CN104164427A - 一种与吸烟成瘾相关的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及健康教育领域，公开了一种与吸烟成瘾相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153等25个SNP的组合。该标志物可用于制备吸烟成瘾相关的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及健康教育领域，涉及吸烟成瘾筛查相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
烟草使用是导致全球可预防死亡的首要死因。大量研究证实，烟草危害人体的许多器官，可导致肺癌、冠心病、脑卒中等多种疾病的发生和死亡，同时也会减少期望寿命，降低生活质量。2011年世界卫生组织全球烟草流行报告指出，每年因烟草使用致全球近600万人死亡并造成数千亿元的经济损失；如果当前的趋势继续下去，到2030年时，全世界每年因烟草导致的死亡将超过800万人。我国是全世界最大的烟草生产国和消费国，吸烟对人民群众健康的影响尤为严重。根据2012年卫生部发布的《中国吸烟危害健康报告》，我国吸烟人群逾3亿，另有约7.4亿不吸烟人群遭受二手烟的危害；每年因吸烟相关疾病所致死亡人数超过100万，如对吸烟流行状况不加以控制，至2050年每年死亡人数将突破300万。由此可见，烟草使用严重威胁全球及我国居民的生命和健康，是亟待解决的重大公共卫生问题。
世界卫生组织指出，烟草依赖是一种慢性成瘾性疾病，嗜烟者实际上是病人。许多吸烟者知道吸烟的危害，并有意愿戒烟，但因烟草依赖而不能控制吸烟行为。双生子研究显示，遗传因素在烟草依赖的发生中扮演着重要角色。近年来，多个GWAS研究发现在高加索人群中15q25.1区域的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)与烟草依赖有关。
SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境因素、药物治疗等因素的不同反应性，因此SNP可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。近年来，针对肿瘤和心血管疾病等常见重大疾病的SNP研究已经成为临床和科研工作者的研究热点。
然而，目前还没有将SNP应用于评价吸烟成瘾的报道，若能筛选出与吸烟成瘾相关的SNP作为生物标志物，并研制相应的试剂盒，对我国吸烟成瘾的评价及烟草使用的控制必将是一次有力的推动，也为戒烟药物的筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与吸烟成瘾相关的SNP标志物。
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物在制备吸烟成瘾相关试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供吸烟成瘾相关的试剂盒。
发明人通过分离和研究吸烟人群及与其年龄、性别匹配的不吸烟对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与吸烟成瘾相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的吸烟成瘾相关试剂盒，为吸烟成瘾的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型戒烟小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与吸烟成瘾相关的SNP标志物，该标志物为rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399和rs998454的组合。
所述的SNP标志物的特异性扩增引物，该引物为：
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所述的SNP标志物的特异性延伸引物，该引物为：
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所述的SNP标志物在制备吸烟成瘾辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性引物在制备吸烟成瘾辅助诊断试剂盒中的应用。
一种吸烟成瘾辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399和rs998454。
所述的吸烟成瘾辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。
所述的吸烟成瘾辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性扩增引物为：
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所述的吸烟成瘾辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性延伸引物为：
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所述吸烟成瘾相关试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择吸烟人群及与其年龄、性别匹配的不吸烟对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与吸烟成瘾相关的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平台进行检测，验证其应用于临床诊断的可重复性。(4)吸烟成瘾相关试剂盒的研制：根据吸烟人群和不吸烟对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP相关的试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描，SequenomMassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)通过问卷调查确定的吸烟人群；
(2)与吸烟人群年龄、性别匹配的不吸烟对照；
本研究共采用4268例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Affymetrix6.0芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在Affymetrix6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；
(3)检测并比较各基因型在吸烟人群与不吸烟对照中的分布差异。
4.单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计单个SNP的特异性引物；
(3)进行PCR反应；
(4)检测并比较吸烟人群与不吸烟对照中不同基因型的分布差异。
5.吸烟成瘾相关试剂盒的制备方法
Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定吸烟人群与不吸烟对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为评价吸烟成瘾的指标。最后筛选出的与吸烟成瘾有关的SNP组成相应试剂盒(rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399和rs998454)。试剂可以包括这些SNP的特异性引物和Taq酶、dNTP等。
