CN114277118A - 一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法 - Google Patents
一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法，步骤一，受试者唾液样本采集；步骤二，唾液样本基因组DNA的提取；步骤三，基因分型检测方法；步骤四，烟碱成瘾程度或易感性判定。本发明还提供了一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定装置以及在所述判定方法和判定装置中采用的引物组。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法。
背景技术
烟碱依赖是指摄入的烟碱经由血液传输，透过血脑屏障，进入脑区，通过与烟碱型乙酰胆碱受体结合，作用于中脑边缘多巴胺奖赏环路，引发奖赏效应。目前烟碱成瘾程度的评估主要依赖各类物质依赖或烟碱依赖量表，如烟碱依赖评估量表(FTND)、《精神障碍诊断与统计手册》第四版(DSM-IV)、《疾病和有关健康问题的国际统计分类》第十版(ICD-10)等。但是，量表评估具有较大的主观性和变异性，且只能代表受试者当前的状态，无法对其烟碱成瘾程度或易感性进行判定或预测。而关于烟碱成瘾的客观评价指标仅有烟碱或其他烟气成分相关代谢标志物，这类指标仅能表征暴露水平，与成瘾程度并无直接关系。
已有研究表明，烟碱成瘾程度或烟碱依赖受社会环境和遗传因素的共同影响，其中遗传因素起主要作用。通过对国内外大量文献的调研，对烟碱成瘾相关候选基因及其亚型信息进行筛选，发现烟碱成瘾相关基因涉及到中脑边缘多巴胺奖赏环路的各个环节，包括烟碱的代谢速率、烟碱型乙酰胆碱受体亚基的种类及多态性、多巴胺受体及转运体和降解酶相关的基因多态性、脑源性神经营养因子相关的基因多态性以及其他烟碱成瘾相关基因多态性。并且，研究发现烟碱成瘾程度或烟碱成瘾易感性存在显著的种族和个体差异，这种差异主要归因于不同种族和个体间烟碱成瘾相关基因多态性的差异。
基于客观指标掌握个体的烟碱成瘾程度或烟碱成瘾易感性，进而获得个性化吸烟建议，如每日吸烟量限值、是否抽吸低焦油/烟碱卷烟、抽烟方式及戒烟建议等，对于吸烟者或潜在吸烟者来说非常重要。但是，本领域中尚未提供基于烟碱成瘾相关SNPs对烟碱成瘾程度进行简单、快速、相对准确的预测模型，因此尚无法为吸烟者或一般受试者就其烟碱成瘾程度或成瘾易感性提供相关信息。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的发明人基于中国汉族人群的大量烟碱代谢及成瘾相关SNPs与成瘾程度之间关联分析的结果，以及不同SNPs间的共线性情况，采用普通最小二乘法(OLS)优化建立了烟碱成瘾程度的预测模型，并相应提供了烟碱依赖易感指数的计算模型。
因此，本发明的目的是建立一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的预测方法和系统。本发明的另一个目的是提供与该方法或系统组合使用的引物组和试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法，所述判定方法包括以下步骤：
(1)从受试者采集生理样本；
(2)从所述生理样本中提取基因组DNA；
(3)针对rs12721655、rs2279343、rs28399433、rs3745274和rs55853698这5个SNPs进行基因组DNA的基因分型分析；
(4)将基因分型分析结果代入如下计算公式：Y＝6.95+a1+a2+a3+a4+a5，其中Y为烟碱成瘾或易感性的测定分数，a1、a2、a3、a4、a5分别为如下不同SNPs的赋值，
将得到的Y值按照四舍五入进行受试者的成瘾分级：0-1，非成瘾；2-3，轻度；4-5，中度；>6，重度。
在本发明的上下文中，“0-1，非成瘾”是指受试者无烟碱成瘾，或不属于烟碱易感；“2-3，轻度”是指受试者为烟碱轻度成瘾，或属于烟碱轻度易感；“4-5，中度”是指受试者为烟碱中度成瘾，或属于烟碱中度易感；“>6，重度”是指受试者为烟碱重度成瘾，或属于烟碱重度易感。
优选地，在本发明的判定方法的步骤(1)中，受试者为吸烟或者非吸烟受试者。优选地，生理样本为受试者的唾液。更优选地，步骤(1)包括：受试者使用清水漱口，半小时后采集受试者的唾液样本，室温保存。例如，吸烟或者非吸烟受试者使用清水漱口，半小时后使用唾液采集管(内置保护液)采集受试者的唾液样本1mL，室温保存。
优选地，在本发明的判定方法的步骤(2)中，基因组DNA的提取方法取决于生理样本采用本领域常规方法进行。例如，在唾液样本的情况下，可采用MGIEasy基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)(华大智造，1000010524)根据所提供的说明书进行唾液样本基因组DNA的提取。
优选地，在本发明的判定方法的步骤(3)包括：采用如下引物进行基因组DNA的多重PCR反应：
rs12721655：
正向引物rs12721655F：CTGCACCCCAGGTGTGATCTTT(SEQ ID NO:1)
反向引物rs12721655R：CTATTCCCGTGCACCTGCATCT(SEQ ID NO:2)
rs2279343：
