CN110218793A - 一种与食管癌辅助诊断相关的snp标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肿瘤医学技术领域，具体公开了一种与食管癌辅助诊断相关的SNP标志物，所述SNP标志物为rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672的组合。该SNP标志物组合可用于辅助食管癌的临床筛查诊断，有助于反映食管癌无症状高危人群的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤医学领域，具体涉及一种与食管癌辅助诊断相关的SNP标志物。
背景技术
食管癌是全球范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一。据2018年世界卫生组织(WHO)最新资料显示，全球每年新发食管癌病例57万人，死亡约51万人，位居全球范围内肿瘤发病率第七位和死亡率第六位。国家癌症中心统计发布的2015年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析中显示，我国新发食管癌病例占世界的一半。
由于食管癌起病非常隐匿，早期发现和诊断极为困难，临床上首诊患者多为中晚期，导致治疗预后不理想，5年生存率偏低。且随着人口基数的不断增大和食管癌期望寿命的延长，庞大的食管癌患病和死亡人数，将在未来相当长一段时期内给我国带来严重的负担，是肿瘤预防及控制的重点。
目前，胃镜是临床诊断食管癌最有效的检查，各种胃镜技术的开展对食管癌早期诊断有重要贡献。但胃镜普查存在很多局限性，一是对胃镜医师操作经验的要求较高；存在被检查者耐受性差的问题；二是在无症状人群中存在胃镜活检操作盲目、不规范的现象；三是胃镜在食管癌高发区无症状人群筛查中食管癌和各类癌前病变的检出率均较低，这些原因使得胃镜检查很难在食管癌高发区的无症状人群中大范围开展。如果能找到一项无创性的食管癌检测手段，即对于预测食管癌患病风险具有较高特异性和敏感性的分子靶标对食管癌的早期发现、高危人群预警和精准筛查都具有十分重要的意义。
食管癌发生是一个复杂的多因素、多阶段的过程，其确切发病机制尚不明确。但其显著的地域性分布(河南、山西、河北三省交界的太行山地区食管癌绝对高发)和明显的家族聚集性发生(家族史阳性患者占40％)是食管癌突出流行病学特征，提示环境和遗传因素在食管癌发生中均起到重要作用。但研究发现在同等环境暴露下，不同遗传背景的个体对食管癌的易感性不同，其中单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)可能发挥了重要作用。SNP是指单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，它是人类最常见的可遗传变异，在人类基因组中广泛存在。SNP赋予个体对环境暴露、药物治疗等的不同反应性及不同的表型，因此SNP可能是导致个体疾病发生发展易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱诊断疾病，具有快速、灵敏、准确等特点，已成为近年来临床和科研工作者的研究热点。
随着高通量测序技术的飞速发展，食管癌大规模的关联研究大量涌现，发现了一批食管癌易感位点，为无症状高危人群预警和精准筛查、食管癌早期诊断奠定了坚实基础。然而目前还没有有效的食管癌早期诊断和普查的制剂，若能筛选出食管癌易感位点作为生物标志物，并研制相应诊断试剂盒，对我国食管癌早期诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选及精准治疗开辟新的途径。
发明内容
针对现有技术存在的问题和不足，本发明的第一个目的是提供一种与食管癌辅助诊断相关的SNP标志物。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测上述SNP标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测上述SNP标志物的特异性引物在制备食管癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种用于食管癌辅助诊断的试剂盒。
本发明通过分离和研究食管癌患者及与其年龄、性别匹配的健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与食管癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的食管癌辅助诊断试剂盒，为食管癌无症状高危人群的筛查和早期诊断提供数据支持。
本发明采用的技术方案如下：
一种与食管癌辅助诊断相关的SNP标志物，所述SNP标志物为rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672的组合。
上述SNP标志物的特异性扩增引物为：
rs10052657的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
rs10058728的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
rs2014300的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
rs4072037的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；
rs2239815的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；
rs9288318的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；
rs3763338的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；
rs9868873的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23；
rs3781264的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；
rs4822983的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29；
rs8030672的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32。
上述SNP标志物的特异性延伸引物为：
rs10052657的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
rs10058728的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；
rs2014300的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；
rs4072037的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；
rs2239815的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.15；
rs9288318的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.18；
rs3763338的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.21；
rs9868873的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.24；
rs3781264的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.27；
rs4822983的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.30；
rs8030672的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.33。
上述SNP标志物的特异性扩增引物在制备食管癌辅助诊断试剂盒中的应用。
上述SNP标志物的特异性延伸引物在制备食管癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种食管癌辅助诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测外周血DNA中的rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672。
根据上述的食管癌辅助诊断试剂盒，优选地，所述试剂盒包含上述的特异性扩增引物和/或上述的特异性延伸引物。
根据上述的食管癌辅助诊断试剂盒，优选地，所述试剂盒还包含PCR技术常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水等。