6.统计分析方法
运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这25个SNP构成的综合指征用于早期评价吸烟成瘾的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与吸烟成瘾的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.39×rs10795690的评分)+(0.40×rs11205276的评分)+(0.41×rs11258964的评分)+(0.37×rs11742916的评分)+(-0.32×rs11757917的评分)+(0.40×rs11858823的评分)+(-0.33×rs11996459的评分)+(0.26×rs1582931的评分)+(0.43×rs166402的评分)+(0.49×rs17636179的评分)+(0.41×rs17646672的评分)+(-0.35×rs2060247的评分)+(0.45×rs2289958的评分)+(0.35×rs2960067的评分)+(-0.64×rs4015379的评分)+(0.46×rs4672335的评分)+(0.43×rs5752676的评分)+(0.45×rs6016431的评分)+(-0.29×rs6717249的评分)+(-0.48×rs6749212的评分)+(0.40×rs7046153的评分)+(0.26×rs7246302的评分)+(0.34×rs8045566的评分)+(-0.30×rs855399的评分)+(0.29×rs998454的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的2190例样本中。(以rs10795690为例：0.39为rs10795690的回归系数(见表1)；rs10795690的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些个SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
在上述912例吸烟人群及1278例不吸烟对照中，两组年龄、性别均衡可比。我们将这两组人群经Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。
根据Affymetrix6.0芯片检测，本发明人检测到在“吸烟人群”组和“不吸烟对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399和rs998454。
根据上述检测结果，我们将这25个与吸烟成瘾相关的SNP在另外1020例吸烟人群和与其年龄、性别匹配的1058例不吸烟对照中进行了单个SNP的检测，结果与芯片检测一致。
单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这25个SNP与吸烟成瘾存在着显著关联。
进一步分析这25个SNP的组合用于评价吸烟成瘾的效果，发现其组合能够很好地区分吸烟与不吸烟。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于评价吸烟成瘾的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言，这25个SNP的组合，或者这25个SNP的特异性引物的组合构成的相关试剂盒有助于评价吸烟成瘾，为医护人员或吸烟者自身快速准确掌握烟草依赖的状态和严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的SNP标志物作为评价吸烟成瘾的标志物的优越性在于：
(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为吸烟成瘾的评价和诊断开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于评价吸烟成瘾的状态，有助于反映吸烟者烟草依赖的严重程度，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱，并应用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和相关试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄、性别等影响因素，研究SNP在吸烟成瘾评价的应用前景，阐述SNP对于吸烟成瘾进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了吸烟成瘾相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和相关试剂盒的研制和应用，可使得吸烟成瘾的评价和诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握吸烟者烟草依赖的状态和严重程度，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全基因组关联研究吸烟组和不吸烟对照组的ROC曲线。
显示吸烟组对不吸烟对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2005月4月开始至2011年12月从江苏地区收集了大量的血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了4268例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：
1、通过问卷调查确定的吸烟人群；
2、与吸烟人群年龄、性别匹配的不吸烟对照；
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描
在上述符合条件的912例吸烟人群和1278例不吸烟对照中，两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Affymetrix6.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、在Affymetrix6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；
9、数据分析与处理：在“吸烟人群”组和“不吸烟对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1.病例组与对照组全基因组关联分析结果
实施例3单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型
将上述全基因组扫描发现与吸烟成瘾有关的SNP在另外1020吸烟人群和1058不吸烟对照中进行检测，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行Sequenom MassARRAY基因分型：
1)使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件对全基因组扫描发现的25个阳性关联的SNP设计PCR扩增引物及单碱基延伸引物(表2)。反应体系包括4μl Sequenom MassARRAY基因分型PCR mastermix(Hotstar Taq0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs，1.9μl双蒸水)，加入1μl DNA。仪器使用的是Sequenom MassARRAYNanodispenser，PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。
