CN103826750A - 从血液中捕获和检测循环多发性骨髓瘤的测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明包括分离循环多发性骨髓瘤细胞的方法以及治疗被怀疑患有异常血浆细胞疾病的患者的方法。
Description
相关申请
这个非临时性申请要求于2011年7月21日提交的美国专利申请序列号61/510,170的临时专利申请的优先权。
背景技术
多发性骨髓瘤（也已知为骨髓瘤或血浆细胞骨髓瘤）是血浆细胞的渐进血液癌症。该病症特征在于骨髓中过量数目的血浆细胞和未受损的单克隆免疫球蛋白或游离的单克隆轻链的生产过剩。
临床上，该疾病是根据多种参数诊断、分阶、和治疗的，所述参数包括基于血清和/或尿液中单克隆（或骨髓瘤）蛋白（M蛋白）的量的骨髓瘤肿瘤细胞群，和血红蛋白和血清钙浓度，基于骨肌检查和肾衰竭的存在或缺乏的溶骨性病变的数量。表征该病症的附加方法包括对骨髓检查的大于百分之十（10%）的血浆细胞检测，软组织浆细胞瘤的存在及游离κ和λ血清免疫球蛋白轻链的检测。骨髓检查是使用标准的组织学和免疫组织化学技术进行的。还进行骨髓样品的细胞遗传学检查以确定预后。接下来，由于骨髓评价是侵入式性的，如果临床需要，监测由化学和骨髓评价组成。
目前，骨髓流式细胞分析(flow cytometric analysis)被评价为疾病表征的工具并用来区分正常血浆细胞和赘生性血浆细胞病症和用来检测微量残留病(minimal residual disease)。尽管如此，这种方法仍然依赖于一种侵入式程序。显著需要开发微创技术(less invasive technique)，以贯穿疾病过程检测、监视和表征疾病，并且血液中这些细胞的存在可提供这样的机会。
此外，需要开发更灵敏的工具用于风险的更精确评估和监视疾病前期阶段中疾病的进展，该疾病包括未明确诊断意义的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)和郁积型多发性骨髓瘤(Smoldering Multiple Myeloma）。一些研究数据表明，循环血浆细胞在疾病的前期阶段可被检测到并且可与预后关联，这支持标准化方法的使用以在疾病的早期阶段中捕获、列举和表征这些细胞。
在异常血浆细胞的识别，尤其是通过流式细胞术识别的文献（Reportof the European Myeloma Network on Multiparametric Flow Cytometry inMultiple Myeloma and Related Disorders，Andy C.Rawstron等人，Haematologica，2008；93(3)。）中普遍共识已包括多个主要由CD138、CD38和CD45组成的关键生物标记物。附加的生物标记物诸如CD19和CD56也已被证明在诊断中的实用性。
本发明研究了循环骨髓瘤细胞，以评价这些特定生物标记物单独或与一个或多个附加生物标记物或与FISH组合是否可用于异常循环血浆细胞的捕获和检测，包括微量残留病的检测。FISH可用于检测已在多发性骨髓瘤中描述的许多细胞遗传学异常性。在IGH基因座t(4;14)处的易位和在p53基因座del(17p)处的缺失，已被证明具有对于多发性骨髓瘤中无事件(event free)生存率和总生存率的预后价值。（Genetic Abnormalities andSurvival in Multiple Myeloma：The Experience of the InterGroupeFrancophone du Myelome.Herve Avet-Loiseau等人，Blood，2007；109：3489-3495）在Poseidon目录中这些探针和多个其它多发性骨髓瘤标记物是可利用的，并可使其适合用于
平台。
商业上存在使用CD138磁性颗粒的免疫磁珠选择试剂盒(immunomagnetic selection kits)。干细胞技术具有可从骨髓和外周血单核细胞(PBMC)中选择CD138阳性细胞的
人类CD138阳性选择试剂盒，而Miltenyi Biotech具有用于从骨髓、PBMC和全血中选择CD138阳性细胞的CD138微珠(Microbeads)。通常使用流式细胞术进行采集样本的分析。
