CN104263823B - 一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 - Google Patents
一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104263823B CN104263823B CN201410469997.5A CN201410469997A CN104263823B CN 104263823 B CN104263823 B CN 104263823B CN 201410469997 A CN201410469997 A CN 201410469997A CN 104263823 B CN104263823 B CN 104263823B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- primer sequence
- primer
- sequence
- gastric cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。该标志物为rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659等52个低频SNV的组合。该标志物可用于制备胃癌辅助诊断试剂盒。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康重大疾病之一。据世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)最新估计，每年全球新发癌症病例达1200余万，约700万人死于恶性肿瘤。胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织(WHO)估计，2012年全球范围内大约63万胃癌新发病例，占全部肿瘤发病的8.5％，仅次于肺癌、前列腺癌和结直肠癌。在我国，恶性肿瘤是仅次于心血管疾病的第二大死因，其中胃癌死亡率仅次于肺癌居我国恶性肿瘤第二位，每年46.4万人死于胃癌，约占全球胃癌死亡人数的47％。在我国，胃癌年龄标化发病率为22.7/10万，仅次于肺癌。尽管在全球范围内胃癌的发病率及死亡率均处于下降趋势，而我国仍处于较高发病的及死亡水平。随着人口基数的不断增大和胃癌期望寿命的延长，胃癌患病和死亡人数，将在未来相当长一段时期内给我国带来严重的负担，依旧是肿瘤预防及控制的重点。
恶性肿瘤是一种慢性复杂性疾病，是环境和遗传因素长期共同作用的结果。双生子研究表明，遗传因素在胃癌等恶性肿瘤的发生中扮演极其重要角色。胃癌的形成是一个多因素、多阶段、复杂的过程，从慢性萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生等癌前病变最终进展为胃癌。不过目前其确切发病机制还不是很清楚。在环境暴露诱导下，遗传因素将在一定程度上决定个体对肿瘤的易感程度。幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori)感染已经在1994年被世界卫生组织(WHO)确认为一级致癌物，是胃癌明确的危险因素之一。然而，相同的环境危险因素暴露下仅有少数个体最终发展为胃癌，这说明不同个体对环境暴露的反应存在不同的易感性，这种易感性目前认为是由个体的遗传因素所决定。例如，全球人群的Helicobacter Pylori感染率大约在40％-80％，但其中只有1％的Helicobacter Pylori感染患者进而发展为胃癌，这说明遗传因素在胃癌的发生发展中起了重要作用。低频高外显性遗传标志物是指较小等位基因频率(MAF)小于0.05的遗传变异。遗传变异的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对环境暴露、药物治疗等因素的不同反应，因此可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。
目前，胃癌初步诊断的方法主要包括病史询问、体格检查、实验室检查、胃肠X线检查、纤维内窥镜检查、脱落细胞学检查、B超以及CT检查、肿瘤标记物检测等。鉴别诊断主要依靠X线钡餐造影、胃镜和活组织病理检查。但是现在临床常用的X线钡餐造影和纤维内窥镜检查存在一些弊端。X线钡餐造影难以发现，或难以肯定局部粘膜上较小的肿瘤；检查存在一定的盲区，可能会漏掉一些小的病变；不能确定病变的性质，可能存在假阳性或假阴性。纤维内窥镜检查对胃壁整体蠕动情况及胃的形态观察欠完整；对肿瘤的浸润深度、有无转移了解不清；对外压性肿物还是胃壁内肿物难以区别。目前临床所用胃癌标志物的特异性不强，血清癌胚抗原(CEA)对诊断意义不大，虽半数患者的胃液中CEA有明显升高，超过100ng/ml，但也与慢性萎缩性胃炎的胃液中含量有重叠。病理活组织检查作为胃癌诊断的金标准，在临床胃癌确诊中居于重要地位，但由于需要做胃镜取尾部组织，不适宜作为临床健康筛查的手段。
通过疾病易感的遗传标志物来诊断疾病的发生，灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景。近年来，疾病遗传标志物已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病的应用价值已初见端倪。
然而，目前还没有将低频高外显性遗传标志物应用于胃癌诊断的报道，若能筛选出胃癌易感的低频高外显性遗传变异作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国胃癌诊断现状将会是个有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。
本发明的第二个目的是提供上述遗传标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述遗传标志物及其特异性引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供胃癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究胃癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与胃癌高度相关的高特异性和敏感性的低频高外显性遗传标志物，并研制出可便于临床应用的胃癌辅助诊断试剂盒，为胃癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物，该标志物为rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659，rs147031025，rs200847762，rs78373056，rs3739757，rs679882，rs141615048，rs146021011，rs7769051，rs201854588，rs41302077，rs11571707，rs78738447，rs79153019，rs35511555，rs190646764，rs76685516，rs61752940，rs190958876，rs9475487，rs80358282，rs2305985，rs201287330，rs188551104，rs202172344，rs11564258，rs2242527，rs1052690，rs117207261，rs140636259，rs2305710，rs61978639，rs3130257，rs34908836，和rs56229136的组合。
所述的遗传标志物的特异性扩增引物，该引物为：
rs3827760的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；
rs11570112的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；
rs201130283的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；
rs201477597的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；
