CN104164495B - 一种与铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，公开了一种与铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451的组合。该标志物可用于制备铂类化疗药物骨髓抑制毒性的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
自20世纪60年代以来，以顺铂为代表的铂类抗癌药广泛用于非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)等恶性肿瘤的治疗，已成为NSCLC化疗中不可缺少的药物。铂类药物进入人体后迅速分布至全身，既可抑制肿瘤生长和扩散，也可杀灭远处转移的肿瘤，对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用。但由于铂类化疗药物对细胞选择性差，在杀灭肿瘤细胞的同时对正常的细胞也有很大的破坏作用，常引起一些毒副反应。
血液中的红细胞和白细胞都源于骨髓干细胞，血液中的血细胞寿命短，常常需要不断补充，为了达到及时补充的目的，作为血细胞前体的干细胞必须快速分裂，而铂类化疗药物常常导致正常骨髓细胞受到抑制，主要表现为白细胞(尤其是中性粒细胞)减少以及血小板减少。因此骨髓抑制毒副反应的评价可按照上述指标(单位血液体积内白细胞、血小板、血红蛋白、粒细胞的水平)分为0、1、2、3-4四个毒性等级。骨髓抑制是铂类化疗影响最大的不良反应，常导致化疗中断或抗肿瘤药物减量，影响治疗效果，严重的骨髓抑制甚至可出现出血、感染等并发症，危及患者的生命。因此，对接受铂类药物化疗的NSCLC患者进行骨髓抑制毒性发病风险的诊断，对高危个体提前采取针对性的保护措施，真正实现个体化治疗，显得尤为重要。
许多因素能影响铂类药物骨髓抑制毒副反应的发病风险，如年龄、性别、吸烟、种族等。然而，在相同的临床病理因素(临床分期、年龄、性别、组织学类型、发病部位及肿瘤大小等)下，采用同样的治疗手段，接受铂类药物化疗的NSCLC患者是否发生骨髓抑制毒性及其发生的严重程度仍有很大差异，提示在同等环境暴露下，具有不同遗传背景的NSCLC个体铂类药物骨髓抑制毒性的易感性不同。
研究表明，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是引起铂类药物毒副反应的重要遗传因素。SNP是指人群中出现频率大于1％的单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP的存在能影响基因的结构或功能，被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此SNP可能是导致个体对常见疾病发生、预后，以及对药物反应易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱诊断疾病，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景。近年来，针对肿瘤和心血管疾病等常见重大疾病的SNP研究已经成为临床和科研工作者的研究热点。
然而，目前还没有将SNP应用于铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断的报道，若能筛选出铂类化疗药物骨髓抑制毒性易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断的现状必将是一次有力的推动，也为其药物预防与控制开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的SNP标志物。
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性扩增引物。
本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性延伸引物。
本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性扩增引物和/或特异性延伸引物在制备铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒中的应用。
本发明第五个目的是提供铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究接受铂类药物化疗并发生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与铂类化疗药物骨髓抑制毒性高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒，为铂类化疗药物骨髓抑制毒性的预防和控制提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的SNP标志物，该标志物为rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451的组合。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物，这些引物为：
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所述的SNP标志物的特异性延伸引物，这些引物为：
rs12883763的延伸引物序列为SEQ ID No:3；rs13014982的延伸引物序列为SEQID No:6；rs6750741的延伸引物序列为SEQ ID No:9；rs11892526的延伸引物序列为SEQ IDNo:12；rs430253的延伸引物序列为SEQ ID No:15；rs7610842的延伸引物序列为SEQ IDNo:18；rs12639117的延伸引物序列为SEQ ID No:21；rs623393的延伸引物序列为SEQ IDNo:24；rs2051802的延伸引物序列为SEQ ID No:27；rs11968978的延伸引物序列为SEQ IDNo:30；rs9390164的延伸引物序列为SEQ ID No:33；rs1485282的延伸引物序列为SEQ IDNo:36；rs1904023的延伸引物序列为SEQ ID No:39；rs11026144的延伸引物序列为SEQ IDNo:42；rs830379的延伸引物序列为SEQ ID No:45；rs712476的延伸引物序列为SEQ ID No:48；rs8006004的延伸引物序列为SEQ ID No:51；rs6497934的延伸引物序列为SEQ ID No:54；rs6502373的延伸引物序列为SEQ ID No:57；rs9909179的延伸引物序列为SEQ ID No:60；rs2830451的延伸引物序列为SEQ ID No:63。
所述的SNP标志物在制备铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒中的应用。
一种铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性扩增引物为：
