KR102623286B1 - 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(camls)를 이용하여 암에 걸린 개체에서 전체 생존 및 무진행 생존을 예측하는 방법 - Google Patents
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(camls)를 이용하여 암에 걸린 개체에서 전체 생존 및 무진행 생존을 예측하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
암에 걸린 개체의 전체 생존(OS) 및 무진행 생존(PFS)을 예측하는 방법으로서, 상기 예측은 개체로부터의 혈액과 같은 생물학적 시료에서 발견된 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(CAML)의 개수 및 크기에 기반한다.
Description
본 발명은 일반적으로 고형 종양과 같은 암에 걸린 개체에서 전체 생존 및 무진행 생존에 관한 예측을 하기 위한 혈액 및 기타 체액 중 바이오마커의 용도에 관한 것이다.
종양 세포가 원발성 고형 종양으로부터 빠져나오는 경우, 혈액 또는 림프 순환에 침투하고, 결국 혈류를 떠나 기관 또는 조직으로 들어가 전이(metastasis)를 형성한다. 암과 관련된 사망의 90%는 전이 과정에 의해 일어난다. 가장 흔한 전이 부위는 폐, 간, 뼈 및 뇌이다. 순환에서 발견된 종양 세포는 순환성 종양 세포(circulating tumor cell; CTC)로 불린다. 많은 연구 간행물 및 임상 시험은 CTC가 (i) 혈류 내 CTC의 계수(enumeration)를 통해 예후 생존 및 암 재발 정보를 제공하고, (ii) CTC에서 단백질 발현 수준, 및 유전자 변이 및 전좌(translocation)의 발생의 검사를 통해 치료 정보를 제공하는데 임상적 유용성(clinical utility)을 갖는다는 것을 보여준다. 그러나, CTC는 4기 암(stage IV cancer) 환자에서도 개체의 암 발생 및/또는 존재와 일관되게 관련되지 않는다. CTC는 유방암, 전립선암 및 대장암의 4기에서 가장 많이 발견되지만, 동일 암의 초기 단계에서는 드물다. CTC는 다른 암에서도 드물다.
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(circulating cancer associated macrophage-like cells; CAMLs)는 암에 걸린 개체의 혈액에서 발견된 또 다른 암 관련 세포 유형이다. CAML은 테스트된 모든 고형 종양 및 암의 모든 단계와 관련된다. CAML는 배수체(polyploid)이며, ~ 25 μm 내지 ~ 300 μm의 크기로 매우 크다. 이러한 배수체 세포는 CD45(-) 또는 CD45(+)이며 CD11c, CD14 및 CD31를 발현할 수 있어서, 그들의 기원(origin)이 골수 계통(myeloid lineage)임을 확인한다. 그들은 CTC 및 세포 찌꺼기(cell debris)를 포식(engulf)하는 과정에서 종종 발견된다[1, 7].
혈액 및 다른 체액에서 CAML과 같은 바이오마커의 식별 및 규명(characterization)과 관련된 분석은 예후 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 임상의 및 다른 중요한 목표에 대한 도구를 제공하는 것에 관한 것이다.
요약
본 발명은 암종, 육종, 신경모세포종 및 흑색종을 포함하는 고형 종양에 걸린 개체의 혈액에서 발견되는 독특한 특징을 갖는 세포의 유형을 이용하는 방법이다. "순환성 암 관련 대식세포 유사 세포"(CAML)라 불리는 순환성 세포는 암에 걸린 개체에서 고형 종양의 존재와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. CAML과 관련된 다섯 가지 형태가 규명되고 설명되었다. CAML은 정밀 마이크로필터를 이용한 미세여과(microfiltration)에 의해 Ⅰ기 내지 Ⅳ기 고형 종양에 걸린 개체의 말초혈액에서 일관되게 발견되었다.
CAML과 관련된 의학적 적용(medical application)은 암의 조기 검출 및 암의 진단, 특히 암 재발(relapse 또는 recurrence)의 조기 검출 및 진단, 및 암 돌연변이의 결정을 제공하기 위한 바이오마커로서 세포의 용도를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한 CAML은 본 명세서에 제시된 데이터를 통해 질병 진행과 환자 생존에 관해 예측하는데 바이오마커로서의 임상적 유용성을 갖는 것으로 보여진다.
CAML은 암 마커로서 독립적으로, 또는 순환성 종양 세포(CTC), 환자의 질병에 대한 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 상피 중간엽 전이 세포(epithelial mesenchymal transition call; EMT), 순환성 암 관련 혈관 내피 세포(circulating cancer associated vascular endothelial cell; CAVE), 무세포 DNA(cell-free DNA), 순환성 종양 DNA(circulating tumor DNA), 메틸화 DNA(methylated DNA), 단백질체(proteomic), 대사체(metabolomic), 지질체(lipidomic) 및 기타 바이오마커와 조합하여 사용될 수 있다.
더 구체적으로, 및 제1 구체예에서, 본 발명은 암에 걸린 개체의 전체 생존(overall survival; OS) 및 무진행 생존(progression free survival; PFS)을 예측하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 암에 걸린 제1 개체로부터의 생물학적 시료에서 순환성 세포의 크기를 결정하는 단계, 및 수득된 결과를 암에 걸린 제2 개체와 비교하는 단계를 포함한다. 더 큰 크기의 세포를 갖는 개체의 OS 및 PFS는 더 작은 크기의 세포를 갖는 개체의 OS 및 PFS에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
일 양태에서, 상기 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료에서 순환성 세포의 크기를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 시료에서 하나 이상의 세포가 약 50 μm 이상의 크기일 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 약 50 μm 보다 큰 크기인 세포가 없는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
제2 구체예에서, 본 발명은 암에 걸린 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료의 선택된 부피(volume) 중 순환성 세포의 비율을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 비율이 7.5 mL의 생물학적 시료 당 약 6개 이상의 세포에 해당할 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 7.5 mL의 생물학적 시료 당 6개 미만의 세포에 해당하는 비율을 갖는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
제3 구체예에서, 본 발명은 암에 걸린 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료 중 순환성 세포에서 CEP17 도트(dot)의 개수를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 시료에서 하나 이상의 세포가 약 10개 이상의 CEP17 도트를 가질 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 개체로부터의 생물학적 시료에 약 10개 이상의 CEP17 도트를 갖는 세포가 없는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, OS 또는 PFS, 또는 둘다는 12개월 이상의 기간이다. 본 발명의 구체예의 다른 양태에서, OS 또는 PFS, 또는 둘다는 24개월 이상의 기간이다.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, 상기 생물학적 시료의 크기는 5 내지 15 mL이다.
