KR20240033068A - 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(caml)의 변화를 이용한 암 치료 반응의 예측 및/또는 모니터링 방법 - Google Patents

순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(caml)의 변화를 이용한 암 치료 반응의 예측 및/또는 모니터링 방법 Download PDF

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Abstract

암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하기 위한 수단이 제공되며, 여기서 상기 예측은 기준선 및 치료 유도 후의 상기 개체로부터의 혈액과 같은 생물학적 샘플에서 발견된 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(CAML) 및 순환성 종양 세포(CTC)의 수와 크기를 비교하는 것을 기반으로 한다.

Description

순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(CAML)의 변화를 이용한 암 치료 반응의 예측 및/또는 모니터링 방법
본 발명은 일반적으로 고형 종양과 같은 암을 갖는 개체의 암 치료 반응을 예측 및/또는 모니터링하기 위한 혈액 및 기타 체액 내 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 본 정보는 환자와, 암 치료를 안내하는 종양 전문의에게 유용할 수 있다.
종양 세포가 원발성 고형 종양에서 이탈하면, 혈액 또는 림프 순환계로 침투하며, 궁극적으로 혈류를 떠나 장기나 조직으로 들어가 전이를 형성한다. 암 관련 사망의 90%는 전이 과정으로 인해 발생한다. 가장 흔한 전이 부위는 폐, 간, 뼈 및 뇌이다. 순환계에서 발견되는 종양 세포를 순환 종양 세포(CTC)라고 한다. 많은 연구 간행물 및 임상 시험에서는 CTC가 (i) 혈류 내 CTC의 개수(enumeration)를 통해 예후적 생존 및 암 재발 정보를 제공하고, (ii) 단백질 발현 수준 및 CTC의 유전자 돌연변이 및 전좌 발생률 검사를 통해 치료 정보를 제공하는 데 임상적 유용성이 있음을 보여준다. 그러나 CTC는 개체, 심지어 IV기 암 환자의 경우에도 암의 발생 및/또는 존재와 일관되게 연관되지 않는다. CTC는 유방암, 전립선암, 대장암의 IV기에서 가장 흔히 발견되지만, 동일한 암의 초기 단계에서는 드물게 발견된다. CTC는 다른 암에서도 드물다.
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(CAML)는 암 환자의 혈액에서 발견되는 또 다른 암 관련 세포 유형이다. CAML은 테스트된 모든 고형 종양 및 모든 단계의 암과 관련이 있다. CAML은 배수체(polyploid)이며 크기가 약 25μm 에서 약 300μm로 매우 크며 경우에 따라 더 크다. 이러한 배수체 세포는 CD45(-) 또는 (+)일 수 있으며 일반적으로 CD14 및 CD31을 발현하며 이는 골수 계통의 기원임을 확인한다. 이는 CTC와 세포 잔해를 삼키는(engulfing) 과정에서 종종 발견된다[1-6].
혈액 및 기타 체액에서 CAML과 같은 바이오마커의 식별 및 특성화와 관련된 분석을 사용하여 예측 및 예후 정보를 제공할 수 있다. 본 발명은 임상의 및 다른 중요한 목표에 이러한 도구를 제공하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 치료 전 및 치료 후로부터 얻은 샘플에서 CAML의 크기 및 수를 결정하고 비교하는 단계; 및 이를 토대로 예측하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료 전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료 후 샘플을 얻는 단계, 및 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수 및 크기를 비교하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법을 제공한다.
본 발명은 암종, 육종, 신경모세포종 및 흑색종을 포함하는 고형 종양을 갖는 개체의 혈액에서 발견되는 독특한 특징을 갖는 세포 유형을 사용하는 방법에 관한 것이다. "순환 암 관련 대식세포 유사 세포"(CAML)로 불리는 이들 순환 세포는 암을 갖는 개체에서 고형 종양의 존재와 연관되어 있는 것으로 나타났다. CAML과 관련된 5가지 형태가 특성화되고 설명되었다[1-3]. CAML은 정밀 마이크로필터를 사용한 크기 배제 미세여과(size exclusion microfiltration)를 통해 I기에서 IV기까지의 고형 종양이 있는 피험자의 말초 혈액에서 일관되게 발견되었다.
CAML과 관련된 의학적 적용에는, 암의 조기 발견 및 진단을 제공하기 위한 바이오마커로서 세포의 사용, 특히 암 재발 또는 재발의 조기 발견 및 진단, 암 돌연변이의 결정이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. CAML의 크기는 예후 정보를 제공하는 것으로 나타났다. 7.5mL의 혈액 샘플에서 50μm보다 큰 CAML을 가진 환자는 50μm보다 큰 CAML이 없는 환자에 비해 짧은 무진행 생존 기간과 전체 생존 기간을 갖는 것으로 나타났다[4].
본원에서 처음으로 보고된 바와 같이, 암 환자의 혈액에서 발견되는 CAML과 관련된 다른 특성뿐만 아니라 동일한 샘플에서 발견되는 순환 종양 세포(CTC)와 관련된 특성을 사용하여 환자 치료에 중요한 예측 및 예후 정보 두 가지를 모두 제공할 수 있다. 예를 들어, 특정 치료 요법에서 얻은 임상 데이터에 바이오마커 양성 그룹과 바이오마커 음성 그룹이 모두 포함된 경우, 데이터는 다음과 같다: (1) 바이오마커 음성 그룹이 치료 반응자 대 비반응자를 계층화할 수 없는 경우, 데이터는 예측적일 수 있고, (2) 상기 바이오마커가 바이오마커 양성 및 바이오마커 음성 코호트 모두에서 반응자를 계층화할 수 있는 경우, 예측 및 예후가 모두 가능하다[7].
본 발명은 이러한 특성을 이용하고, 제1 실시양태에서 동일한 환자로부터의 적어도 2개의 샘플에서 CAML의 크기 및 수를 결정하고 비교함으로써 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 여기에서 제1 환자 샘플은 치료 전에 획득되고(즉, 치료 전 샘플) 제2 환자 샘플은 치료 후에 획득된다(즉, 치료 후 샘플). 기준선(BL)은 첫 번째(치료 전) 환자 샘플에서 제공된다. 본 발명의 특정 측면에서, 치료후 샘플 중 적어도 하나의 CAML이 치료 전 샘플에서 가장 큰 CAML보다 크기가 더 크고, 치료 전 샘플보다 치료후 샘플에 더 많은 CAML이 있는 경우, 샘플에서 피험자는 치료에 반응하지 않을 것으로 예측된다.
본 실시 양태의 첫 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 이는 비교(차이, 차이점)를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 간의 CAML 수 및 크기를 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 CAML 수 및/또는 크기의 차이가 발견되면 치료 반응이 예측된다. 상기 비교는 CAML 크기 변경(변화), CAML 수 변경(변화) 또는 둘 다일 수 있다. 상기 CAML 크기의 변화는 샘플 내 모든 CAML에 대해 계산된 평균 크기의 변화일 수도 있고, 샘플 중 가장 큰 CAML 크기의 변화일 수도 있다. 크기의 변화는 크기의 증가 또는 크기의 감소일 수 있다.
본 실시 양태의 두 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 이는 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수와 크기를 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 치료 후 샘플 중 가장 큰 CAML이 치료 전 샘플 중 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 감소하거나 크기가 유사하고, 치료 후 샘플 중 CAML의 수가 치료 전 샘플에서의 CAML의 수보다 적은 경우, 개체는 치료로 호전되거나 치료에 반응할 가능성이 있다.
본 실시 양태의 세 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수와 크기를 비교하며, 여기서, 치료 후 샘플 중 가장 큰 CAML이 치료 전 샘플 중 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 감소하거나 크기가 유사하고, 치료 후 샘플 중 CAML의 수가 치료 전 샘플의 CAML 수와 같거나 더 많은 경우, 피험자는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
본 실시 양태의 네 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 치료 전 샘플과 후 샘플 간의 CAML 수와 크기의 차이를 비교하고, 여기서, 치료후 샘플에서 가장 큰 CAML은 치료전 샘플에서 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 증가하거나 크기가 유사하고, 치료후 샘플에서 CAML의 수는 치료 전 샘플의 CAML 수와 같거나 적은 경우, 피험자는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
본 실시 양태의 다섯 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 치료 전 샘플과 후 샘플 간의 CAML 수와 크기의 차이를 비교하고, 여기서, 치료 후 샘플 중 가장 큰 CAML이 치료 전 샘플 중 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 증가하거나 크기가 유사하고, 치료 후 샘플 중 CAML의 수가 치료 전 샘플에서의 CAML의 수보다 많은 경우, 피험자는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
제2 실시 양태에서, 본 발명은 암을 갖는 개체로부터의 샘플에서 CTC를 검정함으로써 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법에 관한 것이며, 여기서 암 치료 후 샘플 중 하나 이상의 CTC의 존재는 (즉, 치료 후 샘플)은 개체가 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있음을 시사한다. CTC는 전이성 유방암, 전립선암, 대장암, 소세포폐암(SCLC)을 제외하고 암 환자의 혈액에서 거의 발견되지 않지만, 일부 샘플에서 CTC의 존재를 확인하면 치료 반응을 예측할 수 있다.
본 실시 양태의 하나의 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계, 및 CTC에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 여기서 하나 이상의 CTC가 샘플에서 검출되는 경우, 피험자는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
제3 실시 양태에서, 본 발명은 제1 실시 양태와 제2 실시 양태의 특징을 결합하는 방법에 관한 것이다.
이 제3 실시 양태의 방법은, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 데에도 사용될 수 있다. 상기 방법은 (i) 적어도 2개의 환자 샘플에서 CAML의 크기 및 수를 비교하는 것을 포함하며, 여기서 첫 번째 환자 샘플은 치료 전(즉, 치료 전 샘플)에서 획득되고 두 번째 환자 샘플은 치료 후(즉, 치료 후 샘플)에서 획득되며, 및 (ii) 치료 후 얻은 두 번째 환자 샘플(즉, 치료 후 샘플)에서 CTC의 수를 결정하는 것을 포함한다.