正向引物rs2279343F：TTACAAAAACCTGCAGGAAATCAATG(SEQ ID NO:3)
反向引物rs2279343R：CCTCCCCTCTCTCCCTGTCTCA(SEQ ID NO:4)
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正向引物rs28399433F：CTGCCAAACAGACATCAAGACCATY(SEQ ID NO:5)
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rs3745274：
正向引物rs3745274F：GCTTCTTCCTAGGGGCCCTCAT(SEQ ID NO:7)
反向引物rs3745274R：CCCTGACCTGGCCGAATACAG(SEQ ID NO:8)
rs55853698：
正向引物rs55853698F：AATAGACCGGACTGGGCCAAAA(SEQ ID NO:9)
反向引物rs55853698R：CGACCAGCTGGACCAAGAGC(SEQ ID NO:10)
并且对产物进行测序以检测所述SNPs。
根据本发明的具体实施方式，所述步骤(3)中，在多重PCR反应之后，还进行PCR产物的延伸反应，再对延伸反应产物进行测序，以检测所述SNPs。
根据本发明的具体实施方式，所述步骤(3)包括：
(3-1)基因组DNA的多重PCR反应；
(3-2)多重PCR反应产物的纯化；
(3-3)经纯化产物的延伸反应；
(3-4)延伸反应产物的纯化；
(3-5)经纯化产物的测序。
具体而言，所述步骤(3-1)包括：
将提取的基因组DNA采用所述引物进行多重PCR反应，以10μL反应体系计包含：1xGC-I buffer(Takara.)，3.0mM Mg2+，0.3mM dNTP，1U HotStarTaq polymerase(QiagenInc.)，1μL 5-10ng/μL基因组DNA和1μL所述多重PCR引物，所述各个引物在体系中的浓度为1-2μM；PCR程序为：95℃2min；94℃20s，65℃40s，72℃1.5min，共11个循环，每个循环降低0.5℃；94℃20s，59℃30s，72℃1.5min，共24个循环；72℃2min，4℃保温。
具体而言，所述步骤(3-2)包括：
在10μL PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37℃温浴1h，然后75℃灭活15min。
具体而言，所述步骤(3-3)包括：
将提取的基因组DNA采用以下延伸引物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应，
rs12721655SR：CGCTCCTCCACACTCCGCT(SEQ ID NO:11)
rs2279343SR：TTTTTTTTTTTTTAGGTAGGTGTCGATGAGGTCC(SEQ ID NO:12)
rs55853698SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACGAGGGCAGACGCAGCAG(SEQ ID NO:13)
rs28399433SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTA(SEQ ID NO:14)
rs3745274SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTGGCGGTAAT GGA(SEQ ID NO:15)
以10μL反应体系计包含：5μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2μL纯化后多重PCR产物，2μL超纯水，1μL延伸引物混合物，所述各个引物在体系中的浓度为0.8-2.4μM；PCR程序为：96℃1min；96℃10s，55℃5s，60℃30s，共28个循环；4℃保温。
具体而言，所述步骤(3-4)包括：
在10μL延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1h，然后75℃灭活15min。
具体而言，所述步骤(3-5)包括：
取0.5μL纯化后的延伸产物，与0.5μLLiz120 SIZE STANDARD、9μL Hi-Di混匀，95℃变性5min后使用ABI3730XL测序仪进行检测。
另一方面，本发明提供一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定装置，所述判定装置包括以下模块：
(1)生理样本采集模块，其设置为从受试者采集生理样本；
(2)基因组DNA提取模块，其设置为从生理样本中提取基因组DNA；
(3)基因分型分析模块，其设置为针对rs12721655、rs2279343、rs28399433、rs3745274和rs55853698这5个SNPs进行基因组DNA的基因分型分析；
(4)计算与成瘾分级模块，包括：
(4A)计算模块，其设置为将基因分型分析结果代入如下计算公式：Y＝6.95+a1+a2+a3+a4+a5，其中Y为烟碱成瘾或易感性的测定分数，a1、a2、a3、a4、a5分别为如下不同SNPs的赋值，
(4B)分级模块，其设置为将得到的Y值按照四舍五入进行受试者的成瘾分级：0-1，非成瘾；2-3，轻度；4-5，中度；>6，重度。