根据上述的食管癌辅助诊断试剂盒，优选地，所述试剂盒还包含标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；(2)基因型检测：选择食管癌病例，与食管癌病例年龄、性别匹配的健康对照，利用高密度SNP芯片，在全基因范围内找出与食管癌相关的SNP；(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步在另外的样本中进行检测，以验证其应用于临床诊断的可重复性和稳定性；(4)食管癌辅助诊断试剂盒的研制：根据食管癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发食管癌辅助诊断试剂盒。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为食管癌的病例，采血前未接受过放疗或化疗、既往无肿瘤病史；
(2)与病例年龄、性别匹配的健康对照；
本研究共采用6156例符合标准的样本进行研究。
2.采用Qiagen试剂盒提取外周血DNA，DNA浓度为15-25ng/μl，纯度(紫外260OD/280OD比值和260OD/230OD比值)均在1.8-2.0。
3.Illumina660全外显子芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在Illumina Human 660-Quad BeadChips(Illumina660芯片)上进行全基因组扫描；
(3)检测并比较各基因型在食管癌病例与健康对照中的分布差异。
4.单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计单个SNP的特异性引物和特异性延伸引物；
(3)进行PCR反应；
(4)检测并比较食管癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
Illumina660全外显子芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定食管癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为食管癌诊断的指标。最后筛选出与食管癌发病有关的SNP(rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672)。以这些SNP的特异性扩增引物和特异性延伸引物制备食管癌辅助诊断试剂盒。
6.统计分析方法
运用x2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异，用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这11个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与食管癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑这11个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(-0.40×rs10052657的评分)+(0.71×rs10058728的评分)+(-0.36×rs2014300的评分)+(0.29×rs4072037的评分)+(0.17×rs2239815的评分)+(0.25×rs9288318的评分)+(-0.46×rs3763338的评分)+(0.17×rs9868873的评分)+(0.32×rs3781264的评分)+(0.31×rs4822983的评分)+(0.44×rs8030672的评分)。
研究学分析通过统计学分析软件SPSS 25.0完成。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
(1)本发明采用全基因组芯片扫描以获取食管癌相关的SNP标志物，并应用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大样本中进行了验证，筛选得到了与食管癌稳定关联的SNP标志物组合，该SNP标志物组合对食管癌的诊断灵敏度达到了81.9％，特异度达到了79.4％，远高于现有食管癌的筛查诊断方法，因此，本发明的SNP标志物组合可用于食管癌的临床筛查诊断，有助于反映食管癌无症状高危人群的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(2)SNP标志物具有微创、易于检测的临床优势，通过检测本发明的SNP标志物组合将大大提高食管癌诊断的敏感性和特异性，为食管癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(3)本发明以与食管癌阳性关联的SNP标志物组合的特异性扩增引物和特异性延伸引物来制备试剂盒，该试剂盒的灵敏度高，特异性强，操作简单，使用方便，可用于食管癌的辅助诊断和食管癌无症状高危人群的筛查，使得食管癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确对食管癌无症状高危人群进行筛查诊断，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1为全基因组关联研究食管癌病例组和健康对照组的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：样品的收集和样品资料的整理
发明人于2016年开始至2018年从郑州大学第一附属医院收集了大量的食管癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了6156例样本(2575例食管癌病例和3581例健康对照)作为全基因组芯片扫描和单个SNP Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品，并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。其中6156例样本的选取标准为：
(1)经病理学明确诊断的食管癌病例，采血前未接受过放疗或化疗、无既往肿瘤病史；
(2)与食管癌病例年龄、性别匹配的健康对照。
实施例2：外周血DNA中SNP的全基因组扫描
从6156例实验样品中选取1026例食管癌患者和1573例健康对照，两组年龄、性别均衡可比。将这两组人群经Illumina660芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、抽提DNA：按照QIAGEN基因组DNA提取试剂盒的说明书提取样品DNA，具体步骤如下：
(1)细胞解冻：将血样从-80℃冰箱中取出，依次置于-20℃低温冰箱24h、4℃冰箱24h；
(2)去除红细胞：依次取1.0ml FG1buffer、400μl血样加入新的EP管中，上下均匀颠倒20-30次，混匀直至肉眼观察无血凝块及颗粒出现；4℃，15000rpm离心7分钟，弃上清；
(3)去除蛋白质：向沉淀中加FG2/PK溶液200μl，立即震荡混匀，至细胞团完全溶解；15000rpm离心30秒，65℃水浴孵育20min；后4℃，15000rpm离心30秒；
(4)抽提DNA：加200μl异丙醇(100％)，手动振荡(90-120次/分)混匀5-6分钟，直到细丝状DNA出现；15000rpm离心7分钟，弃上清，倒置沥干30秒；加300μl 70％乙醇，摇床震荡混匀20分钟，后15000rpm离心7分钟；倒置沥干10分钟；
(5)溶解DNA：加110μl FG3，65℃水浴孵育20分钟，置摇床12h；4℃，15000rpm离心30秒。
2、测量浓度：通常能得到15-25ng/μl DNA，纯度(紫外260OD/280OD比值和260OD/230OD比值)均在1.8-2.0。
3、进行全基因组扫描：在Illumina660芯片上进行全基因组扫描。
4、数据分析与处理：
通过对“食管癌病例”组和“健康对照”组进行全外显子芯片检测，采用单因素和多因素Logistic回归分析方法，发现基因型分布频率存在差异的SNP包括rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672(参见表1)。这些SNP在另外的“食管癌病例”组和“健康对照”组进行验证的结果一致。结果表明，这11个SNP与食管癌的发病存在着显著关联(p＜0.05)。
在Logistic回归分析中，OR的含义与相对危险度相同，指暴露组的疾病危险性为非暴露组的多少倍。OR>1说明疾病的危险度因暴露而增加，暴露与疾病之间为“正”关联；OR<1说明疾病的危险度因暴露而减少，暴露与疾病之间为“负”关联。还应计算OR的置信区间，若区间跨1，一般说明该因素无意义。对于这11个SNP而言，其中8个SNP为危险因素(OR>1)，变异等位基因可增加食管癌的发病风险，3个为保护因素(OR<1)，变异等位基因可降低食管癌的发病风险。
表1病例组与对照组全基因组关联分析结果
| SNP位点 | 染色体 | 相关基因 | OR(95％CI) | 回归系数 | P |
| rs10052657 | 5q11 | PDE4D | 0.67(0.62-0.73) | -0.40 | 1.97E-19 |