본 실시 양태의 하나의 특정한 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법으로서, (i) 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 간의 CAML 수와 크기의 차이를 비교하는 것, 및 (ii) 치료 후 샘플에서 CTC의 수를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 CAML 수 및/또는 크기의 차이가 발견되고/되거나 적어도 하나의 CTC가 검출되는 경우, 치료 반응이 예측된다. 예를 들어, 치료 후 샘플에서 하나 이상의 CTC가 검출되면 개체는 치료로 인해 혜택을 받지 못하거나(호전되지 못하거나) 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
위의 실시 양태와 같이, 상기 차이는 CAML 크기의 변화, CAML 수의 변화, 또는 둘 다일 수 있다. 상기 CAML 크기의 변화는 샘플 내 모든 CAML에 대해 계산된 평균 크기의 변화일 수도 있고, 상기 CAML 크기 변화는 샘플 중 가장 큰 CAML 크기의 변화일 수도 있다. 크기의 변화는 크기의 증가 또는 크기의 감소일 수 있다.
본 발명의 각각의 실시예 및 측면에서, CAML은 다음의 특성을 각각 갖는 것으로 정의될 수 있다:
(a) 크기가 약 14~64μm 이상인 큰 비정형 배수체 핵(large atypical polyploid nucleus), 또는 이보다 크거나, 또는 단일 세포에 있는 다중 핵;
(b) 세포 크기는 약 20-300μm이나, 더 큰 것도 가능함; 및
(c) 방추형, 올챙이형, 원형, 직사각형, 두 다리형, 얇은 다리형 및 무정형으로 구성된 그룹에서 선택된 형태학적 형태.
본 발명의 실시예의 특정 측면에서, CAML은 다음과 같은 추가 특성 중 하나 이상을 갖는 것으로 추가로 정의될 수 있다:
(d) CD14 양성 표현형;
(e) CD45 발현;
(f) EpCAM 발현;
(g) 비멘틴(vimentin) 발현;
(h) PD-L1 발현;
(i) 단핵구 CD11C 마커 발현;
(j) 내피 CD146 마커 발현;
(k) 내피 CD202b 마커 발현;
(l) 내피 CD31 마커 발현; 및
(m) 상피암 세포 CK8, 18 및/또는 19 마커 발현.
본 발명의 각 측면 및 실시예에서, 샘플은 생물학적 샘플이고, 샘플은 말초 혈액, 혈액, 림프절, 골수, 뇌척수액, 조직, 소변, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 냉동보존 PBMC 중 하나 이상일 수 있으나 이에 국한되지는 않는다. 생물학적 샘플이 혈액인 경우, 혈액은 예를 들어 전주정맥혈, 하대정맥혈, 대퇴정맥혈, 문맥혈, 경정맥혈일 수 있다. 샘플은 신선한 샘플일 수도 있고 적절하게 준비된 냉동 보존된 해동 샘플일 수도 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 샘플은 혈액 샘플이고 혈액 샘플의 크기는 5 내지 50 mL이다.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, 상기 암은 고형 종양, 1기 암(stage I cancer), 2기 암(stage II cancer), 3기 암(stage III cancer), 4기 암(stage IV cancer), 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 흑색종(melanoma), 상피세포암, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 대장암, 간암, 두경부암, 신장암, 난소암, 식도암, 자궁암, 요로상피암, 방광암, 자궁내막암, 담관암종, 신경내분비암 또는 기타 고형 종양암이다.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, 상기 CAML 및 CTC는 크기 배제 방법(size exclusion methodology), 면역포획(immunocapture), 덴드리머 매개 다가 세포 포획, 친화도 기반 표면 포획, 생체모방 표면 코팅 포획, 셀렉틴 코팅 표면 포획(selectin coated surfaces capture), 기타 기능화된 표면 포획, 관성 포커싱 칩, 적혈구 용해, 백혈구 고갈, FICOLL 분리, 전기 영동, 유전 영동, 유세포 분석, 자기 부상 및 다양한 미세 유체 칩 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 수단을 사용하여 샘플로부터 분리(단리)될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, CAML 및 CTC는 마이크로필터를 사용하는 것을 포함하는 크기 배제 방법을 사용하여 샘플로부터 분리될 수 있다. 마이크로필터는 CTC와 CAML을 모두 포집하기 위해 약 5 마이크론 내지 약 10 마이크론 범위의 기공 크기(pore)를 가질 수 있고, 주로 CAML을 포집하기 위해 마이크로필터는 약 20 마이크론 범위의 기공 크기를 가질 수 있다. 상기 마이크로필터의 포어는 원형, 레이스-트랙형(race-track shape), 타원형, 정사각형 및/또는 직사각형 포어 형상을 갖는 것일 수 있다. 상기 마이크로필터는 정밀 포어 기하학적 구조(precision pore geometry) 및/또는 균일 포어 분포(uniform pore distribution)를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, CAML 및 CTC는 물리적 크기 기반 분류, 유체역학적 크기 기반 분류, 그룹화, 트래핑, 면역포획, 대형 세포 농축, 또는 크기 기반의 소형 세포 제거를 통해, 미세유체 칩을 이용하여 샘플로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, CAML 및 CTC는 CellSieveTM 저압 미세여과 분석을 이용하여 생물학적 샘플로부터 분리된다.
혈액 및 기타 체액에서 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(CAML), CTC와 같은 바이오마커의 식별 및 규명과 관련된 분석은 예후 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 임상 의사 및 기타 중요한 대상에게 이러한 도구를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 치료 전 샘플로부터 치료 후 CAML 크기 및 수의 변화를 도시한다. (i) 치료 후 샘플의 CAML 수가 증가하고 치료 전 샘플보다 가장 큰 CAML의 크기가 증가한 경우, 해당 환자를 "CAML 증가(increase in CAMLs)"로 지정한다. (ii) 치료 후 샘플의 CAML 수가 증가하고 가장 큰 CAML의 크기가 치료 전 샘플에 비해 증가를 나타내지 않는 경우, 환자를 "CAML 혼합(mixed in CAMLs)"으로 지정한다. (iii) 치료 후 샘플의 CAML 수가 증가하지 않고, 가장 큰 CAML의 크기가 치료 전 샘플의 세포보다 증가하는 경우 해당 환자도 "CAML 혼합"으로 지정된다. (iv) 치료 후 샘플에서 CAML의 수가 감소하고 가장 큰 CAML의 크기가 치료 전 샘플보다 감소한 경우, 환자를 "CAML 감소(reduction in CAMLs)"로 지정한다.
도 2A는 하나의 약물 치료 연구에 대한 CAML 크기 또는 수의 변화에 기초하여 계층화(stratification)된 무진행 생존(progression free survival, PFS)의 계층화를 보여준다.
도 2B는 하나의 약물 치료 연구에 대한 CAML 크기 또는 수의 변화에 기초하여 계층화된 전체 생존(overall survival, OS)의 계층화를 보여준다.
도 3은 CAML 크기 또는 수의 변화에 기초한 치료 후 전이성 유방암 환자 그룹에 대한 종양 크기 변화의 스파이더 플롯을 보여준다.
도 4는 전이성 유방암 환자의 더 큰 집단(larger cohort)의 PFS의 카플란-마이어 플롯을 보여주며, 이 중 일부는 CAML 크기 및/또는 수의 변화를 고려하여 도 3의 거미 플롯(spider plot)에 표시되었다.
도 5A는 CAML 크기, 수 및 CTC의 존재를 고려하여, 기준선(baseline) 및 치료 후 CTC 및 CAML 정보를 비교하는, 전이성 유방암 환자의 PFS에 대한 Kaplan-Meier 플롯을 보여준다.
도 5B는 CAML 크기, 수 및 CTC의 존재를 고려하여, 기준선 및 치료 후 CTC 및 CAML 정보를 비교하는, 전이성 유방암 환자의 OS에 대한 Kaplan-Meier 플롯을 보여준다.
도 6A는 CAML 크기, 수 및 CTC의 존재를 고려하여, 기준선 및 치료 후 CTC 및 CAML 정보를 비교하는, 다양한 암 유형을 갖는 220명의 전이성 암 환자의 PFS에 대한 Kaplan-Meier 플롯을 보여준다.
도 6B는 CAML 크기, 수 및 CTC의 존재를 고려하여, 기준선 및 치료 후 CTC 및 CAML 정보를 비교하는, 다양한 암 유형을 갖는 220명의 전이성 암 환자의 OS에 대한 Kaplan-Meier 플롯을 보여준다.
도 7A는 치료 후 ≥50μm CAML을 갖는 환자 및 CTC의 존재를 고려하여, 다수의 다양한 암 유형을 갖는 220명의 전이성 암 환자의 PFS에 대한 Kaplan-Meier 플롯을 보여준다.
도 7B는 치료 후 ≥50μm CAML을 갖는 환자 및 CTC의 존재를 고려하여, 다양한 암 유형을 갖는 220명의 전이성 암 환자의 OS에 대한 Kaplan-Meier 플롯을 보여준다.
도 8은 기준선으로부터의 CAML 크기 및 수의 변화에 기초하여, CCR5 약물 치료 후 30일에 분석된 25명의 삼중 음성 유방암(TNBC) 환자의 (A) PFS 및 (B) OS의 계층화를 보여준다.
도 9는 CCR5 약물 치료 후 30일에 분석된 25명의 삼중 음성 유방암(TNBC) 환자의 (A) PFS 및 (B) OS의 계층화를 보여준다. CCR5 약물로 치료를 받았지만 치료 후 30일에 데이터가 없었던 4명의 추가 TNBC 환자가 포함된다. 이 4명의 환자의 경우 기준선에서 CAML이 50μm 미만인 환자는 CAML 감소 그룹에 속한다.
도 10은 CAML 크기의 35μm 변화에 대한 PFS 및 OS를 보여준다.
(a) 및 (b): 모든 n=182 NSCLC 환자에 대한 PFS 및 OS
(c) & (d): IMT 모집단(n=91, 녹색) 및 CRT 단독 모집단(n=91)에 대한 PFS 및 OS
도 11은 CTC, CAML 및 상피 중간엽 전이 세포(EMT)에서의 CXCR4 발현의 효과를 보여준다.