优选地，在本发明提供的预测系统中，受试者为吸烟或者非吸烟受试者。优选地，所述生理样本为唾液。更优选地，所述(1)生理样本采集模块设置为：受试者使用清水漱口，半小时后采集受试者的唾液样本，室温保存。例如，吸烟或者非吸烟受试者使用清水漱口，半小时后使用唾液采集管(内置保护液)采集受试者的唾液样本1mL，室温保存。
优选地，在本发明提供的预测系统中，所述(2)基因组DNA提取模块设置为取决于生理样本采用本领域常规方法进行基因组DNA的提取。例如，在唾液样本的情况下，可采用MGIEasy基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)(华大智造，1000010524)根据所提供的说明书进行唾液样本基因组DNA的提取。
优选地，在本发明提供的预测系统中，所述(3)基因分型分析模块设置为采用如下引物进行基因组DNA的多重PCR反应：
rs12721655：
正向引物rs12721655F：CTGCACCCCAGGTGTGATCTTT(SEQ ID NO:1)
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正向引物rs55853698F：AATAGACCGGACTGGGCCAAAA(SEQ ID NO:9)
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并且对产物进行测序以检测所述SNPs。
根据本发明的具体实施方式，所述(3)基因分型分析模块还设置为，在多重PCR反应之后，还进行PCR产物的延伸反应，再对延伸反应产物进行测序，以检测所述SNPs。
根据本发明的具体实施方式，所述(3)基因分型分析模块设置为执行以下操作：
(3-1)基因组DNA的多重PCR反应；
(3-2)多重PCR反应产物的纯化；
(3-3)经纯化产物的延伸反应；
(3-4)延伸反应产物的纯化；
(3-5)经纯化产物的测序。
具体而言，所述操作(3-1)包括：
将提取的基因组DNA采用所述引物进行多重PCR反应，以10μL反应体系计包含：1xGC-I buffer(Takara.)，3.0mM Mg2+，0.3mM dNTP，1U HotStarTaq polymerase(QiagenInc.)，1μL 5-10ng/μL基因组DNA和1μL所述多重PCR引物，所述各个引物在体系中的浓度为1μM；PCR程序为：95℃2min；94℃20s，65℃40s，72℃1.5min，共11个循环，每个循环降低0.5℃；94℃20s，59℃30s，72℃1.5min，共24个循环；72℃2min，4℃保温。
具体而言，所述操作(3-2)包括：
在10μL PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37℃温浴1h，然后75℃灭活15min。
具体而言，所述操作(3-3)包括：
将提取的基因组DNA采用以下延伸引物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应，
rs12721655SR：CGCTCCTCCACACTCCGCT(SEQ ID NO:11)
rs2279343SR：TTTTTTTTTTTTTAGGTAGGTGTCGATGAGGTCC(SEQ ID NO:12)
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TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTA(SEQ ID NO:14)
rs3745274SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTGGCGGTAAT GGA(SEQ ID NO:15)
以10μL反应体系计包含：5μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2μL纯化后多重PCR产物，2μL超纯水，1μL延伸引物混合物，所述各个引物在体系中的浓度为0.8-2.4μM；PCR程序为：96℃1min；96℃10s，55℃5s，60℃30s，共28个循环；4℃保温。
具体而言，所述操作(3-4)包括：
在10μL延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1h，然后75℃灭活15min。
具体而言，所述操作(3-5)包括：
取0.5μL纯化后的延伸产物，与0.5μL Liz120 SIZE STANDARD、9μL Hi-Di混匀，95℃变性5min后使用ABI3730XL测序仪进行检测。
还一方面，本发明提供一种用于检测烟碱成瘾相关SNPs的引物组，所述引物组包括针对rs12721655、rs2279343、rs28399433、rs3745274和rs55853698这5个SNPs进行多重PCR扩增的引物对。
优选地，所述引物组包括：
rs12721655：
正向引物rs12721655F：CTGCACCCCAGGTGTGATCTTT(SEQ ID NO:1)
反向引物rs12721655R：CTATTCCCGTGCACCTGCATCT(SEQ ID NO:2)
rs2279343：
