射的方式，用量以小鼠计，为2×109pfu/小鼠。
基于上述背景技术的研究，CEA启动子能够使病毒在CEA表达量高的结肠癌细胞中大量复制，使得病毒具有肿瘤靶向性。此外，OAds载体pCD55删除5型腺病毒E1B区55KDa蛋白，使其能够在p53通路异常的肿瘤细胞中大量增殖但对正常细胞无杀伤作用。同时，Smad4蛋白的异常突变是导致结肠癌发生的原因之一，利用OAds载体携带Smad4基因使其在Smad4蛋白异常或缺失的结肠癌细胞中表达可以使得TGF-β/Smads通路恢复正常，抑制肿瘤的生长。
基于以上考虑，本发明将抑癌基因Smad4表达框插入到CEA启动子调控的溶瘤腺病毒CD55，得到重组病毒CD55-Smad4，希望其能更有效地抑制CRC细胞增殖，并且探索Smad4基因在CRC细胞中的作用，为CRC的治疗提供新的基因治疗方案与理论基础。
本发明在ZD55的基础上进行改造，包括利用CEA启动子控制E1A基因并携带Smad4基因，新构建了CD55-Smad4，所构建的CD55-Smad4具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡、抑制Wnt/β-catenin信号、结肠癌干细胞和结肠癌转移和侵袭的效果，并且抗癌效果强于对照病毒CD55-EGFP。因此，可以将Smad4基因很好地用于肿瘤的靶向基因-病毒治疗。
本发明构建的双靶向溶瘤腺病毒CD55-Smad4经实验证明，能够选择性的杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞，并且在体内能有效抑制结肠癌移植瘤的生长，为治疗癌症提供了一个新型靶向基因-溶瘤病毒药物。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为双靶向溶瘤腺病毒CD55-Smad4的结构示意图。
图2为溶瘤腺病毒CD55-Smad4(CS)介导Smad4基因在HCT116细胞中特异性表达Smad4图；
溶瘤腺病毒CD55-Smad4(CS)介导Smad4基因在HCT116细胞中特异性表达Smad4，则对照病毒CD55-EGFP(CS)和阴性对照(NC)则没有。
图3为体外实验对结肠癌细胞HT-29、HCT116、SW480和SW620的特异性杀伤效果图。
图4为体外对结肠癌细胞HT-29、HCT116、SW480和SW620的病理效应图。
图5为体外对结肠癌细胞HCT116和HCT116-Smad4-/-特异性杀伤效果图。
图6为体内对结肠癌细胞HCT116和HCT116-Smad4-/-荷瘤裸鼠体内肿瘤生长抑制的结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例中，所有酶切的反应参数均为37℃水浴酶切过夜。
实施例1、一种靶向CEA阳性的溶瘤腺病毒CD55-Smad4的构建方法，包括如下步骤：
1)Smad4基因的获取
将L02细胞(正常肝细胞)以每孔5x105个/孔铺于6孔板，用Trizol化学提取法提取细胞总mRNA，用NanoDrop2000测量RNA浓度，置于-80℃保存；
将上述提取的mRNA根据逆转录试剂盒说明书步骤，将其逆转录为cDNA：
(1)将RNA与试剂置于冰上，涡旋振荡后瞬离；
(2)配制如下反应体系(冰上配制)：
Figure BDA0002824919960000051
(3)37℃孵育15min；
(4)85℃孵育5s，使逆转录酶失活；
(5)短暂离心后置于冰上，置于-20℃。
设计Smad4基因引物，上下游分别带有EcoRI与BamHI酶切位点，用无菌水溶解，配成终浓度10umol，-20℃保存。
表1、Smad4基因引物
Figure BDA0002824919960000052
以提取得到的L02细胞cDNA为模板，通过PCR得到完整Smad4基因，PCR体系如下：
Figure BDA0002824919960000053
PCR反应程序为：
Figure BDA0002824919960000054
Figure BDA0002824919960000061
配制1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物140V电泳40min后，于紫外光下拍照；将目的片段切下置于1.5ml EP管中后，根据割胶回收试剂盒步骤回收Smad4基因(SEQ ID NO:1)。
2)pCA13-Smad4的构建
(1)将PCR得到的Smad4基因用EcoR I与BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。体系如下：
Figure BDA0002824919960000062
(2)将pCA13质粒用EcoR I与BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。体系如下：
Figure BDA0002824919960000063
(3)将步骤(1)得到的EcoR I与BamH I双酶切后的Smad4基因与步骤(2)得到的EcoR I与BamH I双酶切后的pCA13载体连接。于16℃反应2h。
