BR112014001423B1 - Métodos para capturar, isolar e analisar células circulantes de mieloma múltiplo em uma amostra e para determinar se um paciente é um candidato provável à intervenção terapêutica, bem como uso de partículas magnéticas coloidais e pelo menos dois ligantes - Google Patents
Métodos para capturar, isolar e analisar células circulantes de mieloma múltiplo em uma amostra e para determinar se um paciente é um candidato provável à intervenção terapêutica, bem como uso de partículas magnéticas coloidais e pelo menos dois ligantes Download PDFInfo
- Publication number
- BR112014001423B1 BR112014001423B1 BR112014001423-0A BR112014001423A BR112014001423B1 BR 112014001423 B1 BR112014001423 B1 BR 112014001423B1 BR 112014001423 A BR112014001423 A BR 112014001423A BR 112014001423 B1 BR112014001423 B1 BR 112014001423B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- antibody
- multiple myeloma
- cells
- patient
- sample
- Prior art date
Links
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 title claims abstract description 64
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 86
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 45
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 claims description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 22
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- RZBCCAZHJQZKLL-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-12-methyl-11h-indolo[2,3-a]carbazole-6-carbonitrile Chemical compound N1C2=C3N(C)C4=CC=C[CH]C4=C3C(OC)=C(C#N)C2=C2[C]1C=CC=C2 RZBCCAZHJQZKLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000021161 Plasma cell disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 19
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 17
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 17
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 15
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 14
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 12
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 12
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 101000874179 Homo sapiens Syndecan-1 Proteins 0.000 description 10
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000011554 ferrofluid Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 7
- 201000005328 monoclonal gammopathy of uncertain significance Diseases 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 5
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 208000010190 Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance Diseases 0.000 description 4
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 208000004346 Smoldering Multiple Myeloma Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 206010061728 Bone lesion Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100523490 Dictyostelium discoideum rab8A gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010090227 Immunoglobulin kappa-Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010004020 Immunoglobulin lambda-Chains Proteins 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000003705 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000058 Syndecan-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- -1 aloxy Chemical compound 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 1
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000004046 cell surface extension Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000014514 chromosome 17p deletion Diseases 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- GOTYRUGSSMKFNF-UHFFFAOYSA-N lenalidomide Chemical compound C1C=2C(N)=CC=CC=2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O GOTYRUGSSMKFNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004942 lenalidomide Drugs 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 125000002524 organometallic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 208000010721 smoldering plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XRASPMIURGNCCH-UHFFFAOYSA-N zoledronic acid Chemical compound OP(=O)(O)C(P(O)(O)=O)(O)CN1C=CN=C1 XRASPMIURGNCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940002005 zometa Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03C1/00—Magnetic separation
- B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
- B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03C1/00—Magnetic separation
- B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
- B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
- B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical applications
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
métodos para capturar e detectar células circulantes de mieloma múltiplo no sangue e para determinar se um paciente é um candidato provável à intervenção terapêutica, bem como uso de partículas magnéticas coloidais e pelo menos um ligante. a presente invenção refere-se aos métodos para isolar células circulantes de mieloma múltiplo bem como ao método para tratar pacientes suspeitos de ter doenças de células plasmáticas anormais.
Description
[001] Este pedido não provisório reivindica prioridade a um pedido de patente provisório, o pedido de patente US n° 61/510.170, depositado em 21 de julho de 2011.
[002] O mieloma múltiplo (também conhecido como mieloma oumieloma de células plasmáticas) é um câncer hematológico progressivo da célula plasmática. A condição é caracterizada por números excessivos de células plasmáticas na medula óssea e superprodução de imunoglobulina monoclonal intacta ou cadeias leves monoclonais livres.
[003] Clinicamente a doença é diagnosticada, estadiada e tratadacom base em uma variedade de parâmetros que incluem a massa celular tumoral do mieloma, com base na quantidade de proteína (proteína M) monoclonal (ou mieloma) no soro e/ou urina, junto com as concentrações de hemoglobina e cálcio no soro, o número de lesões ósseas líticas baseadas em uma pesquisa esquelética, e a presença ou ausência de insuficiência renal. Abordagens adicionais para caracterizar a condição incluem a detecção de mais do que dez por cento (10%) de células plasmáticas em um exame de medula óssea, a presença de plasmacitomas de tecido mole e a detecção de cadeias leves de imunoglobulina sérica kappa e lambda livres. O exame da medula óssea é feito utilizando histologia padrão e técnicas de imuno- histoquímica. Citogenética adicional de amostras da medula óssea pode ser conduzida para determinar o prognóstico. Inspeção de acompanhamento consiste em avaliações químicas e da medula óssea, caso seja indicado clinicamente devido à sua natureza invasiva.
[004] Atualmente a análise de citometria de fluxo da medula óssea está sendo avaliada como uma ferramenta para a caracterização da doença e para diferenciar os distúrbios neoplásicos de célula plas- mática das células plasmáticas normais e para detectar doenças residuais mínimas. Contudo, esta abordagem continua a depender de um procedimento invasivo. Há uma necessidade significativa para desenvolver técnicas menos invasivas para detectar, monitorar e caracterizar a doença através do seu histórico e a presença destas células no sangue pode fornecer esta oportunidade.
[005] Além disso, ferramentas mais sensíveis precisam ser desenvolvidas para uma avaliação mais precisa de risco e monitoramento para a progressão da doença em estágios precoces da doença, incluindo gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS) e mieloma múltiplo latente ou assintomático (Smoldering Multiple Myeloma). Alguns dados de pesquisas sugerem que células plasmáti- cas circulantes podem ser detectadas em estágios precoces da doença e podem se correlacionar com o prognóstico, suportando o uso de uma metodologia padronizada para capturar, enumerar e caracterizar estas células em estágios iniciais da doença.
[006] O consenso geral na literatura (Relatório da EuropeanMyeloma Network on Multiparametric Flow Cytometry in Multiple Myeloma and Related Disorders. Andy C. Rawstron et al. Haematolo- gica, 2008; 93 (3).) para a identificação de células plasmáticas anormais, particularmente por citometria de fluxo, incluiu diversos biomar- cadores chave consistindo primariamente em CD138, CD38 e CD45. Biomarcadores adicionais como CD19 e CD56 também demonstraram utilidade em diagnóstico.
[007] A presente invenção investiga células de mieloma circulantes para avaliar se estes biomarcadores em particular, tanto sozinhos quanto em combinação com um ou mais biomarcadores adicionais, ou com FISH, pode ser usado para a captura e detecção de células plas- máticas circulantes anormais, incluindo a detecção de doença residual mínima. FISH pode ser usado para detectar várias anormalidades ci- togenéticas que foram descritas em mielomas múltiplos. Transloca- ções no lócus de IGH, t(4;14), e deleções no lócus de p53, del(17p), têm mostrado valor prognóstico para sobrevida livre de eventos e so- brevida global em mieloma múltiplo. (Genetic Abnormalities and Survival in Multiple Myeloma: The Experience of the InterGroupe Fran-cophone du Myelome. Herve Avet-Loiseau et al. Blood, 2007; 109: 3489-3495) Estas sondas e vários outros marcadores para mieloma múltiplo estão disponíveis no catálogo Poseidon e podem ser adaptadas para uso com a plataforma CellTracks®.
[008] Existem kits de seleção imunomagnética comerciais utilizando partículas magnéticas de CD138. A Stem Cell Technologies tem um kit de seleção positiva de CD138 humana EasySep® que pode selecionar células positivas para CD138 da medula óssea e células mo- nonucleares de sangue periférico (PBMC) e a Miltenyi Biotech tem mi- croesferas de CD138 para a seleção de células positivas para CD138 a partir da medula óssea, PBMC e sangue total. A análise de amostras coletadas é tipicamente executada com o uso de citometria de fluxo.
[009] A invenção aqui descrita consiste em um método para acaptura e detecção de células plasmáticas circulantes (CPC) e células plasmáticas anormais ou células de mieloma múltiplo ("CMMC") incluindo a detecção de doença residual mínima a partir de sangue periférico. A presente invenção fornece um meio não invasivo para a detec- ção de números muito baixos de CMMCs em volumes de mililitros de amostras sanguíneas para detectar, monitorar e caracterizar a doença através do seu histórico, como também fornece as ferramentas mais sensíveis para uma avaliação mais precisa dos riscos e monitoramento da progressão da doença em estágios iniciais da doença, incluindo gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS) e mi- eloma múltiplo latente ou assintomático. A captura e caracterização destas células plasmáticas circulantes do sangue periférico pode proporcionar biomarcadores inovadores para o gerenciamento de pacientes com mieloma múltiplo.
[0010] Sangue é coletado em tubos CellSave que contém um preservativo que permite o transporte e armazenamento de sangue e minimiza a degradação celular. Células são capturadas utilizando partículas magnéticas coloidais conjugadas a Syndecan-1 ou CD138, um marcador de superfície celular presente em células plasmáticas. Uma vez capturadas, as células são marcadas com os marcadores celulares adicionais CD38-PE (Ficoeritrina), CD19 e CD45-APC (Aloficocia- nina), e CD56-FITC (isotiocianato de fluoresceína) para assim diferenciar as células de mieloma múltiplo dos leucócitos contaminantes de fundo (células brancas). Os reagentes de ferrofluido e marcadores celulares são todos parte de um novo kit de serviços CellSearch® CMMC. O kit consiste em 7 componentes, dos quais 4 são idênticos aos reagentes encontrados no kit de células epiteliais CellSearch® Epithelial Cell kit. Estes 4 reagentes comuns são o reagente de intensificação de captura (Capture Enhancement Reagent), reagente perme- abilizante (Perm Reagent), corante de ácido nucleico (Nucleic Acid Dye) e o fixador de células (CellFix). Os 3 reagentes novos consistem em ferrofluido de CD138, um reagente corante que consiste em CD38- PE, CD19 e CD45-APC e um reagente corante marcador que consiste em CD56-FITC.
[0011] A figura 1 ilustra a reatividade dos anticorpos de CD 138com certas linhagens celulares.
[0012] A figura 2 ilustra a reatividade dos anticorpos de CD 38 comcertas linhagens celulares.
[0013] A figura 3 ilustra a reatividade de diferentes anticorpos deCD19 APC testados em PBMC.
[0014] A figura 4 ilustra marcação de CD 19 APC em várias diluições.
[0015] A figura 5 ilustra marcação de anticorpos de CD 56 emPBMC.
[0016] A figura 6 ilustra marcação de CD 56 em várias linhagenscelulares.
[0017] A figura 7 ilustra marcação sem CD56.
[0018] A figura 8 ilustra marcação de CD 56 FITC de uma linhagem celular em uma diluição.
[0019] A figura 9 ilustra marcação de CD 56 FITC de uma linhagem celular em uma diluição.
[0020] A figura 10 ilustra marcação de CD 56 FITC de uma linhagem celular em uma diluição.
[0021] A figura 11 ilustra imagens representativas de células MM1S.
[0022] A figura 12 ilustra imagens representativas de células H929.
[0023] A figura 13 ilustra imagens representativas de células brancas residuais.
[0024] A figura 14 ilustra imagens de uma amostra de paciente.
[0025] A figura 15 ilustra imagens de uma amostra de paciente.
[0026] A figura 16 ilustra imagens de uma amostra de paciente.
[0027] A figura 17 ilustra imagens de uma amostra de paciente.
[0028] A figura 18 ilustra imagens de doadores normais.
[0029] A invenção inclui um método para capturar, isolar e analisarcélulas de mieloma múltiplo, compreendendo
[0030] (a) obter uma amostra de sangue de um indivíduo de teste
[0031] (b) colocar a dita amostra em contato com partículas magnéticas coloidais que são conjugadas a um primeiro ligante
[0032] (c) submeter a amostra da etapa (b) a um campo magnéticopara produzir uma fração separada de células circulantes de mieloma múltiplo ligadas a partículas magnéticas
[0033] (d) tratar a amostra da etapa (c) com um primeiro marcadoradicional
[0034] (e) analisar as células circulantes de mieloma múltiplo.
[0035] Como usado aqui, o termo "amostra" refere-se a uma quantidade de sangue, preferencialmente expresso como uma medição vo-lumétrica. O volume preferencial de uma amostra de sangue é de cerca de 2 mL a 10 ml, com mais preferência 3 a 7,5 ml, com a máxima preferência 4 ml. O termo "partículas magnéticas coloidais" se refere a partículas que são metálicas ou organometálicas. Exemplos de tais partículas são apresentados nas patentes US n°s 5.597.531; 5.698.271; 5.698.271; 6.365.662, que estão aqui incorporadas, por referência, em sua totalidade, particularmente por sua descrição de tais partículas magnéticas coloidais. Elas podem ser opcionalmente revestidas com um polímero, de preferência um polímero de origem biológica como albumina sérica bovina e caseína.
[0036] O termo "ligante" refere-se a proteínas que se ligam a marcadores associados a células de CMMCs ou de células plasmáticas circulantes ("CPC"s). As proteínas preferenciais são anticorpos, de preferência, anti-CD 138, anti-CD 38 e anti-CD 56, com mais preferência anti-CD 138 e anti-CD 38, com mais preferência ainda anti-CD 138. Tais ligantes podem ser conjugados a partículas magnéticas coloidais por métodos que são substancialmente similares aos métodos apresentados na patente US n° 6.365.662. Dois ou mais ligantes podem ser usados na etapa (b) da invenção e é preferencial que pelo menos dois ligantes sejam utilizados nesta etapa.
[0037] O termo "campo magnético" pode ser produzido por umadiversidade de métodos, particularmente por dois separadores magnéticos substancialmente conforme descrito na patente US n° 7.901.950, que está incorporada a título de referência, em sua totalidade. O termo "marcador adicional" significa uma proteína associada à célula que é específica para CMMC ou exclui CMMCs. Tais proteínas incluem, mas não se limitam a anticorpos selecionados do grupo consistindo em anti-CD38, anti-CD19, e anti-CD45, anti-CD 138, anti-CD 56, anti lambda, anti kappa, anti-CD 200, anti Ki67. Tais anticorpos podem ser marcados com indicadores como ficoeritrina, isotiocianato de fluoresceína e aloficocianina e é preferencial que sejam identificados com um ou mais marcadores. Marcadores adicionais podem incluir corantes de ácido nucleico como DAPI. O marcador adicional preferencial é selecionado do grupo consistindo em anti-CD38, anti-CD19 e anti-CD45; o marcador adicional particularmente preferencial é anti-CD38. Dois ou mais marcadores adicionais podem ser utilizados na etapa (d) da invenção e é preferencial que pelo menos dois marcadores adicionais sejam utilizados, com mais preferência, três marcadores adicionais, com a máxima preferência quatro marcadores adicionais.
[0038] O termo "analisar" significa avaliar a amostra capturadamagneticamente para determinar um ou mais dos seguintes: se a amostra contém CMMCs ou CPCs. Tal identificação pode ser conduzida visualmente ou eletronicamente para determinar o grau de fluorescência de uma amostra magneticamente capturada. Tais métodos de análise são apresentados na patente US n° 7.011.794 que está aqui incorporada, por referência. Particularmente, amostras capturadas magneticamente que são positivas para CD38 e negativas para CD19 e CD45 são identificadas como CMMCs.
[0039] A invenção inclui um método para determinar se o pacienteé um candidato provável para intervenção terapêutica para doenças associadas a células plasmáticas anormais
[0040] (a) processar sangue do dito paciente para determinarquantas CMMC estão na amostra
[0041] (b) determinar mediante contagem se o número de célulasCMMCs presentes na dita amostra é igual a, ou maior que, ou igual à faixa normal
[0042] Como usado aqui, o termo amostra tem seu significado supracitado e faixa preferencial. O termo "processamento" significa o tratamento de uma amostra sanguínea de um paciente através dos métodos aqui descritos para isolar e identificar os CMMCs.
[0043] O termo "intervenção terapêutica" significa buscar ou obterqualquer intervenção médica para o tratamento de doenças associadas a níveis plasmáticos anormais. Tais doenças incluem, mas não se limitam a mieloma múltiplo, MGUS e mieloma múltiplo latente. Tal intervenção terapêutica inclui, mas não se limita a visitar um médico, obter tratamento terapêutico como radiação, e tratamento com fármacos que tratem quaisquer destas doenças associadas a níveis plasmáticos anormais, e monitoramento do efeito destes tratamentos terapêuticos. Por exemplo, se um paciente está sendo tratado com um fármaco, os níveis de CMMC do paciente podem ser avaliados durante o curso do tratamento para determinar se o fármaco está funcionando. Tais fár- macos incluem, mas não se limitam a, dexametasona, ciclofosfamida, vincristina, bortezomibe, melfalana, zometa, aloxi, lenalidomida, doxor- rubicina e similares.
[0044] O termo "faixa normal" significa o número de células CMMCpresentes em uma amostra de população que não possui doenças as- sociadas com células plasmáticas anormais. De preferência, a faixa normal é menor do que 7 CMMCs em uma amostra sanguínea de cerca de 3 mL a cerca de 7,5 ml. O termo "maior que a faixa normal" é um número de CMMCs acima da faixa normal. Quanto maior este número, maior a possibilidade de que o paciente tenha uma das doenças associadas com células plasmáticas anormais. Se um paciente tem entre 8 e 20 CMMCs em uma amostra de sangue, tal paciente tem uma probabilidade maior de possuir uma das doenças associadas a células plasmáti- cas anormais. Se um paciente tem entre 21 e 49 CMMCs, o paciente tem um nível elevado e é mais provável que possua uma das doenças associadas a células plasmáticas anormais, se um paciente tem entre 50 e centenas de milhares de CMMCs, este paciente tem um nível muito elevado e é ainda mais provável que possua uma destas doenças.
[0045] E ainda, adicionalmente, a invenção inclui um método paradeterminar se um paciente sendo submetido à intervenção terapêutica apresenta redução nos números de CMMCs, que compreende
[0046] (a) processar o sangue do dito paciente para determinarquantas CMMC estão na amostra em um primeiro ponto no tempo
[0047] (b) determinar mediante contagem se o número de CMMCspresentes na dita amostra é igual a, ou maior que, ou igual à faixa normal
[0048] (c) processar o sangue do dito paciente para determinarquantas CMMC estão na amostra em um segundo ponto no tempo
[0049] (d) determinar mediante contagem se o número de CMMCspresentes na dita amostra é igual a, ou maior que, ou igual à faixa normal
[0050] (e) comparar os números nas etapas (b) e (d)
[0051] Todos os termos supracitados tem seu mesmo significado efaixa preferencial.
[0052] Ainda adicionalmente, a invenção inclui um método para determinar se um paciente que possui uma doença de células plasmá- ticas anormais e foi tratado com sucesso para determinada doença, permanece em remissão, que compreende
[0053] (a) processar o sangue do dito paciente para determinarquantas CMMC estão na amostra em um primeiro ponto no tempo
[0054] (b) determinar mediante contagem se o número de CMMCspresentes na dita amostra é igual a, ou maior que, ou igual à faixa normal
[0055] (c) processar o sangue do dito paciente para determinarquantas CMMC estão na amostra em um segundo ponto no tempo
[0056] (d) determinar mediante contagem se o número de CMMCspresentes na dita amostra é igual a, ou maior que, ou igual à faixa normal
[0057] (e) comparar os números nas etapas (b) e (d).
[0058] Todos os termos supracitados tem seu mesmo significado efaixas preferenciais.
[0059] Ainda mais adicionalmente, a invenção inclui um reagentepara capturar células circulantes de mieloma múltiplo, compreendendo partículas magnéticas coloidais e pelo menos um ligante.
[0060] Todos os termos supracitados tem seu mesmo significado efaixas preferenciais.
[0061] Ainda mais adicionalmente, a invenção inclui métodos paracapturar, isolar e analisar células plasmáticas circulantes, que compreendem
[0062] (a) obter uma amostra de sangue de um indivíduo de teste
[0063] (b) colocar a dita amostra em contato com partículas magnéticas coloidais que são conjugadas a um primeiro ligante
[0064] (c) submeter a amostra da etapa (b) a um campo magnéticopara produzir uma fração separada de células circulantes de mieloma múltiplo ligadas a partículas magnéticas
[0065] (d) tratar a amostra da etapa (c) com um primeiro marcadoradicional
[0066] (e) analisar células plasmáticas circulantes.
[0067] Todos os termos supracitados tem seu mesmo significado efaixas preferenciais.
[0068] Células de mieloma múltiplo circulantes (CMMC), uma forma de células plasmáticas anormais, capturadas do sangue, foram capturadas e analisadas utilizando os sistemas CellTracks® AutoPrep® e CellTracks Analyzer II®. Neste procedimento, uma combinação de reagente de captura (ferrofluido) e biomarcadores fluorescentes (como anticorpo anti-CD38-Ficoeritrina (PE)) e corantes (como o corante de ácido nucleico DAPI) são usados para identificar células plasmáticas anormais e distingui-las de leucócitos contaminantes e detritos. CD138 ou Sindecan-1 é um marcador de superfície celular em células plasmáticas maduras e em malignidades como mieloma múltiplo mas não em outros leucócitos de sangue periférico normal. Por esta razão o anti-CD138 foi acoplado ao ferrofluido, nanopartículas mag-néticas, que são utilizadas para selecionar magneticamente células plasmáticas circulantes de uma amostra de sangue periférico. Para detectar as células plasmáticas anormais a partir dos leucócitos contami- nantes, vários biomarcadores fluorescentes são utilizados. Anti-CD38 é conjugado à ficoeritrina (PE) e é utilizado como um marcador positivo para a detecção de células plasmáticas. Entretanto já que CD38 é também encontrado em alguns tipos de leucócitos (células T e B ativadas) o ensaio também usa aloficocianina (APC) conjugada a anti- CD45 e anti-CD19 conjugada a aloficocianina (APC) como um marcador negativo. CD45 é um marcador pan-leucocitário encontrado em leucócitos de sangue periférico e CD19 é um marcador celular B- específico. Células de mieloma são células B funcionalmente diferenciadas que não expressam CD45 ou CD19. Um marcador final neste ensaio é o anti-CD56 conjugado ao isotiocianato de fluoresceína (FITC). CD56 pode ser encontrado em alguns subconjuntos de leucócitos periféricos como células NK mas também é expresso em 75% de células de mieloma e está associado com frequência a um prognóstico menos satisfatório do paciente. Deste modo, embora CD56 não seja um marcador positivo ou negativo para mieloma múltiplo, seus níveis de expressão em células podem ser monitorados durante a terapia farmacológica do paciente.
[0069] O ensaio foi inicialmente desenvolvido utilizando linhagenscelulares como RPMI 8226, H929 e MM.1S para avaliar diferentes anticorpos para os marcadores determinados como estando presentes em células de mieloma múltiplo, que incluem CD138, CD38 e CD56. Já que estas linhagens celulares foram negativas para CD45 e CD19, PBMCs foram utilizadas para avaliar estes anticorpos.
[0070] As células enriquecidas e marcadas foram transferidas paraum cartucho CellTracks® e MagNest® para suporte magnético. O cartucho foi analisado utilizando o CellTracks Analyzer II®. Imagens individuais das células foram apresentadas ao operador para revisão, e classificadas como CMMCs com base na fluorescência e na morfologia celular. Em um sistema de enriquecimento modelo, o ensaio recuperou de forma consistente ~60% das células da linhagem celular de mielo- ma múltiplo H929 enriquecidas em 4,0 mL de sangue de doadores saudáveis. O ensaio foi linear em relação à faixa testada de 0 a 2.000 células H929 enriquecidas (r2 0,98, coeficiente angular 0,50, intercep- tação 10). O ensaio foi validado utilizando sangue de doadores saudáveis com idade comparável (n=22) e pacientes com mieloma múltiplo (n=66) e MGUS (n=7). Em 4,0 mL de sangue de doadores normais, 0 CPC foi detectado em 12/22 (55%) e números baixos (1-6 CPC) foram detectados em 10/22 (45%) das amostras. Interessantemente, um CPC positivo para CD56 foi encontrado em um doador normal. CMMC em pacientes com mieloma múltiplo situavam-se na faixa de 0 a 17.000 /4,0 mL de sangue. Um ou mais CMMCs foram detectados em 91% dos pacientes, > 5 em 68%, > 10 em 58% e > 100 em 35%. A expressão de CD56 foi altamente variável na população de pacientes. O CMMC em pacientes MGUS situava-se na faixa de 0 a 112 /4,0 mL de sangue. Um ou mais CMMCs foram detectados em 6/7 dos pacientes, > 5 em 4/6, > 10 em 2/6 e > 100 em 1/6.
[0071] Para adicionalmente caracterizar CMMC, e diferenciar CPCde CMMC, um ensaio de hibridização in situ por fluorescência (FISH) em interfase foi desenvolvido para ser utilizado com o sistema de captura e detecção descrito acima. Uma sonda de quatro cores FISH foi utilizada para detectar simultaneamente mutações de alto risco. Os exemplos a seguir ilustram a invenção.ExemplosAbreviaçõesPE-ficoeritrinaFITC-isotiocianato de fluoresceínaAPC-aloficocianinaPBMC-células mononucleares do sangue periféricoFontes de anticorposCD138:Gen-Probe Diaclone SAS1 Bd A Fleming, BP 1985 F-25020 Besancon Cedex, França CD38 e CD19R&D Systems614 McKinley Place N.E.Minneapolis, MN 55413, EUAExemplo 1. Alvos de captura
[0072] A figura 1 mostra que, entre anticorpos anti-CD138 testados para reatividade com as linhagens celulares RPMI 8226, H929 eMM.1S, o anticorpo com melhor desempenho foi o clone B-A38. As linhagens celulares foram primeiramente marcadas com os diferentes anticorpos, todos sendo anticorpos anti-humanos de camundongo, depois subsequentemente marcadas com um conjugado PE anti- camundongo e analisadas por citometria de fluxo. O clone B-A38 forneceu a maior coloração fluorescente em todas as linhagens celulares de mieloma múltiplo.Exemplo 2. Alvos de detecção
[0073] A figura 2 mostra que, dos anticorpos anti-CD38 testados para reatividade com as linhagens celulares RPMI 8226, H929 e MM.1S, o anticorpo com melhor desempenho foi o clone 240742. As linhagens celulares foram inicialmente testadas utilizando um conjugado anti-CD38- FITC direto, mas depois descobriu-se que o conjugado FITC não era suficientemente adequado para detecção na plataforma CellTracks®. Um conjugado PE deste anticorpo foi subsequentemente preparado e testado e foi observado que o mesmo é adequado para a detecção.Exemplo 3. Determinação da diluição
[0074] O anti-CD19 e anti-CD45, ambos como conjugados APC,foram escolhidos como marcadores de detecção negativa já que a ausência de ambos é indicativa de células plasmáticas anormais. O anti- CD45APC já é um componente do reagente de coloração CellSearch® CTC então não foi necessária otimização adicional. E já que nenhuma das linhagens celulares de mieloma sendo avaliadas expressou CD19, PBMCs foram utilizadas para avaliar os diferentes clones anti- CD19APC. Os resultados dos testes com anti-CD19 em PBMC podem ser vistos na figura 3. A marcação foi conduzida de acordo com os protocolos recomendados do fabricante em PBMC coletadas de tubos EDTA e CellSave. O clone SJ25C1 foi escolhido como o conjugado de melhor desempenho. O conjugado foi então testado em várias diluições nos mesmos volumes de reação utilizados no AutoPrep®, figura 4. Uma diluição de 1:5 foi escolhida como a diluição final para a marcação.Exemplo 4. Marcação de CD56 e PBMC
[0075] O anti-CD56 foi escolhido como um reagente de marcaçãoFITC já que é expresso em 75% dos casos de mieloma com expressão anormal. Os testes foram conduzidos em linhagens celulares (figura 6) e PBMC (figura 5) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. NCAM 16.2 foi escolhido como o conjugado de melhor desempenho.Exemplo 5. Diluições de CD-56 FITC
[0076] O conjugado NCAM 16.2 anti-CD56 FITC foi testado em várias diluições com células H929 em AutoPrep®, consulte as figuras 7 a 10. Nenhuma diluição clara testada foi melhor na linhagem celular. Uma diluição de 1:4 foi escolhida como a diluição final para marcação até que as amostras dos pacientes pudessem ser testadas para ajudar a determinar a concentração ótima.Exemplo 6. Imagens
[0077] Um kit de protótipo de CMMC foi então construído, consistindo em um ferrofluido anti-CD138, reagente de marcação consistindo em anti-CD38 PE, anti-CD45 APC e anti-CD19 APC e um reagente marcador anti-CD56 FITC. Os componentes restantes do kit foram o reagente de intensificação de captura (PN 7037), reagente de perme- abilização (PN 7038), corante de ácido nucleico (PN 7041), e CellFix (PN 7042). A primeira rodada de testes utilizou ferrofluido anti-CD138 em diferentes concentrações. A concentração final de anti-CD38 PE foi definida em 1 μg/mL (concentração de reagente de marcação de 5,7 μg/ml) com base nos dados de fluxo anteriores. A concentração final de anti-CD45 APC foi aproximadamente 2 μg/mL (concentração de reagente de marcação de 13 μg/mL - a mesma que no kit CellSearch® CTC) e o conjugado estoque anti-CD19 APC foi diluído a 1:5 no reagente de marcação. Anti-CD56 FITC foi utilizado a uma concentração de 1:4 no frasco de reagente de marcação. Células H929 foram enriquecidas em 7,5 mL de sangue CellSave e processadas em AutoPrep® em concentrações de ferrofluido de 135, 185, 220 e 270 μg/mL. As amostras foram então analisadas no CellTracks Analyzer II® e a recuperação das células H929 alcançou um platô de 55 a 60% a cerca de 220 μg/mL.
[0078] Então foi decidido que a concentração final de ferrofluido nokit seria de 220 μg/mL por 7,5 mL de amostra sanguínea, que é similar às concentrações usadas em muitos outros kits CellSearch®.
[0079] Imagens do CellTracks® de células H929 e MM.1S recuperadas podem ser vistas nas figuras 11 e 12, respectivamente. Note a maior marcação de CD56 de células H929, comparadas às células MM.1S. Células brancas sanguíneas residuais (CD38+/CD45+) podem ser vistas na figura 13.Exemplo 7. Amostras de pacientes
[0080] Um total de 66 amostras de pacientes com mieloma múltiplo foram testadas para CMMC. Estas amostras foram adquiridas junto à Conversant e originalmente 7,5 mL de sangue foram testados utilizando o kit de serviço CellTracks® CMMC mas como se tornou aparente que muitas amostras possuíam altos números de CMMC, foi tomada uma decisão para reduzir o volume de sangue testado para 4 ml. As amostras foram processadas no CellTracks® AutoPrep® e então analisadas no CellTracks Analyzer II®. A figura 10 é uma tabela de dados gerados a partir do sangue de pacientes. A CMMC em pacientes com mieloma múltiplo situava-se na faixa de 0 a 17.000 /4,0 mL de sangue. Uma ou mais CMMCs foram detectadas em 91% dos pacientes, > 5 em 68%, > 10 em 58% e > 100 em 35%. A expressão de CD56 foi altamente variável na população de pacientes. A CMMC em pacientes MGUS situava-se na faixa de 0 a 112 /4,0 mL de sangue. Uma ou mais CMMCs foram detectadas em 6/7 dos pacientes, > 5 em 4/6, > 10 em 2/6 e > 100 em 1/6. As figuras 14 a 17 mostram algumas imagens representativas do CellTracks®, de amostras de pacientes.Legenda da tabela 1
[0081] Estágio: Uma classificação de diagnóstico da extensão ecaracterísticas de células de mieloma compreendendo os estágios I, II e III. O número de células cancerígenas progride de relativamente poucas a moderadas até relativamente muitas, conforme o estágio avança. Sintomas adicionais como proteína M, anemia e cálcio no soro também aumentam conforme os estágios avançam.
[0082] Estado do tratamento: Reflete o estado da doença e aabordagem para o tratamento
[0083] Tipo de tratamento: Terapia com fármacos ou radiação
[0084] Volume: Volume de sangue periférico processado no sistema CellSearch®
[0085] Eventos totais: Número total de imagens do navegadorCellTracks® apresentadas ao usuário para uma classificação manual das células de mieloma múltiplo
[0086] Células MM totais (CD38+, CD19/45-): Número total deimagens dos eventos totais que o usuário determinou como satisfazendo os critérios de uma célula de mieloma múltiplo (MM). Estas células são CD38-positivas e CD19/45-negativas.
[0087] CD38+, CD19/45-, CD56+: O número de células de mielo-ma múltiplo que eram CD56-positivas
[0088] CD38+, CD19/45-, CD56-: O número de células de mielomamúltiplo que eram CD56-negativas
[0089] Eventos não designados: Os eventos totais menos as células MM totais, que eram eventos que o usuário classificou como células de mieloma múltiplo. Eventos não designados são uma combinação de células brancas sanguíneas, ruído de computador ou outros detritos não classificados como células MM. Tabela 1: Tabela de amostras de pacientes com mieloma múltiplo CMMC
Exemplo 8. Indivíduos normais
[0090] Vinte e dois indivíduos normais com idade comparável foram então também testados. Estas amostras foram também adquiridas junto à Conversant e 4 mL de sangue foram testados utilizando o kit de serviço CellTracks® CMMC. As amostras foram processadas no Cell-Tracks® AutoPrep® e então analisadas no CellTracks Analyzer II®. A tabela 2 é uma tabela de dados gerada das amostras de sangue de 4 ml. Em 4,0 mL de sangue de doadores normais, 0 CPC foi detectado em 12/22 (55%) e números baixos (1 a 6 CPC) foram detectados em 10/22 (45%) das amostras. De forma interessante, uma CPC positiva para CD56 foi encontrada em um doador normal. Consulte a figura 18. O número médio de eventos totais do navegador foi de aproximadamente 1.500.
[0091] Para caracterizar adicionalmente CMMC, e diferenciar CPCde CMMC, um ensaio de hibridização in situ por fluorescência (FISH) em interfase foi desenvolvido para ser utilizado com o sistema de captura e detecção descrito acima. Uma sonda FISH de quatro cores foi usada para detectar simultaneamente mutações de alto risco, incluindo duas translocações recorrentes do locus de IgH (t(4;14)(p16;q32) e t(14;16)(q32;q23)), como também a deleção do locus de TP53 (Δ17p13). O ensaio FISH foi verificado nas linhagens celulares H929, MM1s e U266, que exibiram mutações em t(4;14), t(14;16) e Δ17p13, respectivamente. O ensaio FISH foi testado em 9 amostras de pacientes de CMMC e 8 amostras exibiram resultados avaliáveis. Duas amostras exibiram fusões t(4;14), 3 pacientes exibiram padrões de sinal FISH aberrantes, indicando aneuploidia do cromossomo 4 ou 14 e os pacientes restantes exibiram padrões FISH normais.Tabela 2: Tabela de CMMC a partir de 4 mL de doadores de sangue normais com idade comparável
Exemplo 9. Captura utilizando amostras de pacientes anti-CD 38 e an- ti-CD 138
[0092] Anti-CD138, o marcador de superfície conjugado às partículas magnéticas coloidais utilizado para capturar células de mieloma na presente invenção pode se projetar da superfície da célula de mieloma com o passar do tempo. CD38, um marcador de superfície também presente em células de mieloma, não sofre projeção da superfície celular. Uma nanopartícula magnética foi desenvolvida e então acoplada a ambos anti-CD138 e anti-CD38 e testada com ambas as amostras de pacientes e doadores normais em busca da habilidade de capturar células de mieloma. Anti-CD38 e anti-CD138 ambos conjugados à fi- coeritrina (PE) e ambos reconhecendo diferentes epítopes do que os anti-CD38 e anti-CD138 utilizados na fabricação da nanopartícula magnética, foram utilizados para detecção juntamente com anti-CD45 e anti-CD19 conjugados à aloficocianina (APC).
[0093] Um total de 22 amostras de pacientes com mieloma múltiplo foram testadas em busca de CMMC utilizando o reagente de captura alternativo. Estas amostras foram adquiridas junto à Conversant e 4 mL foram processados no CellTracks® AutoPrep® e então analisadas no CellTracks Analyzer II®. A tabela 3 é uma tabela gerada a partir das amostras dos pacientes. CMMC em pacientes com mieloma múltiplo situavam-se na faixa de 0 a 2.244/4,0 mL de sangue. Uma ou mais CMMCs foram detectadas em 82% dos pacientes, > 5 em 64%, > 10 em 59% e > 100 em 23%.Tabela 3: de CMMC de pacientes com mieloma múltiplo
Exemplo 9 captura utilizando amostras normais anti-CD 38 e anti-CD 138
[0094] Doze doadores normais foram também testados, utilizandoa mesma configuração de kit que o exemplo 8. Estas amostras eram de doadores internos e 4 mL de sangue foi processado no CellTracks® AutoPrep® e, então, analisadas no CellTracks Analyzer II®. A tabela 4 é uma tabela gerada das amostras de sangue de 4 mL. Em 4,0 mL de sangue de doadores normais, 0 CPC foi detectado em 5/12 (42%) e números baixos (1-3 CPC) foram detectados em 7/12 (58%) das amostras.Tabela 4 de CPC de doadores normais
Claims (7)
1. Método para capturar, isolar e analisar células circulantes de mieloma múltiplo em uma amostra de sangue obtido de um indivíduo de teste, caracterizado pelo fato de que compreende(a) contatar a dita amostra com partículas magnéticas coloidais, em que cada uma das partículas magnéticas coloidais é conjugada tanto a um anticorpo anti-CD138 quanto a um anticorpo anti-CD38;(b) submeter a amostra contatada com partículas magnéticas da etapa (a) a um campo magnético para produzir uma fração separada de células circulantes de mieloma múltiplo ligadas às partículas magnéticas;(c) adicionar à fração separada de células circulantes de mieloma da etapa (b) pelo menos um marcador associado à célula; e(d) analisar as células circulantes de mieloma múltiplo da etapa (c).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador associado a célula é selecionado do grupo que consiste em: DAPI, anticorpo anti-CD19, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD 56, anticorpo anti-lambda, anticorpo anti-kappa, anticorpo anti-CD 200 e anticorpo anti-Ki67.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador associado a célula é selecionado do grupo que consiste em: anticorpo anti-CD19, anticorpo anti-CD45 e DAPI.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois marcadores associados a célula são selecionados do grupo que consiste em anticorpo anti-CD19, anticorpo anti-CD45 e DAPI.