发明内容
这里描述的本发明由循环血浆细胞(CPC)和异常血浆细胞或多发性骨髓瘤细胞(“CMMC”)的捕获和检测的方法组成，该检测包括从外周血中检测微量残留病。本发明提供一种检测毫升体积的血样中非常低数目的CMMC的非侵入式方法以贯穿疾病的整个过程检测、监视和表征疾病，以及提供用于风险的更精确评价的更灵敏的工具，和在疾病的前期阶段监视疾病的进展，该监视包括在疾病的前期阶段检测循环血浆细胞，该疾病包括未明确诊断意义的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)和郁积型多发性骨髓瘤。来自外周血的这些循环血浆细胞的捕获和表征可提供用于管理多发性骨髓瘤患者的新型生物标记物。
血液被收集于细胞安全(CellSave)管中，该细胞安全管包含允许血液运输和存储同时使细胞降解最小化的防腐剂。细胞是使用缀合到存在于血浆细胞上的细胞表面标记物Syndecan-1或CD138的胶体磁性颗粒捕获的。为了从污染了白细胞（白血细胞）的背景中区分多发性骨髓瘤细胞，一旦被捕获，用附加的细胞标记物CD38-PE（藻红蛋白）、CD19和CD45-APC（别藻蓝蛋白），以及CD56-FITC（荧光素异硫氰酸酯）标记细胞。铁磁流体和细胞标记物试剂都是新的
CMMC服务试剂盒的成员。该试剂盒由7种组分组成，其中4种与存在于
上皮细胞试剂盒中的试剂相同。这4种常用的试剂是捕获增强试剂、Perm试剂、核酸染料和CellFix。3种新的试剂由CD138铁磁流体、染色试剂和单独的标记物染色试剂组成，染色试剂由CD38-PE、CD19和CD45-APC组成，单独的标记物染色试剂由CD56-FITC组成的。
附图说明
图1示出了CD138抗体与某些细胞系的反应性
图2示出了CD38抗体与某些细胞系的反应性
图3示出了对PBMC测试的不同CD19APC抗体的反应性
图4示出了在不同稀释度下CD19APC的染色
图5示出了CD56抗体对PBMC的染色
图6示出了CD56对各种细胞系的染色
图7示出了无CD56的染色
图8示出了在一种稀释度下CD56FITC染色细胞系
图9示出了在一种稀释度下CD56FITC染色细胞系
图10示出了在一种稀释度下CD56FITC染色细胞系
图11示出了来自MM1S细胞的代表性图像
图12示出了来自H929细胞的代表性图像
图13示出了遗留(carry-over)白血细胞的代表性图像
图14示出了一个患者样品的图像
图15示出了一个患者样品的图像
图16示出了一个患者样品的图像
图17示出了一个患者样品的图像
图18示出了来自正常供体的图像
具体实施方式
本发明包括捕获、分离和分析循环多发性骨髓瘤细胞的方法，所述方法包括
(a)从测试受试者获得血液的样品
(b)使所述样品与缀合至第一配体的胶态磁性颗粒接触
(c)使步骤（b）的样品经受磁场，以生产结合磁性颗粒的循环多发性骨髓瘤细胞的分离级分
(d)用第一附加标记物处理步骤（c）的样品
(e)分析循环多发性骨髓瘤细胞。
如本文所用，术语“样品”是指一定量的血液，优选表示为体积测量。优选的血液样品体积为约2mL至10mL，更优选地3-7.5mL，最优选地4mL。术语“胶态磁性颗粒”是指金属或有机金属颗粒。美国专利No.5,597,531；5,698,271；5,698,271；6,365,662中公开了此类颗粒的实例，据此全文引入以供参考，尤其对于此类胶态磁性颗粒的描述。它们可用聚合物，优选生物来源诸如牛血清白蛋白和酪蛋白的聚合物任选地涂覆。
术语“配体”是指结合到CMMC的或循环血浆细胞(“CPC”)的细胞相关联的标记物的蛋白质。优选的蛋白质是抗体，优选抗CD138、抗-CD38、和抗-CD56，更优选地抗CD138、和抗-CD38，甚至更优选地抗CD-138。此类配体可通过基本上类似于所公开的6,365,662的方法来缀合至胶态磁性颗粒。两个或两个以上配体可用于本发明的步骤（b），且优选至少两个配体用于该步骤。