正向引物rs2279343F：TTACAAAAACCTGCAGGAAATCAATG(SEQ ID NO:3)
反向引物rs2279343R：CCTCCCCTCTCTCCCTGTCTCA(SEQ ID NO:4)
rs28399433：
正向引物rs28399433F：CTGCCAAACAGACATCAAGACCATY(SEQ ID NO:5)
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正向引物rs3745274F：GCTTCTTCCTAGGGGCCCTCAT(SEQ ID NO:7)
反向引物rs3745274R：CCCTGACCTGGCCGAATACAG(SEQ ID NO:8)
rs55853698：
正向引物rs55853698F：AATAGACCGGACTGGGCCAAAA(SEQ ID NO:9)
反向引物rs55853698R：CGACCAGCTGGACCAAGAGC(SEQ ID NO:10)。
根据本发明的具体实施方式，所述引物组还包括对扩增产物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应的延伸引物，所述延伸引物包括：
rs12721655SR：CGCTCCTCCACACTCCGCT(SEQ ID NO:11)
rs2279343SR：TTTTTTTTTTTTTAGGTAGGTGTCGATGAGGTCC(SEQ ID NO:12)
rs55853698SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACGAGGGCAGACGCAGCAG(SEQ ID NO:13)
rs28399433SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTA(SEQ ID NO:14)
rs3745274SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTGGCGGTAATGGA(SEQ ID NO:15)
再一方面，本发明提供一种用于判定烟碱成瘾程度或易感性的试剂盒，所述试剂盒包括本发明提供的用于检测烟碱成瘾相关SNPs的引物组。可选地，所述试剂盒还包括用于使用所述引物组进行PCR扩增的其他试剂，例如缓冲液、dNTP、PCR聚合酶、Mg2+中的一种或多种。
优选地，所述试剂盒在本发明提供的基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法或判定装置中使用。
本发明基于吸烟人群的大量烟碱成瘾相关SNPs多态性与其成瘾程度表型的关联分析，将分析结果应用于烟碱成瘾程度或易感性的模型研究，并进行了模型验证，由此针对最终筛选到的5个烟碱代谢及成瘾相关SNPs建立了一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的预测模型，并相应地提出了一种判定方法、判定系统以及其中使用的试剂。在本发明提供的各个实施方案中，通过针对5个烟碱代谢及成瘾相关SNPs的检测结果，能够检测或预测受试者的烟碱成瘾程度或易感性；并且，进行了模型验证，利用志愿者样本案例研究证明了这种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度检测或易感性预测的可行性。
因此，本发明提供了一种快速、简单且友好的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法，该方法可用于快速、便捷且相对准确地判定吸烟者的成瘾程度或成瘾易感性。所提供的检测结果可以用于综合解析受试者的烟碱依赖程度或易感性，帮助提供个性化吸烟建议，例如对低焦油/烟碱卷烟等烟制品的抽吸选择、每日吸烟量限值、抽烟方式及戒烟建议等。
附图说明
图1为烟碱成瘾分数测定值与模型预测值间的分布图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1 SNPs的选择
(1)位点收集：对烟碱成瘾相关基因多态性位点进行系统全面的文献检索，总计获得与烟碱成瘾相关的SNP位点445个，如表1所示。
表1获得与烟碱成瘾相关的SNP位点
(2)位点筛选：基于各SNP所在基因的功能和外显率及SNP对该基因编码蛋白表达量、结构和功能等方面的影响，及其在亚洲或中国人群中的分布频率，优先选择最小等位基因频率在5％以上的SNP位点，最终筛选到78个SNP，如表2所示。
表2初步筛选到的SNP位点
| 序号 | SNP号 | 序号 | SNP号 | 序号 | SNP号 | 序号 | SNP号 |
| 1 | rs2072660 | 21 | rs4954 | 41 | rs578776 | 61 | rs1799836 |
| 2 | rs3773678 | 22 | rs2779562 | 42 | rs1051730 | 62 | rs4552421 |
| 3 | rs2630349 | 23 | rs2808566 | 43 | rs12914385 | 63 | rs2049045 |
| 4 | rs2630351 | 24 | rs1304100 | 44 | rs6495308 | 64 | rs55853698 |