| rs10058728 | 5q11 | CSNK1A1 | 2.04(1.61-2.56) | 0.71 | 5.00E-09 |
| rs2014300 | 21q22.3 | RUNX1 | 0.70(0.65-0.75) | -0.36 | 8.09E-22 |
| rs4072037 | 1q22 | MUC1 | 1.33(1.19-1.49) | 0.29 | 3.00E-07 |
| rs2239815 | 22q12.1 | XBP1 | 1.18(1.13-1.23) | 0.17 | 3.88E-15 |
| rs9288318 | 2q33 | CASP8/ALS2CR12/TRAK2 | 1.28(1.18-1.39) | 0.25 | 1.35E-09 |
| rs3763338 | 6p22 | TRIM27/RFP/RNF76 | 0.63(0.50–0.78) | -0.46 | 1.62E-05 |
| rs9868873 | 3q21.1 | SEMA5B | 1.19(1.11-1.27) | 0.17 | 1.00E-07 |
| rs3781264 | 10q23 | PLCE1 | 1.38(1.23–1.53) | 0.32 | 7.30E-09 |
| rs4822983 | 22q12.1 | CHEK2 | 1.36(1.05-1.76) | 0.31 | 1.94E-22 |
| rs8030672 | 15q23 | ANP32A | 1.56(1.37-1.78) | 0.44 | 1.00E-11 |
实施例3：单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
将实施例2中经全基因组扫描发现与食管癌发病有关的SNP在另外1549例食管癌病例和2008例健康对照中进行检测，具体步骤为：
1、抽提DNA：按照QIAGEN基因组DNA提取试剂盒的说明书提取样品DNA，其具体操作与实施例1中抽提DNA的步骤相同，在此不再赘述。
2、测量浓度：通常能得到15-25ng/μl DNA，纯度(紫外260OD/280OD比值和260OD/230OD比值)均在1.8-2.0；
3、进行Sequenom MassARRAY基因分型：
(1)用MassARRAY Assay Design软件对全基因组扫描发现的11个阳性关联的SNP设计聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)特异性扩增引物和单碱基的特异性延伸引物，所述特异性扩增引物和特异性延伸引物的具体核苷酸序列如表2所示。
表2 11个阳性关联的SNP的特异性扩增引物和单碱基的特异性延伸引物
(2)PCR扩增：
PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。
①配制PCR master mix溶液(材料购自天根生化科技有限公司(北京))，PCR
master mix液的配制比例参见表3。
表3 PCR master mix液配制比例
| PCR Mix | 对每个反应，μL |
| 10×PCR Buffer | 0.5 |
| MgCl<sub>2</sub>(25mM) | 0.4 |
| dNTP mix(25mM) | 0.1 |
| HotStar Taq(5U/μL) | 0.1 |
| Water | 1.9 |
| PCR primer mix | 1 |
| Total Volume | 4 |
②使用24通道加样器，调节加样体积为4μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCRmaster mix液。该384孔板即为PCR反应板。
③使用24通道加样器，调节加样体积为1μL，向384孔板的每个加样孔中加入DNA抽提物。每个5μlPCR反应体系中包含模板DNA 20-50ng、Hotstar Taq 0.5U、每条扩增引物0.5pmol、0.1μl的25mM dNTPs。
④将384孔板放置于兼容384孔板的PCR仪，进行PCR扩增反应。PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，40个循环；72℃3分钟；4℃维持。
(3)PCR产物碱性磷酸酶处理：
在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。具体操作为：
①配制碱性磷酸酶处理反应液(SAP Mix)，SAP Mix液的配制比例参见表4。
表4 SAP Mix液配制比例
| SAP Mix | 对每个反应，μL |
| Water | 1.53 |
| SAP Buffer(10×) | 0.17 |
| SAP Enzyme(1.7U/ul) | 0.3 |
| Total Volume | 2 |
②使用24通道加样器，调节加样体积为2μL，将SAP Mix加入384孔板的每个加样孔中。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAP Mix 2μl。
③将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持。启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
(4)单碱基延伸：
在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。
①配制单碱基延伸反应液(EXTEND Mix)，单碱基延伸反应液的配制比例参见表5。
表5 EXTEND Mix的配制比例
| EXTEND Mix | 对每个反应，μL |
| Water | 0.619 |
| Extend primer Mix | 0.94 |
| iPLEX Buffer plus | 0.2 |
| iPLEX terminator | 0.2 |
| iPLEX enzyme | 0.041 |
| Total Volume | 2 |
②使用24通道加样器，调节加样体积为2μL，将EXTEND Mix对应加入384孔板的每个加样孔中。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTENDMix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)
③将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：Ⅰ.94℃，30秒；Ⅱ.94℃5秒；Ⅲ.52℃5秒，80℃5秒，5个循环；Ⅳ.94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒，39个循环；Ⅴ.72℃3分钟；Ⅵ.4℃维持。启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
(5)树脂纯化：
①将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；
②加16μl水到延伸产物的对应孔内；
③将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；
④离心使树脂沉入孔底部。
(6)芯片点样和质谱检测：
①启动点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔Sequenom芯片上。
②将点样后的Sequenom芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析。
4、基因型判读：采用TYPER4.0软件(Sequenom)进行分型并输出结果。
5、数据处理和分析：采用logistic回归分析中的additive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，得到基因型分布频率有显著差异的SNP结果与全基因组扫描类似不再列出。
实施例4：利用危险度评分方法进一步分析SNP与食管癌发病
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“食管癌病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些SNP对食管癌发病的判断能力。
绘制ROC曲线具体步骤：
(1)每个研究对象(共6156例)确定一个危险分值：
①对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。
②危险分值的计算方法如下：危险分值＝(-0.40×rs10052657的评分)+(0.71×rs10058728的评分)+(-0.36×rs2014300的评分)+(0.29×rs4072037的评分)+(0.17×rs2239815的评分)+(0.25×rs9288318的评分)+(-0.46×rs3763338的评分)+(0.17×rs9868873的评分)+(0.32×rs3781264的评分)+(0.31×rs4822983的评分)+(0.44×rs8030672的评分)。(以rs10052657为例：-0.40为rs10052657的回归系数(见表1)；rs10052657的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP基因型由仪器检测结果确定。)