5. Método para determinar se um paciente é um candidato provável à intervenção terapêutica para doenças associadas com células plasmáticas anormais, caracterizado pelo fato de que compreende(a) processar uma amostra de sangue do dito paciente para determinar quantas células circulantes de mieloma múltiplo (CMMC) estão na amostra de sangue, em que o processamento compreende o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e(b) determinar mediante contagem se o número de CMMCs presentes na dita amostra de sangue é igual a, ou maior que, ou igual à faixa normal.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recomendar intervenção terapêutica se o número de CMMCs for maior que 7 em cerca de 2 mL a cerca de 10 mL de sangue.
7. Uso de partículas magnéticas coloidais e pelo menos dois ligantes, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um reagente para capturar células circulantes de mieloma múltiplo, em que os pelo menos dois ligantes compreendem anticorpos anti-CD138 e anti-CD38.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161510170P | 2011-07-21 | 2011-07-21 | |
| US61/510,170 | 2011-07-21 | ||
| PCT/US2012/047747 WO2013013222A1 (en) | 2011-07-21 | 2012-07-20 | Assay to capture and detect circulating multiple myeloma cells from blood |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112014001423A2 BR112014001423A2 (pt) | 2017-07-18 |
| BR112014001423B1 true BR112014001423B1 (pt) | 2021-09-21 |
Family
ID=46584417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112014001423-0A BR112014001423B1 (pt) | 2011-07-21 | 2012-07-20 | Métodos para capturar, isolar e analisar células circulantes de mieloma múltiplo em uma amostra e para determinar se um paciente é um candidato provável à intervenção terapêutica, bem como uso de partículas magnéticas coloidais e pelo menos dois ligantes |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9618515B2 (pt) |
| EP (1) | EP2734307B1 (pt) |
| JP (2) | JP6301250B2 (pt) |
| CN (3) | CN114460286A (pt) |
| BR (1) | BR112014001423B1 (pt) |
| CA (1) | CA2842679C (pt) |
| CY (1) | CY1123172T1 (pt) |
| DK (1) | DK2734307T3 (pt) |
| ES (1) | ES2799581T3 (pt) |
| HK (1) | HK1259414A1 (pt) |
| HR (1) | HRP20200961T1 (pt) |
| HU (1) | HUE049527T2 (pt) |
| LT (1) | LT2734307T (pt) |
| MX (1) | MX351113B (pt) |
| PL (1) | PL2734307T3 (pt) |
| PT (1) | PT2734307T (pt) |
| RS (1) | RS60783B1 (pt) |
| SI (1) | SI2734307T1 (pt) |
| TW (2) | TWI663399B (pt) |
| WO (1) | WO2013013222A1 (pt) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9823238B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-21 | Menarini Silicon Biosystems, Inc. | Molecular characterization of circulating tumor cells |
| US20230059544A1 (en) * | 2017-02-28 | 2023-02-23 | Menarini Silicon Biosystems, S.p.A. | Kits and assays to detect circulating multiple myeloma cells from blood |
| US11103351B2 (en) | 2017-04-05 | 2021-08-31 | Opus Medical Therapies, LLC | Transcatheter atrial sealing skirt and related method |
| US11337685B2 (en) | 2017-04-05 | 2022-05-24 | Opus Medical Therapies, LLC | Transcatheter anchoring assembly for a mitral valve, a mitral valve, and related methods |
| US11123187B2 (en) | 2017-04-05 | 2021-09-21 | Opus Medical Therapies, LLC | Transcatheter atrial anchors and methods of implantation |
| US10820992B2 (en) | 2017-04-05 | 2020-11-03 | Opus Medical Therapies, LLC | Transcatheter atrial sealing skirt, anchor, and tether and methods of implantation |
| CA3059102C (en) | 2017-04-05 | 2023-01-03 | Opus Medical Therapies, LLC | Transcatheter atrial sealing skirt, anchor, and tether and methods of implantation |
| CN109991410B (zh) * | 2017-12-29 | 2022-07-05 | 上海白泽医学检验所有限公司 | 一种含抗cd45单抗的组合物及其使用方法 |
| CN109270262B (zh) * | 2018-10-08 | 2022-05-20 | 宁波美晶医疗技术有限公司 | 一种基于微流体技术的激光单细胞提取方法 |
| CN115135281A (zh) | 2020-01-22 | 2022-09-30 | 欧普斯医疗疗法有限公司 | 经导管锚支撑件、系绳装置、植入系统和方法 |
| AU2021351697A1 (en) | 2020-10-01 | 2023-06-08 | Opus Medical Therapies, LLC | Transcatheter anchor support and methods of implantation |
| CN112698037B (zh) * | 2021-03-25 | 2021-06-25 | 北京积水潭医院 | 一种检测多发性骨髓瘤治疗效果的抗体组合物及其试剂盒和应用 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5597531A (en) | 1985-10-04 | 1997-01-28 | Immunivest Corporation | Resuspendable coated magnetic particles and stable magnetic particle suspensions |
| US5698271A (en) | 1989-08-22 | 1997-12-16 | Immunivest Corporation | Methods for the manufacture of magnetically responsive particles |
| US5646001A (en) * | 1991-03-25 | 1997-07-08 | Immunivest Corporation | Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof |
| US5840502A (en) | 1994-08-31 | 1998-11-24 | Activated Cell Therapy, Inc. | Methods for enriching specific cell-types by density gradient centrifugation |
| CA2318122C (en) | 1998-01-16 | 2007-10-23 | Doppel Co., Ltd. | Non-slip artificial stone |
| BR9907852A (pt) | 1998-02-12 | 2000-10-24 | Immunivest Corp | Processos para detectar e enumerar células raras e cancerosas em uma população celular mista, para diagnosticar câncer de estágio precoce em um paciente de teste, para determinar a probabilidade de recorrência de câncer em um paciente humano anteriormente tratado de câncer, para distinguir um carcinoma confinado ao órgão de um carcinoma com propriedades metastáticas, para acompanhar a situação de remissão em um paciente humano com câncer que passa pelo tratamento de terapia contra o câncer e para aumentar quantidades de células epiteliais circulantes em uma amostra de sangue, partìcula magnética revestida, composição, conjuntos de teste para avaliar uma amostra de paciente quanto a presença de células raras circulantes, quanto a presença de células de tumor circulantes, quanto a presença de células de câncer de mama circulantes, quanto a presença de células de câncer de próstata circulantes, quanto a presença de células de câncer de cólon circulantes, quanto a presença de células de câncer de bexiga circulantes e para monitorar um paciente quanto a recorrência de câncer, e, fração de sangue periférico enriquecido quanto a células neoplásticas circulantes |
| US6623982B1 (en) * | 1999-07-12 | 2003-09-23 | Immunivest Corporation | Increased separation efficiency via controlled aggregation of magnetic nanoparticles |
| WO2001017687A2 (en) * | 1999-09-03 | 2001-03-15 | Miltenyi Biotec Gmbh | Methods of modification of selected cells in a magnetic cell separation column |
| US7863012B2 (en) * | 2004-02-17 | 2011-01-04 | Veridex, Llc | Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris |
| US7668659B2 (en) | 2001-11-07 | 2010-02-23 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Diagnosis and classification of multiple myeloma |
| US7011794B2 (en) | 2002-11-25 | 2006-03-14 | Immunivest Corporation | Upon a cartridge for containing a specimen sample for optical analysis |
| US7901950B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-03-08 | Veridex, Llc | Method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells |
| ES2397971T3 (es) | 2006-06-02 | 2013-03-12 | Pfizer Products Incorporated | Ensayo de células tumorales circulantes |
| JP2010502210A (ja) * | 2006-09-07 | 2010-01-28 | ウニベルシダド・デ・サラマンカ | 遺伝子マーカーを使用する癌幹細胞の同定 |
| EP2066689A4 (en) | 2006-09-07 | 2010-04-28 | Univ South Florida | HYD1 PEPTIDES AS ANTICANCER AGENTS |
| EP2067045B1 (en) | 2006-09-28 | 2020-08-05 | The Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Limited | Method for determining the cd4+ t-cell count and kit therefor |
| MX2010005811A (es) | 2007-11-27 | 2010-06-09 | Veridex Llc | Enumeracion automatica y caracterizacion de las celulas del melanoma circulantes en la sangre. |
| US20110269638A1 (en) * | 2011-04-29 | 2011-11-03 | Epstein Joshua | Genes associated with post relapse survival and uses thereof |
-
2012
- 2012-07-20 RS RS20200689A patent/RS60783B1/sr unknown
- 2012-07-20 MX MX2014000804A patent/MX351113B/es active IP Right Grant
- 2012-07-20 HU HUE12740854A patent/HUE049527T2/hu unknown
- 2012-07-20 CN CN202111649476.4A patent/CN114460286A/zh active Pending
- 2012-07-20 JP JP2014521855A patent/JP6301250B2/ja active Active
- 2012-07-20 CA CA2842679A patent/CA2842679C/en active Active
- 2012-07-20 DK DK12740854.0T patent/DK2734307T3/da active
- 2012-07-20 CN CN201711460248.6A patent/CN108375676B/zh active Active
- 2012-07-20 BR BR112014001423-0A patent/BR112014001423B1/pt active IP Right Grant
- 2012-07-20 US US13/554,623 patent/US9618515B2/en active Active
- 2012-07-20 PL PL12740854T patent/PL2734307T3/pl unknown
- 2012-07-20 WO PCT/US2012/047747 patent/WO2013013222A1/en active Application Filing
- 2012-07-20 LT LTEP12740854.0T patent/LT2734307T/lt unknown
- 2012-07-20 ES ES12740854T patent/ES2799581T3/es active Active
- 2012-07-20 EP EP12740854.0A patent/EP2734307B1/en active Active
- 2012-07-20 SI SI201231791T patent/SI2734307T1/sl unknown
- 2012-07-20 PT PT127408540T patent/PT2734307T/pt unknown
- 2012-07-20 CN CN201280046226.4A patent/CN103826750B/zh active Active
- 2012-07-23 TW TW105127783A patent/TWI663399B/zh active
- 2012-07-23 TW TW101126473A patent/TWI605122B/zh active
-
2018
- 2018-02-28 JP JP2018034448A patent/JP6821619B2/ja active Active
-
2019
- 2019-01-31 HK HK19101784.7A patent/HK1259414A1/zh unknown
-
2020
- 2020-06-12 CY CY20201100541T patent/CY1123172T1/el unknown
- 2020-06-17 HR HRP20200961TT patent/HRP20200961T1/hr unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BR112014001423B1 (pt) | Métodos para capturar, isolar e analisar células circulantes de mieloma múltiplo em uma amostra e para determinar se um paciente é um candidato provável à intervenção terapêutica, bem como uso de partículas magnéticas coloidais e pelo menos dois ligantes | |
| JP6352588B2 (ja) | 希少ではない細胞を用いて希少細胞を検出する方法 | |
| JP2015505966A (ja) | 循環腫瘍細胞を特定するための装置、システム、及び方法 | |
| JP2011505012A (ja) | 血液中の循環黒色腫細胞の自動計数及び特徴付け | |
| Dimopoulos et al. | Non-secretory myeloma: one, two, or more entities? | |
| US20230059544A1 (en) | Kits and assays to detect circulating multiple myeloma cells from blood | |
| US11448649B2 (en) | Method for cancer prognosis | |
| CN110678752A (zh) | 在癌症筛查、诊断、治疗和复发中利用巨细胞核酸表征的方法 | |
| Cheng et al. | T cell immunohistochemistry refines lung transplant acute rejection diagnosis and grading | |
| US12013398B2 (en) | Compositions and methods for treatment of invasive cancers | |
| Grigore et al. | Immunologic and cytogenetic markers expressed in non-Hodgkin lymphoma of head and neck | |
| Umar et al. | Different Translocations of Multiple Myeloma on Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) with Clinical Correlation | |
| 久志本和郎 | HLA-B52 allele in giant cell arteritis may indicate diffuse large-vessel vasculitis formation: a retrospective study | |
| JP2024515558A (ja) | ゲノム全体のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを使用するがんを検出する方法 | |
| Kawano et al. | Society for Pediatric Pathology Spring Meeting, Baltimore, Maryland, March 2–3, 2013 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 20/07/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |