CN104293919A - 一种与非吸烟女性肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与非吸烟女性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379等25个SNP的组合。该标志物可用于制备非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及非吸烟女性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
肺癌是全球范围内导致人类死亡最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率增长迅速，尤其在女性中，近年来流行病学调查显示女性肺癌发病率上升超过了男性。据国际癌症研究署(IARC)估计，在女性人群中，2012年肺癌新发病例58.3万人，死亡49.1万人，位居全球范围内肿瘤发病率第四和死亡率第二。由于环境污染、生活方式的改变，长期暴露于环境烟草烟雾厨房油烟等，近二十年来，我国女性人群，尤其是家庭主妇的肺癌发病率显著上升，仅2000年至2005年间，中国女性肺癌患者从12万增至17万，增加了38.4％，据估计，2012年我国女性肺癌发病率为20.4/10万，死亡率为18.0/10万，超过发达的工业化国家水平。由此可见，肺癌是威胁全球及我国女性生命和健康的重要疾病之一，是亟待解决的重大公共卫生问题。
目前，对肺癌的一级预防(病因预防)尚无明确、有效的预防措施，但如果能加强二级预防，做到早发现、早诊断和早治疗，则可以明显改善疾病预后，提高肺癌患者的5年生存率。因此，争取早期诊断是肺癌防治的重点。目前肺癌早期诊断的方法主要有影像学检查(胸部X线检查、胸部CT、核磁共振、正电子发射计算机体层扫描)、微创介入检查(支气管镜检、荧光纤维支气管镜检、超声纤维支气管镜检等)、痰液脱落细胞学检查、肿瘤生物标记等。但是现在临床常用的胸部X线、胸部CT和纤维支气管镜检存在一些弊端。胸部X线检查难以发现，或难以鉴定局部粘膜上较小的肿瘤；胸部CT不能确定病变的性质，可能存在假阳性或假阴性。纤维支气管镜检对肿瘤的浸润深度、有无转移了解不清。另外目前临床所用肺癌标志物的特异性不强，血清癌胚抗原(CEA)在肺癌早期多不增高，对诊断意义不大。病理活组织检查作为肺癌诊断的金标准，虽然在临床肺癌确诊中居于重要地位，但由于需要有创取活检组织，不适宜作为临床健康筛查的手段。
尽管主动吸烟为肺癌的主要病因已经得到证实，但其不足以解释非吸烟肺癌患者的流行病学特征，而女性肺癌多以非吸烟者为主，肺腺癌为主要病理类型。肺癌家庭聚集性的研究显示，遗传因素在非吸烟女性肺癌的发生中同样扮演重要角色。双生子研究表明，肺癌是遗传与环境共同作用的结果，同等环境暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。其中单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)起重要作用。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP的存在赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此SNP可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱诊断疾病的发生，灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景。近年来，利用SNP诊断疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病的应用价值已初见端倪。
然而，目前还没有将SNP应用于非吸烟女性肺癌诊断的报道，若能筛选出非吸烟女性肺癌易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国非吸烟女性肺癌诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与非吸烟女性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物在制备非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究非吸烟女性肺癌患者及与其年龄匹配的非吸烟女性健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与非吸烟女性肺癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒，为非吸烟女性肺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与非吸烟女性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、rs7755507、rs796102和rs8182116的组合。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物，该引物为：
rs10051970的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID NO：2；
rs10087140的引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；
rs10483845的引物序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
rs11233751的引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11；
rs11643408的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
rs11732247的引物序列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；
rs1255485的引物序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
rs12612657的引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23；
rs1535271的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
rs166402的引物序列为SEQ ID No：28和SEQ ID No：29；
rs16935064的引物序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
rs17040797的引物序列为SEQ ID No：34和SEQ ID No：35；
rs17073021的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
rs17623941的引物序列为SEQ ID No：40和SEQ ID No：41；
rs17670695的引物序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
rs2550911的引物序列为SEQ ID No：46和SEQ ID No：47；
rs40395的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
rs4454390的引物序列为SEQ ID No：52和SEQ ID No：53；