(4)将反应完的连接体系通过热激法转入DH5α，首先将DH5α感受态放在冰上化冻8min，再将连接产物取10μl加入感受态中并在冰上放置30min，之后将感受态放入42℃水浴锅热激90s，到时间后迅速插入冰上放置2min，接着在Ep管中加入1ml无抗生素的LB培养基，摇床培养37℃220rpm 1h后，5000rpm离心1min，倒掉部分上清，留下约200μl的液体，将底层沉淀用移液枪吹打均匀并涂布于Amp抗性LB固体培养基中，放入37℃生化培养箱倒置培养12h。
(5)待长出肉眼可见的菌斑，挑6-8个菌斑并加到含0.1％氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇床培养37℃220rpm 12h，待菌液浑浊，取500μL菌液与甘油1:1保菌，然后按照质粒小抽试剂盒说明书抽提质粒，取1μL于NanoDrop2000测质粒浓度。
(6)将步骤(5)提取的pCA13-Smad4质粒用EcoR I与BamH I酶切鉴定，酶切体系如下，鉴定正确的质粒进行测序验证Smad4基因是否发生突变。
Figure BDA0002824919960000071
3)一步克隆法构建pCD55-Smad4
(1)设计能特异性识别BglⅡ位点的pCA13-CMV表达框引物，用无菌水溶解，配成终浓度10umol，-20℃保存。
表2、CMV-Smad4-PA表达框引物
Figure BDA0002824919960000072
(2)以测序成功的pCA13-Smad4质粒为模板，PCR得到序列两端能与BglⅡ位点重组的CMV-Smad4-PA表达框。
PCR体系如下：
Figure BDA0002824919960000073
PCR反应程序为：
Figure BDA0002824919960000074
Figure BDA0002824919960000081
配制1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物140V电泳40min后，拍照；按照割胶回收试剂盒步骤进行割胶回收，得CMV-Smad4-PA表达框。
(3)、将pCD55质粒用BglⅡ单酶切线性化，并用FastAp去磷酸化。
CD55质粒来源如下述文献：Enhanced antitumor effect of combining TRAILand MnSOD mediated by CEA-controlled oncolytic adenovirus in lungcancer.Zhang R,Zhang X,Ma B,Xiao B,Huang F,Huang P,Ying C,Liu T,Wang Y.CancerGene Ther.2016Jun；23(6):168-77。
酶切体系如下：
Figure BDA0002824919960000082
FastAp去磷酸化体系如下：
Figure BDA0002824919960000083
(4)、根据一步克隆试剂盒步骤，将步骤(3)所得FastAp去磷酸化后的pCD55载体与步骤(2)所得的CMV-Smad4-PA表达框连接。
(5)将步骤(4)所得的反应完的连接体系进行转化，涂布于Kana抗性LB固体培养基中，当单克隆菌落肉眼可见时挑6-8个于含0.1％Kana的液体培养基中摇菌，当菌液浑浊，保菌并抽提质粒，用NanoDrop2000测完浓度。
(6)将步骤(5)提取的pCD55-Smad4质粒用BamH I单酶切鉴定，pCD55-Smad4酶切体系如下：
Figure BDA0002824919960000084
Figure BDA0002824919960000091
4)、将酶切鉴定正确的pCD55-Smad4取一支经过Pme I线性化与FastAp磷酸化，再将FastAp磷酸化后的酶切体系转化到含Adeasy-1的BJ5183感受态细胞，涂布于Kana抗性的LB固体培养基中，并于37℃培养箱中倒置培养20h；于20h后挑斑，摇床摇菌37℃220rpm18h，之后根据质粒提取试剂盒说明书抽提质粒，得pAd-CD55-Smad4；即，产生CEA启动子代替E1A内源启动子并调控E1A表达及缺失E1B 55kDa和E3区、携带Smad4基因的腺病毒骨架DNA质粒载体pAd-CD55-Smad4。
并用Mlu I酶切鉴定。
Pme I酶切体系如下：
Figure BDA0002824919960000092
Mlu I酶切体系如下：
Figure BDA0002824919960000093
将Mlu I酶切鉴定正确的重组质粒pAd-CD55-Smad4转化到DH5α感受态细胞，挑斑摇菌后，保菌并抽提质粒，并用Mlu I酶切鉴定(酶切体系同上)，将酶切条带正确的质粒测序，比对Smad4基因片段是否发生突变。
将上述测序正确的pCD55-Smad4质粒通过Pac I线性化，FastAp去磷酸化后，根据Qiagen转染试剂说明书将线性化并FastAp去磷酸化的pCD55-Smad4转染到HEK293细胞中。放入37℃5％CO2细胞培养箱培养，待细胞出现病变(即细胞变圆并聚集形成成串的细胞团块，而且部分细胞与细胞团块漂浮于培养基中)后，得到目的溶瘤腺病毒CD55-Smad4，-80℃保存。
Pac I线性化酶切体系如下：
Figure BDA0002824919960000101
实验1、双靶向溶瘤腺病毒CD55-Smad4体外实验对结肠癌细胞HT-29、HCT116、SW480和SW620的特异性杀伤能力检测