(2)用SPSS 25.0软件绘制ROC曲线，来研究11个SNP标志物对食管癌的联合诊断作用，所述ROC曲线如图1所示：
①采用二元逻辑回归分析，变量设置：因变量为组别(“食管癌病例组”与“健康对照组”)，协变量为因素(根据11个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值)，然后选择保存中的概率；
②再次选择分析，选择ROC曲线分析，检验变量选择上面得出的概率，状态变量即组别，选择标准误和可信区间，面积和统计值如表6所示：
表6 ROC曲线下区域和统计值
备注：a.按非参数假定；b.原假设：真区域＝0.5。
对11个SNP标志物的联合分析发现，这11个SNP以79.3％的AUC将健康对照组和食管癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为81.9％，特异度为79.4％(参见图1)。
因此，本发明人证明了采用rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672的组合能够很好地将健康对照和食管癌患者区分。
实施例5：食管癌辅助诊断试剂盒的制作
食管癌辅助诊断试剂盒的制作和操作流程是基于Illumina660芯片检测和Sequenom MassARRAY基因分型技术。该食管癌辅助诊断试剂盒用于检测外周血DNA中的rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672；该试剂盒包含上述的SNP标志物组合中每一个SNP的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物；更进一步的，所述试剂盒中还含有相应PCR技术所需的常用试剂，如dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以含有有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。
其中，所述特异性扩增引物为：rs10052657的扩增引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2；rs10058728的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；rs2014300的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；rs4072037的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；rs2239815的扩增引物的核苷酸序列为SEQID NO.13和SEQ ID NO.14；rs9288318的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.17；rs3763338的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；rs9868873的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23；rs3781264的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；rs4822983的扩增引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.28和SEQ ID NO.29；rs8030672的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.31和SEQ IDNO.32。所述特异性延伸引物为：rs10052657的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；rs10058728的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；rs2014300的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；rs4072037的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；rs2239815的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.15；rs9288318的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.18；rs3763338的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.21；rs9868873的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.24；rs3781264的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.27；rs4822983的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.30；rs8030672的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.33。
该试剂盒的检测方法包括：(1)外周血DNA提取；(2)PCR扩增；(3)PCR产物碱性磷酸酶处理；(4)单碱基延伸；(5)树脂纯化；(6)芯片点样；(7)质谱检测等步骤；每一个步骤的具体操作参见实施例三。
该试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱辅助判断食管癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但不仅限于上述实例，凡在本发明精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 一种与食管癌辅助诊断相关的SNP标志物
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtgactgat gtgcttgaa 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cattcctctg ctcataacct 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgttccaca tggtagttt 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attactccaa gcagcatcta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taaccttagc ataggcagaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaatctaat tcatgacatc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agaacttagc actccattga 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctattccac tcctacagat t 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cattaaaaca ctctcagggc 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtggtcttc gtggtctt 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tctcagcctg tccttagc 18
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctaaacccgc aacagttgtt ac 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggtaatctt gttggctact 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctggttgctg aagaggag 18
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctcttaccac agaggtatca ctat 24