rs1264429的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；
rs143989805的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；
rs147592698的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；
rs41269281的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；
rs17217280的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；
rs191127702的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；
rs2793086的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；
rs6446315的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；
rs111909699的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；
rs142508708的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；
rs3733782的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；
rs138921247的引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；
rs45611935的引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；
rs35683659的引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；
rs147031025的引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56；
rs200847762的引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；
rs78373056的引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62；
rs3739757的引物序列为SEQ ID No:64和SEQ ID No:65；
rs679882的引物序列为SEQ ID No:67和SEQ ID No:68；
rs141615048的引物序列为SEQ ID No:70和SEQ ID No:71；
rs146021011的引物序列为SEQ ID No:73和SEQ ID No:74；
rs7769051的引物序列为SEQ ID No:76和SEQ ID No:77；
rs201854588的引物序列为SEQ ID No:79和SEQ ID No:80；
rs41302077的引物序列为SEQ ID No:82和SEQ ID No:83；
rs11571707的引物序列为SEQ ID No:85和SEQ ID No:86；
rs78738447的引物序列为SEQ ID No:88和SEQ ID No:89；
rs79153019的引物序列为SEQ ID No:91和SEQ ID No:92；
rs35511555的引物序列为SEQ ID No:94和SEQ ID No:95；
rs190646764的引物序列为SEQ ID No:97和SEQ ID No:98；
rs76685516的引物序列为SEQ ID No:100和SEQ ID No:101；
rs61752940的引物序列为SEQ ID No:103和SEQ ID No:104；
rs190958876的引物序列为SEQ ID No:106和SEQ ID No:107；
rs9475487的引物序列为SEQ ID No:109和SEQ ID No:110；
rs80358282的引物序列为SEQ ID No:112和SEQ ID No:113；
rs2305985的引物序列为SEQ ID No:115和SEQ ID No:116；
rs201287330的引物序列为SEQ ID No:118和SEQ ID No:119；
rs188551104的引物序列为SEQ ID No:121和SEQ ID No:122；
rs202172344的引物序列为SEQ ID No:124和SEQ ID No:125；
rs11564258的引物序列为SEQ ID No:127和SEQ ID No:128；
rs2242527的引物序列为SEQ ID No:130和SEQ ID No:131；
rs1052690的引物序列为SEQ ID No:133和SEQ ID No:134；
rs117207261的引物序列为SEQ ID No:136和SEQ ID No:137；
rs140636259的引物序列为SEQ ID No:139和SEQ ID No:140；
rs2305710的引物序列为SEQ ID No:142和SEQ ID No:143；
rs61978639的引物序列为SEQ ID No:145和SEQ ID No:146；
rs3130257的引物序列为SEQ ID No:148和SEQ ID No:149；
rs34908836的引物序列为SEQ ID No:151和SEQ ID No:152；
rs56229136的引物序列为SEQ ID No:154和SEQ ID No:155。
所述的遗传标志物的特异性延伸引物，该引物为：
rs3827760的引物序列为SEQ ID No:3；rs11570112的引物序列为SEQ ID No:6；rs201130283的引物序列为SEQ ID No:9；rs201477597的引物序列为SEQ ID No:12；rs1264429的引物序列为SEQ ID No:15；rs143989805的引物序列为SEQ ID No:18；rs147592698的引物序列为SEQ ID No:21；rs41269281的引物序列为SEQ ID No:24；rs17217280的引物序列为SEQ ID No:27；rs191127702的引物序列为SEQ ID No:30；rs2793086的引物序列为SEQ ID No:33；rs6446315的引物序列为SEQ ID No:36；rs111909699的引物序列为SEQ ID No:39；rs142508708的引物序列为SEQ ID No:42；rs3733782的引物序列为SEQ ID No:45；rs138921247的引物序列为SEQ ID No:48；rs45611935的引物序列为SEQ ID No:51；rs35683659的引物序列为SEQ ID No:54；rs147031025的引物序列为SEQ ID No:57；rs200847762的引物序列为SEQ ID No:60；rs78373056的引物序列为SEQ ID No:63；rs3739757的引物序列为SEQ ID No:66；rs679882的引物序列为SEQ ID No:69；rs141615048的引物序列为SEQ ID No:72；rs146021011的引物序列为SEQ ID No:75；rs7769051的引物序列为SEQ ID No:78；rs201854588的引物序列为SEQ ID No:81；rs41302077的引物序列为SEQ ID No:84；rs11571707的引物序列为SEQID No:87；rs78738447的引物序列为SEQ ID No:90；rs79153019的引物序列为SEQ ID No:93；rs35511555的引物序列为SEQ ID No:96；rs190646764的引物序列为SEQ ID No:99；rs76685516的引物序列为SEQ ID No:102；rs61752940的引物序列为SEQ ID No:105；rs190958876的引物序列为SEQ ID No:108；rs9475487的引物序列为SEQ ID No:111；rs80358282的引物序列为SEQ ID No:114；rs2305985的引物序列为SEQ ID No:117；rs201287330的引物序列为SEQ ID No:120；rs188551104的引物序列为SEQ ID No:123；rs202172344的引物序列为SEQ ID No:126；rs11564258的引物序列为SEQ ID No:129；rs2242527的引物序列为SEQ ID No:132；rs1052690的引物序列为SEQ ID No:135；rs117207261的引物序列为SEQ ID No:138；rs140636259的引物序列为SEQ ID No:141；rs2305710的引物序列为SEQ ID No:144；rs61978639的引物序列为SEQ ID No:147；rs3130257的引物序列为SEQ ID No:150；rs34908836的引物序列为SEQ ID No:153；rs56229136的引物序列为SEQ ID No:156。