CTC, CAML 및 EMT 발현에 대한 PFS 및 OS의 Kaplan-Meier 그래프
(a.) CTC에서 CXCR4 발현의 PFS
(b.) CTC에서의 CXCR4 발현의 OS
(c.) CAML에 대한 CXCR4 발현의 PFS
(d.) CAML에서 CXCR4 발현의 OS
(e.) EMT에 대한 CXCR4 발현의 PFS
(f.) EMT에 대한 CXCR4 발현의 OS
도 12는 CAML에서의 PD-L1 발현을 비교하는 화학방사선 요법(CRT)에 이은 면역요법으로 치료된 NSCLC 환자의 (A) PFS 및 (B) OS의 계층화를 보여준다.
도 13은 CAML 크기와 조합된 PD-L1 발현을 그룹화함으로써 화학방사선 요법(CRT)에 이어 면역요법으로 치료된 NSCLC 환자의 (A) PFS 및 (B) OS의 계층화를 보여준다. 무반응자는 PD-L1이 낮고 하나 이상의 CAML이 50μm 이상인 환자 그룹에 속한다.
도 14는 CAML의 높은 PD-L1 발현과 낮은 PD-L1 발현을 비교하며, 추가 항-PD-L1/PD-1 면역요법을 포함하는(n=41) 또는 포함하지 않는(n=41) 화학방사선 요법(CRT)을 받는 NSCLC 환자의 (A) PFS 및 (B) OS의 계층화를 보여준다.
도 15는 치료 전과 치료 후 CAML의 PD-L1 발현 변화를 비교하여, 추가 항-PD-L1/PD-1 면역요법을 포함하는(n=41) 또는 포함하지 않는(n=41) 화학방사선 요법(CRT)을 받는 NSCLC 환자의 (A) PFS 및 (B) OS의 계층화를 보여준다.
상세한 구성 및 구성요소와 같은 설명에서 정의된 사항들은 본 발명의 포괄적인 이해를 돕기 위해 제공된 것에 불과하다. 따라서, 당업자는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나는 범위 내에서 본 명세서에 기재된 실시예의 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다.
암은 모든 국가의 모든 인구와 민족에 영향을 미치는 세계에서 가장 두려운 질병 중 하나이다. 남성과 여성 모두의 약 40%가 일생 동안 암에 걸린다. 미국에서만 해도 특정 시점에 1,200만 명 이상의 암 환자가 있으며, 2018년에는 170만 명의 신규 암 환자가 발생하고 60만 명 이상의 사망자가 발생하는 것으로 추산된다. 전 세계적으로 암으로 인한 사망은 매년 약 800만 명으로 추산되며, 이 중 300만 명은 환자가 치료를 받을 수 있는 선진국에서 발생한다.
이상적으로는, 암의 존재 여부 및/또는 암의 전이 여부를 신속하게 판단하고, 치료 유형을 선택하고, 선택한 치료가 효과가 있는지 판단하고, 생존에 대한 예후를 제공하는 데 사용할 수 있는 진단이 있을 것이다.
본 개시에서, 다른 어떤 암 관련 세포보다도 1기부터 4기까지의 고형 종양 환자의 혈액에서 더 일관되게 발견되는 세포 유형이 제시된다. 이러한 순환성 세포는 원발 종양과 동일한 종양 마커를 함유하는 대식세포 유사 세포이며, 본 명세서에서는 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(CAML)로 지칭된다.
순환성 종양 세포(CTC)와 함께, 암 환자의 생물학적 샘플에 존재하는 CAML은 예를 들어, 미세여과 방법을 비롯한 크기 배제 방법을 사용하여 분리하고 규명할 수 있다. 마이크로필터는 적혈구와 대부분의 백혈구는 통과시키면서 CTC 및 CAML과 같은 더 큰 세포는 걸러낼 수 있을 만큼 큰 포어(pore)로 형성될 수 있다. 그런 다음 수집된 세포를 필터에서 직접 또는 다른 수단을 통해 특성화할 수 있다.
CAML은 단독으로 사용될 때 많은 임상적 유용성을 갖는다. 또한, 생물학적 샘플에서 CAML의 특성을 분석하는 것은 진단 기술의 민감도와 특이도를 더욱 향상시키기 위해 혈액 내 CTC, 무세포 DNA 및 유리 단백질과 같은 다른 마커의 분석과 결합될 수 있다. 특히 CAML과 CTC는 동일한 수단을 사용하여 동시에 분리 및 식별할 수 있기 때문에 더욱 그렇다.
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포 (CAML)
본 명세서에서 정의된 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 순환성 세포는 "CAML"로 지칭될 수 있다. CAML은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 것에 의해 특징화된다:
- CAML은 크고 비정형적인 배수체 핵 또는 다수의 개별 핵을 가지고 있으며, 세포 내에 흩어져 있는 경우가 많지만, 융합된 핵이 확대되는 경우도 흔하다. CAML 핵의 크기는 일반적으로 직경이 약 10 μm 내지 약 70 μm이고, 더 일반적으로는 직경이 약 14 μm 내지 약 64 μm이다.
- CAML은 CD45 양성 또는 CD45 음성일 수 있으며, 본 발명은 두 가지 유형의 CAML의 사용을 모두 포괄한다.
- CAML은 가장 긴 치수를 기준으로 약 20 미크론 내지 약 300 미크론의 큰 크기이다.
- CAML은 방추형, 올챙이형, 원형, 직사각형, 두 다리형, 세 다리 이상형, 가는 다리형 또는 무정형 등 다양한 형태학적 형상으로 발견된다.
- 암종의 CAML은 일반적으로 확산된 시토케라틴을 갖는다.
- CAML이 EpCAM을 발현하는 경우, EpCAM은 일반적으로 세포 전체에 확산되거나 공포(vacuole) 및/또는 섭취된 물질과 회합되어 있으며 세포 전체에 걸쳐 거의 균일하지만, 일부 종양에서는 EpCAM을 매우 낮게 또는 전혀 발현하지 않기 때문에 모든 CAML이 EpCAM을 발현하는 것은 아니다.
- CAML이 마커를 발현하는 경우, 마커는 일반적으로 세포 전체에 확산되거나 공포 및/또는 섭취된 물질과 회합되며 세포 전체에 거의 균일하지만, 모든 CAML이 동일한 강도로 동일한 마커를 발현하는 것은 아니다.
- CAML은 종종 종양 기원의 마커와 관련된 마커를 발현한다; 예컨대, 종양이 전립선암 기원이고 PSMA를 발현하는 경우, 그러한 환자의 CAML도 PSMA를 발현한다. 다른 예로서, 원발성 종양이 췌장 기원이고 PDX-1을 발현하는 경우, 그러한 환자의 CAML도 PDX-1을 발현한다. 또 다른 예로서, 원발성 종양 또는 암 기원의 CTC가 CXCR-4를 발현하는 경우, 그러한 환자의 CAML도 CXCR-4를 발현한다. 상피암과 관련된 CAML은 CK 8, 18 또는 19, 비멘틴 등을 발현할 수 있다. 육종, 신경모세포종, 흑색종의 경우 CK 8, 18, 19 대신 해당 암과 관련된 다른 마커를 사용할 수 있다.
- 암에서 유래한 원발성 종양 또는 CTC가 약물 표적의 바이오마커를 발현하는 경우, 그러한 환자의 CAML도 약물 표적의 바이오마커를 발현한다. 이러한 면역치료(immunotherapy) 바이오마커의 예로는 PD-L1이 있다.
- CAML은 단핵구 마커(예컨대, CD11c, CD14)와 내피 마커(예컨대, CD146, CD202b, CD31)를 발현한다.
- CAML은 Fc 단편에 결합하는 능력이 있다.
CAML은 특정 마커의 H&E 또는 형광 염색과 같은 비색 염색에 의해 시각화될 수 있다. 세포질의 경우 CD31이 가장 양성 표현형이다. CD31 단독으로, 또는 다른 양성 마커 또는 종양과 관련된 암 마커와 조합하여 사용하는 것이 권장된다.
본 발명의 다양한 구체예 및 양태에서, CAML은 하기의 각 특징을 갖는 세포로 정의될 수 있다: (a) 크기가 약 14 내지 64 μm인 대형 비정형 배수체 핵(polyploidy nucleus), 또는 단일세포 내 다수의 핵; (b) 약 20 내지 300 μm 크기의 세포 크기; 및 (c) 방추형, 올챙이형, 원형, 장방형, 두 다리형(two legs), 세 다리 이상형(more than two legs), 가는 다리형(thin legs) 및 무정형(amorphous)으로 이루어진 군에서 선택되는 형태학적 형상. 다른 구체예에서, CAML은 하기 추가 특성 중 하나 이상을 갖는 것으로 정의될 수 있다: (d) CD14 양성 표현형; (e) CD45 발현; (f) EpCAM 발현; (g) 비멘틴 발현; (h) PD-L1 발현; (i) 단핵구 CD11C 마커 발현; (j) 내피 CD146 마커 발현; (k) 내피 CD202b 마커 발현; 및 (l) 내피 CD31 마커 발현.
순환성 종양 세포
본 명세서에서 정의된 바와 같이, 암종과 관련된 CTC는 다수의 시토케라틴(cytokeratin; CK)을 발현한다. CK 8, 18, 19는 CTC에 의해 가장 일반적으로 발현되고 진단에 사용되는 시토케라틴이지만, 이러한 마커에만 국한하여 조사할 필요는 없다. 고형 종양 CTC의 표면은 일반적으로 상피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule; EpCAM)를 발현한다. 그러나 이 발현은 균일하거나 일관적이지 않는다. CD45는 백혈구 마커이기 때문에 CTC가 발현하지 않는다. CTC 및 CAML과 같은 종양 관련 세포를 식별하기 위한 분석에서는 CK 8, 18, 19와 같은 고형 종양과 관련된 마커에 대한 항체 또는 CD45 또는 DAPI에 대한 항체를 사용하는 것으로 충분하다. 염색 기법과 형태학을 결합하면 병리학적으로 정의 가능한 CTC(pathologically-definable CTC; PDCTC), 세포사멸 CTC(apoptotic CTC) 및 CAML을 식별할 수 있다[3].
암종과 관련된 PDCTC는 CK 8, 18, 19를 발현하며, 하기 특징에 의해 식별 및 정의될 수 있다.
- DAPI로 염색된 "암과 유사한(cancer-like)" 핵. 핵은 일반적으로 점 무늬가 있는 큰 크기이다. 세포가 분열 중인 경우는 예외이다. 핵이 응축되어 있을 수도 있다.