본 발명의 각 구체예 및 양태에서, 상기 순환성 세포는 하기 각 특징을 갖는 것으로 정의될 수 있다:
(a) 단일 세포 중 약 14 ~ 64 μm 크기의 큰 비정형 배수체 핵(large atypical polyploidy nucleus), 또는 복수의 핵;
(b) 약 20 ~ 300 μm 크기의 세포 크기; 및
(c) 방추형(spindle), 올챙이형(tadpole), 원형, 타원형, 두 다리형(two legs), 세 다리 이상형(more than two legs), 가는 다리형(thin legs), 및 무정형으로 구성된 군에서 선택된 형태학적 형상.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, 상기 순환성 세포는 하기 추가적 특징의 하나 이상을 갖는 것으로 더 정의될 수 있다:
(d) CD14 양성 표현형;
(e) CD45 발현;
(f) EpCAM 발현;
(g) 비멘틴(vimentin) 발현;
(h) PD-L1 발현;
(i) 단핵구(monocytic) CD11C 마커 발현;
(j) 내피(endothelial) CD146 마커 발현;
(k) 내피 CD202b 마커 발현; 및
(l) 내피 CD31 마커 발현.
본 발명의 각 양태 및 구체예에서, 상기 순환성 세포는 "암 관련 대식세포 유사 세포" 또는 CAML로 불릴 수 있다.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, 상기 생물학적 시료의 출처(source)는 말초혈액, 혈액, 림프절, 골수, 뇌척수액, 조직, 및 소변 중 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 생물학적 시료가 혈액일 때, 상기 혈액은 예를 들어, 전주정맥 혈액(antecubital-vein blood), 상대정맥 혈액(inferior-vena-cava blood), 대퇴정맥 혈액(femoral vein blood), 간문맥 혈액(portal vein blood), 또는 경정맥 혈액(jugular-vein blood)일 수 있다. 상기 시료는 신선한 시료 또는 해동되어 적절하게 준비된 냉동 보존(cryo-preserved) 시료일 수 있다.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, 상기 암은 고형 종양, 1기 암(stage I cancer), 2기 암(stage Ⅱ cancer), 3기 암(stage Ⅲ cancer), 4기 암(stage Ⅳ cancer), 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 흑색종(melanoma), 상피세포암(epithelial cell cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 대장암(colorectal cancer), 간암(liver cancer), 두경부암(head and neck cancer), 신장암(kidney cancer), 난소암(ovarian cancer), 식도암(esophageal cancer) 또는 다른 고형 종양 암이다.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, 상기 순환성 세포는 상기 결정하는 단계를 위해 크기 배제 방법(size exclusion methodology), 면역포획(immunocapture), 적혈구 용해, 백혈구 고갈(depletion), 피콜(FICOLL), 전기영동(electrophoresis), 유전영동(dielectrophoresis), 유세포 분석(flow cytometry), 자기 부상(magnetic levitation) 및 다양한 미세유체 칩(microfluidic chip), 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리된다.
본 발명의 일 양태에서, 순환성 세포는 마이크로필터(microfilter)를 사용하는 것을 포함하는 크기 배제 방법을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리된다. 상기 마이크로필터는 약 5 내지 20 미크론의 범위인 포어(pore) 크기를 가질 수 있다. 상기 마이크로필터의 포어는 원형, 레이스-트랙형(race-track shape), 타원형, 정사각형 및/또는 직사각형 포어 형상을 가질 수 있다. 상기 마이크로필터는 정밀 포어 기하학적 구조(precision pore geometry) 및/또는 균일 포어 분포(uniform pore distribution)를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 순환성 세포는 물리적 크기 기반 분류, 유체역학적 크기 기반 분류(hydrodynamic size-based sorting), 그룹화(grouping), 트랩핑(trapping), 면역포획, 크기에 기반한 대형 세포 농축, 또는 소형 세포 제거를 통해 미세유체 칩을 사용하여 생물학적 시료로부터 단리된다.
본 발명의 다른 양태에서, 순환성 세포는 CellSieveTM 저압 미세여과 분석을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리된다.
도 1은 CAML을 식별하고 서브타입핑(subtype)하는데 사용되는 세포 분화 마커의 강도를 나타낸다.
도 2는 6개의 다른 암 및 암의 다른 병기(stage)에서 CTC와 CAML의 존재를 비교한다.
도 3a 및 3b는 암의 다른 병기(stage)에서 크기별 CAML의 평균 개수를 나타낸다.
도 4는 CAML 크기와 세포 당 CEP17 도트의 개수의 관계를 나타낸다.
도 5는 환자 n=157명의 발굴 세트(discovery set) 및 환자 n=158명의 검증 세트(validation set)에 대해 24개월 동안 전체 생존(OS)의 확률의 플롯(plot)을 나타낸다. 데이터는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 분석되었다. 발굴 세트 (n=157); 위험비(hazard ratio): 3.4 (95%CI=2.1-5.6, p<0.001). 검증 세트 (n=158); 위험비: 4.2 (95%CI=2.3-7.7, p<0.001).
도 6은 환자 n=157명의 발굴 세트 및 환자 n=158명의 검증 세트에 대해 24개월 동안 무진행 생존(OS)의 확률의 플롯을 나타낸다. 데이터는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 분석되었다. 발굴 세트 (n=157); 위험비: 3.2 (95%CI=2.1-5.0, p<0.001). 검증 세트 (n=158); 위험비: 3.8 (95%CI=2.7-6.8, p<0.001).
도 7은 6개 이상 및 6개 미만의 CAML 개수에 대한 환자 시료 n=293에 대해 24개월 동안 분석된 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 8은 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대한 환자 시료 n=293에 대해 24개월 동안 분석된 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 9는 50 μm 미만, 50 내지 110 μm, 및 110 μm 초과의 CAML 크기에 대해 Ⅰ 및 Ⅱ기(왼쪽 패널)와 Ⅲ 및 Ⅳ기(오른쪽 패널)로 구분된 환자 시료 n=293에 대해 24개월 동안 분석된 PFS를 나타낸다.
도 10a는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 Ⅰ기 환자 (n=62)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 10b는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 Ⅱ기 환자 (n=72)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 10c는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 Ⅲ기 환자 (n=69)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 10d는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 Ⅳ기 환자 (n=106)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11a는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 유방암 환자 (n=59)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11b는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 식도암 환자 (n=27)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11c는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC) 환자 (n=59)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11d는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 췌장암 환자 (n=59)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11e는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 전립선암 환자 (n=74)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11f는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 신장세포암종(renal cell carcinoma; RCC) 환자 (n=37)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 2는 6개의 다른 암 및 암의 다른 병기(stage)에서 CTC와 CAML의 존재를 비교한다.
도 3a 및 3b는 암의 다른 병기(stage)에서 크기별 CAML의 평균 개수를 나타낸다.
도 4는 CAML 크기와 세포 당 CEP17 도트의 개수의 관계를 나타낸다.
도 5는 환자 n=157명의 발굴 세트(discovery set) 및 환자 n=158명의 검증 세트(validation set)에 대해 24개월 동안 전체 생존(OS)의 확률의 플롯(plot)을 나타낸다. 데이터는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 분석되었다. 발굴 세트 (n=157); 위험비(hazard ratio): 3.4 (95%CI=2.1-5.6, p<0.001). 검증 세트 (n=158); 위험비: 4.2 (95%CI=2.3-7.7, p<0.001).