所述的遗传标志物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的遗传标志物的特异性扩增引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的遗传标志物的特异性延伸引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种胃癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659，rs147031025，rs200847762，rs78373056，rs3739757，rs679882，rs141615048，rs146021011，rs7769051，rs201854588，rs41302077，rs11571707，rs78738447，rs79153019，rs35511555，rs190646764，rs76685516，rs61752940，rs190958876，rs9475487，rs80358282，rs2305985，rs201287330，rs188551104，rs202172344，rs11564258，rs2242527，rs1052690，rs117207261，rs140636259，rs2305710，rs61978639，rs3130257，rs34908836，和rs56229136。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择胃癌病例以及与之匹配的对照，利用高密度低频高外显性遗传标志物芯片，在全外显子组范围内找出与胃癌相关的遗传标志物。(3)对筛选出的阳性关联遗传标志物，进一步在样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4)胃癌辅助诊断试剂盒的研制：根据胃癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗传标志物开发辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片进行全外显子组扫描，Sequeom MassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)经病理学明确诊断的胃癌病例；
(2)与病例匹配的对照；
本研究共选用4090例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片上进行全外显子组扫描；
(3)检测并比较各基因型在胃癌病例与健康对照中的分别差异。
4.单个遗传标志物的Sequeom MassARRAY基因分型
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计单个遗传标志物的特异性引物；
(3)进行PCR反应；
(4)检测并比较胃癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片进行全外显子组扫描和单个遗传标志物检测后确定胃癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗传标志物，作为胃癌诊断的指标。最后筛选出的与胃癌发病有关的遗传标志物组成辅助诊断试剂盒(rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659，rs147031025，rs200847762，rs78373056，rs3739757，rs679882，rs141615048，rs146021011，rs7769051，rs201854588，rs41302077，rs11571707，rs78738447，rs79153019，rs35511555，rs190646764，rs76685516，rs61752940，rs190958876，rs9475487，rs80358282，rs2305985，rs201287330，rs188551104，rs202172344，rs11564258，rs2242527，rs1052690，rs117207261，rs140636259，rs2305710，rs61978639，rs3130257，rs34908836，和rs56229136)。诊断试剂可以包括这些遗传标志物的特异性引物对，以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这52个低频高外显性遗传标志物构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个遗传标志物与胃癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个遗传标志物的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个遗传标志物的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.450×rs3827760的评分)+(0.797×rs11570112的评分)+(1.001×rs201130283的评分)+(1.456×rs201477597的评分)+(0.476×rs1264429的评分)+(0.935×rs143989805的评分)+(0.742×rs147592698的评分)+(1.286×rs41269281的评分)+(0.663×rs17217280的评分)+(1.473×rs191127702的评分)+(0.551×rs2793086的评分)+(1.836×rs6446315的评分)+(-0.782×rs111909699的评分)+(0.757×rs142508708的评分)+(-0.634×rs3733782的评分)+(0.542×rs138921247的评分)+(0.459×rs45611935的评分)+(0.504×rs35683659的评分)+(2.569×rs147031025的评分)+(-0.826×rs200847762的评分)+(1.379×rs78373056的评分)+(2.163×rs3739757的评分)+(0.454×rs679882的评分)+(0.926×rs141615048的评分)+(1.070×rs146021011的评分)+(0.369×rs7769051的评分)+(1.250×rs201854588的评分)+(0.448×rs41302077的评分)+(1.144×rs11571707的评分)+(-0.418×rs78738447的评分)+(0.864×rs79153019的评分)+(1.259×rs35511555的评分)+(1.749×rs190646764的评分)+(0.363×rs76685516的评分)+(1.012×rs61752940的评分)+(0.923×rs190958876的评分)+(0.450×rs9475487的评分)+(1.709×rs80358282的评分)+(0.541×rs2305985的评分)+(1.275×rs201287330的评分)+(1.272×rs188551104的评分)+(1.156×rs202172344的评分)+(0.416×rs11564258的评分)+(0.694×rs2242527的评分)+(-0.606×rs1052690的评分)+(-1.261×rs117207261的评分)+(-0.764×rs140636259的评分)+(0.373×rs2305710的评分)+(.486×rs61978639的评分)+(1.169×rs3130257的评分)+(0.856×rs34908836的评分)+(0.523×rs56229136的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的4090例样本中。(以rs3827760为例：0.450为rs3827760的回归系数(见表1)；rs3827760的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些个SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