| 5 | rs167771 | 25 | rs879048 | 45 | rs11072768 | 65 | rs12914008 |
| 6 | rs324032 | 26 | rs4923457 | 46 | rs11638372 | 66 | rs28399468 |
| 7 | rs1967550 | 27 | rs4923460 | 47 | rs3733829 | 67 | rs5031017 |
| 8 | rs6832644 | 28 | rs6265 | 48 | rs8192709 | 68 | rs5031016 |
| 9 | rs4057797 | 29 | rs6484320 | 49 | rs2236196 | 69 | rs1801272 |
| 10 | rs9764 | 30 | rs10502172 | 50 | rs1044397 | 70 | rs4986891 |
| 11 | rs10033119 | 31 | rs1800497 | 51 | rs1044396 | 71 | rs28399433 |
| 12 | rs27072 | 32 | rs6277 | 52 | rs2229959 | 72 | rs34883432 |
| 13 | rs2314378 | 33 | rs1079597 | 53 | rs2273504 | 73 | rs12721655 |
| 14 | rs11575461 | 34 | rs11214613 | 54 | rs2273506 | 74 | rs3745274 |
| 15 | rs10958725 | 35 | rs6589377 | 55 | rs6122429 | 75 | rs45482602 |
| 16 | rs1451240 | 36 | rs2036534 | 56 | rs933271 | 76 | rs2279343 |
| 17 | rs6474412 | 37 | rs2036527 | 57 | rs740603 | 77 | rs3841324 |
| 18 | rs4950 | 38 | rs588765 | 58 | rs4680 | 78 | rs1799732 |
| 19 | rs13280604 | 39 | rs17486278 | 59 | rs174699 | ||
| 20 | rs6474414 | 40 | rs16969968 | 60 | rs1137070 |
(3)样本采集：为了获得有代表性的关联分析结果，从全国7个大区筛选了10个城市，结合统计学要求和各个SNP位点的最小等位基因分布频率，计划采集2000例样本，实际有效样本数1947例，每个受试者采集唾液样本、烟碱依赖性量表和人口学信息。
(4)基因分型：采集的唾液样本提取基因组DNA后，检测候选78个SNP位点的基因型。
(5)关联分析：78个SNP分型数据与成瘾得分之间进行SNP关联分析，获得与烟碱成瘾具有显著相关性的10个SNP位点：rs55853698，rs45482602，rs12721655，rs1801272，rs28399433，rs5031017，rs28399468，rs5031016，rs3745274，rs2279343。
(6)确定SNPs：基于筛选出的SNPs变量，采用普通最小二乘法优化进行线性模型的建立，结合共线性与基于AIC的逐步回归法进行的SNP变量筛选，考虑到模型复杂度和拟合度，最终从中选定变量为以下5个SNP位点：rs12721655、rs2279343、rs28399433、rs3745274、rs55853698，并拟合出烟碱成瘾程度或易感性的模型方程式(见实施例2)。
实施例2预测模型的应用
具体过程如下：
(1)受试者生理样本采集：吸烟或者非吸烟受试者使用清水漱口，半小时后使用唾液采集管(内置保护液)采集受试者的唾液样本1mL，室温保存。
(2)唾液样本基因组DNA的提取：采用MGIEasy基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)(华大智造，1000010524)根据所提供的说明书进行唾液样本基因组DNA的提取。
(3)基因分型检测方法：
1)DNA样本取1μL 1％agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μL。
2)多重PCR反应：
a)针对5个SNPs设计PCR引物
rs3745274F：
GCTTCTTCCTAGGGGCCCTCAT
rs3745274R：
CCCTGACCTGGCCGAATACAG
rs2279343F：
TTACAAAAACCTGCAGGAAATCAATG
rs2279343R：
CCTCCCCTCTCTCCCTGTCTCA
rs28399433F：
CTGCCAAACAGACATCAAGACCATY
rs28399433R：
AGGATTCATGGTGGGGCATGTAG
rs55853698F：
AATAGACCGGACTGGGCCAAAA
rs55853698R：
CGACCAGCTGGACCAAGAGC
rs12721655F：
CTGCACCCCAGGTGTGATCTTT
rs12721655R：
CTATTCCCGTGCACCTGCATCT
b)PCR条件