rs12883763的扩增引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs13014982的扩增引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs6750741的扩增引物序列为SEQ ID No:7和SEQ IDNo:8；rs11892526的扩增引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs430253的扩增引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；rs7610842的扩增引物序列为SEQ ID No:16和SEQID No:17；rs12639117的扩增引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs623393的扩增引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；rs2051802的扩增引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs11968978的扩增引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；rs9390164的扩增引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；rs1485282的扩增引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs1904023的扩增引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；rs11026144的扩增引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；rs830379的扩增引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs712476的扩增引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；rs8006004的扩增引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；rs6497934的扩增引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；rs6502373的扩增引物序列为SEQ ID No:55和SEQ IDNo:56；rs9909179的扩增引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；rs2830451的扩增引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性延伸引物为：
rs12883763的延伸引物序列为SEQ ID No:3；rs13014982的延伸引物序列为SEQID No:6；rs6750741的延伸引物序列为SEQ ID No:9；rs11892526的延伸引物序列为SEQ IDNo:12；rs430253的延伸引物序列为SEQ ID No:15；rs7610842的延伸引物序列为SEQ IDNo:18；rs12639117的延伸引物序列为SEQ ID No:21；rs623393的延伸引物序列为SEQ IDNo:24；rs2051802的延伸引物序列为SEQ ID No:27；rs11968978的延伸引物序列为SEQ IDNo:30；rs9390164的延伸引物序列为SEQ ID No:33；rs1485282的延伸引物序列为SEQ IDNo:36；rs1904023的延伸引物序列为SEQ ID No:39；rs11026144的延伸引物序列为SEQ IDNo:42；rs830379的延伸引物序列为SEQ ID No:45；rs712476的延伸引物序列为SEQ ID No:48；rs8006004的延伸引物序列为SEQ ID No:51；rs6497934的延伸引物序列为SEQ ID No:54；rs6502373的延伸引物序列为SEQ ID No:57；rs9909179的延伸引物序列为SEQ ID No:60；rs2830451的延伸引物序列为SEQ ID No:63。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择接受铂类药物化疗并有详细骨髓抑制毒性评价信息的NSCLC患者，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的SNP。(3)对于筛选出来的阳性关联SNP，进一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平台进行检测，以验证将其应用于诊断的可重复性。(4)铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒的研制：根据不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描，初筛阳性位点采用Sequenom MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统进行验证。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)首次入院就诊并经病理组织学或细胞学确诊的新发NSCLC患者，其诊断按照世界卫生组织颁布的标准由至少两位病理科医生确认；
(2)首次化疗前血常规检查各项指标均正常；
(3)接受2～6周期的以铂类化疗为主的治疗；排除化疗前或化疗期间接受放疗的NSCLC患者；
(4)有详细的化疗2周期或3周期后骨髓抑制毒性的评价信息。
本研究共采用328例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20ng/μl～50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Affymetrix6.0芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在Affymetrix6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；
(3)检测并比较各基因型在不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中的分别差异。
4.Sequenom MassARRAY基因分型检测
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计SNP的特异性扩增引物和特异性延伸引物；
(3)进行PCR扩增反应及产物纯化；
(4)进行单碱基延伸反应及产物纯化；
(5)检测并比较各基因型在不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中的分别差异。
5.诊断试剂盒制备方法
Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描和Sequenom MassARRAY基因分型平台进行验证后确定了不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断指标。最后筛选出的与铂类化疗药物骨髓抑制毒性发生有关的SNP组成诊断试剂盒(rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性扩增引物和特异性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征、吸烟、组织类型、分期等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析，计算比值比(Odds Ratio,OR)以及它们的95％可信区间。定义那些骨髓抑制毒副反应OR小于1的SNP为保护性SNP；定义那些骨髓抑制毒副反应OR大于1的SNP为危险性SNP。