将生长状态良好的四种CRC细胞HT-29、HCT116、SW480和SW620以5000个/孔铺板于96孔板；12h后，按照不同的MOI稀释治疗病毒CD55-Smad4与对照病毒CD55-EGFP，每组设置5个复孔，每孔加入20μL病毒液；分别在加入病毒24h、48h、72h、96h后，每孔加入20μL MTT；置于培养箱4h后弃培养基，加DMSO 150μL/孔；振荡20min后，酶标仪测量吸光值(490nm)；根据MTT细胞存活率计算公式处理数据，计算细胞存活率。
上述细胞培养均为37℃，5％CO2培养箱恒温培养；培养基为10％胎牛血清的DMEM培养基(DMEM购自Gibco)。
结果如图3所示，病毒感染细胞72h后，随着MOI的增大，病毒的杀伤效果越强，40MOI CD55-Smad4可将4种CRC细胞的生存率将至30％以下，并且目的病毒与对照病毒之间存在显著差异，尤其CD55-Smad4对HCT-116与SW480细胞，生存率已降至20％以下。
实验2、CD55-Smad4体外对结肠癌细胞HT-29、HCT116、SW480和SW620的病理效应
结晶紫实验检测CD55-Smad4对CRC细胞系的杀伤效果。将生长状况良好的四种CRC细胞以50000个/孔铺于24孔板；12h后，按照不同的MOI稀释目的病毒CD55-Smad4与对照病毒CD55-EGFP，每孔加入100μL病毒液；48h后，吸去细胞培液，每孔加入500μL结晶紫染液，染色20min；吸去结晶紫染液，用自来水洗净、烘干、拍照。
细胞培养条件为：10％FBS+1％青霉素和链霉素双抗的DMEM，37℃5％CO2细胞培养箱培养。
结果如图4所示，随着病毒MOI的增加，病毒对CRC细胞的杀伤效果越来越明显，且对HCT-116与SW480杀伤效果更佳。以上实验表明，目的病毒CD55-Smad4相对于对照病毒CD55-EGFP能更好地抑制CRC细胞的存活，并对HCT-116与SW480细胞的抑制效果更明显。
实验3、CD55-Smad4体外对结肠癌细胞HCT116和HCT116-Smad4-/-特异性杀伤效果图
将生长状态良好的对数期结肠癌细胞HCT116和HCT116-Smad4-/-(Smad4基因敲除细胞)以5000个/孔铺板于96孔板；12h后，按照不同的MOI稀释治疗病毒CD55-Smad4与对照病毒CD55-EGFP，每组设置5个复孔，每孔加入20μL病毒液；分别在加入病毒24h、48h、72h、96h后，每孔加入20μL MTT；置于培养箱4h后弃培养基，加DMSO 150μL/孔；酶标仪测量吸光值(490nm)；根据MTT细胞存活率计算公式处理数据，计算细胞存活率。
细胞培养条件为：10％FBS+1％青霉素和链霉素双抗的DMEM，37℃5％CO2培养箱培养。
结果如图5所示，病毒以MOI为5感染细胞，病毒的杀伤效果呈现时间依赖性，当处理时间为96h时，无论HCT116细胞或HCT116-Smad4-/-细胞，CD55-Smad4对2种CRC细胞的生存率将至40％以下，且目的病毒与对照病毒CD55-EGFP之间存在显著差异。
实验4、CD55-Smad4体内对结肠癌细胞HCT116和HCT116-Smad4-/-荷瘤裸鼠体内肿瘤生长抑制效果
动物实验遵循美国农业部和国家卫生研究院制定的法规和标准，以及浙江理工大学动物伦理委员会的要求进行。购自上海斯莱克实验动物中心4周龄左右的BALB/c雌性裸鼠，经过适应性饲养后，将8x106个HCT116或HCT116-smad4-/-细胞皮下接种于裸鼠右侧。当移植瘤达到90-130mm3时，随机分为4组(每组8只裸鼠)，分别注射PBS(vehicle)、CD55-EGFP(1x109PFU/小鼠)、CD55-Smad4(1x109PFU/小鼠)。连续注射溶瘤腺病毒2天。注射病毒后，每5天用游标卡尺测量肿瘤大小。
结果如图6所示，相比较PBS组，CD55-EGFP(CE)和CD55-Smad4(CS)均能有效抑制HCT116或HCT116-smad4-/-荷瘤裸鼠肿瘤的生长，而CS比CE具有更强的抑制肿瘤生长的作用，表明Smad4基因的表达起到了重要抗癌生长的效果。
序列表
<110> 浙江理工大学
<120> 靶向癌胚抗原及携带Smad4基因的溶瘤腺病毒构建和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggacaata tgtctattac gaatacacca acaagtaatg atgcctgtct gagcattgtg 60
catagtttga tgtgccatag acaaggtgga gagagtgaaa catttgcaaa aagagcaatt 120
gaaagtttgg taaagaagct gaaggagaaa aaagatgaat tggattcttt aataacagct 180
ataactacaa atggagctca tcctagtaaa tgtgttacca tacagagaac attggatggg 240
aggcttcagg tggctggtcg gaaaggattt cctcatgtga tctatgcccg tctctggagg 300
tggcctgatc ttcacaaaaa tgaactaaaa catgttaaat attgtcagta tgcgtttgac 360