- CK 8, 18 및 19 중 하나 이상의 발현; 상피암의 CTC는 일반적으로 적어도 CK 8, 18 및 19를 발현한다. 시토케라틴은 필라멘트 패턴을 가지고 있다.
- CD45 발현의 부재(lack).
암종과 관련된 세포사멸 CTC는 CK 8, 18, 19를 발현하며, 하기 특징으로 식별 및 정의될 수 있다:
- 퇴화성 핵(degrading nuclei).
- CK 8, 18 및 19 중 하나 이상의 발현; 모든 시토케라틴이 필라멘트 패턴을 갖고 있는 것은 아니지만, 부분 또는 전체가 반점의 형태로 파편화되어 나타난다.
- CD45 발현의 부재(lack).
상술한 바와 같이, 본 명세서에 기술된 CAML 및 CTC의 고유한 특징은 이들을 암과 같은 질병의 선별 및 진단 방법, 치료 모니터링 방법, 질병 진행 및 재발 모니터링 방법, 치료 예측 방법을 포함하는 임상 방법론에 사용하기에 매우 적합하게 한다.
치료 반응을 예측하는 방법
본 발명은 이러한 특성을 이용하고, 제1 실시 양태로서, 동일한 환자의 최소 2개 샘플에서 CAML의 크기와 수를 결정하고 비교하여 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법으로서, 여기서 제1 환자 샘플은 치료 전에 획득되고(즉, 치료 전 샘플) 제2 환자 샘플은 치료 후에 획득된다(즉, 치료 후 샘플). 기준선(BL)은 첫 번째(치료 전) 환자 샘플에서 제공된다. 본 발명의 특정 측면에서, 치료후 샘플 중 적어도 하나의 CAML이 치료 전 샘플 중 가장 큰 CAML보다 크기가 더 크고, 치료 전 샘플에서보다 치료후 샘플에 더 많은 CAML이 있는 경우, 샘플에서 피험자는 치료에 반응하지 않을 것으로 예측된다.
본 실시 양태의 첫 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 이는 차이(차이점)를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 간의 CAML 수 및/또는 크기를 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 CAML 수 및/또는 크기의 차이가 발견되면 치료 반응이 예측된다. 상기 차이점은 CAML 크기 변경(변화), CAML 수 변경(변화) 또는 둘 다일 수 있다. 상기 CAML 크기의 변화는 샘플 내 모든 CAML에 대해 계산된 평균 크기의 변화일 수도 있고, 샘플 중 가장 큰 CAML 크기의 변화일 수도 있다. 크기의 변화는 크기의 증가 또는 크기의 감소일 수 있다.
본 실시 양태의 두 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 이는 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수와 크기를 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 치료 후 샘플 중 가장 큰 CAML이 치료 전 샘플 중 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 감소하거나 크기가 유사하고, 치료 후 샘플 중 CAML의 수가 치료 전 샘플에서의 CAML의 수보다 적은 경우, 개체는 치료로 호전되거나 치료에 반응할 가능성이 있다.
본 실시 양태의 세 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수와 크기를 비교하며, 여기서, 치료 후 샘플 중 가장 큰 CAML이 치료 전 샘플 중 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 감소하거나 크기가 유사하고, 치료 후 샘플 중 CAML의 수가 치료 전 샘플의 CAML 수와 같거나 더 많은 경우, 피험자는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
본 실시 양태의 네 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 치료 전 샘플과 후 샘플 간의 CAML 수와 크기의 차이를 비교하고, 여기서, 치료후 샘플에서 가장 큰 CAML은 치료전 샘플에서 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 증가하거나 크기가 유사하고, 치료후 샘플에서 CAML의 수는 치료 전 샘플의 CAML 수와 같거나 적은 경우, 피험자는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
본 실시 양태의 다섯 번째 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 치료 전 샘플과 후 샘플 간의 CAML 수와 크기의 차이를 비교하고, 여기서, 치료 후 샘플 중 가장 큰 CAML이 치료 전 샘플 중 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 증가하거나 크기가 유사하고, 치료 후 샘플 중 CAML의 수가 치료 전 샘플에서의 CAML의 수보다 많은 경우, 피험자는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
제2 실시 양태에서, 본 발명은 암을 갖는 개체로부터의 샘플에서 CTC를 검정함으로써 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법에 관한 것이며, 여기서 암 치료 후 샘플 중 하나 이상의 CTC의 존재는 (즉, 치료 후 샘플)은 개체가 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있음을 시사한다. CTC는 전이성 유방암, 전립선암, 대장암, 소세포폐암(SCLC)을 제외하고 암 환자의 혈액에서 거의 발견되지 않지만, 일부 샘플에서 CTC의 존재를 확인하면 치료 반응을 예측할 수 있다.
본 실시 양태의 하나의 구체적인 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계, 및 CTC에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법이며, 여기서 하나 이상의 CTC가 샘플에서 검출되는 경우, 피험자는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
제3 실시 양태에서, 본 발명은 제1 실시 양태와 제2 실시 양태의 특징을 결합하는 방법에 관한 것이다.
이 제3 실시 양태의 방법은, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 데에도 사용될 수 있다. 상기 방법은 (i) 적어도 2개의 환자 샘플에서 CAML의 크기 및 수를 비교하는 것을 포함하며, 여기서 첫 번째 환자 샘플은 치료 전(즉, 치료 전 샘플)에서 획득되고 두 번째 환자 샘플은 치료 후(즉, 치료 후 샘플)에서 획득되며, 및 (ii) 치료 후 얻은 두 번째 환자 샘플(즉, 치료 후 샘플)에서 CTC의 수를 결정하는 것을 포함한다.
본 실시 양태의 하나의 특정한 측면은, 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료후 샘플을 얻는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체의 치료 반응을 예측하는 방법으로서, (i) 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 간의 CAML 수와 크기의 차이를 비교하는 것, 및 (ii) 치료 후 샘플에서 CTC의 수를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 CAML 수 및/또는 크기의 차이가 발견되고/되거나 적어도 하나의 CTC가 검출되는 경우, 치료 반응이 예측된다. 예를 들어, 치료 후 샘플에서 하나 이상의 CTC가 검출되면 개체는 치료로 인해 혜택을 받지 못하거나(호전되지 못하거나) 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다.
위의 실시 양태와 같이, 상기 차이는 CAML 크기의 변화, CAML 수의 변화, 또는 둘 다일 수 있다. 상기 CAML 크기의 변화는 샘플 내 모든 CAML에 대해 계산된 평균 크기의 변화일 수도 있고, 상기 CAML 크기 변화는 샘플 중 가장 큰 CAML 크기의 변화일 수도 있다. 크기의 변화는 크기의 증가 또는 크기의 감소일 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면에서, PD-L1 발현 수준은 또한 치료 전 및 치료 후 샘플에서 수집된 CAML 및/또는 CTC에서 결정될 수 있다. 본원에 제공되고 아래에 논의되는 실험적 증거는 CAML에서의 PD-L1 발현이 또한 암을 갖는 개체, 특히 면역요법으로 치료받는 개체에서 치료 반응을 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있음을 입증한다. 일반적으로 CAML에서 PD-L1 발현 수준이 높을수록 피험자가 치료로 호전되거나 치료에 반응할 확률이 높아진다. 따라서, 본원에 정의된 각각의 실시양태에서 기술된 방법은 또한 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 간의 차이에 대해 CAML의 PD-L1 발현 수준을 비교하는 단계를 포함함으로써 실행될 수 있다. 한 측면에서, 치료 후 샘플 중 CAML의 PD-L1 발현 수준이 치료 전 샘플의 발현 수준보다 낮은 경우, 개체는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다. 또 다른 측면에서, 치료 후 샘플 중 CAML의 PD-L1 발현 수준이 치료 전 샘플의 발현 수준보다 높은 경우, 개체는 치료로 인해 호전되거나 치료에 반응할 가능성이 있다.
본 발명의 추가적인 측면에서, CXCR4 발현 수준은 또한 치료 전 및 치료 후 샘플에서 수집된 CAML 및/또는 CTC에서 결정될 수 있다. 본원에 제공되고 아래에 논의되는 실험적 증거는 CAML CXCR4 발현이 또한 암을 갖는 개체에서 치료 반응을 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있음을 입증한다. 일반적으로 CAML에서 CXCR4 발현 수준이 낮을수록 피험자가 치료로 호전되거나 치료에 반응할 확률이 높아진다. 따라서, 본원에 정의된 각각의 실시양태에서 기술된 방법은 또한 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 간의 차이에 대해 CAML의 CXCR4 발현 수준을 비교하는 단계를 포함함으로써 실행될 수 있다. 한 측면에서, 치료 후 샘플 중 CAML의 CXCR4 발현 수준이 치료 전 샘플의 발현 수준보다 높은 경우, 개체는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있다. 또 다른 측면에서, 치료 후 샘플 중 CAML의 CXCR4 발현 수준이 치료 전 샘플의 발현 수준보다 낮은 경우, 개체는 치료로 인해 호전되거나 치료에 반응할 가능성이 있다.
본 발명의 각각의 실시예 및 측면에서, CAML은 다음의 특성을 각각 갖는 것으로 정의될 수 있다:
(a) 크기가 약 14~64μm 이상인 큰 비정형 배수체 핵(large atypical polyploid nucleus), 또는 이보다 크거나, 또는 단일 세포에 있는 다중 핵;
(b) 세포 크기는 약 20-300μm이나, 더 큰 것도 가능함; 및
(c) 방추형, 올챙이형, 원형, 직사각형, 두 다리형, 얇은 다리형 및 무정형으로 구성된 그룹에서 선택된 형태학적 형태.
본 발명의 실시예의 특정 측면에서, CAML은 다음과 같은 추가 특성 중 하나 이상을 갖는 것으로 추가로 정의될 수 있다:
(d) CD14 양성 표현형;
(e) CD45 발현;
(f) EpCAM 발현;
(g) 비멘틴(vimentin) 발현;
(h) PD-L1 발현;
(i) 단핵구 CD11C 마커 발현;
(j) 내피 CD146 마커 발현;
(k) 내피 CD202b 마커 발현; 및
(l) 내피 CD31 마커 발현.