rs4640379的引物序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
rs4812681的引物序列为SEQ ID No：58和SEQ ID No：59；
rs6438722的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
rs7692314的引物序列为SEQ ID No：64和SEQ ID No：65；
rs7755507的引物序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
rs796102的引物序列为SEQ ID No：70和SEQ ID No：71；
rs8182116的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物，该引物为：
rs10051970的引物序列为SEQ ID NO：3；rs10087140的引物序列为SEQ ID NO：6；rs10483845的引物序列为SEQ ID NO：9；rs11233751的引物序列为SEQ ID NO：12；rs11643408的引物序列为SEQ ID NO：15；rs11732247的引物序列为SEQ ID NO：18；rs1255485的引物序列为SEQ ID NO：21；rs12612657的引物序列为SEQ ID NO：24；rs1535271的引物序列为SEQ ID NO：27；rs166402的引物序列为SEQ ID NO：30；rs16935064的引物序列为SEQ ID NO：33；rs17040797的引物序列为SEQ ID NO：36；rs17073021的引物序列为SEQ ID NO：39；rs17623941的引物序列为SEQ ID NO：42；rs17670695的引物序列为SEQ ID NO：45；rs2550911的引物序列为SEQ ID NO：48；rs40395的引物序列为SEQ ID NO：51；rs4454390的引物序列为SEQ ID NO：54；rs4640379的引物序列为SEQ ID NO：57；rs4812681的引物序列为SEQ ID NO：60；rs6438722的引物序列为SEQ ID NO：63；rs7692314的引物序列为SEQ ID NO：66；rs7755507的引物序列为SEQ ID NO：69；rs796102的引物序列为SEQ ID NO：72；rs8182116的引物序列为SEQ ID NO：75。
所述的SNP标志物在制备非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、rs7755507、rs796102和rs8182116。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择非吸烟女性肺癌病例及与其年龄匹配的非吸烟女性健康对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与非吸烟女性肺癌相关的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步在另外的样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4)非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据非吸烟女性肺癌病例和非吸烟女性健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描，SequenomMassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)临床确诊为非吸烟女性肺癌；
(2)与病例年龄匹配的非吸烟女性健康对照；
本研究共采用1822例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Affymetrix 6.0芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在Affymetrix 6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；
(3)检测并比较各基因型在非吸烟女性肺癌病例与健康对照中的分布差异。
4.单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计单个SNP的特异性引物；
(3)进行PCR反应；
(4)检测并比较非吸烟女性肺癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定非吸烟女性肺癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为非吸烟女性肺癌诊断的指标。最后筛选出的与非吸烟女性肺癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒(rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、rs7755507、rs796102和rs8182116)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物和Taq酶、dNTP等。
6.统计分析方法
运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这25个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与非吸烟女性肺癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.66×rs10051970的评分)+(0.58×rs10087140的评分)+(0.63×rs10483845的评分)+(0.70×rs11233751的评分)+(-1.19×rs11643408的评分)+(0.69×rs11732247的评分)+(0.71×rs1255485的评分)+(0.62×rs12612657的评分)+(0.55×rs1535271的评分)+(0.82×rs166402的评分)+(0.81×rs16935064的评分)+(0.58×rs17040797的评分)+(0.82×rs17073021的评分)+(0.53×rs17623941的评分)+(0.70×rs17670695的评分)+(0.56×rs2550911的评分)+(0.52×rs40395的评分)+(0.55×rs4454390的评分)+(0.80×rs4640379的评分)+(0.61×rs4812681的评分)+(0.72×rs6438722的评分)+(0.79×rs7692314的评分)+(0.84×rs7755507的评分)+(0.55×rs796102的评分)+(0.78×rs8182116的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的796例样本中。(以rs10051970为例：0.66为rs10051970的回归系数(见表1)；rs10051970的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些个SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
在上述228例符合条件的非吸烟女性肺癌病例及568例非吸烟女性健康对照中，两组年龄均衡可比。我们将这两组人群经Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。
