MX2014000804A - Ensayo para capturar y detectar celulas circulantes de mieloma multiple de la sangre. - Google Patents
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Abstract
La invención incluye métodos para aislar células circulantes de mieloma múltiple, y un método para el tratara los pacientes con sospecha tener enfermedades de células plasmáticas anormales.
Description
ENSAYO PARA CAPTURAR Y DETECTAR CELULAS CIRCULANTES DE
MIELOMA MULTIPLE DE LA SANGRE
SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta presentación no provisional reivindica prioridad a una solicitud de patente provisional, la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 61/510,170, presentada el 21 de julio de 2011.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El mieloma múltiple (que se conoce, además, como mieloma o mieloma de células plasmáticas) es un cáncer hematológico progresivo de la célula plasmática. La afección se caracteriza por números excesivos de células plasmáticas en la médula ósea y sobreproducción de inmunoglobulina monoclonal intacta o cadenas ligeras monoclonales libres.
Clínicamente, la enfermedad se diagnostica, se determina en qué etapa está, y se trata con base en una variedad de parámetros que incluyen la masa de células tumorales del mieloma sobre la base de la cantidad de proteína (proteína M) monoclonal (o de mieloma) en el suero y/o en la orina, junto con las concentraciones de hemoglobina y calcio en suero, el número de lesiones óseas líticas con base en un examen del esqueleto, y la presencia o ausencia de insuficiencia renal. Los enfoques adicionales para
la caracterización de la afección incluyen la detección de más de diez por ciento (10%) de células plasmáticas en un examen de médula ósea, la presencia de plasmacitomas de tejidos blandos y la detección de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y lambda libres en suero. El examen de médula ósea se realiza mediante el uso de técnicas estándar de histología e inmunohistoquímica. Para determinar el pronóstico pueden llevarse a cabo estudios citogenéticos adicionales en muestras de médula ósea. La vigilancia del seguimiento consiste en evaluaciones químicas y de la médula ósea si se indica clínicamente debido a su naturaleza invasiva.
Actualmente, el análisis de citometría de flujo de médula ósea se evalúa como una herramienta para la caracterización de la enfermedad y para distinguir entre los trastornos de la célula plasmática neoplásica de células plasmáticas normales y para detectar la enfermedad residual mínima. No obstante, este enfoque continúa dependiendo de un procedimiento invasivo. Existe una necesidad significativa de desarrollar técnicas menos invasivas para detectar, monitorear y caracterizar la enfermedad a lo largo de su historia y la presencia de estas células en sangre puede proporcionar esa oportunidad.
Adicionalmente, es necesario desarrollar herramientas más sensibles para una evaluación más precisa del riesgo y para el monitoreo de la progresión de la enfermedad en etapas tempranas de la enfermedad, que incluyen gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS) y mieloma múltiple quiescente. Algunos datos de investigaciones sugieren que las células plasmáticas circulantes pueden detectarse en etapas tempranas de
la enfermedad y pueden correlacionar con el pronóstico, lo que apoya el uso de una metodología estandarizada para capturar, enumerar y caracterizar estas células en etapas tempranas de la enfermedad.
El consenso general dentro de la literatura (Report of the European Myeloma Network on Multiparametric Flow Cytometry in Múltiple Myeloma and Related Disorders. Andy C. Rawstron et al. Haematologica, 2008; 93 (3).) para la identificación de células plasmáticas anormales, particularmente por citometría de flujo, ha incluido varios biomarcadores clave que consisten principalmente en CD138, CD38 y CD45. Los biomarcadores adicionales tales como CD19 y CD56 han demostrado además utilidad en el diagnóstico.
La presente invención investiga células de mieloma circulantes para evaluar si estos biomarcadores particulares, ya sea solos o en combinación con uno o más biomarcadores adicionales o con FISH, pueden usarse para la captura y detección de células plasmáticas circulantes anormales que incluye la detección de la enfermedad residual mínima. FISH puede usarse para detectar numerosas anomalías citogenéticas que se describen en el mieloma múltiple. Los desplazamientos en el locus IGH, t(4;14), y deieciones en el locus p53, del(17p), demostraron tener valor pronóstico para la supervivencia global y libre de eventos en el mieloma múltiple (Genetic Abnormalities and Survival in Múltiple Myeloma: The Experience of the InterGroupe Francophone du Myelome. Herve Avet-Loiseau y otros Blood, 2007; 109: 3489-3495). Estas sondas y varios otros
marcadores de mieloma múltiple están disponibles en el catálogo Poseidón y podrían adaptarse para su uso con la plataforma CelITracks®.
Comercialmente existen kits de selección inmunomagnética que usan partículas magnéticas CD138. Stem Cell Technologies tiene un kit de selección positiva para CD138 humano EasySep® que puede seleccionar células positivas para CD138 a partir de médula ósea y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y Miltenyi Biotech tiene Microperlas CD138 para la selección de células positivas para CD138 de médula ósea, PBMC y sangre completa. El análisis de las muestras recogidas se realiza típicamente mediante el uso de citometría de flujo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención descrita aquí consiste en un método para la captura y detección de células plasmáticas circulantes (CPC) y células plasmáticas anormales o células de mieloma múltiple ("CMMC") que incluye la detección de la enfermedad mínima residual a partir de sangre periférica. La presente invención proporciona un medio no invasivo para detectar un número muy bajo de CMMC en volúmenes de mililitros de muestras de sangre para detectar, monitorear y caracterizar la enfermedad a lo largo de su historia, y proporciona las herramientas más sensibles para una evaluación más precisa de los riesgos, y el seguimiento de la progresión de la enfermedad en etapas tempranas de la enfermedad que incluyen la detección de células plasmáticas
circulantes en etapas tempranas de la enfermedad que incluye gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS) y mieloma múltiple quiescente. La captura y caracterización de esas células plasmáticas circulantes de la sangre periférica puede proporcionar nuevos biomarcadores para el manejo de los pacientes con mieloma múltiple.
La sangre se recoge en tubos CellSave que contienen un conservante que permite el transporte y almacenamiento de sangre mientras que minimiza la degradación celular. Las células se capturan mediante el uso de partículas magnéticas coloidales conjugadas con Syndecan-1 o CD138, un marcador de superficie celular presente en células plasmáticas. Una vez que se capturan las células, se marcan con los marcadores de células adicionales CD38-PE (Ficoeritrina), CD19 y CD45-APC (aloficocianina), y CD56-FITC (isotiocianato de fluoresceína) para diferenciar las células de mieloma múltiple de los leucocitos contaminantes del fondo (glóbulos blancos). Todos los reactivos marcadores celulares y ferrofluido son parte de un nuevo kit de servicio de CMMC CellSearch®. El kit consiste en 7 componentes de los cuales 4 son idénticos a los reactivos que se encuentran en el kit Cellsearch® Epithelial Cell. Estos 4 reactivos comunes son reactivo para mejora de la captura, reactivo de permeabilización, colorante de ácido nucleico, y CelIFix. Los 3 nuevos reactivos consisten del ferrofluido de CD138, un reactivo de tinción que consiste en CD38-PE, CD19 y CD45-APC y un reactivo separado de tinción de marcador que consiste en CD56-FITC.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 ilustra la reactividad de los anticuerpos CD 138 con ciertas líneas celulares.
La Figura 2 ilustra la reactividad de los anticuerpos CD 38 con ciertas líneas celulares.
La Figura 3 ilustra la reactividad de diferentes anticuerpos CD19 APC de prueba en PBMC.
La Figura 4 ilustra la tinción de CD 19 APC en varias diluciones. La Figura 5 ilustra la tinción de los anticuerpos CD 56 en PBMC.
La Figura 6 ilustra la tinción de CD 56 en varias líneas celulares.
La Figura 7 ilustra la tinción sin CD56.
La Figura 8 ilustra la tinción de CD 56 FITC de una línea celular a una dilución.
La Figura 9 ilustra la tinción de CD 56 FITC de una línea celular a una dilución.
La Figura 10 ilustra la tinción de CD 56 FITC de una línea celular a una dilución.
La Figura 11 ilustra imágenes representativas de células MM 1 S. La Figura 12 ilustra imágenes representativas de células H929.
La Figura 13 ilustra imágenes representativas de arrastre de glóbulos blancos.
La Figura 14 ilustra imágenes de una muestra de paciente.
La Figura 15 ilustra imágenes de una muestra de paciente. La Figura 16 ilustra imágenes de una muestra de paciente. La Figura 17 ilustra imágenes de una muestra de paciente. La Figura 18 ilustra imágenes de donantes normales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención incluye un método para capturar, aislar y analizar las células circulantes de mieloma múltiple; el método comprende:
(a) obtener una muestra de sangre de un sujeto de prueba
(b) contactar dicha muestra con partículas magnéticas coloidales que se conjugan con un primer ligando
(c) someter la muestra de la etapa (b) a un campo magnético para producir una fracción separada de células circulantes de mieloma múltiple unidas a la partícula magnética
(d) tratar la muestra de la etapa (c) con un primer marcador adicional
(e) analizar las células circulantes de mieloma múltiple.
Como se usa en la presente descripción, el término "muestra" se refiere a una cantidad de sangre, preferentemente, expresada como una medición volumétrica. El volumen preferido de una muestra de sangre es aproximadamente 2 mi a 10 mi, con mayor preferencia, 3-7.5 mi, con la máxima preferencia, 4 mi. El término "partículas magnéticas coloidales" se
refiere a las partículas que son metálicas u organometálicas. Los ejemplos de tales partículas se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 5,597,531 ; 5,698,271 ; 5,698,271 ; 6,365,662, las que se incorporan por este medio como referencia en su totalidad, particularmente para la descripción de tales partículas magnéticas coloidales. Éstas pueden recubrirse, opcionalmente, con un polímero, preferentemente, un polímero de origen biológico tal como albúmina sérica bovina y caseína.