ttaaaatgtg atagtgtctg tgtgaatcca tatcactacg aacgagttgt atcacctgga 420
attgatctct caggattaac actgcagagt aatgctccat caagtatgat ggtgaaggat 480
gaatatgtgc atgactttga gggacagcca tcgttgtcca ctgaaggaca ttcaattcaa 540
accatccagc atccaccaag taatcgtgca tcgacagaga catacagcac cccagctctg 600
ttagccccat ctgagtctaa tgctaccagc actgccaact ttcccaacat tcctgtggct 660
tccacaagtc agcctgccag tatactgggg ggcagccata gtgaaggact gttgcagata 720
gcatcagggc ctcagccagg acagcagcag aatggattta ctggtcagcc agctacttac 780
catcataaca gcactaccac ctggactgga agtaggactg caccatacac acctaatttg 840
cctcaccacc aaaacggcca tcttcagcac cacccgccta tgccgcccca tcccggacat 900
tactggcctg ttcacaatga gcttgcattc cagcctccca tttccaatca tcctgctcct 960
gagtattggt gttccattgc ttactttgaa atggatgttc aggtaggaga gacatttaag 1020
gttccttcaa gctgccctat tgttactgtt gatggatacg tggacccttc tggaggagat 1080
cgcttttgtt tgggtcaact ctccaatgtc cacaggacag aagccattga gagagcaagg 1140
ttgcacatag gcaaaggtgt gcagttggaa tgtaaaggtg aaggtgatgt ttgggtcagg 1200
tgccttagtg accacgcggt ctttgtacag agttactact tagacagaga agctgggcgt 1260
gcacctggag atgctgttca taagatctac ccaagtgcat atataaaggt ctttgatttg 1320
cgtcagtgtc atcgacagat gcagcagcag gcggctactg cacaagctgc agcagctgcc 1380
caggcagcag ccgtggcagg aaacatccct ggcccaggat cagtaggtgg aatagctcca 1440
gctatcagtc tgtcagctgc tgctggaatt ggtgttgatg accttcgtcg cttatgcata 1500
ctcaggatga gttttgtgaa aggctgggga ccggattacc caagacagag catcaaagaa 1560
acaccttgct ggattgaaat tcacttacac cgggccctcc agctcctaga cgaagtactt 1620
cataccatgc cgattgcaga cccacaacct ttagactga 1659

Claims (3)

1.靶向癌胚抗原的携带Smad4基因的溶瘤腺病毒CD55-Smad4的构建方法，其特征是包括如下步骤：
1)、制备携带Smad4基因的pCD55-Smad4质粒；
2)、将pCD55-Smad4质粒用Pme I线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pAdeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，最后转入DH5α感受态细胞，得到CEA启动子代替E1A内源启动子并调控E1A表达及缺失E1B 55kDa和E3区、携带Smad4基因表达框的重组腺病毒质粒pAd-CD55-Smad4；
3)、将重组鉴定正确的质粒pAd-CD55-Smad4用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到目的溶瘤腺病毒CD55-Smad4。
2.根据权利要求1所述的靶向CEA的携带Smad4基因的溶瘤腺病毒CD55-Smad4的构建方法，其特征是：
所述步骤1)为：
设计Smad4基因引物，利用KOD高保真PCR聚合酶扩增出Smad4基因；
将Smad4基因通过EcoR I与BamH I双酶切位点连入pCA13质粒载体，获得pCA13-Smad4；
利用Bgl II限制性内切酶分别酶切pCA13-Smad4和pCD55载体，将切割回收的CMV-Smad4-PA表达框连入酶切后的质粒pCD55，得到pCD55-Smad4。
3.如权利要求1或2所述的溶瘤腺病毒CD55-Smad4在制备治疗CEA阳性的结肠癌药物中的应用。
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