反应体系(10μL)包含1x GC-I buffer(Takara.)，3.0mM Mg2+，0.3mM dNTP，1UHotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，1μL样本DNA和1μL多重PCR引物。多重PCR引物中各对引物的浓度为：
rs12721655F/R：1μM；
rs2279343F/R：2μM；
rs28399433F/R：1μM；
rs3745274F/R：1μM；
rs55853698F/R：1μM。
PCR循环程序
以下参照“ABI PRISM SNaPshot Multipelx Kit”Protocol
3)PCR产物纯化：
在10μL PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37℃温浴1小时，然后75℃灭活15min。
4)SNaPshot多重单碱基延伸反应：
a)延伸引物
rs12721655SR：
CGCTCCTCCACACTCCGCT
rs2279343SR：
TTTTTTTTTTTTTAGGTAGGTGTCGATGAGGTCC
rs55853698SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACGAGGGCAGACGCAGCAG
rs28399433SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTA
rs3745274SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTGGCGGTAATGGA
b)延伸反应
延伸反应体系(10μL)包括5μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI),2μL纯化后多重PCR产物，1μL延伸引物混合物，2μL超纯水。各条延伸引物的浓度：
rs12721655SR：0.8μM；
rs55853698SR：2.4μM；
rs2279343SR：2.4μM；
rs28399433SR：0.8μM；
rs3745274SR：1.6μM。
反应程序
5)延伸产物纯化：
在10μL延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1小时，然后75℃灭活15min。
(4)测序仪测序：
取0.5μL纯化后的延伸产物，与0.5μLLiz120 SIZE STANDARD、9μL Hi-Di混匀，95℃变性5min后上ABI3730XL测序仪。ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co.,Ltd.,USA)来分析，获得分型结果。
(5)烟碱成瘾程度或易感性判定：
根据5种SNP变量检测结果，结合模型优化评估最终参数如下：Y＝6.95+a1(rs12721655)+a2(rs2279343)+a3(rs28399433)+a4(rs3745274)+a5(rs55853698)。其中Y，烟碱成瘾或易感性的测定分数，a1、a2、a3、a4、a5分别为不同SNPs的赋值。根据基因分型检测结果，计算受试者的成瘾得分，0-1非成瘾，2-3轻度，4-5中度，>6重度(见表3)，最终结果按照四舍五入进行分级划分。
表3烟碱成瘾相关SNPs优化评估赋值
实施例3模型稳定性与预测效果验证
为验证模型稳定性与预测效果，随机选取20％的数据作为验证集，80％作为训练集。模型的建立基于80％的训练数据并对各涉及变量的参数进行评估。在模型建立后，基于20％的验证数据对模型预测效果进行评估。模型在训练数据解释方面达到R2＝0.14，在预测数据上预测R2＝0.1。具体实测值与预测值的分布见图1。
根据烟碱成瘾分级，将观测得分值和预测值都进行分级。在各成瘾程度内，比较观测与预测值之间的关系。具体信息见表4(80％样本用来建模预测，20％样本用来模型验证)。
表4预测数据集内成瘾等级观测及预测分类数量及预测各级预测准确度
备注：成瘾分级：0-1非成瘾，2-3轻度，4-5中度，>6重度。
实施例4志愿者预测与判定结果验证
选择吸烟成瘾性志愿者共6名(#1，#2，#3，#4，#5，#6)，使用烟碱依赖量表DSM判断各自的成瘾等级。
进行这些志愿者的5个SNPs的分型检测，将检测结果按照不同SNPs结果带入Y＝6.95+a1(rs12721655)+a2(rs2279343)+a3(rs28399433)+a4(rs3745274)+a5(rs55853698)，计算其各自的烟碱成瘾或易感性测定分数，结果如表5所示。
表5：6名志愿者烟碱等级预测得分与其判定结果
结果表明，基于预测模型的判定结果与使用烟碱依赖量表DSM判定的结果一致，可见该判定方法是一种可靠的烟碱成瘾程度检测或易感性预测方法。
总之，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110> 国家烟草质量监督检验中心
<120> 一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法
<130> LC21110063
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 1
ctgcacccca ggtgtgatct tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 2