도 6은 환자 n=157명의 발굴 세트 및 환자 n=158명의 검증 세트에 대해 24개월 동안 무진행 생존(OS)의 확률의 플롯을 나타낸다. 데이터는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 분석되었다. 발굴 세트 (n=157); 위험비: 3.2 (95%CI=2.1-5.0, p<0.001). 검증 세트 (n=158); 위험비: 3.8 (95%CI=2.7-6.8, p<0.001).
도 7은 6개 이상 및 6개 미만의 CAML 개수에 대한 환자 시료 n=293에 대해 24개월 동안 분석된 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 8은 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대한 환자 시료 n=293에 대해 24개월 동안 분석된 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 9는 50 μm 미만, 50 내지 110 μm, 및 110 μm 초과의 CAML 크기에 대해 Ⅰ 및 Ⅱ기(왼쪽 패널)와 Ⅲ 및 Ⅳ기(오른쪽 패널)로 구분된 환자 시료 n=293에 대해 24개월 동안 분석된 PFS를 나타낸다.
도 10a는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 Ⅰ기 환자 (n=62)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 10b는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 Ⅱ기 환자 (n=72)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 10c는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 Ⅲ기 환자 (n=69)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 10d는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 Ⅳ기 환자 (n=106)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11a는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 유방암 환자 (n=59)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11b는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 식도암 환자 (n=27)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11c는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC) 환자 (n=59)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11d는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 췌장암 환자 (n=59)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11e는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 전립선암 환자 (n=74)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
도 11f는 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 24개월 동안 분석된 신장세포암종(renal cell carcinoma; RCC) 환자 (n=37)에 대한 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)를 나타낸다.
상세한 구성 및 요소와 같은 설명에서 정의되는 내용(matter)은 본 발명의 포괄적인 이해를 돕기 위해 제공된 것에 불과하다. 따라서, 당업계 통상의 기술자들은 본 명세서에 기술된 구체예의 다양한 변화 및 변경이 본 발명의 범위와 원리에서 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
암은 모든 나라에서 모든 인구 및 민족에 영향을 미치는 전세계적으로 가장 두려운 질병 중 하나이다. 남성 및 여성 모두의 약 40%는 일생 동안 암이 발병할 것이다. 미국에서만, 특정 시점에 1,200만 명 이상 의 암 환자가 있고, 2018년에 170만 명의 신규 암 환자 및 600만 명 이상의 사망자가 추정된다. 전 세계 암 사망자는 연간 약 800만 명으로 추산되며, 이 중 300만 명은 환자가 치료를 받을 수 있는 선진국에서 발생한다.
이상적으로는, 선택한 치료가 작용하는지 신속하게 결정하여 생존에 대한 예후를 제공할 수 있는 진단법(diagnostics)이 있을 것이다.
본 개시에서, I 내지 IV기로부터의 고형 종양 환자의 혈액에서 어떠한 암 관련 세포보다 더 일관되게 발견되는 세포 유형이 제시된다. 이러한 순환성 세포는 원발성 종양과 동일한 종양 마커를 포함하는 대식세포 유사 세포(macrophage-like cell)이고, 본 명세서에서 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(CAML)로 지칭된다.
순환성 종양 세포(CTC)와 함께, 암에 걸린 환자로부터의 생물학적 시료에 존재하는 CAML은, 예를 들면 미세여과 방법을 포함한 크기 배제 방법의 이용을 통해 단리되고 규명될 수 있다. 마이크로필터는 CTC 및 CAML과 같이 더 큰 세포를 유지하는 반면, 적혈구와 대부분의 백혈구가 통과할 수 있을 정도로 충분히 큰 포어로 형성될 수 있다. 수집된 세포는 직접 여과 또는 다른 방법을 통해 규명될 수 있다.
CAML은 단독으로 사용할 때 많은 임상적 유용성을 갖는다. 또한, 생물학적 시료에서 CAML의 규명은 진단 기법의 민감도 및 특이도를 더 향상시키기 위해 혈액 내 CTC, 무세포 DNA 및 유리 단백질(free protein)과 같은 다른 마커의 분석과 결합될 수 있다. 이는 동일한 방법을 사용하여 동시에 단리 및 식별될 수 있기 때문에 특히 CAML과 CTC에 해당된다.
순환성 종양 세포
본 명세서에서 정의된 바와 같이, 암종과 관련된 CTC는 많은 시토케라틴(cytokeratins; CKs)을 발현한다. CK 8, 18, & 19 는 가장 흔히 발현되고 진단에서 사용되는 시토케라틴이지만, 조사(surveying)가 이러한 마커에만 제한될 필요가 없다. 고형 종양 CTC의 표면은 보통 상피세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule; EpCAM)를 발현한다. 그러나, 이 발현은 균일하지 않고 일관성도 없다. CTC는 백혈구 마커이기 때문에 CD45를 발현하지 않는다. CTC 및 CAML과 같은 종양 관련 세포를 동정하는 분석에서, CK 8, 18, & 19와 같은 고형 종양과 관련된 마커에 대한 항체, 또는 CD45 또는 DAPI에 대한 항체를 사용하는 것이 충분하다. 염색 기법을 형태학과 결합하면, 병리적으로 정의 가능한 CTC(pathologically-definable CTC; PDCTC), 세포사멸(apoptotic) CTC 및 CAML이 식별될 수 있다[3].
고형 종양과 관련된 PDCTC는 CK 8, 18, & 19를 발현하고, 하기 특징에 의해 식별 및 정의될 수 있다:
● DAPI에 의해 염색된 "암 유사(cancer-like)" 핵. 핵은 보통 크고 도트 패턴을 갖는다. 핵은 농축될 수도 있다.
● CK 8, 18 및 19 중 하나 이상의 발현; 상피 암에서의 CTC는 보통 적어도 CK 8, 18 및 19를 발현하다. 시토케라틴은 사상(filamentous) 패턴을 갖는다.
● CD45 발현의 부재(lack)
암과 관련된 세포사멸 CTC는 CK 8, 18, & 19를 발현하고, 하기 특징에 의해 식별 및 정의될 수 있다.
● 퇴화성 핵(degrading nuclei)
● CK 8, 18 및 19 중 하나 이상의 발현; 모든 시토케라틴이 패턴이 사상형은 아니지만, 부분 또는 전체가 반점(spot)의 형태로 단편화된(fragmented) 것으로 보인다.
● CD45 발현의 부재
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(CAML)
본 명세서에서 정의된 바와 같이, 본 발명의 방법에서 사용된 순환성 세포는 "CAML"로 불릴 수 있다. "순환성 세포"에 대한 각 참조는 CAML과 동의어이며, "CAML"에 대한 각 참조는 순환성 세포들과 동의어이다. CAML 또는 "순환성 세포"로 불리는 세포는 하기 특징의 하나 이상을 갖는 것에 의해 특징화된다:
● CAML는 크고 비정형적인 배수체 핵을 갖거나, 또는 확대되어 융합된 핵이 일반적이나 세포에 종종 흩어져 있는, 복수 개의 개별적인 핵을 갖는다. CAML 핵은 크기 범위가 일반적으로 약 10 μm 내지 약 70 μm의 직경이며, 더 흔하게는 약 14 μm 내지 약 64 μm의 직경이다.