根据Affymetrix6.0芯片检测，本发明人检测到在“非吸烟女性肺癌病例”组和“非吸烟女性健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、rs7755507、rs796102和rs8182116。
根据上述检测结果，我们将这25个与非吸烟女性肺癌发病相关的SNP在另外502例非吸烟女性肺癌病例和与其年龄匹配的524例非吸烟女性健康对照中进行了单个SNP的检测，结果与芯片检测一致。
单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这25个SNP与非吸烟女性肺癌的发病存在着显著关联。
进一步分析这25个SNP的组合用于非吸烟女性肺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于非吸烟女性肺癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言，这25个SNP的组合，或者这25个SNP的特异性引物的组合构成的相关诊断试剂盒有助于非吸烟女性肺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的SNP标志物作为非吸烟女性肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为非吸烟女性肺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于非吸烟女性肺癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱，并应用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄等对疾病发展可能的影响因素，研究SNP在非吸烟女性肺癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于非吸烟女性肺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了非吸烟女性肺癌发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得非吸烟女性肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
显示非吸烟女性肺癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1 样品的收集和样品资料的整理
发明人于2005月4月开始至2011年12月从南京医科大学第一附属医院和江苏省肿瘤医院收集了大量的非吸烟女性肺癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了1822例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP SequenomMassARRAY基因分型的实验样品：
1、病理组织学确诊的非吸烟女性肺癌患者；
2、与病例年龄匹配的非吸烟女性健康对照；
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2 外周血DNA中SNP的全基因组扫描
在上述符合条件的228例非吸烟女性肺癌患者和568例非吸烟女性健康对照中，两组年龄匹配。将这两组人群经Affymetrix6.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行全基因组扫描：在Affymetrix 6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描。
9、数据分析与处理：在“非吸烟女性肺癌病例”组和“非吸烟女性健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1 病例组与对照组全基因组关联分析结果
实施例3 单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
将上述全基因组扫描发现与非吸烟女性肺癌发病有关的SNP在另外502非吸烟女性肺癌病例和524非吸烟女性健康对照通过Sequenom MassARRAY基因分型平台上进行检测，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外2600D：2800D)在1.6-2.0。
8、进行Sequenom MassARRAY基因分型。对全外显子组扫描发现的与非吸烟女性肺癌有关的25个SNP设计特异性扩增引物和特异性延伸引物(表2)；扩增反应的体系包括：0.1μl dNTP mix(25mM)，0.4μl MgCl2(25mM)，0.1μl HotStar Taq(5U/μl)，每对正向和反向扩增引物的混合物1μl(1pmol/μl)和1.9μl双蒸水，加入1μl的DNA样本进行PCR扩增反应。延伸反应的体系包括：EXTEND Mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)。加入SAP(shrimp alkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理后的PCR产物7μl进行单碱基延伸反应。使用的仪器为ABI 9700型PCR仪。纯化的产物4,000rpm离心4分钟，沉淀树脂后使用MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪转移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF质谱分析。
9、基因型判读：采用TYPER 4.0软件(sequenom)进行。
10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，结果与全外显子扫描类似不再列出。
实施例4 利用危险度评分方法进一步分析SNP与非吸烟女性肺癌发病
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“非吸烟女性肺癌病例组”和“非吸烟女性健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些SNP对非吸烟女性肺癌发病的判断能力。对25个SNP标志物的联合分析发现，这25个SNP以73.1％的AUC将健康对照组和非吸烟女性肺癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为50.9％，特异度为88.4％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、rs7755507、rs796102和rs8182116的组合能够很好地将健康对照和非吸烟女性肺癌患者区分。