术语“磁场”可由许多方法中的任何一种，尤其是由基本上如美国专利No7,901,950中描述的两个磁性分离器产生，该专利全文以引用方式并入。术语“附加的标记物”意味着细胞相关联的蛋白，其对于CMMC或排除CMMC是特异的。此类蛋白质包括但不限于选自抗-CD38抗CD19、和抗CD45抗CD138、抗CD56、抗λ、抗κ抗CD200、抗Ki67的抗体。此类抗体可用指示剂诸如藻红蛋白、荧光素异硫氰酸酯、和别藻蓝蛋白标记并且优选用一种或多种标记物标记。附加标记物可包括核酸染料诸如DAPI。优选的附加标记物选自抗CD-38、抗CD19、以及抗CD45；尤其优选的附加标记物为抗CD38。两个或更多个附加标记物可用于本发明的步骤（d）且优选使用至少两个附加标记物，更优选地，三个附加标记物，最优选地四个附加标记物。
术语“分析”意味着评价磁力捕获的样品以确定一个或多个下列项：样品是否包含CMMC或CPC。此类识别可由目视或电子方式实施以确定磁力捕获的样品的荧光度。此类分析方法公开在美国专利No.7,011,794中，该专利以引用方式并入本文。尤其是，磁力捕获的样品被标识为CMMC，其对CD38为阳性且对CD19和CD45为阴性。
本发明包括确定患者的血液是否为与异常血浆细胞相关联疾病的治疗干预的可能候选者的方法
(a)处理所述患者的血液以确定样品中有多少CMMC
(b)通过计数1定存在于所述样品中的CMMC细胞数是否等于或者大于或等于正常范围。
如本文使用，术语样品具有其前述意义和优选的范围。术语“处理”意味着通过本文所述的方法处理患者的血液样品以分离和识别CMMC。
术语“治疗干预”寻求或获得用于治疗与异常血浆水平相关联的疾病的任何医疗干预。此类疾病包括但不限于多发性骨髓瘤、MGUS、和郁积型多发性骨髓瘤。此类治疗干预包括但不限于看医生，获得治疗处理诸如辐射，和用治疗任何与异常血浆水平相关联疾病的药物处理，及监视此类治疗处理的效果。例如，如果患者正接受药物治疗，可在治疗过程中评估患者的CMMC水平，以确定该药物是否起作用。此类药物包括但不限于，地塞米松、环磷酰胺、长春新碱、硼替佐米(Bortezomib)、美法仑、择泰、帕洛诺司琼(Aloxi)、来那度胺(Lenalidomide)、多柔比星(Doxirubicin)等。
术语“正常范围”意味着存在于样品群体中的CMMC细胞数，该样品群体未患有与异常血浆细胞相关联的疾病。优选地该正常范围在约3mL至约7.5mL的血样中小于7个CMMC。术语“大于正常范围”是超出正常范围的CMMC数。此数越高，越有可能患者患有与异常血浆细胞相关联的疾病之一。如果患者血液的样品中具有在8至20之间的CMMC，那么此类患者具有更高的患有与异常血浆细胞相关联的疾病之一的概率。如果患者具有在21至49之间的CMMC，那么患者具有提高的水平且更可能患有与异常血浆细胞相关联的疾病之一，如果患者具有在50至数万之间的CMMC，那么患者具有高度提高的水平且甚至更可能患有此类疾病之一。
但仍进一步的，本发明包括确定经历治疗干预的患者是否减少CMMC数的方法，所述方法包括：
(a)处理所述患者的血液以确定在第一时间点在样品中有多少CMMC
(b)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围
(c)处理所述患者的血液以确定在第二时间点在样品中有多少CMMC
(d)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围
(e)比较步骤（b）和（d）中的数目。
所有前面所定义的术语具有其相同的意义和优选的范围。
仍进一步的，本发明包括确定患有异常血浆细胞疾病并已成功治疗此类疾病的患者是否停留在缓解期的方法，所述方法包括
(a)处理所述患者的血液以确定在第一时间点在样品中有多少CMMC
(b)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围
(c)处理所述患者的血液以确定在第二时间点在样品中有多少CMMC
(d)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围
(e)比较步骤（b）和（d）中的数目。
所有前面所定义的术语具有其相同的意义和优选的范围。
仍进一步的，本发明包括用于捕获包括胶态磁性颗粒和至少一种配体的循环多发性骨髓瘤细胞的试剂。
所有前面所定义的术语具有其相同的意义和优选的范围。
但仍另外的，本发明包括捕获、分离和分析循环血浆细胞的方法，所述方法包括