● 많은 암의 경우, CAML는 그 질병의 암 마커를 발현한다. 예를 들면, 상피 암과 관련된 CAML는 CK 8, 18 또는 19, 비멘틴 등을 발현할 수 있다. 마커는 일반적으로 확산되거나, 또는 공포(vacuole) 및/또는 섭취된 물질과 회합된다(associated). 모든 마커의 염색 패턴은 전체 세포에 거의 균일하게 확산된다. 육종, 신경모세포종 및 흑색종의 경우, 암과 관련된 다른 마커는 CK 8, 18, 19 대신에 사용될 수 있다.
● CAML은 CD45 양성 또는 CD45 음성일 수 있고, 본 발명은 CAML의 두 유형의 사용을 포괄한다.
● CAML은 크고, 가장 긴 길이가 약 20 미크론 내지 약 300 미크론의 크기이다.
● CAML은 방추형, 올챙이형, 원형, 타원형, 두 다리형, 세 다리 이상형, 가는 다리형, 또는 무정형을 포함하는 많은 뚜렷한 형태학적 형상으로 발견된다.
● 암종에서의 CAML은 일반적으로 확산된 시토케라틴을 갖는다.
● CAML이 EpCAM를 발현하면, EpCAM은 일반적으로 세포 전체에 확산되거나, 또는 공포 및/또는 섭취된 물질과 회합되고, 세포 전체에 거의 균일하나, 일부 종양이 EpCAM를 매우 낮게 발현하거나 발현하지 않기 때문에, 모든 CAML이 EpCAM를 발현하는 것은 아니다.
● CAML이 마커를 발현하면, 마커는 일반적으로 세포 전체에 확산되거나, 또는 공포 및/또는 섭취된 물질과 회합되고, 세포 전체에 거의 균일하나, 모든 CAML이 동일한 강도로 동일한 마커를 발현하는 것은 아니다
● CAML은 종종 종양 기원의 마커와 관련된 마커를 발현한다; 예컨대, 종양이 전립선암 기원이고 PSMA를 발현한다면, 그러한 환자의 CAML도 PSMA를 발현한다. 또 다른 예로서, 원발성 종양이 췌장 기원이고 PDX-1을 발현한다면, 그러한 환자의 CAML도 PDX-1을 발현한다. 다른 예로서, 원발성 종양 또는 암 기원의 CTC가 CXCR-4를 발현한다면, 그러한 환자의 CAML도 CXCR-4를 발현한다.
● 원발성 종양 또는 암에서 기원된 CTC가 약물 표적의 바이오마커를 발현한다면, 그러한 환자의 CAML도 약물 표적의 바이오마커를 발현한다. 면역치료(immunotherapy)의 그러한 바이오마커의 예는 PD-L1이다.
● CAML은 단핵구 마커 (예컨대, CD11c, CD14) 및 내피 마커 (예컨대, CD146, CD202b, CD31)를 발현한다.
● CAML는 Fc 단편(fragment)에 결합하는 능력을 갖는다.
마커의 광범위한 세트를 CAML에서의 발현에 대해 평가하였고, 그 결과가 도 1에 표시된다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 CAML는 도 1에 표시된 마커 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 모두를 발현하다. 마커는 다른 암에 걸린 다른 환자 93명으로부터의 CAML 1,118개에 대해 선별되었다. CAML을 먼저 단리하고 DAPI, 시토케라틴, 및 CD45로 식별하고, 골수/대식세포, 백혈구, 거핵구(megakaryocyte), 상피(epithelial), 내피(endothelial), 전구(progenitor)/줄기(stem), 및 운동성(motility) 마커를 포함하는 총 27개의 마커로 순차적으로 재염색하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 마커 발현은 0% 내지 96%의 범위이다. 거의 모든 CAML은 CD31의 수준을 발현하는 것으로 발견되었고, 주로 시토케라틴, CD14, CXCR4, 비멘틴 및 다른 마커를 동시 발현하였다. 그러나, CAML은 명확한 골수 계통 마커 (CD14)를 포함하는 반면, CD31 마커가 96%로 보다 흔히 발현되었다.
또한 CAML은 전형적인(classical) 세포 분화의 이해와 일치하는 것으로 보이지 않는 많은 표현형을 갖는다 (즉, CD45 [백혈구] 및 시토케라틴 [상피], CD11c [대식세포] 및 CD41 [거핵구], CD146 [내피] 및 CD41/CD61 [거핵구], CD41/CD61 [거핵구] 및 CD68/CD163 [청소 대식세포(scavenger macrophage)]의 동시 발현). 많은 마커들이 다양한 세포 유형에서 나타난다. 종합하면, 이러한 데이터는 CAML이 줄기세포 및 전혈관형성(proangiogenic) 능력과 관련된 다수의 표현형 특성을 갖는, 분화 과정 중 초기에 있는 골수 유래 세포인 것을 나타낸다.
CAML은 도 1에 나타낸 바와 같이 특정 마커의 H&E, 또는 형광 염색과 같은 비색 염색(colorimetric strain)에 의해 시각화될 수 있다. 세포질의 경우, CD31은 가장 양성적인 표현형이다. 단독이거나 또는 도 1의 다른 양성 마커, 또는 종양과 관련된 암 마커와 조합된 CD31이 권장된다.
본 발명의 다양한 구체예 및 양태에서, 순환성 세포 및 CAML은 하기 특징을 갖는 세포로서 정의될 수 있다: (a) 단일 세포 중 약 14 ~ 64 μm 크기의 큰 비정형 배수체 핵, 또는 복수의 핵; (b) 약 20 ~ 300 μm 크기의 세포 크기; 및 (c) 방추형, 올챙이형, 원형, 타원형, 두 다리형, 세 다리 이상형, 가는 다리형, 및 무정형으로 구성된 군에서 선택된 형태학적 형상. 다른 구체예에서, CAML는 하기 추가적 특징의 하나 이상을 갖는 것으로도 정의될 수 있다: (d) CD14 양성 표현형; (e) CD45 발현; (f) EpCAM 발현; (g) 비멘틴 발현; (h) PD-L1 발현; (i) 단핵구 CD11C 마커 발현; (j) 내피 CD146 마커 발현; (k) 내피 CD202b 마커 발현; 및 (l) 내피 CD31 마커 발현.
앞서 제안된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 CAML과 CTC의 고유한 특징은 그들을 암과 같은 질환의 스크리닝 및 진단, 치료 모니터링, 질환 진행 및 재발의 모니터링의 방법을 포함한 임상적 방법에서 사용하기에 적합하게 한다.