为了进一步研究这21个SNP构成的综合指征用于铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与铂类化疗药物骨髓抑制毒性发生的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.72×rs12883763的评分)+(-0.60×rs13014982的评分)+(0.99×rs6750741的评分)+(0.65×rs11892526的评分)+(0.80×rs430253的评分)+(0.70×rs7610842的评分)+(-0.92×rs12639117的评分)+(0.66×rs623393的评分)+(0.65×rs2051802的评分)+(0.80×rs11968978的评分)+(-0.65×rs9390164的评分)+(0.80×rs1485282的评分)+(0.64×rs1904023的评分)+(0.97×rs11026144的评分)+(-0.58×rs830379的评分)+(0.59×rs712476的评分)+(0.60×rs8006004的评分)+(0.60×rs6497934的评分)+(0.59×rs6502373的评分)+(-0.67×rs9909179的评分)+(-0.62×rs2830451的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被应用于全基因组关联研究的328例样本中。(以rs12883763为例：0.72为rs12883763的回归系数(见表1)；rs12883763的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些个SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为1.0×10-5，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
我们将上述接受铂类药物化疗后发生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者经Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。
根据Affymetrix6.0芯片检测，本发明人检测到在不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451。
根据上述检测结果，我们将这21个与铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的SNP在Sequenom MassARRAY基因分型平台进行验证，结果与Affymetrix6.0芯片检测一致。
多因素logistic回归分析结果表明，这21个SNP与铂类化疗药物骨髓抑制毒性发生风险存在着剂量-反应关系：15个为危险因素(rs712476、rs6502373、rs8006004、rs6497934、rs1904023、rs2051802、rs11892526、rs623393、rs7610842、rs12883763、rs430253、rs11968978、rs1485282、rs11026144和rs6750741，变异等位基因型增加骨髓抑制毒性风险)，6个为保护因素(rs12639117、rs9909179、rs9390164、rs2830451、rs13014982和rs830379，变异等位基因型降低骨髓抑制毒性风险)。
进一步分析这21个SNP的组合用于铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断的效果，发现其组合能够很好的区分不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于临床铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性扩增引物、特异性延伸引物和其他检测试剂。
具体而言，这21个SNP的组合，或者这21个SNP的特异性扩增引物及特异性延伸引物的组合构成的相关诊断试剂盒有助于铂类化疗药物骨髓抑制毒性的诊断，对高危个体提前采取针对性的保护措施，真正实现个体化治疗，显得非常重要。
本发明有益效果：
本发明提供的SNP标志物作为铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的标志物的优越性在于：
(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为铂类化疗药物骨髓抑制毒性的诊断和控制开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于铂类化疗药物骨髓抑制毒性的诊断，有助于反映肿瘤患者对铂类药物骨髓抑制毒性的易患程度，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价系统，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取铂类药物骨髓抑制毒性相关的SNP谱，并在Sequenom MassARRAY基因分型平台上进行了验证；该策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄等对毒副反应发生的影响因素，研究SNP在铂类化疗药物骨髓抑制毒性的诊断中的应用前景，阐述SNP对于铂类化疗药物骨髓抑制毒性进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得临床医生更好地识别铂类药物骨髓抑制毒性的高危个体，为快速准确掌握患者病情及实现个体化治疗奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全基因组关联研究不同程度骨髓抑制毒性(0～1、2～4级)的NSCLC患者的ROC曲线。
显示接受铂类药物化疗的NSCLC患者中发生严重骨髓抑制毒性(2～4级)组对低骨髓抑制毒性(0～1级)组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：样品的收集和样品资料的整理
发明人于2005月4月开始至2011年1月从南京医科大学附属肿瘤医院及南京医科大学附属第一医院收集了大量的原发性NSCLC患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了328例符合下列标准的全基因组芯片扫描样本：
(1)首次入院就诊并经病理组织学或细胞学确诊的新发NSCLC患者，其诊断按照世界卫生组织颁布的标准由至少两位病理科医生确认；
(2)首次化疗前血常规检查各项指标均正常；
(3)接受2～6周期的以铂类化疗为主的治疗；排除化疗前或化疗期间接受放疗的NSCLC患者；
(4)有详细的化疗2周期或3周期后骨髓抑制毒性的评价信息。
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2：外周血DNA中SNP的全基因组扫描