实施例5 用于非吸烟女性肺癌辅助诊断SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和SequenomMassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物(包括下列引物：rs10051970的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID NO：2；rs10087140的引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；rs10483845的引物序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs11233751的引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11；rs11643408的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs11732247的引物序列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；rs1255485的引物序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs12612657的引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23；rs1535271的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs166402的引物序列为SEQ ID No：28和SEQ ID No：29；rs16935064的引物序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs17040797的引物序列为SEQ ID No：34和SEQ ID No：35；rs17073021的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs17623941的引物序列为SEQ ID No：40和SEQ ID No：41；rs17670695的引物序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs2550911的引物序列为SEQ ID No：46和SEQ IDNo：47；rs40395的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs4454390的引物序列为SEQ ID No：52和SEQ ID No：53；rs4640379的引物序列为SEQ ID No：55和SEQID No：56；rs4812681的引物序列为SEQ ID No：58和SEQ ID No：59；rs6438722的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs7692314的引物序列为SEQ ID No：64和SEQ ID No：65；rs7755507的引物序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs796102的引物序列为SEQ ID No：70和SEQ ID No：71；rs8182116的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74)，和/或特异性延伸引物(包括下列引物：rs10051970的引物序列为SEQ ID NO：3；rs10087140的引物序列为SEQ ID NO：6；rs10483845的引物序列为SEQ ID NO：9；rs11233751的引物序列为SEQ ID NO：12；rs11643408的引物序列为SEQ ID NO：15；rs11732247的引物序列为SEQ ID NO：18；rs1255485的引物序列为SEQ ID NO：21；rs12612657的引物序列为SEQ ID NO：24；rs1535271的引物序列为SEQ ID NO：27；rs166402的引物序列为SEQ ID NO：30；rs16935064的引物序列为SEQ ID NO：33；rs17040797的引物序列为SEQ ID NO：36；rs17073021的引物序列为SEQ ID NO：39；rs17623941的引物序列为SEQ ID NO：42；rs17670695的引物序列为SEQ ID NO：45；rs2550911的引物序列为SEQ ID NO：48；rs40395的引物序列为SEQID NO：51；rs4454390的引物序列为SEQ ID NO：54；rs4640379的引物序列为SEQ IDNO：57；rs4812681的引物序列为SEQ ID NO：60；rs6438722的引物序列为SEQ ID NO：63；rs7692314的引物序列为SEQ ID NO：66；rs7755507的引物序列为SEQ ID NO：69；rs796102的引物序列为SEQ ID NO：72；rs8182116的引物序列为SEQ ID NO：75。)；还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱辅助判断非吸烟女性肺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关SNP引物
F：Forward Primer，上游引物；R：Reverse Primer，下游引物；E：Extended Primer，延伸引物。
Claims (9)
1.一种与非吸烟女性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、rs7755507、rs796102和rs8182116的组合。
2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为：
rs10051970的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID NO：2；
rs10087140的引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；
rs10483845的引物序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
rs11233751的引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11；
rs11643408的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
rs11732247的引物序列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；
rs1255485的引物序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
rs12612657的引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23；
rs1535271的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
rs166402的引物序列为SEQ ID No：28和SEQ ID No：29；
rs16935064的引物序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
rs17040797的引物序列为SEQ ID No：34和SEQ ID No：35；
rs17073021的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
rs17623941的引物序列为SEQ ID No：40和SEQ ID No：41；
rs17670695的引物序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
rs2550911的引物序列为SEQ ID No：46和SEQ ID No：47；
rs40395的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
rs4454390的引物序列为SEQ ID No：52和SEQ ID No：53；