세포 크기를 이용한 OS 및 PFS 예측
앞서 요약에서 제안된 바와 같이, 본 발명은 순환성 세포 크기에 기반한 암에 걸린 개체의 전체 생존(OS) 및 무진행 생존(PFS)을 예측하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 암에 걸린 제1 개체로부터의 생물학적 시료에서 순환성 세포의 크기를 결정하는 단계, 및 수득된 결과를 암에 걸린 제2 개체와 비교하는 단계를 포함한다. 더 큰 크기의 세포를 갖는 개체의 OS 및 PFS는 더 작은 크기의 세포를 갖는 개체의 OS 및 PFS에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료에서 순환성 세포의 크기를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 시료에서 하나 이상의 세포가 약 50 μm 이상의 크기일 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 약 50 μm 보다 큰 크기인 세포가 없는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
50 μm 값은 이 방법에 대한 컷오프 값(cut-off value)으로 간주될 수 있다. 이 방법의 관련 양태에서, 컷오프 값은 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 μm 이상 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료에서 순환성 세포의 크기를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 시료에서 하나 이상의 세포가 약 50 μm 이상의 크기일 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 약 50 μm 보다 큰 크기인 세포가 없는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
이 방법에 관하여, 특정 순환성 세포의 크기는 세포의 상태와 형태, 크기가 결정되는 상황, 및 크기가 결정되는 방식에 따라 달라질 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 순환성 세포에 의해 취해진 형태의 유형은 (본 명세서에서 더 정의된 바와 같이) 방추형, 올챙이형, 원형, 타원형, 두 다리형 등을 포함하고, 크기는 또한 측정을 위해 선택된 세포 상의 두 지점(point)에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 세포의 크기는 일반적으로 세포 본체(body)에서 가장 먼 두 지점 사이가 측정될 것이다. 그러므로, 모양이 원형이면(round), 세포의 직경이 측정된다. 형상이 방추형이면, 세포의 축 길이를 따라 양 말단 사이의 거리가 측정될 수 있다.
이 구체예의 각 양태에서, 순환성 세포는 또한 CAML로 불릴 수 있다.
세포 개수를 이용한 OS 및 PFS 예측
또한 본 발명은 순환성 세포 개수에 기반하여 암에 걸린 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료의 선택된 부피 중 순환성 세포의 비율을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 비율이 7.5 mL의 생물학적 시료 당 약 4개 이상의 세포에 해당할 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 7.5 mL의 생물학적 시료 당 4개 미만의 세포에 해당하는 비율을 갖는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
4개의 순환성 세포 값이 이 방법에 대한 컷오프 값으로 간주될 수 있다. 이 방법의 관련 양태에서, 컷오프 값은 7.5 mL의 생물학적 시료 당 4개, 4.5개, 5개, 5.5개, 6개, 6.5개, 7개, 7.5개, 8개, 8.5개, 9개, 9.5개 또는 10개 이상의 세포 중 어느 하나일 수 있다.
다른 예로서, 본 발명의 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료의 선택된 부피 중 순환성 세포의 비율을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 비율이 7.5 mL의 생물학적 시료 당 약 6개 이상의 세포에 해당할 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 7.5 mL의 생물학적 시료 당 6개 미만의 세포에 해당하는 비율을 갖는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
이 구체예의 각 양태에서, 순환성 세포는 또한 CAML로 불릴 수 있다.
CEP17 도트 개수를 이용한 OS 및 PFS 예측
본 발명은 순환성 세포에서 검출된 CEP17 도트의 개수에 기반하여 암에 걸린 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료 중 순환성 세포에서 CEP17 도트의 개수를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 시료에서 하나 이상의 세포가 약 8개 이상의 CEP17 도트를 가질 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 개체로부터의 생물학적 시료에서 약 8개 이상의 CEP17 도트를 갖는 세포가 없는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다.
혼동을 피하기 위해, "개체로부터의 생물학적 시료에서 약 8개 이상의 CEP17 도트를 갖는 세포가 없는(none of the cells in a biological sample from the subject has about 8 or CEP17 dots)"이라는 문구는 생물학적 시료에서의 각 세포가 7개 또는 그 미만의 CEP17 도트를 갖는다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"8개 이상(8 or more)" CEP17 도트 값이 이 방법에 대한 컷오프 값으로 간주될 수 있다. 이 방법의 관련 양태에서, 컷오프 값은 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 또는 15개 이상의 CEP17 도트 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 방법은 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료 중 순환성 세포에서 CEP17 도트의 개수를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 시료에서 하나 이상의 세포가 약 10개 이상의 CEP17 도트를 가질 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 개체로부터의 생물학적 시료에서 약 10개 이상의 CEP17 도트를 갖는 세포가 없는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측된다. 혼동을 피하기 위해, "개체로부터의 생물학적 시료에서 약 10개 이상의 CEP17 도트를 갖는 세포가 없는(none of the cells in a biological sample from the subject has about 10 or CEP17 dots)"이라는 문구는 생물학적 시료의 각 세포가 9개 또는 그 미만의 CEP17 도트를 갖는다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
이 구체예의 각 양태에서, 순환성 세포는 또한 CAML로 불릴 수 있다.
본 발명의 각 방법에서, 전체 생존(OS) 또는 무진행 생존(PFS), 또는 둘다는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개월 이상의 기간이다. 본 발명의 일 양태에서, OS 또는 PFS, 또는 둘다는 약 24 개월 이상의 기간이다.
본 명세서에서 사용된, 전체 생존(OS)은 진단 날짜, 치료가 시작된 날짜, 및 암 진행을 평가하기 위해 혈액을 채취한 날짜와 같이 선택된 날짜로부터 암에 걸린 개체가 생존하는 시간의 길이를 의미한다.
본 명세서에서 사용된, 무진행 생존(PFS)은 치료가 시작된 날짜 또는 암 진행을 평가하기 위해 혈액을 채취한 날짜와 같이 선택된 날짜로부터 암에 걸린 개체가 생존하고, 암이 악화되거나 진행되지 않은 시간의 길이를 의미한다.
본 발명의 각 방법에서, 순환성 세포 (CAML)가 분석된 생물학적 시료의 양이 다양할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 그러나, 상기 방법이 세포의 크기를 결정하는데 기반할 때 적절한 개수의 세포를 얻기 위해, 생물학적 시료는 2.5 mL 이상이어야 한다. 생물학적 시료의 양은 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 12.5, 13, 14, 15, 16, 17, 17.5, 18, 19, 20, 21, 22, 22.5, 23, 24, 25, 26, 27, 27.5, 28, 29 또는 30 mL 이상일 수 있다. 생물학적 시료의 양은 약 2.5 내지 20 mL, 약 5 내지 15 mL, 또는 약 5 내지 10 mL일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 생물학적 시료는 약 7.5 mL이다.
생물학적 시료에서 순환성 세포 (CAML)의 개수에 기반한 암에 걸린 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법과 관련하여, 암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료의 선택된 부피 중 순환성 세포 (CAML)의 비율이 결정된다. 생물학적 시료의 다양한 양이 사용될 수 있지만, 시료의 크기에 대한 시료 중 세포 수의 비율이 결정되어 개체 간에 비교된다는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 15 mL의 시료 중 8개의 세포의 비율은 7.5 mL의 시료 중 4개의 세포, 및 3.75 mL의 시료 중 2개의 세포와 동일하다.