El término "ligando" se refiere a las proteínas que se unen a los marcadores asociados a células de CMMC o de células plasmáticas circulantes ("CPC"). Las proteínas preferidas son anticuerpos, preferentemente, anti-CD 138, anti-CD 38, y anti-CD 56, con mayor preferencia, anti CD 138, y anti-CD 38, aún con mayor preferencia, anti CD-138. Tales ligandos pueden conjugarse con partículas magnéticas coloidales por métodos que son sustancialmente similares a los métodos descritos en la patente de los EE. UU. núm. 6,365,662. Dos o más ligandos pueden usarse en la etapa (b) de la invención y se prefiere usar por lo menos dos ligandos en esa etapa.
El término "campo magnético" puede producirse por cualquier serie de métodos, particularmente, por dos separadores magnéticos sustancialmente como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 7,901,950, la que se incorpora como referencia en su totalidad. El término "marcador adicional" significa una proteína asociada a la célula que es específica para CMMC o excluye CMMC. Tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en anti-CD38 anti CD19, y anti CD45 anti
CD 138, anti CD 56, anti lambda, anti kappa anti CD 200, anti K¡67. Tales anticuerpos pueden marcarse con indicadores tales como ficoeritrina, isotiocianato de fluoresceína, y aloficocianina y se prefiere que se marquen con uno o más marcadores. Los marcadores adicionales pueden incluir colorantes de ácido nucleico, tales como DAPI. El marcador adicional preferido se selecciona del grupo que consiste en anti-CD38, anti CD19, y anti CD45; el marcador adicional particularmente preferido es anti CD38. En la etapa (d) de la invención pueden usarse dos o más marcadores adicionales y se prefiere el uso de por lo menos dos marcadores adicionales, con mayor preferencia, tres marcadores adicionales, con la máxima preferencia, cuatro marcadores adicionales.
El término "analizar" significa evaluar la muestra capturada magnéticamente para determinar uno o más de lo siguiente: si la muestra contiene CMMC o CPC. Tal identificación puede llevarse a cabo visualmente o electrónicamente para determinar el grado de fluorescencia de muestras capturadas magnéticamente. Tales métodos de análisis se describen en la patente de Estados Unidos núm. 7,01 1 ,794, la que se incorpora en la presente descripción como referencia. Particularmente, las muestras magnéticamente capturadas, que son positivas para CD38 y negativas para CD19 y CD45, se identifican como CMMC.
La invención incluye un método para determinar si el paciente es un candidato probable para la intervención terapéutica para enfermedades asociadas con las células plasmáticas anormales
(a) procesar dicha sangre del paciente para determinar cuántas CMMC hay en la muestra
(b) determinar mediante recuento si el número de células CMMC presentes en dicha muestra es igual o mayor que o igual que el intervalo normal
Como se usa en la presente descripción, el término muestra tiene su significado antes mencionado e intervalo preferido. El término "procesamiento" significa tratar una muestra de sangre del paciente mediante los métodos descritos en la presente descripción para aislar e identificar las CMMC.
El término "intervención terapéutica" significa buscar u obtener cualquier intervención médica para tratar enfermedades asociadas con niveles plasmáticos anormales. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, mieloma múltiple, MGUS y mieloma múltiple quiescente. Tal intervención terapéutica incluye, pero no se limita a, visitar un médico, obtener tratamiento terapéutico tal como radiación, y tratamiento con fármacos que tratan cualquiera de las enfermedades asociadas con niveles plasmáticos anormales, y monitorear el efecto de tales tratamientos terapéuticos. Por ejemplo, si un paciente se trata con un fármaco, los niveles de CMMC del paciente pueden evaluarse durante el curso del tratamiento para determinar si el fármaco funciona. Tales fármacos incluyen, pero no se limitan a, dexametasona, ciclofosfamida, vincristina, bortezomib, melfalano, zometa, aloxi, lenalidomida, doxirubicina, y similares.
El término "intervalo normal" se refiere al número de células CMMC presentes en una población de muestra que no tiene enfermedades
asociadas con células plasmáticas anormales. Preferentemente, el intervalo normal es menor que 7 CMMC en una muestra de sangre de aproximadamente 3 mi a aproximadamente 7.5 mi. El término "mayor que el intervalo normal" es un número de CMMC por encima del intervalo normal. Cuanto mayor sea este número, mayor es la probabilidad de que el paciente tenga una de las enfermedades asociadas con células plasmáticas anormales. Si un paciente tiene entre 8 y 20 CMMC en una muestra de sangre, tal paciente tiene una mayor probabilidad de tener una de las enfermedades asociadas con células plasmáticas anormales. Si un paciente tiene entre 21 y 49 CMMC, el paciente tiene un nivel elevado y es más probable que tenga una de las enfermedades asociadas con células plasmáticas anormales, si un paciente tiene entre 50 y decenas de miles de CMMC ese paciente tiene un nivel muy elevado y es aún más probable que tenga una de dichas enfermedades.