(a)从测试受试者获得血液的样品
(b)使所述样品与缀合至第一配体的胶态磁性颗粒接触
(c)使步骤（b）的样品经受磁场，以生产结合磁性颗粒的循环多发性骨髓瘤细胞的分离级分
(d)用第一附加标记物处理步骤（c）的样品
(e)分析循环血浆细胞。
所有前面所定义的术语具有其相同的意义和优选的范围。
从血液中捕获的循环多发性骨髓瘤细胞(CMMC)，一种异常血浆细胞的形式已使用
和CellTracksAnalyzer
系统捕获和分析。在此过程中，捕获试剂（铁磁流体）和荧光生物标记物（诸如抗-CD38-藻红蛋白(PE)抗体）和染料（诸如核酸染料DAPI）的组合被用于识别异常血浆细胞并从污染白细胞和碎片中区分它们。CD138或Syndecan-1（多配体蛋白聚糖-1）是在成熟血浆细胞和血浆细胞恶性肿瘤诸如多发性骨髓瘤上，但不在其它正常外周血白细胞上发现的细胞表面标记物。因为这个原因，将抗-CD138联接到用于从外周血样中磁力选择循环血浆细胞的铁磁流体、磁性纳米颗粒上。为了从污染白细胞中检测异常血浆细胞，使用多个荧光生物标记物。将抗-CD38缀合至藻红蛋白(PE)并用作检测血浆细胞的阳性标记物。然而，CD38也被发现于一些类型的白细胞（活化的T和B细胞）上，因此测定法也使用别藻蓝蛋白(APC)缀合抗-CD45和缀合至别藻蓝蛋白(APC)的抗-CD19作为阴性标记物。CD45是发现于外周血白细胞上的全白细胞标记物(pan-leukocyte marker)，而CD19是特异性B细胞标记物。骨髓瘤细胞是不表达CD45或CD19的功能分化的B细胞。该测定法中的最终标记物为缀合至荧光素异硫氰酸酯(FITC)的抗CD56。CD56可被发现于一些外周白细胞亚群诸如NK细胞上，但也被表达于75%的骨髓瘤细胞上且常常与较差的患者预后相关联。因此，虽然CD56既不是多发性骨髓瘤的阳性标记物也不是多发性骨髓瘤的阴性标记物时，但其在细胞上的表达水平可在患者药物治疗过程中被监视。
使用细胞系诸如RPMI8226、H929和MM.1S初始开发该测定法，以评价确定存在于多发性骨髓瘤细胞上的标记物的不同抗体，该标志物包括CD138、CD38和CD56。因为这些细胞系对于CD45和CD19是阴性的，所以替代利用PBMC来评价这些抗体。
将富集和染色的细胞转移到
盒和用于磁性安装的
使用CellTracks Analyzer
对盒进行扫描。细胞的各个图像被呈现给操作者进行查看，并根据荧光和细胞形态记为CMMC。在模型掺入(spike-in)系统中，该测定法从掺入了来自健康供体的4.0mL的血液的多发性骨髓瘤细胞株H929中一致地回收约60%的细胞。在掺入的H929细胞从0至2000的测试的范围内该测定法是线性的（r20.98，斜率0.50，截距10）。该测定法使用来自年龄匹配的健康供体（n=22）及多发性骨髓瘤患者（n=66）和MGUS患者（n=7）的血液进行验证。在来自正常供体的4.0mL血液中，在12/22（55%）样品中检测到0CPC，而在10/22（45%）样品中检测到低数目（1-6CPC）。有趣地，一个CD56阳性CPC存在于正常供体中。多发性骨髓瘤患者中的CMMC范围为0-17,000/4.0mL血液。在91%的患者中检测到一个或多个CMMC，在68%患者中≥5，在58%患者中≥10而在35%患者中≥100。在患者群体中CD56的表达高度可变。MGUS患者中的CMMC范围为0-112/4.0mL血液。在6/7的患者中检测到一个或多个CMMC，在4/6患者中>5，在2/6患者中>10，而在1/6患者中>100。
为进一步表征CMMC，并从CMMC中区分CPC，开发间期荧光原位杂交(FISH)测定法以与上述的捕获和检测系统一起使用。使用四色FISH探针同时检测高风险的突变。下列实例示出了本发明
实例
缩写
PE-藻红蛋白
FITC-荧光素异硫氰酸酯
APC-别藻蓝蛋白
PBMC-外周血单核细胞
抗体来源-
CD138：
Gen-ProbeDiacloneSAS
1BdAFleming,BP1985
法国，F-25020Besancon Cedex
CD38和CD19
R&D系统
614McKinleyPlaceN.E.
Minneapolis,MN55413
实例1捕获靶标