2)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
3)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系包括：2μl EXTENDMix(单碱基延伸反应液，包括其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)，7μl SAP处理后PCR产物。PCR反应条件：I.94℃30秒；II.94℃5秒；III.52℃5秒；IV.80℃5秒；V.重复III、IV4个循环；VI.重复II、III、IV、V39个循环；VII.72℃3分钟；VIII.4℃保持。
4)树脂纯化：
(1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；
(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内；
(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；
(4)离心使树脂沉入孔底部。
5)芯片点样：启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
6)质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
9、基因型判读：采用TYPER4.0软件(sequenom)进行。
10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，结果与全基因组扫描类似不再列出。
实施例4利用危险度评分方法进一步分析SNP与吸烟成瘾
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“吸烟人群组”和“不吸烟对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评价诊断的灵敏性和特异性，进而诊断这些SNP对吸烟成瘾的判断能力。对25个SNP标志物的联合分析发现，这25个SNP以71.0％的AUC将吸烟组和不吸烟组分开，最佳临界点的灵敏度为63.4％，特异度为70.1％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399和rs998454的组合能够很好地将吸烟人群和不吸烟对照区分。
实施例5吸烟成瘾相关SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和SequenomMassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性引物(包括下列特异性扩增引物：rs10795690的引物序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2；rs11205276的引物序列为SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；rs11258964的引物序列为SEQ ID No：7、SEQ IDNo：8；rs11742916的引物序列为SEQ ID No：10、SEQ ID No：11；rs11757917的引物序列为SEQ ID No：13、SEQ ID No：14；rs11858823的引物序列为SEQ ID No：16、SEQ ID No：17；rs11996459的引物序列为SEQ ID No：19、SEQ ID No：20；rs1582931的引物序列为SEQ ID No：22、SEQ ID No：23；rs166402的引物序列为SEQ ID No：25、SEQ ID No：26；rs17636179的引物序列为SEQ ID No：28、SEQ ID No：29；rs17646672的引物序列为SEQ ID No：31、SEQ ID No：32；rs2060247的引物序列为SEQ ID No：34、SEQ ID No：35；rs2289958的引物序列为SEQ ID No：37、SEQ ID No：38；rs2960067的引物序列为SEQ ID No：40、SEQ ID No：41；rs4015379的引物序列为SEQ ID No：43、SEQ ID No：44；rs4672335的引物序列为SEQ ID No：46、SEQ ID No：47；rs5752676的引物序列为SEQ ID No：49、SEQ ID No：50；rs6016431的引物序列为SEQ ID No：52、SEQ ID No：53；rs6717249的引物序列为SEQ ID No：55、SEQ ID No：56；rs6749212的引物序列为SEQ ID No：58、SEQ ID No：59；rs7046153的引物序列为SEQ ID No：61、SEQ ID No：62；rs7246302的引物序列为SEQ ID No：64、SEQ ID No：65；rs8045566的引物序列为SEQ ID No：67、SEQ ID No：68；rs855399的引物序列为SEQ ID No：70、SEQ ID No：71；rs998454的引物序列为SEQ ID No：73、SEQ ID No：74。和/或特异性延伸引物为：rs10795690的引物序列为SEQ ID NO：3；rs11205276的引物序列为SEQ ID NO：6；rs11258964的引物序列为SEQ ID NO：9；rs11742916的引物序列为SEQ ID NO：12；rs11757917的引物序列为SEQ ID NO：15；rs11858823的引物序列为SEQ ID NO：18；rs11996459的引物序列为SEQ ID NO：21；rs1582931的引物序列为SEQ ID NO：24；rs166402的引物序列为SEQ ID NO：27；rs17636179的引物序列为SEQ ID NO：30；rs17646672的引物序列为SEQ ID NO：33；rs2060247的引物序列为SEQ ID NO：36；rs2289958的引物序列为SEQ ID NO：39；rs2960067的引物序列为SEQID NO：42；rs4015379的引物序列为SEQ ID NO：45；rs4672335的引物序列为SEQ IDNO：48；rs5752676的引物序列为SEQ ID NO：51；rs6016431的引物序列为SEQ ID NO：54；rs6717249的引物序列为SEQ ID NO：57；rs6749212的引物序列为SEQ ID NO：60；rs7046153的引物序列为SEQ ID NO：63；rs7246302的引物序列为SEQ ID NO：66；rs8045566的引物序列为SEQ ID NO：69；rs855399的引物序列为SEQ ID NO：72；rs998454的引物序列为SEQ ID NO：75)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱评价和辅助诊断吸烟成瘾，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关SNP引物
F：Forward Primer，上游引物；R：Reverse Primer，下游引物；E：Extended Primer，延伸引物。
Claims (9)
1.一种与吸烟成瘾相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399和rs998454的组合。