본 발명의 각 구체예 및 양태에서, 순환성 세포 (CAML)는 하기 각 특징을 포함하는 것으로서 정의될 수 있다:
(a) 단일 세포 중 약 14 ~ 64 μm 크기의 큰 비정형 배수체 핵, 또는 복수의 핵;
(b) 약 20 ~ 300 μm 크기의 세포 크기; 및
(c) 방추형, 올챙이형, 원형, 타원형, 두 다리형, 세 다리 이상형, 가는 다리형, 및 무정형으로 구성된 군에서 선택된 형태학적 형상.
본 발명의 구체예의 특정 양태에서, 순환성 세포 (CAML)는 하기 추가적 특징의 하나 이상을 갖는 것으로서 더 정의될 수 있다:
(d) CD14 양성 표현형;
(e) CD45 발현;
(f) EpCAM 발현;
(g) 비멘틴 발현;
(h) PD-L1 발현;
(i) 단핵구 CD11C 마커 발현;
(j) 내피 CD146 마커 발현;
(k) 내피 CD202b 마커 발현; 및
(l) 내피 CD31 마커 발현.
본 발명의 각 구체예 및 양태에서, 생물학적 시료의 출처는 말초혈액, 혈액, 림프절, 골수, 뇌척수액, 조직, 및 소변 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료가 혈액일 때, 혈액은 예를 들어, 전주정맥 혈액, 상대정맥 혈액, 대퇴정맥 혈액, 간문맥 혈액, 또는 경정맥 혈액일 수 있다. 시료는 신선한 시료 또는 해동된 냉동 보존 시료일 수 있다[8].
암에 걸린 두 개체 간에 순환성 세포 (CAML) 크기를 비교할 때, 개체가 동일한 유형의 암을 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 특히, 암의 유형, 암의 병기, 암의 진행율, 치료 이력, 및 암의 완화 및/또는 재발 이력의 측면에서 두 개체를 완전히 일치시키는 것은 어려울 수 있다. 그러므로, 이 방법에서 비교되고 있는 두 개체의 암의 특징에서 약간의 변이가 있을 수 있다는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 각 구체예 및 양태에서, 암은 고형 종양, 1기 암, 2기 암, 3기 암, 4기 암, 암종, 육종, 신경모세포종, 흑색종, 상피세포암, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 대장암, 간암, 두경부암, 신장암, 난소암, 식도암 또는 다른 고형 종양 암이다. 통상의 기술자는 본 발명의 방법이 암의 특정한 형태 또는 유형에 제한되지 않으며, 광범위한 암과 연관되어 실시될 수 있다는 것을 알 것이다.
본 발명의 각 구체예 및 양태에서, 순환성 세포 (CAML)는 상기 결정하는 단계를 위해 크기 배제 방법, 면역포획, 적혈구 용해, 백혈구 고갈, 피콜, 전기영동, 유전영동, 유세포 분석, 자기 부상, 및 다양한 미세유체 칩, 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 수단을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리된다. 특정 양태에서, 크기 배제 방법은 마이크로필터의 사용을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 순환성 세포 (CAML)는 마이크로필터를 사용하는 것을 포함하는 크기 배제 방법을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리된다. 적절한 마이크로필터는 다양한 포어 크기 및 형상을 가질 수 있다. 마이크로필터는 약 5 미크론 내지 약 20 미크론의 범위인 포어 크기를 가질 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 포어 크기는 약 5 내지 10 미크론이고; 다른 양태에서, 포어 크기는 약 7 내지 8 미크론이다. 더 큰 포어 크기는 필터의 WBC 오염의 대부분을 제거할 것이다. 마이크로필터의 포어는 원형, 레이스-트랙형, 타원형, 정사각형 및/또는 직사각형 포어 형상을 가질 수 있다. 마이크로필터는 정밀 포어 기하학적 구조 및 균일 포어 분포를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 순환성 세포 (CAML)는 물리적 크기 기반 분류, 유체역학적 크기 기반 분류, 그룹화, 트랩핑, 면역포획, 크기에 기반한 대형 세포 농축, 또는 소형 세포 제거를 통해 미세유체 칩을 사용하여 생물학적 시료로부터 단리된다. 순환성 세포 (CAML) 포획 효율은 수집 방법에 따라 다양할 수 있다. 예후 및 생존을 결정하기 위해 순환성 세포 크기를 이용하는 원리는 동일하나, 통계는 다를 것이다. CellSieveTM 마이크로필터를 이용한 순환성 세포의 수집은 100% 포획 효율 및 높은 품질의 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 혈액 수집 튜브이다. CellSave 혈액 수집 튜브 (Menarini Silicon Biosystems Inc., San Diego, CA)는 안정된 세포 형태 및 크기를 제공한다. 다른 사용 가능한 혈액 수집 튜브는 세포 안정성을 제공하지 않는다. 대부분의 다른 혈액 수집 튜브에서 수집될 때, 세포는 확장될 수 있고, 심지어 터질 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 CAML 세포 그 자체로서 세포를 구체적으로 식별하지 않고, 대신에 세포질 및 핵의 크기에 기반하여 세포를 단순히 식별하여 시료 중 대형 세포를 식별하는 것이다. 예로는 H&E 염색과 같은 비색 염색(color metric stain)을 이용하거나, 또는 CK (+) 세포를 관찰하는 기법이다.
본 발명의 다른 양태에서, 순환성 세포 (CAML)는 CellSieveTM 저압 미세여과 분석을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리된다.
실시예
시료 수집 및 처리
본 명세서에서 제공되고 하기에 서술된 각 실시예에서, 말초혈액은 CellSave 튜브 (Menarini Silicon Biosystems Inc., San Diego, CA) 에 수집되고 96시간 이내에 처리되었다. CellSieveTM 미세여과 기법을 이용하여 혈액 시료에서 모든 암 관련 세포 (CTC, EMT, CEC, 및 CAML)를 수집하였다. CellSieveTM 마이크로필터는 9 mm 영역 내 7 μm의 포어 직경을 갖는 16만 개 이상의 포어를 균일한 어레이(uniform array)로 갖는다. 시약(reagent)은 전고정 완충액(prefixation buffer), 후고정 완충액(postfixation buffer), 투과화 완충액(permeabilization buffer), 및 항체 칵테일(antibody cocktail)을 포함한다. 여과를 수행하는 기법은 5 mL/min으로 뽑는 주사기 펌프 세트[6] 또는 진공 펌프[4]를 사용한다. 필터를 통해 여과시키기 전에 7.5 mL의 전고정 완충액에 7.5 mL의 혈액을 전고정하여 여과 과정을 시작하였다. 여과 및 포획된 세포를 세척, 후고정, 세척, 투과화 및 세척에 적용시켰다. 그 후, 필터에 포획된 세포를 FITC-항-시토케라틴 8, 18, 19; 피코에리트린(phycoerythrin; PE) 접합 EpCAM; 및 Cy5-항-CD45(5)로 구성된 항체 칵테일로 염색하고, 세척하였다. 필터를 현미경 슬라이드 위에 올려놓고 Fluoromount-G/DAPI (Southern Biotech)로 덮었다(cover-slip). 특정한 형광 큐브(fluorescent cube) 및 단색 카메라(monochrome camera)를 사용하여 세포를 이미지화하기 위해 Carl Zeiss AxioCam이 구비된 형광 현미경 올림푸스(Olympus) BX54WI를 사용하였다. 세포 간의 동일한 신호 비교를 위해 노출을 3초 (Cy5), 2초 (PE), 100 ~ 750msec (FITC), 및 10 ~ 50msec (DAPI)로 미리 설정하였다. 이미지를 처리하기 위해 Zen2011 Blue (Carl Zeiss)를 사용하였다.