Aún adicionalmente, la invención incluye un método para determinar si un paciente sometido a intervención terapéutica reduce el número de CMMC; el método comprende
(a) procesar dicha sangre del paciente para determinar cuántas CMMC hay en la muestra en un primer punto de tiempo
(b) determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en dicha muestra, es igual o mayor que o igual que intervalo normal
(c) procesar dicha sangre del paciente para determinar cuántas CMMC hay en la muestra en un segundo punto de tiempo
(d) determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en dicha muestra es igual o mayor que o igual que el intervalo normal
(e) comparar los números de las etapas (b) y (d). Todos los términos definidos anteriormente tienen su mismo significado e intervalo preferido.
Todavía adicionalmente, la invención incluye un método para determinar si un paciente que tuvo una enfermedad de células plasmáticas anormales y se trató exitosamente debido a tal enfermedad, permanece en remisión; el método comprende
(a) procesar dicha sangre del paciente para determinar cuántas CMMC hay en la muestra en un primer punto de tiempo
(b) determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en dicha muestra es igual o mayor que o igual que el intervalo normal
(c) procesar dicha sangre del paciente para determinar cuántas CMMC hay en la muestra en un segundo punto de tiempo
(d) determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en dicha muestra es igual o mayor que o igual que el intervalo normal
(e) comparar los números de las etapas (b) y (d).
Todos los términos definidos anteriormente tienen su mismo significado e intervalo preferidos.
Todavía adicionalmente, la invención incluye un reactivo para capturar células circulantes de mieloma múltiple que comprende partículas magnéticas coloidales y por lo menos un ligando.
Todos los términos definidos anteriormente tienen su mismo significado e intervalo preferidos.
Aún adicionalmente, la invención incluye métodos para capturar, aislar, y analizar células plasmáticas circulantes; el método comprende
(a) obtener una muestra de sangre de un sujeto de prueba
(b) contactar dicha muestra con partículas magnéticas coloidales que se conjugan con un primer ligando
(c) someter la muestra de la etapa (b) a un campo magnético para producir una fracción separada de células circulantes de mieloma múltiple unidas a la partícula magnética
(d) tratar la muestra de la etapa (c) con un primer marcador adicional
(e) analizar células plasmáticas circulantes.
Todos los términos definidos anteriormente tienen su mismo significado e intervalo preferidos.
Las células circulantes de mieloma múltiple (CMMC), una forma de células plasmáticas anormales, capturadas a partir de la sangre se capturan y analizan mediante el uso del sistema CeilTracks® AutoPrep® y el analizador CeilTracks Analyzer II®. En este procedimiento se usa una combinación del reactivo de captura (ferrofluido) y biomarcadores fluorescentes (tales como
anticuerpo anti-CD38-ficoeritrina (PE)) y colorantes (tales como el colorante de ácido nucleico DAPI) para identificar células plasmáticas anormales y para distinguirlas de leucocitos y restos contaminantes. CD138 o Syndecan-1 es un marcador de superficie celular que se encuentra en las células plasmáticas maduras y en tumores malignos de células plasmáticas tales como mieloma múltiple pero no en otros leucocitos normales de sangre periférica. Por esta razón se acopló anti-CD138 a las nanopartículas magnéticas, ferrofluidas, que se usan para seleccionar magnéticamente células plasmáticas circulantes a partir de una muestra de sangre periférica. Con el propósito de detectar las células plasmáticas anormales a partir de leucocitos contaminantes, se usan varios biomarcadores fluorescentes. El anti-CD38 se conjuga con ficoeritrina (PE) y se usa como un marcador positivo para la detección de células plasmáticas. Sin embargo, debido a que CD38 se encuentra, además, en algunos tipos de leucocitos (células T y B activadas) el ensayo usa, además, aloficocianina (APC) conjugada con anti-CD45 y anti-CD19 conjugado con aloficocianina (APC) como marcador negativo. CD45 es un marcador pan-leucocitario encontrado en leucocitos de sangre periférica y CD19 es un marcador específico de células B. Las células de mieloma son células B diferenciadas funcionalmente que no expresan CD45 o CD19. Un marcador final en este ensayo es anti-CD56 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). CD56 puede encontrarse en algunos subconjuntos de leucocitos periféricos tales como las células NK pero se expresa, además, en el 75% de las células de mieloma y se asocia, frecuentemente, con un peor pronóstico del
paciente. De esta manera, aún cuando CD56 no es un marcador positivo ni negativo para el mieloma múltiple, sus niveles de expresión en las células pueden monitorearse durante la terapia del paciente con fármacos.
El ensayo se desarrolló inicialmente mediante el uso de líneas celulares tales como RPMI 8226, H929 y MM.1S para evaluar diferentes anticuerpos para los marcadores determinados para estar presentes en células de mieloma múltiple que incluyen CD138, CD38 y CD56. Dado que estas líneas celulares fueron negativas para CD45 y CD19, se usaron PBMC en lugar de evaluar los anticuerpos.