본 명세서에서 사용된 용어 "가능성(확률)"은 50% 이상의 확률을 의미한다. 따라서, "확률"은 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 확률을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 반응(treatment response)"은 치료를 받는 개체에 의한 반응을 의미한다. 상기 치료 반응은 치료가 개체가 치료되는 암에 긍정적인 영향을 미치는 경우(예: 종양 크기 감소 또는 성장 둔화) 긍정적인 반응(양성 반응); 치료가 피험자가 치료되는 암에 부정적인 영향을 미치는 경우(예: 종양 크기 증가 또는 성장 가속화) 부정적인 반응(음성 반응); 또는 치료가 피험자가 치료되는 암에 명백한 영향을 미치지 않는 중립 반응일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 치료 반응은 무진행 생존(PFS)이나 전체 생존(OS), 또는 둘 다의 변화일 수 있다. 상기 치료 반응은 무진행 생존(PFS)이나 전체 생존(OS), 또는 둘 다의 증가일 수 있다. 상기 치료 반응은 무진행 생존(PFS)이나 전체 생존(OS), 또는 둘 다의 감소일 수 있다.
본 발명의 각 방법에서, 전체 생존율(OS) 또는 무진행생존율(PFS), 또는 둘 다는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개월 이상의 기간에 걸쳐 이루어지는 것이다. 본 발명의 일 양태에서, 전체 생존율(OS) 또는 무진행생존율(PFS), 또는 둘 다는 적어도 약 24개월의 기간에 걸쳐 이루어지는 것이다.
본원에 사용된 용어 "무진행 생존(PFS)"은 미국 국립암연구소(National Cancer Institute)에서 정의한 바와 같으며, 즉, 암과 같은 질병을 치료하는 동안과 치료한 후에 환자가 질병을 안고 살아가지만 질병이 악화되지 않는 기간이다. PFS는 또한 선택된 날짜, 예를 들어 치료가 시작된 날짜, 암 진행을 평가하기 위해 치료 전 혈액을 채취한 날짜, 암이 악화되거나 진행되지 않은 날짜 등으로부터 암을 갖는 피험자가 생존한 기간으로 정의될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전체 생존(OS)"은 미국 국립암연구소(National Cancer Institute)에서 정의한 바와 같으며, 즉, 암과 같은 질병의 진단일 또는 치료 시작일로부터 환자가 생존할 수 있는 기간이며, 질병 진단을 받은 사람이 아직 살아있다는 것이다. OS는 치료가 시작된 날짜 또는 치료 전 채혈 날짜부터의 시간 길이이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료로 이익을 얻는(치료로 인해 호전되는, benefiting from the treatment)"이라는 문구는 치료를 받는 개체가 치료되는 상태 또는 치료되는 상태의 증상의 개선을 경험할 것임을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료에 반응하는(responding to the treatment)"이라는 문구는 치료를 받는 개체가 치료 중인 상태의 개선 또는 치료 중인 상태의 증상을 나타낼 것임을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료 전 샘플"는 특정 치료가 개체에게 투여되기 전에 개체로부터 얻은 생물학적 샘플을 의미한다. 특정 치료는 피험자에게 투여되는 최초 또는 유일한 치료가 아닐 수도 있다. 그러나 피험자의 치료 반응에 관한 정보가 원하는 치료가 될 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 "치료 후 샘플"은 특정 치료가 개체에게 투여된 후 개체로부터 얻은 생물학적 샘플을 의미한다. 개체에게 하나 이상의 치료가 투여되는 경우, 하나 이상의 "치료 후 샘플"이 있을 수 있다.
본 명세서에 사용된 "개체(대상체, 대상, 피험자, subject)"은 인간, 인간이 아닌 영장류, 말, 소, 염소, 양, 개, 고양이 또는 설치류와 같은 반려 동물, 또는 기타 포유동물이다.
본 문서에 사용된 환자 샘플, 치료 전 샘플, 치료 후 샘플과 같은 "샘플(시료)"는 생물학적 시료이며 샘플은 다음과 같을 수 있지만 이에 국한되지는 않는다: 말초 혈액, 혈액, 림프절, 골수, 뇌척수액, 조직, 소변, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 냉동보존 PBMC 중 하나 이상. 생물학적 샘플이 혈액인 경우, 혈액은 예를 들어 전주정맥혈, 하대정맥혈, 대퇴정맥혈, 문맥혈, 경정맥혈일 수 있다. 샘플은 신선한 샘플일 수도 있고 적절하게 준비된 냉동 보존된 해동 샘플일 수도 있다.
본 발명의 각 방법에서, 상기 세포(CAML 및 CTC)가 분석되는 생물학적 샘플의 양이 다양할 수 있음이 명백할 것이다. 그러나, 방법이 세포의 크기 결정에 기초할 때 적절한 수의 세포를 얻으려면, 생물학적 샘플은 적어도 약 2.5 mL가 되어야 한다. 또한, 생물학적 샘플의 양은 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 12.5, 13, 14, 15, 16, 17, 17.5, 18, 19, 20, 21, 22, 22.5, 23, 24, 25, 26, 27, 27.5, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50mL 이상일 수 있다. 생물학적 샘플의 양은 또한 약 2.5 내지 50mL, 약 2.5 내지 20mL, 약 5 내지 15mL, 또는 약 5 내지 10mL일 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 샘플은 약 7.5mL이다. 본 발명의 특정 측면에서, 샘플은 혈액 샘플이고 혈액 샘플의 크기는 7.5mL이다.
샘플 내 순환 세포(CAML 및 CTC) 수를 기반으로 암을 갖는 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법에 관해, 암을 갖는 개체로부터 채취한 선택된 부피의 샘플 중 순환 세포의 비율이 결정된다. 샘플의 양은 다양하게 사용될 수 있으나, 샘플 크기에 대한 샘플 내 세포 수의 비율을 결정하여 피험자 간에 비교하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 15mL 샘플에 8셀 비율은 7.5mL 샘플에 4셀, 3.75mL 샘플에 2셀과 같다.
본 명세서에 사용된 "암"은 고형 종양, 1기 암(stage I cancer), 2기 암(stage II cancer), 3기 암(stage III cancer), 4기 암(stage IV cancer), 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 흑색종(melanoma), 상피세포암, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 대장암, 간암, 두경부암, 신장암, 난소암, 식도암, 자궁암, 요로상피암, 방광암, 자궁내막암, 담관암종, 신경내분비암 또는 기타 고형 종양암이다. 당업자는 본 발명의 방법이 암의 특정 형태 또는 유형에 제한되지 않으며 매우 다양한 암과 관련하여 실행될 수 있음을 이해할 것이다.
암을 갖는 개체는 치료를 받고 있을 수 있다. 암을 갖는 개체와 관련하여 본원에서 "치료" 또는 "치료하는"에 대한 언급은 암의 성장 또는 확산의 감소, 암의 성장 또는 확산의 차단, 또는 암의 치료에 사용될 수 있는 임의의 치료 분자, 물질, 화학물질, 항체, 세포, 장치, 작용제, 상태(condition) 또는 절차에 대한 것이다. 적합한 치료에는 화학요법, 단일 약물, 약물 병용, 면역요법, 표적 요법, 방사선 요법, 화학방사선요법, 단일 또는 다중 약물과 병용된 방사선, 단일 또는 다중 약물과 병용된 화학방사선요법, 단일 또는 다중 면역치료제, 암백신, 세포치료제와 병용된 화학방사선요법 중 하나 이상이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 적합한 치료 분자에는 아테졸리주맙, 두르발루맙 및 펨브롤리주맙이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 구체적으로, 비제한적인 예에서, 치료법은 유방암에 대한 암 백신이다.
전처리(치료 전)시와 후처리(치료 후)시 CAML의 수나 크기의 변화에 대하여, 상기 차이점(비교)은 CAML 크기 변경, CAML 수 변경 또는 둘 다일 수 있다. CAML 크기의 변화는 샘플의 모든 CAML에 대해 계산된 평균 크기의 변화일 수도 있고, CAML 크기의 변화는 두 개 이상의 샘플에서 가장 큰 CAML의 크기 변화일 수도 있다. 크기의 변화는 증가하거나 감소할 수 있다. CAML의 모양은 매우 다양할 수 있으므로 CAML의 크기는 셀에서 가장 멀리 떨어져 있는 두 지점 사이의 거리를 측정하여 계산된다는 점을 이해해야 한다. CAML이 둥글거나 대략 둥근 경우, 셀의 크기는 셀의 직경이 될 수 있다.
본 발명의 각 구현예 및 측면에서, 세포는 다음을 사용하여 샘플로부터 분리될 수 있다: 크기 배제 방법(size exclusion methodology), 면역포획(immunocapture), 덴드리머 매개 다가 세포 포획, 친화도 기반 표면 포획, 생체모방 표면 코팅 포획, 셀렉틴 코팅 표면 포획(selectin coated surfaces capture), 기타 기능화된 표면 포획, 관성 포커싱 칩, 적혈구 용해, 백혈구 고갈, FICOLL 분리, 전기 영동, 유전 영동, 유세포 분석, 자기 부상 및 다양한 미세 유체 칩 또는 이들의 조합.