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctaatagtca gcacagtctt g 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctctgcctat tcatcctacc 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgaggggacc cttttctac 19
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccaggttcaa gcgattct 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccgaggtcag gagatcat 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaaaaatact tgtaaactga 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatcctgcct ctacctctat 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tctcaccgaa gtcctcata 19
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcacacttt ggcttc 16
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cttctgactg gcatctgaa 19
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgacacttct gacaccaa 18
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gctctgcctt tctgaaagca tgtga 25
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctcagtatct ctagccatca a 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttcacatcct ctccaacatt 20
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccaactctaa aaaacaaaaa caca 24
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccaggtgaag gttgttagg 19
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcagaggcag gagaattg 18
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gcacaaatat tatatgtgt 19
Claims (8)
1.一种与食管癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于，所述SNP标志物为rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672的组合。
2.用于检测权利要求1所述SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于，所述特异性扩增引物如下：
rs10052657的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
rs10058728的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
rs2014300的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
rs4072037的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；
rs2239815的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；
rs9288318的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；
rs3763338的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；
rs9868873的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23；
rs3781264的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；
rs4822983的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29；
rs8030672的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32。
3.用于检测权利要求1所述SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于，所述特异性延伸引物如下：
rs10052657的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
rs10058728的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；
rs2014300的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；
rs4072037的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；
rs2239815的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.15；
rs9288318的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.18；
rs3763338的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.21；
rs9868873的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.24；
rs3781264的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.27；
rs4822983的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.30；
rs8030672的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.33。
4.权利要求2所述的特异性扩增引物在制备食管癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求3所述的特异性延伸引物在制备食管癌辅助诊断试剂盒中的应用。
6.一种食管癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测外周血DNA中的rs10052657、rs10058728、rs2014300、rs4072037、rs2239815、rs9288318、rs3763338、rs9868873、rs3781264、rs4822983和rs8030672。
7.根据权利要求6所述的食管癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的特异性扩增引物和/或权利要求3所述的特异性延伸引物。
8.根据权利要求6或7所述的食管癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR技术常用的试剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 450052 State Key Laboratory of esophageal cancer prevention and treatment, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, No.40, University Road, Erqi District, Zhengzhou City, Henan Province Applicant after: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University Address before: 450052 Construction No. 1 East Road, 27 District, Henan, Zhengzhou Applicant before: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190910 |