图1表明，用细胞系RPMI8226、H929、和MM.1S测试抗-CD138抗体的反应性，表现最佳的抗体为克隆B-A38。首先用不同的抗体标记该细胞系，该不同的抗体全部为小鼠抗人抗体，随后用抗小鼠PE缀合物标记并通过流式细胞术分析。克隆B-A38对所有多发性骨髓瘤细胞系给出了最高的荧光染色。
实例2检测靶标
图2表明，用细胞系RPMI8226、H929、和MM.1S测试抗-CD38抗体的反应性，表现最佳的抗体为克隆240742。该细胞系使用直接抗-CD38-FITC缀合物进行初始测试，但之后发现FITC缀合物不够适于在平台上检测。随后制备和测试这种抗体的PE缀合物，并发现其适于检测
实例3稀释液测定
均为APC缀合物的抗CD19和抗-CD45被选为阴性检测标记物，当两者缺乏时指示异常血浆细胞。抗-CD45APC已经是
CTC染色试剂的组分，所以没有必要进一步优化。并且因为在评价下没有骨髓瘤细胞系表达CD19，所以使用PBMC来评价不同的抗-CD19APC克隆。对PBMC测试抗-CD19的结果可见于图3。根据制造商的推荐方案对从EDTA和CellSave管上收集的PBMC进行染色。克隆SJ25C1被选为表现最佳的缀合物。然后于各种稀释度下以在上使用的相同反应体积测试该缀合物，图4。选择1:5的稀释度作为染色的最终稀释度。
实例4染色CD56和PBMC
选择抗-CD56作为FITC标记物试剂，因为其在75%的具有异常表达的骨髓瘤病例中表达。根据制造商的推荐方案在细胞系（图6）和PBMC（图5）上进行测试。选择NCAM16.2作为表现最佳的缀合物。
实例5CD56FITC稀释液
在各种稀释度下用H929细胞在
上测试抗-CD56FITC缀合物NCAM16.2，见图7-10。对细胞系没有明确的测试稀释度是最佳的。选择1:4的稀释度作为染色的最终稀释度，直到可测试患者样品以帮助确定最佳浓度。
实例6图像
然后构建由抗-CD138铁磁流体、染色试剂、和抗-CD56FITC标记物试剂组成的CMMC原型试剂盒，该染色试剂由抗-CD38PE、抗-CD45APC和抗-CD19APC组成。该试剂盒的剩余组分为捕获增强试剂(PN7037)、透化试剂(PN7038)、核酸染料(PN7041)、和CellFix(PN7042)。第一轮测试使用在不同浓度下的抗-CD138铁磁流体。基于先前的流动数据，将最终抗-CD38PE浓度设定为1μg/ml（5.7μg/ml的染色试剂浓度）。最终抗-CD45APC浓度大约为2μg/ml（13μg/ml的染色试剂浓度-与
CTC试剂盒中相同）并在染色试剂中1:5稀释抗-CD19APC缀合物原液。在标记物试剂瓶中以1:4的浓度使用抗-CD56FITC。将H929细胞掺入7.5ml的CellSave血液并在上以135、185、220和270μg/ml的铁磁流体浓度处理。然后在CellTracksAnalyzer
上分析样品，且在约220μg/ml下H929细胞的回收率达到55-60%的平衡。
因此，这决定了试剂盒中的最终铁磁流体浓度将为每7.5ml血样220μg/ml，这类似于许多其他
试剂盒中使用的浓度。
回收H929和MM.1S细胞的
图像可分别见于图11和12。注意，H929细胞的CD56染色相比MM.1S细胞较高。遗留白血细胞（CD38+/CD45+）可见于图13。
实例7患者样品
共有66个多发性骨髓瘤患者样品进行了CMMC测试。从Conversant获得这些样品并且最初使用
CMMC服务试剂盒测试7.5ml血液，但因为许多样品具有高数目的CMMC变得明显，所以作出决定降低测试血液的体积至4mL。样品在
上处理，然后在CellTracks Analyzer
上扫描。图10是由患者的血样产生的数据表。多发性骨髓瘤患者中的CMMC范围为0-17,000/4.0mL血液。在91%的患者中检测到一个或多个CMMC，在68%患者中≥5，在58%患者中≥10而在35%患者中≥100。在患者群体中CD56的表达高度可变。MGUS患者中的CMMC范围为0-112/4.0mL血液。在6/7的患者中检测到一个或多个CMMC，在4/6患者中>5，在2/6患者中>10，而在1/6患者中>100。图14-17示出了来自患者样品的一些代表性
图像。
表1说明