본 발명의 한 측면에서, CAML 및 CTC는 마이크로필터를 사용하는 것을 포함하는 크기 배제 방법을 사용하여 샘플로부터 분리될 수 있다. 기공(pore)은 모든 적혈구와 대부분의 백혈구를 제거할 수 있을 만큼 충분히 커야 한다. 기공은 CAML과 CTC를 일관되게 포착할 수 있을 만큼 작아야 한다. 마이크로필터는 CTC와 CAML을 모두 포집하기 위해 약 5 마이크론 내지 약 10 마이크론 범위의 기공 크기를 가질 수 있고, 주로 CAML을 포집하기 위해 마이크로필터는 약 20 마이크론 범위의 기공 크기를 가질 수 있다. 어떤 경우에는 더 큰 크기의 CAML만 포착하기 위해 기공 크기를 약 50μm, 60μm, 70μm, 80μm, 90μm, 또는 100μm 이상으로 늘릴 수 있다. 마이크로필터의 기공은 원형, 레이스 트랙 모양, 타원형, 정사각형 및/또는 직사각형 모양을 가질 수 있다. 마이크로필터는 정밀한 기공 구조 및/또는 균일한 기공 분포를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 세포는 물리적 크기 기반 분류, 유체역학적 크기 기반 분류, 그룹화(grouping), 트래핑(trapping), 면역포획, 대형 세포 농축, 또는 크기에 기반한 소형 세포 제거를 통해, 미세유체 칩을 사용하여 샘플로부터 분리되는 것이다. 상기 세포의 포획 효율은 수집 방법에 따라 달라질 수 있다. 플랫폼에 따라 포획할 수 있는 세포((CAML 및 CTC))의 크기도 다를 수 있다. 예후와 생존을 결정하기 위해 순환성 세포 크기를 이용하는 원리는 동일하지만 통계는 달라질 수 있다. CellSieveTM 마이크로필터를 사용하여 순환성 세포를 수집하면 100% 포획 효율과 고품질의 세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 CAML 및 CTC 세포는 물리적 크기 기반 분류, 유체역학적 크기 기반 분류, 그룹화(grouping), 트래핑(trapping), 면역포획, 대형 세포 농축, 또는 크기에 기반한 소형 세포 제거를 통해, 미세유체 칩을 사용하여 샘플로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 혈액은 혈액 수집 튜브를 이용하여 수집된다. CellSave 혈액 수집 튜브 (Menarini Silicon Biosystems Inc., San Diego, CA)는 안정된 세포 형태 및 크기를 제공한다. 다른 사용 가능한 혈액 수집 튜브는 세포 안정성을 제공하지 않는다. 대부분의 다른 혈액 수집 튜브에서는 세포가 비대해질 수 있으며, 심지어 터질 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, CAML 및 CTC는 CellSieveTM 저압 미세여과 분석을 이용하여 생물학적 샘플로부터 분리되는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 CAML 세포 그 자체로서 세포를 구체적으로 식별하지 않고, 대신에 세포질 및 핵의 크기에 기반하여 세포를 단순히 식별함으로써 샘플 중 대형 세포를 식별하는 것이다. 예를 들어, 이러한 양태에서 사용될 수 있는 기법들에는 H&E 염색과 같은 비색 염색을 사용하거나, 또는 단순히 CK(+) 세포를 관찰하는 것 등이 포함된다.
샘플 수집 및 처리의 예시
본원에 제공되고 아래에 설명된 각 예에서 말초 혈액은 CellSave Tubes(Menarini Silicon Biosystems Inc.)에 수집되어 96시간 이내에 처리되었다. CellSieveTM 미세여과 기술을 사용하여 혈액 샘플에서 모든 암 관련 세포(CTC, EMT, 순환 내피 세포(CEC) 및 CAML)를 수집했다. CellSieveTM 마이크로 필터는 9mm 영역 내에 7μm 기공 직경을 갖는 균일한 배열로 160,000개 이상의 기공을 가지고 있다.
시약에는 전고정 버퍼(prefixation buffer), 사후 고정 버퍼, 투과성 버퍼 및 항체 칵테일이 포함된다. 여과를 수행하는 기술은 5mL/분으로 흡입되는 주사기 펌프 세트 또는 진공 펌프를 사용했다[8]. 여과 과정은 필터를 통해 빼내기 전에 7.5mL의 전고정 완충액에 7.5mL의 혈액을 전고정하는 것으로 시작되었다. 그 다음 필터와 포획된 세포를 세척, 후고정, 세척, 투과화 및 세척을 거쳤다. 그 다음, 필터에 포획된 세포를 FITC-항-사이토케라틴 8, 18, 19; 피코에리트린(PE) 접합 EpCAM; 및 Cy5-항-CD45(5)로 구성된 항체 칵테일로 염색한 다음, 이어서 세척하였다. 필터를 현미경 슬라이드 위에 놓고 Fluoromount-G/DAPI(Southern Biotech)로 덮었다. Carl Zeiss AxioCam이 장착된 Olympus BX54WI 형광 현미경은 특정 형광 큐브와 흑백 카메라를 사용하여 세포를 이미지화하는 데 사용되었다. 노출은 셀 간의 동일한 신호 비교를 위해 3초(Cy5), 2초(PE), 100-750msec(FITC) 및 10-50msec(DAPI)로 사전 설정되었다. 이미지 처리에는 Zen2011 Blue(Carl Zeiss)가 사용되었다.
실험예
도 1은 처리 후 샘플과 처리 전 샘플 사이의 CAML 크기 및 수의 변화 분석을 설명한다.
실험예 1
다음 예는 전이성 삼중 음성 유방암(mTNBC)의 인간화 단일클론 항체 레론리맙(Leronlimab)에 의한 치료 후 치료 반응의 예측을 예시한 다. 레론리맙은 종양의 CCR5 마커를 표적으로 삼는다. CAML 크기와 수의 변화를 기반으로 한 약물 반응의 중간 분석을 통해 치료 반응을 예측할 수 있는 것으로 나타났다. 특히, 22명의 환자로 구성된 코호트는 기준선 혈액 샘플(치료 전)과 치료 후 혈액 샘플을 제공했다. 22명의 환자 중 20명의 환자에서는 CAML의 크기 변화가 나타났으며, 2명의 환자에서는 CAML 크기의 변화는 없었으나 CAML 수의 변화가 있었다. 도 2의 "CAML 감소" 및 "CAML 증가/혼합"은 도 1에 표시된 대로 정의된다. "CAML 감소" 환자는 "CAML 증가/혼합" 환자에 비해 PFS 및 OS가 증가했다(도 2A 및 2B 참조).
실험예 2
추가 실험에서, CAML과 CTC 모두의 데이터를 결합하는 알고리즘을 적용하여 치료법 유형에 관계없이 치료법에 대한 환자의 반응을 결정할 수 있다.
다음은 위에서 설명한 방법으로 분석된 6가지 다른 치료법으로 치료받은 83명의 전이성 유방암 환자로부터 얻은 데이터이다. 치료에는 다음이 포함된다.
- 기본 요법으로 Leronlimab을 사용하여 담당 종양 전문의의 권한에 따라 일부 환자에게 Carbo를 투여하고 다른 환자에게는 Leronlimab을 투여했다.
- 담당 종양 전문의의 권한에 따라 일부는 펨브로(Pembro)를 처방 받은 것에 기초한, BriaVax.
- 비니메티닙을 함유한 펨브로
- Her2 치료
- 에리불린
- 트라스투주맙과 라파티닙을 이용한 화학요법
도 3은 알려진 PET/CT 스캔(RECIST 1.1)을 사용하여 종양 크기 변화에 대한 스파이더 플롯을 보여주며, 각 그룹은 색상별로 정리되어 있다. 이와 같이, 종양 크기의 감소와 CAML 크기 및 수의 감소 사이에는 상관관계가 있다.
도 4는 "CAML의 감소" 및 "CAML의 증가/혼합"에 대해 표시된 데이터와 함께 요법의 유도 전후 CAML의 변화에 기초한 83명의 전이성 유방암 환자의 PFS에 대한 Kaplan-Meier 플롯이다. " 도 1에서와 같이, PFS와 CAML 크기 및 수 감소 사이에는 상관 관계가 있다.
도 5A는 PFS의 Kaplan-Meier 플롯이고, 도 5B는 CTC 및 CAML 변화 전후를 평가하기 위해 수행된, 전향적 2년 단일 맹검 다기관 연구(single blind multi-institutional study) 결과로서, 전이성 유방암(mBC) 환자(n=101)에서 새로운 라인 요법(line therapy)을 유도한 OS에 대한 Kaplan-Meier 플롯이다. 새로운 치료법을 시작하기 전에 기준선(BL) 혈액 샘플을 채취했고, 전신 치료 시작 후(~30일) 두 번째 샘플(T1)을 채취했다. LifeTracDxβ 액체 생검 테스트는 CellSieveTM 마이크로필터를 사용하여 CTC 및 CAML을 수집하기 위해 수행되었다. CTC 및 CAML의 수량과 하위 유형이 분석되었다. RECIST v1.1은 검열된 단변량 및 다변량 분석을 통해 2년 동안 위험 비율(HR)을 결정하기 위한 무진행 생존(PFS)을 정의하는 데 사용되었다.
mBC 환자가 치료 유도 후 샘플(혈액 7.5mL)에 단 하나의 CTC를 갖고 있는 경우, 이들의 PFS 및 OS는 CTC가 없는 환자보다 상당히 짧았다(도 5A 및 5B). CAML 크기와 수가 감소한 환자는 혼합된 결과를 보인 환자 또는 CAML 크기와 수가 증가한 환자보다 더 나은 PFS 및 OS를 나타냈다(도 5A 및 5B). 특히, CTC는 기준선(BL)에서 환자의 35%(n=35/101)와 치료 후 샘플 수집 시점(T1)에서 26%(n=26/101)에서 확인되었다. T1의 단일 CTC는 더 나쁜 PFS HR=6.5, p<0.0001 및 OS HR=5.2, p=0.00188에 대해 높은 예후를 보였다. CAML은 BL 환자의 93%(n=94/11), T1 환자의 86%(n=87/101)에서 발견되었다. CAML 감소(즉, 크기/수)는 CTC가 없을 때 개선된 PFS(HR=2.8, p=0.00029 및 OS HR=2.6, p=0.01895)에 대한 유의미한 예후였다. T1에서 CTC가 1 이상인 환자(n=26)의 평균 PFS는 2.4개월, mOS는 4.7개월이었다. CTC가 없고 CAML이 증가/혼합된 환자(n=36)는 mPFS=5.9 및 mOS=14.1개월이었다. CTC가 없고 CAML이 감소한 환자(n=39)는 mPFS=15.0, mOS=18.8개월이었다.
또한, 도 1에 사용된 알고리즘이 매우 다양한 고형 종양에 적용될 수 있다는 것을 발견했다. 도 6A는 PFS의 Kaplan-Meier 플롯이고, 도 6B는 치료법 유도 전후 CAML의 변화와 추적관찰 시 CTC의 존재에 기초한 220명의 전이성 암 환자의 OS에 대한 Kaplan-Meier 플롯이다. 환자에는 유방암, 폐전립선암, 신장세포암, 췌장암, 육종 및 간암 등의 암이 있는 환자가 포함되었다. 치료 유도 후 샘플(혈액 7.5mL)에 단일 CTC가 있는 경우 PFS와 OS는 CTC가 없는 환자보다 유의하게 짧았다. CAML 크기와 수가 감소한 환자는 혼합된 결과를 보인 환자 또는 CAML 크기와 수가 증가한 환자보다 더 나은 PFS와 OS를 나타낸다.