将上述符合条件的328例接受铂类药物化疗的NSCLC患者外周血DNA进行Affymetrix6.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度:通常能得到20ng/μl-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、在Affymetrix6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；
9、数据分析与处理:在接受铂类药物化疗后发生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者全基因组关联分析结果
实施例3：SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
将上述全基因组扫描发现与铂类化疗药物的骨髓抑制毒性有关的SNP在SequenomMassARRAY基因分型平台上进行检测，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20ng/μl-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、在Sequenom MassARRAY基因分型平台上进行基因分型。对全基因组扫描发现的与铂类化疗药物的骨髓抑制毒性有关的21个SNP设计特异性扩增引物和特异性延伸引物；扩增反应的体系包括：0.1μl dNTP mix(25mM)，0.5μl10×PCR Buffer，0.4μl MgCl2(25mM)，0.1μl HotStar Taq(5U/μL)，每对正向和反向扩增引物的混合物1μl和1.9μl双蒸水。加入1μL的DNA样本进行PCR扩增反应。延伸反应的体系包括：EXTEND Mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl,延伸混合物0.2μl)。加入SAP(shrimpalkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理后的PCR产物7μL进行单碱基延伸反应。使用的仪器为ABI9700型PCR仪。纯化的产物4,000rpm离心4分钟，沉淀树脂后使用MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪转移到384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF质谱分析，检测结果采用Typer V4.0软件分型并输出结果。
9、数据分析与处理:用logistic回归分析中的additive模型比较每个SNP在接受铂类药物化疗后发生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中的基因型分布频率的差异，结果与全基因组扫描类似不再列出。
实施例4：利用危险度评分方法进一步分析SNP与铂类化疗药物的骨髓抑制毒性
根据上述结果，本发明人通过对不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评价诊断的灵敏性和特异性，进而评价这些SNP对铂类化疗药物骨髓抑制毒性的诊断能力。对21个SNP标志物的联合分析发现，这21个SNP以88.2％的AUC将发生不同程度骨髓抑制(0～1、2～4级)的NSCLC患者分开，最佳临界点的灵敏度为75.86％，特异度：84.41％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451的组合能够很好地将易发生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者区分。
实施例5：用于铂类化疗药物骨髓抑制毒性的诊断SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Sequenom MassARRAY基因分型平台检测技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物(包括下列引物：rs12883763的扩增引物序列为SEQID No:1和SEQ ID No:2；rs13014982的扩增引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；rs6750741的扩增引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs11892526的扩增引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs430253的扩增引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；rs7610842的扩增引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs12639117的扩增引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；rs623393的扩增引物序列为SEQ ID No:22和SEQ IDNo:23；rs2051802的扩增引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs11968978的扩增引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；rs9390164的扩增引物序列为SEQ ID No:31和SEQID No:32；rs1485282的扩增引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs1904023的扩增引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；rs11026144的扩增引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；rs830379的扩增引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs712476的扩增引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；rs8006004的扩增引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；rs6497934的扩增引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；rs6502373的扩增引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56；rs9909179的扩增引物序列为SEQ IDNo:58和SEQ ID No:59；rs2830451的扩增引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62)、和/或特异性延伸引物(包括下列延伸引物：rs12883763的延伸引物序列为SEQ ID No:3；rs13014982的延伸引物序列为SEQ ID No:6；rs6750741的延伸引物序列为SEQ ID No:9；rs11892526的延伸引物序列为SEQ ID No:12；rs430253的延伸引物序列为SEQ ID No:15；rs7610842的延伸引物序列为SEQ ID No:18；rs12639117的延伸引物序列为SEQ ID No:21；rs623393的延伸引物序列为SEQ ID No:24；rs2051802的延伸引物序列为SEQ ID