阶段：骨髓瘤细胞量值和特性的诊断分类，其包括阶段I、II和III。随着阶段的进展，癌症细胞数从相对少数进展至中等再至相对多数。随着阶段的进展，附加的症状诸如M蛋白、贫血和血清钙也增加。
处理状态：反映疾病状态和处理方法
处理类型：药物或放射治疗
体积：在
系统上处理外周血的体积
总事件：
浏览器图像的总数呈现给使用者用于多发性骨髓瘤细胞的手动分类
总MM细胞（CD38+，CD19/45-）：使用者已确定符合多发性骨髓瘤(MM)细胞标准的来自总事件的图像总数。这些细胞为CD38阳性及CD19/45阴性。
CD38+、CD19/45-、CD56+：为CD56阳性的多发性骨髓瘤细胞数
CD38+、CD19/45-、CD56-：为CD56阴性的多发性骨髓瘤细胞数
未指定的事件：总事件减去总MM细胞，其为使用者分类为多发性骨髓瘤细胞的事件。未指定的事件是白血细胞、计算机噪音、或其他未分类为MM细胞的碎片的组合。
表1：CMMC多发性骨髓瘤患者样品表
实例8正常受试者
然后也如此测试二十二个年龄匹配的正常受试者。也从Conversant获得这些样本并使用
CMMC服务试剂盒测试4ml的血液。样品在
上处理，然后在CellTracksAnalyzer上扫描。表2是由4ml血样产生的数据表。在来自正常供体的4.0mL血液中，在12/22（55%）样品中检测到0CPC，而在10/22（45%）样品中检测到低数目（1-6CPC）。有趣地，有一个CD56阳性CPC存在于正常供体中。参见图18。总浏览器事件的平均数量大约为1500。
为进一步表征CMMC，并从CMMC中区分CPC，开发间期荧光原位杂交(FISH)测定法以与上述的捕获和检测系统一起使用。使用四色FISH探针同时检测高风险的突变，该突变包含IgH基因座(t(4;14)(p16;q32)和t(14;16)(q32;q23))的两个频发易位，以及TP53基因座(Δ17p13)的缺失。在细胞系H929、MM1s、和U266上检验FISH测定法，其分别示出了在t(4;14)，t(14;16)和Δ17p13处的突变。在9个CMMC患者样品上测试FISH测定法，并且8个样品得到了可评价的结果。两个样品示出了t(4;14)融合，3个患者示出了异常的FISH信号模式，指示4或14染色体的非整倍体，而剩余患者示出了正常的FISH模式。
表2：来自4ml年龄匹配的正常血液供体的CMMC表
实例9使用抗CD-38和抗CD138患者样品的捕获
抗CD138为缀合至用于捕获本发明中的骨髓瘤细胞的胶态磁性颗粒的细胞表面标记物，随着时间的推移其可从骨髓瘤细胞表面脱落。CD38为也存在于骨髓瘤细胞上的表面标记物，其不经历从细胞表面脱落。开发磁性纳米颗粒，该磁性纳米颗粒被联接到抗-CD138和抗-CD38两者且用患者样品和正常供体测试其捕获骨髓瘤细胞能力。抗-CD38和抗CD138两者缀合至藻红蛋白(PE)，且均识别与用于制作磁性纳米颗粒的抗CD38和抗CD-138不同的抗原决定部位，该两者和缀合至别藻蓝蛋白(APC)的抗-CD45和抗-CD19一起用于检测。
用替换的捕获试剂对共22个多发性骨髓瘤患者的样品测试CMMC。从Conversant获得这些样品并在
上处理4ml样品，然后在CellTracks Analyzer
上扫描。表3是由患者样品产生的表。多发性骨髓瘤患者中的CMMC范围为0-2244/4.0mL血液。在82%的患者中检测到一个或多个CMMC，在64%患者中>为5，在59%患者中>为10，而在23%患者中>为100。
表3：来自多发性骨髓瘤患者的CMMC
| 样品 | 总事件 | CD38+、CD138+CD19/45-细胞 | 未指定的事件 |
| 1 | 19065 | 737 | 18328 |
| 2 | 5420 | 433 | 4987 |
| 3 | 6098 | 12 | 6086 |
| 4 | 7680 | 22 | 7658 |
| 5 | 26561 | 2244 | 24317 |
| 6 | 7682 | 52 | 7630 |
| 7 | 18621 | 63 | 18558 |
| 8 | 14889 | 111 | 14778 |
| 9 | 7039 | 13 | 7026 |