도 6에 사용된 동일한 그룹의 환자 데이터는 CAML 크기 ≥50μm 또는 <50μm 및 추적 관찰 시 CTC의 존재를 기반으로 재분석되었다. 도 7A는 PFS의 Kaplan-Meier 플롯이고 도 7B는 도 6과 동일한 220명의 전이성 암 환자의 OS에 대한 Kaplan-Meier 플롯이다. 치료 유도 후 CAML이 50μm 이상이거나 CTC가 하나 이상인 환자 샘플의 PFS 및 OS가 좋지 않은 것으로 확인되었다.
실험예 3
종양의 CCR5 마커를 표적으로 하는 약물을 사용한 TNBC(삼중 음성 유방암) 임상 시험이 수행되었다. CellSieveTM 분석을 수행하여 이들 세포의 CCR5 마커 염색을 포함하여 CTC 및 CAML에 대한 정보를 제공했다. CCR5 약물은 종양을 죽이지 않는다. 임상 시험이 끝날 때 데이터의 초기 분석에서는 다양한 정보 세트의 조합이 약물 반응의 유용한 계층화(stratification)를 제공할 수 있음을 보여주었다.
기준선과 비교하여 CCR5 약물의 첫 번째 치료 주기 후 약 30일 후에 CAML 크기 감소 및 CAML 수 감소는 PFS에 대한 도 8A 및 OS에 대한 도 8B에 도시된 바와 같이 25명의 환자 중 약물에 대한 반응자와 비반응자의 정보 계층화를 제공했다.
4명의 환자는 CCR5 약물의 첫 번째 치료 후 30일 추적 관찰 혈액 샘플을 받지 못했다. CAML이 50 μm 미만인 환자는 더 큰 CAML을 가진 환자보다 더 잘할 확률이 높기 때문에 이 4명의 환자의 기준선에서 CAML 크기는 다음과 같은 방식으로 포함되었다. 30일 추적 조사가 없고 CAML <50 μm인 환자는 CCR5 약물의 첫 번째 치료 주기 후 30일 동안 18명의 환자의 CAML 크기 감소 또는 CAML 수 감소로 분류되었다. 수정된 PFS 및 OS는 각각 도 9A 및 9B에 표시되어 있다.
이들 두 실험예는 CellSieveTM 혈액 검사가 단일 마커만을 분석하는 것보다 암 및/또는 약물 반응에 대한 더 유용한 정보를 제공할 수 있음을 보여준다.
실험예 4
CAML은 비소세포폐암종(NSCLC) 환자의 순환계에서 만연하며, 염증성 전종양형성 미세환경을 나타내는 거대 식세포 대식세포로 나타난다. 이전에는 치료 후 CAML이 50μm 이상인 환자의 경우 임상 결과가 좋지 않을 것으로 예상되는 것으로 나타났다. 그러나 시간이 지남에 따라 또는 치료, 즉 화학방사선요법(CRT) 및 면역요법(IMT)에 대한 반응으로 CAML의 동적 변화를 분석하는 것은 평가되지 않았다. CRT 단독(n=91) 또는 동시 IMT(n=91)로 치료받은 절제 불가능한 NSCLC II/III기 환자 n=182명에 대한 모니터링을 수행하여 CRT 유도 전후 CAML의 변화가 무진행 생존(PFS) 또는 전체 생존(OS)과 관련되는지 평가했다.
특히, 환자는 3가지 다른 요법에서 전향적으로(prospectively) 확보되어 CRT 단독 치료(n=91), CRT 및 아테졸리주맙 동시 치료(n=40, 임상 시험 NCT02525757) 또는 Durvalumab과 동시 치료(n=51)를 받았다. 병리학적으로 확인된 절제 불가능한 2기/3기 NSCLC 환자 182명이 모집되었다. 치료 시작 전 기준선(BL) 및 CRT 유도 후 ~5주(T1)에 총 15mL의 혈액 샘플을 채취했다. CellSieveTM 필터를 사용하여 혈액 여과를 수행한 후 CAML을 식별하고 측정하여 2년차에 검열된 단변량 및 다변량 분석을 통해 PFS 및 OS 위험 비율(HR)을 평가했다. 분석을 위해, 환자들은 역치보다 큰 CAML 크기 증가를 기반으로 하여 CAML 변화의 감소 및 차이가 없는 것을 포함하여 역치 미만의 변화가 있는 환자와 비교되었다.
결과는 BL과 T1 시점 사이에 10-50μm의 CAML 크기 증가가 점점 더 짧아지는 PFS 및 OS와 상관관계가 있음을 입증했다(데이터는 표시되지 않음). BL과 T1 사이의 CAML 크기 35마이크론 증가는 PFS 및 OS 측면에서 환자를 계층화하는 데 최적이었다(도 10A 및 10B). CAML 크기 35마이크론의 증가는 CRT로 치료된 PFS 및 OS에 의해 상당히 계층화되었지만 IMT로 치료된 환자에서는 유의미하지 않았다(도 10C 및 10D).
실험예 5
CAML 크기 및 수에 더하여, 일부 종양 특성은 또한 암의 공격성을 나타낼 수도 있다. 예를 들어 마커 CXCR4가 있다. 30명의 췌장암 환자의 말초혈액을 분석하여 CXCR4 발현을 분석했다. CTC, CAML 및 EMT에 대한 PFS 및 OS의 Kaplan-Meier 플롯을 CXCR4 발현에 대해 분석했다. CTC의 CXCR4는 진행(HR=1.6, 95%CI 0.4-5.4, p=0.645)(도 11A)이나 OS(HR=1.7, 95%CI 0.5-5.6, p= 0.497)의 중요한 예측 인자인 것으로 밝혀지지 않았다(도 11B). 그러나 CAML에서 더 높은 CXCR4 발현은 상당히 더 빠른 진행(HR= 4.0, 95%CI 1.5-10.5, p=0.012)(도 11C) 및 상당히 더 높은 사망률(HR= 4.8, 95%CI 1.7-13.1, p 0.006)(도 11D)과 관련된다.
또한, EMT에 대한 CXCR4의 발현은 진행 및 생존과도 관련이 있는 것으로 보이며, CXCR4 발현 EMT가 높은 환자는 상당히 더 빠른 진행(HR=4.6, 95%CI 1.3-15.4, p=0.033)(도 11E), 더 높은 사망률(HR=5.4, 95%CI 1.5-19.2, p=0.021)(도 11F)을 나타낸다.
따라서, CXCR4 발현은 빠르게 진행되거나 더 빨리 사망할 CAML < 50 μm 그룹 또는 CAML 감소 그룹의 환자를 추가로 계층화하는 데 사용될 수 있다.
실험예 6
비소세포폐암(NSCLC)에서 PFS/OS를 얻기 위해 PD-L1 발현과 CAML 크기의 관계를 테스트하기 위해 단일 맹검, 다년간의 전향적 연구(A single blind, multi-year prospective study)가 수행되었다. 96명의 환자가 화학방사선요법(CRT)에 이어 면역요법에 참여했다. 여기에는 atezolizumab(전망 단일군 NCT02525757) n=39, durvalumab n=52 및 pembrolizumab n=5가 포함되었다. 기준선(BL), CRT 완료(T1) 및 면역요법 후 CRT 후 ~1개월(T2)에 혈액 샘플(7.5mL)을 채취했다. CellSieveTM 여과를 통해 혈액을 여과했다. CAML의 크기와 PD-L1 발현을 분석했다. CRT 후 면역요법의 1~2회 치료 주기 후에 PFS 및 OS 데이터를 분석한 결과, T2 시점의 환자 수가 80명으로 감소했다.
7.5mL의 혈액 중 단 하나의 큰 CAML ≥50μm를 가진 환자는 PFS 및 OS가 더 짧았다(데이터는 표시되지 않음). 이 연구는 면역요법에 관한 것이기 때문에 PD-L1 발현은 도 12에 표시된 것처럼 PFS와 OS의 더 나은 계층화를 제공했다. PD-L1 발현이 중간 이상인 환자는 면역요법으로 인해 상당한 이점을 얻었다.
CAML 크기와 PD-L1 발현 모두 동일한 CellSieveTM 분석에서 얻어졌으므로 데이터는 다음과 같은 4가지 범주로 함께 분석될 수도 있다: (1) 낮은 PD-L1 및 작은 CAML, (2) 낮은 PD-L1 및 대형(큰) CAML, (3) 높은 PD-L1 및 소형(작은) CAML, (4) 높은 PD-L1 및 대형 CAML. "대형 CAML"이라는 용어는 샘플에서 하나 이상의 CAML이 ≥50μm임을 의미한다. "소형 CAML"이라는 용어는 샘플의 모든 CAML이 50μm 미만임을 의미한다. PD-L1이 낮고 CAML이 큰 환자는 도 13에 표시된 것처럼 PFS 및 OS가 상당히 나빴다. PFS의 경우 그룹 2와 그룹 1, 3 및 그룹 4를 함께 비교하면 HR=9.0(95%Cl 3.5-22.9) 및 p<0.00001이다. OS의 경우 그룹 2와 그룹 1, 3 및 4를 함께 비교하면 HR=14.7(95%Cl 4.8-44.81) 및 p<0.00001이다.
이 분석은 1-2회 면역요법 치료 직후 면역요법에 대한 비반응자를 결정하는 데 매우 유용했다.
실험예 7
CAML은 종양 미세환경의 실시간 염증성 PD-L1 상태와 유사한 것으로 보인다. 이전에는 국소 비소세포폐암종(NSCLC)에서 CAML의 PD-L1 발현이 역동적이며 순차적 샘플링 및 화학요법 유도 후 PD-L1/PD-1 면역요법(IMT)에 대한 반응을 예측할 수 있다는 것이 입증되었다(~30일). 이는 무진행 생존 기간(PFS) 및 전체 생존 기간(OS)을 기준으로 한다. 그러나 이는 재발성(recurrent) NSCLC에서는 테스트되지 않았다. 따라서 IMT 치료 여부에 관계없이 재발성 NSCLC 환자에서 CAML의 PD-L1 예측 값을 평가하기 위해 화학요법 유도 전후(~30일) CAML에서 PD-L1 발현을 모니터링했다.