rs4640379的引物序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
rs4812681的引物序列为SEQ ID No：58和SEQ ID No：59；
rs6438722的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
rs7692314的引物序列为SEQ ID No：64和SEQ ID No：65；
rs7755507的引物序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
rs796102的引物序列为SEQ ID No：70和SEQ ID No：71；
rs8182116的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74。
3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为：
rs10051970的引物序列为SEQ ID NO：3；rs10087140的引物序列为SEQ ID NO：6；rs10483845的引物序列为SEQ ID NO：9；rs11233751的引物序列为SEQ ID NO：12；rs11643408的引物序列为SEQ ID NO：15；rs11732247的引物序列为SEQ ID NO：18；rs1255485的引物序列为SEQ ID NO：21；rs12612657的引物序列为SEQ ID NO：24；rs1535271的引物序列为SEQ ID NO：27；rs166402的引物序列为SEQ ID NO：30；rs16935064的引物序列为SEQ ID NO：33；rs17040797的引物序列为SEQ ID NO：36；rs17073021的引物序列为SEQ ID NO：39；rs17623941的引物序列为SEQ ID NO：42；rs17670695的引物序列为SEQ ID NO：45；rs2550911的引物序列为SEQ ID NO：48；rs40395的引物序列为SEQ ID NO：51；rs4454390的引物序列为SEQ ID NO：54；rs4640379的引物序列为SEQ ID NO：57；rs4812681的引物序列为SEQ ID NO：60；rs6438722的引物序列为SEQ ID NO：63；rs7692314的引物序列为SEQ ID NO：66；rs7755507的引物序列为SEQ ID NO：69；rs796102的引物序列为SEQ ID NO：72；rs8182116的引物序列为SEQ ID NO：75。
4.权利要求1所述的SNP标志物在制备非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
7.一种非吸烟女性肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs10051970、rs10087140、rs10483845、rs11233751、rs11643408、rs11732247、rs1255485、rs12612657、rs1535271、rs166402、rs16935064、rs17040797、rs17073021、rs17623941、rs17670695、rs2550911、rs40395、rs4454390、rs4640379、rs4812681、rs6438722、rs7692314、rs7755507、rs796102和rs8182116。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的特异性扩增引物和/或权利要求3所述的特异性延伸引物。
9.根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105567822A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-05-11 | 深圳瑞奥康晨生物科技有限公司 | 一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组和试剂盒 |
| CN106434978A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-02-22 | 深圳市核子基因科技有限公司 | 一种用于检测肺癌易感性的试剂盒及其snp标志物 |
| TWI607091B (zh) * | 2015-11-30 | 2017-12-01 | 李克昭 | 用以偵測肺癌發生的方法及套組 |
| CN113981079A (zh) * | 2021-09-22 | 2022-01-28 | 杭州金域医学检验所有限公司 | Csf2rb及编码蛋白在女性非吸烟肺癌保护中的应用 |
| CN114277118A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-04-05 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101180408A (zh) * | 2005-05-19 | 2008-05-14 | 西尼尔根茨生物科学有限公司 | 用遗传多态性分析评估发生肺癌的风险的方法 |
-
2014
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101180408A (zh) * | 2005-05-19 | 2008-05-14 | 西尼尔根茨生物科学有限公司 | 用遗传多态性分析评估发生肺癌的风险的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 郑玲玲 等: "5p15.33(TERT-CLPTM1L)、15q25.1(CHRAN3)基因多态性与非吸烟者肺癌的关联研究", 《全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI607091B (zh) * | 2015-11-30 | 2017-12-01 | 李克昭 | 用以偵測肺癌發生的方法及套組 |
| CN105567822A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-05-11 | 深圳瑞奥康晨生物科技有限公司 | 一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组和试剂盒 |
| CN105567822B (zh) * | 2016-01-13 | 2019-01-04 | 深圳瑞奥康晨生物科技有限公司 | 一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组和试剂盒 |
| CN106434978A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-02-22 | 深圳市核子基因科技有限公司 | 一种用于检测肺癌易感性的试剂盒及其snp标志物 |
| CN113981079A (zh) * | 2021-09-22 | 2022-01-28 | 杭州金域医学检验所有限公司 | Csf2rb及编码蛋白在女性非吸烟肺癌保护中的应用 |
| CN114277118A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-04-05 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法 |
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