| 10 | 12608 | 15 | 12593 |
| 11 | 9708 | 2 | 9706 |
| 12 | 34273 | 5 | 34268 |
| 13 | 21771 | 182 | 21589 |
| 14 | 7097 | 0 | 7097 |
| 15 | 2988 | 3 | 2985 |
| 16 | 7936 | 1 | 7935 |
| 17 | 10879 | 69 | 10810 |
| 18 | 4990 | 0 | 4990 |
| 19 | 6153 | 12 | 6141 |
| 20 | 4248 | 0 | 4248 |
| 21 | 13757 | 0 | 13757 |
| 22 | 3334 | 1 | 3333 |
实例9使用抗-CD38和抗CD138正常样品的捕获
然后使用与实例8相同的试剂盒配置，也如此测试十二个正常供体。这些样品在机构供体中并在
上处理4ml的血液，然后在CellTracks Analyzer
上扫描。表4是由4mL血样产生的表。在来自正常供体的4.0mL血液中，在5/12（42%）的样品中检测到了0CPC，而在7/12的样品（58%）中检测到低数目（1-3CPC）。
表4来自正常供体的CPC
| 样品 | 总事件 | CD38+CD138+、CD19/45-细胞 | 未指定的事件 |
| 1 | 7120 | 2 | 7118 |
| 2 | 13075 | 3 | 13072 |
| 3 | 9208 | 3 | 9205 |
| 4 | 29057 | 3 | 29054 |
| 5 | 20525 | 1 | 20526 |
| 6 | 19619 | 2 | 19617 |
| 7 | 6004 | 1 | 6003 |
| 8 | 14456 | 0 | 14456 |
| 9 | 8528 | 0 | 8528 |
| 10 | 7966 | 0 | 7966 |
| 11 | 17311 | 0 | 17311 |
| 12 | 5924 | 0 | 5924 |
Claims (32)
1.一种捕获、分离和分析循环多发性骨髓瘤细胞的方法，包括
(a)从测试受试者中获得血液的样品
(b)使所述样品与缀合至第一配体的胶态磁性颗粒接触
(c)使步骤（b）的样品经受磁场，以生产结合磁性颗粒的循环多发性骨髓瘤细胞的分离级分
(d)用第一附加标记物处理步骤（c）的样品
(e)分析循环多发性骨髓瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品具有约2mL至约10mL的体积。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品具有约3mL至约7.5mL的体积。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品具有约4mL的体积。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一配体选自抗-CD138、抗-CD38、和抗-CD56。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一配体选自抗-CD138、和抗-CD38。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一选自抗-CD138。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一配体选自抗-56。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶态磁性颗粒被缀合至第二配体，其中所述第一配体选自抗CD138、和抗-CD56并且所述第二配体为CD38。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一配体为CD138并且所述第二配体为CD38。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶态磁性颗粒被缀合至多于两个的配体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胶态磁性颗粒被缀合至抗-CD138、抗-CD38、和抗-CD56。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一附加标记物选自DAPI、抗-CD38抗CD19、和抗CD45抗CD138、抗CD56、抗λ、抗κ抗CD200、抗Ki67。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一附加标记物为抗CD38。