일부 암은 항상 CK 및 EpCAM의 높은 발현을 보이는 것은 아니므로, CAML 계수(count)를 향상시키기 위해 필터 상의 세포를 CD31 및/또는 CD14로 재염색하였다. 재염색 기법은 공개된 바와 같다[5]. 세포를 다시 이미지화하였다. CD31은 폐암에 대한 CAML 계수를 증가시켰다.
암 환자의 혈액에서 CTC 및 CAML의 빈도
PDCTC는 암의 초기 병기에서 거의 발견되지 않는다. PDCTC는 Ⅲ기 및 Ⅳ기 유방암 및 전립선암 환자에서 더 흔히 발견되지만, 대부분 다른 고형 종양에서 낮은 빈도로 나타난다. CAML이 더 흔히 발견된다.
예로서, 7.5 mL의 말초 전혈을 암환자 293명 (유방암 (n=59), 전립선암 (n=52), 췌장암 (n=59), 폐암 (n=59), 식도암 (n=27), 및 신장세포암종 (n=37)) 및 건강한 대조군 30명으로부터 얻었다. CellSieveTM 마이크로필터 분석을 이용하여 시료를 분석하였다.
도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, CAML이 PDCTC에 비해 더 흔한 것으로 밝혀졌다. CAML은 전-전이성 Ⅰ기 (n=60) (84%), Ⅱ기 (n=62) (94%), Ⅲ기 (n=65) (95%) 환자, 및 전이성 Ⅳ기 환자 (n=97) (97%) 및 병기 미분류(unstaged) 환자 9명 (결정되지 않음)을 포함한 환자 시료 93%에서 발견되었지만, 모든 건강한 대조군에서는 없었다. 그러므로, CAML은 고형 종양의 초기 병기에서 높은 확률로 발견되는 반면, CTC는 그렇지 않았다.
병기의 함수로서 CAML 개수 및 크기 검증
도 3a 및 3b는 도 2로부터 시료의 병기에 기반하여 CAML 개수 및 크기를 분석하였다. CAML의 평균 개수는 병기 증가에 따라 증가한다. 끝에서 끝까지의 크기로 25 ~ 50 μm를 갖는 CAML의 평균 개수는 모든 병기에 대해 거의 동일하다. 그러나, 크기가 50 내지 100 μm 및 100 μm 초과인 CAML의 평균 개수는 도 3b에 나타낸 바와 같이 병기에 따라 증가한다.
CAML 크기와 핵 영역 중 CEP17 도트의 개수의 상관관계
증가된 CAML 크기는 CAML이 종양 세포 및 종양 물질을 포식한(engulf) 결과인 것으로 가정되었다. 실제로, 한 실험은 포식된 핵의 개수의 지표(indicator)인 CEP17(chromosome enumeration probe 17) 도트의 개수가 세포의 크기와 잘 상관된다는 것을 입증하였다. 도 4는 50 μm 초과의 크기인 CAML이 25 내지 50 μm의 크기인 CAML 보다 더 많은 CEP17 도트를 갖는다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 50 μm의 크기인 CAML이 도 3b에 도시된 질병 진행에서의 결과와 일치하는 구분선(dividing line)이라는 것을 시사한다.
질병의 공격성을 결정하는 크기 기준의 개발
도 3 및 4는 50 μm가 공격성 질환을 구분하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. CellSieveTM 미세여과 분석을 이용하여 7.5 mL의 말초 전체 혈액을 분석하였다. 24개월에 걸쳐 추적된 다양한 암 및 병기에서의 환자 157명의 발굴 세트를 도 5의 점선 곡선(doted curve)인 OS 및 도 6의 점선 곡선인 무진행 생존에 대해 분석하였다. OS에 대한 위험비는 3.4 및 95%CI=2.1-5.6 (p<0.001) 이다. PFS에 대한 위험비는 3.2 및 95%CI=2.1-5.0 (p<0.001) 이다. 이는 50 μm 이상의 크기인 CAML을 갖는 환자가 더 짧은 PFS 및 OS를 갖는다는 것을 나타낸다.
비슷한 다양한 암 및 단계에서의 환자 158명의 검증 세트를 도 5의 실선 곡선(solid curve)인 OS 및 도 6의 실선 곡선인 무진행 생존에 대해 분석하였다. OS에 대한 위험비는 4.2 및 95%CI=2.3-7.7 (p<0.001) 이다. PFS에 대한 위험비는 3.8 및 95%CI=2.7-6.8 (p<0.001) 이다. 검증 결과는 발굴 결과와 우수하게 일치한다.
CAML 크기의 다변량 분석 및 예후 정보
도 5 및 6에서 표시된 데이터에 기반하여, OS 및 PFS에 대한 다변량 분석(multivariate analysis)을 전술된 환자 시료 n=293으로 수행하였다. 환자를 24개월 동안 추적하였다. 하기 표에 나타낸 다변량 분석을 수행하였다. 50 μm의 크기인 CAML이 OS 및 PFS를 결정하는데 가장 중요한 매개변수(parameter)라는 것을 보여준다. p 값이 더 작을수록, 통계가 정확할 확률도 더 높다.
| 변수 | OS (p 값) | PFS (p 값) |
| 병기 | 0.866 | 0.751 |
| # CTCs (<5 vs ≥5) | 0.995 | 0.136 |
| # CAML (<6 vs ≥6) | 0.816 | 0.244 |
| CAML 크기 (<50 μm vs ≥50 μm) | 0.015 | 0.000 |
| 화학/표적/미치료 (Therapy chemo/targeted/none) |
0.056 | 0.645 |
| 전이 양성 vs 음성 | 0.678 | 0.165 |
| 림프절 비전이, 국소, 원 격(Node negative, local, distant) |
0.017 | 0.231 |
| 종양 크기 (T1, T2, T3 또는 T4) | 0.012 | 0.485 |
| 남/녀 | 0.036 | 0.796 |
| 나이 | 0.088 | 0.066 |
| 인종 백인/ 흑인/아시아인/히스패닉) | 0.152 | 0.055 |
CAML 개수에 기반한 OS 및 PFS 분석을 도 7에 나타낸다. 이 데이터는 말초혈액 시료 7.5 mL 중 CAML의 개수가 CAML 6개 이상의 CAML일 때, OS 및 PFS 모두 동일한 크기의 시료에서 6개 미만의 CAML을 갖는 환자와 비교하여 감소된다는 것을 보여준다.