재발성 mNSCLC에서 화학요법 유도 전 및 후, CAML의 PD-L1 발현과 PFS 및 OS의 관계를 추가 항-PD-L1/PD-1 IMT 유(n=41) 또는 무(n=41)로 테스트하기 위해 단일 맹검 다년간 전향적 연구가 수행되었다. 여기에는 atezolizumab(n=4), nivolumab(n=8) 및 pembrolizumab(n=29)의 세 가지 IMT가 포함되었다. 새로 재발된 질병에 대한 치료 이전에 병리학적으로 확인된 재발성 NSCLC 환자 82명이 모집되었다. 혈액 샘플(15mL)은 기준선(BL), 화학요법 전, 화학요법 후 ~30일(T1)에 채취되었다. CellSieveTM 여과를 통해 혈액을 여과하고 CAML 발현을 이진법 높은 점수 또는 낮은 점수로 나누어 24개월에 검열된 단변량 및 다변량 분석을 통해 PFS 및 OS 위험 비율(HR)을 평가했다.
결과(도 14 및 15)는 CAML이 모든 이용 가능한 샘플의 97%, BL에서 94%, T1에서 100%에서 발견되었음을 보여준다. BL에서는 IMT로 치료받지 않은 환자의 높은 PD-L1이 PFS(p=0.825)나 OS(p=0.518)에 대해 유의미하지 않았다. T1에서, IMT로 치료받지 않은 환자 중 PD-L1이 높은 환자는 PFS(HR=1.10, p=0.937) 또는 OS(HR=1.75 p=0.298)에 대해 유의미하지 않았다. T1에서 IMT로 치료한 PD-L1이 높은 환자는 PFS(HR=3.19, p=0.0112)와 경계선 OS(HR=2.37, p=0.0809)가 유의하게 더 좋았다. BL과 T1 사이에서 PD-L1 발현이 증가한 환자는 PFS(HR=3.49, p=0.0009)와 OS(HR=2.88, p=0.0430)가 유의하게 더 좋았다.
따라서, 재발성 NSCLC에서 CAML의 높은 PD-L1 발현은 IMT 사용의 예후이며 CRT 후 통합 IMT에 대한 반응을 예측한다. CAML에서 PD-L1의 동적 변화를 모니터링하면 재발성 NSCLC에서 면역요법 효과를 예측할 수 있는 것으로 확인하였다.
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Claims (23)

  1. 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법으로서,
    치료 전 및 치료 후로부터 얻은 샘플에서 CAML의 크기 및 수를 결정하고 비교하는 단계; 및 이를 토대로 예측하는 단계를 포함하고,
    상기 치료 후 샘플의 적어도 하나의 CAML이 상기 치료 전 샘플의 가장 큰 CAML보다 크기가 더 크고; 및 상기 치료 전 샘플보다 상기 치료 후 샘플에 CAML이 더 많은 경우, 상기 개체는 치료에 반응하지 않는 것으로 예측되는 것인, 방법.
  2. 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법으로서,
    상기 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료 전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료 후 샘플을 얻는 단계, 및 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수 및 크기를 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 치료 후 샘플의 가장 큰 CAML이 상기 치료 전 샘플의 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 감소하거나 크기가 유사하고; 및 상기 치료 후 샘플의 CAML의 수가 상기 치료 전 샘플의 CAML 수보다 적은 경우, 상기 개체는 치료로 호전되거나 치료에 반응할 가능성이 있는 것인, 방법.
  3. 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법으로서,
    상기 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료 전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료 후 샘플을 얻는 단계, 및 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수 및 크기를 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 치료 후 샘플의 가장 큰 CAML이 상기 치료 전 샘플의 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 감소하거나 크기가 유사하고; 및 상기 치료 후 샘플의 CAML의 수가 상기 치료 전 샘플의 CAML 수와 같거나 더 많은 경우, 상기 개체는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있는 것인, 방법.
  4. 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법으로서,
    상기 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료 전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료 후 샘플을 얻는 단계, 및 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수 및 크기를 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 치료 후 샘플의 가장 큰 CAML이 상기 치료 전 샘플의 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 증가하거나 크기가 유사하고; 및 상기 치료 후 샘플의 CAML의 수가 상기 치료 전 샘플의 CAML 수와 같거나 더 적은 경우, 상기 개체는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있는 것인, 방법.
  5. 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법으로서,
    상기 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료 전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료 후 샘플을 얻는 단계, 및 차이를 위해 치료 전 샘플과 치료 후 샘플 사이의 CAML의 수 및 크기를 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 치료 후 샘플의 가장 큰 CAML이 상기 치료 전 샘플의 가장 큰 CAML과 비교하여 크기가 증가하거나 크기가 유사하고; 및 상기 치료 후 샘플의 CAML의 수가 상기 치료 전 샘플의 CAML 수보다 많은 경우, 상기 개체는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있는 것인, 방법.
  6. 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법으로서,
    상기 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료 후 샘플을 얻는 단계, 및 CTC에 대해 상기 샘플을 분석하는 단계를 포함하고,
    하나 이상의 상기 CTC가 상기 샘플에서 검출되는 경우, 상기 개체는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있는 것인, 방법.
  7. 암을 갖는 개체의 치료 반응 예측 방법으로서,
    상기 암을 갖는 개체로부터 적어도 하나의 치료 전 샘플을 얻는 단계 및 상기 개체로부터 적어도 하나의 치료 후 샘플을 얻는 단계;
    (i) 상기 치료 전 샘플과 상기 치료 후 샘플 간의 CAML 수와 크기의 차이를 비교하는 단계; 및
    (ii) 상기 치료 후 샘플에서 CTC의 수를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 CAML 수 및/또는 크기의 차이가 발견되고/되거나 적어도 하나의 상기 CTC가 검출되면, 치료 반응이 예측되는 것인, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    적어도 하나 이상의 상기 CTC가 상기 치료 후 샘플에서 검출되는 경우, 상기 개체는 치료로 인해 호전되지 못하거나 치료에 반응하지 않을 가능성이 있는 것인, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAML은 다음의 특성을 갖는 것인, 방법:
    (a) 약 14 내지 64μm의 크기를 갖는, 다수의 개별 핵 및/또는 하나 이상의 융합 핵
    (b) 약 20 내지 300μm의 세포 크기; 및
    (c) 방추형, 올챙이형, 원형, 직사각형, 두 다리형, 세 다리 이상형, 얇은 다리형 및 무정형으로 구성된 그룹에서 선택된 형태학적 형태.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 CAML은 다음의 추가적인 특성을 하나 이상 갖는 것인, 방법:
    (d) CD14 양성 표현형;
    (e) CD45 발현;
    (f) EpCAM 발현;
    (g) 비멘틴(vimentin) 발현;
    (h) PD-L1 발현;
    (i) 단핵구 CD11C 마커 발현;
    (j) 내피 CD146 마커 발현;
    (k) 내피 CD202b 마커 발현;
    (l) 내피 CD31 마커 발현; 및
    (m) 상피암 세포 CK8, 18 및/또는 19 마커 발현.
  11. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플의 크기는 5 내지 50 mL인 것인, 방법.
  12. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플의 유래는, 말초 혈액, 혈액, 림프절, 골수, 뇌척수액, 조직, 소변, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 냉동보존 PBMC 중 하나 이상인 것인, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 샘플은 전주정맥혈, 하대정맥혈, 대퇴정맥혈, 문맥혈, 또는 경정맥혈인 것인, 방법.
  14. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 고형 종양, 1기 암(stage I cancer), 2기 암(stage II cancer), 3기 암(stage III cancer), 4기 암(stage IV cancer), 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 흑색종(melanoma), 상피세포암, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 대장암, 간암, 두경부암, 신장암, 난소암, 식도암, 자궁암, 요로상피암, 방광암, 자궁내막암, 담관암종, 신경내분비암 또는 기타 고형 종양암인 것인, 방법.
  15. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAML 및 CTC는, 크기 배제 방법(size exclusion methodology), 면역포획(immunocapture), 덴드리머 매개 다가 세포 포획, 친화도 기반 표면 포획, 생체모방 표면 코팅 포획, 셀렉틴 코팅 표면 포획(selectin coated surfaces capture), 기타 기능화된 표면 포획, 관성 포커싱 칩, 적혈구 용해, 백혈구 고갈, FICOLL 분리, 전기 영동, 유전 영동, 유세포 분석, 자기 부상 및 다양한 미세 유체 칩 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 수단을 사용하여 상기 샘플로부터 분리되는 것인, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 CAML 및 CTC는 마이크로필터를 사용하는 것을 포함하는 크기 배제 방법을 사용하여 상기 샘플로부터 분리되는 것인, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 마이크로필터는 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론 범위의 기공 크기(pore)를 갖는 것인, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 마이크로필터의 상기 기공은 원형, 레이스-트랙형(race-track shape), 타원형, 정사각형 및/또는 직사각형 기공 형상을 갖는 것인, 방법.
  19. 청구항 17에 있어서,
    상기 마이크로필터는 정밀 포어 기하학적 구조(precision pore geometry) 및 균일 포어 분포(uniform pore distribution)를 갖는 것인, 방법.
  20. 청구항 15에 있어서,
    상기 CAML 및 CTC는 물리적 크기 기반 분류, 유체역학적 크기 기반 분류, 그룹화, 트래핑, 면역포획, 대형 세포 농축, 또는 크기 기반의 소형 세포 제거를 통해, 미세유체 칩을 이용하여 상기 샘플로부터 분리되는 것인, 방법.
  21. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAML 및 CTC는 CellSieveTM 저압 미세여과 분석을 이용하는 상기 결정 단계를 위해, 상기 샘플로부터 분리되는 것인, 방법.
  22. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 화학요법, 단일 약물, 약물 병용, 면역요법, 표적 요법, 방사선 요법, 화학방사선요법, 단일 또는 다중 약물과 병용된 방사선, 단일 또는 다중 약물과 병용된 화학방사선요법, 암백신, 및 세포치료제 중 하나 이상인 것인, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 치료는 암백신인 것인, 방법.
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