在上述1140例符合条件的胃癌病例及2950例健康对照中，两组年龄、性别均衡可比。我们将这两组人群经IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，SanDiego，CA)芯片进行全外显子组扫描获得相关结果。
根据IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片检测，本发明人检测到在“胃癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的遗传标志物包括：rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659，rs147031025，rs200847762，rs78373056，rs3739757，rs679882，rs141615048，rs146021011，rs7769051，rs201854588，rs41302077，rs11571707，rs78738447，rs79153019，rs35511555，rs190646764，rs76685516，rs61752940，rs190958876，rs9475487，rs80358282，rs2305985，rs201287330，rs188551104，rs202172344，rs11564258，rs2242527，rs1052690，rs117207261，rs140636259，rs2305710，rs61978639，rs3130257，rs34908836，和rs56229136。
单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这52个遗传标志物与胃癌的发病存在着显著关联。
进一步分析这52个遗传标志物的组合用于胃癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于胃癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述遗传标志物的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言，这52个遗传标志物的组合，或者这52个遗传标志物的特异性引物构成的相关诊断试剂盒有助于胃癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的遗传标志物作为胃癌辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)低频高外显性遗传标志物是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为胃癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)遗传标志物试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于胃癌的辅助诊断，有助于更好地反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全外显子组芯片扫描以获取疾病相关的低频高外显性遗传标志物，并应用Sequeom MassARRAY基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了低频高外显性遗传生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄、性别、吸烟、饮酒等对疾病发展的影响因素，研究遗传标志物在胃癌辅助诊断的应用前景，阐述遗传标志物对于胃癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了胃癌发病相关遗传标志物；通过遗传标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得胃癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全外显子组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
显示胃癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2004年开始至2010年从南京医科大学肿瘤中心收集了大量的胃癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了4090例符合下列标准的样本作为全基因组芯片扫描和单个遗传标志物Sequeom MassARRAY基因分型的实验样品：
1、病理学明确诊断的胃癌患者；
2、与之匹配的健康对照；
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA全外显子组扫描
在上述符合条件的1140例胃癌患者和2950例健康对照中，将这两组人群经IlluminaHuman Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行全外显子组扫描：在IlluminaHuman Exome BeadChip(IlluminaInc.，San Diego，CA)芯片上进行全外显子组扫描。
9、数据分析与处理:在“胃癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的低频高外显性遗传标志物在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1.病例组与对照组全外显子组关联分析结果
实施例3单个低频高外显性遗传标志物的Sequeom MassARRAY基因分型
将上述全外显子组扫描发现与胃癌发病有关的遗传标志物在1140胃癌病例和2950健康对照通过Sequenom MassARRAY基因分型平台上进行检测，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行Sequenom MassARRAY基因分型：
1)使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件对全基因组扫描发现的52个阳性关联的低频SNV设计PCR扩增引物及单碱基延伸引物(表2)。反应体系包括4μl Sequenom MassARRAY基因分型PCR master mix(Hotstar Taq 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs、1.9μl双蒸水)，加入1μl DNA。仪器使用的是SequenomMassARRAY Nanodispenser，PCR反应条件为：94℃ 4分钟；94℃ 20秒,56℃ 30秒，72℃ 1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。
2)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