15.根据权利要求1所述的方法，还包括使步骤（c）的样品与第二附加标记物接触。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二附加标记物选自抗-CD19、抗-CD45、和DAPI。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二附加标记物为DAPI。
18.根据权利要求15所述的方法，还包括使步骤（c）的样品与第三附加标记物接触。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第三附加标记物选自抗-CD19、抗-CD45、和DAPI。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述第三附加标记物为抗-CD19。
21.根据权利要求18所述的方法，还包括使步骤（c）的样品与第四附加标记物接触。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第四附加标记物为抗-CD45。
23.根据权利要求1所述的方法，还包括使步骤（c）的样品与四个或更多个附加标记物接触。
24.一种确定患者的血液是否是与异常血浆细胞相关联的疾病的治疗干预的可能候选者的方法
(a)处理所述患者的血液以确定样品中有多少CMMC
(b)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述处理包括
(a)从测试受试者中获得血液的样品
(b)使所述样品与缀合至第一配体的胶态磁性颗粒接触
(c)使步骤（b）的样品经受磁场，以生产结合磁性颗粒的循环多发性骨髓瘤细胞的分离级分
(d)用第一附加标记物处理步骤（c）的样品
(e)分析循环多发性骨髓瘤细胞。
26.根据权利要求21所述的方法，其中患者样品中CMMC的正常范围在约2mL至10mL的血液中小于7个CMMC。
27.根据权利要求21所述的方法，还包括如果CMMC数在约2mL至约10mL的血液中大于8个，则推荐治疗干预。
28.一种确定经历治疗干预的患者是否减少CMMC数的方法，包括
(a)处理所述患者的血液以确定在第一时间点在样品中有多少CMMC
(b)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围
(c)处理所述患者的血液以确定在第二时间点在样品中有多少CMMC
(d)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围
(e)比较步骤（b）和（d）中的数目。
29.一种确定患有异常血浆细胞疾病并已成功治疗此类疾病的患者是否停留在缓解期的方法，包括
(a)处理所述患者的血液以确定在第一时间点在样品中有多少CMMC
(b)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围
(c)处理所述患者的血液以确定在第二时间点在样品中有多少CMMC
(d)通过计数确定存在于所述样品中的CMMC数是否等于或者大于或等于正常范围
(e)比较步骤（b）和（d）中的数目。
30.一种试剂，其用于捕获包含胶态磁性颗粒和至少一种配体的循环多发性骨髓瘤细胞。
31.根据权利要求30所述的试剂，其中所述配体选自抗CD138、抗-CD38、和抗-CD。
31.根据权利要求30所述的试剂，还包含至少两个配体。
32.根据权利要求30所述的试剂，还包含至少三个配体。
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