No:27；rs11968978的延伸引物序列为SEQ ID No:30；rs9390164的延伸引物序列为SEQ ID No:33；rs1485282的延伸引物序列为SEQ ID No:36；rs1904023的延伸引物序列为SEQ IDNo:39；rs11026144的延伸引物序列为SEQ ID No:42；rs830379的延伸引物序列为SEQ ID No:45；rs712476的延伸引物序列为SEQ ID No:48；rs8006004的延伸引物序列为SEQ ID No:51；rs6497934的延伸引物序列为SEQ ID No:54；rs6502373的延伸引物序列为SEQ ID No:57；rs9909179的延伸引物序列为SEQ ID No:60；rs2830451的延伸引物序列为SEQ ID No:63)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的扩增引物及延伸引物检测SNP，再通过SNP谱评价接受铂类药物化疗的肿瘤患者骨髓抑制毒副反应，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导高危人群的筛检和更有效的个体化治疗。
表2.相关SNP引物信息
F：Forward Primer，上游引物；R：Reverse Primer，下游引物；E：ExtendedPrimer，延伸引物。
Claims (6)
1.一种与铂类化疗药物骨髓抑制毒性相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451的组合。
2.用于检测权利要求1所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为：
rs12883763的扩增引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；
rs13014982的扩增引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；
rs6750741的扩增引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；
rs11892526的扩增引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；
rs430253的扩增引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；
rs7610842的扩增引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；
rs12639117的扩增引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；
rs623393的扩增引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；
rs2051802的扩增引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；
rs11968978的扩增引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；
rs9390164的扩增引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；
rs1485282的扩增引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；
rs1904023的扩增引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；
rs11026144的扩增引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；
rs830379的扩增引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；
rs712476的扩增引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；
rs8006004的扩增引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；
rs6497934的扩增引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；
rs6502373的扩增引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56；
rs9909179的扩增引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；
rs2830451的扩增引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62。
3.用于检测权利要求1所述的SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为：
rs12883763的延伸引物序列为SEQ ID No:3；
rs13014982的延伸引物序列为SEQ ID No:6；
rs6750741的延伸引物序列为SEQ ID No:9；
rs11892526的延伸引物序列为SEQ ID No:12；
rs430253的延伸引物序列为SEQ ID No:15；
rs7610842的延伸引物序列为SEQ ID No:18；
rs12639117的延伸引物序列为SEQ ID No:21；
rs623393的延伸引物序列为SEQ ID No:24；
rs2051802的延伸引物序列为SEQ ID No:27；
rs11968978的延伸引物序列为SEQ ID No:30；
rs9390164的延伸引物序列为SEQ ID No:33；
rs1485282的延伸引物序列为SEQ ID No:36；
rs1904023的延伸引物序列为SEQ ID No:39；
rs11026144的延伸引物序列为SEQ ID No:42；
rs830379的延伸引物序列为SEQ ID No:45；
rs712476的延伸引物序列为SEQ ID No:48；
rs8006004的延伸引物序列为SEQ ID No:51；
rs6497934的延伸引物序列为SEQ ID No:54；
rs6502373的延伸引物序列为SEQ ID No:57；
rs9909179的延伸引物序列为SEQ ID No:60；
rs2830451的延伸引物序列为SEQ ID No:63。
4.权利要求2所述的特异性扩增引物和权利要求3所述的特异性延伸引物在制备铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒中的应用。
5.一种铂类化疗药物骨髓抑制毒性诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的特异性扩增引物和权利要求3所述的特异性延伸引物，用于检测外周血DNA中是否存在rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451。
6.根据权利要求5所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
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