ctattcccgt gcacctgcat ct 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 3
ttacaaaaac ctgcaggaaa tcaatg 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 4
cctcccctct ctccctgtct ca 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 5
ctgccaaaca gacatcaaga ccaty 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 6
aggattcatg gtggggcatg tag 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 7
gcttcttcct aggggccctc at 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 8
ccctgacctg gccgaataca g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 9
aatagaccgg actgggccaa aa 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 10
cgaccagctg gaccaagagc 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 11
cgctcctcca cactccgct 19
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 12
tttttttttt tttaggtagg tgtcgatgag gtcc 34
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 13
tttttttttt tttttttttt tttacgaggg cagacgcagc ag 42
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 14
tttttttttt tttttttttt ttcatccctc tttttcaggc agta 44
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物(primer)
<400> 15
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttgatgtt ggcggtaatg ga 52
Claims (10)
1.一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法，所述判定方法包括以下步骤：
(1)从受试者采集生理样本；
(2)从所述生理样本中提取基因组DNA；
(3)针对rs12721655、rs2279343、rs28399433、rs3745274和rs55853698这5个SNPs进行基因组DNA的基因分型分析；
(4)将基因分型分析结果代入如下计算公式：Y＝6.95+a1+a2+a3+a4+a5，其中Y为烟碱成瘾或易感性的测定分数，a1、a2、a3、a4、a5分别为如下不同SNPs的赋值，
将得到的Y值按照四舍五入进行受试者的成瘾分级：0-1，非成瘾；2-3，轻度；4-5，中度；>6，重度。
2.根据权利要求1所述的预测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述受试者为吸烟或者非吸烟受试者；
优选地，所述生理样本为受试者的唾液。
3.根据权利要求1或2所述的判定方法，其特征在于，所述步骤(3)包括采用如下引物进行基因组DNA的多重PCR反应：
rs12721655：
正向引物rs12721655F：CTGCACCCCAGGTGTGATCTTT(SEQ ID NO:1)
反向引物rs12721655R：CTATTCCCGTGCACCTGCATCT(SEQ ID NO:2)
rs2279343：
正向引物rs2279343F：TTACAAAAACCTGCAGGAAATCAATG(SEQ ID NO:3)
反向引物rs2279343R：CCTCCCCTCTCTCCCTGTCTCA(SEQ ID NO:4)
rs28399433：
正向引物rs28399433F：CTGCCAAACAGACATCAAGACCATY(SEQ ID NO:5)
反向引物rs28399433R：AGGATTCATGGTGGGGCATGTAG(SEQ ID NO:6)
rs3745274：
正向引物rs3745274F：GCTTCTTCCTAGGGGCCCTCAT(SEQ ID NO:7)
反向引物rs3745274R：CCCTGACCTGGCCGAATACAG(SEQ ID NO:8)
rs55853698：
正向引物rs55853698F：AATAGACCGGACTGGGCCAAAA(SEQ ID NO:9)
反向引物rs55853698R：CGACCAGCTGGACCAAGAGC(SEQ ID NO:10)