2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为：
rs10795690的引物序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2；
rs11205276的引物序列为SEQ ID No：4、SEQ ID No：5；
rs11258964的引物序列为SEQ ID No：7、SEQ ID No：8；
rs11742916的引物序列为SEQ ID No：10、SEQ ID No：11；
rs11757917的引物序列为SEQ ID No：13、SEQ ID No：14；
rs11858823的引物序列为SEQ ID No：16、SEQ ID No：17；
rs11996459的引物序列为SEQ ID No：19、SEQ ID No：20；
rs1582931的引物序列为SEQ ID No：22、SEQ ID No：23；
rs166402的引物序列为SEQ ID No：25、SEQ ID No：26；
rs17636179的引物序列为SEQ ID No：28、SEQ ID No：29；
rs17646672的引物序列为SEQ ID No：31、SEQ ID No：32；
rs2060247的引物序列为SEQ ID No：34、SEQ ID No：35；
rs2289958的引物序列为SEQ ID No：37、SEQ ID No：38；
rs2960067的引物序列为SEQ ID No：40、SEQ ID No：41；
rs4015379的引物序列为SEQ ID No：43、SEQ ID No：44；
rs4672335的引物序列为SEQ ID No：46、SEQ ID No：47；
rs5752676的引物序列为SEQ ID No：49、SEQ ID No：50；
rs6016431的引物序列为SEQ ID No：52、SEQ ID No：53；
rs6717249的引物序列为SEQ ID No：55、SEQ ID No：56；
rs6749212的引物序列为SEQ ID No：58、SEQ ID No：59；
rs7046153的引物序列为SEQ ID No：61、SEQ ID No：62；
rs7246302的引物序列为SEQ ID No：64、SEQ ID No：65；
rs8045566的引物序列为SEQ ID No：67、SEQ ID No：68；
rs855399的引物序列为SEQ ID No：70、SEQ ID No：71；
rs998454的引物序列为SEQ ID No：73、SEQ ID No：74。
3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为：
rs10795690的引物序列为SEQ ID NO：3；
rs11205276的引物序列为SEQ ID NO：6；
rs11258964的引物序列为SEQ ID NO：9；
rs11742916的引物序列为SEQ ID NO：12；
rs11757917的引物序列为SEQ ID NO：15；
rs11858823的引物序列为SEQ ID NO：18；
rs11996459的引物序列为SEQ ID NO：21；
rs1582931的引物序列为SEQ ID NO：24；
rs166402的引物序列为SEQ ID NO：27；
rs17636179的引物序列为SEQ ID NO：30；
rs17646672的引物序列为SEQ ID NO：33；
rs2060247的引物序列为SEQ ID NO：36；
rs2289958的引物序列为SEQ ID NO：39；
rs2960067的引物序列为SEQ ID NO：42；
rs4015379的引物序列为SEQ ID NO：45；
rs4672335的引物序列为SEQ ID NO：48；
rs5752676的引物序列为SEQ ID NO：51；
rs6016431的引物序列为SEQ ID NO：54；
rs6717249的引物序列为SEQ ID NO：57；
rs6749212的引物序列为SEQ ID NO：60；
rs7046153的引物序列为SEQ ID NO：63；
rs7246302的引物序列为SEQ ID NO：66；
rs8045566的引物序列为SEQ ID NO：69；
rs855399的引物序列为SEQ ID NO：72；
rs998454的引物序列为SEQ ID NO：75。
4.权利要求1所述的SNP标志物在制备吸烟成瘾辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备吸烟成瘾辅助诊断试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的SNP标志物的特异性延伸引物在制备吸烟成瘾辅助诊断试剂盒中的应用。
7.一种吸烟成瘾辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs10795690、rs11205276、rs11258964、rs11742916、rs11757917、rs11858823、rs11996459、rs1582931、rs166402、rs17636179、rs17646672、rs2060247、rs2289958、rs2960067、rs4015379、rs4672335、rs5752676、rs6016431、rs6717249、rs6749212、rs7046153、rs7246302、rs8045566、rs855399和rs998454。
8.根据权利要求7所述的吸烟成瘾辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述SNP标志物的特异性扩增引物和/或权利要求2所述SNP标志物的特异性延伸引物。
9.根据权利要求7或8所述吸烟成瘾辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CAPORASO N, GU F, CHATTERJEE N, SHENG-CHIH J, YU K, ET AL.: "Genome-Wide and Candidate Gene Association Study of Cigarette Smoking Behaviors", 《PLOS ONE》 * |
| GRANT R. ZIMMERMANN，ET AL: "Molecular interactions and metal binding in the theophylline-binding core of an RNA aptamer", 《RNA》 * |
| SCOTT F. SACCONE，ET AL: "Cholinergic Nicotinic Receptor Genes Implicated in a Nicotine Dependence Association Study Targeting 348 Candidate Genes with 3,713 SNPs", 《HMG ADVANCE ACCESS》 * |
| 张岚等: "在中国人群中45个基因与尼古丁依赖的关联研究", 《中国药物依赖性杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277118A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-04-05 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种基于烟碱成瘾相关SNPs的烟碱成瘾程度或易感性的判定方法 |
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