OS 및 PFS와 관련된 추가 데이터를 도 8에 나타낸다. 도 8에 제시된 데이터는 CAML 크기에 기반한다: 50 μm 이상 대비 50 μm 미만. p 값에 의해 나타낸 바와 같이, 50μm 이상 크기의 CAML은 좋지 않은 예후를 예측하는데 매우 중요하다.
도 9는 플롯을 3개의 다른 CAML 크기로 구분하였다: 50 μm 미만, 50 내지 100 μm 및 100 μm 초과. CAML 크기가 더 클수록, 예후가 다 나쁘다는 것은 분명하다. 또한 CAML 크기가 Ⅰ 및 Ⅱ기 (왼쪽 패널)에서도 예후를 결정하는데 중요하다는 것을 아는 것은 중요하다.
모든 병기 및 다양한 암에서 생존 및 예후 개념을 예측하기 위한 CAML 크기의 유용성을 입증할 수 있도록 n=315의 더 큰 시료 크기를 사용하였다. 암 환자 315명은 (유방암 (n=59), 전립선암 (n=74), 췌장암 (n=59), 폐암 (n=59), 식도암 (n=27), 및 신장세포암종 (n=37))이다. 그들은 I기 (62), Ⅱ기 (72), Ⅲ기 (n=69), Ⅳ기 (106), 및 병기 미분류 6명이다.
도 10a 내지 10d는 각각 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ기에 대한 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)의 자세한 정보를 제공한다.
도 11a 내지 11f는 각각 유방암, 식도암, 비소세포폐암(NSCLC), 췌장암, 전립선암, 및 신장세포암종에 대한 50 μm 이상 및 50 μm 미만의 CAML 크기에 대해 OS(왼쪽 패널) 및 PFS(오른쪽 패널)의 자세한 정보를 제공한다. 병기 또는 암에 따라, 50 μm 초과의 CAML 크기는 좋지 않은 OS 및 PFS를 나타낸다. 최적의 크기 컷오프는 최적 p 값에 대해 암의 유형에 따라 약간 변할 수 있다.
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- 암에 걸린 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법으로서, 상기 방법은
암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료에서 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포의 크기를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 시료에서 하나 이상의 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포가 50 μm 이상의 크기일 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 50 μm 보다 큰 크기인 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포가 없는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측되는 것인 방법.
- 암에 걸린 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법으로서, 상기 방법은
암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료의 선택된 부피(volume) 중 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포의 비율을 결정하는 단계를 포함하고,
상기 비율이 7.5 mL의 생물학적 시료 당 6개 이상의 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포에 해당할 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 7.5 mL의 생물학적 시료 당 6개 미만의 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포에 해당하는 비율을 갖는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측되는 것인 방법.
- 암에 걸린 개체의 OS 및 PFS를 예측하는 방법으로서, 상기 방법은
암에 걸린 개체로부터의 생물학적 시료 중 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포에서 CEP17 도트(dot)의 개수를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 시료에서 하나 이상의 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포가 10개 이상의 CEP17 도트를 가질 때, 상기 개체의 OS 및 PFS는 개체로부터의 생물학적 시료에서 10개 이상의 CEP17 도트를 갖는 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포가 없는 암에 걸린 개체에 비해 더 낮을 것으로 예측되는 것인 방법.
- 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 OS 및/또는 PFS는 12개월 이상의 기간인 것인 방법.
- 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 OS 및/또는 PFS는 24개월 이상의 기간인 것인 방법.
- 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 시료의 크기는 5 내지 15 mL인 것인 방법.
- 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포는 하기 특징을 갖는 것인 방법:
(a) 단일 세포 중 14 ~ 64 μm 크기의 큰 비정형 배수체 핵(large atypical polyploidy nucleus), 또는 복수의 핵;
(b) 20 ~ 300 μm 크기의 세포 크기; 및
(c) 방추형(spindle), 올챙이형(tadpole), 원형, 타원형, 두 다리형(two legs), 세 다리 이상형(more than two legs), 가는 다리형(thin legs), 및 무정형으로 구성된 군에서 선택된 형태학적 형상.
- 청구항 8에 있어서,
상기 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포는 하기 추가적 특징의 하나 이상을 갖는 것인 방법:
(d) CD14 양성 표현형;
(e) CD45 발현;
(f) EpCAM 발현;
(g) 비멘틴(vimentin) 발현;
(h) PD-L1 발현;
(i) 단핵구(monocytic) CD11C 마커 발현;
(j) 내피(endothelial) CD146 마커 발현;
(k) 내피 CD202b 마커 발현; 및
(l) 내피 CD31 마커 발현.
- 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 시료의 출처(source)는 말초혈액, 혈액, 림프절, 골수, 뇌척수액, 조직, 및 소변 중 하나 이상인 것인 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 생물학적 시료는 전주정맥 혈액(antecubital-vein blood), 상대정맥 혈액(inferior-vena-cava blood), 대퇴정맥 혈액(femoral vein blood), 간문맥 혈액(portal vein blood), 또는 경정맥 혈액(jugular-vein blood)인 것인 방법.
- 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암은 고형 종양, 1기 암(stage I cancer), 2기 암(stage Ⅱ cancer), 3기 암(stage Ⅲ cancer), 4기 암(stage Ⅳ cancer), 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 흑색종(melanoma), 상피세포암, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 대장암, 간암, 두경부암, 신장암, 난소암 및 식도암 으로 이루어진 군에서 선택되어진 것인 방법.
- 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포는 상기 결정하는 단계를 위해 크기 배제 방법(size exclusion methodology), 면역포획(immunocapture), 적혈구 용해, 백혈구 고갈(depletion), 피콜(FICOLL), 전기영동, 유전영동, 유세포 분석, 자기 부상, 및 다양한 미세유체 칩, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리되는 것인 방법.
- 청구항 13에 있어서,
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포는 마이크로필터(microfilter)를 사용하는 것을 포함하는 크기 배제 방법을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리되는 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서,
상기 마이크로필터는 5 내지 20 미크론의 범위인 포어(pore) 크기를 갖는 것인 방법.
- 청구항 15에 있어서,
상기 마이크로필터의 포어는 원형, 레이스-트랙형(race-track shape), 타원형, 정사각형 및 직사각형 포어 형상을 갖는 것인 방법.
- 청구항 15에 있어서,
상기 마이크로필터는 정밀 포어 기하학적 구조(precision pore geometry) 및 균일 포어 분포(uniform pore distribution)를 갖는 것인 방법.
- 청구항 13에 있어서,
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포는 물리적 크기 기반 분류, 유체역학적 크기 기반 분류, 그룹화(grouping), 트랩핑(trapping), 면역포획, 크기에 기반한 대형 세포 농축, 또는 소형 세포 제거를 통해 미세유체 칩을 사용하여 단리되는 것인 방법.
- 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
순환성 암 관련 대식세포 유사 세포는 상기 결정하는 단계를 위해 CellSieveTM 저압 미세여과 분석을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리되는 것인 방법.
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