Las células enriquecidas y teñidas se transfirieron a un cartucho de CelITracks ® y MagNest® para el montaje magnético. El cartucho se exploró mediante el uso del analizador CelITracks Analyzer II®. Las imágenes individuales de las células se le presentaron al operador para su revisión, y se calificaron como CMMC, con base en la fluorescencia y la morfología celular. En un sistema modelo de adición el ensayo recuperó consistentemente ~60% de las células de la línea celular de mieloma múltiple H929 añadidas en 4.0 mi de sangre de donantes sanos. El ensayo fue lineal en el intervalo de prueba de 0 a 2000 células H929 añadidas (r2 0.98, pendiente 0.50, intercepción 10). El ensayo se validó mediante el uso de sangre de donantes sanos de la misma edad (n=22) y pacientes con mieloma múltiple (n=66) y MGUS (n=7). En 4.0 mi de sangre de donantes normales, se detectó 0 CPC en 2/22 (55%) y números inferiores (1-6 CPC) se detectaron en 10/22 (45%) de las muestras. De manera interesante, en un donante sano se encontró una CPC positiva para CD56. Las
CMMC en pacientes con mieloma múltiple estaban en el intervalo de 0 - 17,000 /4.0 mi de sangre. Se detectó uno o más CMMC en 91% de los pacientes,= 5 en 68%,= 10 en 58% y= 100 en 35%. La expresión de CD56 fue muy variable en la población de pacientes. Las CMMC en pacientes con MGUS estaban en el intervalo de 0 - 112 /4.0 mi de sangre. Se detectó una o más CMMC en 6/7 de los pacientes, > 5 en 4/6, > 10 en 2/6 y > 100 en 1/6.
Para caracterizar más aún las CMMC, y diferenciar las CPC de las CMMC, se desarrolló un ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH) en interfase para usarlo con el sistema de captura y detección descrito anteriormente. Se usó una sonda de FISH de cuatro colores para detectar simultáneamente mutaciones de alto riesgo. Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
EJEMPLOS
Abreviaturas
PE - ficoeritrina
FITC - isotiocianato de fluoresceína
APC - aloficocianina
PBMC - célula mononuclear de sangre periférica
Fuentes de anticuerpo- CD138:
Gen-Probe Diaclone SAS
1 Bd A Fleming, BP 1985
F-25020 Besancon Cedex, Francia
CD38 y CD19
R&D Systems
614 McKinley Place N.E.
Minneapolis, MN 55413
EJEMPLO 1
Objetivos de captura
La Figura 1 muestra que de los anticuerpos anti-CD138, cuya reactividad se probó con las líneas celulares RPMI 8226, H929, y MM.1S, el anticuerpo con mejor desempeño, fue el clon B-A38. Las líneas celulares se marcaron primero con los diferentes anticuerpos, que eran todos anticuerpos anti-humanos de ratón, después, se marcaron subsecuentemente con un conjugado de PE anti-ratón y se analizaron por citometría de flujo. El clon B-A38 dio la tinción fluorescente más alta en todas las líneas celulares de mieloma múltiple.
EJEMPLO 2
Objetivos de detección
La Figura 2 muestra que de los anticuerpos anti-CD38 cuya reactividad se probó con las líneas celulares RPMI 8226, H929, y MM.1S el
anticuerpo con mejor desempeño fue el clon 240742. Las líneas celulares se probaron inicialmente mediante el uso de un conjugado directo anti-CD38-FITC, pero más tarde se encontró que el conjugado FITC no fue lo suficientemente adecuado para la detección sobre la plataforma CelITracks®. Un conjugado con PE de este anticuerpo se preparó y se probó subsecuentemente y se encontró que es adecuado para la detección.
EJEMPLO 3
Determinación de la dilución
Anti CD19 y anti-CD45, ambos como conjugados de APC, se escogieron como marcadores de detección negativos ya que la ausencia de ambos es indicativa de células plasmáticas anormales. Anti-CD45APC ya es un componente del reactivo de tinción de CTC de CellSearch® así que no se necesitó optimización adicional. Y debido a que ninguna de las líneas celulares de mieloma en evaluación expresó CD19, se usaron PBMC para evaluar los diferentes clones anti-CD19APC. Los resultados de la prueba con anti-CD19 en PBMC pueden observarse en la Figura 3. La tinción se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante en PBMC recogidas en EDTA y tubos CellSave. El clon SJ25C1 se escogió como el conjugado de mejor desempeño. Después, el conjugado se probó a diferentes diluciones en los mismos volúmenes de reacción usados en AutoPrep®, Figura 4. Una dilución de 1 :5 se escogió como la dilución final para la tinción.
EJEMPLO 4
Tinción de CD56 v PBMC
Se escogió el anti-CD56 como un reactivo del marcador FITC ya que se expresa en el 75% de los casos de mieloma con expresión anormal. La prueba se realizó en líneas celulares (Figura 6) y PBMC (Figura 5) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. NCAM 16.2 se escogió como el conjugado de mejor desempeño.
EJEMPLO 5
Diluciones de CP 56 FITC
El conjugado anti-CD56 FITC NCAM 16.2 se probó a diferentes diluciones con células H929 en AutoPrep®, ver Figura 7-10. Ninguna dilución de prueba fue claramente mejor sobre la línea celular. Se escogió una dilución de 1 :4 como la dilución final para la tinción hasta que las muestras de los pacientes se pudieran probar para ayudar a determinar la concentración óptima.
EJEMPLO 6
Imágenes
Después se construyó un kit prototipo para CMMC que consiste en ferrofluido de anti-CD138, reactivo de tinción que consiste en anti-CD38 PE, anti-
CD45 APC y anti-CD19 APC, y un reactivo marcador anti-CD56 FITC. Los componentes restantes del kit fueron el reactivo de mejora de la captura (PN 7037), el reactivo de permeabilización (PN 7038), el colorante de ácido nucleico (PN 7041), y CelIFix (PN 7042). La primera ronda de pruebas usó ferrofluido de anti-CD138 a diferentes concentraciones. La concentración final de anti-CD38 PE se fijó en 1 pg/ mi (concentración del reactivo de tinción de 5.7 pg/ mi) con base en los datos de flujo previos. La concentración final de anti-CD45 APC fue aproximadamente 2 pg/ mi (concentración del reactivo de tinción de 13 pg/ mi -igual que en el kit para CTC CellSearch®) y la solución madre del conjugado anti-CD19 APC se diluyó 1:5 en el reactivo de tinción. El anti-CD56 FITC se usó a una concentración de 1 :4 en el frasco del reactivo marcador. Las células H929 se añadieron en 7.5 mi de sangre en CellSave y se procesaron en AutoPrep® a concentraciones del ferrofluido de 135, 185, 220, y 270 pg/ ml. Las muestras se analizaron, después, en el CellTracks Analyzer II® y la recuperación de células H929 alcanzó una meseta de 55-60% a aproximadamente 220 pg/ml.
Por lo tanto, se decidió que la concentración final de ferrofluido en el kit fuera de 220 pg/ mi por 7.5 mi de muestra de sangre, que es similar a las concentraciones usadas en muchos otros kits de CellSearch®.
Imágenes de CellTracks® de células H929 y MM.1S recuperadas pueden observarse en las Figuras 11 y 12 respectivamente. Nótese la mayor tinción de CD56 de las células H929 en comparación con las células MM.1S. En la Figura 13 puede observarse arrastre de glóbulos blancos (CD38+/CD45+).
EJEMPLO 7
Muestras de pacientes
Un total de 66 muestras de pacientes de mieloma múltiple se probaron para CMMC. Estas muestras se adquirieron de Conversant y se probaron, originalmente, 7.5 mi de sangre mediante el uso del kit de servicio para CMMC CellTracks®, pero cuando se hizo evidente que muchas muestras tenían altos números de CMMC se tomó la decisión de reducir el volumen de análisis de sangre a 4 mi. Las muestras se procesaron en el CellTracks® AutoPrep® y, después, se exploraron en el analizador CellTracks Analyzer II®. La Figura 10 es un cuadro de datos generado a partir de las muestras de sangre de los pacientes. Las CMMC en pacientes con mieloma múltiple estaban en el intervalo de 0 - 17,000 /4.0 mi de sangre. Se detectó una o más CMMC en 91% de los pacientes, > 5 en 68%, > 10 en 58% y > 100 en 35%. La expresión de CD56 fue muy variable en la población de pacientes. Las CMMC en pacientes con MGUS estaban en el intervalo de 0 - 112 /4.0 mi de sangre. Se detectó una o más CMMC en 6/7 de los pacientes, > 5 en 4/6, > 10 en 2/6 y > 100 en 1/6. Las Figuras 14-17 muestran algunas imágenes representativas de CellTracks® de las muestras de pacientes.
Leyendas, Cuadro 1
Etapa: Una clasificación del diagnóstico de la extensión y las características de las células de mieloma comprende las Etapas I, II, y III. El
número de células cancerosas progresa de relativamente poco a moderado a relativamente grande mientras las etapas progresan. Además, los síntomas adicionales tales como la proteína M, anemia y calcio sérico aumentan a medida que las Etapas progresan.
Estado del tratamiento: Refleja el estado de la enfermedad y el enfoque del tratamiento.
Tipo de tratamiento: Fármaco o terapia de radiación. Volumen: El volumen de sangre periférica se procesó en el sistema CellSearch®.
Eventos totales: Número total de imágenes del navegador de
CellTracks® presentadas al usuario para una clasificación manual de las células de mieloma múltiple.
Células de MM Totales (CD38+, CD19/45-): Número total de imágenes de los eventos totales que determinan que el usuario cumple con los criterios de una célula de mieloma múltiple (MM). Estas células son positivas para CD38 y negativas para CD19/45.
CD38+, CD19/45-, CD56+: El número de células de mieloma múltiple que fueron positivas para CD56.
CD38+, CD19/45-, CD56-: El número de células de mieloma múltiple que fueron negativas para CD56.