并且对产物进行测序以检测所述SNPs。
4.一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定装置，所述判定装置包括以下模块：
(1)生理样本采集模块，其设置为从受试者采集生理样本；
(2)基因组DNA提取模块，其设置为从生理样本中提取基因组DNA；
(3)基因分型分析模块，其设置为针对rs12721655、rs2279343、rs28399433、rs3745274和rs55853698这5个SNPs进行基因组DNA的基因分型分析；
(4)计算与成瘾分级模块，包括：
(4A)计算模块，其设置为将基因分型分析结果代入如下计算公式：Y＝6.95+a1+a2+a3+a4+a5，其中Y为烟碱成瘾或易感性的测定分数，a1、a2、a3、a4、a5分别为如下不同SNPs的赋值，
(4B)分级模块，其设置为将得到的Y值按照四舍五入进行受试者的成瘾分级：0-1，非成瘾；2-3，轻度；4-5，中度；>6，重度。
5.根据权利要求4所述的预测系统，其特征在于，所述受试者为吸烟或者非吸烟受试者；
优选地，所述生理样本为唾液。
6.根据权利要求4或5所述的预测系统，其特征在于，所述(3)基因分型分析模块设置为采用如下引物进行基因组DNA的多重PCR反应：
rs12721655：
正向引物rs12721655F：CTGCACCCCAGGTGTGATCTTT(SEQ ID NO:1)
反向引物rs12721655R：CTATTCCCGTGCACCTGCATCT(SEQ ID NO:2)
rs2279343：
正向引物rs2279343F：TTACAAAAACCTGCAGGAAATCAATG(SEQ ID NO:3)
反向引物rs2279343R：CCTCCCCTCTCTCCCTGTCTCA(SEQ ID NO:4)
rs28399433：
正向引物rs28399433F：CTGCCAAACAGACATCAAGACCATY(SEQ ID NO:5)
反向引物rs28399433R：AGGATTCATGGTGGGGCATGTAG(SEQ ID NO:6)
rs3745274：
正向引物rs3745274F：GCTTCTTCCTAGGGGCCCTCAT(SEQ ID NO:7)
反向引物rs3745274R：CCCTGACCTGGCCGAATACAG(SEQ ID NO:8)
rs55853698：
正向引物rs55853698F：AATAGACCGGACTGGGCCAAAA(SEQ ID NO:9)
反向引物rs55853698R：CGACCAGCTGGACCAAGAGC(SEQ ID NO:10)
并且对产物进行测序以检测所述SNPs。
7.一种用于检测烟碱成瘾相关SNPs的引物组，所述引物组包括针对rs12721655、rs2279343、rs28399433、rs3745274和rs55853698这5个SNPs进行多重PCR扩增的引物对。
8.根据权利要求7所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
rs12721655：
正向引物rs12721655F：CTGCACCCCAGGTGTGATCTTT(SEQ ID NO:1)
反向引物rs12721655R：CTATTCCCGTGCACCTGCATCT(SEQ ID NO:2)
rs2279343：
正向引物rs2279343F：TTACAAAAACCTGCAGGAAATCAATG(SEQ ID NO:3)
反向引物rs2279343R：CCTCCCCTCTCTCCCTGTCTCA(SEQ ID NO:4)
rs28399433：
正向引物rs28399433F：CTGCCAAACAGACATCAAGACCATY(SEQ ID NO:5)
反向引物rs28399433R：AGGATTCATGGTGGGGCATGTAG(SEQ ID NO:6)
rs3745274：
正向引物rs3745274F：GCTTCTTCCTAGGGGCCCTCAT(SEQ ID NO:7)
反向引物rs3745274R：CCCTGACCTGGCCGAATACAG(SEQ ID NO:8)
rs55853698：
正向引物rs55853698F：AATAGACCGGACTGGGCCAAAA(SEQ ID NO:9)
反向引物rs55853698R：CGACCAGCTGGACCAAGAGC(SEQ ID NO:10)。
9.一种用于判定烟碱成瘾程度或易感性的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求7或8所述的引物组。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于使用所述引物组进行PCR扩增的其他试剂，例如缓冲液、dNTP、PCR聚合酶、Mg2+中的一种或多种。
Priority Applications (1)
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- 2021-11-12 CN CN202111340633.3A patent/CN114277118A/zh active Pending
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