CN110678752A - 在癌症筛查、诊断、治疗和复发中利用巨细胞核酸表征的方法 - Google Patents

在癌症筛查、诊断、治疗和复发中利用巨细胞核酸表征的方法 Download PDF

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Abstract

公开了获自受试者血液中循环的癌症相关细胞的核酸的表征，以及此类表征在癌症筛选、诊断、治疗和复发中的用途。

Description

在癌症筛查、诊断、治疗和复发中利用巨细胞核酸表征的方法
技术领域
本发明总体上涉及获自受试者血液中循环的癌症相关细胞的核酸的表征，以及此类表征在癌症筛选、诊断、治疗和复发中的用途。
背景技术
癌症中的驱动突变，通常定义为赋予细胞选择性生长优势从而促进癌症发展的基因内的突变，通常通过对肿瘤组织的分析来发现。突变分析可以使用许多可用的分子技术(即PCR、测序、原位杂交等)。
由于细胞异质性和亚群中存在的抗性能力，驱动突变可能很难研究。在肿瘤异质性的情况下，肿瘤内的空间上存在具有不同突变的不同细胞群。因此，当一小块肿瘤组织用于突变分析时，这些突变可能只代表了总肿瘤群中实际存在的一小部分突变。在抗性亚群的情况下，随着时间和治疗，具有抗药性突变的肿瘤细胞的亚群开始在肿瘤区域中传播。因为抗性是暂时发生的，所以测试突变的原始组织可能没有在疾病后期出现的抗性突变。
可以使用多种方法来测试异质性以及在短时间上的抗性肿瘤亚群。
首先，可以从活检或手术后通过手术移除的肿瘤获得肿瘤组织。获得肿瘤组织的优点是它提供了足够数量的肿瘤细胞，可从中获得准确的突变分析。但是，存在许多潜在的问题。获得组织后，肿瘤可能会变化。获得肿瘤活检可能很困难，也许不能获得，可能很危险、昂贵且痛苦。另外，再活检可能仅分离单个亚群，而可能存在许多异质性群。组织样本不能覆盖肿瘤的所有区域。
其次，循环肿瘤DNA(ctDNA)是肿瘤来源的、片段化的DNA，发现在这些细胞无关的血液中。ctDNA只是血液中发现的无细胞DNA(cfDNA)的一小部分，这部分中cfDNA占了血液中的所有DNA，并且不仅限于肿瘤来源的DNA。当前，有许多研究、开发和商业化努力将ctDNA用于一系列临床用途。
血浆被用作ctDNA的来源，用于肿瘤分析。ctDNA的优点是可以实时获得血浆。但是，有许多缺点。ctDNA分析通常会误识别与肿瘤无关的非恶性背景突变，并且可能无法从正常组织的更常见背景核酸中识别出罕见的肿瘤突变。随着年龄的增长，与肿瘤无关的突变会在体内自然地发生，这会在ctDNA中错误地识别出来。使用ctDNA的另一个令人关注的原因是，与来自身体其他部位细胞的DNA相比，ctDNA的浓度低。
Merker,JD等人早期发布的特别文章，Circulating Tumor DNA Analysis inPatients with Cancer,American Society of Clinical Oncology and College ofAmerican Pathologists Joint Review,2018(doi:10.5858/arpa.2018-0901-SA)讨论了利用ctDNA进行应用的问题。目前，他们针对实体瘤的ctDNA的结论以及DNA中序列或拷贝数变异的分析如下：“一些ctDNA测定已证明对某些类型的晚期癌症具有临床有效性和实用性；然而，尚无足够的证据证明大多数ctDNA测定对于晚期癌症的临床有效性和实用性。证据表明ctDNA测定的结果与肿瘤标本的基因分型之间存在不一致，并支持肿瘤组织的基因分型以确认ctDNA检测的未发现的结果。在早期癌症、治疗监测或残留疾病检测中尚无ctDNA测定的临床实用性证据，也很少有临床有效性的证据。没有临床有效性和临床实用性的证据表明，ctDNA测定可用于临床试验以外的癌症筛查。”
第三，通常公认的肿瘤相关细胞样本的潜在来源是实体瘤患者血液中的循环肿瘤细胞(CTC)。但是，仅当收集到足够数量的CTC时，CTC才能提供实时肿瘤样本。当前，商业公司和研究人员正在推动对单细胞进行测序分析。测序CTC的优点是能够提供实时突变分析。同样，也有许多缺点。(i)对于大多数实体瘤，在患者中未发现CTC。具有更多CTC的癌症在很大程度上限于乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌。(ii)即使对于这三种类型的癌症，CTC也主要在晚期患者中发现，而在早期阶段则基本不存在。即使在IV期患者中，也仅约有50％的时间发现CTC。(iii)突变分析的准确性取决于CTC的数量和测序方法。准确分析大量癌症突变所需的CTC数为5-50个CTC。(iv)缺乏准确识别CTC的标准。
因此，显然需要用于获得和使用癌症相关细胞的核酸的其他手段。这种手段的发展将为癌症筛查、诊断、治疗和复发提供新的、侵入性较小的方法。本发明针对这样的装置以及其他相关目标。
发明内容
如以下详细讨论的，本发明总体上涉及收集和分析从受试者血液分离的癌症相关细胞获得的核酸，对该核酸进行分子分析，并使用从癌症筛查、诊断、治疗和复发中分析获得的数据。可以与核酸分析一起分析癌症相关细胞中的表观遗传修饰。
所述核酸是从循环癌细胞、癌基质细胞、巨细胞中收集的，上述细胞从受试者例如癌症患者的血液中分离。也从受试者的血液中分离并收集由这些细胞产生的裸核。本发明描述了(i)从血液、淋巴循环、血清、骨髓、尿液、唾液、脑脊髓液和其他体液中发现的收集此类细胞以及裸核的方法、工具和试剂；(ii)从细胞和裸核获得分子信息的测定方法；(iii)从细胞和裸核获得分子信息相对于其他方法的优势；以及(iv)分子信息的使用。
收集细胞和裸核的方法基于基于大小的分离技术(例如过滤和大小选择)的使用，以及细胞特异性抗原的使用，这些抗原也可用于分子鉴定和细胞突变分析。可以从受试者的组织、血液和其他液体中分离细胞，其中细胞包含与原发性/继发性肿瘤相关的分子变化，或者与肿瘤无关但是仍然是感兴趣的临床靶标的分子变化。通常，这些突变用于确定癌症的早期检测、预后、诊断或预测信息。由于细胞(例如巨细胞)的形成与肿瘤的生长、进展和扩散直接相关，因此检测细胞内发现的分子变化的能力可能与治疗直接对应。可以在大多数实体恶性肿瘤，非实体瘤和癌前病变下从血液中纯化细胞和裸核，以便随后对细胞和裸核进行分子鉴定。
在第一实施例中，本发明包括从患有实体瘤的患者样本中收集完整或未降解的核酸的方法，由通过尺寸排阻法收集巨细胞和巨大裸核的方法组成。一方面，本发明涉及从生物样本中收集巨细胞或巨大裸核或两者的方法，该方法包括对从受试者获得的生物样本进行尺寸排阻方法，从而收集来自生物样本的巨细胞或巨大裸核或两者。在一些方面，本发明可以进一步包括从巨细胞或巨大裸核或两者分离完整或未降解的核酸。在一些方面，本发明还可以进一步包括分析来自巨细胞或巨大裸核或两者的完整或未降解的核酸中的癌症相关分子变化。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析收集的巨细胞的表观遗传修饰。
在第二实施例中，本发明包括从患有实体瘤的患者样本中收集完整或未降解的核酸的方法，由通过基于表面标志物的分析物捕获元件和/或基于细胞内标志物的分析物捕获元件来收集巨细胞和巨大裸核的方法组成。一方面，本发明涉及从生物样本中收集巨细胞或巨大裸核或两者的方法，包括对从受试者获得的生物样本进行分析物捕获方法，所述方法使用巨细胞或巨大裸核的表面标志物，从而收集来自生物样本的巨细胞或巨大裸核或两者。在一些方面，本发明可以进一步包括从巨细胞或巨大裸核或两者分离完整或未降解的核酸。在一些方面，本发明还可以进一步包括分析来自巨细胞或巨大裸核或两者的完整或未降解的核酸中的癌症相关分子变化。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析收集的巨细胞的表观遗传修饰。
在第三实施例中，本发明包括从患有实体瘤的患者样本中收集完整或未降解的核酸的方法，由通过红细胞裂解和白细胞耗竭收集巨细胞和巨大裸核的方法组成。红细胞裂解可以裂解一些CAML。白细胞耗竭可以移除一些CAML。一方面，本发明涉及从生物样本中收集巨细胞或巨大裸核或两者的方法，该方法包括对从受试者获得的生物样本进行红细胞裂解或白细胞耗竭或两者，从而收集来自生物样本的巨细胞或巨大裸核或两者。在一些方面，本发明可以进一步包括从巨细胞或巨大裸核或两者分离完整或未降解的核酸。在一些方面，本发明还可以进一步包括分析来自巨细胞或巨大裸核或两者的完整或未降解的核酸中的癌症相关分子变化。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析收集的巨细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括分析完整核酸的癌症相关分子变化的方法。人们可以在单个巨细胞、巨细胞群、单个巨大裸核、巨大裸核群、带有巨大裸核的巨细胞上进行分析。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，对来自巨细胞和/或巨大裸核的完整或未降解的核酸的分析可以是分析来自单个巨细胞、巨细胞群、单个巨大裸核、巨大裸核群、或巨细胞和巨大裸核两者的核酸。在本发明的一些方面，完整或未降解的核酸的分析将限于分析来自巨细胞和/或巨大裸核的完整或未降解的核酸。在本发明的其他方面，在分离巨细胞和/或巨大裸核时也捕获到的来自与癌症无关的其他细胞的完整或未降解的核酸将作为背景或污染核酸被包括在分析中。这样的其他细胞包括但不限于白细胞。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析巨细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括分析完整核酸的癌症相关分子变化的方法。可以对具有循环肿瘤细胞(CTC)的巨细胞、具有CTC的巨大裸核、具有CTC的巨细胞和巨大裸核、循环内皮细胞(CEC)、上皮间充质转化细胞(EMT)、簇和其他细胞进行分析。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，对来自巨细胞和/或巨大裸核的完整或未降解的核酸的分析还可以包括分析来自CTC、CEC和EMT中的一种或多种的完整或未降解的核酸，连同分析来自单个巨细胞、巨细胞群、单个巨大裸核、巨大裸核群、或巨细胞和巨大裸核两者的核酸。在本发明的一些方面，完整或未降解的核酸的分析将限于分析来自巨细胞、CTC、CEC和EMT和/或巨大裸核的完整或未降解的核酸。在本发明的其他方面，在分离巨细胞、CTC、CEC和EMT和/或巨大裸核时也捕获到的来自与癌症无关的其他细胞的完整或未降解的核酸将作为背景或污染核酸被包括在分析中。这样的其他细胞包括但不限于白细胞。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞(例如,巨细胞、CTC、CEC、EMT等)的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括分析来自所有细胞的核酸的分子变化的方法，该细胞通过尺寸排阻方法捕获。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，对来自巨细胞和/或巨大裸核的完整或未降解的核酸的分析还可以包括分析通过尺寸排阻方法捕获的所有细胞的完整或未降解的核酸，连同分析来自单个巨细胞、巨细胞群、单个巨大裸核、巨大裸核群、或巨细胞和巨大裸核两者的核酸。这样的细胞包括但不限于CTC、CEC、EMT和与癌症无关的细胞，诸如白细胞。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析所收集的所有细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括在收集来自样本的细胞和裸核(诸如巨细胞和/或巨大裸核)之后，以不同阶段进行分子分析：(i)直接进行分子分析；(ii)用荧光抗体或比色法对细胞染色后进行分子分析；(iii)用固定液对显微镜载玻片上固定的细胞进行分子分析，并保存在4℃的冰箱中。类似地，在本发明的第一至第三实施例的某些方面及其方面，可以在以下步骤之后进行来自细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)的完整或未降解核酸的分析：(i)从生物学样本中收集细胞和/或裸核；(ii)在(i)中进行收集，以及在细胞和/或裸核由荧光抗体或比色法染色；或(iii)在收集(i)，并任选(ii)染色，并将细胞和/或裸核固定在显微镜载玻片上，并任选在4℃下保存。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析收集的细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括通过获得的癌症相关分子变化从而早期检测癌症的方法，该癌症相关分子变化是通过从患者样本中的细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或裸核)获得的完整核酸而获得的。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，当分析来自细胞和/或裸核(诸如巨细胞和/或巨大裸核)的完整或未降解的核酸，发现核酸中癌症相关核酸分子发生变化时，则诊断受试者患有癌症。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括通过获得新的癌症相关分子变化来确定对癌症治疗的抗性的方法，所述癌症相关分子变化是通过收集从患者样本中的细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)获得的完整核酸而获得的。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，当分析来自细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)的完整或未降解的核酸，发现核酸中的第二组癌症相关分子变化与核酸中的第一组癌症相关分子变化不同时，确定该受试者对癌症治疗具有抗性，所述核酸获自从受试者在癌症治疗前收集的相似生物学样本。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括通过获得癌症相关分子变化的数量从而提供癌症的预后的方法，所述癌症相关分子变化是通过收集从患者样本中的细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)获得的完整核酸而获得的。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，所述方法还包括基于癌症相关分子变化的数量来得出癌症的预后，所述癌症相关分子变化位于细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)的核酸中。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括通过获得癌症相关分子变化的数量的变化从而预测癌症的治疗反应的方法，所述癌症相关分子变化是通过收集从患者样本中的细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)获得的完整核酸而获得的。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，当在来自细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)的第一样本的核酸和来自细胞和/或裸核的第二样本的核酸之间检测到核酸中癌症相关分子变化的数量中的变化时，做出患者对癌症治疗的反应的预测。在某些方面，在从受试者获得细胞和/或裸核的第一和第二样本的时间点之间，对该受试者进行癌症治疗。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括通过确定先前已知的癌症相关分子变化的存在来检测残留癌症的方法，所述癌症相关分子变化是通过收集从患者样本中的细胞和/或裸核(如巨细胞和/或巨大裸核)获得的完整核酸而获得的。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，当发现来自细胞和/或裸核(诸如巨细胞和/或巨大裸核)的样本的核酸中的一组癌症相关分子的身份与较早从受试者的类似生物样本中获得的细胞和/或裸核(诸如巨细胞和/或巨大裸核)的样本核酸中的一组癌症相关分子变化的身份相同时，在受试者中检测到残留癌。在某些方面，在从受试者获得细胞和/或裸核的第一和第二样本的时间点之间，对该受试者进行癌症治疗。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括通过确定先前已知的癌症相关分子变化的存在的复发来检测癌症复发的方法，所述癌症相关分子变化是通过收集从患者样本中的细胞和/或裸核(如巨细胞和/或巨大裸核)获得的完整核酸而获得的。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，当发现来自细胞和/或裸核(诸如巨细胞和/或巨大裸核)的样本的核酸中一组癌症相关分子的身份与较早从受试者的类似生物样本中获得的细胞和/或裸核(诸如巨细胞和/或巨大裸核)的样本的核酸中的一组癌症相关分子变化的身份相同时，在受试者中检测到癌症复发。在某些方面，在从受试者获得细胞和/或裸核的第一和第二样本的时间点之间，对该受试者进行癌症治疗。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞的表观遗传修饰。
在另一实施例中，本发明包括通过获得新的癌症相关分子变化从而确定处于缓解期的癌症患者的新的癌症的方法，所述新的癌症相关分子变化是通过收集从患者样本中的细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)获得的完整核酸而获得的。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，受试者可以是处于缓解期的癌症患者，癌症相关分子变化组不同于与对应于处于缓解期的受试者的癌症的癌症相关分子变化组。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞的表观遗传修饰。
在另一个实施例中，本发明包括通过获得癌症相关分子变化信息来检测可治疗的癌前病变的方法，所述癌症相关分子变化信息是通过收集从患者样本中的细胞和/或裸核(例如巨细胞和/或巨大裸核)获得的完整核酸而获得的。类似地，在本发明的第一至第三实施例中的某些及其方面中，所述癌症是可治疗的癌前病变。在一些方面，本发明可进一步包括除了分析来自此类细胞的核酸外，还分析细胞的表观遗传修饰。
巨细胞和巨大裸核可用于评估癌症患者的单个分子变化或大量分子变化。在本发明的第一至第三实施例的每一个及其方面中，癌症相关分子变化可以是单个分子变化、2-5、6-10、11-15、16-20或更多个分子变化。
可以单独挑选出巨细胞和巨大裸核进行分子分析。在本发明的第一至第三实施例中的每一个及其各个方面中，可以在单个巨细胞或单个巨大裸核上进行分析。
可以同时分析过滤器上的所有巨大细胞和巨大裸核的分子变化。在本发明的第一至第三实施方式的每一个及其方面中，可以对样本中的每个巨细胞或每个巨大裸核进行分析。
通过分析巨细胞和巨大裸核，可以实时(序列时间点)获得癌症的分子分析结果。在本发明的第一至第三实施例的每一个及其方面中，可以对来自受试者的两个或更多个相似的生物样本进行重复分析。
如果存在适合治疗癌症的药物，则在巨细胞和巨大裸核中检测到的分子变化可以用作治疗决策的基础。类似地，在本发明的第一至第三实施例的某些方面及其方面中，该方法还包括基于分析结果为受试者做出治疗决策。
在活动性病毒感染的血液中发现了巨细胞。这些患者的巨细胞测序可以提供有关病毒活性和患者状况的信息。类似地，在本发明的第一至第三实施例的某些方面及其方面，所述方法还包括检测和/或测序巨细胞和/或巨大裸核中的病毒核酸。
在败血症患者的血液中也发现了巨细胞。分子测定和测序可以提供有关感染的多种信息。类似地，在本发明的第一至第三实施例的某些方面及其方面，所述方法还包括检测和/或测序巨细胞和/或巨大裸核中的细菌核酸。
附图说明
图1显示了具有不同细胞质形态的四个不同CAML(A-D)的图像，显示了细胞核和细胞质。
图2显示了CAML细胞质丢失核的图像，而挤压的核位于其旁边。
图3显示了两个不同的巨大裸核(A-B)的图像，在核表面上有少量细胞质。
图4显示了CAML大小与每个细胞的CEP17点数之间的关系。
图5A-B是两种不同的方法，用于绘制相同数据的突变数与CAML大小的关系。
图6显示，与从CAML核酸测序获得的较少突变相比，具有更多突变的患者的无进展生存期要短得多。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“分子变化”是指核酸中的一种或多种突变和一种或多种表观遗传修饰。
如本文所用，术语“突变”是指受试者的基因组的核酸序列的永久性改变。突变可以是扩增、取代、插入、缺失、融合、易位、染色体倒置、杂合性丧失及其组合中的一种或多种。
如本文所用，术语“表观遗传修饰”是指DNA甲基化、组蛋白修饰及其组合。
可用于分析本文讨论的核酸突变的分子技术和方法，包括来自巨细胞和巨大裸核的突变，包括核酸测序、PCR、表达克隆、凝胶电泳、DNA微阵列、DNA芯片、微卫星富集、western blot、FISH和ddPCR、以及本领域技术人员已知的其他合适的技术和方法。与表观遗传变化的分析有关的其他技术和方法包括限制性内切核酸酶、亚硫酸氢盐测序、单分子实时测序以及技术人员已知的其他合适的技术和方法。
循环CAML是癌症相关的基质细胞，存在于患有癌症的受试者的血液中。术语“癌相关巨噬细胞样细胞(CAML)”表示癌症患者血液中的多倍体巨细胞。CAML的大小通常为25-300μm。CAML吞噬肿瘤细胞和肿瘤碎片，因此它们含有编码癌症突变和/或表现出表观遗传修饰的核酸。它们是多核的，因为它们吞噬了肿瘤细胞。CAML比单个肿瘤细胞包含更多的核。CAML与所有测试的实体瘤和癌症的所有阶段有关。由于其大小，CAML在本文中也称为巨型。CAML可以是CD45(-)或CD45(+)，并且它们可以表达CD11c、CD14和CD31，从而确认它们起源于髓系。通常在吞噬循环肿瘤细胞(CTC)和细胞碎片的过程中发现它们[1-7]。与ctDNA不同，每种CAML不仅提供高质量的核酸，而且还提供单个核酸的多个副本。
如本文所用，术语“巨细胞”是指CAML。它们比红细胞和白细胞大。许多疾病产生在患者的血液中的巨细胞。CAML是在实体瘤患者血液中发现的巨细胞。
如本文所用，术语“裸核”是指孤立且与细胞分离的核。如本文所用，术语“巨大裸核”是指孤立且与巨细胞分离的核。巨大裸核大于没有细胞质的单个CTC的核。它们的大小范围为10-70μm。在癌症患者的血液中也以高频率发现从CAML中挤出的巨大裸核。裸核，无论从中分离出它们的细胞如何，都包括在从受试者分离的生物样本中发现的裸核，例如血液，因此是天然存在的，以及在体外从细胞制备的裸核。
如本文所用，术语“ctDNA”表示循环肿瘤DNA。ctDNA是血液中与细胞无关的肿瘤来源的片段DNA。ctDNA不应与无细胞DNA(cfDNA)混淆，后者是广义的术语，描述了在血液中自由循环但不一定来自肿瘤的DNA。cfDNA包括正常DNA和ctDNA。寻求可以提供与组织活检所的相同诊断信息的血液检查。血液采集可能比组织活检更方便，风险更低，并且可以较低的成本进行。可以连续收集血液。希望ctDNA可以担当此角色并提供许多临床用途。如前所述，目前ctDNA的应用受到限制。主要原因是cfDNA中ctDNA的数量有限，并且ctDNA通常是片段化的。
如本文所用，术语“分析物”是指要进行分析的任何物质或化学成分。
如本文所用，术语“分析物捕获元素”是指识别分析物并结合至分析物的结合部分。分析物捕获元素可以是抗体、抗生素、抗体分析物的抗原靶标、细胞受体蛋白、抗生物素蛋白、
Figure BDA0002286435950000091
生物素、核酸或与核酸有关的核酸(例如寡核苷酸、原位杂交、DNA、cDNA、microRNA、mRNA和RNA)、核糖核苷、多糖、单糖、寡糖、聚L-赖氨酸、多粘菌素B、道诺霉素、吖啶、精胺、适体，VectabondTM、氨基酰基硅烷、Superfrost PlusTM、Maple’s、NaOH/聚L-赖氨酸、bozymes、酶、配体、细胞和细胞片段以及其他生物颗粒。
如本文所用，术语“样本”、“生物样本”和“患者样本”是同义词，并且意指可以包含细胞或核酸并且获自受试者的样本。这样的样本主要是液体形式。最有用的患者样本是血液，但合适的样本还包括淋巴组织、淋巴循环、血清、骨髓、尿液、唾液、羊水、胆汁、痰、腹水、胸腔积液、宫颈阴道液、卵巢囊肿液、子宫内膜液、子宫灌洗液、淋巴水肿和脑脊髓液、以及其他含有或可能含有诸如巨细胞和/或核酸(诸如巨大裸核)的细胞的其他体液。样本也可以是掺有增殖细胞(例如巨细胞)的生长培养基。使用本发明的方法进行分析的合适样本量将由所采用方法的样本的身份以及用于实施该方法的手段来决定。但是，当样本是血液时，合适的体积通常为1到100毫升。一方面，体积为3至50毫升。具体的合适体积包括但不限于1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10毫升或更多。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如但不限于人、猿、狗、猫、马、牛、绵羊或鱼。如本文所用，术语“患者”是指患有癌症的受试者、先前患有癌症的受试者(例如处于缓解期的受试者)、或怀疑患有癌症尚未被诊断出患有癌症的受试者。
当前，希望鉴定出血液中始终从肿瘤部位发出，并可以用于分析肿瘤的分子变化的分析物，并希望有收集这些分析物的方法。目前，从血液中获取突变信息以进行癌症筛查和诊断应用的广泛采用的方法是使用ctDNA，这有很多局限性。DNA甲基化中的变化(即表观遗传修饰)也已用于检测血液和粪便中的癌症。CTC已被广泛用于进行PCR和突变分析，但CTC主要发现于乳腺癌，前列腺癌和结肠直肠癌的晚期，但未见于同一癌症的早期，并很少见于其他实体瘤中。在所有情况下，与基质细胞相关的突变都不是分析的一部分。
因此，容易且可重复地分析癌细胞相关核酸的分子变化的能力，尤其是随着时间的推移，可以作为癌症筛查、诊断、治疗和复发的新方法的基础。本发明针对这样的目的。特别地，本文描述了来自体液的巨细胞和巨大裸核的核酸在与癌症筛查、诊断、治疗和复发相关的方法中的用途。
Daniel Adams[1-7]鉴定出的巨细胞(例如CAML)是从原发性肿瘤部位发出的，并且主要是由于癌症的存在而存在。已知巨细胞吞噬蛋白质、核酸和完整的肿瘤细胞。它们具有大量的肿瘤特异性标志物，所述标志物已描述为匹配原发性肿瘤标志物。纯化和鉴定巨细胞中的分子变化可用于确定预后和预测性药物治疗。
图1A-1D显示了四个典型的CAML。它们比红细胞和白细胞和CTC大得多。它们具有不同的形态，但是都具有多倍体核，具有一个或多个增大的融合核和/或散布的单个核。融合核的大小可以为10～70μm。CAML上的标志物表达可能会因癌症和患者而异。
图2表明，偶尔地，可以挤出CAML的核。图2显示了只有细胞质和大裸核彼此相邻的CAML[4]，在同一张图片中对这两者的观察很少。但是，当发现CAML时，通常会发现裸核。图3A-3B提示了一些细胞质在细胞核表面周围，但是不足以将它们识别为细胞。
图1-3提示CAML中的大核与包含来自多于一个细胞的DNA有关。对CAML评估了染色体探针17(CEP17)点的数量，这是被吞噬的细胞核数量的指标。图4是CAML大小与CEP17的关系图，表明大CAML从许多细胞中获得了DNA。图4显示，尺寸大于50μm的CAML比尺寸介于25至50μm的CAML具有更多的CEP17点。
如上所述，本发明提供了来自CAML的核酸，其包含许多拷贝的完整核DNA，用于通过血液测试对癌症所有阶段(甚至高百分比的I期和癌前病变中的时间)中的所有主要实体瘤进行分析。本发明还提供了RNA和核酸的表观遗传学分析。本文描述了收集足够量的核酸用于分析DNA、RNA和表观遗传的方法。本文还描述了基于细胞核材料的临床应用。
CAML非常适合癌症患者的实时分子分析。迄今评估的所有16种实体瘤血液中均发现CAML：乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肉瘤、肾癌、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫肉瘤、神经母细胞瘤、食道癌、卵巢癌、黑色素瘤和肝癌。因此，与本发明的每种方法相关的提及的癌症包括这些癌症中的一种或多种。预计还将发现CAML与其他实体瘤相关。在癌症的所有阶段，甚至在I期阶段，在7.5mL血液中都以很高的百分比发现CAML。可以通过收集血液(例如3-50mL)来分离CAML，从其中分离细胞的可接受体积为50mL。由于单个CAML细胞是多倍体，因此可以准确测序。
晚期乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌患者通常具有循环肿瘤细胞(CTC)，除非处于有丝分裂状态，否则CTC具有单核[8-17]。在这三种类型的癌症的IV期患者中有时会发现CTC簇。CTC在早期并不常见，在其他类型的实体瘤中也不常见。
上皮间质转化(EMT)细胞经常发现，并且通常在癌症患者血液中成簇出现。EMT具有癌症标志物和癌症DNA。
癌症相关的血管内皮细胞(CAVE)是循环内皮细胞(CEC)的一种亚型，也具有与癌症相关的相同突变[16]。
方法
移除所有红细胞和大部分白细胞并保留大于8微米的细胞的尺寸排阻方法是收集巨细胞和巨大裸核的合适方法。有许多合适的尺寸排除方法。如果唯一的目的是获得核酸，那么尺寸排阻方法的类型并不关键，只要该方法不会丢失一些巨细胞或巨大裸核即可。因此，在本发明的方法中使用的尺寸排阻方法是那些通常保留尺寸大于5微米的细胞的方法。在本发明的方法中使用的特定的尺寸排阻方法是保留尺寸大于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大的细胞的那些。
如果还希望在细胞裂解和核酸分析之前获得从患者样本中分离出来的巨细胞的标志物信息、细胞计数和大小测量信息，那么使用过滤技术来捕获巨细胞是优选的尺寸排阻平台。患者样本通过过滤器。大细胞捕获在过滤器上，而大多数白细胞(WBC)和红细胞(RBC)通过过滤器的孔。
巨细胞，巨大裸核和其他细胞(例如CTC、EMT、CAVE和细胞簇)都可以保留在过滤器上，然后进行可视化和计数。当用靶向CAML标志物的荧光偶联抗体染色或比色染色时，可以测量染色强度并确定大小。过滤器可以安装在显微镜载玻片上，细胞可以是图像。载玻片上的过滤器也可以存储在4℃中，以备以后分析。
一些尺寸排阻方法将捕获的细胞释放到溶液中。一些方法将细胞保留在过滤器或芯片上。如果不需要确定巨细胞特征，可以在捕获后立即裂解细胞进行核酸分析。
需要细胞信息的血液过滤技术的更详细描述，由以下步骤组成。该过程首先将过滤器放入过滤器支架中。当血液是样本时，例如在CellSave管中收集来自受试者的生物样本，例如血液。将血液预先固定在温和的前缀缓冲液中，以使细胞稍强一些，防止细胞通过过滤器的孔挤压或裂解。将预先固定的血液再次通过负压通过过滤器，以减少细胞裂解。使用PBS在过滤器上洗涤细胞。如果不需要细胞信息，则可以立即进行细胞裂解，然后对核酸进行分子进行突变和/或表观遗传修饰的分析。
如果需要细胞信息，可以进行后固定，然后用PBS清洗。可以使细胞膜进过通透化，然后用PBS洗涤。可以进行细胞染色，然后再洗涤。过滤器可通过载液和盖玻片安装在载玻片上。然后可以将细胞成像在过滤器上。成像后，可将细胞储存在4℃下，以便在几年内随时裂解以进行分子分析。
还可以使用题为“Polymer microfiltration devices,method ofmanufacturing the same and the uses of the microfiltration devices”的国际专利申请公开号WO 13/078409的图28中所述和所示的装置，直接从受试者中通过过滤收集巨细胞。可以在细胞捕获后或用抗体染色后立即进行巨细胞的分子分析。
也可以通过红细胞裂解来收集巨细胞。但是，必须注意，因为白细胞的数量可能会超过样本中巨细胞和巨大裸核的数量。
也可以通过白细胞耗竭获得巨细胞。但是，必须再次注意，因为这种耗竭可能会导致某些巨细胞的丢失。
还可以通过针对细胞表面上的标志物(如CD14、CD31和/或在巨细胞情况下的其他标志物)的分析物捕获元素(如上定义)来收集巨细胞。可以将捕获元素(例如抗体)包被在磁珠、磁性纳米颗粒和任何其他种类的颗粒上。将颗粒与样本混合。对颗粒的收集将浓缩巨细胞。该技术特别适合于从样本中分离细胞，然后在不另外表征细胞的情况下对细胞的核酸直接进行分子分析。该方法不能捕获巨大裸核。
分析物捕获元素可以包被在表面、柱和其他结构上。样本流过捕获元素包被表面或者柱或结构周围。
如上所述，可以对单个细胞或多个细胞，单个裸核或多个裸核进行细胞和/或裸核的分子分析。这些细胞通常是巨细胞，但可以包括WBC、CTC、CAVES、EMT等，因为某些捕获方法会诱捕除巨细胞外的细胞。虽然可能认为这些细胞是“污染”细胞，因为此类细胞可能不包括所寻求的突变和表观遗传修饰(WBC就是这种情况)，但它们在样本中的存在通常不会干扰来自巨细胞的核酸的分子分析。同样，裸核通常来自巨细胞，但也可以来自其他细胞，例如WBC、CTC、CAVES、EMT等。
巨细胞中可能在其中包含核酸、线粒体DNA、蛋白质、细菌、病毒、孢子、卵囊、细胞、细胞碎片、受体、寡核苷酸、抗体、酶、抗生素、肽、碳水化合物、激素、毒素、疾病标志物、DNA、cDNA、miRNA、mRNA、RNA、天然有机化合物、合成有机化合物(例如杀虫剂)、药物、食品添加剂、染料和无机化合物(取决于癌症)。
可以捕获巨细胞并培养以扩展分析物。已经发现巨细胞增殖，其放大了巨细胞内的肿瘤分子变化。随着巨细胞在培养物中的生长，一些病毒，细菌和其他病原体会在巨细胞内增殖，这也可能是令人感兴趣的。
工具
允许上述方法的工具的发明是未涂覆或涂覆有捕获分析物识别元素的各种尺寸的过滤器，使用注射器、泵、真空抽吸，手动、半手动或由自动仪器来实施，使样本通过该工具。
示例
进行了一项实验，以检测从9名癌症患者的血液中分离出的巨细胞的核酸的分子变化，其中包括3例结肠癌、3例乳腺癌和3例肺癌。收集并裂解巨细胞，并对核酸进行测序用于癌症突变。另外，在2个时间点对3位患者的巨细胞核酸进行了时间分析，以确定所鉴定突变的稳定性。将全血预先固定，并过滤。过滤后，将过滤器上的细胞进行后固定，透化并对生物标志物DAPI、CD45和细胞角蛋白染色，以确认巨细胞的身份。
·实验1-对来自9名患者的带有巨细胞的过滤样本进行裂解，并针对50种肿瘤学基因组分析了核酸(表1)。在测试的9个样本中的每个中都发现了癌症突变。
·实验2-对3名患者在2个时间点(相隔3-4周)采血，裂解巨细胞，针对50个基因组分析了核酸(表1)，并比较了突变。在相同患者样本中在两个时间点上发现相同的突变。
详细的实验步骤如下。将7.5mL全血样本与预固定缓冲液1：1混合，并温育15分钟。将CellSieveTM过滤器(Creatv MicroTech,Potomac,MD)放入过滤器支架中，并用5ml PBS洗涤。在3分钟内通过过滤器过滤血液，并用5mL PBS洗涤过滤器。后固定CellSieveTM过滤器上的细胞，然后洗涤。透化CellSieveTM过滤器上的细胞，然后洗涤。加入含有抗CD45和细胞角蛋白8、18和19的抗体溶液，并温育1小时。过滤器用10ml PBST洗涤，放置在显微镜载玻片上，并用DAPI和Fluoromount固定。分析过滤器中巨细胞(尺寸大于25微米)，扩大且通常为多倍体、核结构。用微珠裂解细胞，参见下文。
可以采用多种格式检测检测物捕获后的突变。
为了在细胞捕获后进行核酸分析，可以将细胞直接在过滤器上裂解。有许多方案从细胞或病原体提取核酸。以下是使用BiosticTM细菌性DNA分离试剂盒(MO BioLaboratories，Inc.)的说明，并对方案稍微进行了修改，使用放置在MicroBead Tube中的过滤器。该方案包括以下内容
1.将过滤器和“细胞裂解/抑制剂溶液”添加到微珠管中，加热并涡旋样本以释放DNA。
2.移除上清液并分析DNA。
对来自(i)巨(CAML)细胞裂解物和(ii)血浆的DNA进行测序，并对发现的结果进行比较。如上所述，三个样本来自同一位患者的连续时间点(Colon-04B和Colon-04C、B6A和B6B、NSCLC 12B和NSCLC 12C)。测序公司对样本不知情。测序基于表1所示的50个基因组。
表150个肿瘤学基因组
ABL1 IDH2 FGFR1 PTEN EGFR
AKT1 JAK2 FGFR2 RB1 ERBB2
ALK JAK3 FGFR3 RET ERBB4
APC KDR FLT3 SMAD4 EZH2
ATM KIT GNA11 SMARCB1 FBXW7
BRAF KRAS GNAQ SMO NPM1
CDH1 MET GNAS SRC NRAS
CDKN2A MLH1 HNF1A STK11 PDGFRA
CSF1R MPL HRAS TP53 PIK3CA
CTNNB1 NOTCH1 IDH1 VHL PTPN11
结果显示在表2中，其中突变等位基因部分在括号中显示。在同一患者的连续样本中发现的相同突变表明准确性。CAML就是这种情况(表2：粗体和下划线)。这些结果证实，CAML为突变分析提供了足够数量的DNA。只有极少数情况下血浆和CAML中ctDNA的突变一致(表2：粗体、下划线和斜体)。这些结果表明，为此目的，CAML比血浆中的ctDNA是用于突变分析的更可靠的DNA来源。
表2对CAML和血浆进行测序
当前，数据是使用两个或多个CAML获取的，但过滤器上没有CTC。样本NSCLC 12B和12C的良好相关性结果使用了两个CAML。这表明一个CAML也可以提供准确的结果。
通过裂解过滤器上的所有细胞获得表2中的数据。过滤器上白细胞产生的背景不影响准确性。
CAML、ctDNA和肿瘤组织的测序
在检测癌症突变的另一个实验中，从3名癌症患者的血液中分离出巨细胞，并进行了上述分析。将发现的突变与相应的原发肿瘤活检中发现的突变进行比较。特别是，对3例肺癌患者的肺活检进行筛选了50个基因突变组(表1)。开始治疗前，从相同的3名肺癌患者中分离出巨细胞和血浆。在为CAML运行血液样本之前，应从血样中移除血浆，并分别进行测序。在移除血浆后，将全血预先固定，并过滤。过滤后，将过滤器上的细胞进行后固定，透化并对生物标志物DAPI、CD45和细胞角蛋白染色，以确认巨细胞的身份。将巨细胞裂解并测序。
表3对原代活检、CAML和血浆进行测序
Figure BDA0002286435950000161
结果显示在表3中，其中突变等位基因部分显示在括号中，并且未评估活检的突变的频率。在Lung 15患者中发现了在活检和CAML裂解物中均发现的相同突变的一个例子(表3：粗体和下划线)。这些结果证实，CAML为突变分析提供了足够数量的DNA，可以匹配来自同一患者的肿瘤中发现的突变。在某些情况下，血浆和CAML中ctDNA的突变一致(表2和表3：粗体和斜体)。这些结果表明，CAML是用于突变分析的可靠的DNA来源，可对应于肿瘤活检的突变和/或可对应于血浆的突变。
突变分析和患者信息
早期实验中获得的数据表明CAML大小具有重要的预后信息。如果在7.5ml外周血中发现的最大CAML大于50μm，则与发现最大的CAML小于50μm相比，总生存期(OS)较短，无进展生存期(PFS)则要短得多。
图5A是对那些裂解的CAML中发现的CAML大小与致癌突变数的分析。表1中的基因组并未涵盖癌症中的所有突变。趋势是，较小的CAML具有较小的致癌突变，而较大的CAML具有较大的致癌突变。图5B是示出大小与突变数之间的相关性的另一种方式，其中基于图4中呈现的50μm大小信息来绘制突变数。显然，较大的CAML具有更多的突变。
图6是与30例肺癌患者的无进展生存期(PFS)相比，使用50个基因组(表1)对通过测序CAML裂解物测序获得的致癌突变数的分析。在开始治疗之前收集血样。图6显示，如果癌症患者具有4个或更多个突变，则与其CAML裂解物中具有0-3个突变的患者相比，患者以增加的速度进展。
临床应用
CAML存在于癌症的所有阶段和所有主要癌症中。测序了的CAML中的核酸显示出癌症相关分子变化。因此，从患者样本中收集巨细胞和巨大裸核，然后进行分子分析，以及检测癌症相关分子变化，这表明存在实体瘤癌症。癌症筛查也可以基于巨细胞、巨大裸核的计数和在计数后检测癌症相关分子变化的组合。
基于组织活检众所周知，新的癌症相关分子变化是针对特定突变的药物治疗的耐药性的指示。通过从患者样本中收集巨细胞和巨大裸核，随后进行分子分析，可以及时地依次获得突变的身份和/或数量的变化。因此，可以通过从患者样本的巨细胞和巨大裸核获得的新的癌症相关分子变化的出现来获得对癌症治疗的抗性的确定。抗性的检测也可以基于巨细胞、巨大裸核的计数和在计数后检测癌症相关分子变化的组合。
图4和5显示，从癌症患者血液中的巨细胞和巨大裸核获得的突变数目可以提供癌症的预后。预后可以基于巨细胞大小和从巨细胞和巨大裸核中检测到的突变数的组合。
如图5所示，在突变较多的患者中，PFS较短。类似地，本文显示，具有增大的CAML的患者是疾病进展的指标。如图4所示，在较大的CMAL中发现更多的突变。从癌症患者血液中的巨细胞和巨大裸核获得的癌症相关分子变化的数量增加表明癌症的进展。疾病进展还可以基于巨细胞大小与患者样本中巨细胞和巨大裸核的癌症相关分子变化数量增加的组合。CAML和癌症相关分子变化的完全消失是治疗成功的标志。
当停止治疗时，例如在手术后、化学放疗之后或在其他治疗之后，并不总是有准确的方法来确定是否仍然存在残留的疾病。CT或MRI不是总能提供小残留肿瘤的信息。如果存在残留疾病，癌症将复发。如果通知肿瘤科医生存在残留疾病，则肿瘤科医生可能能够提供治疗以消除残留疾病。可以通过从患者样本中的巨细胞和巨大裸核获得的先前已知的癌症相关分子变化的存在来检测残留癌症。残留疾病也可以基于巨细胞的存在与患者样本中巨细胞和巨大裸核中癌症相关分子变化的检测的组合。
许多癌症患者在治疗后可以无癌。他们可以处于几个月直至剩余生命的缓解期。那些患者非常感兴趣地知道他们仍然没有癌症。通过收集从患者血液样本中的巨细胞和巨大裸核获得的完整核酸而获得的癌症相关分子变化的检测是癌症的指示。如果分子变化与患者先前的癌症相关分子变化相同，则患者正在复发先前的癌症。也可以基于巨细胞的计数与患者样本中的巨细胞和巨大裸核的癌症相关分子变化检测的组合来检测疾病的复发。
如果处于缓解期的患者中检测到的癌症相关分子变化与先前的癌症相关分子变化不同，则患者正在进展新的癌症，而不是复发。也可以基于巨细胞的计数与从患者样本中的巨细胞和巨大裸核检测到的癌症相关分子变化的组合来检测处于缓解期的患者的新生癌症。
大多数癌症都有尚未成熟到I期的实体瘤的相关癌前病变，例如乳腺癌的原位导管癌(DCIS)。DCIS进展到I期乳腺癌的可能性很低。DCIS的等级不同，有些更可能进展到I期。如D.L.Adams[1]的论文所示，在这些患者中检测到CAML。其中一些患有癌前病变的患者可能期望接受治疗以防止其进展为癌症。实体瘤的癌前病变的检测可以基于患者样本中巨细胞和裸核的癌症相关分子变化的检测。也可以基于巨细胞的计数与患者样本中的巨细胞和巨大裸核的癌症相关分子变化检测的组合来检测癌前病变。
引文
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Claims (31)

1.测定巨细胞或巨大裸核或两者中的癌症相关分子变化的方法，所述方法包括：
从受试者的生物样本中分离巨细胞或巨大裸核或两者，以及
对巨细胞和/或巨大裸核分析癌症相关分子变化，从而分析巨细胞或巨大裸核或两者中的癌症相关分子变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，癌症相关的分子变化是突变，表观遗传修饰或两者。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用以下一种或多种从生物样本中分离巨细胞和/或巨大裸核：(i)尺寸排阻方法、(ii)分析物捕获元素、(iii)红细胞裂解以及(iv)白细胞耗竭。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述尺寸排阻方法是保留8微米或更大的细胞的过滤器。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述分析物捕获元素是识别巨细胞和/或巨大裸核的细胞表面或细胞内标志物的抗体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述核酸是完整或未降解的核酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述分析是在单个巨细胞、两个或多个巨细胞组、单个巨大裸核、两个或多个巨大裸核组、或其组合上进行的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，进一步包括测定循环肿瘤细胞(CTC)、循环内皮细胞(CEC)和上皮间充质转化细胞(EMT)中的一种或多种中的癌症相关分子变化，其中从生物样本中分离所述CTC、CEC和EMT，连同从生物样本分离巨细胞和/或巨大裸核。
9.测定巨细胞或巨大裸核或两者中的癌症相关分子变化的方法，所述方法包括：
使从受试者获得的生物样本经历尺寸排阻方法，其中收集尺寸为8微米或更大的细胞和裸核，其中所收集的细胞和裸核包括巨细胞或巨大裸核或两者，和
对收集的细胞和/或裸核分析癌症相关分子变化，从而分析巨细胞或巨大裸核或两者中的癌症相关分子变化。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，癌症相关的分子变化是突变，表观遗传修饰或两者。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所收集的细胞和裸核包括CTC、CTC的裸核、CEC、CEC的裸核、EMT和EMT的裸核中的一种或多种。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中，分析所有收集的细胞和裸核的癌症相关分子变化。
13.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中，当识别癌症相关分子变化时，还包括基于癌症有关分子变化的身份进行预后。
14.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中，当识别癌症相关分子变化时，还包括基于癌症有关分子变化的身份预测治疗反应。
15.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中，当识别癌症相关分子变化时，还包括诊断受试者为患有癌症。
16.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中，当识别癌症相关分子变化时，还包括诊断受试者的癌症复发。
17.用于确定对癌症治疗的抗性的方法，所述方法包括：
从受试者的生物样本中分离巨细胞或巨大裸核或两者，
分析巨细胞和/或巨大裸核，以获得第二组癌症相关分子变化，
比较第二组癌症相关分子变化与第一组癌症相关分子变化，所述第一组癌症相关分子变化在较早时间从受试者获得的相似生物样本中的巨细胞和/或巨大裸核获得，
其中当第一和第二组癌症相关分子变化的身份不同时，确定所述受试者对癌症治疗具有抗性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，癌症相关的分子变化是突变，表观遗传修饰或两者。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中使用以下一种或多种从生物样本中分离巨细胞和/或巨大裸核：(i)尺寸排阻方法、(ii)分析物捕获元素、(iii)红细胞裂解以及(iv)白细胞耗竭。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述尺寸排阻方法是保留8微米或更大的细胞的过滤器。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述分析物捕获元素是识别巨细胞和/或巨大裸核的细胞表面或细胞内标志物的抗体。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法，其中，所述核酸是完整或未降解的核酸。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的方法，其中，所述分析是在单个巨细胞、两个或多个巨细胞组、单个巨大裸核、两个或多个巨大裸核组、或其组合上进行的。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，进一步包括测定循环肿瘤细胞(CTC)、循环内皮细胞(CEC)和上皮间充质转化细胞(EMT)中的一种或多种中的癌症相关分子变化，其中从生物样本中分离所述CTC、CEC和EMT，连同从生物样本分离巨细胞和/或巨大裸核。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，进一步包括在分析癌症相关分子变化之前，使所述细胞和/或裸核经受荧光抗体和/或比色染色。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，进一步包括在分析癌症相关分子变化之前，对所述细胞和/或裸核进行计数。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中，所述分析表明受试者患有癌症。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，癌症相关分子变化是单个分子变化。
29.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，癌症相关分子变化是2-5个分子变化。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，进一步包括重复所述方法至少一次以获得第二组癌症相关分子变化，并且比较第一组变化和第二组变化。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自由乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、NSCLC、肉瘤、肾癌、膀胱癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫肉瘤、神经母细胞瘤、食道癌、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌和肺癌组成的组的癌症。
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