Eventos no asignados: Los eventos totales menos las células de MM totales, que fueron eventos que el usuario clasificó como células de mieloma
múltiple. Los eventos no asignados son una combinación de glóbulos blancos,
ruido del computador, u otros restos no clasificados como células de MM.
CUADRO 1
Cuadro de muestras de CMMC de pacientes de mieloma múltiple
EJEMPLO 8
Sujetos normales
Igualmente, se analizaron veintidós sujetos normales de la misma edad. Además, estas muestras se adquirieron de Conversant y se probaron 4 mi de sangre mediante el uso del kit de servicio para CMMC CelITracks®. Las muestras se procesaron en el CelITracks® AutoPrep® y, después, se exploraron en el analizador CelITracks Analyzer II®. El Cuadro 2 es un cuadro de datos generados a partir de las muestras de 4 mi de sangre. En 4.0 mi de sangre de donantes normales, se detectó 0 CPC en 12/22 (55%) y números inferiores (1-6 CPC) se detectaron en 10/22 (45%) de las muestras. De manera interesante, se encontró una CPC positiva para CD56 en un donante normal. Ver la Figura 18. El número promedio de eventos totales del navegador fue aproximadamente 1500.
Para caracterizar más aún las CMMC, y diferenciar las CPC de las CMMC, se desarrolló un ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH) en inferíase para usarse con el sistema de captura y detección descrito anteriormente. Se usó una sonda de FISH de cuatro colores para detectar simultáneamente mutaciones de alto riesgo que incluyen dos translocaciones recurrentes del locus IgH (t(4;14)(p16;q32) y t(14;16)(q32;q23)), así como también la deleción del locus TP53 (?17?13). El ensayo FISH se verificó en las líneas celulares H929, MM1s, y U266, que mostraron mutaciones en t(4;14), t(14;16) y ?17?13, respectivamente. El ensayo FISH se probó en 9 muestras de CMMC de pacientes y 8 muestras dieron resultados evaluables.
Dos muestras mostraron fusiones t(4;1 ), 3 pacientes mostraron patrones aberrantes de señales de FISH que indican aneuploidía del cromosoma 4 o 14 y el resto de los pacientes mostró patrones normales de FISH.
CUADRO 2
Cuadro de CMMC de 4 mi de sangre de donantes normales de la misma edad
EJEMPLO 9
Captura mediante el uso de anti-CD 38 y anti CP 138 en muestras de pacientes
El anti CD138, el marcador de superficie celular conjugado con partículas magnéticas coloidales usadas para capturar células de mieloma en la presente invención puede desprenderse de la superficie de la célula de mieloma con el tiempo. El CD38, un marcador de superficie presente, además, en células de mieloma, no experimenta desprendimiento de la superficie celular. Se desarrolló una nanopartícula magnética que se acopló a anti-CD 138 y a anti-CD38 y se probó la capacidad de capturar células de mieloma con muestras de pacientes y de donantes normales. Para la detección se usaron anti-CD38 y anti CD 138 ambos conjugados con ficoeritrina (PE), y ambos reconocen epítopos diferentes del anti CD38 y el anti-CD 138 usados en la fabricación de la nanopartícula magnética, junto con anti-CD45 y anti-CD19 conjugados con aloficocianina (APC).
Un total de 22 muestras de pacientes de mieloma múltiple se probaron para CMMC mediante el uso del reactivo de captura alternativo. Estas muestras se adquirieron de Conversant y se procesaron 4 mi en CelITracks® AutoPrep® y, después, se exploraron en el analizador CelITracks Analyzer II®. El Cuadro 3 es un cuadro generado a partir de las muestras de pacientes. Las CMMC en pacientes con mieloma múltiple estaban en el
intervalo de 0-2244/4.0 mi de sangre. Se detectaron una o más CMMC 82% de los pacientes,= 5 en 64%, > 10 en 59%, y= 100 en 23%.
CUADRO 3
De CMMC a partir de pacientes de mieloma múltiple
EJEMPLO 10
Captura mediante ei uso de anti-CD 38 y anti CP 138 en muestras normales
Doce donantes normales se probaron, después, mediante el uso de la misma configuración del kit que en el Ejemplo 8. Estas muestras fueron donantes internos y se procesaron 4 mi de sangre en los CellTracks® AutoPrep® y se exploraron, después, en el analizador CellTracks Analyzer II®. El Cuadro 4 es un cuadro generado a partir de las muestras de 4 mi de sangre. En 4.0 mi de sangre de donantes normales, se detectó 0 CPC en 5/12 (42%) y se detectaron números inferiores (1-3 CPC) en 7/12 (58%) de las muestras.
CUADRO 4
De CPC de donantes normales
Claims (33)
1.- Un método para capturar, aislar y analizar células circulantes de mieloma múltiple; el método comprende: (a) contactar una muestra de sangre previamente obtenida de un sujeto de prueba con partículas magnéticas coloidales que se conjugan con un primer ligando; (b) someter la muestra de la etapa (a) a un campo magnético para producir una fracción separada de células circulantes de mieloma múltiple unidas a la partícula magnética; (c) tratar la muestra de la etapa (b) con un primer marcador adicional; y (d) analizar las células circulantes de mieloma múltiple.
2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra tiene un volumen de aproximadamente 2 mi a aproximadamente 10 mi.
3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra tiene un volumen de aproximadamente 3 mi a aproximadamente 7.5 mi.
4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra tiene un volumen de aproximadamente 4 mi.
5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer ligando se selecciona del grupo que consiste en anti-CD 138, anti-CD 38, y anti-CD56.
6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer ligando se selecciona del grupo que consiste en anti- CD 138, y anti-CD 38.
7. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el primer ligando se selecciona del grupo que consiste en anti- CD 138.
8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer ligando se selecciona del grupo que consiste en anti-56.
9 - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las partículas magnéticas coloidales se conjugan con un segundo ligando, en donde el primer ligando se selecciona del grupo que consiste en anti CD 138 y anti-CD56, y el segundo ligando es CD 38.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el primer ligando es CD 138 y el segundo ligando es CD 38.
11- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las partículas magnéticas coloidales se conjugan con más de dos ligandos.
12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque las partículas magnéticas coloidales se conjugan con anti-CD 138, anti-CD 38, y anti-CD56.
13. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer marcador adicional se selecciona del grupo que consiste en DAPI, anti-CD38 anti CD19, y anti CD45 anti CD 138, anti CD 56, anti lambda, anti kappa anti CD 200, anti Ki67.
14. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer marcador adicional es anti-CD38.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente contactar la muestra de la etapa (b) con un segundo marcador adicional.
16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el segundo marcador adicional se selecciona del grupo que consiste en anti- CD19, anti-CD45, y DAPI.
17. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el segundo marcador adicional es DAPI.
18. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque comprende adicionalmente contactar la muestra de la etapa (b) con un tercer marcador adicional.
19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el tercer marcador adicional se selecciona del grupo que consiste en anti-CD19, anti-CD45, y DAPI.
20. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el tercer marcador adicional es anti-CD19.
21. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque comprende adicionalmente contactar la muestra de la etapa (b) con un cuarto marcador adicional.
22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el cuarto marcador adicional es anti-CD45.
23. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente contactar la muestra de la etapa (b) con cuatro o más marcadores adicionales.
24. - Un método para determinar si el paciente es un candidato probable para la intervención terapéutica para enfermedades asociadas con las células plasmáticas anormales, en donde el método comprende determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en una muestra de sangre previamente obtenida de un paciente, es igual a o mayor que o igual que el intervalo normal.
25. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el procesamiento comprende (a) contactar una muestra de sangre previamente obtenida de un sujeto de prueba con partículas magnéticas coloidales que se conjugan con un primer ligando; (b) someter la muestra de la etapa (a) a un campo magnético para producir una fracción separada de células circulantes de mieloma múltiple unidas a la partícula magnética; (c) tratar la muestra de la etapa (b) con un primer marcador adicional; y (d) analizar las células circulantes de mieloma múltiple.
26. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el intervalo normal de CMMC en una muestra de paciente es menor que 7 CMMC en aproximadamente 2 mi a 10 mi de sangre.
27. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende adicionalmente recomendar la intervención terapéutica si el número de CMMC es mayor que 8 en aproximadamente 2 mi a aproximadamente 10 mi de sangre.
28. - Un método para determinar si un paciente sometido a intervención terapéutica está reduciendo el número de CMMC; el método comprende (a) determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en una muestra de sangre previamente obtenida de un paciente en un primer punto de tiempo es igual a o mayor que o igual que el intervalo normal; (b) procesar dicha muestra de sangre del paciente para determinar cuántas CMMC hay en la muestra en un segundo punto de tiempo; (c) determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en la muestra es igual a o mayor que o igual que el intervalo normal; y (d) comparar los números de las etapas (a) y (c).
29. - Un método para determinar si un paciente que tuvo una enfermedad de células plasmáticas anormales y se trató exitosamente por tal enfermedad, permanece en remisión; el método comprende (a) determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en una muestra de sangre previamente obtenida de un paciente en un primer punto de tiempo, es igual a o mayor que o igual que el intervalo normal; (b) procesar dicha muestra de sangre del paciente para determinar cuántas CMMC hay en la muestra en un segundo punto de tiempo; (c) determinar mediante recuento si el número de CMMC presentes en la muestra es igual a o mayor que o igual que el intervalo normal; (d) comparar los números de las etapas (a) y (c).
30. - Un reactivo para capturar células circulantes de mieloma múltiple, que comprende partículas magnéticas coloidales y por lo menos un ligando.
31. - El reactivo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque los ligandos se seleccionan del grupo que consiste en anti CD 138, anti-CD 38, y anti-CD.
32. - El reactivo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende adicionalmente por lo menos dos ligandos
33. - El reactivo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende adicionalmente por lo menos tres ligandos.
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