3)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系包括：2μlEXTENDMix(单碱基延伸反应液，包括其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl,延伸混合物0.2μl)，7μlSAP处理后PCR产物。PCR反应条件：I.94℃ 30秒；II.94℃ 5秒；III.52℃5秒；IV.80℃5秒；V.重复III、IV4个循环；VI.重复II、III、IV、V39个循环；VII.72℃ 3分钟；VII.4℃保持
4)树脂纯化：
(1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；
(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内；
(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触；
(4)离心使树脂沉入孔底部。
5)芯片点样：启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上
6)质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
9、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，结果与全外显子扫描类似不再列出。
实施例4利用危险度评分方法进一步分析遗传标志物与胃癌发病
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“胃癌病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的遗传标志物，以全外显子组扫描样本中单个遗传标志物回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些低频SNV对胃癌发病的判断能力。对52个遗传标志物的联合分析发现，这52个遗传标志物以70.22％的AUC将健康对照组和胃癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为53.95％，特异度为76.20％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659，rs147031025，rs200847762，rs78373056，rs3739757，rs679882，rs141615048，rs146021011，rs7769051，rs201854588，rs41302077，rs11571707，rs78738447，rs79153019，rs35511555，rs190646764，rs76685516，rs61752940，rs190958876，rs9475487，rs80358282，rs2305985，rs201287330，rs188551104，rs202172344，rs11564258，rs2242527，rs1052690，rs117207261，rs140636259，rs2305710，rs61978639，rs3130257，rs34908836，和rs56229136的组合能够很好地将健康对照和胃癌患者区分。
实施例5用于胃癌辅助诊断遗传标志物试剂盒的制作
低频高外显性遗传标志物试剂盒的制作和操作流程是基于Sequeom MassARRAY基因分型技术。该试剂盒含有一批遗传标志物特异性扩增引物(包括下列引物：rs3827760的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；rs11570112的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ IDNo:5；rs201130283的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；rs201477597的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；rs1264429的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；rs143989805的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；rs147592698的引物序列为SEQID No:19和SEQ ID No:20；rs41269281的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；rs17217280的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；rs191127702的引物序列为SEQID No:28和SEQ ID No:29；rs2793086的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；rs6446315的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；rs111909699的引物序列为SEQ IDNo:37和SEQ ID No:38；rs142508708的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；rs3733782的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；rs138921247的引物序列为SEQ IDNo:46和SEQ ID No:47；rs45611935的引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；rs35683659的引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；rs147031025的引物序列为SEQID No:55和SEQ ID No:56；rs200847762的引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；rs78373056的引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62；rs3739757的引物序列为SEQ IDNo:64和SEQ ID No:65；rs679882的引物序列为SEQ ID No:67和SEQ ID No:68；rs141615048的引物序列为SEQ ID No:70和SEQ ID No:71；rs146021011的引物序列为SEQID No:73和SEQ ID No:74；rs7769051的引物序列为SEQ ID No:76和SEQ ID No:77；rs201854588的引物序列为SEQ ID No:79和SEQ ID No:80；rs41302077的引物序列为SEQID No:82和SEQ ID No:83；rs11571707的引物序列为SEQ ID No:85和SEQ ID No:86；rs78738447的引物序列为SEQ ID No:88和SEQ ID No:89；rs79153019的引物序列为SEQ IDNo:91和SEQ ID No:92；rs35511555的引物序列为SEQ ID No:94和SEQ ID No:95；rs190646764的引物序列为SEQ ID No:97和SEQ ID No:98；rs76685516的引物序列为SEQID No:100和SEQ ID No:101；rs61752940的引物序列为SEQ ID No:103和SEQ ID No:104；rs190958876的引物序列为SEQ ID No:106和SEQ ID No:107；rs9475487的引物序列为SEQID No:109和SEQ ID No:110；rs80358282的引物序列为SEQ ID No:112和SEQ ID No:113；rs2305985的引物序列为SEQ ID No:115和SEQ ID No:116；rs201287330的引物序列为SEQID No:118和SEQ ID No:119；rs188551104的引物序列为SEQ ID No:121和SEQ ID No:122；rs202172344的引物序列为SEQ ID No:124和SEQ ID No:125；rs11564258的引物序列为SEQID No:127和SEQ ID No:128；rs2242527的引物序列为SEQ ID No:130和SEQ ID No:131；rs1052690的引物序列为SEQ ID No:133和SEQ ID No:134；rs117207261的引物序列为SEQID No:136和SEQ ID No:137；rs140636259的引物序列为SEQ ID No:139和SEQ ID No:140；rs2305710的引物序列为SEQ ID No:142和SEQ ID No:143；rs61978639的引物序列为SEQID No:145和SEQ ID No:146；rs3130257的引物序列为SEQ ID No:148和SEQ ID No:149；rs34908836的引物序列为SEQ ID No:151和SEQ ID No:152；rs56229136的引物序列为SEQID No:154和SEQ ID No:155)，和/或特异性延伸引物(包括下列引物：rs3827760的引物序列为SEQ ID No:3；rs11570112的引物序列为SEQ ID No:6；rs201130283的引物序列为SEQID No:9；rs201477597的引物序列为SEQ ID No:12；rs1264429的引物序列为SEQ ID No:15；rs143989805的引物序列为SEQ ID No:18；rs147592698的引物序列为SEQ ID No:21；rs41269281的引物序列为SEQ ID No:24；rs17217280的引物序列为SEQ ID No:27；rs191127702的引物序列为SEQ ID No:30；rs2793086的引物序列为SEQ ID No:33；rs6446315的引物序列为SEQ ID No:36；rs111909699的引物序列为SEQ ID No:39；rs142508708的引物序列为SEQ ID No:42；rs3733782的引物序列为SEQ ID No:45；rs138921247的引物序列为SEQ ID No:48；rs45611935的引物序列为SEQ ID No:51；rs35683659的引物序列为SEQ ID No:54；rs147031025的引物序列为SEQ ID No:57；rs200847762的引物序列为SEQ ID No:60；rs78373056的引物序列为SEQ ID No:63；rs3739757的引物序列为SEQ ID No:66；rs679882的引物序列为SEQ ID No:69；rs141615048的引物序列为SEQ ID No:72；rs146021011的引物序列为SEQ ID No:75；rs7769051的引物序列为SEQ ID No:78；rs201854588的引物序列为SEQ ID No:81；rs41302077的引物序列为SEQ ID No:84；rs11571707的引物序列为SEQ ID No:87；rs78738447的引物序列为SEQ ID No:90；rs79153019的引物序列为SEQ ID No:93；rs35511555的引物序列为SEQ ID No:96；rs190646764的引物序列为SEQ ID No:99；rs76685516的引物序列为SEQ ID No:102；rs61752940的引物序列为SEQ ID No:105；rs190958876的引物序列为SEQ ID No:108；rs9475487的引物序列为SEQ ID No:111；rs80358282的引物序列为SEQ ID No:114；rs2305985的引物序列为SEQ ID No:117；rs201287330的引物序列为SEQ ID No:120；rs188551104的引物序列为SEQ ID No:123；rs202172344的引物序列为SEQ ID No:126；rs11564258的引物序列为SEQ ID No:129；rs2242527的引物序列为SEQ ID No:132；rs1052690的引物序列为SEQ ID No:135；rs117207261的引物序列为SEQ ID No:138；rs140636259的引物序列为SEQ ID No:141；rs2305710的引物序列为SEQ ID No:144；rs61978639的引物序列为SEQ ID No:147；rs3130257的引物序列为SEQ ID No:150；rs34908836的引物序列为SEQ ID No:153；rs56229136的引物序列为SEQ ID No:156)，还可以包含PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测遗传标志物，辅助诊断胃癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关遗传标志物引物信息
F：Forward Primer，上游引物；R：Reverse Primer，下游引物；E：ExtendedPrimer，延伸引物。
Claims (4)
1.一种检测与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物的特异性扩增引物组和特异性延伸引物组，其特征在于，该特异性扩增引物组为：
rs3827760的引物序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；
rs11570112的引物序列为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5；
rs201130283的引物序列为SEQ ID No:7和SEQ ID No:8；
rs201477597的引物序列为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11；
rs1264429的引物序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；
rs143989805的引物序列为SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；
rs147592698的引物序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；
rs41269281的引物序列为SEQ ID No:22和SEQ ID No:23；
rs17217280的引物序列为SEQ ID No:25和SEQ ID No:26；
rs191127702的引物序列为SEQ ID No:28和SEQ ID No:29；
rs2793086的引物序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；
rs6446315的引物序列为SEQ ID No:34和SEQ ID No:35；
rs111909699的引物序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；
rs142508708的引物序列为SEQ ID No:40和SEQ ID No:41；
rs3733782的引物序列为SEQ ID No:43和SEQ ID No:44；
rs138921247的引物序列为SEQ ID No:46和SEQ ID No:47；
rs45611935的引物序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；
rs35683659的引物序列为SEQ ID No:52和SEQ ID No:53；
rs147031025的引物序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56；
rs200847762的引物序列为SEQ ID No:58和SEQ ID No:59；
rs78373056的引物序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62；
rs3739757的引物序列为SEQ ID No:64和SEQ ID No:65；
rs679882的引物序列为SEQ ID No:67和SEQ ID No:68；
rs141615048的引物序列为SEQ ID No:70和SEQ ID No:71；
rs146021011的引物序列为SEQ ID No:73和SEQ ID No:74；
rs7769051的引物序列为SEQ ID No:76和SEQ ID No:77；
rs201854588的引物序列为SEQ ID No:79和SEQ ID No:80；
rs41302077的引物序列为SEQ ID No:82和SEQ ID No:83；
rs11571707的引物序列为SEQ ID No:85和SEQ ID No:86；
rs78738447的引物序列为SEQ ID No:88和SEQ ID No:89；
rs79153019的引物序列为SEQ ID No:91和SEQ ID No:92；
rs35511555的引物序列为SEQ ID No:94和SEQ ID No:95；
rs190646764的引物序列为SEQ ID No:97和SEQ ID No:98；
rs76685516的引物序列为SEQ ID No:100和SEQ ID No:101；
rs61752940的引物序列为SEQ ID No:103和SEQ ID No:104；
rs190958876的引物序列为SEQ ID No:106和SEQ ID No:107；
rs9475487的引物序列为SEQ ID No:109和SEQ ID No:110；
rs80358282的引物序列为SEQ ID No:112和SEQ ID No:113；
rs2305985的引物序列为SEQ ID No:115和SEQ ID No:116；
rs201287330的引物序列为SEQ ID No:118和SEQ ID No:119；
rs188551104的引物序列为SEQ ID No:121和SEQ ID No:122；
rs202172344的引物序列为SEQ ID No:124和SEQ ID No:125；
rs11564258的引物序列为SEQ ID No:127和SEQ ID No:128；
rs2242527的引物序列为SEQ ID No:130和SEQ ID No:131；
rs1052690的引物序列为SEQ ID No:133和SEQ ID No:134；
rs117207261的引物序列为SEQ ID No:136和SEQ ID No:137；
rs140636259的引物序列为SEQ ID No:139和SEQ ID No:140；
rs2305710的引物序列为SEQ ID No:142和SEQ ID No:143；
rs61978639的引物序列为SEQ ID No:145和SEQ ID No:146；
rs3130257的引物序列为SEQ ID No:148和SEQ ID No:149；
rs34908836的引物序列为SEQ ID No:151和SEQ ID No:152；
rs56229136的引物序列为SEQ ID No:154和SEQ ID No:155；
该特异性延伸引物组为：
rs3827760的引物序列为SEQ ID No:3；rs11570112的引物序列为SEQ ID No:6；rs201130283的引物序列为SEQ ID No:9；rs201477597的引物序列为SEQ ID No:12；rs1264429的引物序列为SEQ ID No:15；rs143989805的引物序列为SEQ ID No:18；rs147592698的引物序列为SEQ ID No:21；rs41269281的引物序列为SEQ ID No:24；rs17217280的引物序列为SEQ ID No:27；rs191127702的引物序列为SEQ ID No:30；rs2793086的引物序列为SEQ ID No:33；rs6446315的引物序列为SEQ ID No:36；rs111909699的引物序列为SEQ ID No:39；rs142508708的引物序列为SEQ ID No:42；rs3733782的引物序列为SEQ ID No:45；rs138921247的引物序列为SEQ ID No:48；rs45611935的引物序列为SEQ ID No:51；rs35683659的引物序列为SEQ ID No:54；rs147031025的引物序列为SEQ ID No:57；rs200847762的引物序列为SEQ ID No:60；rs78373056的引物序列为SEQ ID No:63；rs3739757的引物序列为SEQ ID No:66；rs679882的引物序列为SEQ ID No:69；rs141615048的引物序列为SEQ ID No:72；rs146021011的引物序列为SEQ ID No:75；rs7769051的引物序列为SEQ ID No:78；rs201854588的引物序列为SEQ ID No:81；rs41302077的引物序列为SEQ ID No:84；rs11571707的引物序列为SEQID No:87；rs78738447的引物序列为SEQ ID No:90；rs79153019的引物序列为SEQ ID No:93；rs35511555的引物序列为SEQ ID No:96；rs190646764的引物序列为SEQ ID No:99；rs76685516的引物序列为SEQ ID No:102；rs61752940的引物序列为SEQ ID No:105；rs190958876的引物序列为SEQ ID No:108；rs9475487的引物序列为SEQ ID No:111；rs80358282的引物序列为SEQ ID No:114；rs2305985的引物序列为SEQ ID No:117；rs201287330的引物序列为SEQ ID No:120；rs188551104的引物序列为SEQ ID No:123；rs202172344的引物序列为SEQ ID No:126；rs11564258的引物序列为SEQ ID No:129；rs2242527的引物序列为SEQ ID No:132；rs1052690的引物序列为SEQ ID No:135；rs117207261的引物序列为SEQ ID No:138；rs140636259的引物序列为SEQ ID No:141；rs2305710的引物序列为SEQ ID No:144；rs61978639的引物序列为SEQ ID No:147；rs3130257的引物序列为SEQ ID No:150；rs34908836的引物序列为SEQ ID No:153；rs56229136的引物序列为SEQ ID No:156。
2.权利要求1所述的遗传标志物的特异性扩增引物组和特异性延伸引物组在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
3.一种胃癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1所述的特异性扩增引物组和特异性延伸引物组，用于检测外周血DNA中rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659，rs147031025，rs200847762，rs78373056，rs3739757，rs679882，rs141615048，rs146021011，rs7769051，rs201854588，rs41302077，rs11571707，rs78738447，rs79153019，rs35511555，rs190646764，rs76685516，rs61752940，rs190958876，rs9475487，rs80358282，rs2305985，rs201287330，rs188551104，rs202172344，rs11564258，rs2242527，rs1052690，rs117207261，rs140636259，rs2305710，rs61978639，rs3130257，rs34908836和rs56229136。
4.根据权利要求3所述胃癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410469997.5A CN104263823B (zh) | 2014-09-15 | 2014-09-15 | 一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410469997.5A CN104263823B (zh) | 2014-09-15 | 2014-09-15 | 一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104263823A CN104263823A (zh) | 2015-01-07 |
| CN104263823B true CN104263823B (zh) | 2017-09-05 |
Family
ID=52155397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410469997.5A Active CN104263823B (zh) | 2014-09-15 | 2014-09-15 | 一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104263823B (zh) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101240326A (zh) * | 2007-02-06 | 2008-08-13 | 上海主健生物工程有限公司 | 一种检测少儿铅中毒遗传易感风险的试剂盒 |
| CN102534008B (zh) * | 2012-01-16 | 2014-03-19 | 南京医科大学 | 一种与非贲门癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 |
-
2014
- 2014-09-15 CN CN201410469997.5A patent/CN104263823B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104263823A (zh) | 2015-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104278085B (zh) | 一种与早发胃癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| CN104745710B (zh) | 一种与原发性肝细胞癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| CN104178567B (zh) | 一种与乳腺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| CN105603101B (zh) | 检测8个miRNA表达量的系统在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用 | |
| CN102534008B (zh) | 一种与非贲门癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| CA2764468A1 (en) | Methods of detecting cancer comprising screening for mutations in the apc, egfr, kras, pten and tp53 genes | |
| CN105442052A (zh) | 一种检测诊断主动脉夹层病致病基因的dna文库及其应用 | |
| CN104988141B (zh) | BRCA2基因g.32912799T＞C突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 | |
| CN105950753A (zh) | 一种与肺腺癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用 | |
| CN104293919B (zh) | 一种与非吸烟女性肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| CN108103198A (zh) | 一种与胰腺癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用 | |
| CN102534009B (zh) | 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| CN107557468A (zh) | 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的癌‑睾丸基因遗传标志物及其应用 | |
| CN104263723B (zh) | 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 | |
| CN104263823B (zh) | 一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用 | |
| CN104946751B (zh) | BRCA1基因g.41244291delT突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 | |
| CN104195228A (zh) | 一种与非综合征型先天性心脏病辅助诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| CN104962612B (zh) | BRCA1基因g.41256139delT移码突变及其在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用 | |
| CN104962613B (zh) | 一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因及其应用 | |
| CN109880903B (zh) | 一种用于非小细胞肺癌辅助诊断的snp标志物及其应用 | |
| CN104164427B (zh) | 一种与吸烟成瘾相关的snp标志物及其应用 | |
| CN105274222B (zh) | 一种与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的snp标志物及其应用 | |
| CN114941030B (zh) | 一种用于胃癌辅助诊断的snp标志物及其应用 | |
| CN110218793A (zh) | 一种与食管癌辅助诊断相关的snp标志物 | |
| CN111154871A (zh) | 一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌相关基因突变的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210508 Address after: 210018 10th floor, building a, Yangzi science and technology innovation center phase I, 211 pubin Road, Jiangbei new district, Nanjing City, Jiangsu Province Patentee after: Hundred million Co.,Ltd. of population health research institute of section of Nanjing Address before: 210029 No. 140, Hanzhoung Road, Nanjing, Jiangsu Patentee before: NANJING MEDICAL University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |